DE69125109T2 - N,O-sulfatierte Heparosane; Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents
N,O-sulfatierte Heparosane; Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende ArzneimittelInfo
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Description
- Die vorliegende Effindung betrifft neue N,O-sulfatierte Heparosane, N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitungen, welche diese neuen N,O-sulfatierten Heparosane enthalten, und pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff die neuen N,O- sulfatierten Heparosane enthalten.
- Es ist bekannt, daß die Glykosaminoglykane Produkte sind, welche durch Extraktion aus Tiergeweben erhalten werden können. Bestimmte Glykosaminoglykane dieser Art besitzen sehr interessante antikoagulierende und antithrombotische Wirkungen. Typische Produkte dieser Familie sind Heparin, dessen Fragmente und deren Derivate sowie Heparansulfat und Dermatansulfat, welche jedoch den Nachteil besitzen, daß sie aufgrund ihrer Herkunft sehr kostspielig sind.
- Insbesondere ist es bekannt, daß Dermatansulfat eine Familie von Polymeren mit variablem Polymerisationsgrad darstellt, welche aus sich wiederholenden Einheiten gebildet sind, die aus einer Uronsäuregruppe (Iduronyl- oder Glucoronylgruppe) und einer Acetylsulfo-4-galactosaminyl-gruppe gebildet sind (H.W. Stuhlsatz, "The Methodology of Connective Tissue Research" (1976), 137-146). Natürliches Dermatansulfat besitzt eine Molekülmasse zwischen 20.000 und 40.000 Da. Dieses Produkt ist besonders interessant als Antikoagulierungsmittel und antithrombotisches Mittel (F. Fernandez et al., British Journal of Haematology 64 (1986), 309-317).
- Es ist andererseits bekannt (I. Björk und U. Lindhal, "Molecular and Cellular Biochemistry" (1982), Dr. W. Junk Publishers - Niederlande), daß die Blutkoagulation ein komplexes physiologisches pHänomen darstellt, dessen Mechanismus wie folgt schematisiert und erläutert werden kann:
- Bestimmte Stimuli, wie die Kontaktaktivierung und die Gewebefaktoren, lösen eine aufeinanderfolgende Aktivierung einer Reihe von Koagulationsfaktoren aus, welche in dem Blutplasma enthalten sind und die in dem obigen Schema durch römische Ziffern bezeichnet werden, wobei die Anwesenheit des Index eines bestimmten Koagulationsfaktors auf die aktivierte Form (Index a vorhanden) oder die nicht aktivierte Form (Index a nicht vorhanden) hinweist.
- Unabhängig von der Art des Stimulus sind die Endstufen identisch: So aktiviert der Faktor Xa den Faktor II (der auch als Prothrombin bezeichnet wird), welcher in seiner aktiven Form (wobei der Faktor IIA auch als Thrombin bezeichnet wird), die teilweise Proteolyse des löslichen Fibrinogens verursacht unter Freisetzung des unlöslichen Fibrins, welches den Hauptbestandteil des Blutpfropfens bildet.
- Bei normalen physiologischen Bedingungen sind in dem Plasma auch regulierende Proteine, wie Antithrombin III (ATIII) und der Heparin-Cofaktor II (HCII) vorhanden.
- Antithrombin III übt eine inhibierende Wirkung auf die Gesamtheit der Koagulationsfaktoren aus, welche in dem obigen Schema mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet sind. Diese Inhibierung wird in sehr starkem Maße durch die Anwesenheit von Heparin oder synthetischen oligosacchariden des Heparintyps verstärkt (D.H. Atha et al., Biochemistry 24 (1985), 6723-6729).
- Der Heparin-Cofaktor II übt nur eine inhibierende Wirkung auf den Faktor IIa (Thrombin) aus, welcher die letzte Stufe der Koagulation katalysiert. Diese Wirkung wird in starkem Maße durch die Gegenwart von Heparin oder Dermatansulfat verstärkt (D.M. Tollefsen, J. Biol. Chem. 258 (1983), 6713-6716).
- Die Inhibierung des Faktors Xa oder des Faktors IIa bildet ein bevorzugtes Mittel zum Hervorrufen einer antikoagulierenden und antithrombotischen Wirkung, da diese beiden Faktoren in den beiden letzten Stufen der Koagulation eingreifen, welche von dem auslösenden Stimulus unabhängig sind.
- Zur Erzielung einer Inhibierung lediglich des Faktors IIa besteht eine besonders interessante Möglichkeit darin, die Spezifität des Cofaktors II des Heparins auszunützen und die verstärkung seiner inhibierenden Wirkung zu untersuchen. Dermatansulfat ist das bekannte Produkt, welches die stärkste verstärkende Wirkung dieses Typs entfaltet.
- Es ist weiterhin bekannt, daß die Bildung der Heparin-Hauptkette in zwei Stufen erfolgt. In einer ersten Stufe wird Heparin ausgehend von einem Vorläufer- Proteoglykan biosynthetisiert, dessen Polysaccharidteil aus einer Familie von Polymeren mit variablem Polymerisationsgrad gebildet ist, welche aus sich wiederholenden β-D-Glucuronyl-1,4-α-N-acetyl-D-glucosaminyl-(1,4)-Einheiten (Disaccharideinheiten) mit einer Molekülmasse von 379 Da gebildet sind. Dieser Polysaccharidteil wird üblicherweise als N-Acetylheparosan bezeichnet (J. Navia, Anal. Biochem. 135 (1983), 134-140). Diese erste Stufe der Biosynthese ist der einzige Augenblick, wo man wirklich von einer "Disaccharideinheit" reden kann, da die zweite Stufe der Biosynthese dieses einfache Skelett in starkem Maße modifiziert ("L'héparin, fabrication, structure, proprietes. analyses", J.P. Duclos (1984), S.81-83, Masson Ed.- Frankreich).
- In der Tat ist das natürliche Heparin als Ergebnis der Biosynthese ein Polysacchand, welches aus Glucuronsäuremolekülen und Iduronsäuremolekülen (Uronsäuren) gebildet ist, die gegebenenfalls in der 2-Stellung sulfatiert sind, welche mit Glucosaminmolekülen verknüpft sind, die gegebenenfalls in der 6-Stellung sulfatiert und am Amin der 2-Stellung sulfatiert oder acetyliert sind.
- Die Struktur des Heparins kann statistisch durch die folgende Formel (i) wiedergegeben werden:
- in der A H und SO&sub3;&supmin;, B SO&sub3; und COCH&sub3; bedeuten und n eine ganze Zahl mit einem Wert zwischen 20 und 30 darstellt, was einem Molekulargewicht von 12000 bis 18000 Da entspricht (EP-A-0 116 801).
- Die Begriffe "H und SO&sub3;&supmin;" und "SO&sub3;&supmin; und COCH&sub3;", wie sie bezüglich der Substituenten A und B benutzt werden, bedeuten, daß in den 20 bis 30 oben angegebenen Disaccharideinheiten A in bestimmten Fällen Wasserstoff und in anderen Fällen eine Gruppe SO&sub3;&supmin; darstellt und in analoger Weise B in der Mehrzahl der Fälle SO&sub3;&supmin; bedeutet und in den anderen Fällen eine Acetylgruppe.
- In gleicher Weise bedeutet die Bindung , daß die COO&supmin;-Gruppe bei den oben angegebenen 20 bis 30 Disaccharideinheiten in bestimmten Fällen die folgende Konfiguration (ii) besitzt:
- (wobei es sich um die D-Glucuronsäure handelt) und in der Mehrzahl der Fälle der n Einheiten die Konfiguration (iii) besitzt:
- (wobei es sich um die L-Iduronsäure handelt).
- Somit sind Heparin und Heparinfragmente, wie man sie durch verschiedenartige Depolymerisationsmethoden erhält, Makromoleküle, die sowohl Glucuronsäureeinheiten als auch Iduronsäureeinheiten enthalten.
- Bestimmte Depolymerisationsmethoden ermöglichen die Bildung von Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 9000 Da und einem Sulfatierungsgrad oberhalb von mindestens 20 % im Vergleich zu dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Heparin. Solche "supersulfatierte" Heparine sind in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 116 801 beschrieben und besitzen für die Uroneinheiten die oben erwähnten beiden Strukturen (ii) und (iii).
- Es ist weiterhin bekannt, daß bestimmte Bakterien des Genus Escherichia coli ein Kapselpolysaccharid produzieren, welches üblicherweise als Antigen K5 bezeichnet wird, welches eine Familie von Polymeren umfaßt, die aus sich wiederholenden β-D-Glucuronyl-1,5-α-N-acetyl-D-glucosaminyl-(1,4)-Einheiten gebildet sind (W.F. Vann et al., Eur. J. Biochem., 116 (1981), 359-364).
- Dieses Polysaccharid mit gleicher chemischer Natur wie der Polysaccharidteil des Vorläufer-Proteoglykans des Heparins wird im folgenden als N-Acetylheparosan bezeichnet. Dieses Produkt besitzt eine Molekülmasse zwischen 10&sup5; und 2,0.10&sup6; Da und im Bereich der "Uronsäureeinheiten" eine sehr regelmäßige Struktur, die ausschließlich aus D-Glucuronsäure gebildet ist (W.F. Vann et al., Eur. J. Biochem., 116 (1981), 359-364 und europäische Patentanmeldung EP-A-0 333 243).
- Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 333 243 beschreibt das O-sulfatierte Polysaccharid K5 sowie bestimmte Fragmente davon, die aus 4, 6 bzw. 8 "Zucker"-Einheiten gebildet sind, die ebenfalls O-sulfatiert sind. Diese Produkte besitzen eine antiangiogene und antitumorale Wirkung mit einem günstigen Verhältnis dieser Wirkungen zu den antikoagulierenden Eigenschaften. Dieses Dokument beschreibt weiterhin N-Acetylheparosan-Fragmente, die aus 4, 6, 8 bzw. 10 "Zucker"-Einheiten gebildet sind.
- Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 333243 beschreibt schließlich die Herstellung eines Pentasaccharids mit der O-sulfatierten N-Acetylheparosan Struktur durch chemische Totalsynthese.
- Es wurde nunmehr gefunden, daß die N-O-sulfatierten Heparosane mit varherendem Molekülgewicht zwischen 1500 und 15000 Da eine antikoagulierende Wirkung gegenüber dem Heparin-Cofaktor II und eine sehr starke Anti-Xa-Wirkung besitzen.
- Die N,O-sulfatierten Heparosane der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich somit von den anderen bereits in der Literatur beschriebenen Produkten durch ihre besondere Struktur, insbesondere ihren Sulfatierungsgrad (mit einer Sulfatlerung sowohl an der Aminogruppe des Glucosamins) und durch ihre pharmakologischen Eigenschaften. Sie besitzen neben anderen pharmakologischen Eigenschaf ten eine antikoagulierende Wirkung gegenüber dem Heparin-Cofaktor II (HCII), die stärker ist als die des Dermatansulfats und sie besitzen sehr interessante pharmakokinetische Eigenschaften. In der Tat entfalten die erfindungsgemäßen Produkte, welche man durch chemische Halbsynthese erhält, die pharmakologischenwirkungen von Glucosaminoglykanen, die häufig in der Therapie verwendet werden, insbesondere jene des Heparins, und können daher zur Regulierung der Koagulation eingesetzt werden und insbesondere Anwendung finden als antithrombotische Mittel.
- Die vorliegende Erfindung betrifft daher N,O-sulfatierte Heparosane, welche aus Ketten oder einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da aufgebaut sind, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel I:
- in der
- - E bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Reparosane eine Acetylgruppe und bei den verbleibenden Disaccharideinheiten eine Sulfatgruppe und gegebenenfalls ein Wasserstoffatom und
- - G ein Wasserstoffatom und eine Sulfatgruppe bedeuten, sowie die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser N,O-sulfatierten Heparosane.
- Der Sulfatierungrad der N,O-sulfatierten Heparosane als Sulfat/Carboxyl- Verhältnis ausgedrückt, beträgt 1,5 bis 3,0.
- Die Erfindung betrifft weiterhin eine N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitung, welche mindestens 70 Masse n-% eines der oben beschriebenen erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane enthält und vorzugsweise mindestens 90 Massen-% des erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosans.
- Die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane können aus identischen Polysaccharidketten mit wohldefinierter Molekülmasse gebildet sein, wobei diese Molekülmasse im Bereich von 1500 bis 15000 Da liegt. Sie können auch aus einer Mischung von Ketten mit variablen Molekülmassen gebildet sein, wobei diese Molekülmassen zwichen 1500 und 15000 Da liegen. Die Verteilung der Molekülmassen dieser Ketten kann mehr oder weniger breit sein. In der Tat können die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane aus Ketten gebildet sein, welche untereinander eine Differenz der Molekülmasse von maximal etwa 13500 Da besitzen oder im Gegensatz dazu auch lediglich Ketten umfassen, die eine Differenz in dem Molekulargewicht von etwa 300 Da aufweisen, was einer Uron-Struktureinheit (D- Glucuronsäure oder Derivate davon), oder der Glucosaminstruktur entspricht. Es ist weiterhin ersichtlich, daß in Abhängigkeit von dem Aufbau eines Jeden N,O-sulfatierten Heparosans die Molekülmasse der Ketten, die entweder die geringste Molekülmasse besitzen oder die höchste Molekülmasse, irgendeinem Wert zwischen 1500 und 15000 Da entsprechen kann.
- Der oben benutzte Begriff "G stellt ein Wasserstoffatom und eine Sulfatgruppe dar" bedeutet, daß G in einer Disaccharideinheit für gewisse Stellungen ein Wasserstoffatom und in den restlichen Stellungen eine Sulfatgruppe bedeutet. In gleicher Weise stellt E bei bestimmten Disaccharideinheiten eine Acetylgruppe dar und beim Rest dieser Einheiten eine Sulfatgruppe oder gegebenenfalls ein Wasserstoffatom. Die Disaccharideinheiten der N,O-sulfatierten Heparosane sind somit nicht sämtlich identisch.
- Die Formel I repräsentiert eine sich wiederholende Disaccharidstruktur, welche aus einer Glucosamineinheit und einer D-Glucuronsäureeinheit gebildet ist. Die genannten Einheiten können invertiert sein, insbesondere wenn man berücksichtigt, daß die Disaccharidstruktur der Formel I sich n-mal wiederholt, so daß die nicht reduzierende Einheit dieser Ketten entweder eine Glucosamineinheit sein kann, wie sie in der Formel I mit einer Hydroxygruppe in der 4-Stellung repräsen tiert wird, wobei diese Glucosamineinheit sulfatiert sein kann oder nicht, oder sie kann eine D-Glucuronsäureeinheit sein, die gegebenenfalls eine Doppelbindung in der C4-C5-Stellung aufweist und gegebenenfalls sulfatiert ist. Diese reduzierende Einheit kann unabhängig entweder eine D-Glucuronsäure sein, wie sie in der Formel I dargestellt ist, die mit einem Wasserstoffatom an dem anomeren Sauerstoffatom substituiert ist, oder ein Glucosamin, oder eine 2,5-Anhydromanno-Struktur, wie man sie als Folge einer Salpetrigsäure-Depolymerisation erhält (2,5-Anhydro- D-mannose), gegebenenfalls gefolgt von einer Oxidation (2,5-Anhydro-D-mannonsäure) oder von einer Reduktion (2,5-Anhydro-D-mannitol).
- Die bevorzugten Produkte sind Jene, bei denen die beiden Enden, nämlich die reduzierenden und nicht-reduzierenden Enden der N,O-sulfatierten Heparosane der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls sulfatierte Uroneinheiten, gegebenenfalls sulfatierte Glucosamineinheiten, gegebenenfalls sulfatierte N-Acetylglucosamineinheiten oder Einheiten mit einer 2,5-Anhydromanno-Struktur sind.
- Bevorzugt sind N,O-sulfatierte Heparosane, die aus Ketten gebildet sind, deren beide reduzierenden und nicht-reduzierenden Enden gegebenenfalls sulfatierte Uroneinheiten, gegebenenfalls sulfatierte Glucosamineinheiten und gegebenenfalls sulfatierte N-Acetylglucosamineinheiten sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die 70 % bis 100 % eines erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten He parosans enthält, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Folge der nachstehenden Stufen umfaßt:
- - Stufe a: Züchten eines Stammes von Escherichia coli (K5), zur Bildung eines N- Acetylheparosans,
- - Stufe b: Isolierung und Reinigung des gebildeten N-Acetylheparosans zur Bildung einer Zusammensetzung, die 70 % bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthält, welches aus Ketten oder einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da aufgebaut ist, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel II:
- - Stufe c: teilweise Desacetylierung dieser N-Acetylheparosan-Zusammensetzung zur Bildung einer Zusammensetzung, die 70 % bis 100 % eines Heparosans enthält, welches aus Ketten oder einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwlschen 1500 und 15000 Da aufgebaut ist, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel III:
- in der R' bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten eine Acetylgruppe und bei den verbleibenden Disaccharideinheiten ein Wasserstoffatom bedeutet,
- - Stufe d: - entweder teilweise N,O-Sulfatierung dieser Heparosan-Zusammensetzung,
- - oder teilweise N,O-Sulfatierung dieser Heparosan-Zusammensetzung, gefolgt von einer Stufe der vollständigen N-Sulfatierung,
- - oder eine vollständige oder teilweise N-Sulfatierung, gefolgt von einer Stufe der vollständigen oder teilweisen O-Sulfatierung,
- und gegebenenfalls eine oder mehrere Stufen der Fraktionierung der Molekülmassen am Ende der Stufen a, b, c oder d.
- Zur Herstellung einer Zubereitung. die 70 % bis 100 % eines erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosans enthält, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man in bevorzugter Weise als Stamm Escherichia coli (K5) den Stam Escherichia coli SEBR 3282. Dieser Stamm ist ein Stamm, der von dem Stamm Bi 8337-41 (O10:K5:H4) ATCC 23506 abgeleitet ist (und insbesondere von D.S. Gupta et al., FEMS Microbiology Letters, 14 (1982), 75-78 und W. Vann, Eur. J. Biochem., 116 (1981), 359-364) beschrieben worden ist.
- Der Stamm Escherichia coli SEBR 3282 spricht positiv auf den Typisierungstest mit dem spezifischen Phagen K5 nach der Methode von B. Kaiser et al. (J. Clin. Microbiol. 19, 2 (1984), 264-266) an. Es handelt sich somit um einen Stamm Escherichia coli (K5). Dieser Stamm wurde bei dem CNCM des Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr.I-1013 hinterlegt. Man kann auch eine spontane oder induzierte Mutante dieses Stammes verwenden ebenso wie andere geeignete Eschen chia coli (K5)-Stämme, beispielsweise den Stamm Bi 626-42 (012:K5:NM) ATCC 23508.
- Das verwendete Kulturmedium ist vorzugsweise ein an Stickstoffmaterial relches Medium, beispielsweise ein Medium, das an Hefeextrakt und Caseinhydrolysat angereichert ist, einem kostengünstigen Mittel zur Zuführung einer erheblichen Menge von Aminosäuren.
- Die Kultur des Stammes Escherichia coli (K5) wird vorzugsweise während mindestens zwei Stunden nach dem Aufhören des Wachstums der Biomasse fortgesetzt.
- Die Isolierung und die Reinigung des N-Acetylheparos ans zur Bildung der Zubereitung, die 70 % bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthält, welches aus einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da aufge-15 baut ist und durch eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der Formel II gekennzeichnet ist, erfolgt mit Hilfe eines Verfahrens, welches mindestens eine Stufe der Ausfällung und eine Stufe der Ionenaustauschchromatographie umfaßt. Diese Stufe wird vorzugsweise unter Anwendung einer Q-Sepharose-Säule oder einer äquivalenten Säule durchgeführt. Die Ausfällung erfolgt mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel und insbesondere einem Alkohol, vorzugsweise Ethanol. Bei diesem Verfahren kann das N-Acetylheparosan in Form eines Salzes vorliegen, vorzugsweise in Form des Natriumsalzes.
- Beispielsweise kann man das bevorzugte Verfahren zur Isolierung und Reinigung wie folgt schematisieren:
- - Stufe a&sub1;: Ausfällung mit Ethanol,
- - Stufe b&sub1;: Dialyse,
- - Stufe c&sub1;: Ausfällung mit Ethanol und dann Entwässerung und Trocknung,
- - Stufe d&sub1;: Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie,
- - Stufe e&sub1;: Ausfällung des in der Stufe d&sub1; erhaltenen Eluats mit Ethanol, Entwässerung, Trocknung und Vermahlen.
- Die Reihenfolge der Stufe a&sub1;, b&sub1; und c &sub1;ist von geringer Bedeutung. Man kann auch auf eine der Stufen a&sub1; oder c&sub1; verzichten.
- Auf die Stufe e&sub1;, die Ausfällung mit Ethanol, kann nicht verzichtet werden. Es ist möglich, N-Acetylheparosan mit Hilfe anderer Methoden zu isolieren, beispielsweise durch Eindampfen des Eluats im Vakuum, welches in der Stufe d&sub1; erhalten worden ist.
- Die Isolierung und die Reinigung des N-Acetylheparosans zur Bildung einer Zubereitung, die 70 % bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthält, welches aus einer Mischung aus Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist, kann auch wie folgt durchgeführt werden:
- - Stufe a'&sub1;: Dialyse,
- - Stufe b'&sub1;: Reinigung in saurem Medium, Entfernen von in wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von 3,5 und 1,8 unlöslichen Verunreinigungen,
- - Stufe c'&sub1;: Ausfällung mit Ethanol und dann Entwässerung und Trocknung,
- - Stufe d'&sub1;: alkalische Hydrolyse und Dialyse,
- - Stufe e'&sub1;: Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie,
- - Stufe f'&sub1;: Reinigung durch Ausschluß chromatographie.
- Dieses Verfahren der Isolierung und Reinigung ist auch das bevorzugte Verfahren der Erfindung.
- Die alkalische Hydrolyse erfolgt mit einer NaOH-Lösung bei einer Temperatur zwischen 30 und 80ºC.
- Unter Anwendung der Verfahren zur Isolierung und Reinigung kann man als Ausgangsprodukt entweder die am Ende der Kultur oder der Züchtung erhaltene Suspension verwenden, wobei in diesem Fall eine vorausgehende Filtration erforderlich ist, oder ein Produkt, welches bereits einer vorausgehenden Reinigung unterworfen worden ist mit Hilfe eines Verfahrens, welches die folgenden Stufen umfaßt:
- - Stufe a"&sub1;: Zentrifugieren der nach dem Züchten erhaltenen Suspension,
- - Stufe b"&sub1;: Inkontaktbringen der überstehenden Flüssigkeit mit einer alkalischen Lösung,
- - Stufe c"&sub1;: Vorfiltration,
- - Stufe d"&sub1;: Einengen auf einer Membran mit vorbestimmter Abtrennschwelle,
- - Stufe e"&sub1;: Dialyse.
- Die Stufe e"&sub1; ist nicht unverzichtbar.
- Als Lösung kann man eine 0,1N NaOH-Lösung verwenden. Vorzugsweise bewirkt man eine Vorreinigung des erhaltenen Produkts am Ende des Züchtungsvorgangs mit Hilfe der oben beschriebenen Methode.
- Das Züchten der Escherichia coli (K5)-Stämme und die Verfahren der Isolierung und Reinigung sowie die Stufe der vorausgehenden Reinigung, wie sie oben erwähnten worden sind, ermöglichen die Bildung von N-Acetylheparosan-Zubereitungen, die 70 % bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthalten, welches aus einer Mischung von Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel II:
- In der Tat ist es auf der Grundlage der oben beschriebenen Verfahren zur Isolierung und Reinigung und der vorausgehenden Reinigung möglich, N-Acetylheparosan-Zubereitungen zu erhalten, welche mindestens 80 % bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthalten, welches aus einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist.
- Die beiden reduzierenden und nicht-reduzierenden Enden dieser neuen, mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens unter Verwendung des Stammes Eschenchia coli SEBR 3282 oder eines anderen geeigneten Stammes, wie er oben angegeben worden ist, erhaltenen N-Acetylheparosane sind Uroneinheiten oder Einheiten von N-Acetylglucosamin.
- Bei der Mehrzahl der Ketten handelt es sich bei dem nicht-reduzierenden Ende um eine Uroneinheit der Formel (a):
- Eine eventuelle Anreicherung der erhaltenen Zubereitung an N-Acetylheparosan, welches aus einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist und eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der Formel II aufweist, kann in unterschiedlich starkem Ausmaß und insbesondere bis zur Isolierung des N-Acetylheparosans erfolgen. Die Anreicherung wird durch die Anwendung klassischer Methoden der Molekülmassenfraktionierung, wie der Gelpermeationschromatographie und der Ultrafiltration, durchgeführt (A.A. Homer, Biochem. J. 262 (1989), 953-958; G. Pyler et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 5197- 5201 und U. Lindahl et al., J. Biol. Chem. 259,20(1984), 12368-12376). Man kann auch die Methode der Ethanol-Fraktionierung anwenden (europäische Patentanmeldung EP-A-0 287477). Diese letztere Fraktionierungsmethode istgegenüberanderen möglichen Methoden besonders bevorzugt.
- Die oben beschriebenen N-Acetylheparosane werden als Zwischenprodukte für die Herstellung von N,O-sulfatierten Heparosanen, welche Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, verwendet, können jedoch auch für die Herstellung anderer Derivate eingesetzt werden.
- Zur Herstellung der erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane kann man auch andere bekannte N-Acetylheparosane verwenden, wie beispielsweise die N-Acetylheparosane, die im wesentlichen aus Polysaccharidketten gebildet sind, die sämtlich die gleiche Anzahl von Disaccharideinheiten aufweisen, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 333243 beschrieben sind, und insbesondere aus 6, 8 oder 10 "Zuckereinheiten" gebildet sind, N-Acetylheparosan-Fraktionen, die aus Ketten gebildet sind, die im Durchschnitt 10 Monosaccharideinheiten aufweisen (Gupta et al., FEMS Microbiology Letters 16 (1983), 13-17) oder N-Acetylheparosane mit hoher Molekülmasse, welche anschließend mit Hilfe von Methoden depolymerisiert werden können, wie sie für die Herstellung von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht angewandt werden.
- In der Tat können die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane mit Hilfe andersartigerverfahren hergestellt werden ausgehend von dem bekannten Polysaccharid (K5) mit einer hohen Molekülmasse. In diesem Fall ist eine Stufe der Depolymerisation notwendig.
- Diese Depolymerisation kann vor der Desacetylierung des N-Acetylheparosans mit hoher Molekülmasse, nach der Desacetylierung, nach der N-Sulfatierung oder auch nach der N,O-Sulfatierung erfolgen.
- Wie oben bereits erwähnt, kann die Depolymerisation mit Hilfe von Methoden durchgeführt werden, die in der Literatur für die Herstellung von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht beschrieben stud, beispielsweise durch Periodat-Depolymerisation, mit freien Radikalen, durch β-Eliminierung oder durch Einwirkung von salpetriger Säurer (europäische Patentanmeldungen und Patente 0 040 144, 0 037319, 0 121 067). Diese Methoden sind lediglich Beispiele, die nicht einschränkend sein sollen. Man kann auch jegliche andere Methode der Depolymerisation von Glykosaminoglykanen anwenden.
- Wenn die N,O-sulfatierten Heparosane durch Depolymerisation eines N-Acetylheparosans hoher Molekülmasse (welches zuvor desacetyliert und gegebenenfalls N-sulfatiert worden ist) hergestellt werden, indem man dieses der Einwirkung von salpetriger Säure unterwirft, so kann die reduzierende Einheit der erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane eine 2,5-Anhydromanno-Struktur aufweisen und insbesondere eine 2,5-Anhydro-D-mannose-Struktur. Die Depolymerisation mit salpetriger Säure kann nach der Stufe der N-Desacetylierung oder der N- Sulfatierung durchgeführt werden. Wenn diese Stufe von einer Oxidation oder einer Reduktion gefolgt wird, erhält man N,O-sulfatierte Heparosane mit einer reduzierenden Einheit und einer 2,5-Anhydro-D-mannonsäure- oder 2,5-Anhydro-D-mannitol-Struktur.
- Die teilweise desacetylierung von Zubereitungen, die 70% bis 100% N-Acetylheparosan enthalten, die zur Bildung von Zubereitungen führt, welche 70 % bis 100 % und sogar 80 % bis 100 % eines Heparosans enthalten, welches aus einer Mi schung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist und durch eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der oben angegebenen Formel III gekennzeichnet sind, erfolgt durch Behandeln mit einem Desacetylierungsmittel.
- Als Desacetylierungsmittel kann man Phosphorpentasulfid, Triethyloxoniumfluorborat, Natriumhydroxid oder Hydrazin nennen, wobei die letzten beiden Mittel besonders bevorzugt sind. Man kann auch starke Mineralsäuren einsetzen, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure etc. Die Reaktionsdauer hängt von den ausgewählten verfahrensbedingungen ab und insbesondere der Temperatur und der Konzentration des desacetylierenden Mittels in dem Reaktionsmedium.
- Die Anreicherung der Heparosan-Zubereitung an Heparosan, welches aus Ketten oder einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist und durch eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der Formel III gekennzeichnet ist, erfolgt durch Anwenden klassischer Methoden der Molekülmassenfraktionierung, wie sie oben angesprochen worden sind (Gelpermeationschromatographie, Ultrafiltration und Ethanol-Fraktionierung). In diesem Fall erhält man Zubereitungen, die 90 bis 100 Massen-% eines Heparosans enthalten, welches mit einer Mischung mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da gebildet ist, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel III.
- Zur Herstellung von Heparosanen, welche aus einer Mischung von Ketten mit Molekülmassen zwischen 1.500 und 15.000 Da gebildet sind, ist es weiterhin möglich, N-Acetylheparosane mit hohem Molekulargewicht zu verwenden. Die nach der Desacetylierung erhaltenen Heparosane mit hohem Molekulargewicht können mit Hilfe der bereits für die Herstellung von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht beschriebenen Methoden depolymerisiert werden, wie sie bereits in dieser Anmel dung erwähnt worden sind. Die Produkte der Depolymerisation können anschließend einer Fraktionierung unterworfen werden, um die bevorzugten erfindungsgemäßen Heparosane zu erhalten.
- Die Heparosane, welche aus einer Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1.500 und 15.000 Da gebildet sind und eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der Formel III
- aufweisen, in der R' bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten eine Acetylgruppe darstellt und bei den restlichen Disaccharideinheiten ein Wasserstoffatom, sind neue Produkte und aufgrund dieser Tatsache ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
- Die bevorzugten erfindungsgemäßen Heparosane sind Heparosane, welche aus einer Mischung von Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 15000 Da gebildet sind und durch eine sich wiederholende Disaccharidstruktur der Formel III gekennzeichnet sind, in der die Acetylgruppe (R') in einem Anteil von 60 % oder weniger vorhanden ist.
- Die Heparosan-Zubereitungen, die mindestens 70 Massen-% eines der oben beschriebenen Heparosane enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
- Diese Heparosane und Heparosan-Zubereitungen stellen nützliche Zwischenprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane dar, können Jedoch auch zur Herstellung anderer Produkte verwendet werden, beispielsweise von Produkten, die einer Epimerisierung im Bereich der D-Glucuronsäureeinheit unterliegen.
- Vor der Stufe der teilweisen N,O-Sulfatierung können die Heparosane in das Salz einer organischen Base oder ein quaternäres Ammoniumsalz umgewandelt werden. Zur Bildung des quaternären Ammoniumsalzes der Heparosane verwendet man vorzugsweise Tetrabutylammonium.
- Die Stufe der teilweisen N,O-Sulfatierung erfolgt nach dem Verfahren, das in der französischen Patentschrift Nr.2 584728 vom 10.11.87 beschrieben ist (und der französischen Patentanmeldung FR-85. 10787 entspricht), erfolgt in einem aprotischen polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphoramid oder Acetonitril oder einer Mischung dieser Lösungsmittel mit Hilfe eines Komplexes aus Schwefelsäureanhydrid (Schwefeltrioxid: SO&sub3;) mit einer organischen Base, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Pyridin. Sie kann auch mit Chlorsulfonsäure in Lösung in Pyridin durchgeführt werden. Vorzugsweise verwendet man den Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex.
- Es ist weiterhin möglich, andere Sulfatierungsmittel zu verwenden, insbesondere jene, die von E.E. Gilbert in Chemical Review, 62 (1962), 549-589 berichtet worden sind. Die N,O-Sulfatierungsreaktion erfolgt im allgemeinen bei einertemperatur zwischen 0º und 100ºC, vorzugsweise zwischen 10º und 50ºC, während einer Zeitdauer zwischen 6 Stunden und 14 Stunden.
- Bei dem Herstellungsverfahren wird am Ende de? teilweisen N,O-Sulfatierungsreaktion die N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitung, welche 70 % bis 100 % eines erfindungsgemaßen N,O-sulfatierten Heparosans enthält, durch Zugabe von Natriumchlorid bis zum Erhalt einer 0,33 M Natriumchloridlösung und einer adäquaten Menge Ethanol ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wird in einer 0,5 M Natriumchloridlösung aufgenommen. Diese Lösung wird anschließend neutralisiert. Nach der Zugabe einer geeigneten Menge Ethanol wird der gebildete Niederschlag isoliert, erneut mit ultragereinigtem Wasser aufgenommen, gegen ultragereinigtes Wasser dialysiert, gefriergetrocknet und getrocknet.
- Die Stufe der N,O-Sulfatierung sowie die in dem obigen Abschnitt beschriebe nen Stufen der Reinigung der N,O-sulfatierten Heparosan-Zubereitung können einoder mehrmals wiederholt werden. Das Reinigungsverfahren ist lediglich als Beispiel angegeben und schließt äquivalente Verfahren nicht aus.
- Diese Stufe der N,O-Sulfatierung wird vorzugsweise von einer Stufe der vollständigen N-Sulfatierung gefolgt, welche im allgemeinen in einem wäßrigen Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem basischen pH-Wert und mit einem Sulfatierungsmittel, wie einem Komplex aus Schwefelsäureanhydrid mit einer organischen Base, beispielsweise Trimethylamin, durchgeführt.
- Am Ende der vollständigen N-Sulfatierung wird die N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitung ausgefällt durch Zugabe von Natriumchlorid bis zum Erhalt einer 0,5 M Natriumchloridlösung und von Ethanol. Der gebildete Niederschlag wird anschließend mit einer 0,5 M Natriumchloridlösung aufgenommen, erneut mit Ethanol ausgefällt, erneut mit ultragereinigtem Wasser aufgenommen, dagegen dialysiert, gefriergetrocknet und getrocknet.
- Die Anreicherung der N,O-sulfatierten Heparosan-Zubereitung an N,O-sulfatiertem Heparosan erfolgt durch Anwendung der bereits erwähnten klassischen Methoden zur Molekülmassenfraktionierung. Die Durchführung dieser Anreicherung ist interessant.
- Man erhält die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane und die N,O- sulfatierten Heparosan-Zubereitungen, welche mindestens 70 % eines neuen erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosans enthalten, mit Vorteil mit Hilfe eines Verfahrens, welches eine abschließende N-Sulfatierungsreaktionumfaßt. E steht somit bei den sich wiederholenden Strukturen der Formel (I) für die Acetylgruppe und die Sulfatgruppe.
- Es ist weiterhin möglich, die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane dadurch zu erhalten, daß man zunächst eine N-Sulfatierung durchführt gefolgt von einer O-Sulfatierung. Diese Verfahrensvariante wird bevorzugt angewandt.
- Die N-Sulfatierung erfolgt mit Hilfe eines Komplexes aus Schwefeltrioxid mit einer organischen Base, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Pyridin. Sie kann auch mit Chlorsulfonsäure in Lösung in Pyridin bewirkt werden. Man verwendet mit Vorteil den Komplex aus Schwefeltrioxid und Trimethylamin, wobei die N-Sulfatierungsreaktion bei einer Temperatur zwischen 20 und 80ºC in wäßrigem alkalischem Medium durchgeführt wird. Am Ende der N-Sulfatierungsreaktion wird das in dieser Weise erhaltene Produkt durch Zugabe einer geeigneten Menge Ethanol ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wird mit ultragereinigtem Wasser aufgenommen, gegen dieses dialysiert, gefriergetrocknet und getrocknet. Das Reinigungsverfahren stellt lediglich ein Beispiel dar und schließt andere äquivalente Verfahren nicht aus. Die Stufen der Reinigung können mehrere Male wiederholt werden.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vor der Stufe der O-Sulfatierung das N-sulfatierte Heparosan vorzugsweise in ein Salz mit einer organischen Base oder ein quaternäres Ammoniumsalz überführt. Zur Bildung des quaternären Ammoniumsalzes verwendet man vorzugsweise Tetrabutylammonium.
- Die O-Sulfatierungsreaktion erfolgt in Formamid oder einem anderen chemisch äquivalenten Lösungsmittel mit Hilfe beispielsweise eines Komplexes aus Schwefeltrioxid mit einer organischen Base, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Pyridin. Man verwendet vorzugsweise einen Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex. Die O-Sulfatierungsreaktion erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen 10ºC und 50ºC.
- Das N,O-sulfatierte Heparosan wird anschließend durch Zugabe von Natriumchlorid zu dem Reaktionsmedium bis zum Erhalt einer 0,33 M NaCl-Lösung und dann von einer geeigneten Menge Ethanol ausgefällt, ebenso wie im Fall der N,O Sulfatierung. Man bewirkt anschließend eine Reinigung der N,O-sulfatierten Heparosan-Zubereitung. Die verschiedenen Stufen sind oben bereits in detaillierterweise beschrieben worden (Ausfällung mit Ethanol, Dialyse etc...).
- Erfindungsgemäß umfaßt das bevorzugte NO - sulfatierte Heparosan mindestens 90 Massen-%-Ketten mit einer Molekülmasse von weniger als 11000 Da. Vorzugsweise enthält dieses N,O-sulfatierte Heparosan weniger als 0,2 µMol/mg Aminogruppen (NH&sub2;).
- Die Acetylgruppe ist vorzugsweise in einer Menge vorhanden, die 60 % oder weniger beträgt, wobei der Sulfatierungsgrad, ausgedrückt als Sulfat/Carboxyl- Verhältnis, zwischen 1,5 und 3,0 liegt.
- Die bevorzugten erfindungsgemäßen Produkte sind N,O-sulfatierte Heparosane, die aus Ketten gebildet sind, mit einer Molekülmasse zwischen etwa 4000 bis 7000 Da und einem als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis ausgedrückten Sulfatierungsgrad zwischen 1,7 und 3, sowie auch die N,O-sulfatierten Heparosane, die zu etwa 180% N-desacetyliert sind (wobei der Anteil der vorhandenenacetylgruppen etwa 20 % beträgt), und die aus mindestens 70 Massen-%-Ketten mit Molekülmassen zwischen 5000 und 7000 Da gebildet sind und einen Sulfatierungsgrad von 1,8 bis 2,5 aufweisen, oder schließlich N,O-sulfatierte Heparosane, die aus mindestens 70 Massen-%-Ketten mit Molekülmassen zwischen 10000 und 12000 Da aufgebaut sind und zu etwa 80 % N-desacetyliert worden sind (mit einem Anteil der vorhandenen Acetylgruppen von etwa 20%) und die einen Sulfatierungsgrad von 1,8 bis 2,5 aufweisen und schließlich weiterhin N,O-sulfatierte Heparosane, die zu etwa 40 % N-desacetyliert sind (mit einem Gehalt an vorhandenen Acetylgruppen von etwa 60 %), und die zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 6000 und 8000 Da aufgebaut sind und einen Sulfatierungsgrad von 2,0 bis 2,8 besitzen.
- Die bevorzugten erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane sind insbesondere:
- - N,O-sulfatierte Heparosane, die zu etwa 80% N-desacetyliert sind (Anteil dervorhandenen Acetylgruppen von etwa 20%), und die zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 2300 Da und 7200 Da aufgebaut sind und einen Sulfatierungrad von 1,8 bis 2,5 aufweisen,
- - N,O-sulfatierte Heparosane, die zu etwa 80% N-desacetyliert sind (Anteil der vorhandenen Acetylgruppen von etwa 20 %), und die zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 3300 Da und 7700 Da aufgebaut sind und einen Sulfatierungsgrad von 1,8 bis 2,5 besitzen,
- - N,O-sulfatierte Heparosane, die zu etwa 80 % N-desacetyliert sind (mit einem Anteil von vorhandenen Acetylgruppen von etwa 20 %), und die zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 6900 Da und 13500 Da aufgebaut sind und einen Sulfatierungsgrad von 1,8 bis 2,5 aufweisen, und
- - N,O-sulfatierte Heparosane, die zu etwa 40 % N-desacetyliert sind (mit einem Anteil von vorhandenen Acetylgruppen von etwa 60 %), und die zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 4000 Da und 10300 Da aufgebaut sind und einen Sulfatierungsgrad von 2,0 bis 2,8 besitzen.
- Als Salze von N,O-sulfatierten Heparosanen versteht man sämtliche pharmazeutisch annehmbaren Salze. Diese Salze erhält man mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen, die insbesondere für die Herstellung von Heparinsalzen beschrieben worden sind (US-Patenteschrift 4 168 377).
- Das oben beschriebene Verfahren zur Bildung der N,O-sulfatierten Heparosane sowie die Methoden zur Reinigung ermöglichen die Bildung von N,O-sulfatierten Heparosanen in Form des Natriumsalzes. Ausgehend von diesen Salzen kann man unter Anwendung der Methoden, die für die Herstellung der verschiedenen Salze von Heparin oder Heparin nicht in Salzform verwendet werden ("L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses". J.P. Duclos (1984), S.81-83, Masson Hrgb., Frankreich) andere Salze von N,O-sulfatierten Heparosanen oder nicht in Salzform vorliegende N,O-sulfatierte Heparosane herstellen.
- Die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane besitzen interessante pharmakologische und biochemische Eigenschaften, die angesichts der Erkenntnise des Standes der Technik überraschend sind.
- Insbesondere und im Gegensatz zu sulfatierten Produkten des Antigens K5, die in dem europäischen Patent EP-A-0 333 243 beschrieben sind und eine antian giogene und antitumorale Wirkung besitzen, mit einem günstigen Verhältnis dieser Wirkungen im Vergleich zu den antikoagulierenden Eigenschaften, besitzen die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane eine gute regulierende Wirkung auf die Koagulation. Diese Wirkung ist sehr viel stärker als die von Dermatansulfat bei den verschiedenen Parametern der Koagulation und kann mit der von Heparin verglichen werden.
- Insbesondere wurde die anti-IIa-, ATIII- oder HCII-abhängige Wirkung von repräsentativen Produkten der vorliegenden Erfindung nach den von D. Dupouy et al. in Thrombosis and Haemostasis, 60, 2 (1988), 236-239 für den Heparin-Cofaktor II (HCII) und von M.L. Larsen et al. in Thrombosis Research 13, 2 (1978), 285-288 für Antithrombin (ATIII) beschriebenen Methoden bestimmt.
- In den beiden Fällen besteht der Test darin, in vitro die inhibierende Wirkung des untersuchten Produkts auf gereinigtes Thrombin (Faktor IIa) in Gegenwart von gereinigtem HCII oder ATII bei der Bestimmung der amidolytischen Wirkung des Thrombins gegenüber einem chromogenen Substrat zu messen. Da es die stärkste anti-IIA-, HCII-abhängige Wirkung besitzt, wird das nach der von H.W. Stuhlsatz et al. in "The Methodology of Connective Tissue Research" (1976), 137-146, beschriebenen Methode hergestellte Dermatansulfat als Vergleichsprodukt bei dem Test der Messung dieser Wirkung verwendet, wobei das Ergebnis in mg Dermatansulfat (DS), die der Wirkung von 1 mg des untersuchten Produkts äquivalent ist, ausgedrückt ist (mg DS äquiv/mg).
- Die Anti-Xa-Wirkung (Yin-Wessler-Titer) de genannten repräsentativen Produkte der vorliegenden Erfindung wurde nach der von E.T. Yin et al. in J. Lab. Clin. Med. 81,2 (1973), 298-310 beschriebenen Methode gemessen, während ihre gesamte antikoagulierende Wirkung nach dem APTT-Test gemessen wird, wie er von R.R. Proctor et al. in Am. J. Clin. Path. 36 (1961), 212-219 beschrieben worden ist.
- Sämtliche untersuchten Produkte zeigen eine im Vergleich zu Dermatansulfat deutlich stärkere anti-IIA-HCII-abhängige Wirkung. Die anti-IIA-ATIII-abhängige Wirkung und der Yin-Wessler-Titer, wenngleich geringer als Jene von Heparinen, sind jenen von Dermatansulfat überlegen. Ihr APTT-Titer ist etwa 2-mal bis 20-mal größer als der von Dermatansulfat und kann bis zu 60 % dessen von Heparin erreichen.
- Die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane besitzen somit eine Wirkungsspezifität und eine antikoagulierende Wirkung, die besonders interessant sind. Die geringe Molekülmasse dieser Produkte verleiht ihnen weiterhin sehr interessante pharmakokineteische Wirkungen.
- Die erfindungsgemäßen N,O-sulfatierten Heparosane sind sehr wenig toxisch. Ihre Toxizität ist mit ihrer Anwendung als Arzneimittel verträglich.
- Die Erfindung umfaßt somit auch pharmazeutische Zubereitungen, welche als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes N,O-sulfatiertes Heparosan, eines seiner Salze oder eine N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitung, die mindestens 70 % dieses N,O- sulfatierten Heparosans oder eines seiner Salze enthält, in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägermaterialien umfassen.
- Diese pharmazeutischen Zubereitungen sind insbesondere zur vorbeugenden oder heilenden Behandlung von Störungen der Gefäßwandung, wie der Atherosklerose und der Artheriosklerose, und von Zuständen der Hyperkoagulierbarkeit, wie man sie beispielsweise als Folge von chirurgischen Operationen, der Entwicklung von Tumoren oder der Deregulierung der Koagulation, die durch bakterielle, virale oder enzymatische Aktivatoren induziert werden, beobachtet, nützlich.
- Die Dosierung kann in starkem Maße variieren in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht und dem Gesundheitszustand des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung sowie dem Verabreichungsweg.
- Diese Dosierung umfaßt die Verabreichung von einer oder mehreren Dosierungen von etwa 1 mg bis 1 g pro Tag, vorzugsweise etwa 5 mg bis 500 mg pro Tag und liegt beispielsweise im Bereich von 200 mg pro Tag bei intravenöser Verabreichung oder durch subkutane Verabreichung, wobei die Verabreichungen diskontinuierlich oder in regelmäßigen Intervallen erfolgen können bei einer täglichen Dosis m Bereich von 200 mg bis 1.000 mg pro Tag bei oraler Verabreichung.
- Dieser Dosierungen können natürliche für Jeden Patienten in Abhängigkeit von den beobachteten Ergebnissen und den zuvor durchgeführten Blutanalysen angepaßt werden.
- Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
- Man impft 400 ml des Mediums B rnit der in der nachfolgenden Tabelle I angegebenen Zusammensetzung mit dem Stamm Escherichia coli SEBR 3282 (beim CNCM des Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr.I-1013 hinterlegt) an und inkubiert unter Rühren während 2 Stunden bei 37ºC.
- Die erhaltene Vorkultur wird dann in einen 18,5 Liter-Fermenter überführt, der 11 Liter des Mediums A mit der in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung enthält, und man inkubiert während 4 Stunden bei 37ºC und einem pH-Wert von 7,4, wobei man den Sauerstoffpartialdruck durch die Zuführung von Luft (bis zu 201/min) und Rühren bei 5332 Pa (40 mmhg) hält. Dann gibt man Glucose zu, indem man kontinuierlich eine sterile Lösung, die 600 gil Glucose enthält, in einer Menge von 250 ml/h während 8 Stunden zuführt.
- Man setzt das Züchten der Kultur unter den gleichen Bedingungen von Temperatur, pH und Sauerstoffpartialdruck während 10 Stunden nach der Zugabe der Glucose fort. Die Überwachung der optischen Dichte (λ = 600 nm) des Kulturmediums ermöglicht die Feststellung, daß kein weiteres Wachstum der Biomasse während der letzten 12 Stunden der Kultur mehr erfolgt.
- Dann kühlt man die Kulturbrühe auf 25ºC und filtriert durch eine Membran mit einer Porosität von 0,22 µm. Man erhält in dieser Weise etwa 12 Liter des Filtrats, welches N-Acetylheparosan enthält. TABELLE I Zusammensetzung und Herstellung des Mediums A und des Mediums B TABELLE II Herstellung der Lösung von Spurenelementen, die bei der Herstellung des Mediums A und des Mediums B verwendet wird
- Man gibt etwa 48 Liter Ethanol (95 %, V/V) zu dem Filtrat und läßt die Mischung während 8 Stunden bei 4ºC ausfällen und dekantieren. Man saugt die überstehende Flüssigkeit ab und nimmt nach dem Zentrifugieren den Zentrifugenrückstand in etwa 100 ml ultragereinigten Wassers auf.
- Man dialysiert die in der vorhergehenden Stufe erhaltene Lösung in einem NOJAX 40-Schlauch mit einer Membran auf der Grundlage von Cellulose mit einer Porosität von 24 Å während 24 Stunden gegen ultragereinigtes Wasser (1 Volumen der Lösung/6 Volumen Wasser, welches nach 2 Stunden, 8 Stunden und 16 Stunden erneuert wird). Diese Maßnahme ermöglicht die Entfernung der in dem Kulturmedium vorhandenen kleinen Moleküle, wie Salze, Zucker, Aminosäuren, Oligonucleotide und Oligopeptide.
- Man gibt zu 1 Volumen der dialysierten Lösung 0,5 M NaCl und 4 Volumen Ethanol. Man läßt den Niederschlag sich während 5 Minuten bei Raumtemperatur bilden. Dann zentrifugiert man während 20 Minuten bei 5.000 g. Man nimmt die Zentrifugenrückstände in Ethanol auf, rührt die erhaltene Suspension und läßt während 1 Stunde bei Raumtemperatur absitzen. Man wiederholt diese Maßnahmen des Zentrifugierens und des Absitzenlassens. Dann zentrifugiert man erneut während 20 Minuten bei 5.000 g. Man trocknet die erhaltenen Zentrifugenrückstände im Vakuumofen während 24 Stunden bei 40ºC.
- Man vermahlt die trockenen Zentrifugenrückstände mit Hilfe eines Mörsers unter wasserfreien Bedingungen.
- Man nimmt die vermahlenen Zentrifugenrückstände in einem Puffer, der als Puffer D bezeichnet wird, der Zusammensetzung Tris-HCl 20 mM pH 7,5, in einer Menge von 100 ml/g auf. Man chromatographiert die erhaltene Lösung über eine starke Anionenaustauschersäule, welche eine mit quaternären Ammoniumgruppen vernetzte Agarosematrlx umfaßt ("Q-Sepharose Fast Flow" von Pharmacia ), welche zuvor mit dem Puffer D äquilibriert worden ist, in einer Menge von 50 ml des Gels pro g des Pulvers. Man wäscht das Gel mit einer ausreichenden Menge des Puffers D, um auf die Grundlinie des UV-Nachweises bei 214 nm zu kommen, und dann mit einer 25 mM Piperazinlösung, deren pH-Wert auf 3,5 eingestellt worden ist. Man eluiert mit einer Lösung mit einem pH-Wert von 3,5 der folgenden Zusammensetzung: 0,5 M NaCl und 25 mM Piperazin. Das Eluat wird mit Hilfe einer 5 M NaOH-Lösung neutralisiert.
- Man wiederholt die in den obigen Stufen c und d beschriebenen Maßnahmen ohne die Zugabe von Natriumchlorid.
- Man bezeichnet das am Ende der Stufe f erhaltene N-Acetylheparosan als Charge A.
- Eine Variante des Reinigungsverfahrens besteht darin, nacheinander die Stufen a, c, b, d. e und f durchzuführen. Das in dieser Weise erhaltene N-Acetylheparosan wird als Charge B bezeichnet.
- Man vergleicht die Protonen- und ¹³C-Kohlenstoff-NMR-Spektren mit jenen von N-Acetylheparosan&sub1; die von W.F. Vann (Eur. J. Biochem. 116 (1981), 59-364) beschrieben worden sind.
- Die Untersuchung der mit dem N-Acetylheparosan der Charge A und der Charge B erhaltenen Spektren bestätigt die chemische Identität des Produkts mit dem von W.F. Vann beschriebenen N-Acetylheparosan. Es handelt sich um Polymerketten, die aus sich wiederholenden β-D-Glucuronyl-1,4-a-N-acetyl-D-glucosaminyl- (1,4)-Strukturen gebildet sind.
- Man bestimmt die Verteilung der Molekülmassen durch Ausschluß-HPLC unter Anwendung der folgenden Bedingungen:
- Säule aus Siliciumdioxidkügelchen mit einem Durchmesser von 10 µm und einer Porosität von 250 Å.
- Elutionsmittel: Wäßrige 0,5 M Natriumsulfatlösung
- Durchsatz: 1 ml/min.
- Nachweis UV bei λ = 205 nm.
- Die Eichung erfolgt mit Hilfe eines Spektrums von von Heparin abgeleiteten Oligosacchariden mit den folgenden Molekülmassen: 1324, 1883, 2436, 3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150, 6671, 7542, 8655, 10088, 11561, 12950, 14809, 17387 und 22674 Da.
- Wegen dieses Bereichs des Eichstandards werden lediglich Molekülmassen zwischen 934 Da und 56703 Da berücksichtigt. Es ist festzustellen, daß die nachgewiesene optische Dichte proportional ist der N-Acetylheparosanmenge. Insgesamt gesehen verringert sich die Genauigkeit der Methode exponentiell für die hohen Molekülmassen und insbesondere Jene oberhalb 20000 Da.
- Das Elutionsprofil der Ausschlußchromatographie der Charge A ist in der Fig. 1 dargestellt. Aus der Fig. 1 ist zu ersehen, daß die Verteilung polydispers ist und daß sie eine Hauptbande bei etwa 4700 Da umfaßt. Ein Gewichtsanteil vo minde stens 70 % der Charge A besitzt eine Masse zwischen 1700 und 8000 Da.
- Man erhält ein sehr ähnliches Chromatogramm bei der Analyse der Charge B. Die Hauptbande der Verteilung liegt bei etwa 5000 Da. Ein Gewichtsanteil von mindestens 70% der Charge B besitzt eine Molekülmasse zwischen 1500 und 8000 Da.
- Man unterwirft diese zu analysierenden Proben sowie einen Marker zur Bestimmung des Endes der Wanderung auf der Grundlage von Bromphenol einer Elektrophorese in einem Tris-Boran-Puffer in einem 15 %-igen Polyacrylamidgel, welches man durch Polymerisation einer Mischung aus 29 Teilen Acrylamid und 1 Teil N,N'-Methylen-bisacrylamid erhalten. Man bewirkt die Wanderung während etwa 4 Stunden auf einem Gel mit einer Länge von 18 cm3 bei 40 mA bis zum Auftreten des Markers am Ende der Wanderungsstrecke. Das Gel wird dann mit Alcyanblau und schließlich mit Silber nach der Methode von S. Pelkonen et al. (J. Bact. 170, 6 (1983), 2646) gefärbt, was für die sauren Polysaccharide spezifisch ist.
- Dieser Elektrophoreseanalyse wurde das teilweise gereinigte Produkt, das am Ende der Stufe a erhalten wurde, und das gereinigte Produkt der Charge A oder der Charge B, welches am Ende der letzten Stufe erhalten wurde, mit dem Ziel unterworfen festzustellen, ob sich eine wesentliche Veränderung der Molekülmassenverteilung des N-Acetylheparosans im Verlaufe der Reinigung ergibt.
- Die Untersuchung der für das teilweise gereinigte, am Ende der Stufe a erhaltene Produkt und das gereinigte Produkt am Ende der letzten Stufe (Charge A oder Charge B) zeigt keinerlei Anzeichen von wesentlichen Unterschieden (Anwesenheit von Banden mit vergleichbarer Intensität bei gleichen Wanderungsstrecken). Es ergibt sich somit keine wesentliche Modifizierung der Molekülmassenverteilung des N-Acetylheparosans im Verlaufe seiner Reinigung.
- Man bestimmt die Menge Uronsäure pro Masseneinheit des gereinigten Produ kts (Charge A oder Charge B), das man am Ende der letzten Stufe erhalten hat, colorimetrisch nach der von T. Bitter beschriebenen Methode (Analytical Biochemistry 4 (1962), 330-334). Diese Bestimmungsmethode beruht auf der Reaktion der Glykosaminoglykane mit Carbazol in warm-saurem Medium, was zu einer rosafarbenen Färbung führt, welche proportional ist der Menge der freigesetzten Uronsäure.
- Für die Charge A, das am Ende der Stufe d erhaltene teilweise gereinigte Produkt und das gereinigte Produkt, das man am Ende der letzten Stufen ferhält, ergibt sich ein Uronsäuregehalt von 1,3 bzw. 2,1 µMol/mg.
- Für die Charge B, das Produkt das man am Ende der Stufe a erhält, ergibt sich ebenfalls ein Uronsäuregehalt von 2,1 µMol/mg.
- Man löst das gereinigte Produkt (Charge A) in ultragereinigtern Wasser und bringt die erhaltene Lösung (C = 1 mg/ml) in eine Küvette mit einer optischen Dicke von 1 cm ein. Man zeichnet das Absorptionsspektrum zwischen 200 und 600 nm auf.
- Das erhaltene Spektrum ermöglicht, insbesondere auf der Grundlage der Absorption bei 256 nm, daß die Charge A weniger als 1 % DNA enthält.
- Man verwendet das Kit "Protein Assay", das von der Firma BIORAD vertrieben wird, zur Bestimmung der gesamten Proteine. Die Bestimmungsmethode beruht auf der Tatsache, daß die maximale Wellenlänge der Absorption einer Lösung von Coomassie g-250-Brillantblau sich von 465 nm zu 595 nm verschiebt, wenn Proteine daran gebunden werden (Reisner et al., Anal. Biochem. 64 (1975), 509). Der Gesamtgehalt der Proteine der Charge A beträgt weniger als 1,5 %.
- Diese Bestimmung erfolgt nach der von Zensaku Yosizawa et al. in Biochimica and Biophysica Acta, 141 (1967), 358-365 beschriebenen Methode.
- Der Parameter des NH&sub2;-Anteils (ausgedrückt in µMol/mg) ist ein Indikator für die Mengen der desacetylierten und verunreinigenden β-D-Glucuronyl-1,4-α-N- acetyl-D-glucosaminyl-(1,4)-Einheiten, welche eine freie Aminogruppe enthalten.
- Die Charge A und die Charge B besitzen jeweils einen NH&sub2;-Gehalt von 0,05 µMol/mg. Das Verhältnis NR&sub2;/Glucuronsäure = 0,05/2,1 ist kleiner als 2,5 %. Es sind somit (in Mol angegeben) pro 100 β-D-Glucuronyl-1,4-o-N-acetyl-glucosaminyl-(1,4)-Einheiten weniger als 2,5 desacetylierte Disaccharideinheiten dieses Typs vorhanden.
- Man bewirkt das Züchten des Stammes Escherichia coli SEBR 3282 und die Abtrennung des N-Acetylheparosan enthaltenden Filtrats nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode.
- Man unterwirft 375 ml des Filtrats einer Dialyse nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekülmasse, Stufe b]. Nach der Dialyse erhält man etwa 1020 ml einer gereinigten Lösung.
- Man gibt zu der dialysierten Lösung eine ausreichende Menge einer 5N HCl- Lösung zur Einstellung eines pH-Werts von 3,5. Dann entfernt man den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren und säuert die Lösungmit dergleichen Säure (5N HCl) auf einen pH-Wert von 1,8 an. Es bildet sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt wird. Anschließend neutralisiert man die Lösung mit einer 5N NaOH-Lösung.
- Man gibt zu der neutralisierten Lösung eine geeignete Menge Natriumchlorid zur Bildung einer 0,5 M NaCl-Lösung und gibt dann 4 Volumen Ethanol zu. Man läßt den Niederschlag sich während 5 Minuten bei Raumtemperatur bilden. Dann zentrifugiert man während 20 Minuten bei 5000 g. Man nimmt die Zentrifugenrückstände mit Ethanol auf, rührt die erhaltene Suspension und läßt sie während 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Man wiederholt die Maßnahmen des Zentrifugierens und Suspendierens. Man zentrifugiert erneut bei 5000 g während 20 Minuten und trocknet die erhaltenen Zentrifuge nrückstände in einem Vakuumofen während 24 Stunden bei 40ºC.
- Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt nach dem Trocknen in einer 0,25N NaOH-Lösung zur Bildung einer 2,5 %-igen Lösung (Gew./Voi.). Man hält die in dieser Weise erhaltene Lösung während 2 Stunden bei 50ºC, neutra lisiert anschließend mit einer 5N HCl-Lösung und unterwirft anschließend die das Polysaccharid enthaltende Lösung einer Dialyse nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekülmasse, Stufe b].
- Nach der Dialyse erhält man etwa 990 ml Lösung.
- Zu der dialysierten Lösung gibt man geeignete Mengen Piperazin, EDTA und Triton X-100 (Prolabo ), so daß man Piperazin in einer Konzentration von 25 mM, EDTA in einer Konzentration von 2 mM und Triton X-100 in einer Konzentration von 0,2 % (Vol./Vol.) erhält. Anschließend stellt man den pH-Wert mit Hilfe einer 5N HCl-Lösung auf 3,5 ein. Man trägt diese Lösung auf eine Q-Sepharose Fast Flow- Säule von 400 ml auf, welche mit einem Piperazinpuffer, der 25 mM Piperazin, 2 mM EDTA und 0,2 mM Triton X-100 (pH = 3,5) enthält, äquilibriert worden ist. Man wäscht mit dem Piperazinpuffer, eluiert mit einer 0,5 M NaCl-Lösung und fällt dann mit 4 Volumen Ethanol aus. Man trocknet im Vakuum bei 40ºC und erhält in dieser Weise etwa 9,85 g N-Acetylheparosan.
- Man löst 4 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produkts in 60 ml einer Pufferlösung der Zusammensetzung 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 1 M NaCl und führt es dann über einer mit 200 ml Octyl-Sepharose beschickten Säule, die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Zu der nicht zurückgehaltenen Fraktion gibt man 4 Volumen Ethanol. Man wäscht den gebildeten Niederschlag und trocknet ihn bei 40ºC im Vakuum.
- Man erhält in dieser Weise 3,90 g N-Acetylheparosan.
- Die mit diesem N-Acetylheparosan erhaltenen Protonen- und ¹³C-Kohlenstoff-NMR-Spektren bestätigen die chemische Identität des Produkts mit dem von W.F. Vann (Eur. J. Biochem. 116 (1981), 59-364) beschriebenen N-Acetylhepärosan.
- Man bestimmt die Molekülmassenverteilung durch Ausschluß-HPLC nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode zur Bestimmung der Verteilung der Molekülmassen von N-Acetylheparosanen. Ein Gewichts anteil von mindestens 86 % der Ketten, welche die nach Beispiel 2 erhaltene Charge bilden, besitzt eine Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da.
- Das am Ende der Stufe e erhaltene N-Acetylheparosan besitzt einen Uronsäuregeh alt von 1,94 µMol/mg.
- Das erhaltene Spektrum ermöglicht die Feststellung, daß das erhaltene N- Acetylheparosan weniger als 1 % DNA enthält.
- Der Anteil der gesamten Proteine in dieser N-Acetylheparosan-Charge beträgt weniger als 1 %.
- Der NH&sub2;-Gehalt ist kleiner als 0,1 µMol/mg.
- Man bewirkt die Kultur des Stammes Escherichia coli SEBR 3282 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Man erhält etwa 12 Liter der Kultur, welche N- Acetylheparosan enthält.
- Am Ende des Züchtungsvorgangs zentrifugiert man die erhaltene Suspension (12 Liter) während 20 Minuten bei 8000 t/min (d.h. zwischen 11.000 und 14.000 g).
- Nach dem Zentrifugieren beseitigt man den Zentrifugenrückstand und bringt die überstehende Flüssigkeit mit einer 0,1N NaOH-Lösung während etwa 1 Stunde in Kontakt.
- Man unterzieht die in der vorhergehenden Stufe erhaltene Lösung einer Vorfiltration über einen Polypropylenfilter 3M Serie 300.
- Man engt das am Ende der Stufe c erhaltene Filtrat auf einer Kartusche mit Hohlfasern Amicon mit einer Abtrennschwelle von 10000 Da oder einem äquivalenten Wert auf. Man erhält in dieser Weise eine an N-Acetylheparosan mit niedriger Molekülmasse angereicherte Lösung.
- Man dialysiert die an N-Acetylheparosan niedriger Molekülmasse angereicherte Lösung gegen ultragereinigtes Wasser auf dem System Amicon bei einem sehr hohen Verdünnungsfaktor (> 10.000).
- Man verfährt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekularmasse, Stufe c - Stufe f] und erhält ein N-Acetylheparosan mit ähnlichen Eigenschaften wie jenen der Charge A oder wie es in Beispiel 2 angegeben ist [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekülmasse, Stufe a - Stufe f].
- Man löst 500 mg der Charge B in 10 ml einer 1N NaOH-Lösung. Man erhitzt die Lösung auf 50ºC und läßt unter Rühren während 8 Stunden bei dieser Temperatur reagieren. Dann neutralisiert man die Lösung mit einer 2N HCl-Lösung, dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und gefriergetrocknet das Material.
- Man nimmt das in der vorhergehenden Stufe erhaltene gefriergetrocknete Material mit 20 ml ultragereinigtem Wasser auf. Man trägt die erhaltene Lösung auf eine Ionenaustauschersäule auf der Grundlage von mit Divinylbenzol vernetztem Polystyrol (Dowex 50 W 8 der Firma Dow Chemical ) auf, welche zuvor in saurem Medium konditioniert worden ist, um die Säureform des Produkts zu regenerieren. Man vermischt die Lösung dann mit 0,4 ml einer 40 %-igen Tetrabutylammoniumlösung und führt eine Gefriertrocknung durch.
- Man löst 421 mg des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Salzes in 35 ml Dimethylformamid und gibt 3,71 g des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes (vertyleben von Aldrich unter der Bezeichnung S755-6) zu. Man läßt unter Rühren während 6 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Dann gibt man zu einem Volumen des Reaktionsmediums Natriumchlorid bis zum Erhalt einer Lösung mit einer Kon zentration von 0,33 M Natriumchlorid und dann 2 Volumen Ethanol. Man läßt den Niederschlag sich bilden, zentrifugiert und entfernt die überstehende Flüssigkeit. Man nimmt den Zentrifugenrückstand mit einer 0,5 M NaCl-Lösung auf und neutralisiert. Dann gibt man 2 Volumen Ethanol zu. Man läßt den Niederschlag sich bilden, zentrifugiert ihn und nimmt den Zentrifugenrückstand mit ultragereinigtem Wasser auf. Man dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet.
- Man wiederholt die in dem obigen Absatz beschriebenen Maßnahmen erneut. Das erhaltene gefriergetrocknete Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften:
- * Uronsäuregehalt: 1,11 µMol/mg
- * Gehalt an freiem NH&sub2; : 0,01 µMol/mg
- * Sulfatgierungsgrad: 2,64 pro Disaccharideinheit
- Man mißt die Gehalte an Uronsäure und NH&sub2; wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Der Sulfatierungsgrad, der auch als Sulfatlcarboxyl-Verhältnis bezeichnet wird, ist die mittlere Anzahl der Sulfatgruppen pro Carboxylgruppe. Er wird mit Hilfe der konduktimetrischen Methode der Bestimmung der Sulfatgruppe und der Carboxylgruppe gemessen, die von B. Casu et al. in Carbohydrate Research 39 (1975), 168-176 beschrieben worden ist.
- Man teilt die Charge A in drei aliquote Anteile, die als Charge A1, Charge A2 und Charge A3 bezeichnet werden.
- Man behandelt die Chargen A1, A2 und A3 in der bezüglich der Stufe a für die Charge B oben beschriebenen Weise, wobei der einzige Unterschied darin besteht, daß die Charge A1 dialysiert und gefriergetrocknet wird. Die ChargenalA1, A2 und A3 werden anschließend durch Gelfiltration fraktioniert (die auch als Gelpermeationschromatographie oder Ausschlußchromatographie bezeichnet wird) unter Anwendung der folgenden Bedingungen:
- Träger in Form von Kügelchen mit Durchmessern von 25 - 75 µm auf der Grundlage von mit N,N'-Methylen-bisacrylamid vernetztem Allyldextran (Sephacryl S300 HR, vertrieben von Pharmacia ). Verwendetes Elutionsmittel: 0,5 M NaCl-Lösung.
- Man bildet Mischungen von Fraktionen, die einem Kav von 0,46 bis 1 entsprechen, bezüglich des Heparosans, das aus der Charge A1 gewonnen worden ist, von 0,43 bis 1 für das Heparosan, das aus der Charge A2 gewonnen worden ist, und von 0,43 bis 0,64 für das Heparosan, das aus der Charge A3 gewonnen worden ist. Diese Fraktionen werden im folgenden als "gelfiltrierte Heparosane" bezeichnet.
- Kav ist ein Koeffizient, der üblicherweise in der Ausschlußchromatographie verwendet wird und der es ermöglicht, die Fraktionierung durch Ausschlußchromatographie zu reproduzieren. Sein Wert ist durch die folgende Formel definiert:
- Kav = Ve - V/ Vo - Vt
- in der Ve = Elutionsvolumen der in Rede stehenden Fraktion
- Vo = Ausschlußvolumen
- Vt = Gesamtvolumend des Gels.
- Man bestimmt die Molekülmassenverteilung des aus der Charge A1 gewonnenen Heparosans unmittelbar nach der teilweisen Desacetylierung ebenso wie die der gelfiltrierten Heparosane, die aus den Chargen A1, A2 und A3 gewonnen worden sind, durch Ausschlußchromatographie nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode.
- Die vor und nach der Gelfiltration des aus der Charge Al erhaltenen Heparosans erhaltenen Elutionsprofile sind in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellt. Einige von den Elutionsprofilen abgeleitete Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt, in der PMo für eine solche Molekülmasse steht, daß ein Gewichtsanteil von 1 % des Produkts eine Molekülmasse von größer als PMo besitzt, PM&sub1; die Molekülmasse darstellt, daß ein Gewichtsanteil von 10 % des Produkts eine Molekülmasse von oberhalb PM&sub1; aufweist, PM&sub3; eine solche Molekülmasse darstellt, daß ein Gewichtsanteil von 10 % des Produkts eine Molekülmasse von weniger als PM&sub3; aufweist und PM&sub2; die Molekülmasse darstellt, die dem Maximum der Absorption entspricht. TABELLE III Verteilung der Molekülmassen des aus der Charge A1 (nicht gelfiltriert) gewonnenen Heparosans und der gelfiltrierten Heparosane, die aus den Chargen A1, A2 und A3 erhalten worden sind
- Wenn man die Fig. 2 und 3 vergleicht. so ist festzustellen, daß die Gelfiltration es ermöglicht, die als kleineren Anteil vorhandene Fraktion des Heparosans mit hoher Molekülmasse zu entfernen.
- Dieses Ergebnis ergibt sich klar aus der Tabelle III, aus der eine starkeverringerung des PMo als Folge der Gelfiltrationsmaßnahme abzulesen ist. Das Heparosan einer jeden der Chargen enthält mindestens 90 Massen-% Ketten mit Molekülmassen von weniger als 7000 Da.
- Die aus den Chargen A1 und A2 erhaltenen gelfiltrierten Heparosane werden anschließend nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans, das überwiegend eine niedrige Molekülmasse aufweist, Stufe c].
- Das aus der Charge A3 gewonnene gelfiltrierte Heparosan wird nicht ausgefällt, sondern gegen ultragereinigtes Wasser dialysiert.
- Man mißt den Uronsäuregehalt und den der freien Aminogruppen nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV aufgeführt. Der restliche Acetylgruppengehalt wurde unter Berücksichtigung der Tatsache festgestellt, daß ebenso viel Glucuronylgruppen wie Glucosaminylgruppen vorhanden sind.
- Der Desacetylierungsgrad wurde unter der Annahme berechnet, daß er gleich ist dem Verhältnis der Mengen der freien Aminogruppen zu dem Uronsäuregehalt.
- Die Untersuchung des protonenkernmagnetischen Resonanzspektrums des aus der Charge A3 erhaltenen gelfutrierten Heparosans ermöglicht die Feststellung, daß das Produkt die erwartete Struktur besitzt.
- Der durch Integrierung berechnete Desacetylierungsgrad hat sich ebenfalls mit 44 % ergeben. Dieser Wert ist nahe demjenigen. den man berechnet unter Verwendung des Verhältnisses von freien Aminogruppen bezogen auf den Uronsäuregehalt (41%). TABELLE IV Eigenschaften des aus den Chargen A1, A2 und A3 gewonnenen gelfiltrierten Heparosane
- Man behandelt die aus den Chargen A1, A2 und A3 gewonnenen gelfiltrierten Heparosane, die in der oben beschriebenen Weise, wie es für die Charge B beschrieben worden ist, desacetyliert worden sind (Stufe c - teilweise N,O-Sulfatierung), mit dem Unterschied, daß man die in dem ersten Abschnitt beschriebenen Maßnahmen nicht wiederholt.
- Man nimmt den Zentrifugenrückstand des aus der Charge A3 gewonnenen Heparosans nach der ersten Ausfällung in ultragereinigtem Wasser auf, dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und beläßt in Lösung.
- Die Eigenschaften der N,O-sulfatierten Produkte sind in der nachfolgenden Tabelle V aufgeführt: TABELLE V Eigenschaften der aus den Chargen Al1, A2 und A3 gewonnenen N,O-sulfatierten Heparosane am Ende der teilweisen N,O-Sulfatierungsreaktion
- Es ist festzuhalten, daß der restliche Anteil der NH&sub2;-Gruppen nach der N,O Sulfatierungsreaktion (0,10 µMol/mg) größer ist als der der gereinigten N-Acetylheparosane (0,05 µMol/mg). Die Sulfatierung ist daher am Stickstoffatom nicht vollständig.
- Man vermischt 1 Gew.-Teil des N,O-sulfatierten Produkts, 1 Gew.-Teil Natriumbicarbonat, 1 Gew.-Teil des Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes mit 1 g des eingesetzten des N,O-sulfatierten Produkts in einem Volumen von 20 ml ultragereinigten Wassers und läßt unter Rühren während 20 Stunden bei 55ºC reagieren. Anschließend verdünnt man die Reaktionsmischung (Verdünnungsfaktor 10) und stellt die Leitfähigkeit der erhaltenen Lösung aufjene einer 0,5 M Natriumchloridlösung ein. Anschließend bewirkt man eine Ausfällung durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol, eine Zentrifugierung gefolgt von einer Wiederaufnahme der Zentrifugenrückstände mit einer 0,5 M NaCl-Lösung und dann eine zweite Ausfällung durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol. Nach der Wiederaufnahme in ultragereinigtem Wasser und Dialyse gegen ultragereinigtes Wasser gefriertrocknet man die Produkte und trocknet sie bei 40ºC im Vakuum.
- Die Untersuchung des ¹³C-NMR-Spektrums des aus der Charge A3 gewonnenen N,O-sulfatierten Heparosans zeigt, daß bei dieser Verbindung die Alkoholgruppe in der 6-Stellung des Glucosaminylrests vollständig in Form des Schwefelsäureesters vorliegt.
- Einige Eigenschaften der erhaltenen N,O-sulfatierten Heparosane, die mit Hilfe der oben beschriebenen Methoden ermittelt worden sind, sind in der nachfolgenden Tabelle VI zusammengestellt: TABELLE VI Eigenschaften der nach der vollständigen N-Sulfatierung erhaltenen Produkte ausgehend von den Chargen A1, A2 und A3
- Es ist festzuhalten, daß der Gehalt an restlichem NH&sub2; (0,02 µMol/mg) niedrig ist und geringer ist als der des gereinigten N-Acetylheparosans (0,05 µMol/mg für die Charge A und die Charge B), sowie der des N,O-sulfatierten Heparosans. das bei der teilweisen N,O-Sulfatierung erhalten worden ist (siehe genauer die Tabelle V). Dies verdeutlicht die Vollständigkeit der N-Sulfatierungsreaktion.
- Die Molekulargewichtsverteilung der nach der N-Sulfatierung erhaltenen Produkte wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode analysiert.
- Das für das aus der Charge A1 gewonnene Produkt erhaltene Elutionsprofil ist in der Fig. 4 dargestellt. Man erhält sehr ähnliche Elutionsprofile für die aus den Chargen A2 und A3 gewonnenen Produkte.
- Einige aus den Elutionsprofilen abgeleitete Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VII aufgeführt. Die Definition von PMo, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch mit der für die Tabelle III angegebenen. TABELLE VII Molekularmassenverteilung der nach der totalen N-Sulfatierung erhaltenen Produkte ausgehend von den Chargen A1, A2 und A3
- Das N,O-sulfatierte Heparosan einer Jeden dieser Chargen enthält mindestens 90 Massen-% Ketten mit Molekülmassen von weniger als 10000 Da.
- In der Tat enthalten die Chargen A1, A2 und A3 80 % Ketten mit Molekülmassen zwischen 2600 Da und 9000 Da, 3400 und 10000 Da bzw. 1800 und 7600 Da.
- Das verwendete N-Acetylheparosan wurde nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellt. Der Uronsäuregehait dieses Produkts beträgt 2,12 µMol/mg. Die Bestimmung der Molekülmassenverteilung wurde durch Ausschlußchromatographie nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode bestimmt. Ein Gewichtsanteil von mindestens 87,5 % des Materials besitzt Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 15000 Da. Die Hauptbande der Verteilung liegt bei etwa 4900 Da. Diese Charge des N-Acetylheparosans wird als Charge C bezeichnet.
- Man löst 2,5 der Charge C in 50 ml einer 2N NaOH-Lösung. Dann erhitzt man die Lösung auf 50ºC und läßt während 8 Stunden unter Rühren bei dieser Temperatur reagieren. Dann stellt man den pH-Wert mit einer 2N HCl-Lösung auf 8, dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet das Material.
- Man erhält in dieser Weise 1,96 g des Produkts.
- Die Bestimmung der freien Aminogruppen (NH&sub2;) weist darauf hin, daß das N- Acetylheparosan zu 80 % N-desacetyliert worden ist.
- Man nimmt das obige gefriergetrocknete Material in 70 ml Wasser auf und gibt 2,5 g Na&sub2;CO&sub3; und 2,5 g des Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes zu. Man läßt während 20 Stunden bei 55ºC reagieren.
- Man stellt dann die Leitfähigkeit der Reaktionslösung durch Zugabe von entmineralisiertem Wasser auf die einer 0,5 M NaCl-Lösung ein. Man fällt mit 4 Volumen Ethanol aus, zentrifugiert, löst den Niederschlag erneut in einer 0,5 M NaCl-Lösung, fällt mit 4 Volumen Ethanol aus und zentrifugiert.
- Man nimmt den Zentrifugenrückstand mit ultragereinigtem Wasser auf, dialysiert diese Lösung nach der bereits beschriebenen Verfahrensweise (Beispiel 1) und gefriertrocknet.
- Man erhält etwa 2 g des Produkts.
- Man wandelt das in der vorhergehenden Stufe erhaltenen gefriergetrocknete Material nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren [1) Chemische Modifizierungen der Charge B, Stufe b] in das Tetrabutylammoniumsalz um.
- Man erhält 2,7 g des Salzes.
- Man löst 2,680 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Salzes in 196 ml Formamid und gibt 11,27 g des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes zu. Man läßt während 6 Stunden unter Rühren bei 30ºC reagieren. Dann gibt man 1 Volumen einer 2 M NaCl-Lösung aufs Volumen der Reaktionslösung zu und stellt den pH-Wert mit einer NaOH-Lösung auf 7 ein. Man fällt erneut mit 2 Volumen Ethanol aus, zentrifugiert und löst den Zentrifugenrückstand in einer 0,5 M NaCl-Lösung. Anschließend gibt man 2 Volumen Ethanol zu. Man läßt den Niederschlag sich bilden, zentrifugiert und nimmt den Zentrifugenrückstand mit 80 ml ultragereinigtem Wasser auf. Man gibt 20 ml einer 2 M NaCl-Lösung und dann 4 Volumen Ethanol zu. Man läßt den Niederschlag sich bilden und zentrifugiert.
- Man nimmt das in der Stufe d erhaltene Produkt mit ultragereinigtem Wasser auf und fraktioniert durch Geifiltration unter Anwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen [2) Chemische Modifizierungen der Charge A, Stufe al. Man bestimmt die Molekülmassen der Ketten, welche die N,O-sulfatierte Heparosan-Zubereitung bilden durch Ausschlußchromatographie nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Man bildet einerseits Fraktionen, die Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 12000 Da enthalten [Lösung C (A)l und andererseits Fraktionen, die N,O-sulfatierte Heparosane enthalten, welche aus Ketten mit Molekülmassen von 200 bis 30000 Da gebildet worden sind [Lösung C(M)].
- Zu der Lösung C(A) gibt man 4 Volumen Ethanol. Man läßt den Niederschlag sich bilden, zentrifugiert ihn und nimmt den Zentrifugenrückstand mit ultragereinigtem Wasser auf, dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet.
- Man erhält 1,8 g des Produkts.
- Das in dieser Weise erhaltene N,O-sulfatierte Heparosan wird als Charge C 1 bezeichnet.
- Bestimmte Eigenschaften dieses N,O-sulfatierten Heparosans, die nach den oben beschriebenen Methoden bestimmt worden sind, sind in der nachfolgenden Tabelle VIII aufgeführt. TABELLE VIII Eigenschaften des Produkts, das der Charge C1 entspricht
- Man bestimmt die Molekulargewichtsverteilung des Produkts nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Einige aus dem Elutionsprofil abgeleitete Ergebnisse sind in der Tabelle IX aufgeführt. TABELLE IX Molekülmassenverteilung des der Charge C1 entsprechenden Produkts
- Die Definition von PMo, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch mit der bezüglich der Tabelle III angegebenen.
- Das N,O-sulfatierte Heparosan der Charge C 1 enthält 95 Massen-% von Ketten zwischen 1500 und 15000 Da.
- Man erzeugt die Protonen- und ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektren mit dem N,O-sulfatierten Heparosan der Charge C1 (Spektren mit AMX 500 aufgezeichnet, Lösungsmittel D&sub2;O).
- Die Untersuchung der Protonen- und ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektren bestätigt die erwartete Struktur des Produkts. Es handelt sich um ein N,O-sulfatiertes Heparosan.
- Die Untersuchung des Verhältnisses der Intensität der Protonen der Zucker, bezogen auf die Protonen der Acetylgruppen des Protonenspektrums, entspricht einem Desacetylierungsgrad von 84 %. Dieser Wert liegt in der Nähe des berechneten unter Verwendung des Verhältnisses des Anteils von freiem Aminogruppen bezogen auf den Uronsäuregehalt (80 %).
- Das ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektrum bestätigt ebenfalls, daß das Glucosamin praktisch vollständig N-sulfatiert ist. Die D-Glucuronsäure ist in den Stellungen 2 und 3 nicht sulfatiert.
- Man gibt zu der Lösung C(M) 4 Volumen Ethanol. Dann läßt man den Niederschlag sich bilden, zentrifugiert, nimmt den Zentrifugenrückstand mit ultragereinigtem Wasser auf, dialysiert und gefriertrocknet.
- Das gefriergetrocknete Material wird anschließend in einer 0,5 M NaCl-Lösung gelöst und durch Gelfiltration unter Anwendung der in der Stufe e angegebe nen Bedingungen fraktioniert.
- Man erhält einerseits Fraktionen, welche Ketten mit Molekülmassen zwischen 1300 und 21000 Da enthalten [Lösung C(B)] und andererseits solche mit 14000 bis 37000 Da [Lösung C(C)].
- Diese beiden Lösungen werden behandelt, wie es oben für die Lösung C(A) beschrieben ist, und man erhält nach der Gefriertrocknung der Lösung C(B) die Charge C2 und aus der Lösung C(C) die Charge C3.
- Die Tabelle X gibt einige Ergebnisse, die aus den Elutionsprofilen der Produkten der Charge C2 und der Charge C3 erhalten worden sind, an. TABELLE X Molekularmassenverteilung der Produkte. die den Chargen C2 und C3 entsprechen
- Die Definition von PMO, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch rnit der in Tabelle III angegebenen.
- Das der Charge C2 entsprechende N,O-sulfatierte Heparosan enthält etwa 99 Massen-% Ketten, deren Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da liegt, während das der Charge C3 entsprechende N,O-sulfatierte Heparosan etwa 73 Massen-% Ketten einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da enthält.
- Das als Ausgangsmaterial verwendete N-Acetylheparosan wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Uronsäuregehalt dieses Produkts beträgt 1,96 µMol/mg. Diese Charge wird als Charge D bezeichnet.
- Man löst 3,7 g der Charge D in 74 ml 1N NaOH und behandelt nach dem in Beispiel 5 (Stufe a) beschriebenen Verfahren. Die Desacetylierung wird unter Stickstoff durchgeführt.
- Nach der Gefriertrocknung erhält man 2,91 g des Produkts.
- Die Bestimmung der freien Aminogruppen (NH&sub2;) des nach der Gefriertrocknung erhaltenen Produkts weist darauf hin, daß das N-Acetylheparosan zu 40 % N desacetyliert worden ist.
- Das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt wurde in Gegenwart von 3,7 g Na&sub2;CO&sub3; nach der in Beispiel 5 (Stufe b) beschriebenen Verfahrensweise mit 3,7 g des Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes behandelt.
- Man erhält in dieser Weise etwa 3 g des N-sulfatierten Heparosans.
- Man wandelt etwa 2 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen N-sulfatierten Heparosans nach der in Beispiel 5 (Stufe c) beschriebenen Weise in das Tetrabutylammoniumsalz um.
- Man erhält 2,99 g des gefriergetrockneten Produkts.
- Man setzt 2,98 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Salzes unteranwendung des in Beispiel 5 (Stufe d) beschriebenen Verfahrens mit 14 g des Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes um und bewirkt dann die Ausfällungen und Reinigungen die in dem gleichen Beispiel 5 (Stufe d) beschrieben sind.
- Man erhält 2,8 des Produkts.
- Man fraktioniert das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt durch Gelfiltration unter Anwendung der Methode und der Materialien, die in Beispiel 4 beschrieben sind [2) Chemische Modifizierungen des Produkts A, Stufe a].
- Man bestimmt die Molekülmassenverteilungen der N,O-sulfatierten Heparosan-Fraktionen durch Ausschluß chromatographie nach der in Beispiel 1 beschriebebenen Methode. Man isoliert Fraktionen, die aus N,O-sulfatierten Heparosanen gebildet sind, deren Mehrzahl der Ketten ein Molekulargewicht zwischen 1500 und 15000 Da besitzt.
- Diese Fraktionen werden anschließend eingeengt und einer Dialyse gegen ultragereinigtes Wasser unterzogen. Anschließend bewirkt man eine Ausfällung durch Zugabe von 5 Volumen Ethanol, zentrifuglert, löst den Niederschlag in einer 0,5 M NaCl-Lösung und wiederholt die Maßnahme der Ausfällung.
- Das in dieser Weise erhaltene gereinigte Produkt wird einer zweiten Fraktionierung unterworfen unter Anwendung des oben zu Beginn dieser Stufe beschriebenen Verfahrens. Man bestimmt die Molekülmassenverteilung der Fraktionen durch Ausschluß chromatographie nach der bereits beschriebenen Methode. Man gewinnt Fraktionen, die Produkte mit Molekülmassen zwischen 4000 und 8000 Da enthalten.
- Die Fraktionen werden einer Dialyse unterworfen und dann mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird gewonnen und in einer 0,5 M NaCl-Lösung gelöst. Die in dieser Weise erhaltene Lösung wird gegen ultragereinigtes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet.
- Man erhält in dieser Weise etwa 1 g eines N,O-sulfatierten Heparosans, das als Charge D1 bezeichnet wird.
- Die Eigenschaften und die Molekülmassenverteilung dieses N,O-sulfatierten Heparosans sind in den nachfolgenden Tabelle XI und XII aufgeführt. TABELLE XI Eigenschaften des Produkts, das der Charge D1 entspricht TABELLE XII Molekülmassenverteilung des der Charge D1 entsprechenden Produkts
- Die Definition von PMo, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch mit der für die Tabelle III angegebenen.
- Das N,O-sulfatierte Heparosan der Charge D1 enthält 80 Massen-% Ketten zwischen 4047 und 10305 Da und etwa 98,5 Massen-% dieser Ketten besitzen eine Molekülmasse zwischen 1500 und 14600 Da. Die Ziffer 5 steht für das Elutionsprofil, welches für dieses N,O-sulfatierte Heparosan erhalten worden ist.
- Man bestimmt die Protonen- und ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektren des N,O- sulfatierten Heparosans der Charge D1 (Spektren aufgezeichnet mit AMX 500, Lösunsmittel D&sub2;O).
- Die Untersuchung der Protonen- und ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektren bestätigt die erwartete Struktur des Produkts. Es handelt sich um eine N,O-sulfatiertes Heparosan.
- Das ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektrum bestätigt insbesondere, daß keine Aminogruppe des Glucosaminrests in Form der freien Aminogruppe (NH&sub2;) vorliegt. Das Glucosamin ist in der Stellung 6 vollständig sulfatiert, während sämtliche Hydroxylgruppen der Glucuronsäure nicht sulfatiert sind.
- Man verwendet als Ausgangsmaterial eine N-Acetylheparosan-Charge, die nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellt worden ist. Diese Charge wird als Charge E bezeichnet und besitzt einen Uronsäuregehalt von 2 µMol/mg. Man bewertet die Molekulargewichtsverteilung dieses N-Acetylheparosans nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Dieses N-Acetylheparosan enthält etwa 75 Massen-% Ketten zwischen 1500 und 15000 Da und die mittlere Masse dieser Ketten beträgt etwa 10900 Da. Die Molekülmasse des überwiegenden Produkts beträgt 5135 Da.
- Man N-desacetyliert das N-Acetylheparosan zu 40 % nach der in Beispiel 6 beschriebenen Methode (Stufe a). Zur Durchführung dieser N-Desacetylierung verwendet man 2,5 g eines Ausgangsmaterials, das man in 50 ml 1N NaOH löst. Nach dem Ende der Reaktion stellt man den pH-Wert des Reaktionsmediums mit HCl auf 6 ein und engt ein.
- Die Bestimmung der freien Aminogruppen (NH&sub2;) weist daraufhin, daß das N- Acetylheparosan zu 40 % N-desacetyliert worden ist.
- Man verwendet eine Sephacryl S300 HR-Säule (5 cm³ x 100 cm), die mit 0,5 M NaCl äquilibriert worden ist.
- Man bestimmt die Verteilung der Molekülmassen des Heparosans, das in den verschiedenen Fraktionen enthalten ist, durch Ausschlußchromatographie. Man gewinnt Fraktionen, die Ketten mit einer Molekülmasse von 6000 bis 20000 Da enthält und engt im Rotationsverdampfer ein, fällt mit 4 Volumen Ethanol aus und trocknet den gebildeten Niederschlag.
- Man erhält in dieser Weise etwa 1 g des Produkts.
- Zur Bildung des Tetrabutylammoniumsalzes verwendet man 300 mg des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produkts und wendet das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren an [1) Chemische Modifizierung der Charge B, Stufe b]. Man erhält 490 mg des Salzes, welches man in 30 ml Formamid löst. Man bewirkt anschließend eine teilweise N,O-Sulfatierung nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise [1) Chemische Modifizierung der Charge B, Stufe c - erster Abschnitt].
- Ausgehend von 490 mg des Salzes, welches man mit 2,25 g des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes umsetzt, erhält man 406 mg N,O-sulfatiertes Heparosan.
- Man löst 372 mg des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produkts in 15 ml einer 5 %-igen Na&sub2;CO&sub3;-Lösung und behandelt mit 372 mg des Schwefeltrioxid- Trimethylamin-Komplexes nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode [2) Chemische Modifizierung der Charge A, Stufe c].
- Das nach der vollständigen N-Sulfatierung erhaltene Produkt wird anschließend durch Gelfiltration fraktioniert unter Anwendung einer Sephacryl 5 300 HR- Säule (2,5 cm³ x 100 cm) unter Anwendung des bereits beschriebenen Verfahrens.
- Die Fraktionen, welche eine Molekülmasse von 600 bis 20000 Da aufweisen, werden vereinigt, im Rotationsverdampfer eingeengt, extensiv gegen kaltes ultragereinigtes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
- Man erhält in dieser Weise 260 mg eines N,O-sulfatierten Heparosans, welches als Charge E1 bezeichnet wird.
- Die Eigenschaften dieses Produkts sind in der Tabelle XIII aufgeführt.
- Die Tabelle XIV zeigt die Molekülmassenverteilung der Ketten, die die Charge E1 bilden.
- Dieses N,O-sulfatierte Heparosan enthält etwa 75 Massen-% Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 15000 Da und etwa 65 Massen-% Ketten mit Molekülmassen zwischen 7700 und 15000 Da. TABELLE XIII Eigenschaften des der Charge E1 entsprechenden Produkts TABELLE XIV Molekülmassenverteilung des der Charge E1 entsprechenden Produkts
- Die Definition von PMo, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch mit der für die Tabelle III angegebenen.
- Das verwendete Ausgangsmaterial, die Charge F, ist eine Charge von N-Acetylheparosan, welches nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode hergestellt worden ist.
- Die Bestimmung der Molekülmassenverteilung der Ketten, welche diese Verbindung bilden, wurde durch Ausschluß chromatographie nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode durchgeführt.
- Die Untersuchung des Profils ermöglicht die Feststellung, daß die Charge F 92 Massen-% Ketten umfaßt, deren Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da liegt.
- Die Hauptbande liegt bei etwa 4800 Da. Ein Gewichtsanteil der Charge F von mindestens 80 % besitzt eine Molekülmasse zwischen 2400 und 10000 Da.
- Der Uronsäuregehalt dieses Produkts beträgt 2,4 µMol/mg.
- Man verfährt nach der in Beispiel 5 (Stufe a) beschriebenen Weise unter Anwendung von 2,5 g der Charge F und von 50 ml 2N NaOH.
- Man erhält 1,6 g des zu 80 % N-desacetylierten Produkts.
- Der Prozentsatz der N-Desacetylierung wurde durch Bestimmung der freien Aminogruppen bewertet.
- Diese beiden Stufen sind identisch mit den Stufe b und c des Beispiels 5.
- Man erhält 4,7 g des Tetrabutyiammoniumsalzes.
- Man löst 2,9 g des in der obigen Weise erhaltenen Salzes in 290 ml Formamid und gibt 17,4 g des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes zu.
- Man verfährt nach der in Beispiel 5, Stufe d, beschriebenen Weise.
- Man löst den Zentrifugenrückstand nach der zweiten Zentrifugierung in ultragereinigtem Wasser, dialysiert ihn gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet.
- Man erhält in dieser Weise 3,68 g des Produkts.
- Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in einer 0,5 M NaCl-Lösung und trägt es dann auf eine Sephacryl S300 HR-Säule auf. die mit 0,5 M NaCl äquilibriert worden ist. Man fängt das Eluat in einem Fraktionssammler auf. Die Fraktionen, die eine Molekülmasse zwischen 1400 Da und 10000 Da aufweisen, werden gesammelt und im Rotationsverdampfer eingeengt. Man fällt mit 4 Volumen Ethanol aus, zentrifugiert und nimmt den Rückstand mit ultragereinigtem Wasser auf, dialysiert die in dieser Weise erhaltene Lösung ausschließlich gegen ultragereinigtes Wasser, gefriertrocknet und trocknet.
- Man erhält in dieser Weise 1,6 g eines N,O-sulfatierten Heparosans, welches als Charge F1 bezeichnet wird.
- Die Fraktionen, welche Molekülmassen zwischen 5000 Da und 35000 Da entsprechen, werden vereinigt, im Rotationsverdampfer eingeengt, worauf die in dieser Weise erhaltene Lösung mit 4 Volumen Ethanol versetzt wird. Man zentrifugiert. nimmt den Niederschlag mit Wasser auf, dialysiert die in dieser Weise erhaltene Lösung gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet. Das gefriergetrocknete Material wird einer erneuten Fraktionierung nach der oben zu Beginn dieser Stufe beschriebenen Methode unterworfen.
- Man bestimmt die Molekülmassenverteilung der verschiedenen Fraktionen durch Ausschlußchromatographie nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Man vereinigt die Fraktionen, welche N,O-sulfatierte Heparosane mit einer Molekülmasse zwischen 2000 und 26000 Da enthalten. Man fällt mit 4 Volumen Ethanol aus, zentrifugiert, löst den Zentrifugenrückstand erneut in destilliertem Wasser, dialysiert und gefriertrocknet. Man erhält in dieser Weise 0,6 g eines N,O-sulfatierten Heparosans, welches als Charge F2 bezeichnet wird.
- Die Eigenschaften der Chargen F1 und F2 sind in der Tabelle XV aufgeführt. Die aus den Elutionsprofilen abgeleiteten Ergebnisse sind in der Tabelle XVI zusammengestellt. TABELLE XIV Eigenschaften der den Chargen F1 und F2 entsprechenden N,O-sulfatierten Heparosane TABELLE XVI Molekülmassenverteilung der den Chargen F1 und F2 entsprechenden Produkte
- Die Definition von PMo, PM&sub1;, PM&sub2; und PM&sub3; ist identisch mit der für die Tabelle III angegebenen.
- Das N,O-sulfatierte Heparosan der Charge F1 enthält etwa 99 Massen-% Ketten mit Molekülmassen zwischen 1500 und 15000 Da und die der Charge F2 enthält etwa 84,6 Massen-% Ketten mit Molekülmassen von 1500 bis 15000 Da und etwa 70 Massen-% Ketten mit Molekülmassen von 6900 bis 13500 Da.
- Man bestimmt die Protonen- und ¹³-C-Kohlenstoff-NMR-Spektren des N,O- sulfatierten Heparosans der Charge F1 (Spektren mit AMX 500 aufgezeichnet, Lösungsmittel D&sub2;O).
- Die Untersuchung des Protonenspektrums und insbesondere das Intensitätsverhältnis der Protonen der Zucker zu den Protonen der desacetyliertenaminogruppen führt zu etwa 20 % N-acetylierten Glucosamineinheiten.
- Die Untersuchung des ¹³-C-Spektrums bestätigt, daß die Glucosamineinheit N-sulfatiert ist. Die Glucuronsäure ist in der Mehrzahl der Disaccharidstrukturen in der Stellung 2 und 3 nicht O-sulfatiert.
- Man impft 400 ml des Mediums D mit der in der nachfolgenden Tabelle XVII angegebenen Zusammensetzung mit dem Stamm Escherichia coli SEBR 3282 an und inkubiert unter Rühren während 2 Stunden bei 37ºC.
- Die erhaltene Vorkultur wird anschließend in einen 18,5 Liter-Fermenter überführt, der 11 Liter des Mediums C enthält, mit der Zusammensetzung, die ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle XVII aufgeführt ist, und man inkubiert während 6 Stunden und 30 Minuten bei 37ºC und einem pH-Wert von 7,2, wobei der Sauerstoffpartialdruck durch Steuerung der zugeführten Luft (bis zu 201/min) und das Rühren bei 40 mmhg gehalten wird. Dann gibt man Glycerin zu durch kontinuierliche Zuführung einer sterilen Lösung, welche 500 g/l Glycerin enthält, in einer Menge von 18 g/h während 16 - 17 Stunden.
- Man setzt das Züchten der Kultur unter den gleichen Bedingungen der Temperatur, des pH-Werts und des Sauerstoffpartialdrucks fort bis zum praktisch vollständigen Verbrauch des Glycerins. Die Überwachung der optischen Dichte (λ = 600 nm) der Kultursuspension nach Beendigung der Zugabe des Glycerins zeigt einen stationären Zustand oder eine schwache Lyse bis zur Beendigung der Kultur in dem Fermenter bei einer Behandlungsdauer von 28 - 38 Stunden.
- Man kühlt dann die Kulturbrühe auf 25ºC ab und filtriert sie durch eine Membran mit einer Porosität von 0,22 µm. Man erhält in dieser Weise etwa 12 Liter des Filtrats, welches N-Acetylheparosan mit überwiegend hoher Molekülmasse enthält. TABELLE XVII Zusammensetzung und Herstellung des Mediums C und des Mediums D MEDIUM C Man löst in 900 ml ultragereinigtem Wasser in der angegebenen Reihenfolge:
- Man stellt den pH-Wert mit konzentrierter Kaliumhydroxidlösung mit einer Dichte von 1,38 auf 7,2 ein und füllt dann mit ultragereinigtem Wasser auf 1000 ml auf. Man bewirkt eine Sterilfiltration unter Anwendung einer Membran mit 0,2 µm Poren.
- Man löst 50 g Glycerin in einer entsprechenden Menge ultragereinigten Wassers und stellt das Volumen mit dem gleichen Lösungsmittel auf 1000 ml ein. Man bewirkt eine Sterilfiltration auf einer Membran mit einer Porosität von 0,2 µm. Das im Verlaufe der Fermentation verwendete Antischäummittel ist Struktol J 673 (Schill und Seilacher ).
- Die Herstellung des Mediums D ist identisch mit der des Mediums C, mit dem Unterschied, daß zusätzlich nach der Zugabe des Antischäummittels eine 3-Morpholinopropansulfonsäure-Puffer (pH 7,2) zugesetzt wird.
- Das N-Acetylheparosan mit überwiegend hoher Molekülmasse wird nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise isoliert und gereinigt [2) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekülmasse, Stufe a - Stufe f].
- Aufgrund der tatsächlich eingesetzten Eichprodukte wurde die Molekülmassenverteilung in angenäherter Weise ermittelt.
- Das bei dieser Herstellung erhaltene N-Acetylheparosan ist aus Ketten mit Molekülmassen zwischen 20000 Da und 500000 Da gebildet, wobei die mittlere Masse bei etwa 100000 - 200000 Da liegt.
- Der Uronsäuregehalt des gereinigten Produkts am Ende der letzten Stufe beträgt 2,2 µMol/mg.
- Das erhaltene Spektrum ermöglicht die Feststellung, daß die Charge weniger als 0,5 % DNA enthält.
- Der Gehalt der gesamten Proteine beträgt weniger als 0,5 %.
- Der Gehalt an NH&sub2; ist niedriger als 0,1 µMol/mg.
- Das Züchten des Stammes Escherichia coli SEBR 3282 wurde nach der bei der Herstellung A beschriebenen Methode durchgeführt. Man erhält etwa 12 Liter der Kultur, die N-Acetylheparosan mit überwiegend hoher Molekülmasse enthält.
- Man verfährt nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise [2) Vorausgehende Reinigung] und unter Anwendung in der Stufe d einer Kartusche mit Hohlfasern Amicon mit einer Abtrennschwelle von etwa 30000 Da.
- Man verfährt nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise [3) Isolierung und Reinigung eines N-Acetylheparosans mit überwiegend niedriger Molekülmasse].
- Man verwendet als Ausgangsmaterial für die verschiedenen chemischen Modifizierungen ein N-Acetylheparosan, das als Charge G1 bezeichnet wird und das nach dem bei der Herstellung A beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist.
- Der Uronsäuregehalt dieses Produkts beträgt 2,41 µMol/mg.
- Man löst 1,9 g der Charge G1 in 38,5 ml 2N NaOH. Man erhitzt die Lösung auf 150ºC und läßt während 18 Stunden unter Stickstoff bei dieser Temperatur reagieren.
- Dann stellt man den pH-Wert durch Zugabe von 2N HCl auf 8,25 ein. Man dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und gefriertrocknet.
- Man erhält in dieser Weise 1,6 g des Produkts.
- Die Bestimmung der freien Aminogruppen (NH&sub2;) weist darauf hin, daß das N- Acetylheparosan zu 80 % N-desacetyliert worden ist.
- Man löst 1,3 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produkts in 57 ml ultragereinigten Wassers, gibt 1,9 g Na&sub2;C0&sub3; und 1,9 g des Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes zu und erhitzt während 20 Stunden auf 55ºC. Man stellt anschließend die Leitfähigkeit der Lösung auf die einer 0,5 M NaC 1-Lösung ein durch Zugabe von entmineralisiertem Wasser und fällt mit 4 Volumen Ethanol aus. Man zentrifugiert und nimmt den Zentrifugenrückstand mit einer 0,5 M NaCl-Lösung auf, fällt mit 4 Volumen Ethanol aus und zentrifugiert.
- Man löst den Zentrifugenrückstand in ultragereinigtem Wasser und dialysiert mit ultragereinigtem Wasser nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, worauf man gefriertrocknet.
- Man erhält in dieser Weise 1,809 g N-sulfatiertes Heparosan.
- Man löst 800 mg des in der vorhergehenden Stufe hergestellten Produkts in 100 ml Wasser. Man trägt diese Lösung auf eine Ionenaustauschersäule Dowex 50 W 8 auf und verfährt nach der in Beispiel 4 beschriebenen Weise [1) Chemische Modifizierungen der Charge B, Stufe b].
- Nach der Gefriertrocknung erhält man etwa 1,3 g des Salzes.
- Man löst das in der obigen Weise erhaltene Salz in 80 ml Formamid, gibt 5,6 g des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes zu, läßt während 6 Stunden bei 30ºC reagleren und setzt dann 16 ml 2 M NaCl-Lösung zu. Man bringt den pH-Wert auf 7 und fällt mit 2 Volumen Ethanol aus. Man nimmt den Niederschlag mit einer 0,5 M NaCl- Lösung auf, fällt erneut mit 2 Volumen Ethanol aus, dialysiert gegen ultragereinigtes Wasser und engt im Rotationsverdampfer ein.
- Man fraktioniert die in der vorhergehenden Stufe erhaltene Lösung durch Gelfutration unter Verwendung einer Sephacryl S 300 HR-Säule und unter Verwendung einer 0,5 M NaCl-Lösung als Elutionsmittel.
- Man isoliert die Fraktionen, welche Molekülmassen zwischen 10000 und 1500000 Da entsprechen.
- Dann gibt man 2 Volumen Ethanol zu und engt ein. Man stellt anschließend die Leitfähigkeit dieser Lösung durch Zugabe von Wasser auf die einer 0,5 M NaCl- Lösung ein.
- Man wiederholt die Fraktionierung durch Gelfiltration und gewinnt Fraktionen, die N,O-sulfatiertes Heparosan enthalten, welches aus Ketten gebildet ist, die mittlere Molekülmassen von 100000 bis 200000 Da enthalten, ebenso wie Fraktionen, die ein N,O-sulfatiertes Heparosan enthalten, das aus Ketten mit mittleren Molekülmassen von etwa 50000 Da und etwa 12000 Da gebildet sind.
- Zuj eder dieser drei Fraktionen gibt man 5 Volumen Ethanol, unterwirft sie einer Dialyse gegen ultragereinigtes Wasser und unterwirft die erhaltenen Lösungen nach der Dialyse einer Gefriertrocknung.
- Man erhält in dieser Weise drei Chargen von N,O-sulfatierten Heparosanen: - Die Charge 0 1 ist ein N,O-sulfatiertes Heparosan, welches aus Ketten gebildet ist mit einer mittleren Molekülmasse von 100000 bis 200000 Da. Man isoliert 0,140 g dieser Charge.
- - Die Charge G2 ist ein N,O-sulfatiertes Heparosan, das aus Ketten mit einer mittleren Molekülmasse von etwa 50000 Da gebildet ist. Man isoliert 0,350 g dieses N,O-sulfatierten Heparosans.
- - Die Charge G3 ist ein N,O-sulfatiertes Heparosan, das aus Ketten mit einer mittleren Molekülmasse von 12000 Da gebildet ist. Man isoliert etwa 0,100 g dieser letzten Charge.
- Die Eigenschaften der drei in diesem Beispiel beschriebenen N,O-sulfatierten Heparosan-Chargen sind in der Tabelle XVIII zusammengestellt. TABELLE XVIII Eigenschaften der N,O-sulfatierten Heparosane entsprechend den Chargen G1, G2 und G3
Claims (30)
1. N,O-sulfatierte
Heparosane die aus Ketten oder einer Mischung von Ketten
mit einer Molekularmasse zwischen 1500 und 15000 Da aufgebaut sind, mit einer
sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel I:
in der
- E bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten
Heparosane eine Acetylgruppe und bei den verbleibenden Disaccharideinheiten
eine Sulfatgruppe und gegebenenfalls ein Wasserstoffatom darstellt,
- G ein Wasserstoffatom und eine Sulfatgruppe darstellt,
wobei der Sulfatierungsgrad, als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis ausgedrückt,
zwischen 1,5 und 3,0 liegt, sowie die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser
N,O-sulfatierten Heparosane.
2. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß E eine Acetylgruppe und eine Sulfatgruppe bedeutet.
3. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, welche aus Ketten oder einer
Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da
aufgebaut sind, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel I:
in der
- E bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten
Heparosane eine Acetylgruppe und bei den verbleibenden Disaccharideinheiten
eine Sulfatgruppe und gegebenenfalls ein Wasserstoffatom und
- G ein Wasserstoffatom und eine Sulfatgruppe bedeuten,
wobei der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis ausgedrückte Sulfatlerungsgrad
1,5 bis 3,0 beträgt und
die beiden reduzierenden und nichtreduzierenden Enden der Ketten der
genannten NO- sulfatierten Heparosane gegebenenfalls sulfatlerte Uroneinheiten,
Einheiten des gegebenenfalls sulfatierten Glucosamins oder Einheiten des
gegebenenfalls N-Acetylglucosamins sind,
und die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser N,O-sulfatierten
Heparosane.
4. N,O-sulfatierte Heparosane nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet. daß E bei 0 bis 60 % der Disaccharideinheiten der genannten N,O-
sulfatierten Heparosane eine Acetylgruppe bedeutet.
5. N,O-sulfatierte Heparosane nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß sie mindestens 90 Massen-% von Ketten mit einer
Molekularmasse von weniger als 11000 Da aufweisen.
6. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie mindestens 0,2 µMol/mg Aminogruppen (NH&sub2;) aufweisen.
7. N,O-sulfatierte Heparosane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4,
welche aus Ketten mit einer mittleren Molekülmasse von 4000 Da bis 7000 Da
aufgebaut sind und einen als Sulfat/Carboxyl-Verhältnls ausgedrückten
Sulfatierungsgrad zwischen 1,7 und 3 aufweisen.
8. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
5000 und 7000 Da aufgebaut sind und der als Sulfat/ Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 1,8 und 2,5 liegt und E bei 0 bis 20% der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
9. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet.
daß sie zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
10000 und 12000 Da aufgebaut sind und der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnls
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 1.8 und 2,5 liegt und E bei 0 bis 20 %
der Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
10. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
6000 und 8000 Da aufgebaut sind, der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 2,0 und 2,8 liegt und E bei 0 bis 60 % der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe bedeutet.
11. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
2300 und 7200 Da aufgebaut sind, der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 1,8 und 2,5 liegt und E bei 0 bis 20 % der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
12. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
3300 und 7700 Da aufgebaut sind, der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 1,8 und 2,5 liegt und E bei 0 bis 20% der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
13. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 70 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
6900 und 13500 Da aufgebaut sind, der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 1,8 und 2,5 liegt und E bei 0 bis 20 % der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
14. N,O-sulfatierte Heparosane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zu mindestens 80 Massen-% aus Ketten mit Molekülmassen zwischen
4000 und 10300 Da aufgebaut sind, der als Sulfat/Carboxyl-Verhältnis
ausgedrückte Sulfatierungsgrad zwischen 2,0 und 2,8 liegt und E bei 0 bis 60 % der
Disaccharideinheiten der genannten N,O-sulfatierten Heparosane eine
Acetylgruppe darstellt.
15. Zubereitung auf der Grundlage von N,O-sulfatiertem Heparosan, dadurch
gekennzeichnet, daß sie mindestens 70 Massen-% eines N,O-sulfatierten
Heparosans nach einem der Ansprüche 1 bis 14 enthält.
16. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die 70% bis 100 % eines N,O-
sulfatierten Heparosans nach Anspruch 1 enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß es die Folge der nachstehenden Stufen umfaßt:
- Stufe a: Züchten eines Stammes von Escherichia coli (K5),
- Stufe b: nach einer eventuellen Vorreinigung - Isolierung und Reinigung des
gebildeten N-Acetylheparosans zur Bildung einer Zusammensetzung, die 70 %
bis 100 % eines N-Acetylheparosans enthält, welches aus Ketten oder einer
Mischung von Ketten mit einer Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da
aufgebaut ist, mit einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur der Formel II:
- Stufe c: teilweise Desacetylierung dieser
N-Acetylheparosan-Zusammensetzung zur Bildung einer Zusammensetzung, die 70 % bis 100 % eines Heparosans
enthält. welches aus Ketten oder einer Mischung von Ketten mit einer
Molekülmasse zwischen 1500 und 15000 Da aufgebaut ist, mit einer sich wiederholenden
Disaccharidstruktur der Formel III:
in der R' bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten eine Acetylgruppe und bei den
verbleibenden Disaccharideinheiten ein Wasserstoffatom bedeutet,
- Stufe d: - entweder teilweise N,O-Sulfatierung dieser
Heparosan-Zusammensetzung.
- oder teilweise N,O-Sulfatierung dieser
Heparosan-Zusammensetzung, gefolgt von einer Stufe der vollständigen N-Sulfatierung,
- oder eine vollständige oder teilweise N-Sulfatierung, gefolgt von
einer Stufe der vollständigen oder teilweisen O-Sulfatierung,
und gegebenenfalls eine oder mehrere Stufen der Fraktionierung der
Molekülmassen am Ende der Stufen a, b, c oder d.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm
Escherichia coli (K5) der Stamm SEBR 3282 (der bei dem CNCM des Institut
Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr.I-1013 hinterlegt worden ist) oder eine
spontane oder induzierte Mutante dieses Stammes ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten
des Stammes Escherichia coli (K5) während mindestens zwei Stunden nach
Unterbrechung des Wachstums der Biomasse fortgesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die
Isolierung und Reinigung des N-Acetylheparosans mindestens eine Stufe der
alkoholischen Ausfällung und mindestens eine Stufe der
Ionenaustauschchromatographie umfaßt.
20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die
Isolierung und Reinigung des N-Acetylheparosans mit Hilfe eines Verfahrens
durchgeführt werden, welches die Folge der nachstehenden Stufen umfaßt:
- Stufe a&sub1;: Ausfällung mit Ethanol,
- Stufe b&sub1;: Dialyse,
- Stufe c&sub1;: Ausfällung mit Ethanol und dann Entwässerung und Trocknung,
- Stufe d&sub1;: Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie,
- Stufe e&sub1;: Ausfällung des in der Stufe d&sub1; erhaltenen Eluats mit Ethanol,
Entwässerung, Trocknung und Vermahlen,
wobei auf eine der Stufe a&sub1; oder c&sub1; verzichtet werden kann.
21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die
Isolierung und Reinigung des N-Acetylheparosans mit Hilfe eines Verfahrens
durchgeführt werden, welches die Folge der nachstehenden Stufen umfaßt:
- Stufe a'&sub1;: Dialyse
- Stufe b'&sub1;: Reinigung in saurem Medium, Entfernen von in wäßrigen Lösungen
mit pH-Werten von 3,5 und 1,8 unlöslichen Verunreinigungen,
- Stufe c'&sub1;: Ausfällung mit Ethanol und dann Entwässerung und Trocknung,
- Stufe d'&sub1;: alkalische Hydrolyse und Dialyse,
- Stufe e'&sub1;: Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie,
- Stufe f'&sub1;: Reinigung durch Ausschlußchromatographie.
22. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das beim
Züchten eines Stammes von Escherichia coli (K5) erhaltene N-Acetylheparosan
vor der Isolierung und Reinigung einer vorausgehenden Reinigung unterworfen
wird, welche mit Hilfe eines Verfahrens durchgeführt wird, das die Folge der
nachstehenden Stufen umfaßt:
- Stufe a"&sub1;: Zentrifugieren der nach dem Züchten erhaltenen Suspension,
- Stufe b"&sub1;: Inkontaktbringen der überstehenden Flüssigkeit mit einer
alkalischen Lösung,
- Stufe c"&sub1;: Vorfiltration,
- Stufe d"&sub1;: Einengen auf einer Membran mit vorbestimmter Abtrennschwelle,
- Stufe e"&sub1;: Dialyse,
wobei auf die Stufe e"&sub1; verzichtet werden kann.
23. Verfahren nach Anspruch 16. dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der
teilweisen N,O-Sulfatierung von einer vollständigen N-Sulfatierung gefolgt wird,
welche mit einem Schwefeltrioxidkomplex mit einer organischen Base in einem
wäßrigen Lösungsmittel mit basischem pH-Wert durchgeführt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der
vollständigen N-Sulfatierung von einer Fraktionierung der Molekülmassen
gefolgt wird.
25. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend als Wirkstoff ein
N,O-sulfatiertes Heparosan nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in Kombination oder in
Mischung mit einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial
26. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend als Wirkstoff eine
Zusammensetzung von N,O-sulfatiertem Heparosan nach Anspruch 15 in Kombination oder
Mischung mit einem inerten. pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial.
27. Pharmazeutische Zubereitung nach irgendeinem der Ansprüche 25 und 25,
geeignet für die Steuerung der Koagulation.
28. Heparosane gebildet aus einer Mischung von Ketten mit Molekülmassen
zwischen 1500 und 15000 Da nut einer sich wiederholenden Disaccharidstruktur
der Formel III:
in der R' bei 0 bis 80 % der Disaccharideinheiten eine Acetylgruppe und bei den
verbleibenden Disaccharideinheiten ein Wasserstoffatom bedeutet.
29. Heparosane nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß R' bei 0 bis
60% der Disaccharideinheiten der genannten Heparosane eine Acetylgruppe
darstellt.
30. Heparosan-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens
70 Massen-% eines Heparosans nach irgendeinem der Ansprüche 28 und 29
enthält.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR909015114A FR2669932B1 (fr) | 1990-12-03 | 1990-12-03 | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. |
Publications (2)
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| DE69125109D1 DE69125109D1 (de) | 1997-04-17 |
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| DE69125109T Expired - Fee Related DE69125109T2 (de) | 1990-12-03 | 1991-12-03 | N,O-sulfatierte Heparosane; Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel |
Country Status (32)
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