DE69313826T2

DE69313826T2 - Sulfatierte polysaccharide, verfahren zu deren herstellung, pharmazeutische zusammensetzung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69313826T2
Application number: DE69313826T
Authority: DE
Inventors: Andre Uzan
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1992-02-07
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2013-02-05
Also published as: FR2687158A1; MX9300584A; HU214327B; ES2109478T3; DK0625166T3; CA2126241C; NZ249165A; WO1993016112A1; NO942897D0; AU3505193A; JP3218039B2; ATE157991T1; HUT67878A; CA2126241A1; FI943642A; KR950700334A; NO942897L; JPH07503496A; NO307466B1; FI106034B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Polysaccharide mit geringer Molmasse. Ganz besonders betrifft sie Zusammensetzungen von Oligosaachariden, die ausgezeichnete pharmakologische und antithrombotische Eigenschaften besitzen.
Im allgemeinen greift man bei antithrombotischen Behandlungen auf zwei große Kategorien von Mitteln zurück, nämlich die Antikoagulationsmittel und die Antiplättchenmittel.
Unter den Antikoagulationsmitteln bilden die Verbindungen von Anti-Vitamin K eine sehr bedeutende Gruppe. Diese auf oralem Wege wirksamen Verbindungen sind bei zahlreichen Indikationen anwendbar. Jedoch ist ihre Verwendung noch durch gewisse Nachteile eingeschränkt und insbesondere durch die sie begleitenden Risiken von Hämorrhagien und die Schwierigkeit, die Dosierung an eine längere Behandlungsdauer anzupassen.
Die Heparine bilden die zweite Kategorie der Antikoagulationsmittel. Dies sind biologische Extraktions-Substanzen aus der Familie der Glucosaminoglycane, zusammengesetzt aus Oligosacchariden mit variablen Kettenlängen und Sulfatierungsgraden. Genauer gesagt verteilen sich die Molmassen der das nicht fraktionierte Heparin bildenden Ketten im allgemeinen zwischen 2000 und 40000 Dalton. Die Heparine werden bei verschiedenen Typen von Thrombosen, insbesondere bei der Behandlung oder der Vorbeugung von venösen Thrombosen, gegebenenfalls in Verbindung mit anderen Therapeutika verwendet.
Der Nachteil der Heparine beruht auf ihrer erhöhten antikoagulierenden Wirkung, die Hämorrhagien hervorrufen kann, und in ihrer Empfindlichkeit zu einigen Inhibitorfaktoren des Blutes, wie den Faktor Flättchen 4, der bei der Anwendung von relativ hohen Dosierungen eine Rolle spielt.
Außerdem sind die Heparine sehr heterogene Produkte. Es ist daher schwierig, ihren Wirkungsmechanismus zu bewerten, den Anteil von jedem der Bestandteile an der Gesamtaktivität des Heparins einzuschätzen und aufgrund dieser Tatsache die antithrombotische Wirkung zu erhöhen, ohne gleichzeitig die Nebenwirkungen zu steigern. Die Weiterentwicklung der wissenschaftlichen Erkenntnisse auf diesem Gebiet hat ergeben, daß die biologischen Eigenschaften, das heißt, die Wirkung auf die Koagulation des Blutes ebenso wie die pharmakologischen Eigenschaften, das heißt, die antithrombotischen Wirkungen dieser Oligosaccharide in vivo, in Abhängigkeit von ihrer Molmasse variieren.
Eine erste Lösung zu diesen oben erwähnten Nachteilen wurde durch die Heparine mit niedriger Molmasse gefunden. Diese Hepanne sind Mischungen von sulfatierten Oligosacchariden, deren Molmasse sich im allgemeinen zwischen 2000 und 10000 Dalton verteilt. Diese Heparine werden durch Fraktionierung der Oligosacchand-Ketten des Heparins erhalten, beispielsweise durch Gelpermeation, gemäß Barrowcliffe et al., Thrombosis research, 12 (1977), 27-36, oder durch Fragmentierung (Depolymerisation) der Oligosaccharid-Ketten des Heparins mit Hilfe von chemischen oder enzymatischen Mitteln. Die Depolymerisation wurde insbesondere beschrieben durch Behandlung eines Heparinesters in Anwesenheit einer starken Base (EF 40 144). Sie kann ebenfalls durch Behandlung des Heparins in Anwesenheit von salpetriger Säure oder durch Einwirkung einer Heparinase (EP 64 452) realisiert werden. Diese verschiedenen Verfahren führen zu Mischungen von Oligosacchariden mit der allgemeinen Struktur der Polysaccharide, aus denen das Heparin besteht, jedoch mit einem niedrigen mittleren Molekulargewicht. Diese Modifikationen übertragen sich im allgemeinen auf eine bessere Bioverfügbarkeit und eine geringere Wirkung auf das Bluten im Vergleich zu dem nicht fraktionierten Heparin. Die durch Auftrennung dieser Mischungen in eine Fraktion vom mittleren Molekulargewicht von 3300 Dalton und in eine Fraktion vom mittleren Molekulargewicht von 6500 Dalton erhaltenen Produkte wurden ebenfalls untersucht [S. BEGUIN et coll., Thromb. And Haemost., 61 (I), 30-34 (1989)].
Ganz besonders waren die Untersuchungen im wesentlichen auf von Heparin abgeleitete Mischungen orientiert, die sehr kurze Oligosaccharid-Ketten besitzen. So zeigt das Patent EP 27 089, daß die von Heparin abgeleiteten Mischungen von Oligosacchariden, die nicht mehr als 8 saccharidische Struktureinheiten umfassen, eine spezifische antithrombotische Wirkung besitzen, die höher als die des Heparins ist. In gleicher Weise wurden Hexasaccharide hergestellt und ihre antithrombotischen Eigenschaften untersucht (EP 64 452). Man kann außerdem die neueren Patente EP 84 999 und EP 301 618 von Polysacchariden nennen, wie Hexa-, Penta- und Tetrasaccharide, die sich von Heparin ableiten.
Jedoch haben diese Produkte bis heute noch nicht ermöglicht, in völlig befriedigender Weise die Probleme zu lösen, denen man bei Heparinen begegnet. Insbesondere die Heparine mit niedriger Molmasse besitzen in der Mehrzahl eine Inhibitorwirkung gegenüber dem Thrombin (Aktivität anti IIa) von mehr als sechsmal niedriger als die von Heparin. In der experimentellen Untersuchung an einem klassischen Thrombose-Modell wie dem von Wessler beim Kaninchen, liegen die antithrombotischen Dosen sehr viel höher als bei Heparin.
Die Anmelderin hat jetzt gefunden, daß es möglich ist, ausgehend von natürlichen oder depolymerisierten Heparinen, Mischungen von Oligosacchariden mit ausgezeichneten biologischen und pharmakologischen Eigenschaften zu erhalten, und demzufolge verbesserte therapeutische Leistungsfähigkeiten.
In unerwarteter Weise hat die Anmelderin nämlich gefunden, daß man in dem Fall, wo man eine Mischung von Cligosacchariden realisiert, deren molekulare Verteilung durch ein Verhältnis von gleich oder höher als 70 % sulfatierten Oligosacchariden mit einer Molmasse zwischen 5400 und 7800 Dalton und mindestens 5 % sulfatierten Oligosacchariden mit einer Molmasse von höher als 6900 Dalton gekennzeichnet ist, eine Aktivität anti ha von höher als 60 IE/mg und vorzugsweise von gleich oder höher als 70 IE/mg erhält, wobei diese Herstellung die Vorteile einer guten Bioverfügbarkeit, verbunden mit unbedeutenden Wirkungen auf die Blutungseigenschaft der Heparine mit geringer Molmasse beibehält, jedoch außerdem den Vorteil aufweist, eine erhöhte Inhibitorfähigkeit gegenüber Thrombin und eine höhere antithrombotische Aktivität mit einer verlängerten oder mindestens gleichen Wirkungsdauer zu besitzen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht daher in einer Mischung von sulfatierten Oligosacchariden, die die allgemeine Struktur der wesentlichen oligosaccharide des Heparins aufweisen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens 70 % oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5400 und 7800 Dalton, mindestens 5 % oligosaccharide mit einer Molmasse von höher als 6900 Dalton umfaßt, und dadurch, daß sie eine Aktivität anti IIa von höher als 60 IE/mg, vorzugsweise von höher oder gleich 70 IE/mg besitzt.
Eine derartige Mischung vereint das erste Mal die Vorteile des nicht fraktionierten Heparins mit denen des Heparins mit geringer Molmasse.
Im Verhältnis zum natürlichen Heparin weisen die Mischungen der Erfindung außerdem eine weniger starke Empfindlichkeit gegenüber den Inhibitorfaktoren des Blutes wie dem Faktor Plättchen 4 auf, was die therapeutische Leistungsfähigkeit erhöht.
Andere Vorteile der Mischungen gemäß der Erfindung bestehen insbesondere in der Verminderung von einigen unerwünschten Nebenwirkungen wie der thrombocytopenischen Wirkung. Einer der Nachteile der bekannten, von Heparin abgeleiteten Mischungen stammt vom Abfall der Anzahl der Plättchen, der auftreten kann. Dieser unerwünschte Effekt ist stark verringert, wenn die Mischungen gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die oben erwähnten Eigenschaften ermöglichen eine besonders leistungsfähige pharmakologische Anwendung, insbesondere bei der Behandlung von venösen oder arteriellen Thrombosen. Außerdem wird die Verwendung viel höherer Dosen in vivo möglich, ohne das häufige Auftreten von hämorrhagischen Risiken befürchten zu müssen.
In ganz besonderer Weise umfassen die Mischungen gemäß der Erfindung mindestens 10 % oligosaccharide mit einer Molmasse von höher als 6900 Dalton.
Außerdem umfassen die bevorzugten Mischungen gemäß der Erfindung 70 % Oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5700 und 7500 Dalton.
Ganz besonders bevorzugt umfassen die Mischungen gemäß der Erfindung mindestens 60 % Oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5700 und 6900 Dalton.
Außerdem liegt die Aktivität anti IIa der Mischungen gemäß der Erfindung vorzugsweise unter ihrer Aktivität anti Xa.
In einer bevorzugten Form sind die Mischungen gemäß der Erfindung ganz besonders depolymerisierte Fraktionen von Heparin. Wie oben gezeigt, kann das depolymerisierte Heparin nach jeder chemischen, enzymatischen oder anderen Methode erhalten werden, wie sie dem Fachmann bekannt ist und die ermöglicht, die oligosaccharidischen Ketten des Heparins zu fragmentieren. Insbesondere empfehlen sich die in den Patenten EP 40 144, EP 64 452, EP 37 317 oder EP 337 327 beschriebenen Verfahren für die Erfindung.
In noch mehr bevorzugter Weise bestehen die Mischungen gemäß der Erfindung aus Oligosacchariden, die an einem ihrer Enden eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure aufweisen.
Eine besonders vorteilhafte Mischung besteht aus einer Fraktion von Heparin, die durch Einwirkung einer Base auf einen Heparinester depolymerisiert wurde.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben definierten Mischung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Heparin oder ein depolymerisiertes Heparin durch Gelfiltration fraktioniert, wie in Anspruch 10 angegeben.
In das Verfahren der Erfindung greifen mehrere Parameter ein, deren Kontrolle ermöglicht, die Masse und die molekulare Verteilung der Endmischung einzustellen. Diese Parameter sind insbesondere die ionische Stärke des Eluenten und die Beschaffenheit des verwendeten Trägers.
Die Fraktionierung ist dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander die folgenden Stufen realisiert, die bestehen in:
(i) das Heparin oder das depolymerisierte Heparin als Ausgangsstoff in Lösung eines Eluierungsmittels zu bringen,
(ii) die auf diese Weise erhaltene Lösung über eine Kolonne passieren zu lassen, die mindestens den festen Träger für die Gelfiltration enthält, der zuvor mit dem gleichen Eluierungsmittel ins Gleichgewicht gebracht wurde, und
(iii) die Fraktionen mit dem gewünschten Molekulargewicht zu gewinnen.
In einer besonderen Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung verwendet man als Heparin-Ausgangsprodukt ein depolymensiertes Heparin. Ein derartiges Heparin kann nach den in den Patenten EP 40 144, EP 64 452, EP 37 317 oder EP 337 327 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
In noch mehr bevorzugter Weise verwendet man ein Heparin, das durch Einwirkung einer Base auf einen Heparinester depolymerisiert wurde, wie beispielsweise gemäß der in dem Patent EP 40 144 beschriebenen Technik. Die Depolymerisation kann insbesondere im wäßrigen Medium oder in einem inerten organischen Lösungsmittel realisiert werden, unter Einwirkung einer organischen Base oder Mineralbase, wie beispielsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, einem Alkalicarbonat oder einem tertiären Amin (Triethylamin, Triethylen-diamin usw.). Die Einwirkung der Base auf den Ester ermöglicht es, eine teilweise und kontrollierte Depolymerisation des Heparins zu erreichen, ohne seine allgemeine Struktur zu beeinträchtigen.
Als in dem Verfahren der Erfindung verwendbare Eluenten kann man verschiedene Typen von Salzlösungen nennen wie die Lösungen von Natriumchlorid. Jedoch hat die Anmelderin gezeigt, daß zum Erhalten der Fraktionen mit den besten Eigenschaften es besonders vorteilhaft ist, die Fraktionierung unter Verwendung eines Eluenten zu realisieren, der unter den Phosphatpuffern ausgewählt wird, wie insbesondere Kaliumphosphat, Natriumphosphat oder NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;. Es ist ebenfalls möglich, Lösungen von NaClC&sub4; oder NH&sub4;NO&sub3; zu verwenden, mit denen man Mischungen mit ausgezeichneten Charakteristiken erhält.
Die Konzentration des Eluenten und somit seine ionische Stärke wird an die gesuchte Endmischung angepaßt. So wird die Konzentration des Eluenten insbesondere vorteilhafterweise unter 1 M liegen, und ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 M und 0,5 M.
Wenn man einen Phosphatpuffer verwendet, ist es besonders vorteilhaft, mit Konzentrationen von nahe 0,2 M zu arbeiten.
In der zweiten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung wird der verwendete Träger im allgemeinen in Abhängigkeit von der mittleren Molmasse der Ausgangsmischung (Heparin natürlich, depolymerisiert ...), vom gesuchten Endprodukt und von dem Verhalten der Ausgangsmischung in dem verwendeten Eluent ausgewählt. Vorteilhafterweise verwendet man als Träger ein Gel vom Typ Polyacrylamid-Agarose. Als Beispiel kann man die Gele AcA 54, AcA 202, Sephadex G25 oder G50 oder auch Biogel P30 nennen, die gute Ergebnisse bringen.
In einer besonders vorteilhaften, ersten Verfahrensweise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird der feste Träger bei der zweiten Stufe der Fraktionierung in mehrere in Reihe angeordnete Kolonnen aufgeteilt. Diese Variante der Erfindung ermöglicht die Verwendung von größeren Endmengen beim Träger für die Gelfiltration ohne die Nachteile des Standes der Technik, nämlich im wesentlichen die Erscheinungen des Absetzens. Bei dieser Art und Weise ist die Abtrennung viel schärfer und in einer einzigen Operation der Fraktionierung erreichbar, eingeschlossen die hohen Molekulargewichte, und die Träger sind leichter zu regenerieren.
Die Anzahl der verwendeten Kolonnen wird vom Fachmann in Abhängigkeit vom Volumen und der Beschaffenheit des verwendeten Gels angepaßt, so daß man das beste Gleichgewicht zwischen der Effektivität der Trennung und der durch das Absetzen des Gels hervorgerufenen schädlichen Wirkung erhält.
Für die praktischen Verhältnisse der Durchführung bevorzugt man im allgemeinen, in der zweiten Stufe des Verfahrens eine Anzahl an Kolonnen von unter 20 zu verwenden.
Zur Veranschaulichung können 40 Liter Gel AcA 202 in 10 Kolonnen von 4 Litern oder 130 Liter in 10 Kolonnen von 13 Litern aufgeteilt werden.
Bei einer anderen, besonders vorteilhaften Ausführungsform zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet man bei der zweiten Stufe der Fraktionierung nacheinander mindestens zwei Trägertypen, die unterschiedliche Trennungs-Charakteristiken aufweisen. Diese Variante der Erfindung ermöglicht es, eine Endfraktionierung von besserer Qualität zu erhalten.
Die Fraktionierung kann beispielsweise mit der folgenden Sequenz von Gelen realisiert werden: AcA 202 - AcA 54 AcA 202.
Im Hinblick auf eine bessere Durchführung der Erfindung ist es wichtig, große Mengen an Gel zu verwenden, so daß man eine deutlichere Trennung realisiert und eine bessere Homogenität erreicht. Unter Berücksichtigung der verwendeten, ausreichend langsamen Durchsätze für diese Art von Gelfiltration soll jedoch das Gelvolumen an die Menge des zu trennenden Produktes angepaßt werden, so daß man ein besseres Gleichgewicht zwischen der Trennung und dem Effekt der längsverlaufenden Diffusion erhält.
Vorteilhafterweise liegt bei dem Verfahren der Erfindung das Verhältnis Ausgangs-Heparin (g)/Gelvolumen (1) unterhalb von 2, und noch bevorzugter zwischen 0,5 und 1,5.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine wie oben definierte Mischung aufweist. Eine derartige Zusammensetzung kann in besonders vorteilhafter Weise bei der Prophylaxe oder der Behandlung oder der Vorbeugung von thrombotischen Zwischenfällen verwendet werden. Genauer gesagt kann sie verwendet werden:
- bei der Vorbeugung von venösen Thrombosen in Risikosituationen,
- bei der Vorbeugung von arteriellen thrombotischen Zwischenfällen, insbesondere im Fall des Myokardinfarktes,
- im post-operativen Bereich zur Vorbeugung von venösen Thrombosen bei chirurgisch Kranken, oder auch
- für die Vorbeugung von Thrombosen in chirurgischem Material.
Die vorliegende Erfindung wird noch vollständiger mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben, die jedoch nur als Veranschaulichung und nicht als einschränkend betrachtet werden sollen. In diesen Beispielen wurden die physikalisch-chemischen, biologischen und pharmakologischen Charakteristiken der Mischungen nach den folgenden Techniken bestimmt:

Molmasse und molekulare Verteilung

Die Molmassen und die molekularen Verteilungen der Produkte werden durch Hochdruck-Flussig-Chromatographie mit zwei Kolonnen in Reihe bestimmt, beispielsweise durch die unter der Bezeichnung TSK G3000 XL und TSK G2000 XL gehandelte, gekoppelt mit einem refraktometrischen Detektor.
Das verwendete Eluent ist 0,5 M Lithiumnitrat und der Durchsatz beträgt 0,6 ml/min. Das System wird mit monodispersen Eichproben kalibriert, erhalten durch Fraktionierung von Enoxaparin (Pharmuka) durch Ausschluß-Chromatographie auf Agarose-Polyacrylamid (IBF) gemäß der von Barrowcliffe et coll., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) oder D.A. Lane et coll., Thromb. Res. 257-271 (1977-78) beschriebenen Technik. Die Resultate werden mit Hilfe des Softwareprogrammes GPC6 (Perkin Elmer) berechnet.

Aktivität anti Xa

Die angewendete Technik ist die von Teien A.N. und Lie M. in Thrombosis research 10 (1977) 399-410 beschriebene, mit dem ersten internationalen Etalon von Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (WHO LMWH1) als Eichprobe.

Aktivität anti IIa

Die angewendete Technik ist die von Anderson L.O. et al., in Thrombosis research 15 (1979) 531-541 beschriebene, mit dem ersten internationalen Etalon von Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (WHO LMWH1) als Eichprobe.

APTT

Die angewendete Technik ist die Technik "Actimat" (Bio Merieux) wie sie von Bell W.N. und Alton H.G. in Nature 174 (1954) 880-881 beschrieben wurde.

Venöse Thrombose beim Kaninchen

Die angewendete Technik ist die von Wessler S. in Journal of Clinical investigation 34 (1955) 647-651 beschriebene.

Blutungszeit bei der Ratte

Die angewendete Technik ist die von Palm M. et al. in Thrombosis and haemostasis 64(1) (1990) 127-132 beschriebene.

Legende der Figuren

Figur 1: Aktivität APTT in vitro der Mischungen der Erfindung an Humanplasma, verglichen mit anderen Heparinen.
Figur 2 (a und b): Kinetik der Aktivität anti Xa der Mischungen der Erfindung am Kaninchen: Vergleich mit einem anderen Heparin mit niedriger Molmasse.
Figur 3 (a und b): Kinetik der Aktivitat anti IIa der Mischungen der Erfindung am Kaninchen: Vergleich mit einem anderen Heparin mit niedriger Molmasse.

Beispiel 1: Herstellung eines depolymerisierten Heparins

Zu einer Lösung von 10 g Natriumheparinat in 100 ml Wasser gibt man eine Lösung von 25 g Benzethoniumchlorid in 125 ml Wasser. Das erhaltene Produkt wird bei Umgebungstemperatur filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen 15 g Benzethonium-heparinat werden in 75 ml Methylenchlorid gelöst, wozu man dann 15 ml Benzylchlorid gibt. Anschließend wird die Lösung 25 Stunden lang auf eine Temperatur zwischen 25 ºC und 35 ºC erhitzt. Dann setzt man 90 ml einer Lösung von Natriumacetat in Methanol (10 %) hinzu, filtriert, wäscht mit Methanol und trocknet.
Eine Menge von 10 g Heparin-benzylester, erhalten in Form des Natriumsalzes unter den oben beschriebenen Bedingungen, wird in 250 ml Wasser gelöst. Zu dieser auf etwa 60 ºC erwärmten Lösung gibt man 0,9 g Natriumhydroxid. Die Temperatur wird 1 Stunde und 30 Minuten lang auf etwa 60 ºC gehalten, die Reaktionsmischung anschließend auf etwa 20 ºC abgekühlt und durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Dann stellt man die Konzentration des Mediums auf 10 % an Natriumchlorid ein, und das Produkt wird in 750 ml Methanol gefällt, filtriert und getrocknet.

Beispiel 2: Herstellung der Mischung M1

Es werden 10 Kolonnen aus Glas mit einem Durchmesser von 100 mm und einer Höhe von 50 cm, die jeweils 4 Liter Gel AcA 202 (Gel in Form von Kügelchen aus Polyacrylamid-Agarose mit einem Durchmesser zwischen 60 µm und 140 µm) enthalten, in Reihe für die Fraktionierung verwendet:
Eine Lösung, die 30 g Heparin enthält, depolymerisiert unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, wird auf den Kopf der ersten Kolonne gegeben und in einem Durchsatz von 300 ml/h mit einer mobilen Phase eluiert, die aus einer 0,2 M Lösung von KH&sub2;PO&sub4; besteht. Die Fraktionen werden am Ende der zehnten Kolonne entnommen.
Diese Behandlung ermöglicht die effektive Trennung der Oligosaccharid-Ketten in Abhängigkeit von ihrer Molmasse und deren anschließende Gewinnung, um Mischungen mit den gewünschten Charakteristiken zu erhalten. Die Mischung M1 wurde auf diese Weise erhalten, deren physikalisch-chemische und biologische Charakteristiken in vitro in der Tabelle 1 angegeben sind.

Beispiel 3: Herstellung der Mischung M2

Die Mischung M2 wurde nach der gleichen Verfahrensweise zur Fraktionierung wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten, unter Verwendung von 50 g depolymerisiertem Heparin.
Die physikalisch-chemischen und biologischen Charakteristiken in vitro der Mischung M2 sind in der Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 4: Herstellung der Mischung M5 und der Mischung M6

Die Mischung M5 wurde nach der gleichen Verfahrensweise zur Fraktionierung wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten, ausgehend von 30 g depolymerisiertem Heparin, jedoch unter Verwendung von 10 Kolonnen mit einem Durchmesser von 9 cm und einer Höhe von 50 cm.
Die Mischung M6 wurde durch eine erste Fraktionierung erhalten, realisiert gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 2, ausgehend von 150 g depolymerisiertem Heparin auf 10 Kolonnen mit einem Durchmesser von 18 cm und einer Höhe von 50 cm und mit einem Durchsatz an mobiler Phase von 1,1 lih. Die interessanten Fraktionen wurden zusammengefaßt und die Oligosaccharide durch Zugabe von Methanol gefällt. Der gewonnene Feststoff wurde anschließend in Lösung gebracht und dann mit dem gleichen chromatographischen System refraktioniert. Die Fraktionen wurden am Ende der zehnten Kolonne entnommen.
Die physikalisch-chemischen und biologischen Charakteristiken in vitro der Mischungen M5 und M6 sind in der Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 5: Vergleichsbeispiel: Herstellung der Mischung M3 und der Mischung M4

Die Mischung M3 wurde nach der gleichen Verfahrensweise zur Fraktionierung wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten. Die Mischung M4 wurde nach der Fraktionierung wie in Beispiel 2 beschrieben durch Vermischen einer Fraktion von 5530 Dalton (63 %) und einer Fraktion von 7770 Dalton (37 %) erhalten.
Die physikalisch-chemischen und biologischen Charakteristiken in vitro der Mischungen M3 und M4 sind in der Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 6: Untersuchung der Aktivität APTT in vitro von Mischungen der Erfindung an Humanplasma

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt. Sie zeigen deutlich, daß die Mischungen der Erfindung (Mischung M1) die Wirkungen APTT in vitro an Humanplasma in viel bedeutenderer Weise variieren, als das nicht fraktionierte Heparin. Tabelle 1

Beispiel 7: Kinetische Untersuchung der Aktivitäten anti Xa und anti IIa am Kaninchen

Diese Untersuchung wurde nach der folgenden Vorschrift durchgeführt:
- Kaninchen: neuseeländisch (3,5 kg)
- injiziertes Volumen: subkutaner Weg: 0,5 ml/kg (Bereich Abdomen)
- Blutproben: es werden 3 ml Blut in eine Natriumcitrat-Lösung, 3,1 % (1/10) aus dem Bereich der medianen Arterie des Ohres zu den Zeiten 0 min, 45 min, 90 min, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h entnommen.
Nach subkutaner Injektion der Mischungen M1, M5 und M6 gemäß der Erfindung oder von depolymerisiertem Heparin gemäß Beispiel 1 am Kaninchen in gleichen Dosen anti Xa erhält man die Aktivitäten anti Xa und anti IIa in dem Plasma, die sind:
- parallel und vergleichbar für anti Xa (Figur 2)
- sehr hoch mit der Mischung der Erfindung für die Aktivität anti IIa (Figur 3)
Derselbe Vergleich, bezogen auf die in Beispiel 5 beschriebene Mischung M4 zeigt, daß die Aktivitäten anti Xa des Plasmas parallel fortbestehen, aber daß der Unterschied bei der Aktivität anti IIa sehr bedeutend ist (Figuren 2 und 3).
Diese Resultate zeigen somit in überraschender Weise, daß die Mischungen der Erfindung andauernde, gleichbleibende und hohe Aktivitäten anti Xa und anti IIa in vivo besitzen. Diese Mischungen sind daher insbesondere im Vergleich zum nicht fraktionierten Heparin vorteilhaft, dessen Aktivitäten anti Xa und anti IIa in vivo von sehr kurzer Dauer sind, aber auch in bezug auf die im Stand der Technik beschriebenen Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, deren Aktivität in vivo ebenfalls von sehr kurzer Dauer ist.

Beispiel 8: Untersuchung der Aktivität in vivo der Mischungen der Erfindung bei der venösen Thrombose am Kaninchen nach intravenöser Injektion

In der Tabelle 2 sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt. Diese Tabelle zeigt, daß die Mischung M3 (Beispiel 4), deren molekulare Verteilung von der beanspruchten unterschiedlich ist, und das depolymerisierte Heparin (Beispiel 1) weniger aktiv sind als die Mischung M1 der Erfindung. Diese zeigt insbesondere eine deutlich höhere Aktivität anti IIa.

Beispiel 9: Untersuchung der Aktivität in vivo der Mischungen der Erfindung bei der venösen Thrombose am Kaninchen nach subkutaner Injektion

In den Tabellen 3 und 4 sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt. Diese Tabellen zeigen, daß die Mischungen M1, M5 und M6 aktiver sind als ein depolymerisiertes Heparin des Standes der Technik (Beispiel 1) und daß sie eine mindestens äquivalente Wirkungsdauer aufweisen.

Beispiel 10: Untersuchung der Aktivität in vivo an der Blutungszeit bei der Ratte

Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, daß die Mischungen der Erfindung (veranschaulicht durch die Mischungen M1, M5 und M6) ein geringeres Bluten nach sich ziehen als die anderen Heparine mit niedriger Molmasse. Die erhaltenen Ergebnisse entsprechen der Erhöhung der Blutungszeit in Minuten in bezug auf die Kontrollwerte. Vergleichsweise ruft Heparin bei 2 mg/kg eine Erhöhung der Blutungszeit von 13 hervor. Tabelle 5 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4

Claims

1. Mischung von sulfatierten Oligosacchariden, die die allgemeine Struktur der wesentlichen Oligosaccharide des Heparins aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 70 % Oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5400 und 7800 Dalton, mindestens 5 % Oligosaccharide mit einer Molmasse von höher als 6900 Dalton umfaßt, und dadurch, daß sie eine Aktivität anti IIa von höher als 60 IE/mg besitzt [Methode von Anderson L.O. et al., Thrombosis research 15 (1979) 531-541, mit WHO LMWHL als Standard].

2. Mischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 70 % Oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5700 und 7500 Dalton umfaßt.

3. Mischung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 60 % Oligosaccharide mit einer Molmasse zwischen 5700 und 6900 Dalton umfaßt.

4. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 10 % Oligosaccharide mit einer Molmasse von höher als 6900 Dalton umfaßt.

5. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aktivität anti IIa von gleich oder höher als 70 IE/mg besitzt.

6. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Fraktion von Heparin handelt.

7. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine depolymerisierte Fraktion von Heparin handelt.

8. Mischung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Oligosacchariden besteht, die an einem ihrer Enden eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure besitzen.

9. Mischung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Fraktion von Heparin handelt, die durch Einwirkung einer Base auf einen Heparinester depolymerisiert wurde.

10. Verfahren zur Herstellung einer Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heparin oder ein depolymerisiertes Heparin durch Gelfiltration fraktioniert, wobei diese Fraktionierung nacheinander die folgenden Stufen um-

(i) das Heparin oder das depolymerisierte Heparin als Ausgangsstoff in Lösung eines Eluierungsmittels zu bringen,

(ii) die auf diese Weise erhaltene Lösung über eine Kolonne passieren zu lassen, die mindestens den festen Träger für die Gelfiltration enthält, der zuvor mit dem gleichen Eluierungsmittel ins Gleichgewicht gebracht wurde, und

(iii) die Fraktionen mit dem gewünschten Molekulargewicht zu gewinnen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine depolymerisierte Fraktion von Heparin verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fraktion von Heparin verwendet, die durch Einwirkung einer Base auf einen Heparinester depolymerisiert wurde.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei der zweiten Stufe der Fraktionierung der Träger in mehrere, in Reihe angeordnete Kolonnen aufgeteilt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Stufe unter Verwendung von nacheinander mindestens zwei Trägertypen realisiert wird, die unterschiedliche Trennungs- Charakteristiken aufweisen.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Mischung von Oligosacchariden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, vorgesehen für die Behandlung und Vorbeugung von venösen und arteriellen Thrombosen.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, vorgesehen für die Vorbeugung von arteriellen thrombotischen Zwischenfällen, insbesondere im Fall des Myokardinfarktes.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, vorgesehen für eine Verwendung im post-operativen Bereich zur Vorbeugung von venösen Thrombosen bei chirurgisch Kranken.

19. Verwendung einer Mischung von Oligosacchariden nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 für die Vorbeugung von Thrombosen in chirurgischem Material.