DE2945595A1

DE2945595A1 - Verfahren zur herstellung von niedermolekularem heparin bzw. seinen salzen

Info

Publication number: DE2945595A1
Application number: DE19792945595
Authority: DE
Inventors: Antrag Auf Nichtnennung
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1979-11-12
Filing date: 1979-11-12
Publication date: 1981-05-21

Description

Verfahren zur Herstellung von niedermolekularem Heparin
bzw. seinen Salzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekulare Heparin bzw. seinen Salzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Heparin bzw. seinen Salzen mit einem mittl. Molakulargewicht von 6000 bis 10.000.
Bisher war es bekannt, Heparin bzw. seine Salze mit Hilfe der Gelfiltrationsmethode in neutralem Bereich aufzutrennen (E.A. Johnson und B. Mulloy "The molecular weight range of mucosal-heparin preparations", erschienen in Elsevier Scientific Publishing Company, Carbohydrate Research 51 (1976), 119-127). Diese Methode ist jedoch aufwendig und wenig ertragreich. Ferner war es bekannt, eine Auftrennung von natürlichem Heparin bzw. seinen Salzen durch Ultrazentrifugieren mit Hilfe von Dichtegradienten durchzuführen. Diese Methode hat jedoch den Nachteil einer aufwendigen apparativen Ausrüstung, und die hierbei erzielte Trennschärfe ist nicht befriedigend.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass man mit geringem apparativem Aufwand eine gute Auftrennung des eingesetzten natürlichen Heparins bzw.
seiner Salze in praktisch quantitativer Ausbeute zu dem gewünschten niedermolekularen Heparin bzw. seinen Salzen erzielt.
Erfindungsgenss gelangt man zu niedermolekularem Heparin bzw. seinen Salzen, indem man handelsübliches natürliches Heparin bzw. seine Salze in wässriger Lösung in einem Bereich von 1 bis 5,5 einer Ultrafiltration unterwirft.
Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird natürliches handelsübliches Heparin (U.S.P. XIX specification) bzw. seine Salze, wie beispielsweise seine Natrium-, Calcium- oder Arninoniumsalze mit einem mittl. Molekulargewicht von 15.000 bis 18.000, zunächst in Wasser, gegebenenfalls in Gegenwart von 5 bis 10 % eines aliphatischen Alkohols, wie beispielsweise Aethanol oder Methanol, mit'einer bevorzugten Konzentration von 100 bis 200 g Heparin bzw. seinen Salzen pro Liter Wasser (aqua dest.) gelöst. Die hierbei verwendete Konzentration ist nicht kritisch, sofern eine gute Löslichkeit erzielt wird. Die so erhaltene Lösung des natürlichen käuflichen Heparins bzw. seiner Salze besitzt einen pH-Wert von 6 bis 7. Danach wird der gewünschte pH-Wert von 1 bis 5,5 mit Hilfe einer anorganischen oder organischen Säure, vorzugsweise der Salzsäure eingestellt und die Lösung danach einer Ultrafiltration unterworfen. Hierbei zeigt sich, dass bei dem eingestellten pH-Wert der Lösung Heparin mit einem mittl. Molekulargewichtsanteil von 6000 bis 10.000 abgetrennt wird. Bei Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert von 2,2 bis 2,8 wird eine Lösung von Heparin mit einem mittl. Molekulargewichtsanteil von 6000 (+ 1000) abgetrennt und bei Einstellung auf einen pH-Wert von 1,7 bis 2,3 bzw. 3,2 bis 3,8 eine Lösung von Heparin mit einem mittl. Molgewichts- anteil von 8000 (+ 1000). Bei einer Einstellung auf einen pH-Wert von 1,1 bis 1,7 bzw. 3,9 bis 4,5 wird schliessllch eine Lösung von Heparin mit einem mittl.
Molekulargewichtsanteil von 9000 (+ 1000) abgetrennt.
Die bei dem Trennvorgang verwendete Temperatur beträgt zweckmässigerweise von 5 bis 400 C, vorzuasweise wird das Trennverfahren jedoch bei Rauntemperatur (20 bis 250 C) durchgesiWhrt.
Das nach Einstellung eines bestimmten pH-Wertes zu erwartende mittl. Molekulargewicht des Heparins bzw.
seiner Salze kann der beiliegenden Abbildung 1 entnommen werden. Die Bestimmung des mittl. Elolekulargewichts der erhaltenen Fraktionen erfolgt mittels Gelchromatographie, wobei auf Referenzstandard des Heparinnatriums bezogen wird.
Die erhaltene saure Lösung der jeweiligen Fraktionen des Heparins wird mit Hilfe einer Lauge, beispielsweise einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung, falls das Natriurnsalz des Heparins hergestellt werden soll, bzw. von Calciunhydroxid, falls das Calciumsalz des Heparins hergestellt werden soll, auf den pH-Wert der Ausgangslösung (pH 6 bis 7) eingestellt. Daraus wird das erhaltene Heparinsalz auf an sich bekannte Weise, beispielsweise durch Zusatz von Aceton, ausgefällt.
Beispiel 1: Herstellungsvorschrift für Heparin-Natrium-Fraktionen im Bereich von 6000 bis 11.000 Molekulargewichtseinheiten 1000 g Heparin-Natrium mit einem mittl. Molgewicht von ca.
15.000 werden in 6,66 Liter destilliertem Wasser gelöst und am pH-Meter der pH-Wert dieser Lösung ermittelt.
Diese Lösung wird mit ca. 145 ml 25 %-iger Salzsäure auf pH 2,7 eingestellt und über ein Faltenfilter Nr.
520 b 1/2 ( 320 mm) der Firma Schleicher & Schüll filtriert, Das Filtrat wird eine Stunde durch ein Molekularfiltrationsmembran mit einer nominalen Ausschlussgrenze von 10.000 Molekulargewichtseinheiten bei folgenden Bedingungen unter Lichtschutz umgepumpt und anschliessend filtriert.
Temperatur: Raumtemperatur Filter Pellicon Filterkassette (Cat.Nr. PTGC 00001 Fa. Millipore) Druck eingangsseitig: 3.2 . 10 Pa Druch retentatseitig: 1.2 . 105 Pa Gesamtdurchfluss: zu 200 ml/Min.
Durchfluss Retentat: ~ 196 ml/Min.
Durchfluss Filtrat: ~ 4 ml/Mill.
Nach einstündigem Umpumpen wird der Filtratfluss in ein separates Gefäss geleitet und aufgefangen. Die Filtration wird nach ca. 24 Stunden abgebrochen. Das Filtrat, ca. 1000 - 1200 ml, wird am pH-Meter auf den Ausgangswert der Heparin-Natrium-Lösung, ~ pH 7, mit ca. 3 ml 30 % Natronlauge eingestellt. Diese Lösung ist die 1.
Fraktion.
Das Retentat wird mit ca. 10 ml 30 z Natronlauge auf pH 3,5 eingestellt und nochmals, unter den oben angegebenen Bedingungen, 24 Stunden filtriert. Das erhaltene Filtrat, ca. 800 ml, wird am pH-Meter wieder auf den Ausgangswert ~ pH 7 eingestellt. Diese Lösung ist die 2. Fraktion.
Das Rententat dieser Filtration wird mit ca. 60 ml 30 %-iger Natronlauge auf pH 4,2 eingestellt und nochmals unter den oben angegebenen Bedingungen 24 Stunden filtriert. Das erhaltene Filtrat, ca. 500 ml, wird am pH-Meter auf den Ausgangswert v pH 7 eingestellt. Diese Lösung ist die 3. Fraktion.
Die drei Fraktionen werden wie folgt getrennt aufgearbeitet: Das neutralisierte Filtrat wird mit dem l,l-fachen Volumen Aceton versetzt und das im Filtrat befindliche Heparin-Natrium ausgefällt. Den Niederschlag (ölige, viskose Flüssigkeit) lässt man über Nacht absitzen und dekantiert das überstehende Lösungsmittel. Der Rückstand wird mit ca. der dreifachen Menge Methanol überschichtet und mit einem Rührer bei ca.
1000 U/Min. gut verrührt. Dadurch fällt das Heparin in Form eines weisslichen Niederschlages an, der anschliessend in einer Reibschale unter Methanol granuliert werden kann. Die daraus erhaltene Suspension wird abfiltriert. Der Rückstand wird dann bei 600 C und ca. 200 Pa im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
Sollte der Gehalt an NaCl >0,5 % sein, so ist eine 2.
Fällung erforderlich.
Die so erhaltenen Fraktionen haben folgende Spezifikationen: Elementaranalyse Fraktion 1 Fraktion 2 Fraktion 3 C 23,7 % 24,9 % 24,4 % H 3,3 % 3,1 % 3,2 % N 2,9 % 2,4 % 2,7 % 0 47,1 % 45,9 % 46,8 % S 11,7 % 11,9 % 11,6 % Na 12,3 % 11,8 % 11,3 % Heparin-Aktivität ~75#5 IE/mg ~80#5 IE/mg ~90#5 IE/mg (PTT-Test, bezogen auf WHO-Standard III) Anti X -Aktivität ~150#10 U/mg ~155+10 Ulnig ~160+10 U/mg a Häufigstes Molekular- ~ 6000+ 1000 - 8000+1000 ~ 9000+1000 gewicht NaCl-Gehalt 40,5 % <0,5 % <0,5 % Beispiel 2: Herstellungsvorschrift für Heparin-natrium mit einem mittleren Molekulargewicht von 6000 + 1000 1000 g Heparin-Natrium mit einem mittleren Molgewicht von ca. 15.000 werden in 6,66 Liter destilliertem Wasser gelöst und am pH-Meter der pH-Wert dieser Lösung ermittelt. Diese Lösung wird mit ca. 145 ml 25 %-iger Salzsäure auf pH 2,7 eingestellt und über ein Faltenfilter Nr. 520 b 1/2 ( 320 mm) der Firma Schleicher & Schüll filtriert. Das Filtrat wird eine Stunde durch eine Pellicon Filterkassette der Firma Millipore mit einer nominalen Ausschlussgrenze von 10.000 Molekulargewichtseinheiten bei folgenden Bedingungen unter Lichtschutz umgepumpt und anschliessend filtriert: Temperatur: Raumtemperatur Filter: Pellicon Filterkassette.
(Cat.No. PTGO 0001), Fa. Millipore 5 Druck eingangsseitig: 3,2 . 10 Pa Druck retentatscitig: 1,2 . 105 Pa Gesamtdurchfluss: : ~ 200 ml/Min.
Druchfluss Retentat: ~196 ml/tXlin.
Durchfluss Filtrat: ~ 4 ml/Min.
Nach einstündigem Umpumpen wird der Filtratfluss in ein separates Gefäss geleitet und aufgefangen. Die Filtration wird nach ca. 24 Stunden abgebrochen. Dabei sind ca. 1000 bis 1200 rl Filtrat vorhanden. Dieses Filtrat wird am pH-Meter mit ca. 3 ml 30 %-iger Natronlauge auf den Ausgangswert der Heparin-NatriunwLösung, ~pH 7, eingestellt. Das Filtrat wird dann mit dem l,l-fachen Volumen Aceton versetzt und das im Filtrat befindliche Heparin-Natrium ausgefällt. Den Niederschlag (ölige, viskose Flüssigkeit) lässt man über Nach absitzen und dekantiert das überstehende Lösungsmittel. Der Rückstand wird mit ca. der dreifachen Menge Methanol über schichtet und mit einem Rührer bei ca. 1000 U/Min. gut verrührt. Dadurch fällt das Heparin in Form eines weisslichen Niederschlages aus, der anschliessend in einer Reibschale unter Methanol granuliert wird. Die daraus erhaltene Suspension wird über ein 585er oder 595er Scheibenfilter der Flrma Schleicher & Schüll filtriert. Der Rückstand wird dann bei 600 C und ca.
200 Pa im akuu:rnrackenschrank getrocknet. Sollte der Gehalt an NaCl ) 5 % sein, so ist eine 2. Umfällung erforderlich.
Die so erhaltene Fraktion besitzt die nachfolgenden Spezifikationen: Elementaranalyse: C : 23,7 % H : 3,3 % N : 2,9 % o : 47,1 % S : 11,7 % Na: 12,3 % Heparin-Aktivität: ~75 # 5 IE/mg (PTT-Test, bezogen auf WHO-Standard III) Anti Xa-Aktivität ~150 # 10 U/mg Häufigstes Molekulargew.: 6000 + 1000 NaC1-Gehalt: # 0,5 %

Claims

Verfahren zur Herstellung von niedermolekularem Heparin bzw. seinen Salzen Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von niedern:olekularem Heparin bzw. seinen Salzen dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung des natürlichen Heparins bei einem pH-Wert von 1 bis 5,5 einer Ultrafiltration unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man zu niederrnolekularem Heparin bzw. seinen Salzen mit einem mittl. rlolekulargewicht von 6000 bis 10.000 gelangt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von Heparin bzw. seinen Salzen mit einem mittl. Molekulargewicht von 6000 (# 1000) natürlIches Heparin bei einen pH-Wert von 2,2 bis 2,8 einer Ultrafiltration unterwirft.
4. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von Heparin bzw. seinen Salzen mit einem mittl. Molekulargewicht von 8000 (+ 1000) natürliches Heparin bei einem pH-Wert von 1,7 bis 2,3 bzw. 3,2 bis 3,8 einer Ultrafiltration unterwirft.
5. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von Heparin bzw. seinen Salzen mit einem mittl. Molekulargewicht von 9000 (+ 1000) natürliches Heparin bei einem pH-Wert von 1,1 bis 1,7 bzw. von 3,9 bis 4,5 einer Ultrafiltration unte-nirft.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass man die Auftrennung in einer wässrigen Lösung gegebenenfalls in Gegenwart von 5 bis 10 g eines aliphatischen Alkohols wie Methanol oder Aethanol durchführt.