DE1617889B1 - Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der Funktion des retikulo-endothelialen Systems aus einer einzelligen gruenen Alge - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der Funktion des retikulo-endothelialen Systems aus einer einzelligen gruenen AlgeInfo
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Description
1 2
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur endothelialen Systems besitzt, die derjenigen des
Herstellung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der »Zymosans« überlegen ist.
Funktion des retikulo-endothelialen Systems aus Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zueiner
einzelligen grünen Alge, wie z. B. »Chlorella« gründe, ein verbessertes Verfahren zur Extraktion
oder »Scenedesmus«, durch sukzessive Extraktion 5 eines zur Stimulierung der Funktion des retikuloder
grünen Alge mit einem hydrophilen organischen endothelialen Systems wirksamen Stoffs aus einLösungsmittel,
Wasser, einer alkalischen wäßrigen zelligen grünen Algen, wie ζ. B. »Chlorella« zu schaf-Lösung
und einer sauren wäßrigen Lösung. fen, bei welchem die Stufe der Entfernung der Ver-
Der allgemeine Ausdruck »retikulo-endotheliales unreinigungen durch Zugabe von Bleiacetat und
System« bezieht sich auf gewisse Gewebezellen, wie io Zugabe von Schwefelwasserstoff weggelassen wird,
z. B. Zellen, die in der Leber, im Knochenmark, der Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch
Milz, der Nebennierendrüse und der Hypophyse vor- gelöst, daß man die grüne Alge aufeinanderfolgend
kommen, oder auf Adventitazellen, die im Binde- mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel,
gewebe vorkommen, und auf einzelne Zellen, die einem Gemisch des hydrophilen organischen Lösungsim
Blut oder in ähnlichem vorhanden sind. Der 15 mittels mit Wasser, Wasser, einer alkalischen oder
Ausdruck bezieht sich jedoch insbesondere auf Ge- sauren wäßrigen Lösung unter Erwärmen extrahiert,
webezellen, wie das Endothel der genannten inneren um einen Lösungsmittelextrakt, einen Wasserextrakt,
Organe, die auf Grund von Phagocytose degeneriert einen alkalischen Wasserextrakt und einen sauren
sind. Die charakteristische Funktion des retikulo- Wasserextrakt herzustellen, daß man das hydroendothelialen
Systems ist eng mit der Entfernung von 20 phile organische Lösungsmittel, den alkalischen Stoff
Fremdkörpern, der Bildung von Antikörpern und und den sauren Stoff von den einzelnen Extrakten
der Erhöhung der nicht-spezifischen Resistenzen des abtrennt, daß man die einzelnen Extrakte bei verWirtes
gegen Infektion verknüpft. rnindertem Druck jeweils zu einem ersten konzentrier-
Kürzlich wurde ein Stoff zur Stimulierung der ten Extrakt konzentriert, daß man durch Zusatz von
Funktion des retikulo-endothelialen Systems gefun- 25 Äthanol zu jedem der ersten konzentrierten Extrakte,
den. Es wurde berichtet, daß das sogenannte «Zymo- bis die Konzentration an Äthanol etwa 80 °/o erreicht,
san», welches ein aus den Zellwandungen von Hefe die Verunreinigungen als Niederschlag ausfällt, daß
extrahiertes wasserunlösliches Polysaccharid ist, eine man den ausgefällten Niederschlag von den einzelnen
derartige Funktion besitzt (Annals of the New York Extrakten abtrennt, daß man die einzelnen Extrakte
Scientific Institute, Bd. 118, Art. 4, S. 233 [1964]). 30 bei vermindertem Druck zu jeweils einem zweiten
Es wurde auch berichtet, daß das »Zymosan« zur konzentrierten Extrakt erneut konzentriert, daß man
Verhinderung von Arteriosklerose, zum Schutz gegen durch Eingießen der einzelnen zweiten konzentrierten
einen bösartigen Tumor oder zum Schutz gegen Extrakte in einen großen Überschuß von absolutem
Infektionskrankheiten und zur Vermeidung von Äthanol den Wirkstoff als weißen Niederschlag ausradioaktiven
Krankheiten wirksam ist, und zwar auf 35 fällt, daß man den weißen Niederschlag jeweils von
Grund seiner Funktion der Stimulierung der Aktivi- den zweiten konzentrierten Extrakten abtrennt und
tat des retikulo-endothelialen Systems. daß man gewünschtenfalls die weißen Niederschläge
Die einzellige grüne Alge »Chlorella« enthält die entweder für sich oder nach ihrer Vereinigung reinigt,
allgemein bekannten Monosaccharide, wie z. B. Zweckmäßigerweise fällt man den Wirkstoff durch
Pentose, Hexose usw., und gewisse Polysaccharide 40 Eingießen der einzelnen Extrakte in das lOOfache
mit einer komplizierten chemischen Zusammenset- Volumen von absolutem Äthanol aus.
zung und Struktur. Es wurde bisher angenommen, Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die ein-
daß diese Polysaccharide nicht als Stoff in der zellige grüne Alge, wie z. B. »Chlorella« oder
»Chlorella« eingelagert sind, sondern- Bestandteile »Scenedesmus« im pulverisierten trockenen Zustand
der Zellwandungen der »Chlorella« bilden. Es wurde 45 oder im Zustand von rohen grünen Algen, die eine
deshalb auch angenommen, daß diese Polysaccharide beträchtliche Menge Wasser enthalten, verwendet
schwierig aus den Zellen zu extrahieren sind, und werden. Beispiele für hydrophile organische Lösungs-
zwar auf Grund der Steifheit der Zellwandungen. mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden kön-
Es wurde bereits von den gleichen Erfindern ein nen, sind Methanol, Äthanol, Aceton u. ä. Ein der-Verfahren
zur Extraktion eines zur Stimulierung der 5° artiges hydrophiles organisches Lösungsmittel kann
Funktion des retikulo-endofhelialen Systems Wirk- mit der wasserhaltigen rohen einzelligen grünen Alge
Stoffs aus einzelligen grünen Algen, wie z. B. »Chlo- gemischt werden, so daß eine Konzentration des
rella« gefunden, bei welchem man die grüne Alge organischen Lösungsmittels von ungefähr 80 % eraufeinanderfolgend
mit Wasser, einer alkalischen zielt wird. Wenn .andererseits die einzellige grüne
wäßrigen Lösung und einer sauren wäßrigen Lösung 55 Alge im trockenen Zustand verwendet wird, dann
extrahiert, die in jedem der Extrakte enthaltenen kann die grüne Alge mit einem hydrophilen organi-Verunreinigungen
durch Zugabe von Bleiacetat ent- sehen Lösungsmittel, das eine Konzentration von
fernt, eine Fällung eines unlöslichen Stoffs durch ungefähr 80 % besitzt, gemischt werden. Auf jeden
Zugabe von Äthylalkohol zu jedem der konzentrier- Fall wird die einzellige grüne Alge in einen Extraktor
ten Extrakte herstellt, und die Fällung aus jedem der 60 eingebracht, der mit einem Rückflußkühler ausgekonzentrischen
Extrakte abtrennt. Es wurde festge- rüstet ist, und dann mit dem hydrophilen organisteilt,
daß der chemisch extrahierte Stoff Stickstoff- sehen Lösungsmittel unter Erhitzung extrahiert,
haltige Polysaccharide enthält und daß sich dieser um einen Lösungsmittelextrakt herzustellen. Der
Stoff von allen bekannten Polysacchariden unter- Lösungsmittelextrakt wird durch Entfernung des
scheidet. Weiterhin wurde bei der Untersuchung der 65 hydrophilen organischen Lösungsmittels bis zum
physiologischen Funktion eine wichtige Tatsache ge- sirupösen Zustand unter vermindertem Druck konfunden,
nämlich daß der Stoff eine vorteilhafte Funk- zentriert,
tion bei der Stimulierung der Aktivität des retikulo- Die mit dem Lösungsmittel extrahierte restliche
tion bei der Stimulierung der Aktivität des retikulo- Die mit dem Lösungsmittel extrahierte restliche
3 4
grüne Alge wird dann unter Erhitzen mit Wasser dunkelgrüner opaker Extrakt erhalten wurde. Die
extrahiert, um einen Wasserextrakt herzustellen. Der restliche »Chlorella« wurde ein weiteres Mal mit
Wasserextrakt wird unter vermindertem Druck bis 21 Äthanol mit einer Konzentration von 80 % in
zum sirupösen Zustand konzentriert. Die mit Wasser der gleichen Weise, wie oben beschrieben, extrahiert,
extrahierte restliche grüne Alge wird dann unter 5 um einen zweiten Extrakt herzustellen. Das Äthanol-Erhitzen
mit einer alkalischen wäßrigen Lösung extraktionsverfahren wurde mit der restlichen »Chloextrahiert,
um einen alkalischen Wasserextrakt her- rella« in der gleichen Weise wie oben beschrieben
zustellen. Der alkalische Stoff wird von dem Wasser- fünfmal wiederholt. Die fünf Extrakte wurden in
extrakt entfernt, worauf der alkalische Wasserextrakt einem Behälter gesammelt, der dann ungefähr 10 1
unter vermindertem Druck bis zum sirupösen Zu- io Extrakt enthielt. Der auf diese Weise gesammelte
stand konzentriert wird. Extrakt wurde unter vermindertem Druck destil-
Weiterhin wird die mit alkalischem Wasser extra- liert, um Äthanol zu entfernen, und die wasserhierte
restliche grüne Alge unter Erhitzen mit einer unlöslichen Stoffe, wie z. B. Chlorophyl usw., wurden
sauren wäßrigen Lösung extrahiert, um einen sauren durch Filtration abgetrennt. Wenn das auf diese
Wasserextrakt herzustellen. Der saure Stoff wird vom 15 Weise erhaltene Filtrat dunkel gefärbt war, dann
sauren Wasserextrakt entfernt, und der saure wurde es mit Aktivkohle entfärbt und dann unter
Wasserextrakt wird unter vermindertem Druck bis vermindertem Druck konzentriert, so daß ungefähr
zum sirupösen Zustand konzentriert. 30 ml sirupöse Flüssigkeit erhalten wurde. Die so
Jeder der oben genannten konzentrierten Extrakte erhaltene sirupöse Flüssigkeit wurde in ungefähr
wird mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel 20 3 1 absolutes Äthanol unter Rühren eingegossen und
gemischt, bis die Konzentration eines jeden Gemisches es wurde eine weiße flockige Fällung erhalten. Das
ungefähr 80 % erreicht, wodurch Verunreinigungen, Gemisch aus dieser Fällung und Äthanol wurde über
wie z. B. Protein, organische Säuren, Tannin und Nacht in einen Kühlschrank gestellt, worauf das
färbende Stoffe, ausgefällt werden. Die Ausfällung Äthanol von dem Gemisch durch zentrifugieren
wird von jedem Gemisch durch Filtration abge- 25 abgetrennt wurde, Die Fällung wurde durch mehrtrennt,
und hierauf wird jedes der Gemische aber- maliges Waschen mit Äthanol gereinigt. Die auf diese
mais durch Entfernung des hydrophilen organischen Weise erhaltene Fällung wurde mit »Fraktion I« beLösungsmittels
bis zum sirupösen Zustand konzen- zeichnet. Die mit Äthanol extrahierte restliche
triert. Der Sirup wird unter Rühren in absolutes »Chorella« wurde mit 21 Wasser unter 5stündigem
Ätanol gegossen, worauf eine weiße, flockige Fäl- 30 Sieden, währenddessen das Gemisch gerührt wurde,
lung aus der Äthanollösung ausfällt. Die Äthanol- extrahiert. Das Gemisch wurde abgekühlt und fillösung
wird über Nacht in einen Kühlschrank ge- triert, wobei ein hellbrauner bis gelblicher trüber
stellt, um die Ausfällung zu vervollständigen, worauf Extrakt erhalten wurde. Das Wasserextraktionsverdie
Ausfällung abgetrennt und gereinigt wird, wobei fahren wurde mit der restlichen »Chlorella« wiederder
in den einzelligen grünen Alge enthaltene Poly- 35 holt, bis der Extrakt farblos wurde; auf diese Weise
saccharidkomplex erhalten wird. Diese Polysac- wurden insgesamt etwa 71 Extrakt erhalten. Dieser
charide sind im Wasser löslich und können als Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf unge-Wasserlösung
gelagert werden. Die Wasserlösung fähr 100 ml konzentriert, worauf 400 ml absolutes
der weißen flockigen Fällung ist eine klare blaß- Äthanol unter Rühren zugegeben wurden, wobei sich
braune Lösung. Nach der Entfernung der freien 4° eine Fällung bildete. Die Fällung wurde vom Extrakt
Saccharide aus der Wasserlösung werden die Proben durch Filtration abgetrennt, worauf das Äthanol vom
der enthaltenen Lösung durch die Molischsche Reak- Extrakt unter vermindertem Druck entfernt wurde;
tion getestet, wobei gefunden wird, daß sie positiv dabei wurden ungefähr 30 ml einer sirupösen Flüssigausfällt.
Dies zeigt die Tatsache, daß die weiße keit gebildet.
Fällung das Polysaccharid ist. Die gleichen Proben 45 Die auf diese Weise erhaltene sirupöse Flüssigkeit
werden auch durch Stickstoffanalyse getestet, wobei wurde unter Rühren in ungefähr 31 absolutes Äthanol
gefunden wird, daß sie große Mengen Stickstoff ent- gegossen, wobei eine heiße flockige Fällung erhalten
halten. Dies zeigt die Tatsache, daß in der weißen wurde- Die Fällung wurde in der gleichen Weise, wie
Fällung der stickstoffhaltige Polysaccharidkomplex oben beschrieben, behandelt, um eine gereinigte
enthalten ist. 50 Fällung herzustellen. Diese gereinigte Fällung wird
Es ist darauf hinzuweisen, daß das erfindungs- als »Fraktion II« bezeichnet.
gemäße Verfahren auf jede grüne Alge, wie z. B. Die mit Wasser extrahierte restliche »Chlorella«
»Scenedesmus«, anwendbar ist und daß der dabei wurde mit 21 einer 5prozentigen Ätznatronlösung
erhaltene Stoff die gleichen pharmakologischen Wir- extrahiert, indem die »Chlorella« auf einem siedenden
kungen besitzt wie der aus der »Chlorella« herge- 55 Wasserbad ungefähr 3 Stunden unter Rühren erhitzt
stellte Stoff. wurde. Das Gemisch wurde abgekühlt und filtriert,
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel wobei ungefähr 2 1 eines dunkelgrünen, opaken
erläutert. · Extrakts erhalten wurden. Zum Extrakt wurde eine
lOprozentige Salzsäure zugegeben, um seinen
Beispiel 60 pH-Wert auf 6,5 einzustellen und um eine Fällung
zu erzeugen. Die Fällung wurde filtriert, und der
100 g trockenes Pulver der .»Chlorella« wurden in Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf ungeeinen
Extraktor eingebracht, der mit einem Rück- fähr 100 ml konzentriert, worauf der konzentrierte
flußkühler ausgerüstet war, und mit 21 Äthanol mit Extrakt über Nacht in fließendem Wasser dialysiert
einer Konzentration von 80 °./o extrahiert, indem das 6g wurde, um die anorganischen Salze zu entfernen.
Gemisch bei 80° C auf einem Wasserbad ungefähr Der Extrakt wurde schließlich auf ungefähr 50 ml
1 Stunde unter Rühren erhitzt wurde. Das erhaltene konzentriert. Dieser konzentrierte Extrakt wurde
Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ein unter Rühren in ungefähr 200 ml absolutes Äthanol
gegossen, um die Verunreinigung, wie z. B. Protein und färbende Stoffe, abzuscheiden, worauf die Verunreinigungen
vom Extrakt durch Filtration entfernt wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck
zur Entfernung des Äthanols destilliert und weiterhin " zu ungefähr 20 ml einer sirupösen Flüssigkeit konzentriert.
Diese sirupöse Flüssigkeit wurde unter Rühren in ungefähr 21 absolutes Äthanol eingegossen,
wobei eine weiße flockige Fällung erhalten wurde. Diese Fällung wurde in der gleichen Weise,
wie oben beschrieben, zur Herstellung einer gereinigten Fällung behandelt. Die gereinigte Fällung wird
als »Fraktion ΙΠ« bezeichnet.
Schließlich wurde die mit alkalischem Wasser extrahierte restliche »Chlorella« mit 11 einer 5prozentigen
Schwefelsäure extrahiert, indem die »Chlorella« auf einem siedenden Wasserbad unter Rühren
3 Stunden erhitzt wurde. Das Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ungefähr 11 eines gelblichbraun Extrakts erhalten wurde. Zu diesem Extrakt
wurde Kalziumkarbonat gegeben, um Kalziumsulfat zu bilden. Das Kalziumsulfat wurde aus dem Extrakt
durch Filtration entfernt, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck auf ungefähr 50 ml konzentriert
wurde, worauf 200 ml absolutes Äthanol unter Ruhren zugegeben wurden, um die Verunreinigungen
auszufällen, die durch Filtration vom Extrakt entfernt wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem
Druck destilliert, um das Äthanol zu entfernen, und dann weiterhin zu 20 ml einer sirupösen Flüssigkeit
konzentriert. Diese sirupöse Flüssigkeit wurde unter Rühren in ungefähr 21 absolutes Äthanol gegossen,
wodurch eine weiße flockige Fällung erhalten wurde. Diese Fällung wurde in der gleichen Weise, wie oben
beschrieben, behandelt, um eine gereinigte Fällung herzustellen. Die gereinigte Fällung wird mit »Fraktion
IV« bezeichnet.
»Fraktion I«, »Fraktion Π«, »Fraktion ΠΙ« und
»Fraktion IV« waren wasserlöslich. Jede Fraktion wurde in Wasser zur Herstellung einer Lösung aufgelöst.
Nach Entfernung der freien Saccharide aus jeder Lösung wurde sie durch die Molischsche Reaktion
und durch Stickstoffanalyse untersucht. Die Reaktion war positiv, und es wurde auch gefunden,
daß die Lösung ungefähr 3 % Stickstoff enthielt.
Es war deshalb anzunehmen, daß die gereinigte Fällung aus einem stickstoffhaltigen Polysaccharidkomplex
bestand. Die gesamte Ausbeute der »Fraktionen I bis IV« betrug ungefähr 3 %. Weiterhin
wurde die gereinigte Fällung auf die Funktion zur Stimulierung der Aktivität des retikulo-endothelialen
Systems untersucht.
Der Versuch zur Messung der Funktion des retikulo-endothelialen Systems wurde unter Verwendung
der Halpernschen Methode durchgeführt, welche in der Wissenschaft allgemein bekannt ist
und in »British Journal of Experimental Pathology«, Bd. 34, S. 426 bis 441 (1953) beschrieben ist.
Bei dieser Methode wird einem Versuchstier »Donryu-Ratte« Tusche intravenös injiziert, und
nach einer gewissen Zeit wird die Versuchsratte ausbluten gelassen, und die Menge der Kohlenstoffteilchen
im Blut wird gemessen. Wenn die Funktion der Ratte bei der Entfernung der Kohlenstoffteilchen
erhöht wird, dann wird die Tusche aus dem Blut der Versuchsratte rascher entfernt und die Menge
der verbleibenden Kohlenstoffteilchen wird herabgesetzt.
Die Versuchsergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 angegeben.
Fig. 1 zeigt den granulopektischen Index des Versuchstiers »Donryu-Ratte«, welches unter Verwendung
einer Kontrollprobe, Zymosan ^4, Zymosan
B, Stoffe und StoffB getestet wurde. Es wird
bemerkt, daß die Stoffe A und B die Polysaccharide waren, die nach den Verfahrensweisen des Beispiels
1 hergestellt wurden. Weiterhin wird bemerkt, daß Zymosan ,4 und Stoffe in die Versuchsratte in
einer Menge von 1 mg je 100 g Körpergewicht und daß Zymosan B und Stoff B in. die Versuchsratte in
einer Menge von 10 mg je 100 g Körpergewicht injiziert wurden. »K« bedeutet den granulopektischen
Index der Versuchsratten und wurde aus der Formel Log. C · Log. C/T errechnet, worin C" die Konzentration
der Tusche im Blut (mg/100 ml) 10 Minuten nach der Injektion der Tusche, C die Konzentration
der Tusche im Blut (mg/100 ml) 20 Minuten nach Injektion der Tusche und T 10 Minuten bedeutet.
»X« bedeutet den Durchschnittswert von »K«.
Aus den in F i g. 1 gezeigten Ergebnissen geht her- g vor, daß die Stoffe^ und B, die erfindungsgemäß "
extrahiert worden waren, einen höheren granulopektischen Index ergeben, als die Kontrollprobe, Zymosan
A und Zymosan B. Diese Tatsache zeigt, daß die Stoffe A und B eine bessere Stimulierungswirkung
auf das retikulo-endotheliale System besitzen als die anderen untersuchten Proben.
F i g. 2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Konzentration der Kohlenstoffteilchen im Blut der
Versuchsratte und der verstrichenen Zeit. Linie 1 zeigt die Änderungen in der Konzentration der Kohlenstoffteilchen
im Blut der Versuchsratte, die mit dem gemäß der Erfindung hergestellten extrahierten
Stoff injiziert worden war, Linie 2 zeigt die Änderungen der Konzentration der Kohlenstoffteilchen
im Blut der Versuchsratte, die mit Zymosan injiziert worden war, und Linie 3 bezieht sich auf die Vergleichsratte,
die mit keiner Medizin injiziert worden war. Ein Vergleich der Linie 1 mit der Linie 2 zeigt,
daß die medizinische Wirkung des gemäß der Erfindung extrahierten Stoffs im wesentlichen die gleiche *
ist wie von Zymosan. \
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der Funktion des retikulo-endothelialen
Systems aus einer einzelligen grünen Alge, dadurch gekennzeichnet, daß man die grüne Alge aufeinanderfolgend mit einem hydrophilen
organischen Lösungsmittel, einem Gemisch des hydrophilen organischen Lösungsmittels mit
Wasser, Wasser, einer alkalischen oder sauren wäßrigen Lösung unter Erwärmen extrahiert, um
einen Lösungsmittelextrakt, einen Wasserextrakt, einen alkalischen Wasserextrakt und einen sauren
Wasserextrakt herzustellen, daß man das hydrophile organische Lösungsmittel, den alkalischen
Stoff und den sauren Stoff von den einzelnen Extrakten abtrennt, daß man die einzelnen
Extrakte bei vermindertem Druck jeweils zu einem ersten konzentrischen Extrakt konzentriert,
daß man durch Zusatz von Äthanol zu jedem der ersten konzentrierten Extrakte, bis die Konzentration
an Äthanol etwa 80 °/o erreicht, die Verunreinigungen
als Niederschlag ausfällt, daß man
den ausgefällten Niederschlag von den einzelnen Extrakten abtrennt, daß man die einzelnen
Extrakte bei vermindertem Druck zu jeweils einem zweiten konzentrierten Extrakt erneut konzentriert,
daß man durch Eingießen der einzelnen zweiten konzentrierten Extrakte in einen großen
Überschuß von absolutem Äthanol den Wirkstoff als weißen Niederschlag ausfällt, daß man
den weißen Niederschlag jeweils von den zweiten
konzentrierten Extrakten abtrennt und daß man gewünschtenfalls die weißen Niederschläge entweder
für sich oder nach ihrer Vereinigung reinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff durch Eingießen
der einzelnen zweiten konzentrierten Extrakte in das lOOfache Volumen von absolutem
Äthanol ausfällt.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
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