-
Verfahren zur Abtrennung von Polysacchariden und Proteinen aus pflanzlichen
oder tierischen Stoffen Das Patent 654 256 betrifft ein Verfahren zur Abtrennung
von biologisch wertvollen Bestandteilen aus pflanzlichen oder tierischen Stoffen
durch Schaumausschüttlung, wobei die Ausgangsstoffe vor der Ausschüttlung einem,
gegebenenfalls wiederhohem Gefrierenlassien und Auftauen. unterworfen werden. Hierbei
erhält man biologisch wertvolle Stoffe, wie Polysaccharide, Fermente, Enzyme, sowie
eiweißartige Stoffe (Hormone) u. dgl.
-
Es wurde gefunden, daß man die Gewinnung von proteinfreien Polysacchariden
und Proteinen aus den ob.enerwähnten Ausgangsstoffen in sehr vorteilhafter Weise
auch dann durchführen kann, wenn man auf sie das Emulsionsausschüttlungsverfahren
zur Anwendung bringt, ohne die Ausgangsmaterialien einer besonderen Vorbehandlung
in der Kälte zu unterwerfen.
-
Die sog. Schaumausschüttlung ist zwar bereits an einer Reihe von Stoffen,
wie Peptonlösungen, Blut, Ölen und Fetten, durchgeführt worden, dagegen hat man
Polysaccharide mit Hilfe der Schaumausschüttlung noch nicht von Proteinen getrennt,
und es war auch nicht vorauszusehen, daß die Anwendung der Schaumauss,chüttlung
zur Gewinnung dieser Stoffe erfolgreich sein würde, da die Polysaccharide einer
ganz anderen chemischen Körperklasse angehören als die Fette, Öle, Peptone und das
Blut.
-
Beispiele i. Kohlehydrat aus getrocknetem Eiereiweiß (Handelspräparat)
i o g getrocknetes, pulverisiertes Eiereiweiß werden mit zo ccm Wasser zu einer
dicken Paste verrieben, sofort in einer Mischung von Zoo ccm Wasser, 6o ccm Chloroform
und 2o ccm Amylalkohol aufgeschwemmt und 15 Stunden geschüttelt. Darauf wird zentrifugiert
und die überstehende Flüssigkeit abgehoben. Das erhaltene Sediment wird wieder in
z5oo ccm Wasser suspendiert und 15 Stunden mit der obigen Chloroform- und Amylalkohollösüng
geschüttelt. Die beim Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit
der beim ersten Ausschütteln erhaltenen vereinigt. Der Rückstand wird nochmals in
gleicher Weise behandelt und auch der dabei erhaltene Wasserextrakt mit den beiden
ersten vereinigt und im Faust-Heim-Apparat bei 37° zur Trockne verdampft. Der Trockenrückstand
wird erneut in i 5oo ccm Wasser suspendiert und die Suspension mit einer Mischung
von 20o ccm
Chloroform und 30 ccm Amylalkohol i , Stunden
geschüttelt. Die nach dem Zentrifagieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird
durch ein Seitz-Filter filtriert und das Filtrat im Luftstrom bei 37° zur Trockne
gebracht. Der Rückstand wird i Stunde lang bei 6o° getrocknet und 2 Tage .lang bei
37° in, einem Wärmeschrank stehengelassen, in 200 ccm Wasser gelöst und durch ein
Seitz-Filter filtriert. Das Filtrat wird im Luftstrom bei 37° zur Trockne verdampft,
der Trockenrückstand in i5o ccm Wasseraufgelöst und wieder zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wird allmählich zu 6oo ccm 96°/oigem Alkohol hinzugefügt und zentrifugiert.
Der dabei erhaltene Rückstand wird in i5o ccm Wasser aufgelöst, mit 6oo ccm 96°/Qigem
Alkohol wie oben behandelt und nochmals zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag
stellt eine proteinfreie Kohlehydratfraktion des Eiweißes dar. Er ist schwach gelb
gefärbt und gibt positive Zuckerreaktionen. Ausbeute 0,735 g, also
7,35 °/a des Ausgangsmaterials. Er besitzt immunologische Aktivität. 2. Polysaccharide
aus käuflicher Preßhefe 25o g käufliche Preßhefe aus einer Bäckerei werden mit Aceton
versetzt, einige Minuten in einem Mörser verrieben, dann durch einen Büchner-Trichter
filtriert, mit Äther gewaschen und bei 6o° getrocknet. Die Ausbeute beträgt etwa
25 %. Diese Trockenhefe wird dann 24. Stunden lang in einer Kugelmühle gemahlen.
-
5o g dieser pulverisierten Trockenhefe werden in 5o ccm Wasser suspendiert
und mit einer Mischung von ioo ccm Methanol, ioo ccm Chloroform, ioo ccm Toluol
und 5o ccm Isoamylalkohol unter Zusatz von Glasperlen 48 Stunden im Schüttelapparat
geschüttelt, zentrifugiert und das Sediment noch einmal in derselben Weise mit organischen
Lösungsmitteln extrahiert. Der Rückstand wird mit Methanol, Aceton und Äther gewaschen.
Die gesammelten Extrakte werden eingedampft und der Trockenrückstand in Wasser aufgenommen.
Es lassen sich zwei Fraktionen unterscheiden: i. eine wasserunlösliche graue, schmierige
Fraktion, in der Hauptsache aus Lipoiden bestehend, Trockengewicht q. g (berechnet
für die Gesamtmenge), Säureäquivalent 2o3 ccm -/1o Na OH; 2. eine wasserlösliche
Fraktion, Trockengewicht q. g (berechnet für die Gesamtmenge), Säureäquivalent 82
ccm n/lo Na OH.
-
Das Sediment, welches nach der Extraktion der Trockenhefe mit dem
oben angeführten Gemisch organischer Lösungsmittel zurückbleibt, wird in einer Mischung
von Soo ccm Wasser, 75 ccm Chloroform und 20 ccm ISO-amylalkohol suspendiert und
nach dem Hinzufügen von Glasperlen io bis 15 Stunden stark geschüttelt. Nach dem
Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit durch Filtrierpapier filtriert.
Die Chloroformschicht, die die Zellreste in gelähnlicher Form enthält, wird noch
sechsmal nacheinander mit Wasser extrahiert. Die vereinigten opalisierenden wäßrigen
Extrakte werden durch Seitz-Filter filtriert und dadurch vollkommen geklärt. Die
Lösung ist hellgelb, reagiert stark sauer gegen Lakmuspapier, zeigt negative Eiweiß-Reaktion
mit Sulfosalicylsäure und sehr starkpositive Molisch-Reaktion, sie enthält die Hauptmenge
des Polysaccharids.
-
Um auch die restliche Menge an Polysaccharid zu gewinnen, wird der
Rückstand von der 6. Extraktion in Aceton suspendiert, zentrifugiert, dann in Äther
suspendiert, filtriert, schließlich mit wenig Wasser in einem Mörser zu einer dicken
Paste verrieben und im Sinne des Verfahrens des Hauptpatents dreimal mit flüssiger
Luft behandelt und wieder aufgetaut. Diese Paste wird dann viermal nacheinander
mit Wasser extrahiert. Diese auf Grund der Behandlung mit flüssiger Luft noch gewonnenen
wäßrigen Extrakte stellen nach der Filtration durch Seitz-Filter klare farblose
Lösungen dar, die ganz schwach sauer gegen Lakmus reagieren, negative Eiweißreaktion
mit Sulfosalicylsäure zeigen und deutlich positive Molisch-Reaktion geben.
-
Sämtliche wäßrigen Extrakte, sowohl die vor der Behandlung mit flüssiger
Luft gewonnenen wie die nachher erhaltenen, werden vereinigt und auf Zoo ccm eingedampft,
zweckmäßig im Faust-Heim-Apparat bei 37°, da bei der Konzentrierung jede Erhitzung
tunlichst zu vermeiden ist. Die stark eingeengte Lösung ist sirupähnlich, reagiert
stark sauer und hat einen scharfen, sehr charakteristischen Geruch nach Essigsäure.
Diese Lösung (Zoo ,ccm) wird mit 400 ccm Methanol, i oo ccm Chloroform, ioo ccm
Toluol, Zoo ccm .Aceton und 5o ccm Amylalkohol versetzt und über :Nacht mit Glasperlen
geschüttelt, dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit beträgt io25 ccm (i.
Extrakt). Das Sediment wird nochmals in i 5o ccm Wasser suspendiert und mit denselben
organischen Lösungsmitteln geschüttelt. Nach dem Zentrifugieren beträgt die obenstehende
Lösung 85o ccm (2. Extrakt).
| Der i. Extrakt verbraucht 240 ccin n/10 Na 0 H. |
| Der 2. Extrakt verbraucht 55 ccm n/lo N a O H. |
| Gesamtverbrauch ...... 295 ccm n/lo Na 0 H. |
Zur Bestimmung des Anteils der flüchtigen Säuren wird ein Teil der beiden vereinigten
Lösungen der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, deren Gesamt-Säure-Äquivalent
mit 295 ccm n/lo Na O H angegeben
wurde, im Faust-Heini-Apparat'
getrocknet, er hinterläßt einen in Wasser vollständig klar löslichen Rückstand,
der keine lipoidähnlichen Substanzen mehr ,enthält. Das Säureäquivalent dieses nicht
flüchtigen Rückstandes entspricht, auf die Gesamtmenge (i875 ccm vereinigte Extrakte)
berechnet,
167 ccm n/lo Na O H oder nach weiterer Reinigung dieses Rückstandes
mit Tierkohle z28 ccm n/10 Na OH (Mittelwert 14.7 ccin nh0 NaOH). Nach diesen Ergebnissen
beträgt der Gehalt an flüchtigen Säuren (aus der Differenz berechnet) ungefähr 45
bis 55111, der Gesamtacidität. Dabei muß noch berücksichtigt werden, daß ein Teil
der flüchtigen Säuren schon bei dem Eindampfen der wäßrigen Extrakte im Faust-Heim-Apparat
verlorengeht.
-
Der Rückstand, der verbleibt, wenn man die zuvor erwähnte, auf 200
ccm eingeengte sirupähnliche Lösung mit dem angeiühxten Gemisch aus Methanol usw.
extrahiert hat, besteht zum größten Teil aus Kohlehydrat. Zur Isolierung der Polysaccharide
wird der Rückstand in 6oo ccm Wasser, Zoo ccm Chloroform und 30 ccm Isoamylalkohol
suspendiert, über Nacht geschüttelt und dann zentrifugiert. Nur noch eine geringe
Fällung wird in der Chloroformschicht niedergeschlagen. Die Chloroformschicht wird
nochmals in Wasser suspendiert und zentrifugiert, um etwa absorbiertes Kohlehydrat
auszuwaschen. Die überstehende Lösung wird mit der ersten vereinigt und durch Filterpapier
filtriert. Eine ganz schwache Trübung in der wäßrigen Lösung läßt sich durch Filtration
durch Seitz-Filter entfernen. Das klare Filtrat, welches eine negative Eiweißreaktion
mit Sulfosalicylsäure gibt, wird im Faust-Heim-Apparat auf ein geringes Volumen
eingeengt und das Kohlehydrat durch 2- bis 3fache Menge Äthylalkohol gefällt. Der
Niederschlag wird in Wasser gelöst und nochmal mit Alkohol ausgefällt, dann im Vakuumexsikkator
über Schwefelsäure getrocknet und pulverisiert. Man erhält so .4 g Polysaccharid
und 50 g Trockenhefe. Diese Substanz enthält 1,50/0 Asche und für die aschefreie
Substanz berechnet 44,23 % C, 6,47'/, H und o,6°/0 N.
-
In gleicher Weise kann man auch aus anderen Ausgangsmaterialien, wie
Bakterien, z. B. Pneumokokken, B. Proteus u. a. m., d. h. aus allen pflanzlichen
oder tierischen Stoffen, die neben Polysacchariden Proteine enthalten, beide Bestandteile
in einem Reinheitsgrad isolieren, wie dies bisher nicht möglich war.