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Verfahren zur Gewinnung eines hormonartigen Wirkstoffes aus .tierischen
Eizellen Es ist bekannt, daß tierische Eier, Eizellen, Teile oder deren Extrakte
als unmittelbares Produkt der Keimdrüsen verschiedene Geschlechtshormone in mehr
oder weniger großer Menge enthalten. Bisher sind jedoch nur solche Hormone aus Eizellen
isoliert worden, die primär aus anderen endokrinen Drüsen stammen, z. B. aus Keimdrüsen,
Hypophyde usw., und mit dem Säftestrom in die Eizellen transportiert worden sind.
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Nach dem vorliegenden Verfahren kann nun aus tierischen Eizellen,
und zwar aus Hühnereiern, S;äugetierovarien, Fischregen, Eiern von Reptilien, Taubeneiern
usw. ein neuer, bisher unbekannter Wirkstoff mit Hormoneigenschaften gewonnen werden,
welcher mit keinem der bekannten Hormone der endokrinen Drüsen indentisch ist und
ganz andersartige Wirkungen ausübt.
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Dieser hormonartige Wirkstoff stammt mit hoher Wahrscheinlichkeit
aus der Eizelle selbst und ist deshalb sowohl in den obengenannten Ausgangsstoffen
als auch in deren Teilen und Extrakten enthalten. Unberührt bleibt davon, daß dieser
hormonartige Wirkstoff in gewissen Teilen der genannten Eizellen besonders angereichert
ist, wie z. B. im Hühnerei in der Dotterhaut. Die Wirkung dieses neuen Körpers äußert
sich u. a. in der Veränderung der Uterusschleimhaut, welche den Eintritt der Menstruation
bzw. der Frühgeburt zur Folge hat. Es ist also ein. Antagonist zum Corpus luteum-Hormon,
wobei dahingestellt sein mag, ob es auf den Uterus direkt einwirkt oder auf dem
Wege über ,eine Blockierung des GeIbkörperhormons. Der neue Wirkstoff ist indessen
nicht identisch mit dem Follikelhormon.
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Die Gewinnung des neuen Wirkstoffes geschieht derart, daß das Ausgangsmaterial
zuerst einer abbauenden Einwirkung unterworfen und dann der hormonartige Wirk-
Stoff
yon anderen E iwei1@JSto@fheri dtwch fraktionierte Fällung und Dialyse getrennt
wird.
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Falls nicht nativ, z. B. durch einen natürlichet, Fäuinap.iozeß abgebautes
Eiweißmaterial VLrivendung findet, ist eine ablzau. ende 1?sindlunuaro-rderlich.
Es konnte bewiesen werden, dpß dieser Abbau sowohl mit Säuren, Alkalien als auch
fermentativ erfolgen kann. Als Säureanteil erwiesen sich alle. wasserlöslichen und
nicht den Reaktionsprozeß störenden organischer,. und anorganischen Säuren als verwendbar,
besonders gut Essigsäure und Salzsäure. Dass gleiche gilt analog für die Alkalien,
während der fermentative Abbau sowohl autolytisch. als auch peiltisch vorgenommen
werden. kann, dagegen nicht tryptisch, da hierdurch die Substanz zerstört wir. Die
Eiweißbegleitstoffc werden durch fraktionierte Fällung, und zwar durch vorsichtiges
Zugeben von Säuren oder Salzen abgetrennt und. der gelöste Wirkstoff durch Dialyse
von Salzen befreit, wobei die gesuchte Substanz allmählich ausfällt.
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Die weitere Reinigung hat das Ziel, die Begleiteiweißstbffe zu fällen,
während der Wirkstoff in Lösung bleiben soll. Wird demnach diz Fällung mit Säuren,
wie z. B. Metaphosphorsäure oder Gerbsäure, vorgenommen, so ist zu beachten, daß
nur so viel Säure zugesetzt wjxd, als zur Fällung der Begieiteiweißstoffe nötig
ist, ohne daß ein Säuregrad erreicht wird, der die Fällw-ig des Wirkstoffes selbst
bedinmt. ist eine abbat,ende Vorbehandlung mit Alkalien vorangegangen, so kann die
Fällung der Eiweißbegleitstoffe durch Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Salzsäure,
oder durch saure Salze, wie z. B. Zinksulfat, erfolgen. Die Fällung der Eiwgißballaststoffe
wird am besten in allen Fällen durch Zentrifugieren beseitigt. Die den Wirkstoff
enthaltende Lösung wird gegebenenfalls neutralisiert und Ibis zur völligen Elektrolytfmiheit
dialysiert. Dabei fällt vier Vlirkstoff -als Gel aus. Diese Fäülun" wird. abze.trifugiert.
r:zr damit erhaltene @'@irkstoif kann durch Umfällan und Ent-:#--trten noch weiter
gereinigt und angereichert werden.
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Das der Erfindung zugrunde liegende Verfahren- ist in %i#esentzlichen
Punkten vc-ii den literaturgeschriebenen Vsrahren äbnlirherArt g=unaverschieden.
Im Biochennical joitr:?a12,3 (1929), S. 1722 ff. und in der britischen Patentschrift
234668 sind einerseits nicht nur andere Ausgangsstoffe benutzt worden, sondern auch,
wesentlich verschiedene C:ewinnungsverf@hren zur .ä.nwendun; gel:cmmen. Während
bei den angegebenen Verfahren das Ausgangsmaterial mit t Salzsäure ausgezogen wird
und dann dir- Substur=z entweder durch Herabsetzung des Salzgehaltes oder durch
Bildung schwer löslicher Verbindungen oder durch Adsorption isoliert wird, werde
In gemäß i-orliegender Erfindung die Begleitstoffe durch entsprechende Behandlung
vom Wirkstoff getrennt und ausgefällt. Bekannt ist ferner nach dem deutschen Pa-:ent
598 toi die Verwendung von Eiern oder Eizellen, jedoch werden nach denn dortigen
Verfahren die Eiweißstoffe entfernt und nur die wäßrigen Extrakte verwendet. Das
Verfahren hat demnach mit der vorliegenden Erfindung nichts gemein.
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Ein wesentliches Merkmal der vorliegen. den Erfindung ist die Vereinigung
folgender drei Verfahrensstufen: i. Verwendung von nativ oder künstlich abgebautem
Ausgangsmaterial von tierischen Eizellen.
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2. Lösung dieses Materials oder eines qualitativ wesentlichen Anteils.
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3. Fällung des gewünschten Anteils. Der hormonartige Wirkstoff ist
wasserlöslich. Im alkalischen Medium ist er leicht löslich, im sauren ist die Lösung
vom pli und der Art de; Säure abhängig. Mit Salzsäule ist die Substanz über pH 4.
fallbar, ohne wirkungsschädigend denaturiert zu werden. Sie ist je nach Reinigungsgrad
mehr oder minder thermostabil, wird jedoch durch tryptische Verdauung unwirksam.
Der Wirkstoff kann mit salzsaurem 7oo!oigem Alkohol gefällt und in 5oo;oib m natronalkalischem
Alkohol gelöst-werden, ferner ist er £ällbar mit Sulfosalicylsäure und Uranylacaetat.
Er ist- unlöslich in allen Lipoidlösungsmitteln und kann in essigsaurer Lösung an
Kieselgur adsorbiert werden. Der Wirkstoff scheint demnach mit einem niedrigen Ehveißkörper
identisch zu sein.
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im. folgenden werden Beispiele zur Isolierung des Eizellenhormons
angegeben, ohne jedoch das Verfahren auf diese Arbeitsweise beschränken zu wollen.
Beispiel i
| Fischrogen, durch Salz- oder Säurezusatz |
| konserviert. gleichgültig, ob irgend:@,ie vor- |
| her bearbeitet oder nicht, wird mit physio- |
| logis:cber Kochsalzlösung gewaschen und im |
| Mörer zerrieben. Die Masse j;ird mit Was- |
| ser -aus--eschwenurt, mit MetaphosphorsäurL |
| i %-c:rsetztyund zentrifugiert. Die Lösung wird |
| mit NatronL!ugc neutralisiert wind bis zum |
| vollständägen Versch>vinden aller Phosphate |
| gegen: Leitungswasser dialysiert, wobei. eine |
| lelartige Fällung entsteht, welche sorgfältig |
| ausgewaschen und zentrifugiert wird. Das |
| Sediment bei der @entrifu;icritng enthält die |
| t aktive Substanz. Zwecks weiterer Reinigung |
| wird dies-- mit Salzsäure -ewaschen. bei. einem |
| zur Lösung nicht ausreichenden p;i erneut |
zentrifugiert und filtriert. Die wirksame Substanz wird mit schwachem
Alkali vom Filter gewaschen und gelöst, die Lösung mit Chloroform oder anderen Lipoidlösungsmitteln
von den. letzten Lipoldresten befreit und ist dann nach Abstumpfung des überschüssigen
Alkalis gebrauchsfertig. Beispiel 2 Hühnereier werden in Natronlauge gelöst, die
Lösung rnit Zinksulfat versetzt und von der Fällung abfiltriert und abzeaitrifugiert.
Der Wirkstoff befindet sich im Filtrat, das nunmehr dialysiert wird, wobei der Wirkstoff
ausfällt. Die abzentrifugierte Fällung wird mit Eisessig versetzt und gekocht und
anschließend filtriert. Der Filterrückstand enthält deal Wirkstoff, der mit 5o%
alkalischem Alkohol aufgekocht und zentrifugiert wird. Die Lösung, die den Wirkstoff
enthält, wird mit Salzsäure ausgefällt, zentrifugiert, und der Bodensatz wird mit
destilliertem Wasser gewaschen und mit Lipoidlösungsmittieln blhandelt. Die Fällung
enthält den Wirkstoff. Beispiel 3 S,äugetierovarien werden zerkleinert, in Natronlauge
gelöst, mit Zn (OH.) gefällt und das Filtrat dialysiert. Der Rückstand, der den
Wirkstoff: enthält, wird mit Eisessig versetzt, gekocht und filtriert. Der Filterrückstand
wird in 5oo/o alkalischem Alkohol aufgenommen, zentrifugiert, der Wirkstoff= mit
Salzsäure ausgefällt, wieder zentrifugiert und der Bodensatz mit destilliertem Wasser
gewaschen.