DE646930C

DE646930C - Verfahren zur partiellen Hydrolyse von herzwirksamen Glucosiden

Info

Publication number: DE646930C
Application number: DEC48105D
Authority: DE
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1932-07-22
Filing date: 1933-07-16
Publication date: 1937-06-26

Description

Verfahren zur partiellen Hydrolyse von herzwirksamen Glucosiden W. A. Jacobs und A. Hoffmann haben gezeigt (Journ. of the Biol. Chemistry, Jahrgang69, S.153 bis 163 [19z6] und Chem. Zentralblatt 1927, Teil I, S. a94), daß es gelingt, mit Hilfe eines Fermentes K-Strophantin in Cymarin und Glucose zu spalten. Das Ferment (Strophantobiase) spaltet nur die Glucose des Strophantins ab und ist streng spezifisch. Es war daher nicht vorauszusehen, daß auch in anderen Drogen, die herzwirksame Glucoside enthalten, Fermente vorkommen könnten, die einen Teil des Zuckers aus Glucosiden abzuspalten imstande wären.
Es wurde nun gefunden, daß bei den Digitalisarten (wie z. B. Digitalis purpurea, Digitalis lanata usw.) und bei der Meerzwiebel (Scilla maritima) Enzyme vorkommen, die Herzglucoside dieser Drogen partiell zu hydrolysieren und unter geeigneten Bedingungen einen Teil des Zuckers der Glucosid-1noleküle abzuspalten vermögen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach die partielle Zuckerabspaltung aus Glucosidmolekülen mit Hilfe in der Droge vorhandener Fermente. Die vorliegende Erfindung gestattet, zuckerreichere Herzglucoside in glucosefreie Glucoside überzuführen, sei es, daß man den Vorgang sich während der Extraktion oder auch schon vor dieser unter geeigneten Bedingungen abspielen läßt, sei es, daß man von bereits isolierten reinen Glucosiden in Mischung oder reinen Einzelindividuen ausgeht.
Man hat schon die verschiedensten Glucoside einer enzymatischen Spaltung unterworfen (Chemisches Zentralblatt 1932, Teil II, S.2666, Zeile 3 ff., i i und 12, Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. ao5, S. a31ff.). Bei diesen Glucosiden (ß-Methylglucosid, ß-Phenylglucosid,, Salicin und Amygdalin) handelt es sich aber um ganz anders zusammengesetzte Stoffe als bei den hier verwendeten. Schon ihre Aglucone unterscheiden sich wesentlich von den Agluconen der herzwirksamen Digitalis- und Scillaglucoside, welche im vorliegenden Verfahren als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Während die Aglucone der letzteren kompliziert aufgebaute ungesättigte Oxylaktone von einer Molekulargröße von etwa 37o bis 39o darstellen, handelt es sich bei ersteren um einfach zusammengesetzte, niedrigmolekulare Stoffe, wie Alkohole, Phenole, Oxyphenole und Oxynitrile. Diese sind direkt an Glucose gebunden, und durch die enzymatische Spaltung wird die Glucose vom Aglucon abgespalten. Bei den Glucosiden des vorliegenden Verfahrens dagegen steht die Glucose nicht in direkter Bindung mit dem Aglucon, sondern ist mit einem anderen Zucker (Rhamnose oder Digitoxose) verbunden, der dann entweder direkt mit dem Aglucon oder durch Vermittlung weiterer Zuckerreste mit dem Aglucon zusammenhängt. Bei der enzymatischen Spaltung des vorliegenden Verfahrens erfolgt also nicht eine Spaltung in Glucose und ein Aglucon, sondern in Glucose und einen Bestandteil, der immer noch wie ein Glucosid zusammengesetzt ist.
Die Neuheit des vorliegenden Verfahrens erstreckt sich aber nicht nur auf das Ausgangsmaterial, sondern auch auf das Enzymmaterial selbst, da noch nie Digitalisblatt-bzw. Meerzwiebelsubstanz für derartige partielle Glucosidspaltungen gedient hatte.
Das Verfahren ermöglicht es daher,, zu einer Reihe neuer herzaktiver Glucoside zu gelangen. Verwendet man als Ausgangsprodukte die genuinen Glucoside aus Digitalis lanata, so erhält man z. B. folgende neuen Glucoside: Aus glucosehaltigem genuinem Glucosid A (DigilanidA) aus Digitalis lanata wird ein neues Glucosid (Acetyldigitoxin) erhalten, welches aus verdünntem Alkohol in glänzenden rechteckigen Täfelchen kristallisiert und bei der physiologischen Prüfung an der Katze nach Hatcher einen Wirkungswert von 0,4i mg pro i kg Katze ergab. Acetyldigitoxin ist mäßig löslich in Methanol und Äthanol, leicht löslich in Chloroform, äußerst schwer löslich in Äther und praktisch unlöslich in Wasser. Die Elementaranalyse ergab C = 63 bis 64 °(o und H = <g bis 8,5 %. Bei der Laktontitration verbrauchten 0,076 g Substanz 1,9 ccm 1/1o n-Lauge, %voraus sich ein Molekulargewicht von etwa 80o ableitet. Bei der sauren Hydrolyse liefert die Substanz etwa 46 °/0 Aglucon (Digitoxigenin), etwa 55 °/o Digitoxose und etwa 7,5 °/o Essigsäure. Diese Spaltung erfolgt nach der Gleichung

C43 H6G 014 -F- 4 H2 0 - C23 1-134 04 -f- 3 Cl; H12 04 + C2 H4 0t

Digit- Digitoxose Essig-

oxigenm säure

Bei vorsichtiger Behandlung mit verdünnten Alkalien wird nur die Essigsäure abgespalten, und man erhält Digitoxin neben essigsaurem Alkali nach der Gleichung

C43H@SU014 -i-- NaOH = C41H64013 + CH,COONa

Digitoxin

Aus glucosehaltigem genuinem Glucosid B (Digilanid B) aus Digitalis lanata wird ein neues Glucosid (Acetylgitoxin) erhalten, welches aus verdünntem Alkohol in glänzenden rechteckigen Täfelchen kristallisiert und das bei der physiologischen Prüfung an der Katze nach H a t c h e r einen Wirkungswert von o,6:2 mg pro i kg Katze ergab. Acetylgitoxin ist mäßig löslich in Methanol und .'Ethanol, schwer löslich in Chloroform, äußerst schwer löslich in Äther und praktisch unlöslich in Wasser. Die Elementaranalyse ergab C=62,i bis 62,80,1o und H=7,8 bis 8,3 %. Bei der Laktontitration verbrauchten o,114 g Substanz 2,7 ccm 1,.."10 n-Lauge, woraus sich ein Molekulargewicht von etwa 8:i2 ableitet. Bei der sauren Hydrolyse liefert die Substanz etwa 47°/o Aglucon (Gitoxigenin), etwa 54°% Digitoxose und etwa 7 °/0 Essigsäure. Die Spaltung erfolgt nach der Gleichung

C-43 1161, 013 4- 4 H _> 0 = C23H3405 + 3 C6 H12 04 -f- C2 H40.,

Git- Digitoxose Essig-

oxigenin säure

Bei vorsichtiger Behandlung mit verdünnten Alkalien wird nur die Essigsäure abgespalten, und man erhält Gitoxin neben essigsaurem Alkali nach der Gleichung

C43 Hf 6 015 -1- NaOH = C41 H14014 -i- C H3 C 00 Na

Gitoxin

Aus glucosehaltigem genuinem Glucosid C (Digilanid C) aus Digitalis lanata wird ein neues Glucosid, Acetyldigoxin, welches aus verdünntem Alkohol in glänzenden rechteckigen Täfelchen kristallisiert, erhalten. Es ergab bei der physiologischen Prüfung an der Katze nach H a t c h e r einen Wirkungswert von 0,36 mg pro i kg Katze. Acetyldigoxin ist mäßig löslich in Methanol und Äthanol und schwer löslich in Chloroform. In Äther ist es äußerst schwer löslich und in Wasser praktisch unlöslich. Die Elementaranalyse ergab C = 62 bis 62,8 °% und H = 7,8 bis 8,3 °/o. Bei der Laktontitration verbrauchten o,192 g Substanz 4,4 ccm '/1, n-Lauge, woraus sich ein Molekulargewicht von etwa 854 ableitet. Bei der sauren Hydrolyse liefert die Substanz etwa 47 °Io@Digoxigenin, etwa 54 B/B Digitoxose und etwa 7 °/B_ Essigsäure. Die Spaltung erfolgt nach der Gleichung

C93 HGB 01s + 4H20 -C23 H34 O3 + 3 Ce H12 04 + C .,H402

Dig-_ Digitoxose Essig-

oxigemn säure

Bei vorsichtiger Behandlung mit verdünnten Alkalien wird nur die Essigsäure abgespalten,; und man erhält Digoxin neben essigsaurem Alkali nach der Gleichung

C43HB,;015 + NaOH= C41H84014 + CH,COONa

Digoxin

Beispiel i io kg frische Meerzwiebeln werden in grobe Stücke zerschnitten und 5 Tage unter Essigester aufbewahrt, wobei durch die Einwirkung des Essigesters die lebenden Zellen der frischen Droge abgetötet werden, ohne daß dabei der Fäulnisprozeß eintritt. Dagegen entfaltet bei dieser Behandlung das für Seillaren A spezifische Enzym; die Scillarenase, seine Wirkung, indem es das in der Meerzwiebel vorgebildete Seillaren A, welches aus seinem Aglycon-Scillaridin A, Rhamnose und Glucose aufgebaut ist, durch partielle Hydrolyse in das um ein Glucosemolekül ärmere Glucosid, das Proscillaridin A, überführt. Dann wird der Essigester abgegossen; die Zwiebelstücke werden mit io kg Ammoniumsulfat zusammen zu einem feinen Brei zerkleinert; ausgepreßt und der Rückstand mit Essigester erschöpfend extrahiert. Hierbei kann der oben abgegossene Essigester mitverwendet werden. Der Essigesterextrakt wird im Vakuum völlig eingedampft, der Rückstand mit Äther mehrmals gewaschen bzw. ausgekocht, der hierbei zurückbleibende urigelöste Anteil in 1 1 eines Gemisches von Methanol-Wasser i : i gelöst, mit einem unlöslichen Gerbstoffällungsmittel behandelt, filtriert und die Lösung im Vakuum vom Methanol befreit. Hierbei scheidet sich das Proscillaridin A in roher Form aus, wird filtriert, aus Methylalkohol durch Wasserzusatz ausgefällt und dann aus Methylalkohol umkristallisiert.
Das bis jetzt unbekannte Proscillaridin A ist aus i Molekül Scillaridin A und i Molekül Rhamnose aufgebaut und wird durch die Hydrolyse mit Säure leicht in diese beiden Spaltstücke gespalten, die beide kristallisiert erhalten werden.
Proscillaridin A kristallisiert aus Methylalkohol in dicken Platten, die Kristallösungsmittel enthalten -und beim Stehen an der Luft öder im Exsikkator verwittern. Es löst sich in etwa. 25 Teilen Methylalkohol, etwa 5o Teilen Alkohol und 6oo Teilen Chloroform, ist äußerst schwer löslich in Wasser und Äther. Es besitzt in 8oo/oigem Alkohol ein spez. opt. Drehungsvermögen von [a]D2 = -86° (-I-2°) (c = 2,4), bezogen auf getrocknete Substanz.
Wie ScillarenA und ScillaridinA gibt auch das Proscillaridin A mit Essigsäureanhydrid und H2 S 04 die Liebermannsche Cholesterolreaktion. Die physiologische Wirksamkeit beträgt etwa 125o Froschdosen pro i mg Glucosid nach Houghton-Straub. Beispiel 2 3 g Seillaren A werden fein verrieben, mit 70 g eines Enzympräparates, Zoo ccm Wasser, 2,5 ccm wässeriger Essigsäure i : io und 5 ccm Toluol innig. vermischt und unter öfterem Umrühren 2o Stunden bei 36° stehengelassen. Dann wird filtriert, mit Wasser bis 'zur neutralen Reaktion nachgewaschen und der Rückstand mit Alkohol erschöpfend extr;Ihiert, wobei das abgebaute Glucosid gelöst wird. Die alkoholische Lösung wird im Vakuum völlig eingedampft, der Rückstand mit etwa i'/21 Chloroform aufgenommen, wobei das Proscillaridin A in Lösung geht. Die filtrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus Methanol zuerst durch Wasserzusatz ausgefällt, filtriert und dann aus Methylalkohol umkristallisiert. Das Präparat zeigt alle in Beispiel i angegebenen Eigenschaften des Proscillaridins A.
Das im vorliegenden Beispiel verwendete Enzympräparat wurde auf folgendeW eise dargestellt: 2 kg frische Meerzwiebeln werden zerkleinert und mit 81 Wasser, das mit Thymol gesättigt wird, 14 Tage lang stehengelassen, wobei Autolyse eintritt. Dann wird durch ein Tuch koliert und ausgepreßt. Das Kolat wird durch ein Talkfilter filtriert, wobei die sich auf der Talkoberfläche festsetzende, verstopfende Schicht von Zeit zu Zeitabgekratzt wird. Das abgekratzte Material enthält- das wirksame Enzym stark angereichert. Es wird gesammelt, zuerst iliit Wasser, dann mit Alkohol gewaschen und rasch getrocknet.
Beispiel 3 iokg frische Blätter von Digitalis purpurea werden fein zerkleinert, mit Essigester überschichtet und so 3 bis ,I Tage lang der Einwirkung des in der Droge enthaltenen Enzyms unterworfen. Dann werden 8 kg fein pulverisiertes Ainmoniumsulfat zugesetzt, und die Masse wird gut vermischt und ausgepreßt. Der Preßrückstand wird mit Essigester erschöpfend extrahiert, wobei der zuerst verwendete Essigester mitverwendet wird. Der Essigesterextrakt wird filtriert und im Vakuum völlig eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther extrahiert, wobei Digitoxin in Lösung geht. Nach dein Filtrieren wird die ätherische Lösung im Vakuum völlig eingedampft und der Rückstand finit Petroläther gewaschen. Der ungelöst gebliebene Anteil wird in 21 eines Gemisches von Methanol-Wasser i : i gelöst und mit einem unlöslichen Gerbstoffällungsmittel behandelt. dann wird filtriert und das Filtrat im Vakuum vom Methylalkohol befreit. Hierbei scheidet sich das rohe Digitoxin aus, es wird filtriert und mit wenig Methanol aufgenommen, wobei ein Teil des Digitoxins als weißer Niederschlag ausfällt. Dieser Teil wird durch Filtration abgetrennt und aus Alkohol-Wasser umkristallisiert. Aus der inethvlalkoliolischen Mutterlauge wird ein weiterer Teil des Digitoxins durch Wasserzusatz ausgefällt und, wenn nötig, durch Umfällen aus Chloroform mit Petrolätlier und nochmalige -Behandlung mit Gerbstoffällungsmitteln gereinigt, gegebenenfalls erfolgt auch Entfärbung mit Tierkohle. Dann wird aus verdünntem Alkohol umkristallisiert. Wird dieExtraktion mitEssigester unter Zusatz von Arnmoniumsulfat ohne Stehenlassen rasch vorgenommen, so erhält man mit demselben Verfahren kein Digitoxin, sondern ein zuckerreicheres Glucosidpräparat, das durch Einwirkung eines entsprechenden Enzympräparates in Digitoxin übergeführt werden kann. Es war bisher nicht bekannt, daß das Digitoxin das Produkt einer partiellen enzymatischen Zuckerabspaltung darstellt.
Läßt man frische Blätter der Digitalis lanata in ähnlicher Weise längere Zeit stehen, so erhält man auch aus dieser Droge zuckerärmere Glucoside. Beispiel d. 2 kg getrocknete und gemahlene Blätter von Digitalis lanata werden in io l Essigester eingetragen und mit 81 Wasser verrührt. Das Gemisch wird 5 Tagelang stehengelassen, wobei der partielle enzymatische Abbau erfolgt. Dann werden 7 kg fein pulverisiertes Amnioniumsulfat eingetragen, und die Masse wird ausgepreßt. Der Preßrückstand wird mit Essigester unter Mitverwendung des oben verwendeten Essigesters erschöpfend extrahiert. Der Essigesterextrakt wird filtriert, im Vakuum völlig eingedampft und der Rückstand mit 2 bis 3 1 Äther erschöpfend extrahiert, wobei die abgebauten Glucoside in den Äther gehen. Nach dem Filtrieren wird die Ätherlösung im Vakuum völlig eingedampft und der Rückstand mit Petroläther mehrmals gewaschen, bis der Petroläther fast farblos bleibt. Der ungelöste Anteil wird in 2 1 eines Gemisches von Wasser-Methanol i : i gelöst und mit unlöslichernGerbstoffällungsmittel behandelt. Nach dein Filtrieren wird die Lösung im Vakuum vorn Methanol befreit, wobei das rohe Gemisch der partiell abgebauten Glucoside, die durch Kristallisation aus verdünntem Alkohol gereinigt werden können, ausfällt. Hindert man bei einem gleichen Versuchsansatz vor dem Zusatz des Wassers die Enzymwirkung durch Enzymgift oder Fällungsmittel, z. B. Ammoniumsulfat, so erhält man die genuinen Glucoside, wie es im Beispiel 3 des Patents 631 790 beschrieben worden ist. Beispiel 2 g des entacetylierten Lanataglycusids A, dargestellt nach dem Verfahren des Patents 636398, gelöst in 8oo ccin Alkohol, werden mit i kg fein zerkleinerten frischen Blättern von Digitalis purpurea vermischt und bis 3 Tage lang stehengelassen, filtriert und der Rückstand mit Alkohol-Wasser i : i erschöpfend nachgewaschen. Das klare Filtrat (etwa 3 1) wird dreimal mit je 3 1 Äther und die vereinigten Ätherauszüge mit 6oo ccm Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trennen der Schichten wird die ätherische Lösung im Vakuum völlig eingedampft, derRückstand in 21 eines Gemisches von Methanol-Wasser i : i gelöst und mit unlöslichem Gerbstofffüllungsmittel behandelt. Dann wird filtriert, nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum vom Methylalkohol befreit. Hierbei scheidet sich das um i Molekül Glucose ärmere Präparat, das mit Digitoxin weitgehend übereinstimmt, in kristallisierter Form ab. In analoger Weise kann von den entacetylierten Lanataglucosiden B und C durch Purpureablattbrei i Molekül Glucose enzymatisch abgespalten werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur partiellen Hydrolyse von herzwirksamen Glucosiden, dadurch gekennzeichnet, daß man herzwirksame, mehrere Zuckerreste enthaltende Glucoside der Digitalis- und Scillaarten der Einwirkung eines nur einen Teil der vorhandenen Zuckerreste abspaltenden Enzyms unterwirft, wobei als Endprodukte nicht zuckerfreie Genine, sondern zuckerärmere, herzwirksame Glucoside entstehen. z. Verfahren nach Anspruch z, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymwirkung während der Extraktion des herzwirksamen Glucosids durch längeres Stehen des Extraktes mit der Ausgangsdroge in geeigneten wasserhaltigen Lösungsmitteln eintreten läßt. 3. Verfahren nach Anspruch r, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymwirkung schon vor der eigentlichen Extraktion in der frischen Droge durch Einwirkung eines den- Zelltod herbeiführenden und -gleichzeitig die Fäulnis verhindernden Mediums eintreten läßt. q.. Verfahren nach Anspruch z, dadurch gekennzeichnet, daß man von bal lastfreien Gemischen genuiner Glucoside ausgeht und diese in geeigneten wasserhaltigen Lösungsmitteln der Einwirkung eines Drogenpulvers oder eines daraus gewonnenen Enzympräparates unterwirft. 5. Verfahren nach Anspruch r und q., dadurch gekennzeichnet, daß man reine und einheitliche herzwirksame Glucoside als Ausgangsmaterialien verwendet und diese der enzymatischen partiellen Zuckerabspaltung unterwirft.