DE684256C

DE684256C - Verfahren zur Abtrennung von biologisch wertvollen Bestandteilen aus pflanzlichen oder tierischen Stoffen

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Publication number: DE684256C
Application number: DES114127D
Authority: DE
Original assignee: MANASSEH GIRAGOS SEVAG DR
Current assignee: MANASSEH GIRAGOS SEVAG DR
Priority date: 1934-05-26
Filing date: 1934-05-27
Publication date: 1939-11-24
Also published as: US2118117A

Description

Verfahren zur Abtrennung von biologisch wertvollen Bestandteilen aus pflanzlichen oder tierischen Stoffen Die Trennung der Bestandteile pflanzlicher oder tierischer Ausgangsmaterialien voneinander erfolgte bisher gewöhnlich mit Hilfe von Chemikalien. So hat man z. B. zur Abtrennung der Eiweiß stoffe aus solchen Ausgangsmaterialien die Fällung mit Schwermetallen, Säuren, Alkalien, mit Alkohol u. dgl. benutzt. Dbei lassen sich aber schädliche Veränderungen der Stoffe nicht immer vermeiden. Auch die bekannten physikalischen Methoden, wie Kochen usw., rufen solche Veränderungen hervor. Es ist zwar bekannt, durch Adsorption Enzyme, z. B. Katalase, aus ihren Ausgangsmaterialien zu isolieren. Dieses Verfahren ist aber sehr mühsam und großtechnisch nicht brauchbar. Außerdem erhält man nach ihm nur eine sehr mangelhafte Ausbeute.
Es wurde nun gefunden, daß die Bestandteile der genannten Ausgangsmaterialien leicht und quantitativ voneinander getrennt werden können, wenn man sie gegebenenfalls ein-oder mehrmals in wasserhaltigem Zustande auf Temperaturen lunterhalXb des Gefrierpunktes des Wassers abkühlt, nach dem Gefrieren wieder auftaut und alsdann mit Wasser und einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser eine Phasengrenzschicht zu bilden vermag, in einer solchen Weise ausschüttelt, daß ein stabiles, zentrifugierbares Gel, welches abgetrennt werden kann, entsteht. Als organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist und eine solche Phasengrenzschicht zu bilden vermag, ist z. B. Chloroform verwendbar: Zur Verhütung der Schaumbildung während des Ausschüttelverfahrens hat sich ein Zusatz geringer Mengen eines schaumverhindernden ;liIittels, wie z B. Amylalkohol, als zweckmäßig erwiesen.
Emulsionsausschüttlungsverfahren oder sog.
Schaumausschüttlungen sind bereits an einer Reihe von Stoffen, wie Peptonlösungen, Blut, Ölen und Fetten, durch, gleführt worden. Bei Verwendung dieses für andere Zwecke bereits bekannten Mittels im Sinne der Erfindung erhält man aus pflanzlichen oder tierischen Stoffen, wie z. B. aus Blut, Leber und anlderen Organen sowie Extrakten aus solchen Organen, Hefe, Bakterien, pflanzlichem Zellenmaterial u. dgl., biologisch wertvolle Erzeugnisse.
Das Verfahren läßt sich auch zur Trennung der eiweißartigen Hormone, wie des Pankreashormons, des thyreotropen und des gonadotropen Hormons, von den begleitenden Eiweißstoffen der Organe, aus denen sie stammen, benutzen.
Beispiele I. Abtrennung der Polysaccharide aus Pneuinokokken.
Künstlich gezüchtete Pneumokokken werden vom Nährboden gefrennt, gewaschen und kurze Zeit mit flüssiger Luft behandelt. Darauf läßt man die gefrorene Masse auftauen.
Die Behandlung mit flüssiger Luft kann gegebenenfalis noch ein oder mehrere Male wiederholt werden. Das aufgetaute Produkt wird darauf in der fünf- bis zehnfachen Menge Wasser suspendiert und mit etwa 1/3 seines Volumens an Chloroform kräftig geschüttelt.
Ein größerer Chloroformzusatz stört nicht.
Die Schaum ; bildung wird durch Zusatz geringer Mengen eines bekannten schaumverhindernden Mittels, z. B. von Amylalkohol, verhindert. Nachdem die Mischung mehrere Stunden lang kräftig geschüttelt worden ist, wird zentrifugiert, wobei die Eiweißbestandteile ein Gel bilden, das sich am Boden absetzt, während die wäßrige Flüssigkeit praktisch frei von Eiweiß ist. Durch Wiederholung des Ausschüttelns und schließliche Filtration der wäßrigen Flüssigkeit durch ein Seitz-Filter wird eine klare wäßrige Lösung der Polysaccharide erhalten. Die wäßrige Lösung kann durch Einengen mit Hilfe des Faustschen Trockenapparates zur Trockne gebracht werden. Man kann die Polysaccharilde aber auch durch Ausfällung mit Alkohl oder Aceton aus der wäßrigen Lösung abscheiden Das Verfahren gestattet eine Trennung der in den Pneumokokken enthaltenen Polysaccharide von den Eiweißstoffen, ohne daß schädigende chemische Veränderungen der ursprünglichen Bestandteile eintreten.
Man kann auch bei höheren Temperaturen als denen der flüssigen Luft arbeiten, z. B. bei - 60°, wenn man die wäßrige Suspension des Ausgangsmaterials in feinst verteilter Form zum schnellen Gefrieren bringt und danach wieder auftaut.
2. Darstellung von Katalase, Blutfarbstoft und Lipoiden aus Schafblut.
Defibriniertes Schafblut wird zentrifugiert.
Die sedimentierten roten Blutkörperchen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und so von Serumbestandteilen befreit. Das Sediment wird mit destilliertem Wasser hämolysiert, Die lackfarbene Lösung wird darauf kurze Zeit der Behandlung bei der Temperatur der flüssigen Luft ausgesetzt und wie in Beispiel I aufgearbeitet. Nach dem Schütteln mit Chloroform bilden sich beim Zentrifugieren drei Schichten, von denen die unterste, die Chloroformschicht, etwa vorhandene Lipoide enthält, während die mittlere Gelschicht den roten Blutfarbstoff enthält und die obere aus einer wasserklaren, wäßrigen Lösung von Katalase und anderen Fermenten besteht.
Es gelingt so in einfacher Weise, die Katalase vollkommen ohne Beeinträchtigung ihrer Wirksamkeit vom Blutfarbstoff abzutrennen.
3. Darstellung von Katalase, Blutfarbstoff und Lipoiden aus Kaninchenblut.
Nach Beispiel 2 aus Kaninchenblut erhaltene hämolysierte Blutlacklösung wird zunächst mit Chloroform kurze Zeit durchgeschüttelt und die Chloroformmischung dann im Eisschrank I bis z Wochen lang stehengelassen.
Danach wird auf Zimmertemperatur ge-@ bracht, mit ungeführ gleichen Mengen Phosphatpuffer (1/15 molar) pE = 7-8 gemischt @ und zentrifugiert. Dabei tritt bereits Trennung in drei Schichten wie bei Beispiel 2 ein, und 98 °/0 des vorhandenen Blutfarbstoffes werden so entfernt. Die verbleibende Lösung wird nochmals mit Chloroform versetzt, I bis 2 Stunden geschüttelt, zentrifugiert und ebenfalls, wie oben bei Beispiel 2 beschrieben, aufgearbeitet. Dabei erhält man eine vollkommen blutfar, bstofffreie Katalaselösung.
4. Isolierung von proteinfreien Kohlehydraten aus Eiweiß.
115 g bei 370 getrocknetes Eiweiß werden pulverisiert und mit 100 ccm Wasser zu einer Paste angerührt. Diese wird in flüssiger Luft zum Gefrieren gebracht und danach wieder aufgestaut. Das Gefrieren in flüssiger Luft und das Auftauen werden noch zweimal wiederholt. Alsdann wird die Paste in 1500 ccm destilliertem Wasser suspendiert und mit einer Mischung von 300 ccm Chloroform und 100 ccm Amylalkohol 15 Stunden geschüttelt.
@ Darauf wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgehoben. Das aus dem Gel erhaltene Produkt wird wieder in I500 ccm Wasser suspendiert und I5 Stunden mit der obigen Choroform- und Amylalkohollösung geschüttelt. Die beim Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit der beim ersten Ausschütteln erhaltenen vereinigt. Der Rückstand wird nochmals in gleicher Weise behandelt und auch der dabei erhaltene Wasserextrakt mit den beiden ersten vereinigt, worauf die gereinigten Wasserextrakte im Faust-Heim-Apparat bei 370 zur Trockne verdampft werden. Die Trockensubstanz wird erneut in 1500 ccm Wasser sustendiert und die Suspension mit einer Mischung von 200 com Chloroform und 30 ccm Amylalkohol 15 Stunden geschüttelt.
Die nach dem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch ein Seitz-Filter filtriert. Das Filtrat wird durch Behandlung mit einem Luftstrom bei 37° zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird 1 Stunde lang im Ofen bei 600 getrocknet und 2 Tage lang bei 370 in einem W,ärmeschrank stehengelassen. Die trockene Substanz wird in 200 ccm Wasser gelöst, durch ein Seitz-Filter filtriert; das Filtrat wird durch einen Luftstrom bei 370 zur Trockne verdampft. Der Trockenrückstand wird in I50 ccm Wasser aufgelöst und wieder zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird allmähllich zu 600 ccm 96 obigem Alkohol hinzugefügt und zentrifugiert. Der dabei erhaltene Rückstand wird in I50 ccm Wasser aufgelöst, mit 600 ccm 96%igem Alkohol wie oben behandelt und nochmals zentrifugiert.
Der erhaltene Niederschlag stellt eine protein freie Kohlehydratfraktion des Eiweißes dar.
Die beim letzten Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit scheidet beim Stehen über Nacht weitere Mengen eines Niederschlages aus, der abzentrifugiert. wird. Löst man diesen Niederschlag erneut in I50 ccm Wasser und setzt diese Lösung allmählich zu 450 ccm 96%igem Alkohol, so erhält man durch 15 Minuten langes Zentrifugieren unmittelbar nach der Ausfällung eine weitere proteinfreie Kohlehydratfraktion. Beide Fraktionen besitzen große immunologische Aktivität.
5. Isolierung einer proteinfreien Kohlehydratfraktion aus B. proteus.
Das gewaschene bakterienhaltige Sediment aus 12 1 Bouillofikultur wird in dünner Schicht dreimal mit flüssiger Luft behandelt und nach jeder Behandlung auftauen gelassen. Das so erhaltene Material wird darauf in einer Mischung von 150 ccm Wasser, 50 ccm Chloroform und 30 ccm Amylalkohol in Gegenwart von Glasperlen über Nacht geschüttelt und darauf zentrifugiert. Das aus dem Chloroformgel erhaltene Produkt wird zweimal in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, behandelt. Die dabei erhaltenen Wasserextrakte werden im Faust-Heim-Apparat bei 37° zur Trockne verdampft. Die Trockensubstanz wird in einer Mischung von I50 ccm Wasser mit 30 com Chloroform und 10 ccm Amylalkohol suspendiert, über Nacht geschüttelt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird durch ein Seitz-Filter filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne verdampft. Der Trockenrückstand wird in der erforderlichen Wassermenge aufgelöst und mit 4 Voluinen 60/0igem Alkohol behandelt. Nach dem Stehenlassen über Nacht im Eisschrank wird zentrifugiert. Das dabei erhaltene Sediment enthält die Kohlehydratfraktion und ist eiweißfrei.
6. Polysaccharide aus Saccharomyces cerevisiae.
100 g pulverisierte Trockenhefe werden in einer Mischung von 100 ccm Toluol, 100 ccm Chloroform und 30 ccm Isoamylalkohol bei Gegenwart von Glasperlen 75 Stunden im Schüttelapparat geschüttelt. Die mikroskopische Untersuchung zeigt Idann die vollständige Zerstörung der Hefezellen. Nach dem Entfernen (der Glasperlen wird die Mischung zentrifugiert. Die über stehende Flüssigkeit ist dunkelgelbbraun und reagiert stark sauer. Das Sediment wird bei 700 getrocknet und pulverisiert. Die Trockensubstanz wird im Mörser mit 100 ccm Wasser zu einer dicken Paste verrieben und viermal nacheinander mit flüssiger Luft behandelt und wieder aufgetaut. Die Masse wird dann in einer Mischung von I200 ccm Wasser, 200 ccm Chloroform und 50 ccm Isoamylalkohol aufgenommen und über Nacht mit Glasperlen geschüttelt. Nach einstündigem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit aufbewahrt und die gelartige Chloroformschicht noch dreimal in derselben Weise mit Wasser (ohne Chloroform und Amylalkohol) cxtrahiert.
Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden nach wider Filtration durch Seitz-Filter im Faust-Heim-Apparat bei 370 auf 100 ccm eingedampft, mit 400 ccm Methanol versetzt, I Stunde geschüttelt und dann zentrifugiert.
Das Sediment wird noch einmal in derselben Weise behandelt. Der überstehende Methanolextrakt (1000 ccm) verbraucht 230 ccm njtO NACH.
Zwecks Isolierung der darin enthaltenen Polysaccharide wird dieser Rückstand in 600 ccm Wasser, 100 ccm Chloroform und 30 ccm Isoamylalkohol suspendiert, über Nacht geschüttelt und dann zentrifugiert.
Nur noch eine geringe Fällung wird in der Chloroformschicht niedergeschlagen. Die Chloroformschicht wird nochmals in Wasser suspendiert und zentrifugiert, um etwa absorbiertes Kohlehydrat auszuwaschen. Die überstehende Lösung wird mit der ersten vereinigt und durch Filterpapier filtriert. Eine ganz schwache Trübung in der wäßrigen Lösung läßt sich durch Filtration dadurch Seitz-Filter entfernen. Das klare Filtrat, welches eine negative Eiweißreaktion mit Sulfosalicylsäure gibt, wird im Faust-Heim-Apparat auf ein geringes Volumen eingeengt und das Kohlehyldrat durch zwei- bis dreifache Menge Äthylalkohol gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und nochmals mit Alkohol ausgefällt, dann im Vakuumexsiccator über Schwefelsäure getrocknet und pulverisiert. Man erhält so 6,5 g schneeweiße Substanz. Das feuchte Polysaccharid nimmt beim allmählichen Trocknen an der Luft bei Zimmertemperatur ein durchsichtiges, glasiges Aussehen an.
Die Analyse Ides in der angegebenen Weise dargestellten Kohlehydrats aus Saccharomyces cerevisiae liefert bei der Kohlenstoff-Wasserstoff-Bestimmung folgende Werte: 44,81% C und 6,7% H berechnet für C6H10O5 44,44% C und 6,17 % H.
Die optische Drehung unter Verwendung von 5 normaler Salzsäure als Lösungsmittel liefert folgenden Wert: [ai21= I480.
Das Polysaccharid löst sich leicht in Wasser mit schwacher Opaleszenz, deren Grad von der Konzentration der Lösung abhängt.
Die nach dem neuen Verfahren erhältlichen Polysaccharide ermöglichen erstmalig, wäßrige Lösungen von Polysacchariden in ihrem natürlichen Zustand für Injektionszwecke herzustellen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Abtrennung von biologisch wertvollen Bestandteilen aus pflanzlichen und tierischen Stoffen durch Schaumausschüttlung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stoffe gegebenenfalls ein-oder mehrmals in wasserhaltigem Zustande auf Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes des Wassers abkühlt, nach dem Gefrieren wieder auftaut, hierauf derart mit genügenden Mengen von Wasser und solchen mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeiten schüttelt, daß ein stabiles zentrifugierbares Gel entsteht und dieses abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stoffe mit Hilfe von flüssiger Luft zum Gefrieren bringt und alsdann wieder auftaut.
3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienkulturen zwecks Trennung in Polysaccharide und Eiweißstoffe als Ausgangsmaterial benutzt.
4. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Hühnereiweiß zwecks Trennung in Polysaccharide und eigentliche Eiweißstoffe als Ausgangsmaterial benutzt.
5. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man defibriniertes Blut zwecks Trennung in Katalase, Lipoide und Blutfarbstoff als Ausgangsmaterial benutzt.
6. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefe zwecks Trennung in Polysaccharide und Eiweißstoffe als Ausgangsmaterial benutzt.
7. Verfahren nach Anspruch I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als organische, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit Chloroform bzw. Mischungen von Chloroform und Isoamylalkohol Verwendung finden.
8. Verfahren nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausschüttlung unter Zusatz geringer Mengen eines schaumverhindernden Mittels, wie z. B.

Amylalkohol, erfolgt.