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Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen des den Oestrus hemmenden
Zirbeldrüsenwirkstoffes Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Zirbeldrüsenwirkstoffes,
nämlich des den Oestrus hemmenden Zirbeldrüsenwirkstoffes, von beliebig eingestelltem
Gehalt.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der netten Erkenntnis, daß es
gelingt, durch Ausziehen der frischen oder feucht bei Kühltemperatur aufbewahrten
oder auch getrockneten Drüse, die gegebenenfalls durch mechanische Zerkleinerungs-
oder chemische Aufschließungsmaßnahmen der Extraktion zugänglich .gemacht wurde,
mit wäßrigen, gegebenenfalls salz-, alkohol- oder glycerinhaltigen, sauren oder
alkalischen Lösungen, bei gleichzeitigem Wirkungsausleseverfahren- den den Oestrus
hemmenden Wirkstoff aus dem zelligen Material herauszuholen, ohne daß seine Wirksamkeit
verlorengeht.
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Ein solches, ohne gleichzeitige Wirkungsauslese ausgeführtes Verfahren,
welches den bei der Gewinnung anderer Wirkstoffe verwandten Methoden ähnlich ist,
konnte indessen bisher nicht zum Ziele führen. Seine Anwendung wurde gemäß vorliegender
Erfindung erst dadurch ermöglicht, daß gleichzeitig ein Wirkungsausleseverfahren
Platz greift.
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Diese wichtige und bisher ungelöste technische Aufgabe konnte man,
da in-an über die chemische Konstitution des Wirkstoffes keine Vorstellung besitzt,
auch nicht auf chemischem Wege lösen; es waren daher andere Mittel zur Erreichung
dieses Zieles notwendig.
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Diese bestehen erfindungsgemäß .darin, daß abgemessene Proben der
Extrakte bestimmten Versuchstieren, z. B. Ratten, Mäusen o. dgl., zugeführt, beispielsweise
eingespritzt werden, um so das Auftreten bzw. die Stärke der erfindungsgemäß spezifischen,
den Oestrus hemmenden Wirkung zu beobachten.
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Auf diese Weise können die inaktiven oder wenig aktiven Anteile verworfen
bezIehungsweise einer Konzentrierung durch Einengen o. dgl. unterworfen werden,
so daß man schließlich zu konzentrierten Zubereitungen gelangt: Diese Präparate
können erfindungsgemäß ferner noch -durch Ausschütteln mit organischen Lösungsmitteln,
z. B. zur Entfernung von begleitenden Fetten und Lipoiden vor oder nach Verseifung,
Filtrieren durch Filter, Ultrafilter, semipermeable Membranen u. dgl. mit oder ohne
Zuhilfenahme von Druck, Rühren oder elektrischen Potentialgefällen (Elektrodialyse),
wobei der Wirkstoff diese Membranen passiert, Herausadsorbieren von Begleitstoffen
mittels bestimmter. Adsorbentien oder auf beliebige andere Weise gereinigt werden.
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Man erhält auf diese Weise Präparate, welche - einerlei ob sie Trockensubstanzen
darstellen oder sich in Lösung befinden - auf einen bestimmten Wirkungsgrad eingestellt
sind
und z. B. als Injektionen oder auf anderem Zuführungswege, z. B. in der Tierzucht,
Verwendung finden können.
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Auszüge aus Zirbeldrüsen sind an sich bereits bekannt (vg1. z. B.
v. J a u r e g g und B a y e r, Lehrbuch der Organotherapie, igi-., S. 25 i und
252, sowie L a q u e r , Hormone und innere Sekretion, 1928, S. io6). Von diesen
vorbekannten Zubereitungen aus Zirbeldrüse unterscheiden sich aber die nach dem
vorliegenden Verfahren hergestellten naturgemäß grundlegend durch ihren Wirkstoffgehalt,
der das Ziel des vorliegenden Herstellungsverfahrens bildet und dessen Erreichung
im Gegensatz zu allen v orbekannten Verfahren durch Anwendung des Wirkungsausleseverfahrens
verbürgt ist.
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Dieser entscheidende Fortschritt zeigt sich am klarsten durch die
Äußerungen in den beiden :genannten Werken. Beide können über Hormonwirkungen und
Wirkstoffgehalt der von ihnen erwähnten Extrakte keinerlei Angaben machen. Im Gegenteil
heißt es z. B. an der angeführten Stelle bei v. J a u r e g g und B a y e r, daß
der eine Untersucher derartiger Extrakte, v. C y o n , die Wirkung seiner Ephiphysenextrakte
.als Folge. der Wirkung der in ihnen enthaltenen Salze ansah, und an der gleichen
Stelle betonen die Verfasser, daß alle von ihnen zitierten Untersuchungen keinerlei
sicherer Auskünfte über die Funktion der Ephiphyscn ergeben. Beispiele i.
5,g frischer Schweinszirbeldrüse werden zerkleinert und im Vacuum getrocknet,
alsdann wiederholt mit Benzol ausgezogen. Man erhält so i .g entfettetes Drüsenpulver
und nach Verjagen des Benzols 0,05 g Fettextrakt. Von diesen ersten
beiden Fraktionen gibt die erstgenannte eine positive biologische Reaktion, d. h.
o,1 g in Wasser aufgeschwemmt und binnen vier Tagen einer brünstenden weiblichen
Maus unter die Haut gespritzt haben die Scheidenbrunst für insgesamt acht Tage vollkommen
auf, d. h. o, i g Material entsprechend Mäuseeinheit.
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2. 5o g frische Schafzirbeldrüse werd.n fein zerkleinert und -wiederholt
mit destilliertem Wasser ausgezogen, die vereinigten Auszüge durch Zentrifugieren
geklärt und durch ein feines Filter filtriert. Die Zentrifugenriickstände enthalten
bei der -biologischen Prüfung an der Maus nur noch in Mengen entsprechend 2,og der
frischenDrüseeine Mäuseeinheit des Wirkstoffes (zusammen also nur 25 Mäuseeinheiten),
der Filterrückstand mit 5 ccm Nasser aufgeschwemmt, zur biologischen Gehaltsprüfung
verwendet, @ enthält gleichfalls nur auf je i ccin eine Mäuseeinheit, zusammen also
nur 5 Mäuseeinheiten. Dagegen rufen von dem 2 500 ccm betragenden klaren
Filtrat gerade 2 ccm biologische Reaktion an der Maus in der Wirkungsstärke von
i Mäuseeinheit hervor (i ccm wirkten zu schwach, 3 ccm zu stark). Die Zentrifugen-
und Filterrückstände werden daher als hormonarm verworfen, das i 25o Mäuseeinheiten
des Wirkstoffs enthaltende Filtrat wird dagegen zur Weiterverarbeitung verwendet.
Es wird auf 125 ccm eingeengt, woraufhin sich bei Anstellung der biologischen Reaktion
o,i ccm als Träger von i Mäuseeinheit erweist, und dann siebenmal gegen je
70 ccm Außenflüssigkeit (destilliertes Wasser) dialysiert. Die Innenflüssigkeit
wird daraufhin, da sie bei der biologischen Gehaltsprüfungnur' nochinsgesamt ioo
Mäuseeinheiten Wirkstoff enthält, verworfen, die Außenflüssigkeiten werden vereinigt
und auf ioo ccm eingeengt, von denen wiederum je o,i ccm die biologische Reaktion
in Stärke von i Mäuseeinheit zeigt.
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3. 5,o g frischer Schweinszirbeldrüse werden in einem Zellzertrümmerungsapparat
zerkleinert, mit io v. H. Glycerin enthaltendem Wasser im Soxhletapparat bei erniedrigtem
Druck und q.0° C ausgezogen. Die so gewonnene klare Lösung enthält den zellfreien
Wirkstoff.
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4.:2 g zerkleinerte, im Vakuum getrocknete Zirbeldrüse vom Kalb werden
i Stunde mit n/2-Natronlauge digeriert. Dann wird das Gemisch mit Salzsäure leicht
angesäuert und zentrifugiert. Die überstehende Lösung enthält .den Wirkstoff frei
von geformten Bestandteilen der Drüse.
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5. Ein wäßriger Auszug aus 2o g Zirbeldrüse, der in i ccm i Mäuseeinheit
Zirbeldrüsenwirkstoff enthält, wird in bekannter Weise durch Ferrum sesquichloratum
dialysatum enteiweißt. Das eiweißfreie Filtrat enthält unverändert je i ccm i Mäuseeinheit,
-während der Trockenrückstand der Lösung, also die jeder Wirkstoffeinheit anhaftende
Ballastmenge auf 1/1o verringert Worden ist.
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6. Ein wäßriger Auszug aus 2o g Zirbeldrüse, der noch nicht von dem
-zerkleinerten Extraktionsgut getrennt worden ist, wird der Elektrodialyse durch
eine Pergamentmembran unterworfen. Das Elektrodialysat ist frei von Eiweißstoffen,
zugleich auch von allen geformten Bestandteilen der Drüse, von sonstigen schwer
oder gar nicht dialysablen Beimengungen, wie Lipoiden, Cholesterin u. a. m., befreit,
aber an Wirkstoffgehalt unverändert geblieben.