-
Verfahren zur Isolierung von Organbestandteilen aus tierischen Geweben,
Organen u. dgl. Es wurde gefunden, daß es in einfacher Weise gelingt, aus tierischen
Geweben und Organen, wie z. B. Drüsen mit innerer Sekretion, einzelne Organbestandteile
zu isolieren, indem man jene, nach geeigneter Vorbehandlung, mit Flüssigkeiten oder
Flüssigkeitsgemischen von verschiedenem spezifischem Gewicht behandelt und die einzelnen
Bestandteile der Gewebe auf Grund ihrer in den verschiedenen Flüssigkeiten verschiedenen
Sedimentierfähigkeit voneinander trennt. Hierbei schafft das verschiedene spezifische
Gewicht der Organbestandteile die :Möglichkeit ihrer Trennung, insbesondere auch
in solchen Fällen, in denen die Organe nach den in der Histologie bekannten Methoden
nicht oder nicht vollständig voneinander getrennt werden können. Die Vorbehandlung
besteht darin, daß man aus den zu behandelnden Geweben bzw.Organen das Wasser vollständig
entfernt, beispielsweise durch Trocknen im gefrorenen Zustand, und die Gewebe dann
zerkleinert, worauf gegebenenfalls eine Trennung der gröberen von den feineren Teilen,
beispielsweise auf mechanischem Wege und/oder durch Absitzenlassen in Äther, vorgenommen
werden kann. Für die Behandlung mit Flüssigkeiten mit verschiedenem spezifischem
Gewicht werden beispielsweise Ätherchloroformmischungen benutzt, aber auch andere
Mischungen von Flüssigkeiten, deren Wahl und Mischungsverhältnisse von dem zu behandelnden
Material abhängen, kommen selbstverständlich in Frage.
-
Die unter Verwendung dieser Flüssigkeiten bzw. Flüssigkeitsgemische
vorzunehmende eigentliche Isolierung bzw. Trennung der Gewebs- bzw. Organbestandteile
gestaltet sich im Prinzip folgendermaßen Das entwässerte und zerkleinerte Organ
wird zunächst grob fraktioniert, indem es der Reihe nach z. B. mit 25, 2o, 15, 1o,
5o/oigem Ätherchloroform und reinem Chloroform behandelt und, gegebenenfalls unter
Zentrifugieren, sedimentiert wird. Die jeweils nach oben gehenden Bestandteile und
die in Suspension gebliebenen werden dabei jedesmal abgegossen. . Die so gewonnenen
einzelnen Fraktionen werden auf den gesuchten Bestandteil hin untersucht. Die Suspension,
die den gesuchten Bestandteil enthält, wird beispielsweise mit reichlich Äther versetzt,
sedimentiert und getrocknet, um dann einer feineren Fraktionierung, beispielsweise
unter Verwendung von 15, 14, 13, 12, 1i und io°/oigem Ätherchloroform unterworfen
zu werden.
-
Die praktische Bedeutung des Verfahrens ergibt sich aus der Möglichkeit,
daß man z. B. in der Hormonchemie eine Anreicherung von Drüsenfraktionen an Hormonen
dadurch erzielen kann, daß man die inneren Strukturen, an die das Hormon gebunden
ist, zum großen Teil von den Ballaststoffen abtrennen kann. So gelingt es beispielsweise,
aus der Schilddrüse und dem Pankreas nach dem vorliegenden Verfahren besonders aktive
Fraktionen zu gewinnen.
-
Beispiele i. iooo g möglichst fett- und bindegewebefreies Rindfleisch
werden in Stücke geschnitten
und in flüssiger Luft, Kohlensäureäther
oder im Kälteraum von etwa minus :17' gefroren.
-
Das gefrorene Fleisch wird nun in einem mit Schwefelsäure beschickten
Exsikkator unter Vakuum etwa 5 bis 6 Tage getrocknet. Das getrocknete Fleisch wird
zunächst grob und dann fein gemahlen. Ist das Fleisch nicht sehr fettreich, so läßt
man das Pulver nun einen Siebsatz mit Maschenweiten von 2,5 bis 0,5 mm durchlaufen,
um Bindegewebe und Gefäße abzutrennen, wobei zur Beschleunigung des Durchtreibens
des Pulvers zweckmäßig Glasperlen in die einzelnen Etagen des Siebsatzes gegeben
werden. Für den Fall, daß der Fettreichtum das Pulver klebrig macht, muß eine Ätherextraktion
vorangehen. Die Ausbeute an feinstem Pulver, das in der Hauptsache aus Muskelzellen
besteht, beträgt 114 g. Den Rückstand bilden Bindegewebe und Gefäßteile, die eine
faserige Masse darstellen.
-
Das Parenchympulver wird nun in einer Flasche mit Äther, gegebenenfalls
mit dem Äther von der Fettextraktion, der schon Parenchympulv er enthält, vereinigt.
Durch wiederholtes fraktioniertes Absitzenlassen in Äther wird das bereits genügend
fein zerkleinerte Parenchympulver, das aus freiem Protoplasma und aus freien Kernen
besteht, von dem gröberen Parenchympulver, das aus noch zusammenhängenden Protoplasma-
und Kernteilen besteht, abgetrennt.
-
Das so gewonnene feine Parenchympulver besteht aus freien Kernen und
aus Protoplasmastücken, die die Kerne in der Mehrzahl an Größe bedeutend übertreffen.
Diese größeren Protoplasmastücke werden durch nochmaliges wiederholtes Sedimentierenlassen
in Äther abgetrennt.
-
Das so erhaltene, mit Kernen angereicherte, nicht vollkommen trockengesaugte
Parenchympulver wird über Nacht im Schwefelsäureexsikkator getrocknet. Die Ausbeute
an trockenem Parenchympulver beträgt etwa 2o g.
-
Das so vorbereitete Organpulver (2o g) wird in einem 30o-ccm-Erlenmeyerkolben
durch kurzes, kräftiges Schütteln in 150 ccm Chloroform, das 2o°/o Äther enthält,
in Suspension gebracht. Die Pulversuspension wird nun eine Stunde lang in zwei mit
gut schließenden Deckeln versehenen Zentrifugengläsern von etwa go ccm Fassungsraum
in einer gut ventilierten, d. h. beim Laufen nicht wärmer werdenden Zentrifuge zentrifugiert
(Temperatur im Gehänge etwa23 °). Nach dem Zentrifugieren wird der Pulverkuchen,
der sich oben abgesetzt hat, zusammen mit der überstehenden Flüssigkeit vom Bodensatz
in ein Becherglas abgegossen. Der Bodensatz wird nun sofort, bevor er eintrocknen
kann, mit i5°/oigem Ätherchloroform übergossen. Das Abgegossene, das in der Hauptsache
aus Protoplasma besteht, wird in einem Erlenmeyerkolben wieder in Suspension gebracht
und nochmals, um mitgerissene Kerne abzutrennen, eine halbe Stunde zentrifugiert.
Alle Bodensätze werden dann in einem go-ccm-Zentrifugenglas vereinigt und mit i5°/@gem
Ätherchloroform "4 Stundenlang zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstehenden wird
der Bodensatz dieser Fraktion 4 Stunden mit io°/oigem Ätherchloroform in einem kleineren
Zentrifugenglase zentrifugiert. Das in Suspension gebliebene und der evtl. oben
abgesetzte Pulverkuchen werden abgegossen, mitÄtherversetzt und in einem kleinen
Zentrifugenglas zu Boden zentrifugiert. Der Bodensatz wird in der Zentrifuge noch
zweimal mit Äther ausgewaschen und im Schwefelsäure-Exsikkator über Nacht getrocknet.
Ausbeute 0,32 g fast reine Zellkerne aus dem Muskelgewebe. Um die Kerne noch
reiner zu erhalten, wird das Pulver nun noch der Reihe nach mit IS, 14, 13, 12,
1i, io°/oigem Ätherchloroform je 4 Stunden zentrifugiert. Die einzelnen so gewonnenen
Fraktionen unterscheiden sich durch einen verschiedenen Gehalt an Zellkernen. Die
reinste Kernfraktion, die bis zu 6o bis 8o°/, Zellkerne enthält, wird getrocknet
und nochmals 4 Stunden mit der Ätherchloroformmischung, bei der sie zu Boden ging,
und der Bodensatz mit der Mischung, bei der er noch gerade in Suspension blieb,
zentrifugiert. Ausbeute etwa 0,2 g.
-
Der Kerngehalt der einzelnen Fraktionen wird untersucht, indem Ausstrichpräparate
nach der Nuclealfärbungsmethode gefärbt und in i°/oiger Naphtholgrünlösung 5 Minuten
nachgefärbt werden. Ausstriche ungetrennten Gewebepulvers und reinen Protoplasmas
sehen grün aus, während genau so behandelte Kernsuspensionen eine tief violette
Färbung zeigen.
-
2. Möglichst frische Schweineschilddrüsen werden einzeln in Kohlensäüreät@ei=-vori
-etwa 7o 'gegeben und darauf in einem Schwefelsäureexsikkator im Vakuum einige
Tage getrocknet. Darauf werden die im gefrorenen Zustand getrockneten Drüsen zerschnitten
und in einer grob mahlenden Mühle gemahlen und durch einen Siebsatz getrieben, dessen
feinstes Sieb eine Maschenweite von 0,5 mm hat. Das grobe Pulver, das das
feinste Sieb nicht passiert, wird nochmals gemahlen und wieder gesiebt. Diese Maßnahme
wird so oft wiederholt, bis sämtliche Drüsensubstanz das feinste Sieb passiert hat.
-
ioo g , des so gewonnenen Drüsenpulvers werden in einer il/, -Literflasche
in Äther suspendiert und das feinere Pulver von dem gröberen durch Sedimentieren
getrennt. Zu diesem Zwecke wird die Flasche nach Umschütteln pro cm ausnützbarer
Fallhöhe (Abstand von der Ätheroberfläche bis zur Oberfläche des sich nach einiger
Zeit bildenden Bodensatzes) o,i Minute stehengelassen und die Äthersuspension vom
Bodensatz (Bodensatz I) in eine 3-Literflasche mit einem Heber abgesaugt. Diese
Prozedur
wird im ganzen dreimal vorgenommen. In der 3-Literflasche,
die eine ausnutzbare Fallhöhe von i8 cm hat, werden die abgesaugten Suspensionen
12 Stunden lang stehen gelassen. Der nach dieser Zeit entstandene Bodensatz (Bodensatz
II) besteht zum großen Teil aus Follikelinhalt (Schilddrüsenkolloid), während der
Bodensatz I in der Hauptsache aus Bindegewebe und Follikelwandzellen besteht. Nach
12 Stunden wird der Äther aus der 3-Literflasche mit dem in Suspension Gebliebenen
vom Bodensatz (Bodensatz II) abgesaugt. Der Bodensatz II wird auf einer Nutsche
durch Absaugen von der Hauptmenge Äther befreit und im Schwefelsäureexsikkator 12
Stunden getrocknet. Ausbeute etwa 37 g. Das in Suspension Gebliebene wird ebenfalls
abgenutscht und getrocknet. Ausbeute etwa 2 g. An Bodensatz I werden erhalten etwa
3o g, die in Suspension zusammen mit Glasperlen geschüttelt und dem beschriebenen
Verfahren nochmals unterworfen werden können. Der schilddrüsenkolloidhaltige Bodensatz
(Bodensatz 1I) wird nun durch Zentrifugieren in Ätherchloroformmischungen verschiedenen
spezifischen Gewichtes systematisch in Fraktionen verschiedenen spezifischen Gewichtes
zerlegt, wobei Fraktionen gewonnen werden, die fast ausschließlich aus Schilddrüsenkolloid
bestehen. Zu diesem Zwecke wird das Pulver zuerst in 6oo ccm Chloroform, das 22
Volumprozent Äther enthält, suspendiert und bei konstanter Zentrifugentemperatur
q. Stunden in verschlossenen Zentrifugengefäßen zentrifugiert. Das in Suspension
Gebliebene wird abgegossen, abgenutscht und getrocknet. Die Bodensätze werden ebenfalls
im Schwefelsäureexsikkator getrocknet. Die getrockneten Bodensätze werden dann nacheinander
mit 2o, i9 und i8°ioigem Ätherchloroform entsprechend zentrifugiert, das Leberstehende
abgegossen, abgenutscht und getrocknet.
-
Die Ausbeuten betragen hierbei a) in 22o/oigem Ätherchloroform bleiben
in Suspension: o,8 g stark bluthaltige Teile; b) in 2oo/oigem Ätherchloroform bleiben
in Suspension: 0,35 g bluthaltige Teile; c) in igo/oigem Ätherchloroform
bleiben in Suspension: 6,2 g fast reines Schilddrüsenkolloid; d) in i8o/oigem Ätherchloroform
bleiben in Suspension: 2o,2 g fast reines Schilddrüsenkolloid; e) in i8o/oigem Ätherchloroform
werden als Bodensatz erhalten: 6,6 g Schilddrüsenkolloid, Zellen und Bindegewebe.
-
Die bei d) erhaltene Suspension stellt also die an genuinem Schilddrüsenkolloid
reichste Fraktion dar.