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Verfahren zur Zerlegung tierischer Gewebe, Organe u. tlgl.
Es wurde gefunden, dass es in einfacher Weise gelingt, aus tierischen Gewebenl1l1d Organen, wie z. B. Drüsen mit innerer Sekretion einzelne Organbestandteile zu isolieren, indem man jene nach geeigneter Vorbehandlung mit Flüssigkeiten von verschiedenem spezifischem Gewicht behandelt, wobei das versehiedene spezifische Gewicht der Organbestandteile die Möglichkeit ihrer Trennung schafft. Die Vorbehandlung besteht darin, dass man aus den zu untersuchenden Organen das Wasser vollständig entfernt, beispielsweise durch Trocknen im gefrorenen Zustand, und die Organe dann zerkleinert, worauf gegebenenfalls eine Trennung der gröberen von den feineren Teilen vorgenommen werden kann.
Für die Behandlung mit Flüssigkeiten werden beispielsweise Ätherchloroformmischungen benutzt, aber auch andere Mischungen von Flüssigkeiten kommen selbstverständlich in Frage. Es kann auch von Vorteil sein, organische Flüssigkeiten mit Wassergehalt oder anderen Zusätzen zu verwenden, beispielsweise dann, wenn die spezifischen Gewichte der zu trennenden Bestandteile wegen zu geringer Unterschiede die Trennungsmöglichkeit erschweren. Es unterliegt lediglich einem Ausprobieren, welche Flüssigkeit oder welches Gemisch für den einzelnen Zweck am praktischesten ist.
Die eigentliche Isolierung bzw. Trennung gestaltet sieh im Prinzip folgendermassen :
Das entwässerte und zerkleinerte Organ wird grob fraktioniert, indem es der Reihe nach mit 25,20, 15,10, 5% igem Ätherchloroform und reinem Chloroform behandelt und, gegebenenfalls unter Zentrifugieren, sedimentiert wird. Die nach oben gehenden Bestandteile und die in Suspension gebliebenen werden dabei jedesmal abgegossen. Die so gewonnenen einzelnen Fraktionen werden auf den gesuchten Bestandteil hin untersucht. Die Suspension, die den gesuchten Bestandteil enthält, wird beispielsweise mit reichlich Äther versetzt, sedimentiert und getrocknet, um einer feineren Fraktionierung beispielsweise unter Verwendung von 15, 14,13, 12, 11 und 10% igen Ätherchloroform unterworfen zu werden.
Die grosse praktische Bedeutung des Verfahrens ergibt sich aus der Möglichkeit, dass man z. B. in der Hormonchemie eine Anreicherung von Drüsenfraktionen an Hormonen dadurch erzielen kann, dass man die inneren Strukturen an die das Hormon gebunden ist, zum grossen Teil von den Ballaststoffen abtrennen kann. So gelingt es beispielsweise aus der Schilddrüse und dem Pankreas nach dem vorliegenden Verfahren besonders aktive Fraktionen zu gewinnen.
Beispiele :
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achten ist, dass das Fleisch vollkommen durehfriert ; in der Kühlkammer muss es zirka 12 Stunden bleiben.
Das beispielsweise im Kühlraum gefrorene Fleisch wird nun in einem mit Schwefelsäure beschickten Exsiccator in einem Abstand von zirka 5 cm von der Schwefelsäure aufgehängt und einige Tage unter gutem Vakuum gehalten. Die gute Wärmeisolierung des stark luftverdünnten Raumes und die Verdunstungskälte verhindern ein Auftauen des Fleisches während des Trocknungsprozesses. 1 kg
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schneiden des grob sichtbaren Fettes und Bindegewebes verbleiben 195 g. Das verbleibende gereinigte Fleisch wird nun durch eine grob schneidende Fleischmaschine und anschliessend durch eine elektrisch betriebene Kaffeemühle getrieben. Ist das Fleisch nicht sehr fettreich, so lässt man das Pulver nun einen Siebsatz passieren, um Bindegewebe und Gefässe abzutrennen.
Für den Fall, dass der Fettreichtum das Pulver klebrig macht, muss eine Atherextraktion vorangehen. Das gröbste Sieb des Siebsatzes hat eine Maschenweite von 2'5 mm, das feinste eine Maschenweite von 0'5 mm. Beschleunigt wird das Durchtreiben des Pulvers dadurch, dass Glasperlen in die einzelnen Etagen des Siebsatzes gegeben werden. Die Ausbeute an feinstem Pulver, das in der Hauptsache aus Muskelzellen besteht, beträgt 114 g. Den Rückstand bilden Bindegewebe und Gefässteile, die eine faserige Masse darstellen.
Das Parenchympulver wird nun in einer Flasche mit Äther, gegebenenfalls mit dem Äther von der Fettextraktion, der schon Parenchympulver enthält, vereinigt. Durch wiederholtes fraktioniertes Absitzenlassen in Äther wird das bereits genügend fein zerkleinerte Parenchympulver, das aus freiem Protoplasma und aus freien Kernen besteht, von dem gröberen Parenchympulver, das aus noch zusammenhängenden Protoplasma-und Kernteilen besteht, abgetrennt. Empirisch wurde festgestellt, dass das gröbere Pulver im Durchschnitt eine grössere Fallgeschwindigkeit hat als 1 em pro 0'5 Minuten, wogegen diejenige der Kerne und der kernfreien Protoplasmastücke geringer ist. Die zu gebrauchende Äthermenge richtet sich nach der Menge des angefallenen feinen Pulvers.
Das feine Pulver darf nämlich eine gewisse Konzentration nicht übersteigen, da sonst die Fallzeit durch Stauung der einzelnen Teilchen, die sieh durch Absetzen mit einer scharfen Zone bemerkbar macht, in unkontrollierbarer Weise verzögert wird. Aus dem gröberen Parenchympulver lassen sich durch weiteres Mahlen z. B. mit Glasperlen und darauffolgendes fraktioniertes Absitzenlassen weitere Mengen feines Parenchympulver gewinnen. Hiebei wird zweckmässig der lipoidhaltige Äther, der von den ersten Sedimentierungen zurückgewonnen wurde, mit benutzt. Ein gewisser Lipoidgehalt des Äthers verhindert nämlich Agglutinationserseheinungen. die jedes Schlemmen illusorisch machen würden.
Das so gewonnene feine Parenchympulver besteht aus freien Kernen und aus Protoplasmastueken, die die Kerne in der Mehrzahl an Grösse bedeutend übertreffen. Diese grösseren Protoplasmastücke werden abgetrennt, indem man dreimal. in Äther sedimentiert, wobei die Fallzeit 1 Minute pro ein beträgt, und das so gewonnene kernreichere Pulver nochmals dreimal mit einer Fallzeit von drei Minuten pro cm sedimentiert.
Beim Absaugen des mit Kernen angereicherten Parenehympulvers vom Äther ist zu beachten, dass das Pulver nie trocken gesaugt wird, damit Abkühlung durch Verdunsten des Äthers und damit Feuchtwerden des Parenehympulvers vermieden wird. Das nicht vollkommen trockengesaugte Parenehym- pulver wird schnell in Filtrierpapier eingeschlagen und über Nacht in dem Schwefelsäureexsiccator getrocknet. Die Ausbeute an trockenem Parenehympulver beträgt zirka 20 g.
Die getrockneten Organe und Organpulver sind dauernd im Exsiccator zu halten. Nur bei der groben Zerkleinerung und beim Sieben werden sie längere Zeit der Luft ausgesetzt. Die Gründe hiezu sind mannigfache Art : Je trockner die Organe sind, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit nachträg- licher chemischer Umwandlungen. Weiterhin, sind die Organpulver nicht absolut trocken, so können verschiedene Teile des hygroskopischen Pulvers verschiedenen Wassergehalt besitzen, so dass auf Grund des zufällig verschiedenen Wassergehaltes Verschiebungen des spezifischen Gewichtes eintreten, die eine Trennung in die verschiedenen Strukturen unmöglich machen. Feuchte Organe sind weniger spröde als trockene, lassen sich also nur schwierig mahlen. Feuchte Organpulver lassen sich nicht sieben, da sich die Sieblöcher rasch zusetzen.
Schliesslich, Organpulver, die kürzere Zeit der Luft ausgesetzt waren. lassen sieh nicht mehr in Suspension bringen, da die einzelnen Teile miteinander verkleben.
Bei der weiteren Zerlegung werden als Trennungsflüssigkeiten Ätherchloroformmisehungen benutzt.
Die Skala der für unsere Zwecke zu gebrauchenden Flüssigkeiten erstreckt sich praktisch von reinem Chloroform als spezifisch-schwerster Flüssigkeit, bis zu einer Ätherchloroformmischung, die 25 Volumenprozent Äther enthält, mit einem Abstand von je 1%. Um nicht soviel Mischungen vorrätig halten zu müssen, werden die einzelnen Lösungen zweckmässigerweise kurz vor dem Gebrauch durch Mischen von vorrätig gehaltenem Chloroform und Chloroform, das 30% Äther enthält, hergestellt. 30% Ätherchloroform wird genommen, weil die zum Mischen erforderlichen Volumina einfacher abzumessen sind, und weil die sehr störende Erwärmung, die beim Mischen von reinem Äther mit reinem Chloroform auftritt, vermieden wird. Die beiden Vorratslösungen stehen über Chlorcalcium und werden vermittels automatischer Büretten abgefüllt.
Die eigentliche Trennung gestaltet sich im Prinzip folgendermassen : Zuerst wird das Organpulver grob fraktioniert, indem es der Reihe nach mit 25-, 20-, 15-, 10-, 5prozentigemÄtherchloroform und reinem Chloroform zentrifugiert wird. Das nach oben gegangene und in Suspension gebliebenewird dabei jedesmal abgegossen. Die so gewonnenen einzelnen Fraktionen werden auf den gesuchten Bestandteil hin untersucht. Diejenige Suspension, die den gesuchten Bestandteil enthält, wird mit reichlich Äther versetzt, zu Boden zentrifugiert und getrocknet, um einer feineren Fraktionierung unterzogen zu werden. Befand sich
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zentrifugiert. Dann wird nachgesehen, in welcher Fraktion der gesuchte Bestandteil in grösster Reinheit vorhanden ist.
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in Suspension gebracht.
Die Pulversuspension wird nun eine Stunde lang in zwei Zentrifugengläsern von zirka 90 cm3 Fassungsraum in einer gut ventilierten, d. h. beim Laufen nicht wärmer werdenden Zentrifuge zentrifugiert (Temperatur im Gehänge zirka 23 ). Die Zentrifugengläser müssen dabei wegen der Verdunstungsgefahr mit gut schliessenden Deckeln versehen sein. Nach dem Zentrifugieren wird der Pulverkuchen, der sich oben abgesetzt hat, mit einem Spatel vorsichtig zerkleinert und vom Rande des Glases abgelöst und zusammen mit der überstehenden Flüssigkeit vom Bodensatz in ein Becherglas abgegossen. Der Bodensatz wird nun sofort, bevor er eintrocknen kann, mit 15% Ätherchloroform übergossen.
Das Abgegossene, das in der Hauptsache aus Protoplasma besteht, wird in einem Erlenmeyerkolben wieder in Suspension gebracht und nochmals, um mitgerissene Kerne abzutrennen, eine halbe Stunde zentrifugiert. Nachdem das tberstehende abgegossen ist, werden alle Bodensätze in einem 90 cm3 Zentrifugenglas vereinigt und mit 15% Ätherchloroform vier Stunden lang zentrifugiert. Nach Abgiessen des Überstehenden wird der Bodensatz vier Stunden mit 10prozentigem Ätherchloroform in einem kleineren Zentrifugenglase zentrifugiert. Das in Suspension gebliebene und der eventuell oben abgesetzte Pulverkuchen werden abgegossen, mit Äther versetzt und in einem kleinen Zentrifugenglas zu Boden zentrifugiert.
Der Bodensatz wird in der Zentrifuge noch zweimal mit Äther ausgewaschen und im Schwefelsäureexsiccator über Nacht getrocknet. Ausbeute 0'32 g fast reine Kerne. Um die Kerne noch reiner zu erhalten, wird das Pulver nun noch der Reihe nach mit 15-, 14-, 13-, 12-, 11-, 10prozentigem Ätherchloroform je vier Stunden zentrifugiert. Die einzelnen so gewonnenen Fraktionen unterscheiden sich
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der Mischung, bei der er noch gerade in Suspension blieb, zentrifugiert. Ausbeute zirka 0'2 g. Zwischen welchen Mischungen die reinste Fraktion liegt, hängt von der Temperatur ab, die während des Zentrifugierens in den Zentrifugengläsern herrscht.
Der Kerngehalt der einzelnen Fraktionen wird untersucht, indem Ausstrichpräparate nach der
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werden. Ausstriche ungetrennten Gewebepulvers und reinem Protoplasmas sehen grün aus, während genau so so behandelse Kernsuspensionen eine tief violette Färbung zeigen.
2. Möglichst frische Schweineschilddrüsen werden einzeln in Kohlensäureäther von zirka minus 70 gegeben und darauf in einem Mullbeutel in einem Schwefelsäureexsieeator aufgehängt, der auf zirka 0'2 mm Hg ausgepumpt und 8 Tage lang auf diesem Vakuum gehalten wird. Darauf werden die auf diese Weise im gefrorenen Zustand getrockneten Drüsen herausgenommen und in zirka 1 em3 grosse Stücke zerschnitten, wobei Fett und grobes Bindegewebe nach Möglichkeit entfernt wird. Die so zerschnittenen Drüsen werden in einer grob mahlenden Mühle gemahlen und durch einen Siebsatz getrieben, dessen feinstes Sieb eine Maschenweite von 0'5 mm hat. Das grobe Pulver, das das feinste Sieb nicht passiert, wird nochmals gemahlen und wieder gesiebt.
Diese Prozedur wird so oft wiederholt, bis sämtliche Drüsensubstanz das feinste Sieb passiert hat.
100 g des so gewonnenen Drüsenpulvers werden in einer anderthalb Literflasche in Äther suspendiert und das feinere Pulver von dem gröberen durch Sedimentieren getrennt. Zu diesem Zwecke wird die Flasche nach Umschütteln pro Zentimeter ausnutzbarer Fallhöhe (Abstand von der Ätheroberfläehe bis zur Oberfläche des sich nach einiger Zeit bildenden Bodensatzes) 0'1 Minute stehen gelassen und die Äthersuspension vom Bodensatz (Bodensatz 1) in eine Dreiliterflasche mit einem Heber abgesaugt.
Diese Prozedur wird im ganzen dreimal vorgenommen. In der Dreiliterflasehe, die eine ausnutzbare Fallhöhe von 18 cm hat, werden die abgesaugten Suspensionen 12 Stunden lang stehen gelassen. Der nach dieser Zeit entstandene Bodensatz (Bodensatz 11) besteht zum grossen Teil aus Follikelinhalt (Kolloid), während der Bodensatz I in der Hauptsache aus Bindegewebe und Follikelwandzellen besteht. Nach 12 Stunden wird der Äther aus der Dreiliterflasche mit dem in Suspension Gebliebenen vom Bodensatz (Bodensatz 11) abgesaugt. Der Bodensatz Il wird auf einer Nutsche durch Absaugen von der Hauptmenge Äther befreit und im Schwefelsäureexsiecator 12 Stunden getrocknet. Ausbeute zirka 37 g. Das in Suspension Gebliebene wird ebenfalls abgenutscht und getrocknet.
Ausbeute zirka 2 g. An Bodensatz 1 werden erhalten zirka 30 g. Der kolloidhaltige Bodensatz (Bodensatz II) wird nun durch Zentri-
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lich aus Kolloid bestehen. Zu diesem Zwecke wird das Pulver zuerst in 600 cm2 Chloroform, das 22 Volumenprozent Äther enthält, suspendiert und bei einer Zentrifugentemperatur von 23'a g vier Stunden in verschlossenen Zentrifugengefässen zentrifugiert. Das in Suspension Gebliebene wird abgegossen, abgenutseht und getrocknet. Die Bodensätze werden ebenfalls im Schwefelsäureexsieeator getrocknet.
Die getrockneten Bodensätze werden dann nacheinander mit 20-, 19- und 18prozentigem Ätherchloroform
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Ausbeuten :
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<tb> 22% <SEP> oben <SEP> 0-8 <SEP> g <SEP> stark <SEP> bluthaltig
<tb> 20% <SEP> oben <SEP> 0 <SEP> 35 <SEP> g <SEP> bluthaltig
<tb> 19% <SEP> oben <SEP> 6-2 <SEP> g <SEP> fast <SEP> reines <SEP> Kolloid
<tb> 18% <SEP> oben <SEP> 20'2 <SEP> g <SEP> fast <SEP> reines <SEP> Kolloid
<tb> 18% <SEP> unten <SEP> 6#6 <SEP> g <SEP> Kolloid, <SEP> Zellen <SEP> und <SEP> Bindegewebe.
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Kolloid aus den Follikeln freigemacht und durch dreimaliges Schlemmen (0'1 Minute pro 1 cm Fallhöhe) in einer 1. 5-l-Flasche abgetrennt.
Der Rückstand wird nun in einer l-l-Flasche mit 500 g Glasperlen und wenig Äther 8 Stunden geschüttelt. Durch dieses intensive Mahlen werden die Follikelzellen von dem Bundegewebe abgelöst. Durch dreimaliges Schlemmen (0'5 Minuten pro 1 cm Fallhöhe) werden die Zellen vom Bindegewebe abgetrennt.
Das Zellenpulver, das noch Kolloid, Blut, Bindegewebe und freie Zellkerne enthält, wird in der oben angegebenen Art in Fraktionen verschiedenen spezifischen Gewichtes zerlegt und so sehr zellreiehe Fraktionen gewonnen.