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Bereich der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht, die aus dem Knorpelgewebe
von Haien extrahiert werden, sowie Verfahren zu deren Gewinnung.
Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zur Isolierung und Reinigung
eines Knorpelgewebeextrakts unter einer Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen.
Die Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zeigen eine Anti-Matrix-Metalloprotease- (Anti-MMP-)
und/oder eine anti-angiogene und/oder eine tumorhemmende Wirkung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Verfahren zur Gewinnung von Hai-Knorpelgewebe-Extrakten
und die Extrakte selbst sind in den internationalen Veröffentlichungen
WO 95/32722, WO 96/23512 und WO 97/16197 offenbart. Flüssige Extrakte
von Hai-Knorpelgewebe wurden in verschiedenen Versuchen auf ihre
anti-angiogene und antikollagenolytische Wirkung, ihre direkte Antitumorproliferationswirkung
sowie ihre entzündungshemmende
Wirkung hin untersucht.
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Die WO 95/32722 beschreibt ein Verfahren
zur Gewinnung eines Hai-Knorpelgewebeextrakts
mit anti-angiogener Wirkung, mit einer direkten Antitumorproliferationswirkung
in vitro und mit einer Antitumorwirkung in vivo. Dieses Verfahren
umfasst die Verfahrensschritte eines Mischens von Hai-Knorpelgewebe
und einer Reduzierung desselben auf eine Partikelgröße von etwa
500 μm in
. Wasser; der Extrahierung aktiver Komponenten in das Wasser und
der Fraktionierung der auf diese Weise hergestellten Extrakte zur
Gewinnung von Molekülen,
deren Molekulargewicht weniger als etwa 500 kDa (0–500-Fraktion)
beträgt.
Der flüssige
Knorpelgewebeextrakt wurde auf einer Membran mit einer nominalen
Porosität
von etwa 1 kDa konzentriert, um einen konzentrierten flüssigen Extrakt
herzustellen, welcher Moleküle
mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 kDa enthielt.
Der Extrakt wurde mit Molekülen
mit einem Molekulargewicht von zwischen etwa 1–500 kDa angereichert. Die
0–500-Fraktion
wurde weiter fraktioniert, um mehrere Extrakte herzustellen, welche
Antitumorproliferationsmoleküle
mit einem Molekulargewicht von etwa 1 bis 120 kDa enthielten. Die
Veröffentlichung
WO 95/32722 offenbart nicht die spezielle Gewinnung von Komponenten mit
einem Molekulargewicht von unter etwa 1 kDa. Sie offenbart auch
kein Verfahren zur Gewinnung eines Knorpelgewebeextrakts oder von
Fraktionen eines solchen Extrakts in organisches Lösungsmittel
enthaltenden Lösungen.
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Die internationale Veröffentlichung
WO 96/23512 offenbart ein Verfahren zur Extraktion von biologisch wirksamen
Komponenten aus einer beliebigen Knorpelgewebequelle in wässrigen
Lösungen.
Zudem offenbart die Veröffentlichung
andere biologische Wirkungen, die mit dem flüssigen Hai-Knorpelgewebe in
Verbindung stehen, nämlich
anti-kollagenolytische und entzündungshemmende
Wirkungen. Die Veröffentlichung
WO 96/23512 offenbart weder die Gewinnung von Komponenten, deren
Molekulargewicht weniger als 1 kDa beträgt, noch irgendein Verfahren,
bei dem organisches Lösungsmittel
enthaltende Lösungen
zum Einsatz kommen.
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Die internationale Veröffentlichung
WO 97/16197 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung eines wässrigen
Extrakts, das mit Molekülen
angereichert ist, welche ein Molekulargewicht von zwischen etwa
0,1 und 500 kDa besitzen. Obwohl durch dieses Verfahren Komponenten
mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa gewonnen werden
können,
ist das Verfahren doch nicht auf die Gewinnung spezifischer Komponenten
mit niedrigem Molekulargewicht ausgelegt. Komponenten in isolierter
oder gereinigter Form werden nicht beschrieben.
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Unter Fachleuten ist es allgemein
anerkannt, dass Matrix-Metalloproteasen in Gefäßneubildungsprozessen eine
Rolle spielen und dabei das Wachstum von primären Tumoren und die Bildung
von Metastasen fördern.
Dementsprechend geht man davon aus, dass Komponenten oder Wirkstoffe,
die eine anti-angiogene und/oder eine Anti-Matrix-Metalloprotease-Wirkung
aufweisen, zur Hemmung der Gefäßneubildung
und/oder des Tumorwachstums und/oder des Eindringens von Metastasen
in Zellen und/oder zur Hemmung der Metastasenbildung und/oder zur
Behandlung von angiogenese-bezogenen Krankheiten nutzbringend eingesetzt werden
können.
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Berücksichtigt man das Interesse
an aus Hai-Knorpelgewebe gewonnenen Komponenten, so besteht ein
Bedarf nach verbesserten Verfahren zu deren Herstellung und zur
Isolierung und Reinigung weiterer Komponenten, deren biologische
Wirksamkeit früher
noch nicht bekannt war.
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Überblick über die
Erfindung
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Ziel der vorliegenden Erfindung ist
es, verbesserte Verfahren zur Bereitstellung von aus Hai-Knorpelgewebe
gewonnenen Extrakten zu beschreiben.
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Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung
betrifft dabei ein Verfahren gemäß Anspruch
1.
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Zur Minimierung der Bildung von Komponentenaggregaten
sowie zur Verbesserung der Auflösung
und der Aufrechterhaltung einer stabilen löslichen Form können Saccharose
oder ein oder mehrere andere geeignete Stabilisatoren, wie etwa
Dextran, FicollTM, Fruktose, Gelatine, Glukose,
Glyzin, Inositol, Laktose, Mannitol und Sorbitol in einer zur Stabilisierung
ausreichenden Menge der 0–500-,
der 0–1- und/oder der 1–500-Fraktion
zugegeben werden oder in einem beliebigen Schritt des Herstellungsverfahrens
Verwendung finden. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der
Ausdruck "enthaltend
1 Gew.-/Vol.-% Saccharose" bei
Fraktionen, Lösungen
oder Extrakten auf eine entsprechende Fraktion bzw. Lösung oder
einen entsprechenden Extrakt, die bzw. der etwa 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose
enthält.
Biologisch wirksame Komponenten in der 0–1- und der 1–500-Fraktion
besitzen eine Anti-MMP-, eine anti-angiogene und eine Anti-Tumor-Wirkung.
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Ein anderer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft eine biologisch wirksame Komponente gemäß Anspruch
13, die sich durch das oben genannte Verfahren gewinnen lässt, sowie
die Verwendung einer derartigen biologisch wirksamen Komponente
gemäß Anspruch
14 bei der Herstellung eines Medikaments, das eine Anti-Matrix-Metalloprotease
und/oder eine anti-angiogene und/oder eine Anti-Tumor-Wirkung besitzt.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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Die im folgenden erwähnten Zeichnungsfiguren
sind Teil der vorliegende Beschreibung und dienen zur genaueren
Darstellung bestimmter Aspekte der Erfindung, wobei die Erfindung
unter Bezugnahme auf eine oder mehrere der Figuren in Verbindung
mit der vorliegenden detaillierten Beschreibung der spezifischen
Ausführungsbeispiele
leichter verständlich
wird.
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In der Zeichnung zeigen
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1a und 1b das Total-Ionen-Chromatogramm
bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm
(245 M + 1), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System
unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 7) bei Durchführung einer
isokratischen Elution ergibt;
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2a und 2b das Total-Ionen-Chromatogramm
bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm
(245 M + 1 ), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System
unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer
Gradientenelution ergibt;
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3a und 3b das Total-Ionen-Chromatogramm
bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm
(245), das sich durch die Anlayse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System
unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer
isokratischen Elution ergibt;
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4a und 4b das Total-Ionen-Chromatogramm
bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm
(245), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-NH2-System
unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer
Gradientenelution ergibt;
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5 das
MS/MS-Spektrum von Æ-986,
dem sich der Verlust von 18 amu (Hauptpeak m/e 227.1) entnehmen
lässt,
der dem Verlust eines Wassermoleküls entspricht;
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6 das
MS/MS-Spektrum der spezifischen Fragmente des Ions 227 (245 M +
1 minus ein Wassermolekül).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung Biologische Versuche
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Die biologischen Eigenschaften von
Hai-Knorpelgewebeextrakten, daraus gewonnenen Fraktionen und der
Komponente Æ-986
wurden durch wenigstens einen der folgenden Versuche bestimmt:
- – Gelatinase-Inhibitor-Versuch
(GIA): ein Versuch zur Bewertung der Anti-MMP-Wirkung;
- – Embryonen-Vaskularisations-Test
(EVT): ein Versuch zur Bewertung der anti-angiogenen Wirkung; und
- – Lewis-Lungenkarzinom-Metastasten-Maus-Modell
(LLC): ein Versuch zur Bewertung der Anti-Tumorwirkung.
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GIA
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Der GIA wurde unter Verwendung einer
im Handel (Boehringer Mannheim) erhältlichen Ausstattung durchgeführt. GIA
dient zur Bestimmung der Fähigkeit
von Komponenten in den aus Knorpelgewebe gewonnenen Extrakten oder
von Fraktionen hiervon oder der Komponente Æ-986, die Wirkung des Gelatinase-A-Enzyms (MMP-2) zu
hemmen.
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Kurz gesagt, wurde der GIA in der
folgenden Weise durchgeführt:
Ein mit Biotin markiertes Gelatinesubstrat wurde einerseits in Abwesenheit
und andererseits bei Vorhandensein eines flüssigen Knorpelgewebeextrakts
oder von dessen Derivaten mit Gelatinase A einer Inkubation unterzogen.
Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch auf eine mit Streptavidin überzogene
Mikrotiter-Platte aufgebracht. Die mit Biotin markierte Gelatine
wurde durch ihre freien Biotinrückstände an die
mit Streptavidin überzogene
Mikrotiter-Platte gebunden. Erfolgte nun keine durch die Gelatinase
hervorgerufene Spleiß-Reaktion
des Substrats, d. h. der Gelatine, so entstanden Bindungen zwischen
dem Streptavidin-Peroxidase-(POD)-Konjugat und dem Gelatinase-Biotin-Komplex.
Die POD wandelte sodann ein zugegebenes ABTS-Substrat in ein grünes Endprodukt
um, das bei 405 nm gemessen wurde. Bewirkte hingegen die Gelatinase
eine Spleiß-Reaktion
der mit Biotin markierten Gelatine, so bildeten sich nur kleine
Gelatinfragmente. Nach der Anhaftung an einer Mikrotiter-Platte
besaßen diese
Fragmente nicht die Fähigkeit,
Bindungen mit dem Streptavidin-POD-Konjugat herzustellen, so dass
hier auch keine Farbwirkung eintrat.
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Somit liefert eine hohe Gelatinase-Aktivität niedrige
Signale, während
eine (z. B. auf die Zugabe eines Inhibitors zurückzuführende) niedrige Gelatinase-Aktivität hohe Signale
liefert. Bei der Wirkung, nach der bei den Komponenten in einem
aus Knorpelgewebe gewonnenen Extrakt bzw. bei hieraus derivierten
Fraktionen gesucht wurde, kann es sich um eine gelatinasehemmende
Wirkung oder eine antagonistische Wirkung handeln, welche mit der
Interaktion zwischen der Gelatinase und dem zugehörigen Gelatin-Substrat
konkurriert (z. B. indem die antagonistischen Komponenten Bindungen
mit der Gelatine ausbilden).
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EVT
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Der Embryonen-Vaskularisierungs-Test
(EVT) wurde zur Bestimmung der Fähigkeiten
von Komponenten in den flüssigen
Haiknorpelgewebeextrakten oder von daraus derivierten Fraktionen
eingesetzt, die Bildung neuer Blutgefäße zu hemmen (anti-angiogene
Wirkung).
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Die normale Entwicklung von Hühnerembryonen
beinhaltet die Bildung eines externen Gefäßsystems in der Vitellus-Membran,
das Nährstoffe
vom Vitellus (Eigelb) zu dem sich entwickelnden Embryo transportiert. Werden
anti-angiogene Substanzen auf die Vitellus-Membran platziert, so
können
sie die in der Vitellus-Membran
ablaufende Bildung der Blutgefäße hemmen.
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Auf den äußeren Rand des vaskulären Perimeters
der Vitellus-Membran, wo der angiogene Prozess abläuft, wurden
Methylzellulosescheiben (inerter Feststoff und durchsichtige Matrix)
mit unterschiedlichen Mengen an Komponenten von aus Haiknorpelgewebe
derivierten flüssigen
Extrakten oder daraus derivierten Fraktionen oder geeigneten Kontrollsubstanzen
platziert. Zu den positiven Kontrollsubstanzen gehörten dabei Methylzellulosescheiben,
welche 1,5 mg/ml 2- Methoxyestradiol
enthielten. Scheiben mit Kontrollsubstanzen und mit Proben wurden
auf die Vitellus-Membran von drei Tage alten Embryonen platziert.
Zu diesem Zeitpunkt dringen in den Vitellus nur die Anfänge der
primären
Blutgefäße ein.
Auf die Vitellus-Membran desselben Embryos wurden immer gleichzeitig
eine Methylzellulosescheibe mit einer negativen Kontrollsubstanz
und eine Methylzellulosescheibe mit einer bestimmten Menge an Komponenten
des aus Haiknorpelgewebe derivierten flüssigen Extrakts oder daraus
derivierter Fraktionen platziert. Die beiden Scheiben wurden symmetrisch
zur Zephalokaudalachse des Embryos angeordnet, um individuelle Abweichungen
zwischen den einzelnen Embryonen beim Vergleich der Effizienz der
Komponenten mit derjenigen der negativen Kontrollsubstanzen möglichst
gering zu halten. Die Gefäßbildung
wurde 24 Stunden nach der Platzierung der Scheiben bewertet und die
Ergebnisse wurden als Prozentsatz an Embryonen angegeben, deren
Blutgefäßbildung
beeinträchtigt
wurde. Die Blutgefäßbildung
wurde als beeinträchtigt
angesehen, wenn der Blutgefäß-Wuchspfad entweder
umgeleitet oder eingeschränkt
wurde oder wenn im Vergleich zur negativen Kontrollsubstanz kein über die
Scheibe hinausreichendes Wachstum zu beobachten war.
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LLC-Modell
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Das Lewis-Lungenkarzinom-Maus-Modell
(LLC) wurde zur Bestimmung der Fähigkeit
von Komponenten von flüssigen
Haiknorpelgewebeextrakten, von daraus derivierten Fraktionen bzw.
von Æ-986
zur Hemmung der Metastasenbildung in der Lunge eingesetzt.
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Zeltkultur: Das Lewis-Lungenkarzinom-Klon-M27
mit hohem Metastasenpotential der Lunge wurde durch Dr. P. Brodt
(Brodt P, Cancer Res., 46: 2442, 1986) etabliert. Dieses Modell
hat sich durchgesetzt und ist für
seine Vorhersagen über
Beziehungen zwischen in-vitro- und in-vivo-Wirkungen bekannt. Zellen
wurden in einem mit 10% Rinderfötenserum
und 1% Penicillin-Streptomyzin angereicherten RPMI-Medium unter
5% CO2 gehalten und zweimal pro Woche passagiert.
Es wurden Zellstämme
erzeugt und als frühe
Passagen gelagert. Alle Experimente wurden unter Verwendung derselben
Passage durchgeführt.
Zur Tumorinduktion ließ man
M27-Zellen bei 70%iger Konfluenz in vollständigem Medium wachsen, die
sodann unter Verwendung von Trypsin-EDTA-Lösung (0,05% Trypsin, 0,53 mM
EDTA-4Na in HBSS ohne Ca++ oder Mg++) geerntet wurden. Die Zellen wur den sodann
zentrifugiert, gewaschen und resuspendiert (1 × 106 LLC
Zellen pro 200 μl
PBS, Ca++-frei und Mg++-frei).
Die Lebensfähigkeit
wurde durch Tryptan-Blau-Anfärbung bestimmt
und nur Kolben, deren Inhalt eine Lebensfähigkeit von mehr als 95 % aufwies,
wurden zur Beimpfung verwendet.
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Tumorinduktion: Für die Induktion der Lewis-Lungenkarzinomtumore
wurden weibliche Mäuse C57BL/10
(15 bis 20 g) (Charles River Inc.) herangezogen. Nach einer Inkubationszeit
von einer Woche wurden am Tag 0 im Axillarbereich der rechten Flanke
LLC-Zellen subkutan transplantiert (5 × 105 lebensfähige Zellen
pro 100 μl).
Alle Tiere wurden an derselben Stelle beimpft. Das Tumorwachstum
wurde jeden Tag mit Hilfe von Messlehren überprüft. Das relative Tumorvolumen
wurde mit Hilfe der folgenden Formel berechnet: Länge (cm) × [Breite
(cm)]2/2, wobei die Länge der längsten Achse und die Breite
der kürzesten
senkrechten Achse des Tumors entspricht. Sobald der primäre Tumor
eine Größe von 0,5
bis 1,0 cm3 (10 Tage nach der Beimpfung)
erreichte, wurden Mäuse
mit primären
Tumoren etwa identischer Größe nach
dem Zufallsprinzip spezifischen Experimentgruppen von jeweils 15
Tieren zugeordnet und mit Hilfe des Ohrstanzverfahrens mit Nummern
markiert. Sodann wurde unter sterilen Bedingungen operiert. Nach
einem kleinen Einschnitt in die Haut (0,5–1 cm) wurde der Tumor sorgfältig vom
ihn umgebenden gesunden Gewebe gelöst. LLC-Zellen bilden (in einer
frühen
Wachstumsphase) einen gut abgegrenzten Tumor und die Entfernung
ließ sich
leicht ohne nennenswerte Beschädigung
des normalen Gewebes durchführen.
Eine Stereoskop-Untersuchung zeigte das Fehlen jeglicher makroskopischer
Tumorreste an der mit dem Tumor beimpften Stelle und es wurde unter
den genannten Bedingungen auch kein erneutes Tumorwachstum beobachtet.
Nach der Entfernung wurde der Tumor gewogen und die Wunde mit Klammern
aus chirurgischem Edelstahl verschlossen und mit Providon-Jod desinfiziert.
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Experimentaufbau für die Effizienzstudie:
Die Behandlung mit unterschiedlichen Testproben (aus flüssigem Haiknorpelgewebeextrakt
derivierte Komponenten, hieraus derivierte Fraktionen oder Æ-986) begann am
Tag nach der Tumorentfernung (Tag 11 nach Beimpfung). Es wurde zwei
Wochen lang täglich
eine Schlundfütterung
einer Salzlösung
bzw. der aus Knorpelgewebe derivierten Produkte vorgenommen. Die Schlundfütterung
(0,5 ml) wurde unter Einsatz einer gebogenen 22G-Nadel durchgeführt. Da
frühere
Experimente gezeigt hatten, dass ein Zeitraum von etwa 2 Wochen
nach Entfernung des primären
Tumors ausreicht, damit im Durchschnitt 30 bis 50 Knötchen auf
der Lungenoberfläche
ent stehen, wurden die Tiere nach zwei Wochen in einer CO2-Kammer getötet. Nach der Autopsie wurden
beide Lungenflügel
entfernt, gewogen und in einer 10%igen Bouin-Lösung fixiert. Die Metastasen
an der Lungenoberfläche
wurden mit Hilfe eines Stereomikroskops (4fach) gemessen.
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Messung des Körpergewichts: Das Körpergewicht
wurde jeden zweiten oder dritten Tag bis zur Tötung gemessen.
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Verfahren
zur Herstellung von Knorpelgewebeextrakten
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Extraktion
wirksamer Komponenten aus Hai-Knorpelgewebe unter Verwendung organisches
Lösungsmittel enthaltender
Lösungen
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Die vorliegende Erfindung offenbart
ein Verfahren zur Herstellung eines Knorpelgewebeextraktes und zur
Gewinnung, Isolierung und Aufbereitung darin enthaltener biologisch
wirksamer Komponenten aus dem Extrakt, wobei zumindest ein Teil
der biologisch wirksamen Komponenten keine Proteinstruktur aufweist.
Allerdings können
im erfindungsgemäßen Verfahren
chaotrope Wirkstoffe eingesetzt werden, die zur Extraktion von proteinhaltigen
Komponenten dienen.
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Im vorliegenden Zusammenhang bezieht
sich der Ausdruck "organisches
Lösungsmittel
enthaltende Lösung" auf eine Lösung oder
ein Gemisch, die bzw. das zumindest eine gewisse Menge an organischem
Lösungsmittel
enthält.
Die organisches Lösungsmittel
enthaltende Lösung
kann ein oder mehrere organische Lösungsmittel umfassen und Wasser
enthalten. Im vorliegenden Zusammenhang wird vorzugsweise ein polares organisches
Lösungsmittel
oder eine polare Kombination organischer Lösungsmittel eingesetzt. Bei
einem Ausführungsbeispiel
kann für
die Herstellung von flüssigen
Hai-Knorpelgewebeextrakten Methanol und/oder Ethanol zum Einsatz
kommen. Bei anderen organischen Lösungsmitteln, wie Azetonitril,
Propanol, Isopropanol und Azeton, handelt es sich um geeignete polare
Lösungsmittel,
die ebenfalls Verwendung finden können. Das organische Lösungsmittel
kann halogenierte, Äther-,
protische, aprotische, polare, nichtpolare, basische, saure, wasserabweisende
und hydrophile Lösungsmittel
einzeln oder in Kombination umfassen.
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Zu den geeigneten halogenierten Lösungsmittel
zählen
Chloroform, Dibrommethan, Butylchlorid und Dichlormethan.
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Geeignete Äther-Lösungsmittel sind Dimethoxymethan,
Tetrahydrofuran, Diethyläther,
Ethylenglykoldimethyläther,
Ethylenglykoldiethyläther,
Diethlyenglykoldiethyläther,
Triethylenglykoldimethyläther,
t-Butylethyläther
und t-Butylmethyläther.
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Zu den geeigneten protischen Lösungsmitteln
zählen
beispielsweise u. a. Methanol, Ethanol, 2-Nitroethanol, 2-Fluorethanol,
2,2,2,-Trifluorethanol, Ethylenglykol, 1-Propanol, 2-Propanol, 2-Methoxyethanol, 1-Butanol,
2-Butanol, i-Butylalkohol, t-Butylalkohol,
2-Ethoxyethanol, Diethylenglykol, 1-, 2- oder 3-Pentanol, Neopentylalkohol,
t-Pentylalkohol, Diethylenglykolmonomethyläther, Diethylenglykolmonoethyläther, Zyklohexanol,
Anisol, Benzylalkohol, Phenol oder Glyzerol.
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Als geeignete aprotische Lösungsmittel
kommen beispielsweise u. a. Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid
(DMAC), 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (DMPU), 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon
(DMI), N-Methylpyrrolidinon (NMP), Formamid, N-Methylacetamid, N-Methylformamid,
Azetonitril, Dimethyfsulfoxid, Propionitril, Ethylformiat, Methylazetat,
Azeton, Ethylmethylketon, Ethylazetat, Sulfolan, N,N-Dimethlypropionamid,
Tetramethylharnstoff, Nitromethan, Nitrobenzen oder Hexamethylphosphoramid
in Betracht.
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Zu den geeigneten basischen Lösungsmitteln
gehören
2-, 3- oder 4-Picolin, Pyrrol, Pyrrolidin, Morpholin, Pyridin oder
Piperidin.
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Als saure Lösungsmittel sind Trifluor-Essigsäure, Essigsäure, Proprionsäure und
Ameisensäure
geeignet.
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Die geeigneten Kohlenwasserstofflösungsmittel
umfassen Benzen, Zyklohexan, Pentan, Hexan, Toluen, Zykloheptan,
Methylzyklohexan, Heptan, Ethylbenzen, Oktan, Indan, Nonan oder
Naphthalen.
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Die organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung kann
Kombinationen von organischen Lösungsmitteln
und/oder Kombinationen von organischen Lösungsmitteln mit Wasser umfassen.
Zu den geeigneten protischen Lösungsmittelverbindungen
mit Wasser zählen
beispielsweise u. a. Wasser- Methanol,
Wasser-Propanol, Wasser-Isopropanol und Wasser-Butanol. Geeignete
aprotische Lösungsmittelkombinationen
mit und ohne Wasser können
beispielsweise u. a. Wasser-Azetonitril, Wasser-Dimethylsulfoxid,
Methanol-Azetonitril, Methanol-Dimethylsulfoxid,
Ethanol-Azetonitril und Ethanol-Dimethylsulfoxid
umfassen.
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Die Menge des erfindungsgemäß vorhandenen
organischen Lösungsmittels
kann entsprechend des Typs der aus dem Knorpelgewebe zu extrahierenden
Komponente und ihren physikalischen Eigenschaften variieren. Im
allgemeinen enthält
die organisches Lösungsmittel
enthaltende Lösung
etwa 1–100
Vol.-/Vol.-%, etwa 40–80
Vol.-/Vol.-%, mindestens 1 % Vol.-/Vol.-%, mindestens 10% Vol.-/Vol.-%,
mindestens 25% Vol.-/Vol.-%, mindestens 50 % Vol.-/Vol.-%, mindestens
90% Vol.-/Vol.-% oder mindestens 99% Vol.-/Vol.-% an organischem
Lösungsmittel
im Verhältnis
zum Gesamtvolumen der Lösung.
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Dementsprechend offenbart die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung von Hai-Knorpelgewebeextrakten,
welches die folgenden Schritte umfasst:
- a)
Behandeln von Hai-Knorpelgewebematerial mit einer bestimmten Menge
einer ein organisches Lösungsmittel
enthaltenden Lösung
zur Herstellung eines ersten Gemisches, welches lösliche Hai-Knorpelgewebekomponenten
umfasst,
- b) Separieren des ersten Gemisches zur Herstellung eines die
löslichen
Komponenten enthaltenden ersten flüssigen Extraktes sowie einer
ersten Feststoffmasse; und
- c) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus dem ersten
flüssigen
Extrakt.
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Das Verfahren kann zusätzlich die
folgenden Schritte beinhalten:
- d) Entfernen
einer ausreichenden Menge an Flüssigkeit
vom ersten flüssigen
Extrakt zur Herstellung einer im wesentlichen trockenen zweiten
Feststoffmasse;
- e) Zusetzen von Wasser zur zweiten Feststoffmasse zur Bildung
eines zweiten Gemisches;
- f) Separieren des zweiten Gemisches zur Herstellung eines ersten
flüssigen
Endextraktes und einer dritten Feststoffmasse.
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Die das Hai-Knorpelgewebematerial
enthaltende erste Feststoffmasse kann noch ein weiteres Mal oder
auch noch mehrmals mit einer ein organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung oder
anstatt mit der organisches Lösungsmittel
enthaltenden Lösung
mit Wasser entsprechend den oben beschriebenen Schritten a) bis
c) extrahiert werden, um einen zweiten, dritten etc. flüssigen Endextrakt
zu erhalten, der wenigstens Restmengen der löslichen Hai-Knorpelgewebekomponenten
enthält.
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Die Separierung von Feststoffen und
Flüssigkeit
im Schritt b) lässt
sich mit beliebigen der dem Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannten
Verfahren durchführen,
indem man beispielsweise u. a. Zentrifugier-, Filtrier-, Diafiltrier-,
Ultrafiltrier- bzw. Mikrofiltrierverfahren einsetzt, die Feststoffe
sedimentieren lässt
und den Überstand
entfernt.
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Die Entfernung von organischem Lösungsmittel
gemäß Schritt
c) lässt
sich ebenfalls mit beliebigen der dem Fachmann bereits vertrauten
entsprechenden Verfahren durchführen,
z. B. u. a. durch Verdampfung, Liophilisation, Destillation, Desikkation,
Zugabe von Absorptionsmittel für
organische Lösungsmittel,
Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktion
bzw. Rotationsverdampfung.
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Bei dem hier verwendeten Hai-Material
handelt es sich um einen Feststoff, der beispielsweise in Form eines
Pulvers, Granulats, Stabes oder in Partikelform vorliegen kann.
Vor oder während
des Schrittes a) kann das Hai-Material homogenisiert werden. Im
vorliegenden Text beziehen sich die Begriffe "homogenisieren", "Homogenisieren" bzw. "Homogenisierung" auf ein Verfahren,
bei dem die Wirksamkeit der Extraktion der gewünschten Komponenten aus dem
Knorpelgewebematerial erhöht
wird, indem entweder a) der gesamte Oberflächenbereich des Knorpelgewebematerials
oder ein bestimmter Teil davon vergrößert oder b) die Abgabe der gewünschten
Komponenten durch das Knorpelgewebematerial erleichtert wird. Die
Homogenisierung kann mit einem oder mehreren chemischen Mitteln,
mit physikalischen Mitteln bzw. mit einer Kombinationen aus diesen Mitteln
durchgeführt
werden.
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Als chemische Mittel zur Homogenisierung
des Knorpelgewebematerials dienen beispielsweise ein oder mehrere
chemische Wirkstoffe, die das Knorpelgewebematerial anschwellen
lassen, zum Aufbrechen oder zur Zerstörung von Zellen oder der extrazellularen
Matrix im Knorpelgewebematerial führen und/oder die Porosität des Knorpelgewebematerials
erhöhen.
Zu diesen chemischen Wirkstoffen zählen beispielsweise u. a. Reinigungsmittel,
Tenside, ionische Wirkstoffe, nicht-ionische Wirkstoffe, Reduktionsmittel,
Chelatoren, Glykosyliermittel, chaotrope Wirkstoffe, Harnstoff,
Guanidin, Phospholipide, Glykolipide, Dithiothreitol, β-Mercaptoethanol,
Natriumlaurylsulfat, Tritonlösung
und andere derartige Wirkstoffe, die dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt bzw. in "A
Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry" von Judith Neugebauer
(Calbiochem-Novabiochem Corporation 1988) beschrieben sind.
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Physikalische Mittel zur Homogenisierung
von Knorpelgewebematerial bewirken üblicherweise eine Reduzierung
der mittleren Partikelgröße des Hai-Materials
und einer damit einhergehende Vergrößerung seines spezifischen
Oberflächenbereichs.
Die Partikelgrößenreduzierung
kann durch eines oder mehrere der im folgenden beispielhaft genannten
Verfahren erfolgen, nämlich
u. a. durch Pulverisierung, Mikronisierung, Grob- und Feinmahlung,
Zerteilung, Hochgeschwindigkeitsmischen oder andere dem Fachmann
auf dem Gebiet der Partikelreduzierung bereits bekannte Verfahren.
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Die Extrahierlösungen können extraktionsunterstützende Wirkstoffe
zur Unterstützung
der Extraktion der Komponenten aus dem Knorpelgewebe enthalten.
Zu diesen extraktionsunterstützenden
Wirkstoffen zählen
u. a. anorganische und organische Säuren, anorganische und organische
Basen, Polymere, Puffer, Salze und andere, ähnliche Wirkstoffe, die dem
Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannt sind.
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Gemäß einem Ausführungsbeispiel
wird die Extraktion von Materialien mit niedrigem Molekulargewicht
aus dem Knorpelgewebe in der folgenden Weise durchgeführt:
- a) Behandlung homogenisierten Hai-Knorpelgewebematerials
(1 kg) mit Methanol (1 kg) zur Bildung eines ersten, lösliche Hai-Knorpelgewebekomponenten
enthaltenden Gemisches;
- b) Zentrifugieren des ersten Gemisches zur Bildung eines ersten,
die löslichen
Komponenten enthaltenden flüssigen
Extrakts sowie einer ersten Feststoffmasse;
- c) Verdampfen des Methanols aus dem ersten flüssigen Extrakt;
- d) Verdampfen einer ausreichenden Menge an Flüssigkeit
aus dem ersten flüssigen
Extrakt zur Bildung einer im wesentlichen trockenen zweiten Feststoffmasse;
- e) Zusetzen von Wasser (1 kg) zur zweiten Feststoffmasse zur
Bildung eines zweiten Gemisches; und
- f) Zentrifugieren des zweiten Gemisches zur Bildung eines ersten
flüssigen
Endextrakts und einer dritten Feststoffmasse.
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Die obigen Schritte c) und d) lassen
sich, falls gewünscht,
miteinander kombinieren, um direkt vom ersten flüssigen Extrakt zur zweiten
Feststoffmasse zu gelangen.
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Alle in den gemäß den obigen Schritten durchgeführten Extraktionen
und erneuten Extraktionen des Hai-Knorpelgewebes gewonnenen Extrakte
wurden zur Bestimmung ihres Trockengewichtanteils und ihrer Proteinkonzentrationen
(gemäß den Bedingungen
eines Standard-Bradford-Protein-Assays) analysiert, um so einen
Hinweis auf die Gewinnung löslicher
Komponenten zu erhalten. Zudem wurde auch die Anti-MMP-Wirkung bewertet.
Der GIA wurde an 40 μl
von 20fach konzentrierten Proben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 zusammengefasst.
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In Tabelle 1 steht die Angabe "CTRL" (Kontrollprobe)
für einen
flüssigen
Endextrakt, der durch Einsatz von gereinigtem Wasser als Extraktionslösung gewonnen
wurde. Der Ausdruck "SU-MET" steht für einen
flüssigen
Endextrakt, der unter Einsatz von Methanol als ein organisches Lösungsmittel
enthaltende Lösung
gewonnen wurde, während
der Ausdruck "SU-ETH" einen flüssigen Endextrakt
bezeichnet, der durch Einsatz von Ethanol als organisches Lösungsmittel
enthaltende Lösung
hergestellt wurde. Die Angaben "S1", "S2" und "S3" stehen für einen
ersten flüssigen
Endextrakt, einen zweiten flüssigen
Endextrakt bzw. einen dritten flüssigen
Endextrakt, wobei die angegebenen Lösungsmittel als organisches
Lösungsmittel
enthaltende Lösungen
bzw. gereinigtes Wasser eingesetzt wurden.
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Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl
wässrige
als auch nicht-wässrige
ein organisches Lösungsmittel enthaltende
Lösungen
zur Gewinnung biologisch wirksamer, zumindest eine Anti-MMP-Wirkung
aufweisender Komponenten aus Hai-Knorpelgewebe
eingesetzt werden können.
Zudem kann man durch mehrmalige aufeinanderfolgende erneute Extraktionen
der Feststoffpartikel von Hai-Knorpelgewebe
eine eine Restwirkung aufweisende Substanz gewinnen. Zwischen der
Anti-MMP-Wirkung und der durch die Trockengewichtanalyse und Protein-Gewinnung
ermittelten Menge an isoliertem Material ist eine direkte Beziehung
nicht offensichtlich.
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Auswirkung
des Verhältnisses
von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser auf die Produktion flüssiger Extrakte
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Bei einem ersten Ausführungsbeispiel
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird der unfertige flüssige Extrakt
mit Wasser bei einem Verhältnis
von Knorpelgewebe (C) zu gereinigtem Wasser (E) von etwa 1 kg zu 11
hergestellt. Das Verfahren zur Gewinnung der Komponenten umfasst
dabei die folgenden Schritte:
- a) Homogenisieren
von Hai-Knorpelgewebe in einer wässrigen
Lösung,
bis das Knorpelgewebe auf Feststoffpartikel mit einer mittleren
Partikelgröße von weniger
als etwa 500 μ reduziert
wird, um so ein Homogenat zu erzeugen;
- b) Equilibrieren des Homogenats zur Extrahierung biologisch
wirksamer Komponenten in die wässrigen
Lösungen
zur Herstellung eines ersten Gemisches, das eine erste Feststoffmasse
und einen ersten, die biologisch wirksamen Komponenten enthaltenden
flüssigen
Extrakt (LE) umfasst;
- c) Separieren des ersten flüssigen
Extrakts von der ersten Feststoffmasse;
- d) Durchführen
eines Separationsvorgangs am ersten flüssigen Extrakt zur Herstellung
eines zweiten flüssigen
Extrakts, das Knorpelgewebemoleküle
mit einem Molekulargewicht von unter etwa 500 kDa enthält (LE-0–500);
- e) Filtrieren des zweiten flüssigen
Extrakts durch eine Mikrofiltriermembran mit einer nominalen Porosität von 0,22
Mikron zur Herstellung eines flüssigen
Endextrakts (P-C1-E1, das im wesentlichen der 0–500-Fraktion entspricht).
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Das vorliegende Verfahren wurde zudem
unter Einsatz der im folgenden aufgeführten unterschiedlichen Knorpelgewebe-Wasser-Verhältnisse
durchgeführt:
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Alle gemäß den oben erwähnten Verfahren
hergestellten ersten flüssigen
Extrakte wurden auf ihren Trockengewichtanteil, ihre Proteinkonzentration
und ihre Anti-MMP-Wirkung
hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass sich
pro Kilogramm Hai-Knorpelgewebe-Ausgangsmaterial
etwa 20 g lösliche
Komponenten gewinnen lassen, wobei die maximale Ausbeute an löslichen
Komponenten unter den spezifizierten Bedingungen pro kg Hai-Knorpelgewebe
(P-C1-E2 bzw, P-C1-E3) 19,8 (9,9 × 2) und 18,9 (6,3 × 3) g betrug.
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Diese Ergebnisse zeigen zudem, dass
eine effiziente Gewinnung des Trockengewichtanteils, der enthaltenen
Proteine sowie der die Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Komponenten
bei unterschiedlichen Verhältnissen
von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser möglich ist.
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Die erste aus der P-C1-E1-Extraktion
gewonnene Feststoffmasse wurde noch zweimal bei demselben Verhältnis von
Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser reextrahiert, um die darin noch
enthaltene Restmenge an Komponenten zu gewinnen. Das Verfahren zur
wiederholten Extraktion der ersten Feststoffmasse umfasst die folgenden
Schritte:
- f) Behandeln der ersten, im Schritt
c) gewonnenen Feststoffmasse mit gereinigtem Wasser zur Herstellung eines
zweiten Gemisches, welches zur Herstellung eines zweiten flüssigen Extrakts
(P-C1-E1-2) und einer zweiten Feststoffmasse separiert wird, wobei
der zweite flüssige
Extrakt gemäß den Verfahrensschritten
d) und e) behandelt werden kann; und wahlweise
- g) Wiederholung des Schrittes f) mit der zweiten Feststoffmasse
zur Herstellung eines dritten flüssigen
Extrakts (P-C1-E1-3) und einer dritten Feststoffmasse, wobei der
dritte flüssige
Extrakt gemäß den Verfahrensschritten
d) und e) behandelt werden kann.
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In Tabelle 3 sind die in den genannten
Schritten a) bis g) eingesetzten Mengen an Wasser und Hai-Knorpelgewebe
angegeben.
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Alle durch das genannte Verfahren
hergestellten flüssigen
Extrakte wurden auf ihren Trockengewichtanteil, ihre Proteinkonzentration
und ihre Anti-MMP-Wirkung hin analysiert. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4 zusammengefasst.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Durchführung
einer oder mehrerer Extraktionen von Hai-Knorpelgewebe gemäß den genannten
Schritten a) bis c) zu einer erhöhten
Gewinnung der löslichen
Hai-Knorpelgewebekomponenten führen
kann. Zudem lassen sich Restmengen an eine Anti-MMP-Wirkung besitzenden Komponenten
auch noch nach einer zweiten und dritten Extraktion derselben Feststoffpartikel
extrahieren.
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Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist
klar, dass Modifikationen der Extraktionsparameter, etwa hinsichtlich
Temperatur, Anzahl der Extraktionen oder des Extraktionslösungsmittels
vorgenommen werden können,
um die Menge an gewonnenen Feststoffen, Protein und biologisch wirksamen
Komponenten zu optimieren.
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Verfahren
zur Herstellung von Fraktionen der aus dem Knorpelgewebe derivierten
Komponenten mit unterschiedlichem Molekulargewicht
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Die 0–500-Fraktion: Bei der 0–500-Fraktion
handelt es sich um einen flüssigen
Hai-Knorpelgewebeextrakt, welcher Komponenten mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 500 kDa umfasst. Herstellungsverfahren für die 0–500-Fraktion sind in
den internationalen Veröffentlichungen
Nr. WO 95/32722, WO 96/23512 und WO 97/16197 beschrieben. Diese
bekannten Verfahren umfassen die folgenden Schritte:
- a) Homogenisierung von Hai-Knorpelgewebe in einer wässrigen
Lösung
unter Bedingungen, die es ermöglichen,
die im Knorpelgewebe vorhandenen biologisch wirksamen Komponenten
so lange unversehrt zu erhalten, bis das Knorpelgewebe zu Feststoffen
mit einer Größe von weniger
als 500 μm
zerkleinert wird;
- b) Extrahieren der biologisch wirksamen Komponenten in die wässrige Lösung, wodurch
man ein Gemisch aus Feststoffen und einem die biologisch wirksamen
Komponenten enthaltenden unbehandelten flüssigen Extrakt (LE) erhält;
- c) Separieren des flüssigen
Extrakts von den Feststoffpartikeln;
- d) weiteres Separieren des unbehandelten flüssigen Extrakts zur Gewinnung
eines flüssigen
Endextrakts, das Moleküle
mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 kDa enthält (LE-0–500); und
- e) Filtrieren des LE-0–500
auf einer Mikrofiltriermembran (0,22 Mikron) und Einfrieren zur
Gewinnung des flüssigen
Endextrakts (0–500-Fraktion).
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Die 0–1- und die 1–500-Fraktion:
Bei der 0–1-Fraktion
handelt es sich um einen flüssigen
Hai-Knorpelgewebeextrakt, der Komponenten mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 1 kDa enthält,
während die
1–500-Fraktion
aus einem flüssigen
Hai-Knorpelgewebeextrakt besteht, der Komponenten mit einem Molekulargewicht
von zwischen etwa 1 und 500 kDa umfasst. Die 0–1- und die 1– 500-Fraktion
des Hai-Knorpelgewebeextrakts wurden mit einem Ultrafiltriersystem
unter Verwendung einer Membran hergestellt, welche eine nominale
Molekulargewichtstrenngrenze von etwa 1 kDa aufweist. Durch den
Einsatz dieses Systems wurden die beiden Knorpelgewebefraktionen
nach Durchführung
eines Reinigungszyklus gewonnen (wobei ein Reinigungszyklus als
Beendigung des Reinigungsschrittes nach Rückgewinnung von 50% des Permeats definiert
ist). Die 1– 500-Fraktion
umfasste das Retentat (R), das Komponenten mit einem Molekulargewicht von
etwa 1 bis 500 kDa in derselben Konzentration wie der für die Reinigung
verwendete Originalextrakt und Komponenten von weniger als etwa
1 kDa in einer im Vergleich zum Originalextrakt 0,5-fachen Konzentration enthält, wenn
es unter Einsatz von gereinigtem Wasser zu einem dem Originalvolumen
des für
die Reinigung eingesetzten Knorpelgewebeextrakts entsprechenden
Endvolumen rekonstruiert wird. Die 0–1-Fraktion enthielt das Permeat
(P), das nur Komponenten mit einem Molekulargewicht von unter etwa
1 kDa in einfacher Konzentration ent hält. Durch Einsatz des Ultrafiltriersystems
wurde die 1–500-Fraktion
in zusätzlichen
Reinigungszyklen weiter gereinigt, wie sich dies Tabelle 5 entnehmen
lässt.
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Es wurden mehrere Chargen von 0–1- und
1–500-Fraktionen
gemäß den angegebenen
Verfahren hergestellt. Zur Minimierung der Aggregatbildung und zur
Verbesserung der Auflösung
und Aufrechterhaltung einer stabilen löslichen Form wurde als Stabilisator
für die
Extraktion 1 Gew./Vol.-% einer wässrigen
Saccharoselösung
beigegeben.
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Die 0–1- und die 1–500-Fraktion
erhielt man, indem man eine Charge einer LE-0– 500-Fraktion gemäß den bereits
beschriebenen bekannten Verfahren vorbereitete und sodann die folgenden
neuartigen Schritte zusätzlich
durchführte:
- e) wahlweise Gewinnung des LE-0–500-Extrakts
mit einer Lösung,
welche Saccharose in einer Endkonzentration von etwa 1 (Gew.-/Vol.-)%
enthält,
zur Herstellung der 1% Saccharose enthaltenden LE-0–500-Fraktion;
- f) Filtrieren der LE-0–500-Fraktion
bzw. der 1% Saccharose enthaltenden LE-0–500-Fraktion
mit Hilfe einer eine nominale Molekulargewichtstrenngrenze von etwa
1 kDa aufweisenden Membran zur Herstellung von flüssigen Extrakten,
welche Knorpelgewebemoleküle
mit einem Molekulargewicht von unter etwa 1 kDa enthalten (Pn-0–1 bzw.
Fraktion Pn0–1
mit 1% Saccharose, wobei "n" für den Reinigungszyklus
gemäß Tabelle
5 steht) sowie zur Herstellung von flüssigen Retentat-Extrakten (Rn-0–1 bzw.
Fraktion Rn-0–1
mit 1% Saccharose, wobei "n" für den Reinigungszyklus
gemäß Tabelle
5 steht), die Knorpelgewebemoleküle
mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 1 kDa enthalten; und
- g) Mikrofiltrieren des flüssigen
Retentat- und des flüssigen
Permeatextrakts durch eine Mikrofiltriermembran mit einer Porosität von etwa
0,22 Mikron.
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Das obige Verfahren lässt sich
auch ohne den Schritte) durchführen,
um Extrakte herzustellen, die frei von Saccharose sind. Die flüssigen Retentat-Extrakte
können
in einem oder mehreren, und dabei vorzugsweise in wenigstens vier
weiteren Reinigungszyklen ultrafiltriert werden, um zusätzlich flüssige Filtratextrakte
herzustellen, welche Knorpelgewebekomponenten mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 1 kDa (P1-0–1 bis P6-0–1) enthalten, und um Retentatextrakte
herzustellen, die Knorpelgewebekomponenten mit einem Molekulargewicht
zwischen 1 und etwa 500 kDa umfassen (R6-1–500 und R6-1–500 mit
1% Saccharose). Die flüssigen
Extrakte können,
falls gewünscht,
zu Aufbewahrungszwecken eingefroren werden.
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Das eben beschriebene Verfahren wurde
in entsprechender Weise zur Herstellung der folgenden flüssigen Extrakte
eingesetzt:
- 1) aus LE-0–500 hergestellte 0–500-Fraktion
- 2) aus LE-0–500
mit 1% Saccharose hergestellte 0–500-Fraktion mit 1% Saccharose
- 3) aus P1-0–1
hergestellte 0–1-Fraktion
- 4) aus P1-0–1
mit 1% Saccharose hergestellte 0–1-Fraktion mit 1% Saccharose
- 5) aus R6-1–500
hergestellte 1–500-Fraktion
- 6) aus R6-1–500
mit 1% Saccharose hergestellte 1–500-Fraktion mit 1% Saccharose
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Die zweite Feststoffmasse, die durch
Separation des zweiten, während
der Behandlung der ersten Feststoffmasse mit Wasser hergestellten
Gemisches erzeugt wurde, kann wiederholt mit Wasser extrahiert werden,
um zusätzliche
Mengen der löslichen
Hai-Knorpelgewebefraktion zu gewinnen.
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Alle gemäß dem beschriebenen Verfahren
hergestellten Extrakte wurde hinsichtlich ihres Trockengewichtanteils
und Proteingehalts analysiert. Zudem wurden auch die Anti-MMP-Wirkung
sowie die anti-angiogene Wirkung und die Anti-Tumor-Wirkung jeder Fraktion bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
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Die Analyseergebnisse zeigen, dass
sowohl die 0–1-Fraktion
als auch die entsprechende Fraktion mit 1% Saccharose zwar mehr
als 90% des gewonnen Trockengewichtanteils, dabei aber nur sehr
geringe, beinahe nicht nachweisbare Mengen an Proteinen enthalten.
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Allerdings wurde sowohl bei der 0–1-Fraktion
als auch bei der 1–500-Fraktion
eine Anti-MMP-Wirkung beobachtet, was den Schluss zulässt, dass
1) wenigstens eine Nicht-Protein-Komponente für diese Wirkung verantwortlich
ist und 2) möglicherweise
nicht nur eine Komponente allein eine Anti-MMP-Wirkung aufweist. Die wirksame
Komponente muss dabei nicht notwendigerweise eine Protein- oder
eine Peptid-Beschaffenheit besitzen.
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Im übrigen wurde die anti-angiogene
Wirkung, die entsprechend dem EVT gemessen wurde, ausschließlich in
der 0–1-Fraktion
beobachtet. Es ist festzustellen, dass das Vorhandensein von Saccharose
für eine
leichte Verbesserung der antiangiogenen Wirkung der 1–500-Fraktion
in 1% Saccharose verantwortlich war.
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Die Behandlung von Tieren, welche
mit M27-Tumorzellen (LLC) beimpft worden waren, führte zu
einer signifikanten Verringerung der Anzahl makroskopisch sichtbarer
Metastasen-Knötchen
an der Lungenoberfläche.
Sowohl die 0–1-
als auch die 0–500-Fraktion
bewirkte eine erhebliche Verringerung der Anzahl von Metastasen-Knötchen (etwa
30%). Allerdings war die 1–500-Fraktion
weniger wirksam als die 0–1-
und die 0–500-Fraktion,
was nahelegt, dass eine wirksame Komponente in der 0–1-Fraktion
zumindest teilweise für
die Anti-Tumor-Wirkung verantwortlich ist. Diese Ergebnisse lassen
zudem darauf schließen,
dass in der 1–500-Fraktion
eine weitere Anti-Tumor-Komponente vorhanden ist. Einige weitere
Gruppen von Tieren wurden mit Fraktionen desselben jeweiligen Molekulargewichts
behandelt, welche 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthielten. Obwohl die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung keinen wesentlichen Unterschied
zwischen den Gruppen feststellen konnten, geht die Tendenz doch
dahin, dass Fraktionen mit hohem Molekulargewicht bei Vorhandensein
von Saccharose wirksamer sind (siehe obige Tabelle). Die Erfinder
der vorliegenden Anmeldung beobachteten keine Verringerung des Körpergewichts
der Tiere, was darauf hinweist, das das Knorpelgewebeextrakts im
LLC-Modell nicht toxisch wirkt.
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Isolierung
und Charakterisierung einer Anti-MMP-Komponente
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Chromatographische
Isolierung und Reinigung
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Nachdem festgestellt wurde, dass
in der 0–500-Fraktion
und insbesondere in der 0–1-Fraktion
mehrere Komponenten mit nutzbringender biologischer Wirkung vorhanden
sind, bestand der nächste
Schritt darin, die wirksamen Komponenten aus der Fraktion zu isolieren.
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Zur Isolierung und Reinigung von
eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Komponenten aus der 0–500-Fraktion
wurden vier verschiedenen Verfahren entwickelt.
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Verfahren 1:
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Schritt 1:
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Die im weiter oben detailliert beschriebenen
Verfahren gewonnene 0–500-Fraktion
wurde einer Liophilisation unterzogen und in gereinigtem Wasser
(zu einer 20-fachen
Konzentration gegenüber
dem Originalvolumen) rekonstruiert. Das rekonstruierte Material
wurde 15 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um
die Löslichkeit
der biologisch wirksamen Komponenten zu optimieren. Nach Durchführung eines
Separiervorgangs, beispielsweise einer zehnminütigen Zentrifugierung bei 2.200
g und 4°C,
wurde der Überstand zur
weiteren Reinigung aufbewahrt.
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Schritt 2:
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Es wurde eine adsorptive Chromatographie
unter Einsatz einer Festphasenextraktionssäule (SPE-C18 neutral) durchgeführt.
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Eine mit 500 mg C18-Sorptionsmittel
(Supelco Nr. 5-7012, Abmessung 3 cm3) bepackte
SPE-Säule wurde
zweimal in 2 ml Methanol (100%) und dreimal in 2 ml gereinigten
Wassers konditioniert. 1 ml des zwanzigfach rekonstruierten Knorpelgewebeextrakts
wurde auf die Säule
geladen. Der Sorptionsmitteltropfen wurde mit 1,5 ml gereinigten
Wassers gewaschen und Komponenten, die eine Anti-MMP-Wirkung aufweisen, wurden mit zwei
2,5-ml-Portionen gereinigten Wassers eluiert, die zu einem ersten
Eluant kombiniert wurden.
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Im ersten Eluant wurde etwa 50% der
anfänglichen
Anti-MMP-Wirkung zurückgewonnen.
Die restlichen 50% gingen während
des Säulen-Lade-
und des Waschschritts verloren. Es zeigte sich somit, dass neutrale
Bedingungen nur eine schwache Retention der eine Anti-MMP-Wirkung
aufweisenden Komponenten ermöglichen.
Die schwache Retention der Komponenten beim Einsatz dieses chromatographischen
Mediums lässt
darauf schließen,
dass es sich um polare oder ionische Komponenten handelt.
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Schritt 3:
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Nach mehrmaliger Wiederholung des
obigen Verfahrens mit unterschiedlichen Proben des 20fach rekonstruierten
Knorpelgewebeextrakts wurden die jeweils ersten Eluate zusammengeführt und
in einer Speed-Vac-Zentrifuge verdampft. Die hierbei gewonnenen
Feststoffe wurden in gereinigtem Wasser mit einer 200fachen Konzentration
gegenüber
dem Originalvolumen der eingesetzten 0– 500-Fraktion rekonstruiert. Nach
der Ultraschallbehandlung und Zentrifugierung wurde der Überstand
für den
nächsten
Reinigungsschritt aufbewahrt.
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Schritt 4:
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Unter neutralen Bedingungen wurde
eine semipräparative
HPLC-Separation der im Überstand
vorhandenen biologisch wirksamen Komponenten mit niedriger Auflösung durchgeführt, wobei
eine Novapack-C18HR-Säule
(7,6 × 300
mm; Waters) zum Einsatz kam. Bei der verwendeten mobilen Phase handelte es
sich um Natriumphosphat (0,01 M, pH 7)/Methanol (92 : 8). Die Fließrate und
die Temperatur wurden bei 2 ml/min bzw. 30°C gehalten. Die erwähnte 200fach
rekonstruierte Fraktion (100 μl)
wurde auf die Säule
injiziert und es wurden unter isokratischen Eluationsbedingungen
und durch UV-Detektion (205 nm) 2-ml-Fraktionen gesammelt. Die Durchlaufzeit
betrug dabei 30 Minuten. In Eluant-Fraktionen, die einer Retentionszeit
von zwischen 11 und 13 Minuten entsprachen, wurden eine MMP-Wirkung
aufweisende Komponenten gefunden.
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Schritt 5:
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Schritt 4 wurde mit unterschiedlichen
100-μl-Aliquots
der 200fach rekonstruierten Fraktion wiederholt und die entsprechenden
gewünschten
Eluant-Fraktionen wurden zusammengeführt, verdunstet, mit gereinigtem
Wasser zu einer 500fachen Konzentration im Vergleich zum Originalvolumen
der eingesetzten 0-500-Fraktion rekonstruiert, mit Ultraschall behandelt
und zentrifugiert. Der Überstand
wurde für
den nächsten
Reinigungsschritt aufbewahrt.
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Schritt 6:
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Am im Schritt 5 gewonnenen Überstand
wurde eine semipräparative
HPLC mit höherer
Auflösung
unter neutralen Bedingungen durchgeführt. Das Vorgehen für diese
semipräparative
HPLC mit hoher Auflösung entspricht
demjenigen im oben angegebenen Schritt 4, wobei allerdings als mobile
Phase Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7)/Methanol (97 : 3) eingesetzt
wird. In Eluant-Fraktionen, die einer Retentionszeit von zwischen 23
und 27 Minuten entsprachen, wurden Komponenten mit Anti-MMP-Wirkung
aufgefunden.
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Schritt 7:
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Nachdem der Schritt 6 wiederholt
wurde, wobei die entsprechenden, wirksame Komponenten enthaltenden
Eluant-Fraktionen zusammengeführt
wurden und das Lösungsmittel
verdampft wurde, um einen im wesentlichen festen Rückstand
zu erhalten, wurde der Rückstand
in Wasser mit einer 500- bis 2000-fachen Konzentration im Vergleich
zum Originalvolumen der verwendeten 0–500-Fraktion rekonstruiert,
einer Ultraschallbehandlung unterzogen und zentrifugiert und sodann
für eine
weitere Molekulargewichtsanalyse und eine Bestimmung seiner Anti-MMP-Wirkung aufbewahrt.
Die biologisch wirksame Komponente wurde als "Æ-986" bezeichnet.
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Verfahren 2:
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Es wurde festgestellt, dass sich
bei einem pH-Wert von 3 allgemein eine bessere Retention von Æ-986 am
C18-Phasen-Chromatographiemedium beobachten ließ, woraufhin das SPE-Verfahren
(obiger Schritt 2) sowie das (in den obigen Schritten 4 und 6 beschriebene)
semipräparative
Chromatographiesystem modifiziert wurden. Die im folgenden genannten
Bedingungen ermöglichen
den Einsatz einer stärkeren
Waschlösung
im SPE-Verfahren, was zur Gewinnung eines reineren Endextraktes
führt und
es ermöglicht,
auf einen der semipräparativen
Reinigungsschritte (Schritt 4 des Verfahrens 1) zu verzichten.
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So wurden beispielsweise die Schritte
1 bis 3 des Verfahrens 1 wiederholt und der Schritt 4 durch den folgenden
Schritt ersetzt:
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Schritt 4:
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Es wurde dieselbe SPE-C18-Säule wie
im obigen Schritt 2 eingesetzt, wobei allerdings das Chromatographiemedium
dreimal mit 2 ml Ammoniumformiat (0,01 M, pH 3) konditioniert wurde.
1 ml des im Schritt 3 (in dem der pH-Wert vor dem Laden der Proben
mit Ameisensäure
auf 3 eingestellt wurde) gewonnenen 200fach rekonstituierten Extrakts
wurde auf die Säule
geladen. Das Sorptionsmittelbett wurde dreimal mit 2 ml Ammoniumformiat/Methanol
(90 : 10, bei pH 3) gewaschen. Es wurde eine Elution des Æ-986 mit
1 ml Methanol (100%) durchgeführt.
Für einen
Fachmann auf diesem Gebiet ist es offensichtlich, dass Fraktionen,
die durch eine Methanol-Elution der Säule gewonnenen wurden, Wasser
enthalten. Dementsprechend kann es sich bei dem Elutions-Lösungsmittel in diesem Schritt
um ein anderes organischen Lösungsmittel,
vorzugsweise um ein polares und/oder ein mit Wasser mischbares organisches
Lösungsmittel
handeln, wobei auch das Elutions-Lösungsmittel selbst Wasser enthalten
kann.
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Schritt 5:
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Der Schritt 5 des Verfahrens 1 wurde
wiederholt, wobei allerdings die rekonstruierte Anti-MMP-Fraktion
in einer 4000-fachen Konzentration vorlag.
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Schritt 6:
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Dieser Schritt ist dem Schritt 6
des Verfahrens 1 identisch, wobei es sich allerdings bei der mobilen Phase
um Ammoniumformiat/Methanol (75 : 25, pH 3) handelte.
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Schritt 7:
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Schritt 7 entspricht dem Schritt
7 des Verfahrens 1, wobei allerdings wiederum die im obigen Schritt
6 erwähnte
4000-fache Konzentration beibehalten wurde.
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Verfahren 3:
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Dieses Verfahren entspricht im wesentlichen
dem Verfahren 2, wobei allerdings der pH-Wert des Formiatpuffers
im Schritt 6 von sauer (pH 3) auf neutral (etwa pH 7) umgestellt
wurde.
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Verfahren 4:
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Bei diesem Reinigungsverfahren wurde
von Anfang an eine saure mobile Phase verwendet.
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Schritt 1:
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Der pH-Wert der ursprünglichen
0-500-Fraktion (bei einer einfachen Konzentration) wurde mit Ameisensäure auf
pH 3 eingestellt und die Fraktion wurde sodann bei 2.200 g 10 Minuten
lang zentrifugiert. Der Überstand
fand in Schritt 2 Verwendung.
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Schritt 2:
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Der Überstand wurde auf eine SPE-C18-Cartridge
(Supelco Nr. 5.-7136: Abmessungen 60 cm3,
mit 10 g eines Feststoffphasenträgers
bepackt) geladen, die unter sauren Bedingungen konditioniert worden
war. Die Säule
wurde mit 120 ml Methanol (100%) und 120 ml Ameisensäure (0,01
M, pH 3) konditioniert. Auf die Säule wurden 500 ml einfach gesäuerter Knorpelgewebeextrakt
geladen und mit sechs Volumina von 100 ml Ameisensäure (0,01
M (pH 3)/Methanol 90 : 10) eluiert. Biologisch wirksame Komponenten
fanden sich in den Eluant-Fraktionen 3, 4 und 5.
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Schritt 3:
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Die im Schritt 2 gewonnenen Eluantfraktionen
3, 4 und 5 wurden zusammengeführt
und das Lösungsmittel
so weit verdampft, bis ein nahezu trockener Rückstand verblieb. Die Fraktionen
wurden sodann zu einer das 4000-fache der Originalkonzentration
betragenden Konzentration verdünnt,
um eine Æ-986
enthaltende Lösung
herzustellen.
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Schritt 4:
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Das Æ-986 wurde auf einer präparativen
HPLC-Säule
in einem Ameisensäure-Puffer bei pH 3 gereinigt.
Die Säule
(Prodigy OSD-prep, 10 μ,
250 × 50
mm, von Phenomenex) wurde konditioniert und bei Zimmertemperatur
eingesetzt. Die mobile Phase setzte sich aus Ameisensäure (0,01
M, pH 3)/Methanol (70 : 30) zusammen und die Fließrate betrug
45 ml/min. Auf die Säule
wurden 4 ml der SPE-C18-Fraktion
mit 4000-facher Konzentration injiziert und sodann in einem isokratischen
Modus unter Einsatz der UV-Detektion (205 nm) von der Säule eluiert.
Es wurden 60 Minuten lang im Minutentakt Fraktionen gesammelt, wobei
das Æ-986
mit Anti-MMP-Wirkung zwischen der 33. und 36. Minute eluiert wurde.
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Schritt 5:
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Die eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden
Fraktionen wurden zusammengeführt
und verdampft, um eine 10.000-fach konzentrierte Fraktion zu erhalten.
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Schritt 6:
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Dieser Schritt ist dem Schritt 6
des Verfahrens 2 identisch, wobei allerdings die mobile Phase aus Ameisensäure (0,01
M, pH 3)/Methanol (75 : 25) bestand. Es wurden 500-μl-Aliquots
der 10.000-fach konzentrierten Fraktion auf die Säule geladen.
Komponenten, die eine Anti-MMP-Wirkung aufwiesen, wurden zwischen
der 21. und der 23. Minute eluiert.
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Schritt 7:
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Schritt 7 entsprach dem Schritt 7
im Verfahren 1. Hierbei wurde die im vorangegangenen Schritt 6 erwähnte 4.000-fache
Konzentration beibehalten.
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Gemäß Verfahren 1 gewonnene halbgereinigte
Fraktionen: Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben zum ersten
mal gezeigt, dass eine HPLC-gereinigte
Fraktion (d. h. die aus dem beschriebenen Verfahren 1 resultierende
Fraktion) Komponenten umfasst, die eine Anti-MMP-Wirkung besitzen.
Die in der beschriebenen Weise gereinigten Komponenten zeigen zudem
auch eine Anti- Tumor-Wirkung,
wie dies im bereits beschriebenen in-vivo-Modell-LLC gezeigt wurde.
Die Anti-Tumor-Wirkung wurde bestimmt, indem Tiere mit drei verschiedenen
Konzentrationen der HPLC-gereinigten Fraktion behandelt wurden.
Dabei wurde eine glockenförmige
Dosis-Reaktionskurve mit einer maximalen Effizienz von etwa 50%
(p < 0,005) für die 2,5-fach
konzentrierte Dosis beobachtet (die Konzentration basierte auf einer
100%igen Rückgewinnung
während
der Reinigungsschritte und bezieht sich auf das Originalvolumen
des Knorpelgewebeextrakts).
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Da die Angiogenese- und Matrix-Metalloprotease-Wirkung
eng mit der Tumorwucherung und Metastasenentwicklung zusammenhängt, ist
es möglich,
dass die HPLC-gereinigte Fraktion, die eine Anti-MMP-Komponente
aufweist, für
die Anti-Tumor-Wirkung
verantwortlich ist. Somit stellen Komponenten, die diese Wirkung
besitzen, ein potentielles Therapiemittel bei der Krebsbehandlung
dar (Tolnay, E. et al, J. Cancer Res Clin. Oncol. 123: 652–658, 1997;
Skobe, M., et al. Nature Medicine, 3: 1222–1227, 1997).
-
Halbgereinigte, gemäß Verfahren
4 gewonnene Fraktionen: Die in diesem Abschnitt behandelten Fraktionen
wurden gemäß dem bereits
beschriebenen Verfahren 4 erzeugt, wobei allerdings die Schritte
2) und 3) in der folgenden Weise durchgeführt wurden:
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Schritt 2:
-
Der Überstand wurde auf eine SPE-C-18-Cartridge
(Supelco Nr. 5.-7012: Abmessungen 3 cm3,
bepackt mit 500 mg eines Feststoffphasenträgers) geladen, die unter sauren
Bedingungen konditioniert worden war. Die Säule wurde mit 4 ml Methanol
(100%) und 6 ml Ameisensäure
(0,01 M, pH 3) konditioniert. 10 ml einfach gesäuerten Knorpelgewebeextrakts
wurden auf die Säule
geladen, dreimal mit 1,0 ml-Volumina Ameisensäure (0,01 M (pH 3)/Methanol
90 : 10) gewaschen und die biologisch wirksamen Komponenten wurden hieraus
mit 1,0 ml Methanol eluiert.
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Schritt 3:
-
Die biologisch wirksamen Komponenten
enthaltende Eluantfraktion des Schrittes 2 wurde bis zur Trockenheit
verdampft. Die Fraktionen wurden sodann zu einer das 40- oder 20-fache
der Originalkonzentration betragenden Konzentration verdünnt, um
eine Æ-986
enthaltende Lösung
zu erhalten.
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Alle aus diesem Verfahren resultierenden
flüssigen
Extrakte wurden auf eine Anti-MMP-Wirkung
hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit
die Gewinnung von spezifischen Haiknorpelgewebefraktionen, die eine
Anti-MMP-Wirkung besitzen. Zudem können sowohl Lösungen,
die wässrige
Lösungsmittel,
als auch solche, die organische Lösungsmittel enthalten, zur
Herstellung der zumindest eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Knorpelgewebeextrakte
eingesetzt werden. Zwar zeigen sowohl die 0–500- als auch die 1–500-Fraktion
eine Anti-MMP-Wirkung; Anti-MMP-Komponenten,
die mit dem vorliegenden Verfahren gereinigt wurden, sind aber vor
allem im 0–1-kDa-Bereich
enthalten. Gleichartige Ergebnisse wurden in den entsprechenden
1 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthaltenden Fraktionen beobachtet. Im übrigen lassen
sich Fraktionen, die eine Anti-MMP-Wirkung besitzen, in effizienter
Weise bei unterschiedlichen Verhältnissen
von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser gewinnen.
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Bestimmung
des Molekulargewichts der Anti-MMP-Komponente durch LC/MS
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Es wurden fünf mehrdimensionale Chromatographiesysteme
für die
leichtere Bestimmung des Molekulargewichts von Haiknorpelgewebefraktionen
durch Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie
(LC/MS) entwickelt. Die fünf
Systeme sind jeweils in einer der folgenden Tabellen 8–12 dargestellt.
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Die Experimente umfassen ein MS-Scannen
des aufgeteilten (7 : 1) Chromatographiesäuleneluants sowie eine Sammlung
von Fraktionen der Flüssigchromatographie
zur Verwendung für
die Bestimmung der Anti-MMP-Wirkung nach dem Durchlauf. Durch diese
Beziehung zwischen Massenspektrometrie und biologischer Anti-MMP-Wirkung
lässt sich
speziell die Elutionsfraktion sowie die Retentionszeit der interessierenden Zusammensetzung
für jedes
verwendete Chromatographiesystem identifizieren.
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Für
die MS-Ermittlung negativer Ionen wurde vor der Einführung in
die MS-Ionen-Quelle
eine Lösung von
Ammoniumhydroxid (0,75 Vol.-/Vol.-% bei 0,15 ml/min) zum Säuleneluant
gegeben. Der sich ergebende pH-Wert des Gemisches lag zwischen 8
und 10, was die Bildung und Erfassung negativer Ionen bei der Massenspektrometrie
verbessert.
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Tabelle
8: Chromatographiesystem 1: Isokratisch, C18, neutrale Bedingungen
(Ammonium-Formiat)
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Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten
Fraktionen wurde bewertet.
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Tabelle
9: Chromatographiesystem 2: Gradient, C18, saure Bedingungen (Ammoniumformiat)
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Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten
Fraktionen wurde bewertet.
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Tabelle
10. Chromatographiesystem 3: Isokratisch, C18, saure Bedingungen
(Ammoniumformiat)
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Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten
Fraktionen wurde bewertet.
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Tabelle
11. Chromatographiesystem 4: Gradient, NH
2,
saure Bedingungen (Ammoniumformiat)
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Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten
Fraktionen wurde bewertet.
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Tabelle
12. Chromatographiesystem 5: Isokratisch, C18, saure Bedingungen
(Ammoniumazetat)
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Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten
Fraktionen wurde bewertet.
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Die mehrdimensionalen chromatographischen
Experimente wurden durchgeführt,
indem man 100 μl der
500- bis 1000-fach konzentrierten gereinigten Phosphatendfraktion
(die im Schritt 7 des Reinigungsverfahrens 1 gewonnen wurde) injizierte.
Bei dieser Konzentration erhielt man im MS-Scan-Modus (Total-Ionen)
kein starkes und klares Signal für Æ-986. Interessierende
Peaks wurden entdeckt, indem man nach dem Durchlauf alle individuellen
Ionensignale (100–1000
amu) im interessierenden Bereich (wirksame Fraktionen) überwachte.
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Die Injektion gereinigter Fraktionen
mit einer bis zu 2000-fachen Konzentration zeigte einen kleinen Peak
im Total-Ionen-Chromatogramm sowie im den Æ-986 entsprechenden Base-Peak-Chromatogramm.
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Im Detektionsmodus für positive
Ionen (Tabelle 13) wurden im interessierenden Bereich (Æ-986) nur die
Ionen 245 M + 1 und 227 eindeutig nachgewiesen. Im Hinblick auf
den Aufbau und die Operationsweise der LCQ-MS ist die Beobachtung
von Ionen, die einem Verlust eines Wassermoleküls entsprechen, sowie des Molekül-Ions (M
+ 1) bei einem eine Alkohol-Funktionsgruppe enthaltenden Analyt
weder ungewöhnlich
noch selten. Das Co-Elutionsprofil der Ionen 245 M + 1 und 227 sowie
der Unterschied von 18 amu, der dem Verlust eines Wassermoleküls (N2O) entspricht, lassen stark auf das Vorhandensein
einer einzigen interessie renden Komponente mit einem Molekulargewicht
von 244 schließen,
wobei 245 der M + 1-Gattung im positiven Ionen-Modus entspricht.
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Die 1 bis 4 zeigen Beispiele für Total-Ionen-Chromatogramme
(TIC) sowie Einzel-Ionen-Chromatogramme (245 M + 1 m/e), die durch
die Injektion von halbgereinigtem Æ-986 in unterschiedliche Chromatographiesystem
gewonnen wurden. Die Analyse dieser Chromatogramme nach dem Durchlauf
wies auf das Vorhandensein des Ions 245 (M + 1) in jeder der aus
den unterschiedlichen Chromatographiesystemen gesammelten und Komponenten
mit einer Anti-MMP-Wirkung
enthaltenden Fraktionen hin.
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Das Total-Ionen-Chromatogramm sowie
das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245 M + 1), die bei der Analyse
von im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat, neutraler pH 7, isokratisch)
isoliertem Æ-986
gewonnen wurden, sind in 1 gezeigt.
Das Æ-986
wurde in Fraktionen entdeckt, die bei zwischen 13,5 und 15,0 Minuten
gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 14,14 Minuten für die Elution
des m/e-245-M + 1-Peak entspricht.
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2 zeigt
das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245
M + 1), die bei der Analyse des im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat,
sauerer pH 3, gradient) isolierten Æ-986 gewonnenen wurden. Das Æ-986 wurde
in Fraktionen entdeckt, die bei zwischen 16,5 und 17,0 Minuten gesammelt
wurden, was einer Retentionszeit von 16,62 Minuten für die Elution
des m/e-245-M + 1-Peak entspricht.
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3 zeigt
das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245),
die bei der Analyse des im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat, sauerer
pH 3, isokratisch) isolierten Æ-986
gewonnen wurden. Das Æ-986 wurde in Fraktionen
entdeckt, die zwischen der 16. und 18. Minute gesammelt wurden,
was einer Retentionszeit von 16,79 Minuten für die Elution des m/e-245 M + 1-Peak entspricht.
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4 zeigt
das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Chromatogramm (245),
die bei der Analyse des im HPLC-NH2-System (Ammoniumformiat, sauerer
pH 3, gradient) isolierten Æ-986
gewonnen wurden. Das Æ-986
wurde in Fraktionen entdeckt, die zwischen der 14. und 16. Minute
gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 14,28 Minuten für die Elution
des m/e-245-Peak entspricht.
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Nur im negativen Modus (Tabelle 14)
wurden im interessierenden Bereich (Æ-986) in allen bewerteten Chromatographiesystemen
Ionen 243 und 289 entdeckt, wobei wiederum die perfekte Co-Elution
dieser beiden Ionen die Bildung eines Formiat-Addukts am Ion 243
nahelegt. Dieses Phänomen
wird häufig
bei negativen Ionen beobachtet, wenn Ammoniumformiat als Puffer
in der mobilen Phase zum Einsatz kommt. Dies wurde bewiesen, indem
der Ammoniumformiatpuffer bei gleichbleibendem pH-Wert durch einen
Ammoniumazetatpuffer ersetzt wurde. Die mobile Ammoniumazetatphase
wurde nach der Säule
mit einer Ammoniumhydroxidlösung
alkalisiert, ehe die MS-Detektion durchgeführt wurde. Beide Systeme zeigten
ein klares Signal für das
Ion 243, während
das Ion 289 nur im Formiatsystem und ein neues Ion (303), das einem
Azetat-Addukt entspricht, im zweiten Chromatographiesystem entdeckt
wurde. Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass die Æ-986-Komponente
ein Molekulargewicht von etwa 244 amu besitzt (wobei 243 der M-1-Gattung
im negativen Ionenmodus entspricht).
-
-
-
Empirische Formelbestimmung
sowie teilweise Strukturbestimmung von Æ-986
-
Empirische LC-MS-Formel-Bestimmung:
Zur Gewinnung von Informationen über
die Struktur von Æ-986
wurde die Massenspektrometrie eingesetzt. In der Tabelle 15 sind
die Bedingungen bei der LC-MS-Analyse von Æ-986 zusammengefasst.
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Tabelle
15. Für
die empirische teilweise LC-MS-Formelbestimmung eingesetzte Chromatographiebedingungen
-
Die Bestimmung des Isotopverhältnisses
von 247, 246, 245 wurde in einem Zoom-Scan-Modus durchgeführt, um die Präzision bei
der Ablesung schwacher Signale dieser Ionen zu erhöhen. Die
ermittelten Isotop-Verhältnisse
für das
Ion 246/245 (A + 1-Typ)
und 247/245 (A + 2-Typ) sind weiter unten im Tabellenformat dargestellt.
-
Das Verhältnis von 5,9% der m/e-247/245-Peak-Höhen (Isotopverhältnis A
+ 2) weist stark auf ein Vorhandensein eines Schwefelatoms und weniger
Sauerstoffatome im Molekül
hin.
-
Das Isotopverhältnis von 11,8% für die A
+ 1-Elemente (m/e 246/245 Peak-Höhe)
kann auf bis zu 10 Kohlenstoffatome oder ein Gemisch aus Kohlenstoff,
Stickstoff und Schwefel (1) am Molekül verweisen.
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Mit einem Molekülgewicht von 244 amu kann bei
diesem Molekül
nur eine gerade Anzahl an Stickstoffatomen (0, 2, 4) vorhanden sein.
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LC/MSn-Struktur-Bestimmung: Eine
teilweise Bestimmung der Struktur von Æ-986 erfolgte mit Hilfe der
Durchführung
von Tandem-Massenspektrometrie-Experimenten.
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Tabelle
16. Im folgenden erläuterte
Chromatographiebedingungen beim MSn-Experiment
-
An positiven Ionen für das Molekül-Ion 245
m/e (M + 1) durchgeführte
Tandemmassenspektrometrie-Experimente (MS/MS-Experimente) zeigten
Verluste von 18 amu (m/e 227.1) und 36 amu (m/e 209) (minor). Diese
Verluste entsprechen dem Verlust von einem oder zwei Wassermolekülen (–H2O bzw. –2H2O), was auf das Vorhandensein einer Alkohol-
und/oder Diol-Hälfte
in Æ-986
hinweist. Das tatsächliche
MS/MS-Spektrum ist
in 5 gezeigt.
-
Ein am m/e-227-Ion durchgeführtes MS/MS-Experiment
ergab ein komplexes Spektrum mit vielen charakteristischen Fragmenten
der chemischen Struktur von Æ-986.
Die in diesem Spektrum erscheinenden Fragmente könnten dabei aus der Fragmentierung
des m/e-227-Ions und/oder aus der Fragmentierung anderer intensiver
Ionen stammen, die in diesem Spektrum erscheinen (d. h. m/e 166
stammt aus der Fragmentierung des 209-Ions). Dementsprechend wurden
weitere MS/MS-Experimente an ausgewählten Fragmenten des m/e-227-Ions
durchgeführt.
Das dabei gewonnene MS/MS-Spektrum ist in 6 dargestellt.
-
Ein MS/MS-Experiment am 209 m/e-Ion
(M + 1 – 2H2O) basiert auf dem Verlust von 60 amu, wodurch man
m/e 149 erhält,
was für
den Verlust einer Karboxylsäurehälfte (– CH3COOH) charakteristisch ist.
-
Das Ion 149 m/e (M + 1 – 2H2O – CH3COOH) wurde sodann mit Hilfe von MS/MS nochmals
analysiert, wobei man die folgenden Fragmente erhielt: m/e 105,
115, 116 und 134. Der Verlust von 15 von 149 auf 134 entspricht
mit größter Wahrscheinlichkeit
dem Verlust von CH3. Der Verlust von 33
und 34 ist charakteristisch für
den Verlust von SH bzw. H2S und weist somit
stark auf das Vorhandensein einer schwefelhaltigen Gruppe (Thiol
oder Thioäther)
im Æ-986
hin. Der Verlust von 44 von m/e 149 auf 105 kann auf den Verlust
mehrerer unterschiedlicher Gruppen zurückgeführt werden.
-
Strukturbestimmung durch chemische
Derivatbildung: Das Æ-986
wurde Bedingungen unterworfen, wie sie normalerweise für die Esterbildung
bei Karboxylsäuren
eingesetzt werden, worauf weiter unten noch detaillierter eingegangen
wird.
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Methylation (HCl/Methanol)
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Zur Methylation gereinigter Fraktionen
wurden von den Erfindern dieser Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion
(4000fach) von Æ-986
verdampft und dieser in einer geschlossenen Phiole 100 μl eines Gemisches
aus HCl (12 N): MeOH/(1 : 99) zugegeben. Das Gemisch wurde 60 bis
90 Minuten lang bei 45°C
inkubiert und sodann bis zur Trocknung verdampft und in 100 μl Wasser
aufgelöst.
Diese Lösung
wurde entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Strukturbestimmung
injiziert.
-
Methylation (BF3/Methanol)
-
Zur Methylation gereinigter Fraktionen
verdampften die Erfinder dieser Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion
(4000-fach) von Æ-986
und fügten
100 μl einer
BF3/Methanollösung in einer geschlossenen Phiole
hinzu. Das Gemisch wurde 60 bis 90 Minuten lang bei 45°C inkubiert
und sodann bis zur Trocknung verdampft und mit 100 μl Wasser
aufgelöst.
Die Lösung
wurde entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Strukturbestimmung
injiziert.
-
Verdünnung von gereinigten Fraktionen
(4000fach)
-
Zur Verifizierung der Rückgewinnung
bei der Derivatbildung verdünnten
die Erfinder der vorliegenden Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion
(4000fach) von Æ-986
mit 85 μl
Wasser. Die verdünnte
Lösung wurde
entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Bestimmung analysiert.
-
Ergebnisse
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Die einstündige Derivatbildung der Æ-986-Komponente
mit BF3/Methanol bzw. H+/Methanol bei 45°C führte zu
einem mehr als 95%igen Verschwinden ihres Chromatographiesignals,
wobei die Signalstärke
bei der erwarteten Retentionszeit für Æ-986 bestimmt wurde. Beide
Reaktionen sind für
die Umwandlung von Karboxylsäure
in ihre entsprechenden Methylester bereits bekannt. Die Methylisierung
verursacht einen Anstieg im Molekulargewicht von Æ-986 sowie
eine Verlängerung
seiner Retentionszeit am Chromatographiesystem. Die Konzentration
der dabei erzeugten Æ-986-Derivate
ermöglichte
keine Detektion des derivierten Produkts.
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Physiochemische Eigenschaften: Das
Vorhandensein einer schwachen sauren Funktionsgruppe, etwa einer
Karboxylsäure,
am Æ-986
wurde durch den Anstieg der Retentionszeit des Æ-986 auf der HPLC-C18-Säule bestätigt, wenn
der pH-Wert des Formiatpuffers von 7 auf 3 gesenkt wurde. Dies weist
stark darauf hin, dass im Æ-986
eine einen pKa-Wert von wenigstens etwa 4 aufweisende Hälfte vorhanden
ist.
-
Wenn im Æ-986 eine Thiol- oder Thioäther-Funktionsgruppe
vorhanden ist, wie dies durch die MS/MS-Daten nahegelegt wird, so
beeinflusst dies die Rückgewinnung
von Æ-986
aus der 0–500-Fraktion
und dem Knorpelgewebe. Es ist wahrscheinlich, dass nur der freie
Thiol-Anteil des Æ-986
durch das vorliegende Verfahren extrahiert werden kann, da Thiole
dazu neigen, in einer Lösung
Disulfidbindungen (S=S) mit anderen schwefelhaltigen Molekülen (etwa
Proteinen, Peptiden, Aminosäuren)
auszubilden. Die Bildung eines Disulfid-Addukts verändert im
allgemeinen die physiochemischen Eigenschaften der Thiol-Gruppen
enthaltenden Moleküle
und wirkt sich auf ihre Gewinnung durch Extraktion aus. So ist es
möglich,
dass ein Disulfid-Addukt von Æ-986
durch direkte Extraktion der 0–500-Fraktion
(20fach) nicht isoliert werden kann. Die Bildung von Disulfid-Addukten
des Æ-986
lässt sich
durch eine fünfzehnminütige Behandlung
der das Æ-986
enthaltenden Lösungen
mit Tributhylphosphamid bei pH 7 und bei Zimmer temperatur vor der
Extraktion, insbesondere bei Lösungen
mit dem pH-Wert 3 (SPE C18 pH 3) minimieren. Andere Reagenzien,
die Disulfidbindungen auftrennen, wie Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol,
lassen sich ebenfalls einsetzen, um die Bildung von Disulfid-Addukten
von Æ-986
zu minimieren.
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Die beschriebenen Verfahren zur Gewinnung
und Isolierung biologisch wirksamer Substanzen aus Hai-Knorpelgewebe
lassen sich für
jede beliebige Knorpelgewebequelle einsetzen, um (1) Fraktionen
zu extrahieren, die die gewünschten
biologischen Wirkungen aufweisen, und (2) spezifische Komponenten
zu extrahieren, die diese biologischen Wirkungen besitzen.
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Da die vorliegende Erfindung lehrt,
dass biologisch wirksame Komponenten aus Knorpelgewebe in einer
Vielzahl unterschiedlicher hydrophiler Lösungsmittel extrahiert werden
können,
lassen sich die genannten Verfahren so anpassen, dass sie auch zur
Extraktion biologisch wirksamer Komponenten aus dem Knorpelgewebe
anderer Spezies eingesetzt werden können. Jede aus einem Knorpelgewebematerial,
vorzugsweise aus Hai-Knorpelgewebe, isolierte Komponente, die 1)
ein biologisches Wirkprofil aufweist, das demjenigen der Æ-986-Komponente ähnlich oder
identisch ist und/oder 2) eine Masse von 244 amu besitzt, liegt
im Bereich der vorliegenden Erfindung.
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Die Erfindung wurde hier unter Bezugnahme
auf spezifische Ausführungsbeispiele
beschrieben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet ist durchaus in der
Lage, Modifikationen vorzunehmen, ohne von den obigen Lehren abzuweichen,
wobei derartige Modifikationen innerhalb der durch die beigefügten Ansprüche bestimmten
Reichweite der Erfindung liegen.