DE69911614T2

DE69911614T2 - Komponenten mit niedrigem molekulargewicht aus knorpelgewebe von haien, verfahren zur herstellung und therapeutische verwendungen

Info

Publication number: DE69911614T2
Application number: DE69911614T
Authority: DE
Inventors: Eric Dupont; Yves Lachance; Denis Lessard; Serge Auger
Original assignee: Les Laboratories Aeterna Inc
Current assignee: Les Laboratories Aeterna Inc
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1999-07-23
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2019-07-24
Also published as: AU4893199A; WO2000004910A2; WO2000004910A3; US6168807B1; US20010001041A1; CA2338068A1; ATE250422T1; US6506414B2; DE69911614D1; CN1314816A; EP1098656A2; HK1035488A1; ES2207248T3; EP1098656B1; JP2002521340A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht, die aus dem Knorpelgewebe von Haien extrahiert werden, sowie Verfahren zu deren Gewinnung. Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Knorpelgewebeextrakts unter einer Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen. Die Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zeigen eine Anti-Matrix-Metalloprotease- (Anti-MMP-) und/oder eine anti-angiogene und/oder eine tumorhemmende Wirkung.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zur Gewinnung von Hai-Knorpelgewebe-Extrakten und die Extrakte selbst sind in den internationalen Veröffentlichungen WO 95/32722, WO 96/23512 und WO 97/16197 offenbart. Flüssige Extrakte von Hai-Knorpelgewebe wurden in verschiedenen Versuchen auf ihre anti-angiogene und antikollagenolytische Wirkung, ihre direkte Antitumorproliferationswirkung sowie ihre entzündungshemmende Wirkung hin untersucht.
Die WO 95/32722 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung eines Hai-Knorpelgewebeextrakts mit anti-angiogener Wirkung, mit einer direkten Antitumorproliferationswirkung in vitro und mit einer Antitumorwirkung in vivo. Dieses Verfahren umfasst die Verfahrensschritte eines Mischens von Hai-Knorpelgewebe und einer Reduzierung desselben auf eine Partikelgröße von etwa 500 μm in . Wasser; der Extrahierung aktiver Komponenten in das Wasser und der Fraktionierung der auf diese Weise hergestellten Extrakte zur Gewinnung von Molekülen, deren Molekulargewicht weniger als etwa 500 kDa (0–500-Fraktion) beträgt. Der flüssige Knorpelgewebeextrakt wurde auf einer Membran mit einer nominalen Porosität von etwa 1 kDa konzentriert, um einen konzentrierten flüssigen Extrakt herzustellen, welcher Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 kDa enthielt. Der Extrakt wurde mit Molekülen mit einem Molekulargewicht von zwischen etwa 1–500 kDa angereichert. Die 0–500-Fraktion wurde weiter fraktioniert, um mehrere Extrakte herzustellen, welche Antitumorproliferationsmoleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 1 bis 120 kDa enthielten. Die Veröffentlichung WO 95/32722 offenbart nicht die spezielle Gewinnung von Komponenten mit einem Molekulargewicht von unter etwa 1 kDa. Sie offenbart auch kein Verfahren zur Gewinnung eines Knorpelgewebeextrakts oder von Fraktionen eines solchen Extrakts in organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösungen.
Die internationale Veröffentlichung WO 96/23512 offenbart ein Verfahren zur Extraktion von biologisch wirksamen Komponenten aus einer beliebigen Knorpelgewebequelle in wässrigen Lösungen. Zudem offenbart die Veröffentlichung andere biologische Wirkungen, die mit dem flüssigen Hai-Knorpelgewebe in Verbindung stehen, nämlich anti-kollagenolytische und entzündungshemmende Wirkungen. Die Veröffentlichung WO 96/23512 offenbart weder die Gewinnung von Komponenten, deren Molekulargewicht weniger als 1 kDa beträgt, noch irgendein Verfahren, bei dem organisches Lösungsmittel enthaltende Lösungen zum Einsatz kommen.
Die internationale Veröffentlichung WO 97/16197 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung eines wässrigen Extrakts, das mit Molekülen angereichert ist, welche ein Molekulargewicht von zwischen etwa 0,1 und 500 kDa besitzen. Obwohl durch dieses Verfahren Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa gewonnen werden können, ist das Verfahren doch nicht auf die Gewinnung spezifischer Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht ausgelegt. Komponenten in isolierter oder gereinigter Form werden nicht beschrieben.
Unter Fachleuten ist es allgemein anerkannt, dass Matrix-Metalloproteasen in Gefäßneubildungsprozessen eine Rolle spielen und dabei das Wachstum von primären Tumoren und die Bildung von Metastasen fördern. Dementsprechend geht man davon aus, dass Komponenten oder Wirkstoffe, die eine anti-angiogene und/oder eine Anti-Matrix-Metalloprotease-Wirkung aufweisen, zur Hemmung der Gefäßneubildung und/oder des Tumorwachstums und/oder des Eindringens von Metastasen in Zellen und/oder zur Hemmung der Metastasenbildung und/oder zur Behandlung von angiogenese-bezogenen Krankheiten nutzbringend eingesetzt werden können.
Berücksichtigt man das Interesse an aus Hai-Knorpelgewebe gewonnenen Komponenten, so besteht ein Bedarf nach verbesserten Verfahren zu deren Herstellung und zur Isolierung und Reinigung weiterer Komponenten, deren biologische Wirksamkeit früher noch nicht bekannt war.
Überblick über die Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur Bereitstellung von aus Hai-Knorpelgewebe gewonnenen Extrakten zu beschreiben.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dabei ein Verfahren gemäß Anspruch 1.
Zur Minimierung der Bildung von Komponentenaggregaten sowie zur Verbesserung der Auflösung und der Aufrechterhaltung einer stabilen löslichen Form können Saccharose oder ein oder mehrere andere geeignete Stabilisatoren, wie etwa Dextran, Ficoll^TM, Fruktose, Gelatine, Glukose, Glyzin, Inositol, Laktose, Mannitol und Sorbitol in einer zur Stabilisierung ausreichenden Menge der 0–500-, der 0–1- und/oder der 1–500-Fraktion zugegeben werden oder in einem beliebigen Schritt des Herstellungsverfahrens Verwendung finden. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "enthaltend 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose" bei Fraktionen, Lösungen oder Extrakten auf eine entsprechende Fraktion bzw. Lösung oder einen entsprechenden Extrakt, die bzw. der etwa 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthält. Biologisch wirksame Komponenten in der 0–1- und der 1–500-Fraktion besitzen eine Anti-MMP-, eine anti-angiogene und eine Anti-Tumor-Wirkung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine biologisch wirksame Komponente gemäß Anspruch 13, die sich durch das oben genannte Verfahren gewinnen lässt, sowie die Verwendung einer derartigen biologisch wirksamen Komponente gemäß Anspruch 14 bei der Herstellung eines Medikaments, das eine Anti-Matrix-Metalloprotease und/oder eine anti-angiogene und/oder eine Anti-Tumor-Wirkung besitzt.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
Die im folgenden erwähnten Zeichnungsfiguren sind Teil der vorliegende Beschreibung und dienen zur genaueren Darstellung bestimmter Aspekte der Erfindung, wobei die Erfindung unter Bezugnahme auf eine oder mehrere der Figuren in Verbindung mit der vorliegenden detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsbeispiele leichter verständlich wird.
In der Zeichnung zeigen
1a und 1b das Total-Ionen-Chromatogramm bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245 M + 1), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 7) bei Durchführung einer isokratischen Elution ergibt;
2a und 2b das Total-Ionen-Chromatogramm bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245 M + 1 ), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer Gradientenelution ergibt;
3a und 3b das Total-Ionen-Chromatogramm bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245), das sich durch die Anlayse von Æ-986 in einem HPLC-C18-System unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer isokratischen Elution ergibt;
4a und 4b das Total-Ionen-Chromatogramm bzw. das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245), das sich durch die Analyse von Æ-986 in einem HPLC-NH2-System unter Verwendung eines Ammoniumformiatpuffers (pH 3) bei Durchführung einer Gradientenelution ergibt;
5 das MS/MS-Spektrum von Æ-986, dem sich der Verlust von 18 amu (Hauptpeak m/e 227.1) entnehmen lässt, der dem Verlust eines Wassermoleküls entspricht;
6 das MS/MS-Spektrum der spezifischen Fragmente des Ions 227 (245 M + 1 minus ein Wassermolekül).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Biologische Versuche
Die biologischen Eigenschaften von Hai-Knorpelgewebeextrakten, daraus gewonnenen Fraktionen und der Komponente Æ-986 wurden durch wenigstens einen der folgenden Versuche bestimmt:

– Gelatinase-Inhibitor-Versuch (GIA): ein Versuch zur Bewertung der Anti-MMP-Wirkung;
– Embryonen-Vaskularisations-Test (EVT): ein Versuch zur Bewertung der anti-angiogenen Wirkung; und
– Lewis-Lungenkarzinom-Metastasten-Maus-Modell (LLC): ein Versuch zur Bewertung der Anti-Tumorwirkung.

GIA
Der GIA wurde unter Verwendung einer im Handel (Boehringer Mannheim) erhältlichen Ausstattung durchgeführt. GIA dient zur Bestimmung der Fähigkeit von Komponenten in den aus Knorpelgewebe gewonnenen Extrakten oder von Fraktionen hiervon oder der Komponente Æ-986, die Wirkung des Gelatinase-A-Enzyms (MMP-2) zu hemmen.
Kurz gesagt, wurde der GIA in der folgenden Weise durchgeführt: Ein mit Biotin markiertes Gelatinesubstrat wurde einerseits in Abwesenheit und andererseits bei Vorhandensein eines flüssigen Knorpelgewebeextrakts oder von dessen Derivaten mit Gelatinase A einer Inkubation unterzogen. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch auf eine mit Streptavidin überzogene Mikrotiter-Platte aufgebracht. Die mit Biotin markierte Gelatine wurde durch ihre freien Biotinrückstände an die mit Streptavidin überzogene Mikrotiter-Platte gebunden. Erfolgte nun keine durch die Gelatinase hervorgerufene Spleiß-Reaktion des Substrats, d. h. der Gelatine, so entstanden Bindungen zwischen dem Streptavidin-Peroxidase-(POD)-Konjugat und dem Gelatinase-Biotin-Komplex. Die POD wandelte sodann ein zugegebenes ABTS-Substrat in ein grünes Endprodukt um, das bei 405 nm gemessen wurde. Bewirkte hingegen die Gelatinase eine Spleiß-Reaktion der mit Biotin markierten Gelatine, so bildeten sich nur kleine Gelatinfragmente. Nach der Anhaftung an einer Mikrotiter-Platte besaßen diese Fragmente nicht die Fähigkeit, Bindungen mit dem Streptavidin-POD-Konjugat herzustellen, so dass hier auch keine Farbwirkung eintrat.
Somit liefert eine hohe Gelatinase-Aktivität niedrige Signale, während eine (z. B. auf die Zugabe eines Inhibitors zurückzuführende) niedrige Gelatinase-Aktivität hohe Signale liefert. Bei der Wirkung, nach der bei den Komponenten in einem aus Knorpelgewebe gewonnenen Extrakt bzw. bei hieraus derivierten Fraktionen gesucht wurde, kann es sich um eine gelatinasehemmende Wirkung oder eine antagonistische Wirkung handeln, welche mit der Interaktion zwischen der Gelatinase und dem zugehörigen Gelatin-Substrat konkurriert (z. B. indem die antagonistischen Komponenten Bindungen mit der Gelatine ausbilden).
EVT
Der Embryonen-Vaskularisierungs-Test (EVT) wurde zur Bestimmung der Fähigkeiten von Komponenten in den flüssigen Haiknorpelgewebeextrakten oder von daraus derivierten Fraktionen eingesetzt, die Bildung neuer Blutgefäße zu hemmen (anti-angiogene Wirkung).
Die normale Entwicklung von Hühnerembryonen beinhaltet die Bildung eines externen Gefäßsystems in der Vitellus-Membran, das Nährstoffe vom Vitellus (Eigelb) zu dem sich entwickelnden Embryo transportiert. Werden anti-angiogene Substanzen auf die Vitellus-Membran platziert, so können sie die in der Vitellus-Membran ablaufende Bildung der Blutgefäße hemmen.
Auf den äußeren Rand des vaskulären Perimeters der Vitellus-Membran, wo der angiogene Prozess abläuft, wurden Methylzellulosescheiben (inerter Feststoff und durchsichtige Matrix) mit unterschiedlichen Mengen an Komponenten von aus Haiknorpelgewebe derivierten flüssigen Extrakten oder daraus derivierten Fraktionen oder geeigneten Kontrollsubstanzen platziert. Zu den positiven Kontrollsubstanzen gehörten dabei Methylzellulosescheiben, welche 1,5 mg/ml 2- Methoxyestradiol enthielten. Scheiben mit Kontrollsubstanzen und mit Proben wurden auf die Vitellus-Membran von drei Tage alten Embryonen platziert. Zu diesem Zeitpunkt dringen in den Vitellus nur die Anfänge der primären Blutgefäße ein. Auf die Vitellus-Membran desselben Embryos wurden immer gleichzeitig eine Methylzellulosescheibe mit einer negativen Kontrollsubstanz und eine Methylzellulosescheibe mit einer bestimmten Menge an Komponenten des aus Haiknorpelgewebe derivierten flüssigen Extrakts oder daraus derivierter Fraktionen platziert. Die beiden Scheiben wurden symmetrisch zur Zephalokaudalachse des Embryos angeordnet, um individuelle Abweichungen zwischen den einzelnen Embryonen beim Vergleich der Effizienz der Komponenten mit derjenigen der negativen Kontrollsubstanzen möglichst gering zu halten. Die Gefäßbildung wurde 24 Stunden nach der Platzierung der Scheiben bewertet und die Ergebnisse wurden als Prozentsatz an Embryonen angegeben, deren Blutgefäßbildung beeinträchtigt wurde. Die Blutgefäßbildung wurde als beeinträchtigt angesehen, wenn der Blutgefäß-Wuchspfad entweder umgeleitet oder eingeschränkt wurde oder wenn im Vergleich zur negativen Kontrollsubstanz kein über die Scheibe hinausreichendes Wachstum zu beobachten war.
LLC-Modell
Das Lewis-Lungenkarzinom-Maus-Modell (LLC) wurde zur Bestimmung der Fähigkeit von Komponenten von flüssigen Haiknorpelgewebeextrakten, von daraus derivierten Fraktionen bzw. von Æ-986 zur Hemmung der Metastasenbildung in der Lunge eingesetzt.
Zeltkultur: Das Lewis-Lungenkarzinom-Klon-M27 mit hohem Metastasenpotential der Lunge wurde durch Dr. P. Brodt (Brodt P, Cancer Res., 46: 2442, 1986) etabliert. Dieses Modell hat sich durchgesetzt und ist für seine Vorhersagen über Beziehungen zwischen in-vitro- und in-vivo-Wirkungen bekannt. Zellen wurden in einem mit 10% Rinderfötenserum und 1% Penicillin-Streptomyzin angereicherten RPMI-Medium unter 5% CO₂ gehalten und zweimal pro Woche passagiert. Es wurden Zellstämme erzeugt und als frühe Passagen gelagert. Alle Experimente wurden unter Verwendung derselben Passage durchgeführt. Zur Tumorinduktion ließ man M27-Zellen bei 70%iger Konfluenz in vollständigem Medium wachsen, die sodann unter Verwendung von Trypsin-EDTA-Lösung (0,05% Trypsin, 0,53 mM EDTA-4Na in HBSS ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺) geerntet wurden. Die Zellen wur den sodann zentrifugiert, gewaschen und resuspendiert (1 × 10⁶ LLC Zellen pro 200 μl PBS, Ca⁺⁺-frei und Mg⁺⁺-frei). Die Lebensfähigkeit wurde durch Tryptan-Blau-Anfärbung bestimmt und nur Kolben, deren Inhalt eine Lebensfähigkeit von mehr als 95 % aufwies, wurden zur Beimpfung verwendet.
Tumorinduktion: Für die Induktion der Lewis-Lungenkarzinomtumore wurden weibliche Mäuse C57BL/10 (15 bis 20 g) (Charles River Inc.) herangezogen. Nach einer Inkubationszeit von einer Woche wurden am Tag 0 im Axillarbereich der rechten Flanke LLC-Zellen subkutan transplantiert (5 × 10⁵ lebensfähige Zellen pro 100 μl). Alle Tiere wurden an derselben Stelle beimpft. Das Tumorwachstum wurde jeden Tag mit Hilfe von Messlehren überprüft. Das relative Tumorvolumen wurde mit Hilfe der folgenden Formel berechnet: Länge (cm) × [Breite (cm)]²/2, wobei die Länge der längsten Achse und die Breite der kürzesten senkrechten Achse des Tumors entspricht. Sobald der primäre Tumor eine Größe von 0,5 bis 1,0 cm³ (10 Tage nach der Beimpfung) erreichte, wurden Mäuse mit primären Tumoren etwa identischer Größe nach dem Zufallsprinzip spezifischen Experimentgruppen von jeweils 15 Tieren zugeordnet und mit Hilfe des Ohrstanzverfahrens mit Nummern markiert. Sodann wurde unter sterilen Bedingungen operiert. Nach einem kleinen Einschnitt in die Haut (0,5–1 cm) wurde der Tumor sorgfältig vom ihn umgebenden gesunden Gewebe gelöst. LLC-Zellen bilden (in einer frühen Wachstumsphase) einen gut abgegrenzten Tumor und die Entfernung ließ sich leicht ohne nennenswerte Beschädigung des normalen Gewebes durchführen. Eine Stereoskop-Untersuchung zeigte das Fehlen jeglicher makroskopischer Tumorreste an der mit dem Tumor beimpften Stelle und es wurde unter den genannten Bedingungen auch kein erneutes Tumorwachstum beobachtet. Nach der Entfernung wurde der Tumor gewogen und die Wunde mit Klammern aus chirurgischem Edelstahl verschlossen und mit Providon-Jod desinfiziert.
Experimentaufbau für die Effizienzstudie: Die Behandlung mit unterschiedlichen Testproben (aus flüssigem Haiknorpelgewebeextrakt derivierte Komponenten, hieraus derivierte Fraktionen oder Æ-986) begann am Tag nach der Tumorentfernung (Tag 11 nach Beimpfung). Es wurde zwei Wochen lang täglich eine Schlundfütterung einer Salzlösung bzw. der aus Knorpelgewebe derivierten Produkte vorgenommen. Die Schlundfütterung (0,5 ml) wurde unter Einsatz einer gebogenen 22G-Nadel durchgeführt. Da frühere Experimente gezeigt hatten, dass ein Zeitraum von etwa 2 Wochen nach Entfernung des primären Tumors ausreicht, damit im Durchschnitt 30 bis 50 Knötchen auf der Lungenoberfläche ent stehen, wurden die Tiere nach zwei Wochen in einer CO₂-Kammer getötet. Nach der Autopsie wurden beide Lungenflügel entfernt, gewogen und in einer 10%igen Bouin-Lösung fixiert. Die Metastasen an der Lungenoberfläche wurden mit Hilfe eines Stereomikroskops (4fach) gemessen.
Messung des Körpergewichts: Das Körpergewicht wurde jeden zweiten oder dritten Tag bis zur Tötung gemessen.
Verfahren zur Herstellung von Knorpelgewebeextrakten
Extraktion wirksamer Komponenten aus Hai-Knorpelgewebe unter Verwendung organisches Lösungsmittel enthaltender Lösungen
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Knorpelgewebeextraktes und zur Gewinnung, Isolierung und Aufbereitung darin enthaltener biologisch wirksamer Komponenten aus dem Extrakt, wobei zumindest ein Teil der biologisch wirksamen Komponenten keine Proteinstruktur aufweist. Allerdings können im erfindungsgemäßen Verfahren chaotrope Wirkstoffe eingesetzt werden, die zur Extraktion von proteinhaltigen Komponenten dienen.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung" auf eine Lösung oder ein Gemisch, die bzw. das zumindest eine gewisse Menge an organischem Lösungsmittel enthält. Die organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung kann ein oder mehrere organische Lösungsmittel umfassen und Wasser enthalten. Im vorliegenden Zusammenhang wird vorzugsweise ein polares organisches Lösungsmittel oder eine polare Kombination organischer Lösungsmittel eingesetzt. Bei einem Ausführungsbeispiel kann für die Herstellung von flüssigen Hai-Knorpelgewebeextrakten Methanol und/oder Ethanol zum Einsatz kommen. Bei anderen organischen Lösungsmitteln, wie Azetonitril, Propanol, Isopropanol und Azeton, handelt es sich um geeignete polare Lösungsmittel, die ebenfalls Verwendung finden können. Das organische Lösungsmittel kann halogenierte, Äther-, protische, aprotische, polare, nichtpolare, basische, saure, wasserabweisende und hydrophile Lösungsmittel einzeln oder in Kombination umfassen.
Zu den geeigneten halogenierten Lösungsmittel zählen Chloroform, Dibrommethan, Butylchlorid und Dichlormethan.
Geeignete Äther-Lösungsmittel sind Dimethoxymethan, Tetrahydrofuran, Diethyläther, Ethylenglykoldimethyläther, Ethylenglykoldiethyläther, Diethlyenglykoldiethyläther, Triethylenglykoldimethyläther, t-Butylethyläther und t-Butylmethyläther.
Zu den geeigneten protischen Lösungsmitteln zählen beispielsweise u. a. Methanol, Ethanol, 2-Nitroethanol, 2-Fluorethanol, 2,2,2,-Trifluorethanol, Ethylenglykol, 1-Propanol, 2-Propanol, 2-Methoxyethanol, 1-Butanol, 2-Butanol, i-Butylalkohol, t-Butylalkohol, 2-Ethoxyethanol, Diethylenglykol, 1-, 2- oder 3-Pentanol, Neopentylalkohol, t-Pentylalkohol, Diethylenglykolmonomethyläther, Diethylenglykolmonoethyläther, Zyklohexanol, Anisol, Benzylalkohol, Phenol oder Glyzerol.
Als geeignete aprotische Lösungsmittel kommen beispielsweise u. a. Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMAC), 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (DMPU), 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon (DMI), N-Methylpyrrolidinon (NMP), Formamid, N-Methylacetamid, N-Methylformamid, Azetonitril, Dimethyfsulfoxid, Propionitril, Ethylformiat, Methylazetat, Azeton, Ethylmethylketon, Ethylazetat, Sulfolan, N,N-Dimethlypropionamid, Tetramethylharnstoff, Nitromethan, Nitrobenzen oder Hexamethylphosphoramid in Betracht.
Zu den geeigneten basischen Lösungsmitteln gehören 2-, 3- oder 4-Picolin, Pyrrol, Pyrrolidin, Morpholin, Pyridin oder Piperidin.
Als saure Lösungsmittel sind Trifluor-Essigsäure, Essigsäure, Proprionsäure und Ameisensäure geeignet.
Die geeigneten Kohlenwasserstofflösungsmittel umfassen Benzen, Zyklohexan, Pentan, Hexan, Toluen, Zykloheptan, Methylzyklohexan, Heptan, Ethylbenzen, Oktan, Indan, Nonan oder Naphthalen.
Die organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung kann Kombinationen von organischen Lösungsmitteln und/oder Kombinationen von organischen Lösungsmitteln mit Wasser umfassen. Zu den geeigneten protischen Lösungsmittelverbindungen mit Wasser zählen beispielsweise u. a. Wasser- Methanol, Wasser-Propanol, Wasser-Isopropanol und Wasser-Butanol. Geeignete aprotische Lösungsmittelkombinationen mit und ohne Wasser können beispielsweise u. a. Wasser-Azetonitril, Wasser-Dimethylsulfoxid, Methanol-Azetonitril, Methanol-Dimethylsulfoxid, Ethanol-Azetonitril und Ethanol-Dimethylsulfoxid umfassen.
Die Menge des erfindungsgemäß vorhandenen organischen Lösungsmittels kann entsprechend des Typs der aus dem Knorpelgewebe zu extrahierenden Komponente und ihren physikalischen Eigenschaften variieren. Im allgemeinen enthält die organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung etwa 1–100 Vol.-/Vol.-%, etwa 40–80 Vol.-/Vol.-%, mindestens 1 % Vol.-/Vol.-%, mindestens 10% Vol.-/Vol.-%, mindestens 25% Vol.-/Vol.-%, mindestens 50 % Vol.-/Vol.-%, mindestens 90% Vol.-/Vol.-% oder mindestens 99% Vol.-/Vol.-% an organischem Lösungsmittel im Verhältnis zum Gesamtvolumen der Lösung.
Dementsprechend offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung von Hai-Knorpelgewebeextrakten, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Behandeln von Hai-Knorpelgewebematerial mit einer bestimmten Menge einer ein organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung zur Herstellung eines ersten Gemisches, welches lösliche Hai-Knorpelgewebekomponenten umfasst,
b) Separieren des ersten Gemisches zur Herstellung eines die löslichen Komponenten enthaltenden ersten flüssigen Extraktes sowie einer ersten Feststoffmasse; und
c) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus dem ersten flüssigen Extrakt.

Das Verfahren kann zusätzlich die folgenden Schritte beinhalten:

d) Entfernen einer ausreichenden Menge an Flüssigkeit vom ersten flüssigen Extrakt zur Herstellung einer im wesentlichen trockenen zweiten Feststoffmasse;
e) Zusetzen von Wasser zur zweiten Feststoffmasse zur Bildung eines zweiten Gemisches;
f) Separieren des zweiten Gemisches zur Herstellung eines ersten flüssigen Endextraktes und einer dritten Feststoffmasse.

Die das Hai-Knorpelgewebematerial enthaltende erste Feststoffmasse kann noch ein weiteres Mal oder auch noch mehrmals mit einer ein organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung oder anstatt mit der organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung mit Wasser entsprechend den oben beschriebenen Schritten a) bis c) extrahiert werden, um einen zweiten, dritten etc. flüssigen Endextrakt zu erhalten, der wenigstens Restmengen der löslichen Hai-Knorpelgewebekomponenten enthält.
Die Separierung von Feststoffen und Flüssigkeit im Schritt b) lässt sich mit beliebigen der dem Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannten Verfahren durchführen, indem man beispielsweise u. a. Zentrifugier-, Filtrier-, Diafiltrier-, Ultrafiltrier- bzw. Mikrofiltrierverfahren einsetzt, die Feststoffe sedimentieren lässt und den Überstand entfernt.
Die Entfernung von organischem Lösungsmittel gemäß Schritt c) lässt sich ebenfalls mit beliebigen der dem Fachmann bereits vertrauten entsprechenden Verfahren durchführen, z. B. u. a. durch Verdampfung, Liophilisation, Destillation, Desikkation, Zugabe von Absorptionsmittel für organische Lösungsmittel, Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktion bzw. Rotationsverdampfung.
Bei dem hier verwendeten Hai-Material handelt es sich um einen Feststoff, der beispielsweise in Form eines Pulvers, Granulats, Stabes oder in Partikelform vorliegen kann. Vor oder während des Schrittes a) kann das Hai-Material homogenisiert werden. Im vorliegenden Text beziehen sich die Begriffe "homogenisieren", "Homogenisieren" bzw. "Homogenisierung" auf ein Verfahren, bei dem die Wirksamkeit der Extraktion der gewünschten Komponenten aus dem Knorpelgewebematerial erhöht wird, indem entweder a) der gesamte Oberflächenbereich des Knorpelgewebematerials oder ein bestimmter Teil davon vergrößert oder b) die Abgabe der gewünschten Komponenten durch das Knorpelgewebematerial erleichtert wird. Die Homogenisierung kann mit einem oder mehreren chemischen Mitteln, mit physikalischen Mitteln bzw. mit einer Kombinationen aus diesen Mitteln durchgeführt werden.
Als chemische Mittel zur Homogenisierung des Knorpelgewebematerials dienen beispielsweise ein oder mehrere chemische Wirkstoffe, die das Knorpelgewebematerial anschwellen lassen, zum Aufbrechen oder zur Zerstörung von Zellen oder der extrazellularen Matrix im Knorpelgewebematerial führen und/oder die Porosität des Knorpelgewebematerials erhöhen. Zu diesen chemischen Wirkstoffen zählen beispielsweise u. a. Reinigungsmittel, Tenside, ionische Wirkstoffe, nicht-ionische Wirkstoffe, Reduktionsmittel, Chelatoren, Glykosyliermittel, chaotrope Wirkstoffe, Harnstoff, Guanidin, Phospholipide, Glykolipide, Dithiothreitol, β-Mercaptoethanol, Natriumlaurylsulfat, Tritonlösung und andere derartige Wirkstoffe, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt bzw. in "A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry" von Judith Neugebauer (Calbiochem-Novabiochem Corporation 1988) beschrieben sind.
Physikalische Mittel zur Homogenisierung von Knorpelgewebematerial bewirken üblicherweise eine Reduzierung der mittleren Partikelgröße des Hai-Materials und einer damit einhergehende Vergrößerung seines spezifischen Oberflächenbereichs. Die Partikelgrößenreduzierung kann durch eines oder mehrere der im folgenden beispielhaft genannten Verfahren erfolgen, nämlich u. a. durch Pulverisierung, Mikronisierung, Grob- und Feinmahlung, Zerteilung, Hochgeschwindigkeitsmischen oder andere dem Fachmann auf dem Gebiet der Partikelreduzierung bereits bekannte Verfahren.
Die Extrahierlösungen können extraktionsunterstützende Wirkstoffe zur Unterstützung der Extraktion der Komponenten aus dem Knorpelgewebe enthalten. Zu diesen extraktionsunterstützenden Wirkstoffen zählen u. a. anorganische und organische Säuren, anorganische und organische Basen, Polymere, Puffer, Salze und andere, ähnliche Wirkstoffe, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannt sind.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird die Extraktion von Materialien mit niedrigem Molekulargewicht aus dem Knorpelgewebe in der folgenden Weise durchgeführt:

a) Behandlung homogenisierten Hai-Knorpelgewebematerials (1 kg) mit Methanol (1 kg) zur Bildung eines ersten, lösliche Hai-Knorpelgewebekomponenten enthaltenden Gemisches;
b) Zentrifugieren des ersten Gemisches zur Bildung eines ersten, die löslichen Komponenten enthaltenden flüssigen Extrakts sowie einer ersten Feststoffmasse;
c) Verdampfen des Methanols aus dem ersten flüssigen Extrakt;
d) Verdampfen einer ausreichenden Menge an Flüssigkeit aus dem ersten flüssigen Extrakt zur Bildung einer im wesentlichen trockenen zweiten Feststoffmasse;
e) Zusetzen von Wasser (1 kg) zur zweiten Feststoffmasse zur Bildung eines zweiten Gemisches; und
f) Zentrifugieren des zweiten Gemisches zur Bildung eines ersten flüssigen Endextrakts und einer dritten Feststoffmasse.

Die obigen Schritte c) und d) lassen sich, falls gewünscht, miteinander kombinieren, um direkt vom ersten flüssigen Extrakt zur zweiten Feststoffmasse zu gelangen.
Alle in den gemäß den obigen Schritten durchgeführten Extraktionen und erneuten Extraktionen des Hai-Knorpelgewebes gewonnenen Extrakte wurden zur Bestimmung ihres Trockengewichtanteils und ihrer Proteinkonzentrationen (gemäß den Bedingungen eines Standard-Bradford-Protein-Assays) analysiert, um so einen Hinweis auf die Gewinnung löslicher Komponenten zu erhalten. Zudem wurde auch die Anti-MMP-Wirkung bewertet. Der GIA wurde an 40 μl von 20fach konzentrierten Proben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
In Tabelle 1 steht die Angabe "CTRL" (Kontrollprobe) für einen flüssigen Endextrakt, der durch Einsatz von gereinigtem Wasser als Extraktionslösung gewonnen wurde. Der Ausdruck "SU-MET" steht für einen flüssigen Endextrakt, der unter Einsatz von Methanol als ein organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung gewonnen wurde, während der Ausdruck "SU-ETH" einen flüssigen Endextrakt bezeichnet, der durch Einsatz von Ethanol als organisches Lösungsmittel enthaltende Lösung hergestellt wurde. Die Angaben "S1", "S2" und "S3" stehen für einen ersten flüssigen Endextrakt, einen zweiten flüssigen Endextrakt bzw. einen dritten flüssigen Endextrakt, wobei die angegebenen Lösungsmittel als organisches Lösungsmittel enthaltende Lösungen bzw. gereinigtes Wasser eingesetzt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl wässrige als auch nicht-wässrige ein organisches Lösungsmittel enthaltende Lösungen zur Gewinnung biologisch wirksamer, zumindest eine Anti-MMP-Wirkung aufweisender Komponenten aus Hai-Knorpelgewebe eingesetzt werden können. Zudem kann man durch mehrmalige aufeinanderfolgende erneute Extraktionen der Feststoffpartikel von Hai-Knorpelgewebe eine eine Restwirkung aufweisende Substanz gewinnen. Zwischen der Anti-MMP-Wirkung und der durch die Trockengewichtanalyse und Protein-Gewinnung ermittelten Menge an isoliertem Material ist eine direkte Beziehung nicht offensichtlich.
Auswirkung des Verhältnisses von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser auf die Produktion flüssiger Extrakte
Bei einem ersten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der unfertige flüssige Extrakt mit Wasser bei einem Verhältnis von Knorpelgewebe (C) zu gereinigtem Wasser (E) von etwa 1 kg zu 11 hergestellt. Das Verfahren zur Gewinnung der Komponenten umfasst dabei die folgenden Schritte:

a) Homogenisieren von Hai-Knorpelgewebe in einer wässrigen Lösung, bis das Knorpelgewebe auf Feststoffpartikel mit einer mittleren Partikelgröße von weniger als etwa 500 μ reduziert wird, um so ein Homogenat zu erzeugen;
b) Equilibrieren des Homogenats zur Extrahierung biologisch wirksamer Komponenten in die wässrigen Lösungen zur Herstellung eines ersten Gemisches, das eine erste Feststoffmasse und einen ersten, die biologisch wirksamen Komponenten enthaltenden flüssigen Extrakt (LE) umfasst;
c) Separieren des ersten flüssigen Extrakts von der ersten Feststoffmasse;
d) Durchführen eines Separationsvorgangs am ersten flüssigen Extrakt zur Herstellung eines zweiten flüssigen Extrakts, das Knorpelgewebemoleküle mit einem Molekulargewicht von unter etwa 500 kDa enthält (LE-0–500);
e) Filtrieren des zweiten flüssigen Extrakts durch eine Mikrofiltriermembran mit einer nominalen Porosität von 0,22 Mikron zur Herstellung eines flüssigen Endextrakts (P-C1-E1, das im wesentlichen der 0–500-Fraktion entspricht).

Das vorliegende Verfahren wurde zudem unter Einsatz der im folgenden aufgeführten unterschiedlichen Knorpelgewebe-Wasser-Verhältnisse durchgeführt:
Alle gemäß den oben erwähnten Verfahren hergestellten ersten flüssigen Extrakte wurden auf ihren Trockengewichtanteil, ihre Proteinkonzentration und ihre Anti-MMP-Wirkung hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich pro Kilogramm Hai-Knorpelgewebe-Ausgangsmaterial etwa 20 g lösliche Komponenten gewinnen lassen, wobei die maximale Ausbeute an löslichen Komponenten unter den spezifizierten Bedingungen pro kg Hai-Knorpelgewebe (P-C1-E2 bzw, P-C1-E3) 19,8 (9,9 × 2) und 18,9 (6,3 × 3) g betrug.
Diese Ergebnisse zeigen zudem, dass eine effiziente Gewinnung des Trockengewichtanteils, der enthaltenen Proteine sowie der die Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Komponenten bei unterschiedlichen Verhältnissen von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser möglich ist.
Die erste aus der P-C1-E1-Extraktion gewonnene Feststoffmasse wurde noch zweimal bei demselben Verhältnis von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser reextrahiert, um die darin noch enthaltene Restmenge an Komponenten zu gewinnen. Das Verfahren zur wiederholten Extraktion der ersten Feststoffmasse umfasst die folgenden Schritte:

f) Behandeln der ersten, im Schritt c) gewonnenen Feststoffmasse mit gereinigtem Wasser zur Herstellung eines zweiten Gemisches, welches zur Herstellung eines zweiten flüssigen Extrakts (P-C1-E1-2) und einer zweiten Feststoffmasse separiert wird, wobei der zweite flüssige Extrakt gemäß den Verfahrensschritten d) und e) behandelt werden kann; und wahlweise
g) Wiederholung des Schrittes f) mit der zweiten Feststoffmasse zur Herstellung eines dritten flüssigen Extrakts (P-C1-E1-3) und einer dritten Feststoffmasse, wobei der dritte flüssige Extrakt gemäß den Verfahrensschritten d) und e) behandelt werden kann.

In Tabelle 3 sind die in den genannten Schritten a) bis g) eingesetzten Mengen an Wasser und Hai-Knorpelgewebe angegeben.
Tabelle 3
Alle durch das genannte Verfahren hergestellten flüssigen Extrakte wurden auf ihren Trockengewichtanteil, ihre Proteinkonzentration und ihre Anti-MMP-Wirkung hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Durchführung einer oder mehrerer Extraktionen von Hai-Knorpelgewebe gemäß den genannten Schritten a) bis c) zu einer erhöhten Gewinnung der löslichen Hai-Knorpelgewebekomponenten führen kann. Zudem lassen sich Restmengen an eine Anti-MMP-Wirkung besitzenden Komponenten auch noch nach einer zweiten und dritten Extraktion derselben Feststoffpartikel extrahieren.
Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, dass Modifikationen der Extraktionsparameter, etwa hinsichtlich Temperatur, Anzahl der Extraktionen oder des Extraktionslösungsmittels vorgenommen werden können, um die Menge an gewonnenen Feststoffen, Protein und biologisch wirksamen Komponenten zu optimieren.
Verfahren zur Herstellung von Fraktionen der aus dem Knorpelgewebe derivierten Komponenten mit unterschiedlichem Molekulargewicht
Die 0–500-Fraktion: Bei der 0–500-Fraktion handelt es sich um einen flüssigen Hai-Knorpelgewebeextrakt, welcher Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 kDa umfasst. Herstellungsverfahren für die 0–500-Fraktion sind in den internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 95/32722, WO 96/23512 und WO 97/16197 beschrieben. Diese bekannten Verfahren umfassen die folgenden Schritte:

a) Homogenisierung von Hai-Knorpelgewebe in einer wässrigen Lösung unter Bedingungen, die es ermöglichen, die im Knorpelgewebe vorhandenen biologisch wirksamen Komponenten so lange unversehrt zu erhalten, bis das Knorpelgewebe zu Feststoffen mit einer Größe von weniger als 500 μm zerkleinert wird;
b) Extrahieren der biologisch wirksamen Komponenten in die wässrige Lösung, wodurch man ein Gemisch aus Feststoffen und einem die biologisch wirksamen Komponenten enthaltenden unbehandelten flüssigen Extrakt (LE) erhält;
c) Separieren des flüssigen Extrakts von den Feststoffpartikeln;
d) weiteres Separieren des unbehandelten flüssigen Extrakts zur Gewinnung eines flüssigen Endextrakts, das Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 kDa enthält (LE-0–500); und
e) Filtrieren des LE-0–500 auf einer Mikrofiltriermembran (0,22 Mikron) und Einfrieren zur Gewinnung des flüssigen Endextrakts (0–500-Fraktion).

Die 0–1- und die 1–500-Fraktion: Bei der 0–1-Fraktion handelt es sich um einen flüssigen Hai-Knorpelgewebeextrakt, der Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa enthält, während die 1–500-Fraktion aus einem flüssigen Hai-Knorpelgewebeextrakt besteht, der Komponenten mit einem Molekulargewicht von zwischen etwa 1 und 500 kDa umfasst. Die 0–1- und die 1– 500-Fraktion des Hai-Knorpelgewebeextrakts wurden mit einem Ultrafiltriersystem unter Verwendung einer Membran hergestellt, welche eine nominale Molekulargewichtstrenngrenze von etwa 1 kDa aufweist. Durch den Einsatz dieses Systems wurden die beiden Knorpelgewebefraktionen nach Durchführung eines Reinigungszyklus gewonnen (wobei ein Reinigungszyklus als Beendigung des Reinigungsschrittes nach Rückgewinnung von 50% des Permeats definiert ist). Die 1– 500-Fraktion umfasste das Retentat (R), das Komponenten mit einem Molekulargewicht von etwa 1 bis 500 kDa in derselben Konzentration wie der für die Reinigung verwendete Originalextrakt und Komponenten von weniger als etwa 1 kDa in einer im Vergleich zum Originalextrakt 0,5-fachen Konzentration enthält, wenn es unter Einsatz von gereinigtem Wasser zu einem dem Originalvolumen des für die Reinigung eingesetzten Knorpelgewebeextrakts entsprechenden Endvolumen rekonstruiert wird. Die 0–1-Fraktion enthielt das Permeat (P), das nur Komponenten mit einem Molekulargewicht von unter etwa 1 kDa in einfacher Konzentration ent hält. Durch Einsatz des Ultrafiltriersystems wurde die 1–500-Fraktion in zusätzlichen Reinigungszyklen weiter gereinigt, wie sich dies Tabelle 5 entnehmen lässt.
Tabelle 5
Es wurden mehrere Chargen von 0–1- und 1–500-Fraktionen gemäß den angegebenen Verfahren hergestellt. Zur Minimierung der Aggregatbildung und zur Verbesserung der Auflösung und Aufrechterhaltung einer stabilen löslichen Form wurde als Stabilisator für die Extraktion 1 Gew./Vol.-% einer wässrigen Saccharoselösung beigegeben.
Die 0–1- und die 1–500-Fraktion erhielt man, indem man eine Charge einer LE-0– 500-Fraktion gemäß den bereits beschriebenen bekannten Verfahren vorbereitete und sodann die folgenden neuartigen Schritte zusätzlich durchführte:

e) wahlweise Gewinnung des LE-0–500-Extrakts mit einer Lösung, welche Saccharose in einer Endkonzentration von etwa 1 (Gew.-/Vol.-)% enthält, zur Herstellung der 1% Saccharose enthaltenden LE-0–500-Fraktion;
f) Filtrieren der LE-0–500-Fraktion bzw. der 1% Saccharose enthaltenden LE-0–500-Fraktion mit Hilfe einer eine nominale Molekulargewichtstrenngrenze von etwa 1 kDa aufweisenden Membran zur Herstellung von flüssigen Extrakten, welche Knorpelgewebemoleküle mit einem Molekulargewicht von unter etwa 1 kDa enthalten (Pn-0–1 bzw. Fraktion Pn0–1 mit 1% Saccharose, wobei "n" für den Reinigungszyklus gemäß Tabelle 5 steht) sowie zur Herstellung von flüssigen Retentat-Extrakten (Rn-0–1 bzw. Fraktion Rn-0–1 mit 1% Saccharose, wobei "n" für den Reinigungszyklus gemäß Tabelle 5 steht), die Knorpelgewebemoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 1 kDa enthalten; und
g) Mikrofiltrieren des flüssigen Retentat- und des flüssigen Permeatextrakts durch eine Mikrofiltriermembran mit einer Porosität von etwa 0,22 Mikron.

Das obige Verfahren lässt sich auch ohne den Schritte) durchführen, um Extrakte herzustellen, die frei von Saccharose sind. Die flüssigen Retentat-Extrakte können in einem oder mehreren, und dabei vorzugsweise in wenigstens vier weiteren Reinigungszyklen ultrafiltriert werden, um zusätzlich flüssige Filtratextrakte herzustellen, welche Knorpelgewebekomponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa (P1-0–1 bis P6-0–1) enthalten, und um Retentatextrakte herzustellen, die Knorpelgewebekomponenten mit einem Molekulargewicht zwischen 1 und etwa 500 kDa umfassen (R6-1–500 und R6-1–500 mit 1% Saccharose). Die flüssigen Extrakte können, falls gewünscht, zu Aufbewahrungszwecken eingefroren werden.
Das eben beschriebene Verfahren wurde in entsprechender Weise zur Herstellung der folgenden flüssigen Extrakte eingesetzt:

1) aus LE-0–500 hergestellte 0–500-Fraktion
2) aus LE-0–500 mit 1% Saccharose hergestellte 0–500-Fraktion mit 1% Saccharose
3) aus P1-0–1 hergestellte 0–1-Fraktion
4) aus P1-0–1 mit 1% Saccharose hergestellte 0–1-Fraktion mit 1% Saccharose
5) aus R6-1–500 hergestellte 1–500-Fraktion
6) aus R6-1–500 mit 1% Saccharose hergestellte 1–500-Fraktion mit 1% Saccharose

Die zweite Feststoffmasse, die durch Separation des zweiten, während der Behandlung der ersten Feststoffmasse mit Wasser hergestellten Gemisches erzeugt wurde, kann wiederholt mit Wasser extrahiert werden, um zusätzliche Mengen der löslichen Hai-Knorpelgewebefraktion zu gewinnen.
Alle gemäß dem beschriebenen Verfahren hergestellten Extrakte wurde hinsichtlich ihres Trockengewichtanteils und Proteingehalts analysiert. Zudem wurden auch die Anti-MMP-Wirkung sowie die anti-angiogene Wirkung und die Anti-Tumor-Wirkung jeder Fraktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6
Die Analyseergebnisse zeigen, dass sowohl die 0–1-Fraktion als auch die entsprechende Fraktion mit 1% Saccharose zwar mehr als 90% des gewonnen Trockengewichtanteils, dabei aber nur sehr geringe, beinahe nicht nachweisbare Mengen an Proteinen enthalten.
Allerdings wurde sowohl bei der 0–1-Fraktion als auch bei der 1–500-Fraktion eine Anti-MMP-Wirkung beobachtet, was den Schluss zulässt, dass 1) wenigstens eine Nicht-Protein-Komponente für diese Wirkung verantwortlich ist und 2) möglicherweise nicht nur eine Komponente allein eine Anti-MMP-Wirkung aufweist. Die wirksame Komponente muss dabei nicht notwendigerweise eine Protein- oder eine Peptid-Beschaffenheit besitzen.
Im übrigen wurde die anti-angiogene Wirkung, die entsprechend dem EVT gemessen wurde, ausschließlich in der 0–1-Fraktion beobachtet. Es ist festzustellen, dass das Vorhandensein von Saccharose für eine leichte Verbesserung der antiangiogenen Wirkung der 1–500-Fraktion in 1% Saccharose verantwortlich war.
Die Behandlung von Tieren, welche mit M27-Tumorzellen (LLC) beimpft worden waren, führte zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl makroskopisch sichtbarer Metastasen-Knötchen an der Lungenoberfläche. Sowohl die 0–1- als auch die 0–500-Fraktion bewirkte eine erhebliche Verringerung der Anzahl von Metastasen-Knötchen (etwa 30%). Allerdings war die 1–500-Fraktion weniger wirksam als die 0–1- und die 0–500-Fraktion, was nahelegt, dass eine wirksame Komponente in der 0–1-Fraktion zumindest teilweise für die Anti-Tumor-Wirkung verantwortlich ist. Diese Ergebnisse lassen zudem darauf schließen, dass in der 1–500-Fraktion eine weitere Anti-Tumor-Komponente vorhanden ist. Einige weitere Gruppen von Tieren wurden mit Fraktionen desselben jeweiligen Molekulargewichts behandelt, welche 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthielten. Obwohl die Erfinder der vorliegenden Anmeldung keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Gruppen feststellen konnten, geht die Tendenz doch dahin, dass Fraktionen mit hohem Molekulargewicht bei Vorhandensein von Saccharose wirksamer sind (siehe obige Tabelle). Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung beobachteten keine Verringerung des Körpergewichts der Tiere, was darauf hinweist, das das Knorpelgewebeextrakts im LLC-Modell nicht toxisch wirkt.
Isolierung und Charakterisierung einer Anti-MMP-Komponente
Chromatographische Isolierung und Reinigung
Nachdem festgestellt wurde, dass in der 0–500-Fraktion und insbesondere in der 0–1-Fraktion mehrere Komponenten mit nutzbringender biologischer Wirkung vorhanden sind, bestand der nächste Schritt darin, die wirksamen Komponenten aus der Fraktion zu isolieren.
Zur Isolierung und Reinigung von eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Komponenten aus der 0–500-Fraktion wurden vier verschiedenen Verfahren entwickelt.
Verfahren 1:
Schritt 1:
Die im weiter oben detailliert beschriebenen Verfahren gewonnene 0–500-Fraktion wurde einer Liophilisation unterzogen und in gereinigtem Wasser (zu einer 20-fachen Konzentration gegenüber dem Originalvolumen) rekonstruiert. Das rekonstruierte Material wurde 15 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um die Löslichkeit der biologisch wirksamen Komponenten zu optimieren. Nach Durchführung eines Separiervorgangs, beispielsweise einer zehnminütigen Zentrifugierung bei 2.200 g und 4°C, wurde der Überstand zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Schritt 2:
Es wurde eine adsorptive Chromatographie unter Einsatz einer Festphasenextraktionssäule (SPE-C18 neutral) durchgeführt.
Eine mit 500 mg C18-Sorptionsmittel (Supelco Nr. 5-7012, Abmessung 3 cm³) bepackte SPE-Säule wurde zweimal in 2 ml Methanol (100%) und dreimal in 2 ml gereinigten Wassers konditioniert. 1 ml des zwanzigfach rekonstruierten Knorpelgewebeextrakts wurde auf die Säule geladen. Der Sorptionsmitteltropfen wurde mit 1,5 ml gereinigten Wassers gewaschen und Komponenten, die eine Anti-MMP-Wirkung aufweisen, wurden mit zwei 2,5-ml-Portionen gereinigten Wassers eluiert, die zu einem ersten Eluant kombiniert wurden.
Im ersten Eluant wurde etwa 50% der anfänglichen Anti-MMP-Wirkung zurückgewonnen. Die restlichen 50% gingen während des Säulen-Lade- und des Waschschritts verloren. Es zeigte sich somit, dass neutrale Bedingungen nur eine schwache Retention der eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Komponenten ermöglichen. Die schwache Retention der Komponenten beim Einsatz dieses chromatographischen Mediums lässt darauf schließen, dass es sich um polare oder ionische Komponenten handelt.
Schritt 3:
Nach mehrmaliger Wiederholung des obigen Verfahrens mit unterschiedlichen Proben des 20fach rekonstruierten Knorpelgewebeextrakts wurden die jeweils ersten Eluate zusammengeführt und in einer Speed-Vac-Zentrifuge verdampft. Die hierbei gewonnenen Feststoffe wurden in gereinigtem Wasser mit einer 200fachen Konzentration gegenüber dem Originalvolumen der eingesetzten 0– 500-Fraktion rekonstruiert. Nach der Ultraschallbehandlung und Zentrifugierung wurde der Überstand für den nächsten Reinigungsschritt aufbewahrt.
Schritt 4:
Unter neutralen Bedingungen wurde eine semipräparative HPLC-Separation der im Überstand vorhandenen biologisch wirksamen Komponenten mit niedriger Auflösung durchgeführt, wobei eine Novapack-C18HR-Säule (7,6 × 300 mm; Waters) zum Einsatz kam. Bei der verwendeten mobilen Phase handelte es sich um Natriumphosphat (0,01 M, pH 7)/Methanol (92 : 8). Die Fließrate und die Temperatur wurden bei 2 ml/min bzw. 30°C gehalten. Die erwähnte 200fach rekonstruierte Fraktion (100 μl) wurde auf die Säule injiziert und es wurden unter isokratischen Eluationsbedingungen und durch UV-Detektion (205 nm) 2-ml-Fraktionen gesammelt. Die Durchlaufzeit betrug dabei 30 Minuten. In Eluant-Fraktionen, die einer Retentionszeit von zwischen 11 und 13 Minuten entsprachen, wurden eine MMP-Wirkung aufweisende Komponenten gefunden.
Schritt 5:
Schritt 4 wurde mit unterschiedlichen 100-μl-Aliquots der 200fach rekonstruierten Fraktion wiederholt und die entsprechenden gewünschten Eluant-Fraktionen wurden zusammengeführt, verdunstet, mit gereinigtem Wasser zu einer 500fachen Konzentration im Vergleich zum Originalvolumen der eingesetzten 0-500-Fraktion rekonstruiert, mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Der Überstand wurde für den nächsten Reinigungsschritt aufbewahrt.
Schritt 6:
Am im Schritt 5 gewonnenen Überstand wurde eine semipräparative HPLC mit höherer Auflösung unter neutralen Bedingungen durchgeführt. Das Vorgehen für diese semipräparative HPLC mit hoher Auflösung entspricht demjenigen im oben angegebenen Schritt 4, wobei allerdings als mobile Phase Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7)/Methanol (97 : 3) eingesetzt wird. In Eluant-Fraktionen, die einer Retentionszeit von zwischen 23 und 27 Minuten entsprachen, wurden Komponenten mit Anti-MMP-Wirkung aufgefunden.
Schritt 7:
Nachdem der Schritt 6 wiederholt wurde, wobei die entsprechenden, wirksame Komponenten enthaltenden Eluant-Fraktionen zusammengeführt wurden und das Lösungsmittel verdampft wurde, um einen im wesentlichen festen Rückstand zu erhalten, wurde der Rückstand in Wasser mit einer 500- bis 2000-fachen Konzentration im Vergleich zum Originalvolumen der verwendeten 0–500-Fraktion rekonstruiert, einer Ultraschallbehandlung unterzogen und zentrifugiert und sodann für eine weitere Molekulargewichtsanalyse und eine Bestimmung seiner Anti-MMP-Wirkung aufbewahrt. Die biologisch wirksame Komponente wurde als "Æ-986" bezeichnet.
Verfahren 2:
Es wurde festgestellt, dass sich bei einem pH-Wert von 3 allgemein eine bessere Retention von Æ-986 am C18-Phasen-Chromatographiemedium beobachten ließ, woraufhin das SPE-Verfahren (obiger Schritt 2) sowie das (in den obigen Schritten 4 und 6 beschriebene) semipräparative Chromatographiesystem modifiziert wurden. Die im folgenden genannten Bedingungen ermöglichen den Einsatz einer stärkeren Waschlösung im SPE-Verfahren, was zur Gewinnung eines reineren Endextraktes führt und es ermöglicht, auf einen der semipräparativen Reinigungsschritte (Schritt 4 des Verfahrens 1) zu verzichten.
So wurden beispielsweise die Schritte 1 bis 3 des Verfahrens 1 wiederholt und der Schritt 4 durch den folgenden Schritt ersetzt:
Schritt 4:
Es wurde dieselbe SPE-C18-Säule wie im obigen Schritt 2 eingesetzt, wobei allerdings das Chromatographiemedium dreimal mit 2 ml Ammoniumformiat (0,01 M, pH 3) konditioniert wurde. 1 ml des im Schritt 3 (in dem der pH-Wert vor dem Laden der Proben mit Ameisensäure auf 3 eingestellt wurde) gewonnenen 200fach rekonstituierten Extrakts wurde auf die Säule geladen. Das Sorptionsmittelbett wurde dreimal mit 2 ml Ammoniumformiat/Methanol (90 : 10, bei pH 3) gewaschen. Es wurde eine Elution des Æ-986 mit 1 ml Methanol (100%) durchgeführt. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es offensichtlich, dass Fraktionen, die durch eine Methanol-Elution der Säule gewonnenen wurden, Wasser enthalten. Dementsprechend kann es sich bei dem Elutions-Lösungsmittel in diesem Schritt um ein anderes organischen Lösungsmittel, vorzugsweise um ein polares und/oder ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel handeln, wobei auch das Elutions-Lösungsmittel selbst Wasser enthalten kann.
Schritt 5:
Der Schritt 5 des Verfahrens 1 wurde wiederholt, wobei allerdings die rekonstruierte Anti-MMP-Fraktion in einer 4000-fachen Konzentration vorlag.
Schritt 6:
Dieser Schritt ist dem Schritt 6 des Verfahrens 1 identisch, wobei es sich allerdings bei der mobilen Phase um Ammoniumformiat/Methanol (75 : 25, pH 3) handelte.
Schritt 7:
Schritt 7 entspricht dem Schritt 7 des Verfahrens 1, wobei allerdings wiederum die im obigen Schritt 6 erwähnte 4000-fache Konzentration beibehalten wurde.
Verfahren 3:
Dieses Verfahren entspricht im wesentlichen dem Verfahren 2, wobei allerdings der pH-Wert des Formiatpuffers im Schritt 6 von sauer (pH 3) auf neutral (etwa pH 7) umgestellt wurde.
Verfahren 4:
Bei diesem Reinigungsverfahren wurde von Anfang an eine saure mobile Phase verwendet.
Schritt 1:
Der pH-Wert der ursprünglichen 0-500-Fraktion (bei einer einfachen Konzentration) wurde mit Ameisensäure auf pH 3 eingestellt und die Fraktion wurde sodann bei 2.200 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand fand in Schritt 2 Verwendung.
Schritt 2:
Der Überstand wurde auf eine SPE-C18-Cartridge (Supelco Nr. 5.-7136: Abmessungen 60 cm³, mit 10 g eines Feststoffphasenträgers bepackt) geladen, die unter sauren Bedingungen konditioniert worden war. Die Säule wurde mit 120 ml Methanol (100%) und 120 ml Ameisensäure (0,01 M, pH 3) konditioniert. Auf die Säule wurden 500 ml einfach gesäuerter Knorpelgewebeextrakt geladen und mit sechs Volumina von 100 ml Ameisensäure (0,01 M (pH 3)/Methanol 90 : 10) eluiert. Biologisch wirksame Komponenten fanden sich in den Eluant-Fraktionen 3, 4 und 5.
Schritt 3:
Die im Schritt 2 gewonnenen Eluantfraktionen 3, 4 und 5 wurden zusammengeführt und das Lösungsmittel so weit verdampft, bis ein nahezu trockener Rückstand verblieb. Die Fraktionen wurden sodann zu einer das 4000-fache der Originalkonzentration betragenden Konzentration verdünnt, um eine Æ-986 enthaltende Lösung herzustellen.
Schritt 4:
Das Æ-986 wurde auf einer präparativen HPLC-Säule in einem Ameisensäure-Puffer bei pH 3 gereinigt. Die Säule (Prodigy OSD-prep, 10 μ, 250 × 50 mm, von Phenomenex) wurde konditioniert und bei Zimmertemperatur eingesetzt. Die mobile Phase setzte sich aus Ameisensäure (0,01 M, pH 3)/Methanol (70 : 30) zusammen und die Fließrate betrug 45 ml/min. Auf die Säule wurden 4 ml der SPE-C18-Fraktion mit 4000-facher Konzentration injiziert und sodann in einem isokratischen Modus unter Einsatz der UV-Detektion (205 nm) von der Säule eluiert. Es wurden 60 Minuten lang im Minutentakt Fraktionen gesammelt, wobei das Æ-986 mit Anti-MMP-Wirkung zwischen der 33. und 36. Minute eluiert wurde.
Schritt 5:
Die eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Fraktionen wurden zusammengeführt und verdampft, um eine 10.000-fach konzentrierte Fraktion zu erhalten.
Schritt 6:
Dieser Schritt ist dem Schritt 6 des Verfahrens 2 identisch, wobei allerdings die mobile Phase aus Ameisensäure (0,01 M, pH 3)/Methanol (75 : 25) bestand. Es wurden 500-μl-Aliquots der 10.000-fach konzentrierten Fraktion auf die Säule geladen. Komponenten, die eine Anti-MMP-Wirkung aufwiesen, wurden zwischen der 21. und der 23. Minute eluiert.
Schritt 7:
Schritt 7 entsprach dem Schritt 7 im Verfahren 1. Hierbei wurde die im vorangegangenen Schritt 6 erwähnte 4.000-fache Konzentration beibehalten.
Gemäß Verfahren 1 gewonnene halbgereinigte Fraktionen: Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben zum ersten mal gezeigt, dass eine HPLC-gereinigte Fraktion (d. h. die aus dem beschriebenen Verfahren 1 resultierende Fraktion) Komponenten umfasst, die eine Anti-MMP-Wirkung besitzen. Die in der beschriebenen Weise gereinigten Komponenten zeigen zudem auch eine Anti- Tumor-Wirkung, wie dies im bereits beschriebenen in-vivo-Modell-LLC gezeigt wurde. Die Anti-Tumor-Wirkung wurde bestimmt, indem Tiere mit drei verschiedenen Konzentrationen der HPLC-gereinigten Fraktion behandelt wurden. Dabei wurde eine glockenförmige Dosis-Reaktionskurve mit einer maximalen Effizienz von etwa 50% (p < 0,005) für die 2,5-fach konzentrierte Dosis beobachtet (die Konzentration basierte auf einer 100%igen Rückgewinnung während der Reinigungsschritte und bezieht sich auf das Originalvolumen des Knorpelgewebeextrakts).
Da die Angiogenese- und Matrix-Metalloprotease-Wirkung eng mit der Tumorwucherung und Metastasenentwicklung zusammenhängt, ist es möglich, dass die HPLC-gereinigte Fraktion, die eine Anti-MMP-Komponente aufweist, für die Anti-Tumor-Wirkung verantwortlich ist. Somit stellen Komponenten, die diese Wirkung besitzen, ein potentielles Therapiemittel bei der Krebsbehandlung dar (Tolnay, E. et al, J. Cancer Res Clin. Oncol. 123: 652–658, 1997; Skobe, M., et al. Nature Medicine, 3: 1222–1227, 1997).
Halbgereinigte, gemäß Verfahren 4 gewonnene Fraktionen: Die in diesem Abschnitt behandelten Fraktionen wurden gemäß dem bereits beschriebenen Verfahren 4 erzeugt, wobei allerdings die Schritte 2) und 3) in der folgenden Weise durchgeführt wurden:
Schritt 2:
Der Überstand wurde auf eine SPE-C-18-Cartridge (Supelco Nr. 5.-7012: Abmessungen 3 cm³, bepackt mit 500 mg eines Feststoffphasenträgers) geladen, die unter sauren Bedingungen konditioniert worden war. Die Säule wurde mit 4 ml Methanol (100%) und 6 ml Ameisensäure (0,01 M, pH 3) konditioniert. 10 ml einfach gesäuerten Knorpelgewebeextrakts wurden auf die Säule geladen, dreimal mit 1,0 ml-Volumina Ameisensäure (0,01 M (pH 3)/Methanol 90 : 10) gewaschen und die biologisch wirksamen Komponenten wurden hieraus mit 1,0 ml Methanol eluiert.
Schritt 3:
Die biologisch wirksamen Komponenten enthaltende Eluantfraktion des Schrittes 2 wurde bis zur Trockenheit verdampft. Die Fraktionen wurden sodann zu einer das 40- oder 20-fache der Originalkonzentration betragenden Konzentration verdünnt, um eine Æ-986 enthaltende Lösung zu erhalten.
Alle aus diesem Verfahren resultierenden flüssigen Extrakte wurden auf eine Anti-MMP-Wirkung hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Gewinnung von spezifischen Haiknorpelgewebefraktionen, die eine Anti-MMP-Wirkung besitzen. Zudem können sowohl Lösungen, die wässrige Lösungsmittel, als auch solche, die organische Lösungsmittel enthalten, zur Herstellung der zumindest eine Anti-MMP-Wirkung aufweisenden Knorpelgewebeextrakte eingesetzt werden. Zwar zeigen sowohl die 0–500- als auch die 1–500-Fraktion eine Anti-MMP-Wirkung; Anti-MMP-Komponenten, die mit dem vorliegenden Verfahren gereinigt wurden, sind aber vor allem im 0–1-kDa-Bereich enthalten. Gleichartige Ergebnisse wurden in den entsprechenden 1 Gew.-/Vol.-% Saccharose enthaltenden Fraktionen beobachtet. Im übrigen lassen sich Fraktionen, die eine Anti-MMP-Wirkung besitzen, in effizienter Weise bei unterschiedlichen Verhältnissen von Knorpelgewebe zu gereinigtem Wasser gewinnen.
Bestimmung des Molekulargewichts der Anti-MMP-Komponente durch LC/MS
Es wurden fünf mehrdimensionale Chromatographiesysteme für die leichtere Bestimmung des Molekulargewichts von Haiknorpelgewebefraktionen durch Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) entwickelt. Die fünf Systeme sind jeweils in einer der folgenden Tabellen 8–12 dargestellt.
Die Experimente umfassen ein MS-Scannen des aufgeteilten (7 : 1) Chromatographiesäuleneluants sowie eine Sammlung von Fraktionen der Flüssigchromatographie zur Verwendung für die Bestimmung der Anti-MMP-Wirkung nach dem Durchlauf. Durch diese Beziehung zwischen Massenspektrometrie und biologischer Anti-MMP-Wirkung lässt sich speziell die Elutionsfraktion sowie die Retentionszeit der interessierenden Zusammensetzung für jedes verwendete Chromatographiesystem identifizieren.
Für die MS-Ermittlung negativer Ionen wurde vor der Einführung in die MS-Ionen-Quelle eine Lösung von Ammoniumhydroxid (0,75 Vol.-/Vol.-% bei 0,15 ml/min) zum Säuleneluant gegeben. Der sich ergebende pH-Wert des Gemisches lag zwischen 8 und 10, was die Bildung und Erfassung negativer Ionen bei der Massenspektrometrie verbessert.
Tabelle 8: Chromatographiesystem 1: Isokratisch, C18, neutrale Bedingungen (Ammonium-Formiat)
Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten Fraktionen wurde bewertet.
Tabelle 9: Chromatographiesystem 2: Gradient, C18, saure Bedingungen (Ammoniumformiat)
Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten Fraktionen wurde bewertet.
Tabelle 10. Chromatographiesystem 3: Isokratisch, C18, saure Bedingungen (Ammoniumformiat)
Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten Fraktionen wurde bewertet.
Tabelle 11. Chromatographiesystem 4: Gradient, NH₂, saure Bedingungen (Ammoniumformiat)
Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten Fraktionen wurde bewertet.
Tabelle 12. Chromatographiesystem 5: Isokratisch, C18, saure Bedingungen (Ammoniumazetat)
Die Anti-MMP-Wirkung der gesammelten Fraktionen wurde bewertet.
Die mehrdimensionalen chromatographischen Experimente wurden durchgeführt, indem man 100 μl der 500- bis 1000-fach konzentrierten gereinigten Phosphatendfraktion (die im Schritt 7 des Reinigungsverfahrens 1 gewonnen wurde) injizierte. Bei dieser Konzentration erhielt man im MS-Scan-Modus (Total-Ionen) kein starkes und klares Signal für Æ-986. Interessierende Peaks wurden entdeckt, indem man nach dem Durchlauf alle individuellen Ionensignale (100–1000 amu) im interessierenden Bereich (wirksame Fraktionen) überwachte.
Die Injektion gereinigter Fraktionen mit einer bis zu 2000-fachen Konzentration zeigte einen kleinen Peak im Total-Ionen-Chromatogramm sowie im den Æ-986 entsprechenden Base-Peak-Chromatogramm.
Im Detektionsmodus für positive Ionen (Tabelle 13) wurden im interessierenden Bereich (Æ-986) nur die Ionen 245 M + 1 und 227 eindeutig nachgewiesen. Im Hinblick auf den Aufbau und die Operationsweise der LCQ-MS ist die Beobachtung von Ionen, die einem Verlust eines Wassermoleküls entsprechen, sowie des Molekül-Ions (M + 1) bei einem eine Alkohol-Funktionsgruppe enthaltenden Analyt weder ungewöhnlich noch selten. Das Co-Elutionsprofil der Ionen 245 M + 1 und 227 sowie der Unterschied von 18 amu, der dem Verlust eines Wassermoleküls (N₂O) entspricht, lassen stark auf das Vorhandensein einer einzigen interessie renden Komponente mit einem Molekulargewicht von 244 schließen, wobei 245 der M + 1-Gattung im positiven Ionen-Modus entspricht.
Die 1 bis 4 zeigen Beispiele für Total-Ionen-Chromatogramme (TIC) sowie Einzel-Ionen-Chromatogramme (245 M + 1 m/e), die durch die Injektion von halbgereinigtem Æ-986 in unterschiedliche Chromatographiesystem gewonnen wurden. Die Analyse dieser Chromatogramme nach dem Durchlauf wies auf das Vorhandensein des Ions 245 (M + 1) in jeder der aus den unterschiedlichen Chromatographiesystemen gesammelten und Komponenten mit einer Anti-MMP-Wirkung enthaltenden Fraktionen hin.
Das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245 M + 1), die bei der Analyse von im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat, neutraler pH 7, isokratisch) isoliertem Æ-986 gewonnen wurden, sind in 1 gezeigt. Das Æ-986 wurde in Fraktionen entdeckt, die bei zwischen 13,5 und 15,0 Minuten gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 14,14 Minuten für die Elution des m/e-245-M + 1-Peak entspricht.
2 zeigt das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245 M + 1), die bei der Analyse des im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat, sauerer pH 3, gradient) isolierten Æ-986 gewonnenen wurden. Das Æ-986 wurde in Fraktionen entdeckt, die bei zwischen 16,5 und 17,0 Minuten gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 16,62 Minuten für die Elution des m/e-245-M + 1-Peak entspricht.
3 zeigt das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Ionen-Chromatogramm (245), die bei der Analyse des im HPLC-C18-System (Ammoniumformiat, sauerer pH 3, isokratisch) isolierten Æ-986 gewonnen wurden. Das Æ-986 wurde in Fraktionen entdeckt, die zwischen der 16. und 18. Minute gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 16,79 Minuten für die Elution des m/e-245 M + 1-Peak entspricht.
4 zeigt das Total-Ionen-Chromatogramm sowie das Einzel-Chromatogramm (245), die bei der Analyse des im HPLC-NH2-System (Ammoniumformiat, sauerer pH 3, gradient) isolierten Æ-986 gewonnen wurden. Das Æ-986 wurde in Fraktionen entdeckt, die zwischen der 14. und 16. Minute gesammelt wurden, was einer Retentionszeit von 14,28 Minuten für die Elution des m/e-245-Peak entspricht.
Nur im negativen Modus (Tabelle 14) wurden im interessierenden Bereich (Æ-986) in allen bewerteten Chromatographiesystemen Ionen 243 und 289 entdeckt, wobei wiederum die perfekte Co-Elution dieser beiden Ionen die Bildung eines Formiat-Addukts am Ion 243 nahelegt. Dieses Phänomen wird häufig bei negativen Ionen beobachtet, wenn Ammoniumformiat als Puffer in der mobilen Phase zum Einsatz kommt. Dies wurde bewiesen, indem der Ammoniumformiatpuffer bei gleichbleibendem pH-Wert durch einen Ammoniumazetatpuffer ersetzt wurde. Die mobile Ammoniumazetatphase wurde nach der Säule mit einer Ammoniumhydroxidlösung alkalisiert, ehe die MS-Detektion durchgeführt wurde. Beide Systeme zeigten ein klares Signal für das Ion 243, während das Ion 289 nur im Formiatsystem und ein neues Ion (303), das einem Azetat-Addukt entspricht, im zweiten Chromatographiesystem entdeckt wurde. Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass die Æ-986-Komponente ein Molekulargewicht von etwa 244 amu besitzt (wobei 243 der M-1-Gattung im negativen Ionenmodus entspricht).
Empirische Formelbestimmung sowie teilweise Strukturbestimmung von Æ-986
Empirische LC-MS-Formel-Bestimmung: Zur Gewinnung von Informationen über die Struktur von Æ-986 wurde die Massenspektrometrie eingesetzt. In der Tabelle 15 sind die Bedingungen bei der LC-MS-Analyse von Æ-986 zusammengefasst.
Tabelle 15. Für die empirische teilweise LC-MS-Formelbestimmung eingesetzte Chromatographiebedingungen
Die Bestimmung des Isotopverhältnisses von 247, 246, 245 wurde in einem Zoom-Scan-Modus durchgeführt, um die Präzision bei der Ablesung schwacher Signale dieser Ionen zu erhöhen. Die ermittelten Isotop-Verhältnisse für das Ion 246/245 (A + 1-Typ) und 247/245 (A + 2-Typ) sind weiter unten im Tabellenformat dargestellt.
Das Verhältnis von 5,9% der m/e-247/245-Peak-Höhen (Isotopverhältnis A + 2) weist stark auf ein Vorhandensein eines Schwefelatoms und weniger Sauerstoffatome im Molekül hin.
Das Isotopverhältnis von 11,8% für die A + 1-Elemente (m/e 246/245 Peak-Höhe) kann auf bis zu 10 Kohlenstoffatome oder ein Gemisch aus Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel (1) am Molekül verweisen.
Mit einem Molekülgewicht von 244 amu kann bei diesem Molekül nur eine gerade Anzahl an Stickstoffatomen (0, 2, 4) vorhanden sein.
LC/MSn-Struktur-Bestimmung: Eine teilweise Bestimmung der Struktur von Æ-986 erfolgte mit Hilfe der Durchführung von Tandem-Massenspektrometrie-Experimenten.
Tabelle 16. Im folgenden erläuterte Chromatographiebedingungen beim MSn-Experiment
An positiven Ionen für das Molekül-Ion 245 m/e (M + 1) durchgeführte Tandemmassenspektrometrie-Experimente (MS/MS-Experimente) zeigten Verluste von 18 amu (m/e 227.1) und 36 amu (m/e 209) (minor). Diese Verluste entsprechen dem Verlust von einem oder zwei Wassermolekülen (–H₂O bzw. –2H₂O), was auf das Vorhandensein einer Alkohol- und/oder Diol-Hälfte in Æ-986 hinweist. Das tatsächliche MS/MS-Spektrum ist in 5 gezeigt.
Ein am m/e-227-Ion durchgeführtes MS/MS-Experiment ergab ein komplexes Spektrum mit vielen charakteristischen Fragmenten der chemischen Struktur von Æ-986. Die in diesem Spektrum erscheinenden Fragmente könnten dabei aus der Fragmentierung des m/e-227-Ions und/oder aus der Fragmentierung anderer intensiver Ionen stammen, die in diesem Spektrum erscheinen (d. h. m/e 166 stammt aus der Fragmentierung des 209-Ions). Dementsprechend wurden weitere MS/MS-Experimente an ausgewählten Fragmenten des m/e-227-Ions durchgeführt. Das dabei gewonnene MS/MS-Spektrum ist in 6 dargestellt.
Ein MS/MS-Experiment am 209 m/e-Ion (M + 1 – 2H₂O) basiert auf dem Verlust von 60 amu, wodurch man m/e 149 erhält, was für den Verlust einer Karboxylsäurehälfte (– CH₃COOH) charakteristisch ist.
Das Ion 149 m/e (M + 1 – 2H₂O – CH₃COOH) wurde sodann mit Hilfe von MS/MS nochmals analysiert, wobei man die folgenden Fragmente erhielt: m/e 105, 115, 116 und 134. Der Verlust von 15 von 149 auf 134 entspricht mit größter Wahrscheinlichkeit dem Verlust von CH₃. Der Verlust von 33 und 34 ist charakteristisch für den Verlust von SH bzw. H₂S und weist somit stark auf das Vorhandensein einer schwefelhaltigen Gruppe (Thiol oder Thioäther) im Æ-986 hin. Der Verlust von 44 von m/e 149 auf 105 kann auf den Verlust mehrerer unterschiedlicher Gruppen zurückgeführt werden.
Strukturbestimmung durch chemische Derivatbildung: Das Æ-986 wurde Bedingungen unterworfen, wie sie normalerweise für die Esterbildung bei Karboxylsäuren eingesetzt werden, worauf weiter unten noch detaillierter eingegangen wird.
Methylation (HCl/Methanol)
Zur Methylation gereinigter Fraktionen wurden von den Erfindern dieser Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion (4000fach) von Æ-986 verdampft und dieser in einer geschlossenen Phiole 100 μl eines Gemisches aus HCl (12 N): MeOH/(1 : 99) zugegeben. Das Gemisch wurde 60 bis 90 Minuten lang bei 45°C inkubiert und sodann bis zur Trocknung verdampft und in 100 μl Wasser aufgelöst. Diese Lösung wurde entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Strukturbestimmung injiziert.
Methylation (BF₃/Methanol)
Zur Methylation gereinigter Fraktionen verdampften die Erfinder dieser Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion (4000-fach) von Æ-986 und fügten 100 μl einer BF₃/Methanollösung in einer geschlossenen Phiole hinzu. Das Gemisch wurde 60 bis 90 Minuten lang bei 45°C inkubiert und sodann bis zur Trocknung verdampft und mit 100 μl Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Strukturbestimmung injiziert.
Verdünnung von gereinigten Fraktionen (4000fach)
Zur Verifizierung der Rückgewinnung bei der Derivatbildung verdünnten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung 15 μl einer gereinigten Fraktion (4000fach) von Æ-986 mit 85 μl Wasser. Die verdünnte Lösung wurde entsprechend den Chromatographiebedingungen für die LC/MS-Bestimmung analysiert.
Ergebnisse
Die einstündige Derivatbildung der Æ-986-Komponente mit BF₃/Methanol bzw. H+/Methanol bei 45°C führte zu einem mehr als 95%igen Verschwinden ihres Chromatographiesignals, wobei die Signalstärke bei der erwarteten Retentionszeit für Æ-986 bestimmt wurde. Beide Reaktionen sind für die Umwandlung von Karboxylsäure in ihre entsprechenden Methylester bereits bekannt. Die Methylisierung verursacht einen Anstieg im Molekulargewicht von Æ-986 sowie eine Verlängerung seiner Retentionszeit am Chromatographiesystem. Die Konzentration der dabei erzeugten Æ-986-Derivate ermöglichte keine Detektion des derivierten Produkts.
Physiochemische Eigenschaften: Das Vorhandensein einer schwachen sauren Funktionsgruppe, etwa einer Karboxylsäure, am Æ-986 wurde durch den Anstieg der Retentionszeit des Æ-986 auf der HPLC-C18-Säule bestätigt, wenn der pH-Wert des Formiatpuffers von 7 auf 3 gesenkt wurde. Dies weist stark darauf hin, dass im Æ-986 eine einen pKa-Wert von wenigstens etwa 4 aufweisende Hälfte vorhanden ist.
Wenn im Æ-986 eine Thiol- oder Thioäther-Funktionsgruppe vorhanden ist, wie dies durch die MS/MS-Daten nahegelegt wird, so beeinflusst dies die Rückgewinnung von Æ-986 aus der 0–500-Fraktion und dem Knorpelgewebe. Es ist wahrscheinlich, dass nur der freie Thiol-Anteil des Æ-986 durch das vorliegende Verfahren extrahiert werden kann, da Thiole dazu neigen, in einer Lösung Disulfidbindungen (S=S) mit anderen schwefelhaltigen Molekülen (etwa Proteinen, Peptiden, Aminosäuren) auszubilden. Die Bildung eines Disulfid-Addukts verändert im allgemeinen die physiochemischen Eigenschaften der Thiol-Gruppen enthaltenden Moleküle und wirkt sich auf ihre Gewinnung durch Extraktion aus. So ist es möglich, dass ein Disulfid-Addukt von Æ-986 durch direkte Extraktion der 0–500-Fraktion (20fach) nicht isoliert werden kann. Die Bildung von Disulfid-Addukten des Æ-986 lässt sich durch eine fünfzehnminütige Behandlung der das Æ-986 enthaltenden Lösungen mit Tributhylphosphamid bei pH 7 und bei Zimmer temperatur vor der Extraktion, insbesondere bei Lösungen mit dem pH-Wert 3 (SPE C18 pH 3) minimieren. Andere Reagenzien, die Disulfidbindungen auftrennen, wie Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol, lassen sich ebenfalls einsetzen, um die Bildung von Disulfid-Addukten von Æ-986 zu minimieren.
Die beschriebenen Verfahren zur Gewinnung und Isolierung biologisch wirksamer Substanzen aus Hai-Knorpelgewebe lassen sich für jede beliebige Knorpelgewebequelle einsetzen, um (1) Fraktionen zu extrahieren, die die gewünschten biologischen Wirkungen aufweisen, und (2) spezifische Komponenten zu extrahieren, die diese biologischen Wirkungen besitzen.
Da die vorliegende Erfindung lehrt, dass biologisch wirksame Komponenten aus Knorpelgewebe in einer Vielzahl unterschiedlicher hydrophiler Lösungsmittel extrahiert werden können, lassen sich die genannten Verfahren so anpassen, dass sie auch zur Extraktion biologisch wirksamer Komponenten aus dem Knorpelgewebe anderer Spezies eingesetzt werden können. Jede aus einem Knorpelgewebematerial, vorzugsweise aus Hai-Knorpelgewebe, isolierte Komponente, die 1) ein biologisches Wirkprofil aufweist, das demjenigen der Æ-986-Komponente ähnlich oder identisch ist und/oder 2) eine Masse von 244 amu besitzt, liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung wurde hier unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsbeispiele beschrieben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet ist durchaus in der Lage, Modifikationen vorzunehmen, ohne von den obigen Lehren abzuweichen, wobei derartige Modifikationen innerhalb der durch die beigefügten Ansprüche bestimmten Reichweite der Erfindung liegen.

Claims

Verfahren zur Gewinnung einer Komponente aus Knorpelgewebe, umfassend die folgenden Schritte: a) Behandeln von Knorpelgewebematerial mit einer bestimmten Menge einer organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung zur Herstellung eines ersten Gemisches, welches eine in dieser Lösung lösliche Knorpelgewebekomponente enthält, wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel wahlweise um Ethanol oder Methanol handelt und wobei das organische Lösungsmittel in der Extraktionslösung in einem Anteil von 1 bis 100 Vol.-% vorliegt; sowie b) Separieren des ersten Gemisches zur Herstellung eines die lösliche Komponente enthaltenden ersten flüssigen Extraktes sowie einer ersten Feststoffmasse, wobei die lösliche Komponente eine Anti-Matrix-Metalloprotease- und/oder eine Anti-Tumor- und/oder eine anti-angiogene Wirkung besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Entfernen einer ausreichenden Menge von Flüssigkeit aus dem ersten flüssigen Extrakt zur Herstellung einer im wesentlichen trockenen zweiten Feststoffmasse; b) Behandeln der zweiten Feststoffmasse mit Wasser zur Herstellung eines zweiten Gemisches; und c) Separieren des zweiten Gemisches zur Herstellung eines flüssigen Endextraktes und einer dritten Feststoffmasse, wobei der flüssige Endextrakt die lösliche Komponente enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend den folgenden Verfahrensschritt: Entfernen im wesentlichen des gesamten organischen Lösungsmittels aus dem ersten flüssigen Extrakt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Separierung des ersten Gemisches durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren und/oder Dialyse und/oder Feststoff-Sedimentation mit anschließender Entfernung eines Überstandes erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Entfernung der Flüssigkeit durch Verdampfung und/oder Liophilisation und/oder Destillation und/oder azeotrope Destillation und/oder Desikkation und/oder Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktion und/oder Zugabe eines Absorptionsmittels für organisches Lösungsmittel und/oder Rotationsverdampfung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend den folgenden Verfahrensschritt: Homogenisierung des Knorpelgewebematerials vor, während oder nach seiner Behandlung mit der organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Homogenisierung durch ein oder mehrere physikalische oder chemische Mittel erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend die folgenden Verfahrensschritte: a) Behandeln der ersten Feststoffmasse mit einer bestimmten Menge einer organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung zur Herstellung eines zweiten Gemisches, welches eine lösliche Knorpelgewebekomponente enthält; und b) Separieren des zweiten Gemisches zur Herstellung eines die lösliche Komponente enthaltenden zweiten flüssigen Extrakts sowie einer zweiten Feststoffmasse.
Verfahren nach Anspruch 8, zusätzlich enthaltend die folgenden Verfahrensschritte: a) Behandeln der zweiten Feststoffmasse mit einer bestimmten Menge einer organisches Lösungsmittel enthaltenden Lösung zur Herstellung eines dritten Gemisches, das eine lösliche Knorpelgewebekomponente enthält; und b) Separieren des dritten Gemisches zur Herstellung eines die lösliche Komponente enthaltenden dritten flüssigen Extrakts sowie einer dritten Feststoffmasse.
Verfahren nach Anspruch 9, zusätzlich enthaltend den folgenden Verfahrensschritt: Kombinieren des ersten, zweiten und dritten flüssigen Extrakts zur Herstellung eines flüssigen Gesamtextrakts.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lösliche Komponente vom ersten flüssigen Extrakt isoliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei es sich bei dem Knorpelgewebematerial um Hai-Knorpelgewebe handelt.
Biologisch wirksame Komponente, die sich durch das Verfahren gemäß Anspruch 12 gewinnen lässt.
Einsatz einer biologisch wirksamen Komponente gemäß Anspruch 13 bei der Herstellung eines Medikaments, welches eine Anti-Matrix-Metalloprotease- und/oder eine anti-angiogene und/oder eine Anti-Tumor-Wirkung besitzt.