DE3323093A1 - Pharmazeutisches praeparat - Google Patents

Description

PHARMAZEUTISCFIES PRÄPARAT

Die Erfindung betrifft einen pyridinlösliichen Extrakt aus Mikroorganismen, der in Verbindung mit Zellwandgerüst (CWS) und Trehalosedimycolat "(TDM) ein pharmazeutisches Präparat mit antijtumoralen Eigenschaften ergibt. ;

Mit Bakterien wie. z.B. Corynebacterium ibarvum wurden Versuche angestellt, um diejenigen Komponenten zu isolieren und kennzeichnen, welche die Hemmung des Tumorwachstums bewirken (s. z.B. An^i Tumor Ac-ti vity and Lymphoreticular Stimulation Properties of

ι Fractions Isolated from C. parvum;,Cantgell, et al, Cancer Research, Band 39, S. 3554-3563, -'September 1979). Abgesehen von seiner antitumoralen Wirkung hat sich der C. parvum als wirkungsvolles Stimulans des lymphoreticularen Systems, welches gu unerwünschter Gewichtszunahme der Milz und der Leber und zu Blastogenese führt, erwiesen. Es wurde herausgefunden, daß ein pyridinlöslicher Extrakt aus einem Mikroorganismus hohe antitumorale Eigenschaften ahne die mit den bekannten Erzeugnissen verbundenen unerwünschten toxischen "Wirkungen aufweist.

Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der ^normalerweise darin enthaltenden Proteine und Lipide entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactarimucopeptid, das Trehalosemycplatreste ("P3") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterden M. smegmatis, M.phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M.kansasii, M.tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B) ,

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und M.bovis·Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur aus diesen.. Außerdem kann es auch noch aus anderen Mikroorganismen wie E.coli, B.abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.

Das Zellwandgerüst kann hergestellt werden, indem man zuerst Bakterien, wie z.B. M.bovis Stamm BCG (bacillus Calmette-Guerin) züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-I)) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen (z.B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin ) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält.

Trehalosedimycolat (TDM) kann aus Organismen wie z.B. M.avium, M.phlei, M.tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M.bovis. BCG, M.smeqmatis, M.kansasii, Nocardia rubra, M.bovinis und Corynebacterium diphtheriae hergestellt werden.

Die Bakterien/ wie z.B. M.avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliehe Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Compositions of Cell Wall Skeleton and Component P-.; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silicagel

- 5 gereinigt werden.

Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitstellung eines pharmazeutischen Präparats, das einen pyridinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus in Verbindung mit Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat enthält.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Tumorbehandlung von Warmblütern und Menschen unter Verwendung des den aus einem Mikroorganismus erhaltenen pyridinlöslichen Extrakt, Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat enthaltenden Präparats.

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat aus einem aus einem Mikroorganismus erhaltenen pyridinlöslichen, zwischen etwa 7 und 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 16 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 55 Gew.-% Fettsäuren enthaltenden Extrakt, Zellwandgerüst (CWS) und Trehalosedimycolat (TDM). Der .Extrakt enthält vorzugsweise etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren.

Zur Herstellung des pyridinlöslichen Extraktes können alle Mikroorganismen einschl. M.bovis BCG, M.phlei, M. smeqmatis, M.kansasii, Nocardia rubra, Corvnebacterium diphtheriae und Corynebacterium parvum verwendet werden. Corynebacterium parvum ist besonders vorzuziehen.

Vollzellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das erhaltene Gemisch wird abgetrennt, um eine Überstandsfraktion enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand

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kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extraktes unterzogen werden.

Nachfolgend wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete Flüssigkeit,wie z.B. destilliertes Wasser, dialysiert. Das Fehlen von Vollzellen oder Zellfragmentverunreinigungen wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene gereinigte Extrakt kann anschließend nach bekannten Verfahren lyophilisiert werden,um ein beständiges Produkt zu erhalten.

Der erfindungsgemäß hergestellte pyridinlösliche Extrakt kann mit CWS und TDM kombiniert werden,um so ein Präparat mit hoher antitumoraler Wirkung zu ergeben, das keine Milz- und Lebervergrößerungen verursacht.

Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderem Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore, z.B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z.B. Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzell-Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden.

Das Präparat wird vorzugsweise durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z. B. in einer Öltröpfchenemulsion, unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen direkt in den Tumor verabreicht. Das besagte Präparat kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.

Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einfachen Injektion für die Behandlung von-Tieren liegt zwischen etwa 375 und 2500 Aig/ml. Die Menge an CWS und TDM beträgt je zwischen etwa 125 und 375 /ag/ml.

Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor zu injizierenden Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird.

Dosis bei Tieren je' nach Tumorgr'öße

Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden biologischen Präparats

0-1 bis zu 0,5 ml

1-2 0,5 bis 2,5 ml

2-3 2,5 bis 5 ml

3-5 5 bis 10 ml

5-8 IO bis 15 ml

größer als 8 15 bis 20 ml

Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 40 mg an pyridinlöslichem Extrakt, 40 mg CWS und 6 mg TDM. Die Behandlung sieht bis zu sechs, in 2-Wochenintervallen zu verabreichende Injektionen vor.

Die Verabreichung des erfindungsgemäßen' Präparats einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z.B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 200 und 5000/ig, vorzugsweise zwischen etwa 800 und 1200 Xig. Die Menge an CWS beträgt zwischen etwa 50 und 2000 Aig, während die Menge an TDM zwischen ungefähr 50 und 1000 üg liegt. Die bevorzugte Menge an CWS und

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TDM pro Injektion beträgt je zwischen etwa 475 und yug. Bei sämtlichen obengenannten Dosierungsmengen wird von der Verabreichung an einem Durchschnittscrwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal etwa einmal wöchentlich verabreicht.

Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Öltropfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr O,75 "nd 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt zwischen etwa 0,02 und 0,25 Vol.-%, und die bevorzugte Menge liegt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Es können alle üblichen Detergentien, wie z.B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Atlas Chemical Company) , verwendet werden.

Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit Wirkstoffen überzogenen ÖltrÖpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte Erfindung nicht ein.

Beispiel 1

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus Corynebacterium Parvum

Corvnebacterium parvum (P.acnes, Stamm 4182) wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten wurde. Die Paste wurde anschließend mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 Gramm (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden mit 200 nil reinem Pyridin gemischt und bei 4°C während einer Stunde mit der 1700-fachen

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Erdbeschleunigung g (9,81 m/s ) zentrifugiert. Ein pyridinlöslieher Extrakt wurde als Überstandsfraktion entfernt.

Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, extrahiert. Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von Whatman No. 1-Papier wurden die Pyridin-Fraktionen vereinigt, und das Lösungsmittel durch Verdampfung bei 50°C in einem Buchi-Rotationsverdampfer (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) entfernt. Der getrocknete Pyridin-Extrakt wurde eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene gereinigte Pyridin-Extrakt enthielt etwa 12 Gew.~% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren. Der Extrakt wurde elektronenmikroskopisch untersucht, und es wurde festgestellt, daß er frei von Verunreinigungen in Form von Vollzellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichem Extrakt betrug 9% (8,1 g).

Beispiel 2

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus M.bovis Stamm BCG,

M. bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei 37°C während etwa 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine gewaschene Vollzellpaste erhalten wurde, 50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt in einer Ausbeute von 7% (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt enthielt 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew.-% Fettsäuren.

Beispiel 3

Versuche an Guinea-Schweinen mit Line-10 Tumor

Sechs Schweinen vom 2-Guinea-Stamm mit Line-10 Tumorgewächsen mit einem Durchmesser von etwa 9 mm wurde einmal eine Injektion mit 0,4 ml einer sterilen Öltropfchenemulsion, d.h. mit Drakeol 6 VR Mineralöl (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), enthaltend 300 ^Ug des gemäß Beispiel 1 hergestellten pyridinlöslichen Extraktes, 50/ng Zellwandgerüst und 50 /ag Trehalosedimycolat direkt in das Tumorgewebe verabreicht.

Nach Ablauf von 3 Monaten wurden die Tiere untersucht, wobei bei 5 der 6 Tiere eine totale Rückbildung des Tumorwachstums festgestellt wurde.

Bei Kontrollexperimenten wurde sechs Schweinen vom ■ 2-Guinea-Stamm, die mit Line-10 Tumorwachstum mit einem Durchmesser von etwa 9 mm befallen waren, einmal eine Injektion mit 0,4 ml der oben beschriebenen Oltropfchenemulsxon ohne Pyridin-Extrakt oder ohne Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat direkt in das Tumorgewebe verabreicht. Bei keinem der 6 Schweine konnte auch nur das geringste Anzeichen einer Tumorrückbildung nach 3 Monaten festgestellt werden.

Claims (5)

FDNER .:.. ;EB-,E-1.MS_-H_AUS FINCK PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÖNCHEN 95 RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC. 27. Juni 1983 DEAA-31160.4 PHARMAZEUTISCHES PRÄPARAT Patentansprüche

1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch
gekennzeichnet , daß es eine therapeutisch wirkungsvolle Menge an gereinigtem, aus
Mikroorganismen erhaltenem, pyridinlöslichem Extrakt
mit zwischen etwa 7 und 20 Gew.-% Protein, zwischen
etwa 10 und 16 Gew.-% Zucker und zwischen etwa 35 und 55 Gew.-% Fettsäuren, Zellwandgerüst, Trehalosedimycolat und einen pharmazeutisch geeigneten Träger
enthält.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet , daß der Extrakt aus
den Mikroorganismen M. bovis BCG, M.phlei, M. smeqmatis, M.Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae oder Corynebacterium parvum, vorzugsweise aus Corynebacterium parvum, erhalten wird.

3. Präparat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt etwa 12 Gew.-% Protein., etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren enthält und daß ferner
die Menge an pyridinlöslichem Extrakt und an Zellwandgerüst je bis zu etwa 40 mg und die Menge an
Trehalosedimycolat bis zu etwa 6 mg beträgt, wobei

das Präparat in lyophilisierter Form oder in Form einer Oltröpfchenemulsion vorliegt.

4. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß es sich bei dem Öl um ein leichtes Mineralöl, Squalan/ Squalen/ 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl oder Drakeol 6VR Mineralöl handelt, wobei das Öl in einer Menge von zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats, vorliegt.

5. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Detergens in einer Menge von zwischen etwa 0,02 und 0,25 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats, zwischen etwa 200 und 5000 Aig pyridinlöslichen Extrakt, Zellwandgerüst in einer Menge von zwischen etwa 50 und 2000 /ag und Trehalosedimycolat in einer Menge.von zwischen etwa 50 und 1000 yug enthält.