DE3318567C2

DE3318567C2 - Therapeutisches Mittel, enthaltend gereinigtes, entgiftetes Endotoxin, Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat

Info

Publication number: DE3318567C2
Application number: DE3318567A
Authority: DE
Inventors: John Leonard Hamilton Mont. Cantrell; Edgar Ernst Hamilton Mont. Ribi; Steven Marc Stevensville Mont. Schwartzman
Original assignee: Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, Mont.
Priority date: 1982-05-26
Filing date: 1983-05-20
Publication date: 1987-01-29
Also published as: FR2527443B1; DE3318567A1; GB2122083A; IT8321288A0; GB2122083B; JPS6256135B2; FR2527443A1; CA1217136A; JPS58222025A; IT1164243B; GB8313053D0; US4436728A

Abstract

Es werden eine pharmazeutische Zusammensetzung aus gereinigtem, entgiftetem Endotoxin, Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat, die bei der Behandlung von Krebstumoren wirksam ist, sowie Verfahren zur Anwendung der Zusammensetzung für diese Zwecke vorgeschlagen.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein pharmazeutisches Mittel, enthaltend gereinigtes, entgiftetes Endotoxin (RDE), Zellwandgerüst (CWS) und Trehalosedimycolat (TDM). Das in dem erfindungsgemäßen Mittel verwendete RDE ist dadurch gekennzeichnet, daß es kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, zwischen 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält. Dieses Mittel ist bei der Remission und/oder Rückbildung von Krebstumoren in Warmblütern wirksam.
Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaciae einschließlich verwandte Organismen und Mutanten erhalten werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immunotherapie bei verschiedenen immunogenen Tumoren (s. Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig-Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen hoch toxisch, weshalb ihre Verwendung bei der Behandlung von Krebstumoren eingeschränkt ist. Es sind Versuche unternommen worden, die Endotoxine zu entgiften, ohne deren tumorrückbildende Eigenschaft zu beeinträchtigen. Wie von Ribi, et al, aufgezeigt, führten die zur Entgiftung von Endotoxin bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung seiner Adjuvantizität bekannten chemischen Verfahren, wie z. B. Succinylierung und Phthalylierung zum Verlust sowohl der Endotoxizität als auch der tumorrückbildenden Eigenschaften. Demzufolge blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eines Endotoxinprodukts mit hoher tumorrückbildender Eigenschaft und geringer oder keiner Toxizität ohne Erfolg.
Die Kombination von Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat ist bekannt (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. 11 Supression and Regression of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma; Meyer, et al, Journal of the National Cancer Institute, Band 52, Nr. 1, januar 1974, und Mycobacterial Cell Wall Components in Tumor Supression and Regression; Ribi, et al, National Cancer Institute Monograph Nr. 39, S. 115-120, Oktober 1972).
Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin enthaltenen Proteine und Lipide entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmucopeptid, das Trehalosemycolatreste ("P3") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Aoyoma B), und M. bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur diesen. Außerdem kann es auch noch aus Nicht-Mycobakterien wie E. coli, B. abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.
Das Zellwandgerüst wird hergestellt, indem man zuerst Bakterien, wie z. B. M. bovis, Stamm BCG (bacillus Calmette-Guerin) züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-1)) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzymatischen Behandlungen (z. B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält.
Trehalosedimycolat (TDM) kann aus Organismen wie z. B. M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra und Corynebacterium diphtheriae hergestellt werden.
Die Bakterien, wie z. B. M. avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. 1. lsolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P&sub3;; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1975). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silikagel gereinigt werden.
Die wie oben beschrieben hergestellten CWS- und TDM-Komponenten können in Form einer Öltröpfchenemulsion zur Herstellung eines antitumoral wirksamen injizierbaren Mittels verwendet werden (s. Immunotherapy with Non-viable Microbial Components; Ribi, et al; Annals of the New York Academy of Science, Band 227, S. 228-238, 20. September 1976).
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, das gereinigtes, entgiftetes Endotoxin, Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat enthält und das bei der Behandlung von mit Krebs befallenen Geweben bei Warmblütern und Menschen wirksam ist.
Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, das diese Komponenten enthält, wobei die schädlichen Nebenwirkungen, die normalerweise mit Endotoxinen verbunden sind, eliminiert werden.
Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.
Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin (RDE) verwendeten Typs können, wie eingangs bereits erwähnt, aus Enterobacteriaciae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen:
Salmonella, Shigella, Escherichia, Bruccella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.
Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:
S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni und S. abortus equi.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte können durch eines der nachfolgenden bekannten Verfahren hergestellt werden:

1) Webster, M. E., Sagin, J. F., Landy, M., and johnson, A. G., J. Immunol. 1955, 744, 55.
2) Westphal, 0., Luderitz, 0., and Bister, F., Z. Naturforsch, 76 148 (1952).
3) Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides in Biology Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N. J. Madison printing Co., 1957, 115.
4) Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur. J. Biochem, 9 245 (1969).
5) Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N., Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis 128 543 (1973).
6) Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., Milner, K. C., The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961).
7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1967).
8) Ribi, E., Milner, K. C., and Perrine, T., J. Immunol. 82 75 (1959).

Das von Chen et al beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, stellt die bevorzugte Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extraktsdar.
Das Methanol-Chloroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und anschließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid A mit verringerter Toxizität und Pyrogenizität, verglichen mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin, zu erhalten. Das erhaltene Material wird daraufhin mit einem Lösungsmittel behandelt, welches fähig ist, besonders Fettsäuren und andere Verunreinigungen, jedoch nicht das Roh-Lipid A, zu lösen. Der Phosphatgehalt im entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen Endotoxin festgesteIlten Konzentration, was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen von Endotoxinen in Beziehung steht.
Die für die Reaktion mit MCP bevorzugt verwendeten anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure; die bevorzugten organischen Säuren sind Toluolsulfonsäure oder Trichloressigsäure. Die Reaktion kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen etwa 90°C und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen etwa 15 und 60 Minuten, durchgeführt werden.
Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann durch Reaktion des Ausgangsmaterials mit der Säure in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Ethanol erfolgen.
Das erhaltene Roh-Lipid A wird in Aceton, dem bevorzugten Lösungsmittel zur Lösung von Fettsäuren und anderen Verunreinigungen, gelöst. Das Lösungsmittel wird daraufhin entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin zu erhalten.
Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und die Lösung durch eine geeignete Chromatographiesäule, wie z. B. eine Molekularausschluß-Chromatographiesäule, geschickt, um die RDE-Fraktionen abzutrennen, welche nach der Entfernung des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung in Anwesenheit eines Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Aceton, Pyridin, Ether, Essigsäure oder Gemische davon, durch eine Sephadexsäule geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt aber vorzugsweise im Bereich zwischen Atmosphärendruck und 70 N/cm², und die Fließgeschwindigkeit liegt etwa zwischen 0,1 und 10 ml/Min.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt. Die Fließgeschwindigkeit wird zwischen etwa 2 und 15 ml/Min. gehalten. Die Lösungsmittel sind ebenfalls die gleichen, wie sie bei der Sephadexsäule verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diethylamin in einer Konzentration bis zu etwa 1% zugegeben werden kann.
Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die Lösung durch eine Niederdruck-60-Säule mit Silikagelteilchen mit einer Teilchengröße zwischen ungefähr 25 µm und 63 µm unter Verwendung eines Lösungsmittels aus Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniumhydroxyd geschickt. Das bevorzugte Volumenverhältnis der Lösungsmittelkomponenten beträgt etwa 50:25:4:2.
RDE, CWS und TDM werden miteinander kombiniert, um eine Zusammensetzung mit hoher antitumoraler Wirksamkeit zu erhalten. Mit dem erfindungsgemäßen Mittel können unter anderem Krebsarten, wie die folgenden tierischen Tumore, z. B. Rinder-Schuppenzell-Carcinom, Rinder-Fibrosarcom, Pferde-Sarcoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Carcinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z. B. Brusttumore, Lungentumore, Coleo-Rectal-Tumor, malignes Melanom, Schuppenzell-Carcinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden. Das Mittel wird durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z. B. in einer Öltröpfchenemulsion, verabreicht. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung direkt in den Tumor unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen. Es kann beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
Die RDE-Menge in einer einfachen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen etwa 6,25 und 250 µg/ml. Die Menge an CWS beträgt zwischen 125 und 750 µg/ml und die des TDM ebenfalls zwischen etwa 125 und 250 µg/ml. Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor injizierten Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird. Dosis bei Tieren je nach Tumorgröße
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 1500 µg RDE, etwa 4500 µg CWS und etwa 1500 µg I DM. Die Behandlung sieht bis zu 5, in 1-Wochenintervallen verabreichte Injektionen vor.
Die Verabreichung des RDE-CWS-TDM-Mittels in einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z. B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an RDE bzw. CWS in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 50 und 1000 µg. Die Menge an TDM in einer Injektion kann zwischen etwa 50 und 300 µg betragen. Die bevorzugte Dosierung an RDE und TDM liegt im Bereich zwischen etwa 125 und 175 µg, während die bevorzugte Dosierung an CWS zwischen etwa 275 und 325 µg beträgt. Bei sämtlichen obengenannten Dosierungsmengen für RDE, CWS und TDM wird vor der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal einmal wöchentlich verabreicht. Gewöhnlich empfiehlt sich die Verabreichung eines Mittels, das zwischen etwa 50 und 500 µg/ml RDE, zwischen etwa 50 und 500 µg/ml CWS und zwischen etwa 50 und 150 µg/ml TDM je Injektion enthält.
Wie oben beschrieben, kann das Mittel bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in form einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mittels. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalane, 7-n- Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).
Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergent, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergents beträgt zwischen etwa 0,02 und 0,2 Vol.-%, und die bevorzugte Menge beträgt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mittels. Es können alle üblichen Detergentien verwendet werden, wie z. B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt von Atlas Chemical Company).
Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit RDE und CWS überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Beispiel

Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin

Eine 650 mg-Probe eines gemäß dem Verfahren von Chen, et al J. Infect. Dis. 128 543 (1973) hergestellten Methanol-Chloroform-Präzipitats wurde in 150 ml 0,1N HCl in einem mit einem Kondensator versehenen Dreihals-Rundbogen-Kolben suspendiert und in ein Beschallungsgerät getaucht. Nach der Beschallung wurde die Glasvorrichtung in ein Ölbad, dessen Temperatur bei 120°C gehalten wurde, versenkt, wodurch die Innentemperatur des Kolbens sich dem Siedepunkt der Lösung näherte oder ihn überschritt. Durch Anbringen eines mit einer Stickstoffgasquelle verbundenen Kapillarröhrchens am Kolben durch einen der Hälse wurde die Überhitzungsgefahr so gering wie möglich gehalten. Während des Hydrolyseverfahrens erfolgte ein kontinuierlicher Stickstofffluß.
Die Hydrolyse dauerte 30 Minuten. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, schallbehandelt, um die Feststoffe zu dispergieren, und in Corex-Röhrchen verteilt. Der Kolben wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um alle den Seitenwänden des Kolbens anhaftenden Feststoffe zu beseitigen, und die Waschflüssigkeit der Suspension in den Corex-Röhrchen zugegeben. Anschließend wurde bei 12000 Upm während 80 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und verworfen. Der Feststoffrückstand wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert, schallbehandelt, bis eine gute Verteilung der Suspension erreicht war, und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugierung wurde daraufhin wiederholt. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser aufgenommen, gefriergetrocknet und lyophilisiert, wodurch 382 mg rohes Lipid A erhalten wurden. 150 mg dieser Substanz wurden zwecks Entfernung der Fettsäuren mit kaltem (0°C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatmann Nr. 1-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

Beispiel 2

Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin

Eine 120 mg-Probe eines MCP ( Methanol-Chloroform-Präzipitats) wurde in 12 ml absolutem Methanols suspendiert, zwecks Dispersion der Feststoffe schallbehandelt und in 61×10 cm große Schraubenverschlußampullen verteilt. Jeder Ampulle wurden 2 ml 0,2N HCl zugegeben, und die erhaltene Suspension wurde während 45 Minuten in einem Bad mit kochendem Wasser bebrütet. Nach der Hydrolyse wurden die Ampullen in einem Eiswasserbad gekühlt und bei 2500 Upm während etwa 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und dem Rückstand wurden 5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) zugegeben, um die Auflösung zu bewerkstelligen. Jeder Ampulle wurden 2 ml Wasser zugegeben, und die Lösung wurde vermischt. Die Zweiphasen-Lösung wurde erneut bei 2500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde verworfen, und jeder Ampulle wurde 1 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) zugegeben, woraufhin klare Lösungen erhalten wurden. Die Lösungen wurden anschließend vereinigt, und das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde unter Hochvakuumbedingungen getrocknet und lyophilisiert, worauf man 45 mg rohes Lipid A erhielt. 20 mg davon wurden mit kaltem (0°C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatmann Nr. 1 -Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 13 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

Beispiel 3

Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin)

110 g LH-20-100 (Teilchengröße: 25-100 µm nach Pharmacia) wurden mit 600 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) vermischt und anschließend 30 Minuten stehengelassen. Die dadurch erhaltene Aufschlämmung wurde in eine 25×1000 mm große, mit Druckfittings ausgestattete Glaschromatographiesäule gegeben. Nach erfolgter Beschickung wurde die Säule durch ein Teflon-Druckrohr an eine Pumpe angeschlossen. 400 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) wurden mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min durch die Säule gepumpt. 100 mg des nach Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurden über ein Rohr zur Probenvolumenbestimmung in 2,5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) auf die Säule aufgegeben. Der Zufluß wurde auf 1 ml/min reduziert, und, nachdem eine Menge von 150 ml Eluierungsmittel erhalten worden war, wurde der Abfluß mit einem Fraktionssammler verbunden. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und gereinigte, entgiftete Endotoxinfraktionen durch Dünnschicht-Chromatographie- Analyse ermittelt (E. Merck, Dicke: 0,25 mm, Chloroform/Methanol/H₂O/NH₄OH (50:25/4:2) als Eluierungsmittel).
Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weißen Pulvers zurückblieben.

Beispiel 4

Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin)

33 g DEAE-Zellulose (Whatmann DE-32) wurden in 150 ml Eisessig suspendiert und während 10 Minuten schwach gerührt, woraufhin eine pulverige Aufschlämmung erhalten wurde. Das Gemisch wurde über Nacht beiseite gestellt. Die Aufschlämmung wurde in eine 25×400 mm große Säule gegossen, wo sie sich unter Beklopfen absetzte, und anschließend der Säureüberschuß abgezogen. Die Säule wurde zuerst mit 2000 ml Methanol und dann mit 200 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) gewaschen. Eine 100 mg-Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurde in 3 ml eines Chloroform-Methanol- Gemisches (4:1) oder eines ChloroformMethanol-Wasser-Gemisches (80:20:1) in die Säule gegeben. Die Säule wurde zuerst mit 350 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) und dann mit 300 ml eines Methanol-Wasser-Gemisches (99:1) eluiert. Unter Verwendung eines Apparats mit linearem Gradienten wurde die Säule mit 2000 ml eines linearen Gradienten, beginnend mit 100%igem Methanol und schließlich mit 0,2 M Essigsäure in Methanol, eluiert. Die Säule wurde bei einer Geschwindigkeit von 6 ml/min eluiert, und es wurden 15 ml an Fraktionen gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Bartlett, G. R., J. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959) auf ihren Gesamtgehalt an Phosphor untersucht. Die Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockenheit abgedampft und in 10 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) und 40 ml einer 0,001 M Essigsäure in einen Scheidetrichter aufgenommen. Die untere Schicht wurde abgetrennt, durch ein Whatmann Nr. 2-Filterpapier abfiltriert und bis zur Trockenheit abgedampft, wonach 19,2 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin erhalten wurden.

Beispiel 5

Sieben Meerschweinchen vom Stamm 2 mit Linie-10 Tumorgewächsen von etwa 9 mm wurde einmal eine Injektion mit 0,4 ml einer sterilen Öltröpfchenemulsion, d. h. mit Drakeol 6 VR Mineralöl (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania) eines RDE, CWS und TDM enthaltenden Injektionsmittels direkt in das Tumorgewebe verabreicht.
Nach 3 Monaten wurden die Tiere untersucht und in allen Fällen eine totale Rückbildung des Tumorwachstums festgestellt.
Bei Kontrollexperimenten wurde zwei Gruppen mit je sieben Meerschweinchen vom Stamm 2, die mit Line-10 Tumorwachstum von einer Größe zwischen 9 und 12 mm befallen waren, einmal eine Injektion mit 0,4 ml eines 50 µg RDE und jeweils 50 µg RDE und TDM enthaltenden Injektionsmittels direkt in das Tumorgewebe verabreicht.
Nach Ablauf von 3 Monaten wurden die Tiere untersucht. Bei keinem Meerschweinchen aus den beiden Gruppen mit jeweils 7 Versuchstieren konnte auch nur das geringste Anzeichen einer Rückbildung des Tumorgewebes festgestellt werden.

Claims

1. Therapeutisches Mittel zur Bekämpfung von Tumoren, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an

a) gereinigtem, entgiftetem Endotoxin, das kein nachweisbares 2-Keto-3deoxyoctanoat, jedoch zwischen 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält, erhältlich durch
Hydrolysieren von aus Enterobacteriaceae gewonnen Endotoxinen mit Säuren in Gegenwart von Lösungsmitteln;
Gefriertrocknen des Roh-Lipid A enhaltenden Hydrolysats;
Entfernen von Fettsäuren aus dem Lipid A mit entsprechenden Lösungsmitteln;
Auflösen des unlöslichen Rückstandes in einem Lösungsmittel;
Chromatographieren der Lösung an einer Säule und Eluieren des entgifteten Endotoxins daraus;

b) Zellwandgerüst;

c) Trehalosedimycolat; und

d) einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch wirksame Menge an gereinigtem, entgiftetem Endotoxin und Trehalosedimycolat bis zu 1500 µg und die therapeutisch wirkungsvolle Menge an Zellwandgerüst bis 4500 µg pro Injektion beträgt.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in lyophilisierter Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.