DE3318569C2

DE3318569C2 -

Info

Publication number: DE3318569C2
Application number: DE3318569A
Authority: DE
Inventors: Edgar Ernst Hamilton Mont. Us Ribi
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1982-05-26
Filing date: 1983-05-20
Publication date: 1987-10-29
Also published as: CA1185899A; JPH042573B2; IL68713A0; JPS6313968B2; FR2527613B1; SE8302774D0; FI76494C; DE3318569A1; KR870000842B1; NO154864B; IL68713A; FR2527613A1; NO831855L; ATA189483A; NZ204298A; AU1461483A; HU190491B; KR840004510A; AU556532B2; FI831749A0

Description

Die Erfindung betrifft gereinigtes, entgiftetes Endotoxin (RDE), das in Verbindung mit Zellwandgerüst (CWS) eine bei der Behandlung von Krebstumoren therapeutisch wirksame Zusammensetzung ohne die normalerweise mit Endotoxin in Verbindung gebrachten schädlichen Nebenwirkungen ergibt.

Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaceae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immunotherapie bei verschiedenen immunogenen Tumoren (s. Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen hochtoxisch, weshalb ihre Verwendung auf die Behandlung von Krebstumoren beschränkt ist. Es sind Versuche unternommen worden, die Endotoxine zu entgiften, ohne deren tumorrückbildende Eigenschaft zu beeinträchtigen. Wie von Ribi, et al, aufgezeigt, führten die zur Entgiftung von Endotoxin bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung seiner Adjuvantizität bekannten chemischen Verfahren, wie z. B. Succinylierung und Phthalylierung, zum Verlust der Endotoxizität als auch der tumorrückbildenden Eigenschaften. Demzufolge blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eine Endotoxinprodukts mit hoher tumorrückbildender Eigenschaft und geringer oder keiner Toxizität ohne Erfolg.

Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin enthaltenen Proteine entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmucopeptid, das Trehalosemycolatreste ("P3") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), und M. bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur aus diesen. Außerdem kann es auch noch aus Nicht-Mycobakterien wie E. coli, B. abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.

Das Zellwandgerüst wird hergestellt, indem man zuerst Bakterien, wie z. B. M. bovis, Stamm BCG (bacillus Calmette- Guerin) züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Modell FR-1)) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzymatischen Behandlungen (z. B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines hervorragenden, gereinigten und entgifteten Endotoxinprodukts mit hoher tumorrückbildender Wirksamkeit ohne die normalerweise damit verbundenen toxischen Nebenwirkungen.

Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.

Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin (RDE) verwendeten Typs können, wie eingangs bereits erwähnt, aus Enterobacteriaceae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen:

Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudommas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia. Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni und S. abortus equi.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte können durch eines der nachfolgenden bekannten Verfahren hergestellt werden:

Webster, M. E., Sagin, J. F., Landy, M., and Johnson, A. G., J Immunol. 1955, 744, 55;
Westphal, O., Luderitz, O., and Bister, F., Z., Naturforsch, 76 148 (1952);
Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy, Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N. J. Madison Printing Co., 1957, 115;
Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O., Eur., J. Biochem. 9, 245 (1969);
Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N., Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect., Dis. 128 543 (1973);
Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., Milner, K. C., The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961);
Leive, L., Biochem. Biophy. Res., Comm. 21 290 (1965);
Ribi, E., Milner, K. C., and Perrine, T., J., Immunol. 82 75 (1959).

Das von Chen et al beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, stellt die bevorzugte Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extrakts dar.

Das Methanol-Choroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und anschließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid A mit verringerter Toxizität und Pydrogenizität, verglichen mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin, zu erhalten. Das erhaltene Produkt wird daraufhin mit einem Lösungsmittel behandelt, welches besonders Fettsäuren und andere Verunreinigungen, jedoch nicht das Roh-Lipid A, zu lösen vermag. Das bevorzugte Lösungsmittel für diesen Zweck ist Aceton. Der Phosphatgehalt im entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen Gegenstück festgestellten Konzentration, was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen von Endotoxinen in Beziehung steht.

Die für die Reaktion mit MCP bevorzugt verwendeten anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure; die bevorzugten organischen Säuren sind Toluolsulfonsäure oder Trichloressigsäure. Die Reaktion kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen 90°C und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen 15 und 60 Minuten, durchgeführt werden.

Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann durch Umsetzung des Ausgangsmaterials mit der Säure in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Ethanol oder Gemische davon erfolgen.

Das erhaltene Roh-Lipid A wird in Aceton, dem für die Lösung von Fettsäuren und anderen Verunreinigungen bevorzugten Lösungsmittel, gelöst. Das Lösungsmittel wird daraufhin entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin zu erhalten.

Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und die Lösung durch eine geeignete Chromatographiesäule, wie z. B. Molekularausschluß- Chromatographiesäule, geschickt, um die RDE- Fraktionen abzutrennen, welche nach der Entfernung des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung in Anwesenheit eines Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Aceton, Pyridin, Ether, Essigsäure oder Gemische davon, durch eine Sephadexsäule® geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt jedoch vorzugsweise im Bereich zwischen Atmosphärendruck und 70 N/cm², und die Fließgeschwindigkeit liegt zwischen 0,1 und 10 ml/Min.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule® durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt. Die Fließgeschwindigkkeit wird zwischen 2 und 15 ml/Min gehalten. Die Lösungsmittel sind ebenfalls die gleichen, wie sie bei der Sephadexsäule® verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diäthylamin in Konzentrationen bis zu 1% zugegeben werden kann.

Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die Lösung durch eine Niederdruck-60-Säule mit Silikagelteilchen mit einer Teilchengröße zwischen 25 und 63 µm unter Verwendung eines Lösungsmittels, ausgewählt aus Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniumhydroxyd, geschickt. Das bevorzugte Volumenverhältnis der Lösungsmittelkomponenten beträgt etwa 50 : 25 : 4 : 2.

Das erfindungsgemäß hergestellte RDE und CWS werden vereinigt, um eine wirksame antitumorale Zusammensetzung zu erhalten. Mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können unter anderem Krebsarten, wie die folgenden tierischen Tumore, z. B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder- Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde- Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z. B. Brusttumore, Coleo-Rectal-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzell- Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden.

Die Zusammensetzung wird durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, z. B. in einer Öltröpfchenemulsion, verabreicht. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung direkt in den Tumor unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen. Sie kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in dem ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.

Die RDE-Menge in einer einzelnen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen 6,25 und 250 µg/ml. Die Menge an CWS beträgt zwischen 125 und 750 µg/ml. Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor injizierten Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird.

Dosis bei Tieren je nach Tumorgröße

Durchmesser des Tumors
(cm)Menge des zu injizierenden
biologischen Präparats 0-1 cmbis zu 0,5 ml 1-2 cm 0,5 bis 2,5 ml 2-3 cm 2,5 bis 5 ml 3-5 cm 5 bis 10 ml 5-8 cm10 bis 15 ml größer als 8 cm15 bis 20 ml

Die maximale Dosis pro Injektion beträgt 1500 µg RDE und 4500 µg CWS. Die Behandlung sieht bis zu 5 Injektionen vor, die in 1-Wochenintervallen verabreicht werden.

Die Verabreichungen der RDE-CWS-Zusammensetzung in einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z. B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an RDE bzw. CWS in einer einzigen Injektion liegt zwischen 50 und 1000 µg, wobei die bevorzugte einfache Dosis für jede Komponente jeweils zwischen 275 und 325 µg bei einem Durchschnittspatienten mit 70 kg beträgt. Die Injektionen werden bis zu 15 Mal in Intervallen von etwa einer Woche verabreicht. Gewöhnlich empfiehlt sich die Verabreichung einer zwischen 50 ud 500 µg/ml RDE und zwischen 50 und 500 µg/ml CWS enthaltenden Zusammensetzung pro Injektion.

Wie oben beschrieben, kann die Zusammensetzung bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Die bevorzugte Menge des zu verwendeten Öls beträgt zwischen 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalane, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco® Superöl und Drakeol® 6 VR Mineralöl.

Das homogenisierte Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergent, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergents beträgt zwischen 0,02 und 0,2 Vol.-%, und die bevorzugte Menge beträgt zwischen 0,10 und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Es können alle üblichen Detergentien verwendet werden, wie z. B. Tween®-80 und Arlacel®.

Das nach dem Zusatz des Detergents erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit RDE und CWS überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Beispiel 1 Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin

Eine 650 mg-Probe eines gemäß dem Verfahren von Chen, et al J. Infect. Dis. 128 543 (1973) hergestellten Methanol-Chloroform- Präzipitats wurde in 150 ml 0,1N HCl in einem mit einem Kondensator versehenen Dreihals-Rundboden-Kolben suspendiert und in ein Beschallungsgerät getaucht. Nach der Beschallung wurde die Glasvorrichtung in ein Ölbad, dessen Temperatur bei 120°C gehalten wurde, versenkt, wodurch die Innentemperatur des Kolbens sich dem Siedepunkt der Lösung näherte oder ihn überschritt. Durch Anbringen eines mit einer Stickstoffgasquelle verbundenen Kapillarröhrchens am Kolben durch einen der Hälse wurde die Überhitzungsgefahr so gering wie möglich gehalten. Während des Hydrolyseverfahrens erfolgte ein kontinuierlicher Stickstofffluß.

Die Hydrolyse dauerte 30 Minuten. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, schallbehandelt, um die Feststoffe zu dispergieren, und in Corex-Röhrchen verteilt. Der Kolben wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um all den Seitenwänden des Kolbens anhaftenden Feststoffe zu beseitigen, und die Waschflüssigkeit der Suspension in den Corex-Röhrchen zugegeben. Anschließend wurde bei 12 000 Upm während 80 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und verworfen. Der Feststoffrückstand wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert, schallbehandelt, bis eine gute Verteilung der Suspension erreicht war, und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugierung wurde daraufhin wiederholt. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser aufgenommen; gefriergetrocknet und lyophilisiert, wodurch 382 mg rohes Lipid A erhalten wurden. 150 mg dieser Substanz wurden zwecks Entfernung der Fettsäuren mit kaltem (0°C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatmann Nr. 1-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

Beispiel 2 Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin

Eine 120 mg-Probe eines MCP (Methanol-Chloroform-Präzipitats) wurde in 12 ml absolutem Methanols suspendiert, zwecks Dispersion der Feststoffe schallbehandelt und in 6 1 × 10 cm große Schraubverschlußampullen verteilt. Jeder Ampulle wurden 2 ml 0,2N HCl zugegeben, und die erhaltene Suspension wurde während 45 Minuten in einem Bad mit kochendem Wasser bebrütet. Nach der Hydrolyse wurden die Ampullen in einem Eiswasserbad gekühlt und bei 2500 Ump während 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und dem Rückstand wurden 5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2 : 1) zugegeben, um die Auflösung zu bewerkstelligen. Jeder Ampulle wurden 2 ml Wasser zugegeben, und die Lösung wurde vermischt. Die Zweiphasen-Lösung wurde erneut bei 2500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde verworfen, und jeder Ampulle wurde 1 ml eines Chloroform- Methanol-Gemisches (4 : 1) zugegeben, woraufhin klare Lösungen erhalten wurden. Die Lösungen wurden anschließend vereinigt, und das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde unter Hochvakuumbedingungen getrocknet und lyophilisiert, worauf man 45 mg rohes Lipid A erhielt. 20 mg davon wurden mit kaltem (0°C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatmann Nr. 1-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 13 mg rohes, entgiftets Endotoxin zurück.

Beispiel 3 Herstellung von RDE (gerreinigtes, entgiftetes Endotoxin)

110 g LH-20-100 (Teilchengröße: 25-100 µm nach Pharmacia) wurden mit 600 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2 : 1) vermischt und anschließend 30 Minuten stehengelassen. Die dadurch erhaltene Aufschlämmung wurde in eine 25 × 1000 mm große, mit Druckfittings ausgestattete Glaschromatographiesäule (BRL Laboratories) gegeben. Nach erfolgter Beschickung wurde die Säule durch ein Teflon®-Druckrohr an eine Pumpe (ISCO Model 132) angeschlossen. 400 ml eines Chloroform- Methanol-Gemisches (4 : 1) wurden mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min durch die Säule gepumpt. 100 mg des nach Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurden über ein Rohr zur Probenvolumenbestimmung in 2,5 ml Chloroform-Methanol-Gemisches (4 : 1) auf die Säule aufgegeben. Der Zufluß wurde auf 1 ml/min reduziert, und, nachdem eine Menge von 150 ml Eluierungsmittel erhalten worden war, wurde der Abfluß mit einem Fraktionssammler verbunden. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und gereinigte, entgiftete Endotoxinfraktionen durch Dünnschicht- Chromatographie-Analyse ermittelt (E. Merck, Dicke: 0,25 mm, Chloroform/Methanol/H₂O/NH₄OH (50 : 25/4 : 2) als Eluierungsmittel).

Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weißen Pulvers zurückblieben.

Beispiel 4 Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin)

33 g DEAE-Zellulose (Whatmann DE-32) wurden in 150 ml Eisessig suspendiert und während 10 Minuten schwach gerührt, woraufhin eine pulverige Aufschlämmung erhalten wurde. Das Gemisch wurde über Nacht beiseite gestellt.

Die Aufschlämmung wurde in eine 25 × 400 mm große Säule gegossen, wo sie sich unter Beklopfen absetzte, und anschließend der Säureüberschuß abgezogen. Die Säule wurde zuerst mit 2000 ml Methanol und dann mit 200 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4 : 1) gewaschen. Eine 100 mg-Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurde in 3 ml eines Chloroform- Methanol-Gemisches (4 : 1) oder eines Chloroform- Methanol-Wasser-Gemisches (80 : 20 : 1) in die Säule gegeben. Die Säule wurde zuerst mit 350 ml eines Chloroform- Methanol-Gemisches (4 : 1) und dann mit 300 ml eines Methanol- Wasser-Gemisches (99 : 1) eluiert. Unter Verwendung eines Apparats mit linearem Gradienten wurde die Säule mit 2000 ml eines linearen Gradienten, beginnend mit 100-%igem Methanol und schließlich mit 0,2M Essigsäure in Methanol, eluiert. Die Säule wurde bei einer Geschwindikgkeit von 6 ml/min eluiert, und es wurden 15 ml an Fraktionen gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Bartlett, G. R., J. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959) auf ihren Gesamtgehalt an Phosphor untersucht. Die Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockenheit abgedampft und in 10 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2 : 1) und 40 ml einer 0,001M Essigsäure in einen Scheidetrichter aufgenommen. Die untere Schicht wurde abgetrennt, durch ein Whatmann Nr 2-Filterpapier abfiltriert und bis zur Trockenheit abgedampft, wonach 19,2 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin erhalten wurden.

Beispiel 5

Dreizehn Schweinen vom 2-Guinea-Stamm mit Line-10 Tumorgewächsen von etwa 9 mm wurde einmal eine 0,4 ml-Injektion einer sterilen Öltröpfchenemulsion, d. h. Drakeol® 6 VR Mineralöl (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), enthaltend 50 µg RDE und 50 µg CWS direkt in das Tumorgewebe verabreicht.

Nach Ablauf von 3 Monaten wurden die Tiere untersucht, wobei festgestellt wurde, daß bei 12 der 13 Tiere eine totale Rückbildung des Tumorwachstums stattgefunden hatte. Bei einem Kontrollexperiment wurde 6 Schweinen vom 2-Guinea-Stamm, die mit Line-10 Tumorwachstum mit einer Größe von etwa 9 mm befallen waren, einmal eine 0,4 ml-Injektion, die nur 50 µg RDE enthielt, direkt in das Tumorgewebe verabreicht. Nach drei Monaten konnte man bei keinem der 6 Tiere Anzeichen einer Rückbildung des Tumors feststellen.

Claims

1. Gereinigtes, entgiftetes Endotoxin, das kein nachweisbares 2-Keto-3- deoxyoctonat, zwischen 350 und 475 nM Phosphor/mg und zwischen 1700 und 2000 nM Fettsäuren/mg enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten worden ist, in dem

a) ein aus Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae erhaltenes Endotoxinextrakt mit einer Säure bei einer Temperatur zwischen 90 und 130°C hydrolysiert wurde,
b) das hydrolisierte Produkt lyophilisisert wurde, um ein Roh-Lipid A zu erhalten,
c) das Roh-Lipid A mit einem ersten Lösungsmittel behandelt wurde das die darin enthaltenden Fettsäuren löst,
d) das erhaltene unlösliche Produkt in einem zweiten Lösungsmittel dafür gelöst wurde und
e) die erhaltene Lösung durch eine Chromatographiesäule geschickt wurde um das gewünschte Produkt zu erhalten.

2. Therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Menge des gereinigten, entgifteten Endotoxins gemäß Anspruch 1 und zusätzlich Zellwandgerüst und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in lyophilisierter Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die therapeutisch wirksame Menge an gereinigtem, entgiftetem Endotoxin bis zu 1500 µg und die wirksame Menge an Zellwandgerüst bis zu 4500 µg pro Injektionseinheit beträgt.