DE3323092C2

DE3323092C2 - Pharmazeutisches Präparat

Info

Publication number: DE3323092C2
Application number: DE3323092A
Authority: DE
Inventors: John L. Hamilton Mont. Cantrell
Original assignee: Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, Mont.
Priority date: 1982-06-30
Filing date: 1983-06-27
Publication date: 1987-02-05
Also published as: IT1163624B; GB2122897B; DE3323092A1; IT8321854A0; JPS5917991A; CA1206415A; FR2529462A1; FR2529462B1; JPS6254774B2; GB2122897A; GB8317744D0

Abstract

Es wird ein pharmazeutisches Präparat, enthaltend einen gereinigten, aus Mikroorganismen erhaltenen, pyridinlöslichen Extrakt, der zwischen etwa 7 und 20 Gew.% Protein, zwischen etwa 10 und 16 Gew.% Zucker und zwischen etwa 35 und 55 Gew.% Fettsäuren enthält, vorgeschlagen, der in Verbindung mit Trehalosedimycolat und einem mit Azeton ausgefällten Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel als antitumoraler Wirkstoff bei der Behandlung von Tieren und Menschen verwendet werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft einen pyridinlöslichen Extrakt aus Mikroorganismen, der in Verbindung mit Trehalosedimycolat (TDM) und einem mit Azeton ausgefällten Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden (APC) ein pharmazeutisches Präparat mit antitumoralen Eigenschaften ergibt.
Mit Bakterien wie z. B. Corynebacterium parvum wurden Versuche angestellt, um diejenigen Komponenten zu isolieren und zu kennzeichnen, welche die Hemmung des Tumorwachstums bewirken (s. z. B. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum; Cantrell, et al., Cancer Research, Band 39, S. 3554-3563, September 1979). Abgesehen von seiner antitumoralen Wirkung hat sich der C. parvum als wirkungsvolles Stimulans des lymphoreticularen Systems, welches zu unerwünschter Gewichtszunahme der Milz und der Leber und zu Blastogenese führt, erwiesen. Es wurde herausgefunden, daß ein pyridinlöslicher Extrakt aus einem Mikroorganismus hohe antitumorale Eigenschaften ohne die mit den bekannten Erzeugnissen verbundenen unerwünschten toxischen Wirkungen aufweist.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Präparat zur Bekämpfung von Tumoren bereit zu stellen, das eine hohe antitumorale Wirkung besitzt und keine Milz- und Lebervergrößerung verursacht. Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.
Trehalosedimycolat (TDM) b) kann aus Organismen wie z. B. M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Aoyoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphteriae hergestellt werden.
Die Bakterien, wie z. B. M. avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Islolation and Compositions of Cell Wall Skeleton and Component P&sub3;; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silicagel gereinigt werden.
Das mit Azeton ausgefällte Nebenprodukt c) von mit Chloroform- Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden (ACP) hat bei seiner alleinigen Verwendung oder bei der Verwendung kombiniert mit Trehalosedimycolat b) keine tumorrückbildenden Eigenschaften. Zwecks einer vollständigeren Untersuchung des ACP, seiner Eigenschaften und Herstellungsverfahren wird auf die Veröffentlichung "Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins" (Ribi, et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwiesen. ACP erhält man aus Enterobacteriaciae folgender Gattungen, jedoch nicht ausschließlich aus diesen: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.
Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:
S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni und S. abortus equi.
Vollzellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das erhaltene Gemisch wird abgetrennt, um eine Überstandsfraktion, enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand, zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extraktes unterzogen werden.
Nachfolgend wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete Flüssigkeit, wie z. B. destilliertes Wasser, dialysiert. Das Fehlen von Vollzellen oder Zellfragmentverunreinigungen wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene gereinigte Extrakt kann anschließend nach bekannten Verfahren lyophilisiert werden, um ein beständiges Produkt zu erhalten.
Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderm Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore, z. B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z. B. Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzell-Karzinom und Ovarial-Tumore, behandelt werden.
Das Präparat wird vorzugsweise durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z. B. in einer Öltröpfchenemulsion, unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen direkt in den Tumor verabreicht. Das besagte Präparat kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einfachen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen etwa 375 und 2500 µg/ml. Die Menge an APC und TDM beträgt je zwischen etwa 375 und 1250 µg/ml.
Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor zu injizierenden Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird. Dosis bei Tieren je nach Tumorgröße &udf53;ta:10:18&udf54;&udf53;tz5,5&udf54; &udf53;tw,4&udf54;H@&udf53;sg8&udf54;\Durchmesser des Tumors&udf50;(cm)\ Menge des zu&udf50;injizierenden biologischen&udf50;Pr¿parats&udf53;tz5,10&udf54; &udf53;tw,4&udf54;&udf53;sg9&udf54;\0^1\ bis zu 0,5 ml&udf53;tz&udf54; \1^2\ 0,5 bis 2,5 ml&udf53;tz&udf54; \2^3\ 2,5 bis 5 ml&udf53;tz&udf54; \3^5\ 5 bis 10 ml&udf53;tz&udf54; \5^8\ 10 bis 15 ml&udf53;tz&udf54; \grÐÅer als 8\ 15 bis 20 ml&udf53;tz&udf54; &udf53;te&udf54;&udf53;vu10&udf54;
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 40 mg an pyridinlöslichem Extrakt, etwa 6 mg TDM und etwa 20 mg ACP. Die Behandlung sieht bis zu sechs, in 2- Wochenintervallen zu verabreichende Injektionen vor.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Präparats einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z. B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 200 und 5000 µg, vorzugsweise zwischen etwa 800 und 1200 µg. Die Menge an ACP beträgt zwischen etwa 150 und 1000 µg, während die Menge an TDM zwischen ungefähr 50 und 1000 üg liegt. Die bevorzugte Menge an ACP und TDM pro Injektion beträgt je zwischen etwa 475 und 525 µg. Bei sämtlichen obengenannten Dosierungsmengen wird von der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal etwa einmal wöchentlich verabreicht.
Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütlern und Menschen in Form einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl.
Das homogenisierte Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt zwischen etwea 0,02 und 0,25 Vol.-%, und die bevorzugte Menge liegt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Es können alle üblichen Detergentien, wie z. B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Atlas Chemical Company), verwendet werden.
Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit Wirkstoffen überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Beispiel 1

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus Corynebacterium Parvum

Corynebacterium parvum (P. acnes,) wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten wurde. Die Paste wurde anschließend mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 Gramm (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden mit 200 ml reinem Pyridin gemischt und bei 4°C während einer Stunde mit der 1700-fachen Erdbeschleunigung g (9,81 m/s²) zentrifugiert. Ein pyridinlöslicher Extrakt wurde als Überstandsfraktion entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, extrahiert. Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von Whatman No. 1-Papier wurden die Pyridin-Fraktionen vereinigt, und das Lösungsmittel durch Verdampfung bei 50°C in einem Buchi-Rotationsverdampfer entfernt. Der getrocknete Pyridin-Extrakt wurde eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene gereinigte Pyridin-Extrakt enthielt etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren. Der Extrakt wurde elektronenmikroskopisch untersucht, und es wurde festgestellt, daß er frei von Verunreinigungen in Form von Vollzellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichem Extrakt betrug 9% (8,1 g).

Beispiel 2

Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus M.bovis Stamm BCG.

B.bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei 37°C während etwa 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine gewaschene, in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellte Vollzellpaste erhalten wurde. 50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt in einer Ausbeute von 7% (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt enthielt 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew.-% Fettsäuren.
Der pyridinlösliche Extrakt besitzt in Verbindung mit TDM und ACP in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel eine hohe Wirksamkeit bei der Behandlung von Tumoren, wobei in den meisten Fällen eine totale Rückbildung des Tumors erreicht wird.

Claims

1. Pharmazeutisches Präparat zur Bekämpfung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) eine therapeutische wirkungsvolle Menge an gereinigtem, aus einem Mikroorganismus von M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. Kansasii, Nocardia-rubra, Corynebacterium diphtheriae oder Corynebacterium parvum, vorzugsweise aus Corynebacterium parvum, erhaltenem, pyridinlöslichem Extrakt mit zwischen 7 und 20 Gew.-% Protein, zwischen 10 und 16 Gew.-% Zucker und zwischen 35 und 55 Gew.-%Fettsäuren, erhältlich durch Mischen der Mikroorganismenzellen mit Pyridin, Abtrennen des Gemisches vom pyridinlöslichen Extrakt, Entfernen von Pyridin aus dem Extrakt und Dialysieren des getrockneten Extraktes gegen Wasser,

b) Trehalosedimycolat,

c) ein mit Azeton ausgefälltes Nebenprodukt von mit Chloroform- Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden und

d) einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt a) 12 Gew.-% Protein, 12 Gew.-% Zucker und 45 Gew.-% Fettsäuren enthält und daß die Menge an pyridinlöslichem Extrakt bis zu 40 mg, die Menge an Trehalosedimycolat b) bis zu 6 mg und die Menge des mit Azeton ausgefällten Nebenproduktes c) von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden bis zu 20 mg beträgt, wobei das Präparat an lyophilisierter Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.

3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Öl um ein leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl oder Drakeol 6 VR Mineralöl handelt, wobei das Öl in einer Menge von zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats vorliegt.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Extrakt a) zwischen 200 und 5000 µg, die Menge an Trehalosedimycolat b) zwischen 50 und 1000 µg und die Menge an mit Azeton ausgefälltem Nebenprodukt c) zwischen 150 und 1000 µg beträgt.