DE3323093C2 - Pharmazeutisches Präparat zur Bekämpfung von Tumoren - Google Patents
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Abstract
Es wird ein pharmazeutisches Präparat enthaltend einen gereinigten, aus Mikroorganismen erhaltenen, pyridinlöslichen Extrakt, der zwischen etwa 7 und 20 Gew.% Protein, zwischen etwa 10 und 16 Gew.% Zucker und zwischen etwa 35 und 55 Gew.% Fettsäuren enthält, vorgeschlagen, der in Verbindung mit Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat in einem pharamzeutisch geeigneten Mittel als antitumoraler Wirkstoff bei der Behandlung von Tieren und Menschen verwendet werden kann.
Description
enthält.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt 12 Gew.-% Protein, etwa
12 Gew.-% Zucker und 45 Gew.-% Fettsäuren enthält und daß ferner die Menge an pyridinlöslichem
Extrakt und an Zellwandgerüst je bis zu 40 mg und die Menge an Trehalosedimycolat bis zu 6 mg beträgt,
wobei das Präparat in lyophilisierter Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.
3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem öl um ein leichtes
Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl oder Drakeol 6VR Mineralöl handelt,
wobei das öl in einer Menge von zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des
Präparats, vorliegt.
4. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Detergens in einer Menge von
zwischen 0,02 und 0,25 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats, zwischen 200 und
5000 μg pyridinlöslichen Extrakt, Zellwandgerüst in
einer Menge von zwischen 50 und 2000 μg und Trehalosedimycolat
in einer Menge von zwischen 50 und 1000 μg enthält.
Die Erfindung betrifft einen pyridinlöslichen Extrakt aus Mikroorganismen, der in Verbindung mit Zellwandgerüst
(CWS) und Trehalosedimycolat (TDM) ein pharmazeutisches Präparat mit antitumoralen Eigenschaften
ergibt.
Mit Bakterien wie z. B. Corynebacterium parvum
\r L_ i-lli j:_:-_: Λ7
nuiuui τ ti auLtic aiigcaiciu, um uicjciugcti rvuillpuucilten
zu isolieren und kennzeichnen, welche die Hemmung des Tumorwachstums bewirken (s. z. B. Anti Tumor
Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum; Cantrell, et al,
Cander Research, Band 39, S. 3554-3563, September 1979). Abgesehen von seiner antitumoralen Wirkung
hat sich der C. parvum als wirkungsvolles Stimulans des lymphoreticularen Systems, welches zu unerwünschter
Gewichtszunahme der Milz und der Leber und zu BIastogenese führt, erwiesen. Es wurde herausgefunden,
daß ein pyridinlöslicher Extrakt aus einem Mikroorganismus hohe antitumorale Eigenschaften ohne die mit
den bekannten Erzeugnissen verbundenen unerwünschten toxischen Wirkungen aufweist
Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise
darin enthaltenden Proteine und Lipide entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabincgalactanmucopeptid,
das Trehalosemycolatreste (»P3«) und unverdaute Tuberculoproteme enthält.
Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterien
M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides,
Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV
und Ayoma B) und M. bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur aus diesen. Außerdem kann es auch
noch aus anderen Mikroorganismen wie E. coli, B. abortus
und Coxiella burnettii hergestellt werden.
Das Zellwandgerüst kann hergestellt werden, indem man zuerst Bakterien, wie z. B. M. bovis Stamm BCG
(bacillus Calmette-Guerin) züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen ZeII-fraktionator
aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen
Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen
(z. B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst
erhält.
Trehalosedimycolat (TDM) kann aus Organismen wie z. B. M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37
RV und Ayoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium
diphteriae hergestellt werden.
Die Bakterien, wie z. B. M. avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet.
Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel
lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt,
wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation
and Compositions of Cell Wall Skeleton and Component P3; Azuma, et al., Journal of the National Cancer
Institute, Band 52, S. 95—101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann
weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silicagel gereinigt werden.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines pharmazeutischen Präparats, das einen pyridinlöslichen
Extrakt aus einem Mikroorganismus in Verbindung mit Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat enthält.
Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.
Vollzellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das cnialieiie Gemisch wird abgeirenni, um eine Uberstandsfraktion enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extrakts unterzogen werden.
Vollzellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das cnialieiie Gemisch wird abgeirenni, um eine Uberstandsfraktion enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extrakts unterzogen werden.
Dann wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und
der getrocknete Extrakt gegen eine geeignete Flüssigkeit, wie z. B. destilliertes Wasser, dialysierL Das Fehlen
von Vollzellen oder Zellfragmentverunreinigungen wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene
gereinigte Extrakt kann anschließend in an sich bekannter Weise lyophilisiert werden, um ein beständiges
Produkt zu erhalten.
Der erfindungsgemäß hergestellte pyridinlösliche Extrakt
kann mit CWS und TDM kombiniert werden, um so ein Präparat mit hoher antitumoraler Wirkung zu
ergeben, das keine Milz- und Lebervergrößerungen verursacht.
Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderem Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore,
z. B. Rinder-Schuppenzell-Carcinom, Rinder-Fibrosarcom,
Pferde-Sarcoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Carcinom, Hunde-Mamma-Tun<ore,
Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche
Tumore, wie z. B. Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore,
malignes Melanom, Schuppenzell-Carcinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden.
Das Präparat wird vorzugsweise durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z. B. in
einer öltröpfchenemulsion, unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen direkt in den Tumor
verabreicht. Das besagte Präparat kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und
nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einfachen
Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen 375 und 25(M^g/ml. Die Menge an CWS und
TDM beträgt je zwischen 125 und 375 μg/ml.
Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor
zu injizierenden Präparate wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der
nachstehenden Tabelle verwiesen wird.
Dosis bei Tieren je nach Tumorgröße
| Durchmesser des Tumors | Menge des zu injizierenden |
| (cm) | biologischen Präparats |
| 0-1 | bis zu 0,5 ml |
| 1-2 | 0,5 bis 2,5 ml |
| 2-3 | 2,5 bis 5 ml |
| 3-5 | 5 bis 10 ml |
| 5-8 | 10 bis 15 ml |
| größer als 8 | 15 bis 20 ml |
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt 40 mg an pyridinlöslichem Extrakt, 40 mg CWS und 6 mg TDM.
Die Behandlung sieht bis zu sechs, in 2-Wocheninterval- !en zu verabreichende Injektionen vor.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Präparats in einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z. B.
einer öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an pyridinlöslichem
Extrakt in einer einzigen Injektion liegt zwischen 200 und 5000 μg, vorzugsweise zwischen 800 und 1200μg.
Die Menge an CWS beträgt zwischen 50 und 2000 μ&
während die Menge an TDM zwischen ungefähr 50 und 1000 μ^ liegt. Die bevorzugte Menge an CWS und TDM
pro Injektion beträgt je zwischen 475 und 525 μg. Bei
sämtlichen obengenannten Dosierungsmengen wird von der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen
mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal einmal wöchentlich
verabreicht.
Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer
Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete ölmenge liegt zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%,
bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt
zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 VoI.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen,
ίο 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol
6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).
Das homogenisiertes öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls
in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt zwischen
0,02 und 0,25 Vol.-%, und die bevorzugte Menge liegt zwischen 0,10 und 0,20 VoI.-°/o, jeweils bezogen auf
das Gesamtvolumen des Präparats. Es können alle üblichten
Detergentien, wie z. B. Tween-80® und Arlacel®,
verwendet werden.
Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine
Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit Wirk-
stoffen überzogenen öltröpfchen erhält, was sich unter
dem Mikroskop nachweisen läßt.
Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt
aus Corynebacterium Parvum
Corynebacterium parvum wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe gezüchtet
J5 und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten
wurde. Die Paste wurde anschließend mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 Gramm (Feuchtgewicht)
der gewaschenen Paste wurden mit 200 ml reinem Pyridin gemischt und bei 4°C während einer Stunde mit der
1700-fachen Erdbeschleunigung g (9,81 m/s2) zentrifugiert. Ein pyridinlöslicher Extrakt wurde als Überstandsfraktion
entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen,
wie oben beschrieben, extrahiert. Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von Whatman
No. 1-Papier wurden die Pyridin-Fraktionen vereinigt, und das Lösungsmittel durch Verdampfung bei 5O0C in
einem Buchi-Rotationsverdampfer (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) entfernt. Der getrocknete
Pyridin-Extrakt wurde eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene
gereinigte Pyridin-Extrakt enthielt etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-°/o Zucker und etwa 45
Gew.-% Fettsäuren. Der Extrakt wurde elektronenmikroskopisch untersucht, und es wurde festgestellt, daß
er frei von Verunreinigungen in Form von Vollzellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichsm
Extrakt betrug 9% (8,1 g).
B e i s ρ i e 1 2
Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt
aus M. bovis Stamm BCG
aus M. bovis Stamm BCG
M. bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei 37° C während etwa 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet,
woraufhin eine gewaschene Vollzellpaste erhalten wurde. 50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste
wurden anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt
in einer Ausbeute von 7% (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt enthieil 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker
und 52 Gew.-% Fettsäuren.
Beispiel 3
Versuche an Meerschweinchen mit Line-10 Tumor
Versuche an Meerschweinchen mit Line-10 Tumor
10
Sechs Meerschweinchen vom Stamm 2 mit Line-10 Tumorgewächsen mit einem Durchmesser von etwa
9 mm wurde einmal eine Injektion mit 0,4 ml einer sterilen öltröpfchenemulsion, d. h. mit Drakeol 6 VR Mineralöl
enthaltend 300 μg des gemäß Beispiel 1 hergestellten
pyridinlöslichen Extraktes, 50 μg Zellwandgerüst
und 50 μg Trehalosedimycolat direkt in das Tumorgewebe
verabreicht
Nach Ablauf von 3 Monaten wurde:, die Tiere untersucht,
wobei bei 5 der 6 Tiere eine totale Rückbildung des Tumorwachstums festgestellt wurde.
Bei Kontrollexperimenten wurde sechs Meerschweinchen vom Stamm 2, die mit Line-10 Tumorwachstum
mit einem Durchmesser von etwa 9 mm befallen waren, einmal eine Injektion mit 0,4 ml der oben
beschriebenen öltröpfchenemulsion ohne Pyridin-Extrakt oder ohne Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat
direkt in das Tumorgewebe verabreicht. Bei keinem der 6 Tiere konnte auch nur das geringste Anzeichen
einer Tumorrückbildung nach 3 Monaten festgestellt werden.
35
40
45
50
55
60
65
Claims (1)
1. Pharmazeutisches Präparat zur Bekämpfung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet,
daß es
a) eine therapeutisch wirkungsvolle Menge an gereinigtem, aus irgendeinem Mikroorganismus
der Gruppe M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium
diphteriae oder Corynebacterium parvum, vorzugsweise aus Corynebacterium parvum,
erhaltenem, pyridinlöslichem Extrakt mit zwischen 7 und 20 Gew.-% Protein, zwischen 10
und 16 Gew.-% Zucker und zwischen 35 und 55 Gew.-% Fettsäuren, erhältlich durch Mischen
der Mikroorganismenzellen mit Pyridin, Abtrennen des Gemisches vom pyridinlöslichen
Extrakt, Entfernen von Pyridin aus dem Extrakt und Dialysieren des getrockneten Extraktes gegen
Wasser,
b) Zellwandgerüst,
c) Trehalosedimycolat und
d) einen pharmazeutisch geeigneten Träger
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