DE3315264A1 - Verfahren zur reinigung von rohen trehalosedimycolaten - Google Patents

Verfahren zur reinigung von rohen trehalosedimycolaten

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DE3315264A1 DE19833315264 DE3315264A DE3315264A1 DE 3315264 A1 DE3315264 A1 DE 3315264A1 DE 19833315264 DE19833315264 DE 19833315264 DE 3315264 A DE3315264 A DE 3315264A DE 3315264 A1 DE3315264 A1 DE 3315264A1
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Description

VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON ROHKN TREHALOSEDT-
MYCOLATEN
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von rohen Trehalosediniyco] aten (TDM). Aus Bakterien .i so ■ lierte TDM ergeben zusammen mit Ze] J wandgerüst (CWS) ei no Zusammensetzung, die bei der Unterdrückung und Rückbildung von Tumorzellen wirksam ist.
Die Kombination von Zeilwandgerüst und TDM ist bekannt (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. II. Suppression and Regression of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma; Meyer, et al., Journal of the National Cancer Institute Monograph No. 39, SS. 115-120, Oktober 1972).
Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine ZeIlwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin enthaltenen Proteine und Lipide entfernt wurden. FJs handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmucopeptid,.das Trehalosemycolatreste ("PS") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), und M.bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur aus diesen. Außerdem kann es auch noch aus Nichb-Mycobakterien wie E. coli, B. abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.
Das Verfahren zur Herstellung von Zellwandgerüst ist sehr zeitaufwendig. Bakterien wie M. bovis,'Stamm BCG (Bacillus Calmette-Guerin) werden zu diesem Zweck gezüchtet und dann abgeerntet. Der erhaltene VoIlzel!rückstand wird dann
auf einen Άο\Ifraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorva] J , Model RF-I-) ) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die duiiu-re Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden da-Γ) nach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzymatisehen Behandlungen (z.B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält.
Die zweite Komponente, die Trehalosedimycolate (TDM), können aus Mycobakterien hergestellt werden,wie z.B. aus M.civium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae.
Die Bakterien, wie z.B. M. avium, werden gezüchtet, abge- '> orntot und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P^; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können 2Ί die TDM dann weiter durch Zentrifugal Chromatographie an f ei nvor teil tem iiilikagel gereinigt werden.
Die wie oben be:;chri eben hergestellte CWS- und TDM-Komponente können in Form einer Öltröpfchenemulsion zur Herstellung einer .int ii umoral wirksamen injizierbaren Zusammen-U) ;,'■! xunq VCi wondi-t worden (s. Immunotherapy with Non-viable Mi.croli ial Components; Ribi, et al; Annals of the New York ArvuliMtiy of Science, Band 227, S. 228-238, 20. Sept. 1976).
■—ti —
Die bekannten Emulsionen haben jedoch ο im? η rrhfbl i ο!ι< -n Nachteil. Die in den gereinigten TPM zuiürkhioibonden Verunreinigungen beeinträchtig·-'!! nämlich erhob! ich die'Wirksamkeit der Zusammensetzung, indem .sie Effektivität bei der Tumorbehandlung einschränken. Bisherige Verbuche, die TDM weiter zu reinigen, waren jedoch mit wiederholter zeitaufwendiger und kostspielige; I1IIuI..ion durcli Hochdrucksi].ikagelsäulen verbunden. Es wurde nun gefunden, daß bei Verwendung einer Niederdrucksäule auf (z.H.
2
IQ ca. 7 bis 211 NT/cm ) mit SiI ikagel teil chen mit einer Teilchengröße von ca. 15 bis 63 Aim überraschenderweise und wirksam faktisch sämtliche Verunreinigungen aus den rohen TDM entfernt werden können.
Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von rohen TDM. Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung eines gereinigten TDM-Produktes, das zur Bereitung einer anlitumoral wirksamen Öl-in-Kochsalzlösung-Emulsion mit CWS kombiniert werden kann.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Reinigung von TDM von faktisch sämtlichen Verunreinigungen, wie sie gewöhnlich in rohen TDM enthalten sind. Das Verfahren umfaßt das Lösen der rohen TDM in einem Lösungsmittel unter nachfolgender Niederdruckchromatogrciphie der Lösung mit Hilfe einer Silikagelsäule mit einer Teilchengröße von ca. 15 bis 6 3 /um. Der Druck in der Säule be-
1 2
2 wegt sich gewöhnlich zwischen 7 und 211 N/cm , vorzugsweise zwischen ca. 21 und 56 N/cm'
Zur Lösung der rohen TDM kann eine große Zahl apolarer Lösungsmittel verwendet werden. Bevorzugt werden dabei z.B. Chloroform, Äther, Hexan, Methanol, Äthanol, Tetrahydrofuran,. Pol· ιοί äther , ik-pt.in, Mft hy 1 onch'l οι i ei, l,iqir<in,
OäiGINAL INSPECTED
Propanol, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Toluol, Essignäure u.a. einschließlich der Gemische davon.
Die einzelnen Fraktionen der gereinigten TDM werden miteinander vereinigt, wonach das Lösungsmittel entfernt r) wird. Das erhaltene Produkt weist faktisch keine nachweisbaren Verunreinigungen auf, d.h. die Reinheit beträgt 99,9 % oder mehr. Bei Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens- läßt sich ohne wiederholte Reinigung ein hochreines TDM-Produkt erhalten. Dieses kann wirksam mit dem CSW auf übliche Weise vereinigt werden, wodurch man eine starke antitumoral wirkende Zusammensetzung erhält.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte Er-]r) findung nicht ein.
Beijspiel 1
Herste!lung von Roh-TDM
600 g (Feuchtgewicht) ganze Zellen von M. phlei, die vorgängig durch Wärmeeinwirkung abgetötet worden waren, wurden über Nacht mit Hilfe eines Magnetrührwerks in 4 1 95%-igem Äthanol gerührt und dann durch einen 27 cm-Buchnortrichter mit 24,0 cm-Whatman Nr. !-Filterpapier in einen 2 1-Filteikolben filtriert. Danach wurde die äthanolische Lösung entfernt. Der ZeI!rückstand wurde in
2ri ninern 2 1-Kolben in 1500 ml einer Diäthyl äther-Äthanol Lösung (I:]) erneut suspendiert und über Nacht mit Hilfe eines Magnet: ruh ι werkr. gerührt und danach, wie oben ber.rhri c .-hon, <ibi i 1 t r i ei t. Danach wurde die Äthcr-Äthanol-Lö'-uiriq entfernt und eine zweite Äther-Äthanol-Extraktion
J,0 durchyofuhr t und wieder abfiltriert. Nach Entfernung der Athor-Athanol-Lösung wurde der Zeil rückstand erneut in
ORIGäNAL INSPECTED
1500 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) {suspendiert und über Nacht mit Hilfe eines Magnetrührwerks gerührt und durch einen Buchneitrichter abfiltriert oder bei 10.000 Upm während 30 Sekunden zentrifugiert. Die Chloroform-Methanol-Lösung wurde entfernt. Die Extraktion und Filtration wurde zweimal wiederholt. Der Zellrückstand wurde luftgetrocknet und abgefüllt. Die drei Chloroform-Methanol-Lösungen wurden miteinander vereinigt und an einem Buchi-Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben eingedampft. Das Gewicht des Chloroform-Methanol-Rückstandes betrug 13,0 g.
Der Rückstand wurde in 500 ml einer Chloroform-Methanol Lösung (2:1) gelöst und während 1 Stunde mit Hilfe eines Magnetrührwerks gerührt und danach durch einen Sinterglas-Buchner-Trichter (grob, 300 ml) abfiltriert. Das-Lösungsmittel wurde an einem Buchi-Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben abgedampft, wodurch man einen Rückstand von 12,5 g erhielt. Der erhaltene Rückstand wurde erneut in 400 ml Diäthyläther suspendiert und mit Hilfe eines Magnetrührwerks während 1 Stunde gerührt. Die Suspension wurde dann in Zentrifugenflaschen mit DoppelSchraubverschluß in einem GSA-Rotor bei 5000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Die ätherlösliche Fraktion wurde dann abdekantiert. Sowohl die ätherlösliche als auch die ätherunlösliche Fraktion wurden aufbewahrt.
Die ätherunlösliche Fraktion wurde in 200 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) gelöst und danach durch einen Buchner-Trichter abfiltriert.
Die ätherlösliche Fraktion wurde an einem Buchi-Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben eingedampft, wodurch man einen ätherlöslichen Rückstand er-
hielt. Dieser wurde in 300 ml Äther gelöst und danach in 900 ml Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch einen Buchner-Trichter mit Whatman Nr. 1-Filterpapier abfiltriert und mit der Chloroform-Äthanol-Lösung (2:1), welche die oben beschriebene ätherunlösliche Fraktion enthielt, vereinigt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde an einem Buchi-Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben eingedampft, wodurch man 6,5 g eines Rückstandes erhielt.
Dar Rückstand wurde in 200 ml einer Chloroform-Methanol-] ü Lösung (2:1) gelöst und dann in einen 500 ml-Scheidetrichtor gegossen. Diese Lösung wurde danach tropfenweise in einen mit einem Magnetwerk ausgestatteten 2 l~Kolben der 600 ml Aceton enthielt, gegossen. Das erhaltene Präzipitat wurde in einen Buchner-Filter abfiltriert, luftgetrocknet und dann in eine abgewogene Flasche gegeben, wodurch man 4,5 g Roh-TDM erhielt.
Beispiel 2
Reinigung der Roh-TDM
2 g der in Beispiel 1 erhaltenen Roh-TDM wurden in 2 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (10:1) gelöst und dann in ein 5 ml-Rohr zur Probenvolumenbestimmung gegeben. Der restliche Teil des Rohrs wurde mit dem Lösungsmittel gefüllt. Die Lösung wurde auf eine Silikagel-60-Säule (25 χ 1000 mm) mit einer Teilchengröße von ca. 50 bis 63 Aim mit Hilfe einer Isco Model 132-Pumpe gepumpt. Die Säule wurde mit 800 ml Chloroform und danach mit 1200 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (98:2) bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min eluiert (die Fließgeschwindigkeit ist kritisch, da gefunden wurde, daß die Auflösung geringer ist, wenn·die Fließge-■50 schwindi gke i t zu stark zunimmt. Eluiert wird daher im allgemeinen be. i einor Fl ießgeschwi ndigkeit zwischen ca. 0,1 ml und 20 ml/min, gewöhnlich bei einer Geschwindigkeit zwi-
sehen ca. 2 und 5 ml/min). Der Sau1"nabiluß wurde.· dann mit einem Fraktionssammler verbunden. E.1. wurden Fraktionen zu je 8 ml pro Rohr gesammelt, wobei die Säule mit 3r.iü0 in]
einer Chloroform-Methanol-Lösunq (96:4) eluiert wurde.
Die Röhrchen, die gereinigte TDM enthielten, wurden ruii
Hilfe der Fleckenanteile der verschiedenen Fraktionen auf Dünrischichtchromatograpliieplalten (Silikagol F-:)r>4, 5x10, Dicke 0,25 mm) ermittelt, wobei man als Eluierungsmittel eine Chloroform-Methanol-Lösung (10:1) verwendete und diese Fraktionen mit vorgängig isolierten reinen TDM verglich. Die Sichtbarmachung der Dünnschichtchromatographieplatten erfolgte durch Besprühen der Platten mit 10%-iger (Gewicht/Volumen) Phosphormolybdänsäure in Äthanol. Die Fraktionen, die gereinigte TDM erzielten, wurden miteinander vereinigt, wonach das Lösungsmittel auf einem
Buchi-Rotati onsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben abgedampft wurde. Auf diese Weise erhielt m<m
358 mg gereinigte TDM.
ORiGiNAL INSPECTED

Claims (7)

  1. ./Verfahren zur Reinigung von rohen Trehaloscdimycolat en, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) die rohen Trehalosedimycolate in einem Lösungsmittel löst und
    b) auf eine Niederdruck-Silikagelsäule mit einer Teilchengröße von ca. 15 bis 63 /um aufgibt.
  2. 2. Vex-fahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da 13 man den Druck zwischen ca. 7
    2
    und 211 N/cm , vorzugsweise zwischen fast 21 und 56
    N/ cm2 hält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g ekennzeichnet , daß man als Lösungsmittel Chloroform, Äther, Hexan, Äthanol, Methanol, Tetrahydrofuran, Petroläther, Heptan, Methylenchlorid, Ligroin, Propanol, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Toluol, Essigsäure oder Gemische davon verwendet.
    •I ·
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die aus Mycobakterien erhaltenen Trehalosedimycolate. verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e η η - ν. ο i c h η e t , daß man als Mycobakterien M. avium,
    M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37RV und Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, Msmegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis oder Corynebacterium diphtheriae verwendet.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,1 ml bis 20 ml/min, vorzugsweise von ca. 2 bis 5 ml/min eluiert.
  7. 7. Nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltene Trehalosed imycolato.
DE19833315264 1982-04-29 1983-04-27 Verfahren zur reinigung von rohen trehalosedimycolaten Granted DE3315264A1 (de)

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