JPS58219122A - 粗トレハロ−スジミコレ−ト（ｔｄｍ）の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明の目的は、粗トレハロースジミコレート（ＴＤＭ
）の精製法に関するものである。ＴＤＭは、バクテリア
の分離物であり、細胞壁骨格（ＣＷＳ　）と併用して、
肺癌細胞の抑制および退行に効果のある組成物を形成す
る。

細胞壁骨格とＴＤＭの併用は、当該分野においら、　　
Ｊ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎａｔ、　
５２巻、４１゜１９７４年１月：および腫瘍抑制および
退行におけるマイコバクテリウム細胞壁成分：リビら。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　　モノ
グラフ扁３９゜１１５〜１２０ページ−１９７２年１０
月、参照）細胞壁骨格は、除去された細胞壁に正常に見
い□出されるタンパク質および脂質の多くを有する本質
的には、細胞壁である。トコハロースミコレート（”　
Ｐ　３″）の残遺物および未消化（分解）結核菌タンパ
ク質を含む重合体ミコール酸アラビノガラクタンムコペ
プチドである。細胞壁骨格は。

マイクバクテリアを含むものから得られるが。

結核菌（菌株Ｈ３７ＲＶおよびＡｙｏｍａ　Ｂ　）、お
裏びＭ、　ｂｏｖｉａ菌株ＢＣＧに限る。（・」加重に
、細胞壁骨格は、大腸菌、バンク函およびコキシエラ標
準菌のようなＪト−マイクバクテリアからも得られ細胞
壁骨格を生り乏引程は２時間の浪費である。

Ｍ、　ｂｏｖｉａ　、　菌株ＢＣＧ（バチルス　力ルメ
ットーゲラン）を増殖させ、回収する。得られ瓦全細胞
残留物は、原形質不純物から細胞壁ま７’Ｃは外部エン
ベロー１化分離する細胞を破壊する細胞分画器〔リビ細
胞分・画器（ソルヴエル、ＲＦ−１型）〕によって処理
する。得られた細胞壁ｔ、一連の溶　　　　　□媒抽出
、そして酵素処理（７ｃとえはトリプシンおよび／ま７
’（はキモトリプシン）をすることにＬつて、精製され
た細胞壁骨格が得られる。

第二成分トレハロースシミコレ−）（ＴＤＭ）は、マイ
クバクテリアを含むものから、たとえばＭ、　ａｖｌｕ
ｍ　ｒ　Ｍ、　ｐｈｉａｌ　、結核菌（Ｉ株Ｈ３７ＲＶ
およびＡｙｏｍａ　Ｂ　）　、　Ｍ、　ｂｏｖｌｓ　Ｂ
　ＣＧ　。

Ｍ、　ａｍｅｇｍａｔｉｓ　、　Ｍ、　ｋａｎａａｓｉ
ｉ　、　Ｎｏｃａｒｄｉａｒｕｂｒａ　、　Ｍ、　ｂｏ
ｖｉｎｉｓおよびジフテリア菌、から得られる。

Ｍ、　ａｖｉｕｍのようなバクテリア會増殖させ、回収
し１次いで熱滅菌する。細胞塊をいくつかの溶媒で抽出
し、活性な、溶媒可溶な両分が抽出される。この抽出は
、粗ＴＤＭｔ−−供するために一連の溶媒抽出によって
、更に精製する（マイコバクらＪ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　５２巻、９５〜１０１ペ
ージ１９７４年参照）。アズマ、らによって明らかにさ
れたように、粗ＴＤＭｔ−精製したＴＤＭｔ−得るため
に、遠心ミクロパーティキュレートシリカゲルクロマト
グラフィーに裏って精製する。′ 上記記載のように生成されたＣＷＳおよびＴＤＭは、注
射に好適な抗−腫瘍組成分を得るために油飛沫乳剤とし
て用いることができる（非−生育性微生物成分での免疫
療法：リビら：　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆＮｅｗ　ＹｏｖＫ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２７
巻。

２２８〜２３８ページ、１９７６年９月２０日。

参照）。

乳剤に関する先行分野は、主な不利性をこうむっている
。精製されたＴＤＭにおいて残留する不純物は、腫瘍の
治療において、その効果を限定する組成物の効能にひど
く影響を与える。更にＴＤＭを精製する試みに関する先
行技術は、一般的に。

高速（高圧）シリカゲルカラムを用いての、費ｉのかか
る溶出９時間の浪費ｔくり返すことが含まれている。出
願者Ｖｉ、約１５から６３ミクロンまでのサイズをもつ
シリカゲル粒子を用いた低圧カラムの使用は、驚くほど
、効果的に粗ＴＩ？Ｍから。

すべての不純物を笑声的に除去するこ１−ｈＦ４１１ｔ
−１ル八・従って２本発明の目的は、粗ＴＤＭｔ精製す
る方法を提供することである。本発明の他の目的は。

抗腫瘍剤として、効果的である食塩における油乳化剤を
生成するためにＣＷＳと併用しうる精製し九ＴＤＭ生成
物を提供することである。

発明 本発明は、通常、粗ＴＤＭに結合しているすべての不純
物を、実質的に除去する方法に関するものである。方法
は、溶媒に粗ＴＤＭ′に溶解すること、次いで、約１５
から６３ミクロンまでの粒子サイズをもつ低圧シリカゲ
ルカラムに溶液を応用することを含んでなる。カラムに
おいて用いられ友圧力は１通常約１０および３００９ｓ
ｉであり、好ましくは約３０およびＢ　ｏ　ｐｓｉであ
る。

非−極性溶媒の広範囲の種類が、粗ＴＤＭｔ−溶解する
友めに用いられる。好ましい溶媒とし王は、たとえばク
ロロホルム、エーテル、ヘキザン、ツタノール、エタノ
ール、テトラヒドロフラン、石油エーテル、ヘプタン、
塩化メチレン、リグロイン、プロパツール゛、ブタノー
ル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、酢酸およびそれ
らの併用を含む類似物、が挙げられる。

精製したＴＤＭの画分を合わせ、溶媒を留去する。得ら
れた生成物は、実質的に不純物が検出されない（すなわ
ち、純度は９９．９％に等しいかもしくはそれ以上であ
る）。上記記載の方法を用いることによって、高度に精
製されｆｃＴＤＭ生我物が１反復精製段階の必要なく得
られる。生成物は。

強力な抗−腫瘍組成物全生成するための常法で、効果的
Ｉ／ｃＣＷＳと組合わせることができる。

次に挙げる例は、単に説明する目的のｔめであり、本発
明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものも
しくは、どのようにしても再定義されるものではないこ
とはいうまでもない。

実施例】−粗ＴＤＭの調製 前もって熱滅菌しｆｃＭ−ｐｈｌｅｉの全細胞６００Ｉ
（含水重量）、ｉ９５％エタノール４ｊ中で、−夜、磁
気攪拌器で攪拌し、ホワトマン准１ろ紙を用いて２７ｃ
ｍブッフナニロートで２Ｅ口過フラスコに真空下でろ過
する。エタノール溶液を留去する。細胞残留物は、２Ｊ
フラスコ中で、１：１エチルエーテル−エタノール溶液
１５００ｄで再懸濁し、−夜磁気攪拌器で攪拌した後、
上記記載のようにろ過する。エーテル−エタノール溶液
を留去し、第二のエチルエーテル−エタノール抽出およ
びろ過を行なう。エーテル−エタノール溶液の留去後、
細胞残留物１．ｚ：１クロロホルム−メタノール溶液１
５００ｍ＃で再懸濁し、−夜磁気攪拌器で攪拌し、ブ・
ンフナーロー）ｔ−用いてろ過するかまたは１０．００
０　ｒｐｒｎで３０秒間遠心する。

クロロホルム−メタノール溶液を留去し、抽出およびろ
過の工程？二回くり返す。細胞残留物は。

空気中で乾燥し、ピンに入れる。３つのクロロホルム−
メタノール溶液全台わせ、風袋を測定した丸底フラスコ
でブ・ンシ回転−蒸気器で蒸発させる。

クロロホルム−メタノール残留物の重量Ｕ、１３．０ｇ
である。

ｆｉｌｉ物＆、　２　：　１クロロホルム−メタノール
溶液５００ｍ１に溶解し、磁気攪拌器で１時間攪拌し。

次いで、シンター・ガラス・プツフナー〇−トを用いて
ろ過する（粗、３００ｍＡり。溶媒は、風袋を測定した
丸底フラスコでプツシ回転−蒸気器を用いて蒸発させ、
残留物１２．５１１が得られる。

得られた残留物を、エチルエーテル４００１に再懸濁し
、磁気攪拌器で１時間攪拌する。懸濁液′ｆ：２つのね
じぶｔ遠心管に入れ、ＧＳＡローターを用いて５０００
　ｒｐｍで３０分間遠心する。エーテル可溶画分は、捨
てるやエーテル可溶およびエーテル不溶画分を残してお
く。

エーテル不溶物質ｔｌ−２：１クロロホルム−メタノー
ル溶液２００ｍ１に溶解し、ブツフナーロートを用いて
ろ過する。

エーテル可溶画分は、風袋を測定した丸底フラスコでブ
９シ回転−蒸気器で蒸発させ、エーテル可溶残留物が、
得られる。残留物をエーテル３０〇−に溶解し、メタノ
ール９００ｍＪで沈澱せしめる。

沈澱物は、ホワイトマン屑１ろ紙を用いたプックナーロ
ートを用いてろ過し、上記記載のエーテル不ｇ物’Ｊｆ
’を含ム２　：　１クロロホルム−メタノール溶液と合
わせる。得られた溶液をプツシ回転−蒸気器で蒸発させ
、残留物６．５ｇが得られる。

残留物’に２：１クロロホルム−メタノール溶液２００
ｍＪに溶解し、５００．ｗ１分離ロートに入れる。

この溶液をアセトン６００ｍ１を含む磁気攪拌器のそな
えた２１フラスコに滴下して加える。得られ１ｔＪｔ物
を、ブッフナーロートでろ過し、空気中で乾燥し、風袋
を測定したビンに入れ、粗ＴＤＭ４゜５ｇが得られる。

実施例２−粗ＴＤＭの精製 実施例１で得られたように粗ＴＤＭ２１１を１０：１ク
ロロホルム−メタノール溶液２耐に溶解し。

５ｖｔｌサンプル−ループをひく。ループの残りは。

溶媒で満たす。約１５から６３ｊクロンまでの粒子サイ
ズをもつシリカゲル６０カラム（２５×１００１００Ｏ
に、　　ｌ５ｃｏ　１３２型ポンプを用いて。

溶液を適用する。カラムをクロロホルム８００ｍ／。

９８：２７０口ホルム−メタノール溶液１２００ｍ１．
で４　Ｗｔｅ　７分の速度で熔出する（流速を過度に増
加した場合１分割（分ｍ＞ｕ良くないということから、
流速は重要である。結果的に、溶出は。

一般的に約０．１　ｔｘｌから２（Ｊｎｌ１分の間で変
動する流速で影響され、ａ常は２−と５−７分の間の速
度である）。カラムからの溶出はフラクシヨン・コレク
ターに連結されており、管につｆｉ８ｄ画分がとられ、
一方力ラムは、９６：４クロロホルム−メタノール溶液
３５００−で溶出される。精製しＡＴＤＭ’ｅ含む管は
、溶出剤として１０：１クロロホルム−メタノール溶液
を用いて、ＴＬＣプレート（シリカゲルＦ−２５４，５
ＸＩＯｍ０．２５ｍ＋ｎ厚さ）にいろいろの両分の一定
量全スポットすることによって測定され、それらの画分
を先に分離された精製されたＴＤＭと比較する。

ＴＬＣプレートの視覚比（目に見えるようにすること）
は、エタノール中の１０％（Ｗ／Ｕ）燐モリブデン酸で
のスプレーによって得られる。精製された’ｌ’ＤＭｔ
一台む画分全台わせ、溶媒は風袋を測定しに丸底フ、ラ
スコで、プツシ回転−蒸気器で蒸発させる。精製され７
ｃＴＤＭ３５８■が得られる。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、粗トレハロースジミコレートの精製に当たり、 （ａ）粗）レバロースジきコレートを溶媒に溶解するこ
   と：および （ｂ３　　約１５および６３ミクロンの間の粒子サイズ
   を有する低圧シリカゲルカラムに溶液を適用することを
   特徴とする精製方法。 ２、該圧が約１０および３００ｐｓｉであり、好ましく
   はほぼ３０および８０　ｐｓｉであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　　溶ｆＬ！：Ｌ”Ｃ，クロロホル□ム、エーテル
   、ヘキサン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフ
   ラン、石油エーテル、ヘプタン、塩化メチレン。 リグロイン、プロパツール、ブタノール、酢酸エチル、
   ベンゼン、トルエン、酢酸またはそれらの混合物を用い
   ることｔ％徴とする特ＰＩＦ　請求の範囲第１項記載の
   方法。 ４．１ｔｉ）レハロースジゼコレートがマイコバクテリ
   アから得られることｔ特徴とする前記特許請求の範囲の
   いずれかに記載による方法。 ５、　マイコバクテリアとして１Ｍ、アビウム。 Ｍ、フレイ、結核菌（菌株Ｈ３７ＲＶおよびアヨ？Ｂ’
   ）、Ｍ、　ボビス、ＢＯＧ、恥垢菌１Ｍ、カンサの範囲
   第４項記載の方法。 ６、溶出を約０．１　ｒｕｔおよび２０ｍＡ！／分間で
   、好ましくは約０．２−および２０＊ｌ／分間での変動
   速度で行なうことを特徴とする特許 のいずれかに記載の方法。 ７、前記特許請求の範囲記載のように実質的に粗トレハ
   ロースジミコレートを精製する方体。 ８、前記特許請求の範囲のいずれかに記載の方法によっ
   て得られたトレハロースジミコレート。 以下余白