DE3323094A1 - Verfahren zur herstellung eines gereinigten, pyridinloeslichen extraktes aus mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines gereinigten, pyridinloeslichen extraktes aus mikroorganismen

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Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES GEREINIGTEN, PYRIDINLÖSLICHEN EXTRAKTES AUS MIKROORGANISMEN
Die Erfindung betrifft einen pyridinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus, der in Verbindung mit Zellwandgerüst (CWS) ein pharmazeutisches Präparat mit antitumoralen Eigenschaften ergibt.
Mit Bakterien wie.z.B. Corynebacterium parvum wurden Versuche angestellt, um diejenigen Komponenten zu isolieren und kennzeichnen, welche die Hemmung des Tumorwachstums bewirken (s. z.B. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum,· Cantrell, et al, Cancer Research, Band 39, S. 3554-3563, September 1979). Abgesehen von seiner antitumoralen Wirkung hat sich der C. parvum als wirkungsvolles Stimulans des lymphoreticularen Systems, welches zu unerwünschter Gewichtszunahme der Milz und der Leber und zu Blastogenese führt, erwiesen. Es wurde herausgefunden, daß ein pyridinlöslicher Extrakt aus einem Mikroorganismus hohe antitumorale Eigenschaften ohne die mit den bekannten Erzeugnissen verbundenen unerwünschten toxischen Wirkungen aufweist.
Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin enthaltenden Proteine und Lipide entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmucopeptid, das Trehalosemycolatreste ("P3") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. ZeIl-Xtfandgerüst erhält man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M.phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M.kansasii, M.tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B) ,
und M.bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlach nur aus diesen. Außerdem kann es auch noch aus anderen Mikroorganismen wie E.coli, B.abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.
Das Zellwandgerüst kann hergestellt werden, indem man zuerst Bakterien, wie z.B„ M.bovis Stamm BCG (bacillus Calmette-Guerin) züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-I)) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen (z.B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin ) unterworfen, vrodurch man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält,,
Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitstellung eines pharmazeutischen Präparats, das einen pyridinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus in Verbindung mit Zellwandgerüst enthält.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung dieses pyridinlöslichen Extraktes aus einem Mikroorganismus.
Erfindungsgegenstand ist ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Tumorbehandlung von Warmblütern und Mensehen unter Verwendung eines den pyridinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus und Zellwandgerüst enthaltenden Präparats.
Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat aus einem pyridinlöslichen Extrakt aus einem Mikroorganismus, der zwischen etwa 7 und 20 Gew.-%
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Protein und etwa 10 bis 16 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 55 Gew.-% Fettsäuren enthält, und Zellwandgerüst (CWS). Der Extrakt enthält vorzugsweise etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren.
Zur Herstellung des pyridinlöslichen Extraktes können alle Mikroorganismen einschl. M.bovis BCG, M. phlei, M. smeqmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium parvum verwendet werden. Corynebacterium parvum ist besonders vorzuziehen.
Vollzellen des Mikroorganismus vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das erhaltene Gemisch wird abgetrennt, um eine Überstandsfraktion enthaltend den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann fakultativ wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung von weiteren Mengen des gewünschten Extraktes unterzogen werden.
Nachfolgend wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete Flüssigkeit,wie z.B. destilliertes Wasser, dialysiert. Das Fehlen von Vollzellen oder Zellfragmentverunreini-25' gungen wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene gereinigte Extrakt kann anschließend nach bekannten Verfahren lyophilisiert werden,um ein beständiges Produkt zu erhalten.
Der erfindungsgemäß hergestellte pyridinlösliche Extrakt kann mit CWS kombiniert werden, um so ein Präparat mit hoher antitumoraler Wirkung zu ergeben, das keine Milz- und Lebervergrößerungen verursacht.
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Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderem Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore, z.B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Marnma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z„B„ Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzell-Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden.
10
15
Das Präparat wird vorzugsweise durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z„ B. in einer Öltröpfchenemulsion, unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen direkt in den Tumor verabreicht. Das besagte Präparat kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einfachen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwisehen etwa 375 und 2500/ag/ml» Die Menge an CWS beträgt zwischen etwa 125 und 375yug/mlo
Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor zu injizierenden Präparats wird von der Tumorgröße be-' stimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nach- 2~> stehenden Tabelle verwiesen wird.
Dosis bei Tieren Ie nach Tumorgröße
Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden
biologischen Präparats
0-1 cm
1-2 cm
30 2-3 cm
bis zu 0,5 ml 0,5 bis 2,5 ml 2,5 bis 5 ml
Q 9 ? Π Q A
ν Z. O J J Τ"
3-5 cm 5 bis 10 ml
5-8 cm 10 bis 15 ml
größer als 8 cm 15 bis 20 ml
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 40 mg an pyridinlöslichem Extrakt und etwa 40 mg CWS. Die Behandlung sieht bis zu sechs, in 2-Wochenintervallen zu verabreichende Injektionen vor.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Präparats in einem geeigneten injizierbaren Mittel, wie z.B.
einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an pyridinlöslichem Extrakt in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 200 und 5000yUg, vorzugsweise zwischen etwa 800 und 1200 /ig, während die Menge an CWS zwischen ungefähr 50 und 2000 yug, die bevorzugte Menge an CWS zwischen etwa 475 und 525 jug, beträgt, wobei in allen Fällen der Dosierung von der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen wird. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal etwa einmal wöchentlich verabreicht.
Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania) .
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Das homogenisiertes Öl < ntha 1 ΐ ende- (V-ini .·■-=.-h vvü,i -t schließend mit ei η on; ivino-'ü:. vi^,·- v,·: jw·?·, >j.-.j.-i·--".--falls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt zwisehen etwa 0,02 und 0,25 Vol=-%, und die bevorzugte Menge beträgt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol„-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats„ Es können alle üblichen Detergentien, wie ZoB« Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Atlas Chemical Com-" pany), verwendet \tferden„
Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit Ttfirkstoffen überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt»
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte Erfindung nicht ein.
Beispiel 1
2Ό Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus Corynebacterium Parvunru
Corynebacterium parvum (P.acnes, Stamm 4182) wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten wurde. Die Paste wurde anschließend mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 Gramm (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden mit 2OO ml reinem Pyridin gemischt und bsi 4 C während einer Stunde mit der 1700-
fachen Erdbeschleunigung g (9,81 m/s ) zentrifugiert» Ein pyriainlöslicher Extrakt wurde als Überstandsfraktion entfernt«, Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, extrahiert» Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von
- IO -
Whatman No. 1-Papier wurden die Pyridin-Fraktionen vereinigt und das Lösungsmittel durch Verdampfung bei 5O C in einem Buchi-Rotationsverdampfer (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) entfernt. Der getrocknete Pyridin-Extrakt wurde eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene gereinigte Pyridin-Extrakt enthielt etwa
• 12 Gew.-% Protein, etwa 12 Gew.-% Zucker und etwa 45
• Gew„-% Fettsäuren. Der Extrakt wurde elektronenmikroskopis'ch untersucht .und es wurde festgestellt, daß er frei von Verunreinigungen in Form von Vollzellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichem Extrakt betrug 9% (8,1 g).
Beispiel 2
Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus M.bovis Stamm BCG.
M. bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei.37°C während 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine gewaschene Vollzellpaste erhalten wurde. 50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden anschliessend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt in einer Ausbeute von 7% (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt enthielt 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew.-iS Fettsäuren.
Beispiel 3
Versuche an Guinea-Schweinen mit Line-10 Tumor
Sieben Schweinen vom 2-Guinea-Stamm mit Line-10 Tumorgewachsen mit einem Durchmesser von etwa 9 mm wurde ein- -io itui 1 eine Injektion mit O, 4 ml einer sterilen Öltröpfchenor.iu 1 si on, d.h. mit Drakeol 6 VR Mineralöl (Pennsylvania Kof mmo Company, Hutlor, Pennsylvania) enthaltend
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300 ^g des gemäß BoispirJ 1 licrgcstollion pyridinlor.-lichen Extraktes und r>O/ig %c;l 1 wandgeriist direkt in dui; Tumorgewebe verabreicht.
Nach 3 Monaten wurden die Tiere untersucht und bei 6 der 7 Tiere eine totale Rückbildung des Tumorwachstums festgestellt.
Bei Kontrollexperimenten wurde sechs Schweinen vom 2--Guinea-Stamm, die mit Line-10 Tumorwachstum mit einem Durchmesser von etwa 9 mm befallen waren, einmal eine Injektion mit O74 ml der oben beschriebenen sterilen Öltröpfchenemulsion ohne Pyridin-Extrakt oder ohne Zellwandgerüst direkt in das Tumorgewebe verabreicht. Bei keinem der 6 Schweine konnte auch nur das geringste Anzeichen einer Rückbildung des Tumors nach Ablauf von 3 Monaten festgestellt werden„

Claims (10)

ο ζ. ·:■ fl Q Λ --» O co ν . F Ü N E R <- - E B JB " J „ "N "C. "\A,Λ U S FINCK PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 60, D-BOOO MÜNCHEN aß RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC. 27. Juni 1983 DEAA-31159„1 VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES GEREINIGTEN, PYRIDINLÖSLICHEN EXTRAKTES AUS MIKROORGANISMEN Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten, pyridinlöslichen Extraktes aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) eine Vollzell-Paste aus der Bakterie herstellt,
(b) diese Paste wäscht,
(c) die Paste mit Pyridin umsetzt, um einen Extrakt und einen Rückstand zu erhalten,
(d) das Pyridin aus dem Extrakt entfernt, und
(e) den getrockneten Extrakt dialysiert und einen gereinigten, pyridinloslxchen Extrakt erhält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man den gereinigten, pyridinlöslichen Extrakt lyophilisiert„
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß es sich bei dem Mikroorganismus um M. bovis BCG, M.phlei, M. smecmatis, M.Kansasii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae oder Corynebacterium parvum, vorzugsweise um Corynebacterium parvum, handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man den
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Rückstand mit Pyridin zu zusätzlichen Mengen des pyridinlöslichen Extraktes umsetzt.
5. Pyridinlöslicher, aus Mikroorganismen erhaltener Extrakt, dadurch gekennzeichnet , daß er zwischen etwa 7 und 20 Gew.-% Protein, zwischen etwa 10 und 16 Gew„-% Zucker und zwisehen etwa 35 und 55 Gew.-% Fettsäuren enthält.
6s Extrakt nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge an Protein und Zucker je etwa 12 Gew.-% und die Menge an Fettsäuren etwa 45 Gew.-% beträgt.
7. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet , daß es eine therapeutisch wirkungsvolle Menge des Produktes gemäß Anspruch 5, Zellxvandgerüst und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.
8. Präparat nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet , daß es in lyophilisierter Form vorliegt, und daß der Träger eine Öltröpfchenemulsion ist, wobei die Ölmenge zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung, beträgt.
9. Präparat nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekannzeichnet, daß es sich bei dem Öl um Squalan, leichtes Mineralöl, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl oder Drakeol 6VR Mineralöl handelt, und daß das Präparat zusätzlich ein Detergens in einer Menge von zv/ischen etwa 0,02 und O,25 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats enthält.
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10. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge des pyridinlöslichen Extraktes und des Zellxirandgerüstes je bis zu etwa 40 mg, die bevorzugte Menge an pyridinlöslichem Extrakt zwischen etwa 200 und 50OO yag und die bevorzugte Menge Zellgerüst zwischen etwa 5O und 2000 /ug, beträgt.
DE19833323094 1982-06-30 1983-06-27 Verfahren zur herstellung eines gereinigten, pyridinloeslichen extraktes aus mikroorganismen Granted DE3323094A1 (de)

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