DE3318568A1 - Therapeutische zusammensetzung enthaltend gereinigtes, entgiftetes endotoxin, trehalosedimycolat und ein mit azeton ausgefaelltes nebenprodukt von mit chloroform-methanol extrahierten endotoxischen glykolipiden - Google Patents

Description

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THERAPEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG ENTHALTEND GEREINIGTES, ENTGIFTETES ENDOTOXIN, TREHALOSEDIMYCOLAT UND EIN MIT AZETON AUSGEFÄLLTES NEBENPRODUKT VON MIT CHLOROFORMMETHANOL EXTRAHIERTEN ENDOTOXISCHEN GLYKOLIPIDEN

Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, aus drei Komponenten. Die erste Komponente ist gereinigtes, entgiftetes Endotoxin (RDE), das dadurch gekennzeichnet ist, daß es kein nachweisbares 2-Keto -3-deoxyoctanoat, jedoch zwischen etwa 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält. Die zweite Komponente ist Trehalosedimycolat und die dritte Komponente ist ein mit Azeton ausgefälltes Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden (ACP). Diese Zusammensetzung ist eine hochwirksame antitumorale Zusammensetzung und bei der Behandlung von Krebstumoren in Tieren und Menschen anwendbar.

Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaciae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immunotherapie bei verschiedenen immunogenen Tumoren (s. Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen hoch toxisch, weshalb ihre Verwendung bei der Behandlung von Krebstumoren beschränkt ist. Es sind Versuche unternommen worden, die Endotoxine zu entgiften, ohne deren tumorrückbildendte Eigenschaft zu beeinträchtigen. Wie von Ribi, et al, aufgezeigt, führten die zur Entgiftung von Endotoxin bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung seiner Adjuvantizität bekannten chemischen Verfahren, wie z.B. Succinylierung und Phthalylierung, zum 5 Verlust sowohl der Endotoxizität als auch der tumorrück-

bildenden Eigenschaft. Demzufolge blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eines Endotoxinprodukts mit hoher tumorrückbildender Eigenschaft und geringer oder keiner Toxizität ohne Erfolg.

Das mit Azeton ausgefällte Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxisehen Glykolipiden (ACP) hat bei seiner alleinigen Verwendung oder bei der Verwendung kombiniert mit Trehalosedimycolat keine tumorrückbildenden Eigenschaften. Zwecks einer vollständigeren Untersuchung des ACP, seiner Eigenschaften und Herstellungsverfahren wird auf die eingangs erwähnte Veröffentlichung von Ribi, et al verwiesen.

Erfindungsgegenstand ist daher die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein gereinigtes, entgiftetes Endotoxinprodukt in Verbindung mit ACP und TDM enthält, welche eine hohe tumorrückbildende Wirksamkeit, jedoch keine toxischen Nebenwirkungen, die normalerweise mit Endotoxinprodukten verbunden sind, aufweiweist.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung von Verfahren zur Behandlung von Menschen und Tieren mit der obengenannten Zusammensetzung bei der Remission oder Rückbildung von Krebsgewächsen.

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung aus RDE, das kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, jedoch zwischen etwa 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält, TDM und ACP. Die Zusammensetzung ist bei der Behandlung von Krebstumoren bei Tieren und Menschen wirksam.

— it —

Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin (RDE) verwendeten Typs können, wie eingangs bereits erwähnt, aus Enterobacteriaciae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen:

Salmonella, Shigella, Escherichia, Bruceila, Bordetella, Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsieila und Serratia.

Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:

S.minnesota, S.typhimurium, B,pertussis, B.abortus, S.enteritidis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa, Shigella flexni und S.abortus equi.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte können durch eines der nachfolgenden bekannten Verfahren hergestellt werden.

1) Webster, M.E., Sagin, J.P., Landy, M., and Johnson, A-G., J.Immunol. 1955, 744,55. 2) Westphal, 0., Luderitz, 0., and Bister, P., Z.

Naturforsch, 76 148 (1952).

3) Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides' in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison printing Co., 1957, 115. 4) Galanos, C, Luderitz, Ο., Westphal, Ο., Eur. J.

Biochem, 9. 245 (1969).
5) Chen, CH., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A-,

Levin, J., Nowotny, Α., J. Infect. Pis 128 543 (1973).

6) Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K. C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961).

7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290

(1967).

8) Ribi, E., Milner, K.C, and Perrine, T., J. Immunol. 82. 75 (1959) .

Das von Chen et al beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, stellt die bevorzugte Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extrakts dar.

Das Methanol-Chloroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und anschließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid A mit verringerter Toxizität und Pyrogenizität, verglichen mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin, zu erhalten. Das erhaltene Material wird daraufhin mit einem Lösungsmittel behandelt, welches fähig ist, Fettsäuren und andere Verunreinigungen, jedoch nicht das Roh-Lipid A, zu lösen. Der Phosphatgehalt im entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen Endotoxin festgestellten Konzentration, was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen von Endotoxinen in Beziehung steht.

Die für die Reaktion mit MCP bevorzugt verwendeten anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure; die bevorzugten organischen Säuren sind Toluolsulfonsäure oder Trichloressigsäure. Die Reaktion kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen etwa 90 C und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen etwa 15 und 60 Minuten, durchgeführt werden.

Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann durch Reaktion des Ausgangsmaterials mit der Säure in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels wie z.B. Chloroform, Methanol, Äthanol oder Verbindungen davon erfolgen.

Das erhaltene Roh-Lipid A wird in einem Lösungsmittel, welches Fettsäuren zu lösen vermag, ohne dabei jedoch das Roh-Lipid A zu lösen, gelöst. Dazu eignet sich besonders Azeton. Das Lösungsmittel wird daraufhin entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin zu erhalten.

Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und die Lösung durch eine geeignete Chromatographiesäule, wie z.B. eine Molekularausschluß-Chromatographiesäule, geschickt, um die RDE-Fraktionen abzutrennen, welche nach der Entfernung des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung in Anwesenheit eines Lösungsmittels wie z.B. Chloroform, Methanol, Azeton, Pyridin, Äther, Essigsäure oder Gemische davon, durch eine Sephadexsäule geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt aber vorzugsweise

im Bereich zwischen Atmosphärendruck und 70 N/cm , und die Fließgeschwindigkeit liegt etwa zwischen 0,1 und 10 ml/Min.

Gemäß einer anderes Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt. Die Fließgeschwindigkeit kann zwischen etwa 2 und 15 ml/Min gehalten werden.

Die Lösungsmittel sind ebenfalls die gleichen, wie sie bei der Sephadexsäule verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diäthylamin in einer Konzentration bis zu etwa 1% zugegeben werden kann.

-Jf-%

Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die Lösung durch eine Niederdruck-60-Säule mit Silikagelteilchen mit einer Teilchengröße zwischen etwa 25 /um und 63yum unter Verwendung eines Lösungsmittels aus Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniumhydroxyd geschickt„ Das bevorzugte Volumenverhältnis der Lösungsmittelkomponenten beträgt etwa 50:25:4:2,

Die zweite Komponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, nämlich Trehalosedimycolat (TDM),kann aus Organismen wie z.B. M.avium, M.phlei, M.tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra und Corynebacterium diphtheriae hergestellt werden.

Die Bakterien, wie z.B. M. avium, werden gezüchtet, abgeerntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P₃; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silikagel gereinigt werden.

Die dritte Komponente der Zusammensetzung ist ein mit Azeton ausgefälltes Nebenprodukt von mit Chloroform-Methanol extrahierten endotoxischen Glykolipiden (ACP). Wie schon eingangs erwähnt, werden in der Veröffentlichung von Ribi, et al ausführlich dessen Zusammensetzung und die

-Xi-

Herstellungsverfahren beschrieben. ACP kann aus allen der vorher bei der Erläuterung von RDE erwähnten Enterobacteraciae hergestellt werden.

RDE, TDM und ACP werden miteinander kombiniert, um eine Zusammensetzung mit hoher antitumoraler Wirksamkeit zu erhalten. Mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können unter anderem Krebsarten wie die folgenden tierischen Tumore, z.B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z.B. Brusttumore, Lungentumore, Coleo-Rectal-Tumpr, malignes Melanom, Schuppenzeil-Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden. Die Zusammensetzung wird durch Injektion in einem pharmazeutisch geeignetem Mittel, wie z.B. in einer Öltröpfchenemulsion, verabreicht. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung direkt in den Tumor unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen. Die Zusammensetzung kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.

Die RDE-Menge in einer einfachen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen etwa 6,25 und 25O^ig/ml. Die Menge an ACP beträgt zwischen etwa 375 /and 750 ug/ml und die des TDM zwischen etwa 125 und 250 /ug/ml. Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor injizierten Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird.

"~ ' ~ "λθ
-VL-

Dosis bei Tieren ie nach Tumorqröße

Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden

biologischen Präparats

bis zu O,5 ml 0,5 o±s 2,5 ml 2,5 bis 5 ml 5 bis 10 ml 10 bis 15 ml großer als 8 cm 15 bis 20 ml

0-1	cm
1-2	cm
2-3	cm
3-5	cm
5-8	cm

Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 4500 RDE, etwa 4500 /ag ACP und etwa 1500 μg TDM. Die Behandlung sieht bis zu 5, in 1-Wochenintervallen verabreichte Injektionen vor.

Die Verabreichung der RDE-ACP-TDM-Zusammensetzung in einem geeigneten injiezierbaren Mittel, wie z.B. einer Öltröpfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen Tumor erfolgen. Die Menge an RDE bzw. ACP in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 50 und lOOO μg. Die Menge des in einer Injektion zu verabreichenden TDM kann zwischen etwa 50 und 300 pg liegen. Die bevorzugte Dosierung an RDE und TDM liegt zwischen etwa 125 und 175 /ug, während die bevorzugte Dosierung an ACP jeder Injektion zwischen etwa 275 und 325 yug beträgt, wobei in allen Fällen von der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen wird. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal einmal wöchentlich verabreicht. Gewöhnlich empfiehlt sich die Verabreichung einer Zusammensetzung, die zwischen etwa 50 und 500 /ug/ml RDE, zwischen etwa 50 und 500 yug/ml ACP und zwischen etwa 50 und 150 fig/ml TDM je Injektion enthält.

AA

-Yl-

Wie oben beschrieben, kann die Zusammensetzung bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl, Squalane, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergent, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergents beträgt zwischen etwa 0,02 und 0,2 Vol.-%, und die bevorzugte Menge beträgt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Es können alle üblichen Detergentien verwendet werden, wie z.B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Atlas Chemical Company).

Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit RDE, ACP und TDM überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte Erfindung nicht ^in.

Beispiel 1

Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.

Eine 650 mg-Probe eines gemäß dem Verfahren von Chen, et al J. Infect. Pis. 128 543 (1973) hergestellten Methanol-Chloroform-Präzipitats wurde in 150 ml 0,IN HCl in einem mit einem Kondensator versehenen Dreihais-Rundboden-Kolben suspendiert und in ein Beschallungsgerät getaucht.r Nach der Beschallung wurde die Glasvorrichtung in ein Ölbad, dessen Temperatur bei 120°C gehalten wurde, versenkt, wodurch die Innentemperatur des Kolbens sich dem Siedepunkt der Lösung näherte oder ihn überschritt. Durch Anbringen eines mit einer Stickstoffgasquelle verbundenen Kapillarröhrchens am Kolben durch einen der Hälse wurde die Überhitzungsgefahr so gering wie möglich gehalten. Während des Hydrolyseverfahrens erfolgte ein kontinuierlicher Stickstofffluß.

Die Hydrolyse dauerte 30 Minuten. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, schallbehandelt, um die Feststoffe zu dispergieren, und in Corex-Röhrchen verteilt.

^Der Kolben wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um alle den Seitenwänden des Kolbens anhaftenden Feststoffe zu beseitigen, und die Waschflüssigkeit der Suspension in den Corex-Röhrchen zugegeben. Anschließend wurde bei 12.000 Upm während 80 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und verworfen. Der Feststoffrückstand wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert, schallbehandelt, bis eine gute Verteilung der Suspension erreicht war, und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugierung wurde daraufhin wiederholt. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser aufgenommen, gefriergetrocknet und lyophilisiert, wodurch 382 mg rohes Lipid A erhalten wurden. 150 mg dieser Substanz wurden zwecks Entfernung der Fettsäuren mit kaltem (0 C) Azeton behandelt, schallbe-

handelt und durch eine Whatmann Nr. 1-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5 C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

Beispiel 2
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.

Eine 120 mg-Probe eines MCP (Methanol-Chloroform-Präzipitats) wurde in 12 ml absolutem Methanols suspendiert, zwecks Dispersion der Feststoffe schallbehandelt und in 6 1x10 cm große Schraubverschlußampullen verteilt.

Jeder Ampulle wurden 2 ml 0,2N HCl zugegeben, und die erhaltene Suspension wurde während 45 Minuten in einem Bad mit kochendem Wasser bebrütet. Nach der Hydrolyse wurden die Ampullen in einem Eiswasserbad gekühlt und bei 2500 Ump während etwa 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und dem Rückstand wurden 5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) zugegeben, um die Auflösung zu bewerkstelligen. Jeder Ampulle wurden 2 ml Wasser zugegeben,und die Lösung wurde vermischt. Die Zweiphasen-Lösung wurde erneut bei 2500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde verworfen, und jeder Ampulle wurde 1 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) zugegeben, woraufhin klare Lösungen erhalten wurden. Die Lösungen wurden anschließend vereinigt, und das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde unter Hochvakuumbedingungen getrocknet und lyophilisiert, worauf man 45 mg rohes Lipid A erhielt. 20 mg davon wurden mit kaltem (O⁰C) Azeton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatmann Nr 1-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert„ Nach dem T: rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

tung bei 5 C abfiltriert,, Nach dem Trocknen blieben 13 mg

Beispiel 3

Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin).

110 g LH-20-lOO (Teilchengröße: 25-100 pm nach Pharmacia) wurden mit 600 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) vermischt und anschließend 30 Minuoen stehengelassen. Die dadurch erhaltene Aufschlämmung wurde in eine 25 χ 1000 mm große, mit Druckfittings ausgestattete Glaschromatographiesäule (BRL Laboratories) gegeben. Nach erfolgter Beschikkung wurde die Säule durch ein Teflon-Druckrohr an eine Pumpe (ISCO Model 132) angeschlossen. 400 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) wurden mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min durch die Säule gepumpt. 100 mg des nach Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurden über ein Rohr zur Probenvolumenbestimmung in 2,5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) auf die Säule aufgegeben. Der Zufluß wurde auf 1 ml/min reduziert, und, nachdem eine Menge von 150 ml Eluierungsmittel erhalten worden war, wurde der Abfluß mit einem Fraktionssammler verbunden. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und gereinigte, entgiftete Endotoxinfraktionen durch Dünnschicht-Chromatographie-Analyse ermittelt (e. Merck, Dicke: 0,25 mm, Chloroform/Methanol/H₀0/NH.OH (50:25/4:2) als Eluierungsmittel).

Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weißen Pulvers zurückblieben.

Beispiel 4

Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin).

33 g DEAE-Zellulose (Whatmann DE-32) wurden in 150 ml Eisessig suspendiert und während 10 Minuten schwach gerührt, woraufhin eine pulverige Aufschlämmung erhalten wurde. Das Gemisch wurde über Nacht beiseite gestellt.

Die Aufschlämmung wurde in eine 25 χ 400 mm große Säule gegossen, wo sie sich unter Beklopfen absetzte, und anschließend der Säureüberschuß abgezogen. Die Säule wurde zuerst mit 2000 ml Methanol und dann mit 200 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) gewaschen.

Eine 100 mg-Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurde in 3 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) oder eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (80:20:1) in die Säule gegeben. Die Säule wurde zuerst mit 350 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) und dann mit 300 ml eines Methanol-Wasser-Gemisches (99:1) eluiert. Unter Verwendung eines Apparats mit linearem Gradienten wurde die Säule mit 2000 ml eines linearen Gradienten,beginnend mit 100-%igem Methanol und schließlich mit 0,2 M Essigsäure in Methanol, eluiert. Die Säule wurde bei einer Geschwindigkeit von 6 ml/min eluiert, und es wurden 15 ml an Fraktionen gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Bartlett, G.R., J= Biol. Chem. 234, 466-471

(1959) auf ihren Gesamtgehalt an Phosphor untersucht. Die Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockenheit abgedampft und in 10 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) und 40 ml einer O₇OOl M Essigsäure in einen Scheidetrichter aufgenommen.

Die untere Schicht wurde abgetrennt, durch ein Whatmann Nr 2-Filterpapier abfiltriert und bis zur Trockenheit abgedampft, wonach 19,2 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin erhalten wurden.

Beispiel 5

15 Schweinen vom 2-Guinea-Stamm mit Line-ΙΟ Tumorgewächsen von etwa 9 mm wurde einmal eine 0,4 ml-Injektion enthaltend 150 ug RDE, 150 yug ACP und 50 pg TDM direkt in das Tumorgewebe verabreicht.

Nach Beendigung des Verabreichungszeitraums wurde jedes der Guinea-Scheine untersucht, um die Auswirkung der Injektionsbehandlung auf das Tumorwachstum festzustellen. Bei 14 der 15 Versuchstiere zeigte sich eine völlige Rückbildung des Tumorwachsturns.

Es wurden Kontrollexperimente an zwei Gruppen mit jeweils 6 Schweinen vom 2-Guinea-Stamm, die mit Line-10 Tumorwachstum der obenangegebenen Größe befallen waren, durchgeführt. Der ersten Gruppe mit 6 Guinea-Schweinen wurde einmal eine 0,4 ml-Injektion, enthaltend 50^g RDE und 50 /ig TDM, verabreicht. Der zweiten Gruppe mit 6 Guinea-Schweinen wurde einmal eine 0,4 ml-Injektion, enthaltend nur 50yug RDE, verabreicht. Nach Beendigung des Versuchs wurde jedes der Guinea-r-Schweine untersucht, um die Auswirkung der Behandlung festzustellen. Bei keinem der 12 Guinea-Schweine waren Anzeichen für eine Rückbildung oder Remission des Tumorwachstums festzustellen.

Claims (3)

F ü N E R .:.."--E B--B--I- N (S" Η-ΛΑ US FINCK PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95Ο1 60, D-8OOO MÜNCHEN 95 RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC. 20. Mai 1983 DEAA-31031.6 THERAPEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG ENTHALTEND GEREINIGTES, ENTGIFTETES ENDOTOXIN, TREHALOSEDIMYCOLAT UND EIN MIT AZETON AUSGEFÄLLTES NEBENPRODUKT VON MIT CHLOROFORM-METHANOL EXTRAHIERTEN ENDOTOXISCHEN GLYKOLIPIDEN Patentansprüche

1. Therapeutische Zusammensetzung enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an

a) gereinigtes, entgiftetes Endotoxin, das kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, jedoch zwischen 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält;

b) ein mit Azeton ausgefälltes Nebenprodukt von mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch extrahierten endotoxischen Glykolipiden;

c) Trehalosedimycolat; und

d) einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die therapeutisch wirksame Menge an gereinigtem, entgiftetem Endotoxin bis zu etwa 4500 ^ug, die therapeutisch wirksame Menge des mit Azeton ausgefällten Nebenprodukts bis zu etwa 4500 ^üg und die therapeutisch wirksame Menge des Trehalosedimycolats bis zu etwa 1500 ug beträgt.

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3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß sie in lyophilisierter Form oder in Form einer- Öltröpfchenemulsion vorliegt.