DE3448164C2

DE3448164C2 -

Info

Publication number: DE3448164C2
Application number: DE3448164A
Authority: DE
Inventors: Edgar Ernst Hamilton Mont. Us Ribi
Original assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Current assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Priority date: 1983-08-26
Filing date: 1984-08-23
Publication date: 1987-06-25
Also published as: DK389384A; NO843243L; DE3431058C2; ES8606883A1; SE8404090D0; HUT34887A; GB2147806B; HU191713B; AT389228B; KR880002223B1; JPH0556326B2; CA1225592A; NL192326B; NL192326C; FR2550945A1; AU554039B2; ATA273384A; KR850001696A; GB2147806A; IT8448757A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines gereinigten, entgifteten Endotoxinprodukts (RDE-Produkts) als wirk samer Immunstimulator sowie als Adjuvans.

Das erfindungsgemäß verwendete, gereinigte, ent giftete Endotoxin (RDE) ist dadurch gekennzeichnet, daß es kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, zwischen etwa 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält.

Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaceae, ein schließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immuno therapie bei verschiedenen immunogenen Tumoren (siehe Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea- Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen hochtoxisch, weshalb ihre Verwendung bei der Be handlung von Krebstumoren beschränkt ist. Es sind Versuche unternommen worden, die Endotoxine zu "entgiften", ohne deren tumorrückbildende Eigenschaft zu beeinträchtigen. Wie in Ribi et al., supra, aufgezeigt, führten die zur Ent giftung von Endotoxinen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihres Adjuvanscharakters bekannten chemischen Verfahren, wie z. B. Succinylierung und Phthalylierung, zum Verlust sowohl der Endotoxizität als auch der tumorrückbildenden Wirk samkeit. Folglich blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eines gereinigten, entgifteten Endo toxinprodukts ohne Erfolg.

Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Her stellung des erfindungsgemäß verwendeten RDE Typs können aus sämtlichen Enterobacteriaceae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhal ten werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen:

Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.

Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:

S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni und S. abortus equi.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte können z. B. durch eines der folgenden bekannten Verfahren hergestellt werden:

1) Webster, M. E., Sagin, J. F., Landy, M., and Johnson, A. G., J. Immunol. 1955, 744, 55.
2) Westphal, O., Luderitz, O., and Bister, F., Z. Naturforsch, 76, 148 (1952).
3) Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N. J. Madison Printing Co., 1957, 115.
4) Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O., Eur. J. Biochem. 9, 245 (1969).
5) Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N., Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis. 128, 543 (1973).
6) Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., Milner, K. C., The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961).
7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 290 (1965).
8) Ribi, E., Milner, K. C., and Perrine, T., J. Immunol. 82, 75 (1959).

Das von Chen et al. beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, ist die am besten geeignete Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extrakts.

Das Methanol-Chloroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und an schließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid A mit verringerter Toxizität und Pyrogenizität, verglichen mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin, zu erhalten. Das erhal tene Material wird daraufhin mit einem Lösungsmittel behan delt, welches fähig ist, besonders Fettsäuren und andere Verun reinigungen zu lösen, ohne daß das Roh-Lipid A gelöst wird.

Ein für diesen Zweck geeignetes Lösungsmittel ist Aceton. Der Phosphatgehalt im entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen Gegenstück fest gestellten Konzentration, was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen von Endotoxinen in Beziehung steht.

Die sich für die Reaktion mit MCP eignende anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, während die Toluolsulfonsäure und die Trichloressigsäure geeignete organische Säuren sind. Die Reaktion kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen 90°C und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen 15 und 60 Minuten, zweckmäßig durchgeführt werden. Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann auch durch Reaktion des Ausgangsmaterials mit der ausgewählten Säure in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Ethanol oder Gemischen davon erfolgen.

Das erhaltene Roh-Lipid A wird in Aceton, das sich zur Ent fernung der Fettsäurekomponenten besonders gut eignet, ge löst. Das Lösungsmittel wird daraufhin entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin zu erhalten.

Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und durch eine geeignete Chromatogra phiesäule, wie z. B. eine Molekularausschluß-Chromatogra phiesäule, geschickt, um die RDE-Fraktionen abzutrennen, welche nach der Entfernung des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung in Anwesenheit eines Lösungsmittels, wie z. B. Chloroform, Methanol, Aceton, Pyridin, Ether, Essigsäure oder Gemische davon, durch eine Sepha dexsäule^R geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt jedoch gewöhnlich im Bereich zwischen Atmosphären druck und 70 N/cm², während die Fließgeschwindigkeit zwischen 0,1 und 10 ml/min beträgt.

Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die rohe, ent giftete Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule^R durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt. Die Fließgeschwindigkeit kann zwischen etwa 2 und 15 ml/min gehalten werden. Die Lösungsmittel sind ebenfalls dieselben, wie sie bei der Sephadexsäule^R verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diethylamin in einer Konzentration bis zu etwa 1% zugegeben werden kann.

Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die Lösung durch eine Niederdruck-Silikagel-60-Säule mit einer Teilchengröße von zwischen 15 µm und 63 µm unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels wie z. B. Chloroform, Methanol, Wasser oder Ammoniumhydroxid geschickt. Das bevorzugte Volumenverhältnis des obigen Lösungsmittel gemisches beträgt etwa 50 : 25 : 4 : 2.

Das RDE wird als Stimulans der Immunreaktion von Warmblütern gegen Antigene wie z. B. Mikrobakterien und Pilzzellen, Mikrobakterienzellfragmente, Viren, syn thetische Peptide (Untereinheiten von Viren), die Zell- und Virusuntereinheiten nachahmen, angewandt.

Bei speziellen Antigenen, bei denen sich die auf Grund der Ver abreichung von RDE erhöhte Immunreaktion auswirkt, handelt es sich um Cryptococcus neoformans candida spp., Chlamydia spp., Legionella spp. clostridia, Hepatitis meningitis, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Herpesvirus, Brucella spp., Borditella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Camphylobacter spp., Versinia spp., Pasturella spp., Francisella spp., Listeria spp. und dergleichen.

Das erfindungsgemäß verwendete RDE weist eine B-Zellen mitogene Aktivität auf, d. h. es aktiviert bei seiner Ver abreichung an Warmblütern bei angemessener Dosierung die B-Lymphozyten, welche die für die Produktion von Antikörpern verantwortlichen Zellen sind.

Versuche (1) B-Zellen-mitogene Aktivität

RDE ist durch seine Fähigkeit zur Aktivierung von B-Lympho zyten, die die für die Produktion von Antikörpern verant wortlichen Zellen sind, gekennzeichnet, wie nachstehend ausgeführt wird.

Mitogene Aktivität von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin

(2) Produktion von Interleukin-I

Das RDE kann zur Anregung der Produktion der durch Makro phagen freigesetzten Lymphokine verwendet werden. Interleu kin-I ist ein löslicher, von Makrophagen freigesetzter Im munregulator, der für die Aktivierung von Lymphozyten im Infektionsherd verantwortlich ist. Interleukin spielt als Verstärker der Immunreaktion eine wichtige Rolle.

Mäusemakrophagen wurden auf Mikrotiterplatten (1×10⁶ pro Vertiefung) aufgebracht, wobei jede Bestimmung dreimal er folgte. In die ersten Vertiefungen wurde 1 ml einer 50 µg/ml-Lösung des gemäß der in der vorher erwähnten schwebenden Anmeldung beschriebenen Verfahrens hergestellten Standard-Endotoxins eingebracht. Der zweiten Serie von Vertiefungen wurde 1 ml einer 50 µg/ml-Lösung des erfin dungsgemäßen RDE zugegeben. Jedes Agens wurde in M 199 Medium mit 5% FCS (fötales Kalbserum) löslich gemacht. Zu Kontrollzwecken wurde der dritten Serie von Vertiefungen 1 ml M 199 Medium zugegeben.

Die Platten wurden während 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und verdünnt, wonach man eine Lösung mit einem Verhältnis von 1 : 10 von Überstand zu destilliertem Wasser erhielt. Der Überstand wurde gemäß der Methode von Gery et al., Cellular Immun. 64, 293 (1981) auf Interleukin-I-Produktion hin untersucht.

Die nach der Entfernung des Überstandes verbleibenden Zellen wurden unter Verwendung von 0,1% Triton X-100 aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit RPMI 1640 Medium mit 5% fötalem Kalbserum bei einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 10 verdünnt.

Die verdünnte Lösung wurde auf Interleukin-I-Produktion hin getestet, indem die Erhöhung der durch PHA verursachten Makrophagenaufnahme von H³-Thymidin, wie im obengenannten Verfahren von Gery et al., beschrieben, gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgezeigt.

Tabelle I

Wie aus Tabelle I hervorgeht, war die Interleukin-I-Pro duktion aus erfindungsgemäßem RDE in den aufgelösten Zel len weitaus höher als die Produktion von Interleukin-I aus dem Standard-Endotoxinextrakt.

Derselbe Versuch wurde unter Verwendung von menschlichen Monozyten an Stelle der Mäusemakrophagen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgezeigt:

Tabelle IA

(3) Aktivierung von Makrophagen

Das erfindungsgemäß verwendete RDE stimuliert auch die Makrophagen, wie durch die Fähigkeit der Makrophagen, fluoreszierende Bläschen zu phagozytieren, nachgewiesen werden konnte.

Zwecks Herstellung von drei Testlösungen wurden 1×10⁶ peritoneale Exsudatzellen mit jeweils 5 µl einer Lösung eines Testmaterials, das einmal normales Endotoxin, einmal erfindungsgemäßes RDE und einmal - als Kontrolle - physio logische Kochsalzlösung enthielt, gemischt. Jede der Lösungen enthielt 1 µg des Versuchsmaterials und 20 µg einer Suspension aus fluoreszierenden Bläschen. Die Versuchs lösungen wurden auf einzelne Mikroskop-Objektträger aufge bracht und dann während 90 Minuten bei 37°C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht und durch visuelle Beobachtung die Anzahl der Zellen ermittelt, die fluoreszie rende Bläschen phagozytiert haben sowie auch die Anzahl der Bläschen je Zelle ermittelt.

Der Phagozytoseindex wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:

Die Ergebnisse zweier Versuche sind in der Tabelle II auf gezeigt.

Tabelle II

Wie aus Tabelle II hervorgeht, war der Phagozytoseindex des RDE wesentlich höher als der von Standard-Endotoxin, so daß der Nachweis erbracht ist, daß das gereinigte, entgiftete Endotoxin (RDE) ein außer ordentlich wirksamer Makrophagenstimulator ist.

(4) Wirksamkeit als Adjuvans

Zur weiteren Bestätigung der Tatsache, daß die Verwendung von RDE das Immunsystem bei Warmblütern anregt, wurde das RDE auf Adjuvansaktivität hin untersucht, wobei man vom Kriterium seiner Fähigkeit zur Erhöhung der Immunreak tion gegen rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) ausging, und zwar durch Messung der Fähigkeit der Antikörper, die roten Blutkörperchen von Schafen aufzulösen, untersucht.

Es wurden drei Testmaterialien hergestellt, wobei jedes SRBC (rote Blutkörperchen von Schafen), in einer Menge von 1×10⁷ enthielt. Das Testmaterial enthielt weiterhin 20 µg Standard-Endotoxin+SRBC, während das Versuchsmaterial 20 µg des erfindungsgemäßen RDE+SRBC enthielt.

Die Versuchssubstanzen wurden Mäusen vom Stamm BALB/C interperitoneal injiziert. Nach 4 bis 5 Tagen wurden die Versuchstiere getötet und deren Milz entnommen und in einem Gewebezerkleinerer zerrieben. Unter Verwendung eines Hämo zytometers wurde aus jeder Milz eine Standard-Zellsuspen sion hergestellt und jede dieser Suspensionen zusammen mit dem Versuchsobjekt SRBC, den Medien und Agar auf Objekt träger aufgebracht.

Die Objektträger wurden während 2 Stunden bei 37°C inku biert, und als Komplement wurde auf jeden Objektträger Meerschweinchenserum aufgebracht, bevor eine weitere Inku bation während 30 Minuten bei 37°C folgte.

Anschließend wurden die Objektträger untersucht, um die An zahl der plaquebildenden Zellen, d. h. die Bereiche, in denen die Antikörper mit Hilfe des im Meerschweinchenserum gefundenen Komplements die SRBC-Zellen zerstörten, zu ermitteln.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle III angezeigt.

Tabelle III

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, war die Zahl der plaquebildenden Zellen bei der Verwendung von RDE wesent lich höher, verglichen mit der Anzahl bei Verwendung von Standard-Endotoxin, was bestätigt, daß RDE ein hochwirk sames Adjuvans ist.

Das in vorliegender Erfindung verwendete RDE kann in Ver bindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Mittel wie z. B. physiologischer Kochsalzlösung oder einer Öltröpfchenemul sion verabreicht werden. Die obenerwähnte Zusammensetzung kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfah rens, stabilisiert und anschließend ohne Verlust an Wirk samkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.

Wie oben beschrieben, kann die Zusammensetzung bei der Be handlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Öl tröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für geeignete Öle sind leichtes Mineralöl, Sqalan^R, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl^R und Drakeol 6 VR^RMineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).

Das homogenisierte, Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergens beträgt gewöhnlich zwischen 0,02 und 0,20 Vol.-%, und die bevorzugte Menge liegt zwischen 0,10 und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Es können alle üblichen Detergenzien verwendet werden, wie z. B. Tween-80^R und Arlacel^R (hergestellt von der Atlas Chemical Company).

Das nach dem Zusatz des Detergens erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension mit einem hohen Prozentsatz an mit RDE überzogenen Öltröpf chen erhält, was sich unter dem Mikroskop nachweisen läßt.

Die RDE-Menge in einer einzelnen Injektionseinheit liegt zwischen 5 und 500 µg, vorzugsweise zwischen 10 und 100 µg (je Ge samtkörpergewicht eines 70 kg wiegenden Erwachsenen).

Es wurden 1 bis 3 Injektionen über eine Periode von etwa zwei Monaten verabreicht.

Die erfindungsgemäß verwendete RDE-Zusammensetzung weist eine wesentlich geringere pyrogene Aktivität als eine Standard-Endotoxin enthaltende Zusammensetzung auf, wie das folgende Beispiel aufzeigt.

Drei Kaninchen der Neuseeland-Rasse wurde eine Standard- Endotoxin enthaltende Zusammensetzung injiziert (in die Ohrvene). Die zur Erhöhung der Körpertemperatur um wenigstens 0,46°C in 50% der gesamten Versuchstiere er forderliche Menge an Standard-Endotoxin wurde unter Ver wendung eines Rektalthermometers während eines Zeitraums von 3 Stunden ermittelt.

Drei weiteren Versuchskaninchen wurde ebenfalls eine RDE enthaltende Zusammensetzung injiziert, wonach der selbe Pyrogenaktivitätstest durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgezeigt.

Tabelle IV

Pyrogenaktivität

Wie in der Tabelle IV aufgezeigt, verursachte Standard-Endo toxin bei 50% der Versuchstiere bei einer Dosis von 0,012 µg/kg eine Fieberreaktion, während RDE bei einer Dosis von <10 µg/kg, d. h. einer 850mal höheren Dosierung als bei Standard-Endo toxin, keine Fieberreaktion hervorrief.

Claims

1. Verwendung einer Zusammensetzung aus gereinigtem, entgiftetem Endotoxin ohne nachweisbares 2-Keto-deoxyoctanoat, ent haltend 350 bis 475 nM/mg Phosphor und 1700 bis 2000 nM/mg Fettsäuren zur Erzeugung einer wirksamen Adjuvansreaktion von Warmblütern.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung in lyophilisierter Form vorliegt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Öltröpfchen emulsion vorliegt.