JPS6072825A - アジユバント応答を起こすか又は免疫応答を刺激することのできる組成物 - Google Patents
アジユバント応答を起こすか又は免疫応答を刺激することのできる組成物Info
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- JPS6072825A JPS6072825A JP59175877A JP17587784A JPS6072825A JP S6072825 A JPS6072825 A JP S6072825A JP 59175877 A JP59175877 A JP 59175877A JP 17587784 A JP17587784 A JP 17587784A JP S6072825 A JPS6072825 A JP S6072825A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、精製され脱毒性化された内毒素（ＲＤＥ ：
ｒｅｆｉｎｅｄ ｄｅｔｏｘｉｆｔｅｄ ｅｎｄｏｔ
ｏｘｉｎ）生成物を効力のある免疫刺激体として及びア
ジュ・ヤントとして使用することに関する。本発明で使
用するＲＤＥは、検出できる２−ケト−３−デオキシオ
クタノエートを含まず、そしてリン約３５０〜４７５ｎ
モル／η及び脂肪酸約１７００〜２０００ｎモル／Ｔｎ
９を含むことを特徴としている。
ｒｅｆｉｎｅｄ ｄｅｔｏｘｉｆｔｅｄ ｅｎｄｏｔ
ｏｘｉｎ）生成物を効力のある免疫刺激体として及びア
ジュ・ヤントとして使用することに関する。本発明で使
用するＲＤＥは、検出できる２−ケト−３−デオキシオ
クタノエートを含まず、そしてリン約３５０〜４７５ｎ
モル／η及び脂肪酸約１７００〜２０００ｎモル／Ｔｎ
９を含むことを特徴としている。
親生物及び突然変異体を含むエンテロ・嗜りテリアセア
エ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から得ら
れる内毒素抽出物は公知である。これらの抽出物は、種
々の免疫原性腫瘍の免疫療法に使用されてきた［Ｒｉｂ
１等ｒｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒ、Ｊ第７巻、第４３〜５８頁（１９７９年）のｒ
Ｐｅｐｔｉｄｅａ ａｓＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｈｅＧｕｉ
ｎｅａ−Ｐｉｇ Ｌｉｎｅ−１０Ｔｕｒｎｏｒ ｗｉｔ
ｈ ＥｎｄｏｔｏｘｉｎｓＪ参照〕。しかしながら、内
毒素抽出物は高毒性であることが知られておシ、従って
、癌腫瘍の治療での用途は限られている。内毒素の腫瘍
退行能を維持しながら内毒素を脱感性化する努力が行な
われてきた。Ｒｉｌ＞１等の前記の文献に示されている
とおり、アジュバント活性を残しながら内毒素を脱感性
化する公知の化学的手段例えばスクシニル化及びフタリ
ル化は、内毒素毒性の欠損及び腫瘍退行能の欠損の両者
をもたらした。従って、精製され脱感性化された内毒素
を得る従来技術の試みは、成功には遠く及ばないもので
あった。
エ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から得ら
れる内毒素抽出物は公知である。これらの抽出物は、種
々の免疫原性腫瘍の免疫療法に使用されてきた［Ｒｉｂ
１等ｒｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒ、Ｊ第７巻、第４３〜５８頁（１９７９年）のｒ
Ｐｅｐｔｉｄｅａ ａｓＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｈｅＧｕｉ
ｎｅａ−Ｐｉｇ Ｌｉｎｅ−１０Ｔｕｒｎｏｒ ｗｉｔ
ｈ ＥｎｄｏｔｏｘｉｎｓＪ参照〕。しかしながら、内
毒素抽出物は高毒性であることが知られておシ、従って
、癌腫瘍の治療での用途は限られている。内毒素の腫瘍
退行能を維持しながら内毒素を脱感性化する努力が行な
われてきた。Ｒｉｌ＞１等の前記の文献に示されている
とおり、アジュバント活性を残しながら内毒素を脱感性
化する公知の化学的手段例えばスクシニル化及びフタリ
ル化は、内毒素毒性の欠損及び腫瘍退行能の欠損の両者
をもたらした。従って、精製され脱感性化された内毒素
を得る従来技術の試みは、成功には遠く及ばないもので
あった。
本発明で使用するＲＤＥを製造するための出発材料とし
て使用する型の内毒素抽出物は、親生物及び突然変異体
を含む任意のエンテロバクテリアセアエから得ることが
できる。以下の属は、使用することのできる微生物の型
を例として挙げて説明するものである。
て使用する型の内毒素抽出物は、親生物及び突然変異体
を含む任意のエンテロバクテリアセアエから得ることが
できる。以下の属は、使用することのできる微生物の型
を例として挙げて説明するものである。
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ）、シｒう（Ｓｂｉ
ｇｓｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ
）、プルセラ（Ｂｒｕａｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ）、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）１、ｆスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌｍ）、ナイセリ
ア（Ｎｏ１ｓｓｅｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕ
＠）、クレブシェラ（Ｋｌ＠ｂｉｉｅｌｌａ）及びセラ
チア（Ｓｅｒｒａｔｌａ）。
ｇｓｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ
）、プルセラ（Ｂｒｕａｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ）、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）１、ｆスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌｍ）、ナイセリ
ア（Ｎｏ１ｓｓｅｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕ
＠）、クレブシェラ（Ｋｌ＠ｂｉｉｅｌｌａ）及びセラ
チア（Ｓｅｒｒａｔｌａ）。
以下の種は代表的に使用するものである。
Ｓ、ミネソタ（ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、Ｓ、チフィムリ
ウム（ｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｍ）、Ｂ、、Ｊ？−タラシ
ス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｇ）、Ｂ、ア？−タス（ａｂｏｒ
ｔｕｓ ） 、Ｓ 、ｘンテリチジス（ｅｎｔｅｒｉｔ
ｉｄｌｇ）、Ｅ、コリー（ｃｏｉｌ）、Ｓ、チフィ（ｔ
ｙｐｈｉ）、Ｓ、マルセッセンス（ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ａ） 、 Ｓ、チホサ（ｔｙｐｈｏ＠ａ）。
ウム（ｔｙｐｈｌｍｕｒｉｕｍ）、Ｂ、、Ｊ？−タラシ
ス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｇ）、Ｂ、ア？−タス（ａｂｏｒ
ｔｕｓ ） 、Ｓ 、ｘンテリチジス（ｅｎｔｅｒｉｔ
ｉｄｌｇ）、Ｅ、コリー（ｃｏｉｌ）、Ｓ、チフィ（ｔ
ｙｐｈｉ）、Ｓ、マルセッセンス（ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ａ） 、 Ｓ、チホサ（ｔｙｐｈｏ＠ａ）。
シｒう・フレクスニ（ｆｌｅｘｎｉ）及びＳ・アが一タ
スエクイ（ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）。
スエクイ（ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）。
出発材料として使用する内毒素抽出物は、数種の公知方
法の１つによって調製することができる。
法の１つによって調製することができる。
例えば、Ｍ、Ｉ’；、Ｗａｂｌｔｅｒ 、 Ｊ、Ｆ、Ｓ
ａｇｉｎ 、 Ｍ、Ｌａｎｄｙ。
ａｇｉｎ 、 Ｍ、Ｌａｎｄｙ。
及びＡ、Ｇ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＋ Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ
、１９５５ ＋ ７４４＋５５ ： Ｏ，Ｗｅｉｔｐｈ
ａｌ 、 Ｏ，Ｌｕｄｅｒｌｔｚ及びＦ、Ｂｌ＠ｔａｒ
。
、１９５５ ＋ ７４４＋５５ ： Ｏ，Ｗｅｉｔｐｈ
ａｌ 、 Ｏ，Ｌｕｄｅｒｌｔｚ及びＦ、Ｂｌ＠ｔａｒ
。
Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ｒ ７６ ＃ １４８
（１９５２）：０．Ｗｅｓｔｐｈａｌ。
（１９５２）：０．Ｗｅｓｔｐｈａｌ。
Ｐｙｒｏｇｅｎｓ、Ｐｏ１ｙｓａａａｈａｒｉｄｅｓ
ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｒ。
ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｒ。
５ｅｅｏｎｄ Ｍａｃｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ （Ｇ
ｅｏｒｇｅ Ｆ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編）ニュージャーソ
ー州ＭａｄｉｉｏｎのＭａｄｉｓｏｎＰｒｉｎｔｉｎｇ
社ｖ １９５７ ｍ １１５ ： Ｃ，Ｇａｌａｎｏｇ
。
ｅｏｒｇｅ Ｆ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編）ニュージャーソ
ー州ＭａｄｉｉｏｎのＭａｄｉｓｏｎＰｒｉｎｔｉｎｇ
社ｖ １９５７ ｍ １１５ ： Ｃ，Ｇａｌａｎｏｇ
。
０、Ｌｕｄ＠ｒｉｔｚ ＋ Ｏ，Ｗｅｍｔｐｈａｌ ＊
Ｅｕｒ−Ｊ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ。
Ｅｕｒ−Ｊ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ。
９ ＊ ２４５ （１９６９） ；Ｃ，Ｈ，Ｃｈｅｎ
、Ａ、Ｇ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＋Ｎ、Ｋａｓａｉ 、Ｂ−Ａ
、Ｋｅｙ 、Ｊ、Ｌｅｖｌｎ 、Ａ、Ｎｏｗｏｔｎｙ
＋Ｊ、Ｉｎｆａａｔ、Ｄｉｇ、１２８ ５４３（１９７
３）：Ｅ、Ｒｌｂｉ ＋ Ｗ、Ｔ、Ｈａａｋｉｎｓ １
Ｍ、Ｌａｎｄｙ ＊に、Ｃ０Ｍ１ｌｎｅｒ＋Ｔｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ１１４ ＋ ６４７（１９６１）：Ｌ、Ｌ
＠ｉｖ＠ａ Ｂｉｏａｈ＠ｍ・Ｂｉｏｐｈｙｍ、Ｒｅｓ
、Ｃｏｍｍ、２１．２９０（１９６５）、”並びに１．
Ｒ％ｂｉ 、 Ｋ、Ｃ，Ｍｉｌｎｅｒ及びＴ、Ｐ＠ｒｒ
ｉｎｅｅＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ−８２，７５（１９５９）
を参照されたい。
、Ａ、Ｇ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＋Ｎ、Ｋａｓａｉ 、Ｂ−Ａ
、Ｋｅｙ 、Ｊ、Ｌｅｖｌｎ 、Ａ、Ｎｏｗｏｔｎｙ
＋Ｊ、Ｉｎｆａａｔ、Ｄｉｇ、１２８ ５４３（１９７
３）：Ｅ、Ｒｌｂｉ ＋ Ｗ、Ｔ、Ｈａａｋｉｎｓ １
Ｍ、Ｌａｎｄｙ ＊に、Ｃ０Ｍ１ｌｎｅｒ＋Ｔｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ１１４ ＋ ６４７（１９６１）：Ｌ、Ｌ
＠ｉｖ＠ａ Ｂｉｏａｈ＠ｍ・Ｂｉｏｐｈｙｍ、Ｒｅｓ
、Ｃｏｍｍ、２１．２９０（１９６５）、”並びに１．
Ｒ％ｂｉ 、 Ｋ、Ｃ，Ｍｉｌｎｅｒ及びＴ、Ｐ＠ｒｒ
ｉｎｅｅＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ−８２，７５（１９５９）
を参照されたい。
内毒素抽出物を得る最も適当な方法は、 Ｃｈ＠ｎ等が
記載し友方法、すなわちメタノール−クロロホルム沈澱
である。
記載し友方法、すなわちメタノール−クロロホルム沈澱
である。
メタノールクロロホルム沈澱物（ＭＣＰ：ｍｏｔｈ畠ｎ
ｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｐｒｅｏｌｐｌｔａｔ＊
）を有機酸又は無機酸と反応させ、続いて親液性化（ｌ
ｙｏｐｈｉｌｌｚ・）して、内毒素出発材料と比較して
減少した毒性と発熱原性とを有する加水分解された粗製
脂質人を製造する・次に、得られた生成物を、前記の粗
製脂質Ａｔ溶解せずに脂肪酸及び他の不純物を特に溶解
することのできる溶媒で処理する。この目的に適した溶
媒はアセトンである。脱感性化され精製された脂質Ａの
リン酸塩含量は、リン酸塩含量が内毒素の毒性効果に関
連することを示唆する毒性等両物に関して観察されるも
のの約Ａである。
ｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｐｒｅｏｌｐｌｔａｔ＊
）を有機酸又は無機酸と反応させ、続いて親液性化（ｌ
ｙｏｐｈｉｌｌｚ・）して、内毒素出発材料と比較して
減少した毒性と発熱原性とを有する加水分解された粗製
脂質人を製造する・次に、得られた生成物を、前記の粗
製脂質Ａｔ溶解せずに脂肪酸及び他の不純物を特に溶解
することのできる溶媒で処理する。この目的に適した溶
媒はアセトンである。脱感性化され精製された脂質Ａの
リン酸塩含量は、リン酸塩含量が内毒素の毒性効果に関
連することを示唆する毒性等両物に関して観察されるも
のの約Ａである。
ＭＣＰと反応させるのに使用する適当な無機酸は塩酸、
硫酸又はリン酸であシ、適当な有機酸はトルエンスルホ
ン酸又はトリクロロ酢酸である。反応は、約９０〜１３
０℃の温度で、完全加水分解に充分な時間、通常は約１
５〜６０分間で、適当に行なうことができる。
硫酸又はリン酸であシ、適当な有機酸はトルエンスルホ
ン酸又はトリクロロ酢酸である。反応は、約９０〜１３
０℃の温度で、完全加水分解に充分な時間、通常は約１
５〜６０分間で、適当に行なうことができる。
脱感性化された粗製の内毒素の調製は、有機溶媒例えば
クロロホルム、メタノール及ヒエタノール又はそれらの
組合せの存在下で、前記出発材料と選ばれた酸とを反応
させることによっても行なうことができる。
クロロホルム、メタノール及ヒエタノール又はそれらの
組合せの存在下で、前記出発材料と選ばれた酸とを反応
させることによっても行なうことができる。
得られた粗製脂質人を、脂肪酸成分を除去するのに特に
適したアセトン中に溶解する。次に、溶媒を除去して粗
製の脱感性化された内毒素を製造する。
適したアセトン中に溶解する。次に、溶媒を除去して粗
製の脱感性化された内毒素を製造する。
続いて粗製の脱毒性化された内毒素を溶媒内に溶解し、
適当なりロマトグラフィーカラム例えば分子排除（又は
、エクスクルーノヨン）クロマトグラフィーカラムに通
し、ＲＤＥ分画を分離し、続いてこれを溶媒除去後に一
緒にする。一つの態様においては、粗製の脱毒性化され
た内毒素溶液を、溶媒例えばクロロホルム、メタノール
、アセトン、ピリジン、エーテル若しくは酢酸又はそれ
らの組合せの存在下でセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）カラムに通す。カラムの圧力は変えることができる
が、代表的には約大気圧から約６．８気圧（１００ｔｂ
／ｉｎ ）であり、そして流速は約０１〜１０ｍＡ／分
である。
適当なりロマトグラフィーカラム例えば分子排除（又は
、エクスクルーノヨン）クロマトグラフィーカラムに通
し、ＲＤＥ分画を分離し、続いてこれを溶媒除去後に一
緒にする。一つの態様においては、粗製の脱毒性化され
た内毒素溶液を、溶媒例えばクロロホルム、メタノール
、アセトン、ピリジン、エーテル若しくは酢酸又はそれ
らの組合せの存在下でセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）カラムに通す。カラムの圧力は変えることができる
が、代表的には約大気圧から約６．８気圧（１００ｔｂ
／ｉｎ ）であり、そして流速は約０１〜１０ｍＡ／分
である。
あるいは、粗製の脱毒性化された内毒素溶液を、前記の
セファデックスカラムについて記載したものト同じ圧力
条件下で、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに通す。流速は
約２〜１５ｍＡ／分に維持することができる。使用する
溶媒も、セファデックスカラム用に使用するものと同じ
でおるが、水及び（又は）ジエチルアミンを約１％まで
の濃度で全混合物に加えることができる。
セファデックスカラムについて記載したものト同じ圧力
条件下で、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに通す。流速は
約２〜１５ｍＡ／分に維持することができる。使用する
溶媒も、セファデックスカラム用に使用するものと同じ
でおるが、水及び（又は）ジエチルアミンを約１％まで
の濃度で全混合物に加えることができる。
粗製の脱毒性化された内毒素からＲＤＥを製造する他の
方法は、約１５〜６３μの粒子寸法を有する低圧シリカ
ダル６０カラムに溶液を通し、そして適当な溶媒例えば
クロロホルム、メタノール、水又は水酸化アンモニウム
を使うことを含む。前記溶媒混合物の好ましい容讐比は
約５０：２５：４：２である。
方法は、約１５〜６３μの粒子寸法を有する低圧シリカ
ダル６０カラムに溶液を通し、そして適当な溶媒例えば
クロロホルム、メタノール、水又は水酸化アンモニウム
を使うことを含む。前記溶媒混合物の好ましい容讐比は
約５０：２５：４：２である。
従って、本発明の目的は、温血動物の免疫系を刺激する
のに有効に使用することのできる精製され脱毒性化され
た内毒素生成物を使用することにある。具体的には、Ｒ
ＤＥをＢ−細胞マイトジェン（又は、有糸分裂誘発因子
）として使用し７て、リンフ才力イン産生を刺激し、マ
クロファージを刺激することができ、そしてＲＤＥを、
温血動物の免疫応答を向上するアジュバントとして使用
することができる。
のに有効に使用することのできる精製され脱毒性化され
た内毒素生成物を使用することにある。具体的には、Ｒ
ＤＥをＢ−細胞マイトジェン（又は、有糸分裂誘発因子
）として使用し７て、リンフ才力イン産生を刺激し、マ
クロファージを刺激することができ、そしてＲＤＥを、
温血動物の免疫応答を向上するアジュバントとして使用
することができる。
本発明は、精製され脱毒性化された内毒素（ＲＤＥ）を
免疫系刺激体として使用することに関する。本発明で使
用するＲＤＥは、検出できる２−ケト−３−デオキシオ
クタノエートを含まず、リン約３５０〜４７５ｎモル／
Ｉｖ及び脂肪酸約１７００〜２０００ｎモル／■を有す
る。
免疫系刺激体として使用することに関する。本発明で使
用するＲＤＥは、検出できる２−ケト−３−デオキシオ
クタノエートを含まず、リン約３５０〜４７５ｎモル／
Ｉｖ及び脂肪酸約１７００〜２０００ｎモル／■を有す
る。
本発明のＲＤＥは、抗原例えば細菌及び真菌の細胞、細
菌細胞７ラグメント、ウィルス、又は細胞性及びウィル
ス性サブユニットに似ているウィルスサブユニット合成
ペプチドに対する、温血動物の免疫応答の刺激体として
使用することができる。
菌細胞７ラグメント、ウィルス、又は細胞性及びウィル
ス性サブユニットに似ているウィルスサブユニット合成
ペプチドに対する、温血動物の免疫応答の刺激体として
使用することができる。
ＲＤＥの投与によって増加する免疫応答によシ影響を受
ける特別な抗原としては、クリプトコツカス・ネオフォ
ルマンス・カンジダ（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃａｕｓｎｅｏ
ｆｏｒｍａｎｓ ｃａｎｄｉｄａ）種、クラミジア（ａ
ｈ １ ｍｍｙｄ ｌａ）樵、レジオネラ（ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌｍ）種、クロストリシア（ｃｌｏｇｔｒｉｄｌ
ｍ）、ヘノ母チチス・メニンジチス（ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓ ｍａｎｉｎｇ目」Ｓ）、レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｕｓ）種１ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ａｕｓ）種、クレブシェラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｍ）種
、ヘルペス（ｈｅｒｐｅａ）ウィルス、プルセラ（ｂｒ
ｕｃｅｌｌａ）種、がルジテラ（ｂｏｒｄｉｔｅｌｌｍ
）種、サルモネラ（ｇａｌｍｏｎｅｌ ｌａ）種、シｒ
う種、カンピロバクタ−（ｃａｍｐｈｙｌｏｂａａｔｅ
ｒ）種、エルジニア（ｙｅｒｍｉｎｉａ）ｆＬ ａｆス
ッレラ（ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）ｌｉｆｔ、７ランシセ
ラ（ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌｍ）種、リステリア（ｌｉｓ
ｔｓｒｉａ）種等が含まれる。
ける特別な抗原としては、クリプトコツカス・ネオフォ
ルマンス・カンジダ（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃａｕｓｎｅｏ
ｆｏｒｍａｎｓ ｃａｎｄｉｄａ）種、クラミジア（ａ
ｈ １ ｍｍｙｄ ｌａ）樵、レジオネラ（ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌｍ）種、クロストリシア（ｃｌｏｇｔｒｉｄｌ
ｍ）、ヘノ母チチス・メニンジチス（ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓ ｍａｎｉｎｇ目」Ｓ）、レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｕｓ）種１ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ａｕｓ）種、クレブシェラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｍ）種
、ヘルペス（ｈｅｒｐｅａ）ウィルス、プルセラ（ｂｒ
ｕｃｅｌｌａ）種、がルジテラ（ｂｏｒｄｉｔｅｌｌｍ
）種、サルモネラ（ｇａｌｍｏｎｅｌ ｌａ）種、シｒ
う種、カンピロバクタ−（ｃａｍｐｈｙｌｏｂａａｔｅ
ｒ）種、エルジニア（ｙｅｒｍｉｎｉａ）ｆＬ ａｆス
ッレラ（ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）ｌｉｆｔ、７ランシセ
ラ（ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌｍ）種、リステリア（ｌｉｓ
ｔｓｒｉａ）種等が含まれる。
本発明で使用するＲＤＥはＢ細胞有糸分裂誘発活性を示
す。すなわちＲＤＥは、温血動物に適当な投薬量養生法
で投与した場合に、抗体産生に応答する細胞であるＢす
／・９球を活性化する。
す。すなわちＲＤＥは、温血動物に適当な投薬量養生法
で投与した場合に、抗体産生に応答する細胞であるＢす
／・９球を活性化する。
検定
（１）Ｂ細胞有糸分裂誘発活性−ＲＤＥは、抗体産生に
応答できる細胞である１３１Ｊンパ球を活性化する能力
によって以下のように特徴づけられる。
応答できる細胞である１３１Ｊンパ球を活性化する能力
によって以下のように特徴づけられる。
精製され脱毒性化された内毒素の
有糸分裂誘発因子
ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／＋ １０ ３４．５００ ５．０
ＢＡＬＢ／ｅ ｎｕ／ｎｕ １０ ３８，６９３ ５．
６〔実験観察記録：各株Ｉ Ｘ １０’細胞／ａをマイ
トジェンと共に又はなしで、ウェル・マイクロタイター
（ｗｅｌｌ ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート９６個中
でＲＰＭＩ−１６４０（５１ＦＣ８）０．２１ｖの中で
培養した。４８時間インキュベーションの最後の１８時
間に、各ウェル中に３日−チミジン１ｅｄを加え、９Ｈ
の取込みを標準シンチレーション法で測定した。
ＢＡＬＢ／ｅ ｎｕ／ｎｕ １０ ３８，６９３ ５．
６〔実験観察記録：各株Ｉ Ｘ １０’細胞／ａをマイ
トジェンと共に又はなしで、ウェル・マイクロタイター
（ｗｅｌｌ ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート９６個中
でＲＰＭＩ−１６４０（５１ＦＣ８）０．２１ｖの中で
培養した。４８時間インキュベーションの最後の１８時
間に、各ウェル中に３日−チミジン１ｅｄを加え、９Ｈ
の取込みを標準シンチレーション法で測定した。
”ＣＰＭ−１分間当シの計数（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ
ｍ１ｎｕｔｅ ）ＩｔＳＩ−刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｏｎ １ｎｄｅｘ） ］（２）インターロイキン（
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ） −Ｉ産生。ＲＤＥは、マク
ロファージによって放出されるリンフ才力イン産生を刺
激するのに使用することができる。インターロイキン−
■は、マクロファージによシ放出される可溶性免疫調節
子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ）であシ、感染部位における
リンパ球の活性化に応答するものである。
ｍ１ｎｕｔｅ ）ＩｔＳＩ−刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｏｎ １ｎｄｅｘ） ］（２）インターロイキン（
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ） −Ｉ産生。ＲＤＥは、マク
ロファージによって放出されるリンフ才力イン産生を刺
激するのに使用することができる。インターロイキン−
■は、マクロファージによシ放出される可溶性免疫調節
子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ）であシ、感染部位における
リンパ球の活性化に応答するものである。
マウスのマクロファージをマイクロタイタープレート（
ＩＸＩＯ／ウェル）に接着させ、各測定を３回行なった
。第１のウェルは標準内毒素の５０μ９／一溶液１Ｍを
受け取った。第２の組のウェルには、本発明によるＲＤ
Ｅの５０μ９／ｒａｔ溶液１ ａｔを加えた◎各薬剤を
５ ％ Ｆｅ２ （子すし胎児の血清：ｆａｔａｌ ｃ
ａｌｆ ｓｅｒｕｍ） １ｍＪを含むＭ１９９媒質中に
溶解した。５ ％ Ｆｅ２を含むＭ１９９媒質を第３の
組のウェルに加え、対照用とした。
ＩＸＩＯ／ウェル）に接着させ、各測定を３回行なった
。第１のウェルは標準内毒素の５０μ９／一溶液１Ｍを
受け取った。第２の組のウェルには、本発明によるＲＤ
Ｅの５０μ９／ｒａｔ溶液１ ａｔを加えた◎各薬剤を
５ ％ Ｆｅ２ （子すし胎児の血清：ｆａｔａｌ ｃ
ａｌｆ ｓｅｒｕｍ） １ｍＪを含むＭ１９９媒質中に
溶解した。５ ％ Ｆｅ２を含むＭ１９９媒質を第３の
組のウェルに加え、対照用とした。
前記のプレートを３７℃で２０時間インキュベーション
した。上層液を取出して希釈し、上層液：蒸留水が１：
１０の比の溶液を得た。この上層液について、Ｇｅ ｒ
ｙ等のＣｅ１ｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ−６４＋２９３（
１９８１）に記載の方法により、インターロイキン−■
産生の試験を行なった。
した。上層液を取出して希釈し、上層液：蒸留水が１：
１０の比の溶液を得た。この上層液について、Ｇｅ ｒ
ｙ等のＣｅ１ｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ−６４＋２９３（
１９８１）に記載の方法により、インターロイキン−■
産生の試験を行なった。
上層液除去後に残留した細胞は、０１％トライトン（Ｔ
ｒｌｔｏｎ） Ｘ −１００を使って溶菌（ｌｙｓｅ）
した。得られた溶液を、希釈率１：１０で、５％ＦＣ８
を含むＲＰＭ１１６４０媒質で希釈した。
ｒｌｔｏｎ） Ｘ −１００を使って溶菌（ｌｙｓｅ）
した。得られた溶液を、希釈率１：１０で、５％ＦＣ８
を含むＲＰＭ１１６４０媒質で希釈した。
希釈した溶液について、ＰＩ（Ａ誘発マクロファージの
佃−チミジン摂取の増加を、前記Ｇｅ ｔｙ等の文献に
記載の方法のようにして測定することにより、インター
ロイキン−Ｉ産生の試験を行なっ表 ！ 試験材料 上層液応答 溶菌物応答 （５０μ９／ｍＡ） （１：１０の希釈） （１：１０
の希釈）標準内毒素 ３１，１３７±１．７２１ ５１
．６９５±２７９７ＲＤＥ１６，７８２±１．２９５
６６．１７８±２３３２対照 ３，３２３± ３１ １
２．１５３±４９７表１に示すとおり、溶菌された細胞
における、本発明のＲＤＥからのインターロイキン−Ｉ
産生は、標準内毒素抽出物からのインターロイキン−Ｉ
産生を大幅に上まわっていた。
佃−チミジン摂取の増加を、前記Ｇｅ ｔｙ等の文献に
記載の方法のようにして測定することにより、インター
ロイキン−Ｉ産生の試験を行なっ表 ！ 試験材料 上層液応答 溶菌物応答 （５０μ９／ｍＡ） （１：１０の希釈） （１：１０
の希釈）標準内毒素 ３１，１３７±１．７２１ ５１
．６９５±２７９７ＲＤＥ１６，７８２±１．２９５
６６．１７８±２３３２対照 ３，３２３± ３１ １
２．１５３±４９７表１に示すとおり、溶菌された細胞
における、本発明のＲＤＥからのインターロイキン−Ｉ
産生は、標準内毒素抽出物からのインターロイキン−Ｉ
産生を大幅に上まわっていた。
マウスのマクロファージの代わシにヒト単球ヲ使用して
、同様の分析を実施した。
、同様の分析を実施した。
結果は以下のとおシである。
表［Ａ
標準内毒素 ４２，４１８±１７６３ ５１．８２１±
１３４８ＲＤＥ１７，９１０±１９８３ ５０．６２６
±８１３対照 １，６９３±２８９ １５．１７３±１
２９２（３）マクロファージ活性化 マクロファージが螢光ビーズを食べる（飲み込む）能力
によって測定されるように、本発明のＲＤＥはマクロフ
ァージも刺激する。
１３４８ＲＤＥ１７，９１０±１９８３ ５０．６２６
±８１３対照 １，６９３±２８９ １５．１７３±１
２９２（３）マクロファージ活性化 マクロファージが螢光ビーズを食べる（飲み込む）能力
によって測定されるように、本発明のＲＤＥはマクロフ
ァージも刺激する。
腹腔８出細胞１×１０個を、標準内寡素又は本発明によ
るＲＤＥ又は対照用食塩水を含む試験材料溶液５μｌと
混合し、それぞれ３つの試験溶液を調製した。各溶液は
、試験材料１μ９と螢光ビード懸濁液２０ ｆｉｌとを
含むものであ−）た。試験溶液を何個の顕微鏡スライド
上に置き、３７℃で９０分間インキュベーションした。
るＲＤＥ又は対照用食塩水を含む試験材料溶液５μｌと
混合し、それぞれ３つの試験溶液を調製した。各溶液は
、試験材料１μ９と螢光ビード懸濁液２０ ｆｉｌとを
含むものであ−）た。試験溶液を何個の顕微鏡スライド
上に置き、３７℃で９０分間インキュベーションした。
インキュベーションの後で、スライドを螢光顕微鏡下で
観察した。肉眼観察によシ、螢光ビードを食べた細胞の
数を、ビード／細胞の数とともに測定した。
観察した。肉眼観察によシ、螢光ビードを食べた細胞の
数を、ビード／細胞の数とともに測定した。
食作用係数は以下の式によって計算した。
０００
２回の実験の結果を以下の表■に示す口以下余白
表 ■
食作用係数”
実験１ 実験２
標準内毒素 ５．０ ３．６
ＲＤＥ５．４ ４．１
対照 １．０ ０．５
表■から明らかなとおシ、本発明のＲＤＥに対する食作
用係数は、標準内毒素に比べ有意に大きな値を示した。
用係数は、標準内毒素に比べ有意に大きな値を示した。
これによ９％ ＲＤＥがマクロファージの非常に有効な
刺激体であることが立証された。
刺激体であることが立証された。
（４）アジュバント活性
温血動物の免疫系の刺激体としてのＲＤＥの使用を更に
立証するために、抗体がヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ：５ｈ
ｅｅｐ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を溶菌する能
力を測定することによシ、ヒツジ赤血球に対する免疫応
答を増大するＲＤＥの能力にょシ決定されるアジュバン
ト活性について試験を行なった。３つの試験材料を調製
した。各材料は、５ＲＢＣＩ Ｘ １０７量を含むもの
であった。試験材斜陽２は５ＲＢＣ＋標準内毒素２０ｍ
ｃｇを更に含むものであり、試験材料Ｎ１１３は５ＲＢ
Ｃ＋本発明によるＲＤＥ ２０ ｍｃｇを含むものであ
った。
立証するために、抗体がヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ：５ｈ
ｅｅｐ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を溶菌する能
力を測定することによシ、ヒツジ赤血球に対する免疫応
答を増大するＲＤＥの能力にょシ決定されるアジュバン
ト活性について試験を行なった。３つの試験材料を調製
した。各材料は、５ＲＢＣＩ Ｘ １０７量を含むもの
であった。試験材斜陽２は５ＲＢＣ＋標準内毒素２０ｍ
ｃｇを更に含むものであり、試験材料Ｎ１１３は５ＲＢ
Ｃ＋本発明によるＲＤＥ ２０ ｍｃｇを含むものであ
った。
試験材料をＢＡＬＢ／Ｃ株マウス中に経腹膜注入した。
４〜５日後、試験動物を殺し、肺臓を取出して、組織グ
ラインダーでつぶした。各肺臓の標準細胞懸濁液は血球
計算板を使って製造し、その各懸濁液をターｐ 、 ）
５ＲＢＣ，媒質及び寒天と共にスライド上に置いた。
ラインダーでつぶした。各肺臓の標準細胞懸濁液は血球
計算板を使って製造し、その各懸濁液をターｐ 、 ）
５ＲＢＣ，媒質及び寒天と共にスライド上に置いた。
そのスライドを３７℃で２時間インキュベーションし、
モルモット血清を補体源として各スライドに加え、３７
℃で３０分間インキュベーションした〇 その後、スライドを検査して、モルモット血清中に見出
される補体の助けによシ抗体が５ＲＢＣ細胞を破壊した
領域である、プラーク形成細胞の量を測定した。
モルモット血清を補体源として各スライドに加え、３７
℃で３０分間インキュベーションした〇 その後、スライドを検査して、モルモット血清中に見出
される補体の助けによシ抗体が５ＲＢＣ細胞を破壊した
領域である、プラーク形成細胞の量を測定した。
結果を表■に示す。
以下余９
表 ■
５ＲＢＣ８８
ＳＲＢＣ＋標準内毒素 １６５
ＳＲＢＣ＋ＲＤＦ： ２１９
表■から明らかなとおυ、ＲＤＥを使用して得られるプ
ラーク形成細胞の数は標準内毒素の場合と比較して有意
に高く、このことがらＲＤＥが有効なアソユパ／トであ
ることが立証された。
ラーク形成細胞の数は標準内毒素の場合と比較して有意
に高く、このことがらＲＤＥが有効なアソユパ／トであ
ることが立証された。
本発明で使用するＲＤＥは、医薬的に受け入れることの
できる媒質例えば食塩水又は油滴乳剤と組合せて投与す
ることができる。前記組成物は、例えば親液性化操作に
よって安定化し、そして次に、有効性欠損を伴わずに再
構成することができる。
できる媒質例えば食塩水又は油滴乳剤と組合せて投与す
ることができる。前記組成物は、例えば親液性化操作に
よって安定化し、そして次に、有効性欠損を伴わずに再
構成することができる。
前記のように、温血動物及びヒトの治療用組成物は、油
滴乳剤の形で使用することができる。使用する油の量は
、組成物の合計容量に対して約０．５〜３．０容量チの
範囲である。約０．７５〜１．５容量−の油を使うこと
が好ましい。適当な油の例としては、軽鉱油、スクアレ
ン、７−ｎ−へキシルオクタデカン、コノコ（Ｃｏｎｏ
ｏｏ）スー２９−オイル及びドラケオル（Ｄｒａｋｅｏ
ｌ）６ＶＲ鉱油〔ペンシルバニア州、パルター（Ｂｕｌ
ｔｅｒ）のＰｅｎｎｒｅｃｏ社製〕が含まれる。
滴乳剤の形で使用することができる。使用する油の量は
、組成物の合計容量に対して約０．５〜３．０容量チの
範囲である。約０．７５〜１．５容量−の油を使うこと
が好ましい。適当な油の例としては、軽鉱油、スクアレ
ン、７−ｎ−へキシルオクタデカン、コノコ（Ｃｏｎｏ
ｏｏ）スー２９−オイル及びドラケオル（Ｄｒａｋｅｏ
ｌ）６ＶＲ鉱油〔ペンシルバニア州、パルター（Ｂｕｌ
ｔｅｒ）のＰｅｎｎｒｅｃｏ社製〕が含まれる。
均質前を含む混合物は続いて、混合前に食塩水溶液中に
場合により溶解されていることのある洗浄剤と組合せる
。洗浄剤の債に組成物の合計容量に対して、代表的には
約０．０２〜０．２０容量チ好ましくは約０．１０〜０
．２０容ｆｉ％である。任意の通常の洗浄剤材料を使用
することができ、これにはトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−
８０及びアルラセル（Ａｒｌａｃａｌ）［：Ａｔ１ａｓ
Ｃｈｅｍｉｃａ１社製］が含まれる。
場合により溶解されていることのある洗浄剤と組合せる
。洗浄剤の債に組成物の合計容量に対して、代表的には
約０．０２〜０．２０容量チ好ましくは約０．１０〜０
．２０容ｆｉ％である。任意の通常の洗浄剤材料を使用
することができ、これにはトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−
８０及びアルラセル（Ａｒｌａｃａｌ）［：Ａｔ１ａｓ
Ｃｈｅｍｉｃａ１社製］が含まれる。
洗浄剤を添加して得られた混合物を次に均質にし、ＲＤ
ｇで被覆された油滴を高い百分率（顕微鏡下で観察して
測定する）で有する懸濁液を形成する。
ｇで被覆された油滴を高い百分率（顕微鏡下で観察して
測定する）で有する懸濁液を形成する。
１回分の注入におけるＲＤＥＯ級は、７０ｋｇのヒトの
成人の合計体重に対して５〜５００μＩ好ましくは１０
〜１００ ｐ９である。
成人の合計体重に対して５〜５００μＩ好ましくは１０
〜１００ ｐ９である。
約２カ月間の期間に亘り、１〜３回の注入金投与する。
本発明で使用するＲＤＥ組成物は、以下の例から明らか
なように、標準内毒素を含む組成物に比べ、有意に低い
発熱性活性を示す。
なように、標準内毒素を含む組成物に比べ、有意に低い
発熱性活性を示す。
３匹のニューシーラント株ラビットに、標準内毒素を含
む組成物を耳静脈から注入した。試験験体の５０優にお
いて少なくとも０４６℃の体温上昇をもたらすのに必要
な標準内毒素の量を、直腸温度計を使用して３時間に亘
り測定した。
む組成物を耳静脈から注入した。試験験体の５０優にお
いて少なくとも０４６℃の体温上昇をもたらすのに必要
な標準内毒素の量を、直腸温度計を使用して３時間に亘
り測定した。
他の３匹の試験用ラビットにも、ＲＤＥ含有組成物を注
入し、同様の発熱性活性試験を行なった。
入し、同様の発熱性活性試験を行なった。
結果を以下の表■に示す。
表 ■
発熱活性
ＲＤＥ １０ （すなわち、最高投与量脅試験験体の５
０％において０．４６℃よシ大きい熱性応答を起こすの
に必要な投与童 表■に示すとおシ、標準内毒素は０．０１２μ９／ｋｇ
の投与量で試験動物の５０チに発熱応答を生じた。
０％において０．４６℃よシ大きい熱性応答を起こすの
に必要な投与童 表■に示すとおシ、標準内毒素は０．０１２μ９／ｋｇ
の投与量で試験動物の５０チに発熱応答を生じた。
しかしながらＲＤＥは、１０μ９／に９を越えても発熱
応答を起こさなかった。この値は標準菌体内毒素の投与
水準の８５０倍である。
応答を起こさなかった。この値は標準菌体内毒素の投与
水準の８５０倍である。
特許出願人
リビイミュノケムリブーチ、インコ−ヂレイティド特許
出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士 西 舘 和 之 弁理士 森 １）憲 − 弁理士 山 口 昭 之 弁理士 西 山 雅 也
出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士 西 舘 和 之 弁理士 森 １）憲 − 弁理士 山 口 昭 之 弁理士 西 山 雅 也
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、検出できる２−ケト−デオキシオクタノエートを有
さすにリン約３５０〜４７５ｎモル／ｍ９及び脂肪酸的
１７００〜２００ Ｏｎ’モル／９を有する精製され脱
毒性化された内毒素を含む組成物の有効量を、医薬的に
受け入れることのできるキャリヤーと組合せて含んで成
る、温血動物の有効なアジュバント応答を起こすことが
できるか又は免疫応答を刺激することのできる組成物。 ２、前記の有効量が約５〜５００μ９ Ａｇである特許
請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、前記の有効量が約１０〜１００μ９Ａψである特許
請求の範囲第２項記載の組成物。 ４、親液性化された形の特＃！Ｆ請求の範囲第１項記載
の組成物。 ５、油滴乳剤の形の特許請求の範囲第１項記載の組成物
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52696783A | 1983-08-26 | 1983-08-26 | |
| US256967 | 1999-02-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6072825A true JPS6072825A (ja) | 1985-04-24 |
| JPH0556326B2 JPH0556326B2 (ja) | 1993-08-19 |
Family
ID=24099553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59175877A Granted JPS6072825A (ja) | 1983-08-26 | 1984-08-25 | アジユバント応答を起こすか又は免疫応答を刺激することのできる組成物 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6072825A (ja) |
| KR (1) | KR880002223B1 (ja) |
| AT (1) | AT389228B (ja) |
| AU (1) | AU554039B2 (ja) |
| BE (1) | BE900377A (ja) |
| CA (1) | CA1225592A (ja) |
| CH (1) | CH660125A5 (ja) |
| DE (2) | DE3448164C2 (ja) |
| DK (1) | DK389384A (ja) |
| ES (1) | ES8606883A1 (ja) |
| FI (1) | FI843204A (ja) |
| FR (1) | FR2550945B1 (ja) |
| GB (1) | GB2147806B (ja) |
| HU (1) | HU191713B (ja) |
| IL (1) | IL72675A (ja) |
| IN (1) | IN157910B (ja) |
| IT (1) | IT1177974B (ja) |
| NL (1) | NL192326C (ja) |
| NO (1) | NO843243L (ja) |
| NZ (1) | NZ209233A (ja) |
| SE (1) | SE8404090L (ja) |
| ZA (1) | ZA846309B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6310736A (ja) * | 1986-04-15 | 1988-01-18 | リビ、イミュノケム、リサ−チ、インコ−ポレ−テッド | 免疫学的アジュバント |
| JPS6322029A (ja) * | 1986-04-15 | 1988-01-29 | リビ、イミユノケム、リサ−チ、インコ−ポレ−テツド | 多糖類ワクチン用免疫学的アジユバント |
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| KR100868443B1 (ko) * | 2002-05-27 | 2008-11-11 | 주식회사 포스코 | 폭과 길이가 가변 조정되는 런치박스 제작장치 |
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| JPS4868729A (ja) * | 1971-12-24 | 1973-09-19 | ||
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-
1984
- 1984-08-10 CA CA000460820A patent/CA1225592A/en not_active Expired
- 1984-08-13 DK DK389384A patent/DK389384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-08-14 ZA ZA846309A patent/ZA846309B/xx unknown
- 1984-08-14 GB GB08420612A patent/GB2147806B/en not_active Expired
- 1984-08-14 IN IN567/CAL/84A patent/IN157910B/en unknown
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