NL8402515A - Preparaat met immuunstimulerende werking. - Google Patents

Description

1 h 'λ - 1 -

Preparaat met immuunstimulerende werking.

De uitvinding heeft betrekking or> het gebruik van een gezuiverd, ontgiftigd endotoxine (refined detoxified 5 endotoxin of afgekort RDE, zoals in het vervolg hieronder aan geduid) produkt als potente immuunstimulator en ook als hulpmiddel. Het bij de onderhavige uitvinding gebruikte RDE wordt gekenmerkt als hebbende geen waarneembaar 2-keto-3-deoxyoctanaat tussen ongeveer 350 en 475 nmolen/mg fosfor en tussen ongeveer 10 1700 en 2000 nmolen/mg vetzuren.

Endotoxineextrakten, die zijn verkregen uit Enterobacteriaciae met inbegrip van moederorganismen en mutanten, zijn bekend. Deze extrakten zijn gebruikt voor immuno-therapie van verschillende immunogene tumoren (zie Peptides as 15 Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al Cancer Immunol. Immunother., 43-48 (1979)). Het is echter bekend, dat de endotoxineextrakten zeer toxisch zijn en zij kunnen dan ook beperkt worden toegepast voor de behandeling van kankertumoren. Hen heeft pogingen 20 ondernomen tot het "ontgiftigen" van endotoxinen onder behoud van hun tumorregressieve vermogen. Zoals aangetoond in Ribi, et al, boven, hebben bekende chemische werkwijzen voor het "ont-giftigen" van endotoxinen onder behoud van hun hulpwerking, zoals succinylering en ftalylering, geleid tot zowel verlies van 25 endotoxiciteit als tumorregressieve potentie. Pogingen in het verleden tot het verkrijgen van een gezuiverd, ontgiftigd endo-toxineprodukt hebben dan ook tot dusver geen succes gehad.

Endotoxineextrakten van het type, dat gebruikt wordt als uitgangsstof voor het bereiden van het RDE, dat bij 30 de onderhavige uitvinding gebruikt wordt, kunnen worden verkre gen uit allerlei Enterobacteriaciae met inbegrip van moederorganismen en mutanten. Zo zijn bijvoorbeeld de volgende genera illustratief voor het type mikroorganisme, dat men kan gebruiken: 35 Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, 8402515 r', ·ΐ - 2 -

Bordetalla, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella en Serratia.

De volgende species worden met name gebruikt: S.minnesota, S.typhimurium, B.pertussis, 5 B.abortus, S.enteritidis, E.coli, S.typhi, S.mareescens, S.typho- sa, Shigella flexni en S.abortus equi.

De endotoxineextrakten, die als uitgangsstof worden gebruikt, kunnen worden bereid volgens een of meer bekende werkwijzen (zie bijvoorbeeld Webster, M.E., Sagin, J.F., 10 Landy, M. en Johnson,. A.G., J. Immunol. 1955, 744, 55; Westphal, 0., Luderitz, 0., en Bister, F., Z. Naturforsch, 76 148 (1952); Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957, 115; Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 15 0., Eur. J. Biochem. 9^, 245 (1969); Chen, C.H., Johnson, A.G.,

Kasai, N. Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Pis.

128 543 (1973); Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K. C., The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961); Leive, L. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1965) en Ribi, E,, 20 Milner, K.C., en Perrine, T., J. Immunol. 82 75 (1959)).

Een zeer geschikte methode voor het verkrijgen van het endotoxineextrakt is die beschreven door Chen, et al, namelijk methanol-chloroformprecipitatie.

Men laat het methanol-chloroformprecipitaat 25 (MCP) reageren met een organisch of anorganisch zuur en vries droogt het daarna onder verkrijging van een gehydrolyseerd ruw lipide A met verminderde toxiciteit en pyrogeniciteit, vergeleken met het endotoxinemateriaal, waarvan men is uitgegaan. Daar- * na behandelt men het resulterende produkt met een oplosmiddel, 30 dat specifiek vetzuren en andere onzuiverheden kan oplossen zonder het ruwe lipide A op te lossen. Een voor dit doel geschikt oplosmiddel is aceton. Het fosfaatgehalte van het ont-giftigde, gezuiverde lipide A is. ongeveer de helft van wat is waargenomen bij de toxische tegenhanger, wat doet vermoeden, dat 35 het fosfaatgehalte verband houdt met de toxische effekten van 8402515 - 3 - f ,¾ endotoxinen.

Voor reaktie met MC3? geschikte anorganische zuren zijn zoutzuur, zwavelzuur of fosforzuur en de geschikte organische zuren zijn tolueensulfonzuur of trichloorazijnzuur.

5 De reaktie kan goed worden uitgevoerd bij een temperatuur van 90-130°C gedurende een ter voltooiing van hydrolyse voldoende tijd, gewoonlijk 15-60 minuten.

Men kan ruw, ontgiftigd endotoxine ook bereiden door de uitgangsstof met het uitgekozen zuur te laten rea-10 geren in aanwezigheid van een organisch oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, ethanol of combinaties daarvan.

Men lost het resulterende ruwe lipide A op in aceton, dat bijzonder geschikt is voor de verwijdering van de vetzuurcomp onent en. Daarna verwijdert men het oplosmiddel 15 onder verkrijging van ruw, ontgiftigd endotoxine.

Daarna lost men het ruwe, ontgiftigde endotoxine op in een oplosmiddel en leidt de oplossing door een geschikte chromatografiekolom, bijvoorbeeld een molekulaire uit-sluitingschromatografiekolom, teneinde de EDE-frakties af te 20 scheiden, die men vervolgens, na verwijdering van het oplosmiddel, combineert. Bij één uitvoeringsvorm leidt men de ruwe, ontgiftigde endotoxineoplossing door een Sephadexkolom in aanwezigheid van een oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, aceton, pyridine, ether of azijnzuur, of combinaties daarvan. De druk 25 van de kolom kan variëren, maar bedraagt met name atmosferische druk tot 100 pounds/in2 en de stroomsnelheid bedraagt 0,1-10 ml/min.

Eventueel leidt men de ruwe, ontgiftigde endotoxineoplossing door een DEAE-cellulosekolom onder dezelfde druk 30 als boven genoemd voor de Sephadexkolom. De stroomsnelheid kan op 2-15 ml/min worden gehouden. De gebruikte oplosmiddelen zijn ook hetzelfde als bij de Sephadexkolom, hoewel men water en/of diethylamine aan alle mengsels kan toevoegen in een concentratie tot 1%.

35 Andere werkwijzen voor het bereiden van EDE

8402515 ί* 3 - 4 - uit ruw, ontgiftigd endotoxine zijn het leiden van de oplossing door een lage druk silicagel 60 kolom met een deeltjesgrootte van 15-63 mikron en gebruikmaking van een geschikt oplosmiddel, zoals chloroform, methanol, water of ammoniumhydroxyde. De volu-5 meverhouding van bovengenoemd oplosmiddel bedraagt bij voorkeur 50:25:4:2.

De uitvinding beoogt dan ook het gebruik van een gezuiverd, ontgiftigd endotoxineprodukt, dat men doeltreffend kan gebruiken voor de stimulering van het immuunsysteem 10 van een warmbloedig dier. EDE kan vooral worden gebruikt als B-celmitogeen ter stimulering van de produktie van lymfokinen, ter stimulering van mikrofagen en als hulpmiddel, dat de immuunrespons van een warmbloedig dier verhoogt.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking 15 op. het gebruik van gezuiverd, ontgiftigd endotoxine (EDE) als een stimulant van het immuunsysteem. Het bij de uitvinding gebruikte EDE heeft geen waarneembaar 2-keto-3-deoxyoctanaat bij 350-475 nmolen/mg fosfor en 1700-2000 nmolen/mg vetzuren.

‘Men kan het EDE van de onderhavige uitvinding 20 gebruiken als stimulator van de immuunrespons bij warmbloedige dieren tegen antigenen, zoals mikrobacteriele en fungicellen, mikrobacteriele celfragmenten, virussen, virusonderdelen en synthetische peptiden, die cel en virusonderdelen nabootsen. Antigenen, die met name worden aangetast door de immuunrespons, die 25 wordt verhoogd door de toediening van EDE zijn cryptococcus neoformans Candida spp., chlamydia spp·,. legionella spp. clos-tridia, hepatitis meningitis, streptococus spp, staphyloeocus spp., klebsiella spp., herpes virus, brucella spp.,. borditella spp., salmonella spp., shigella spp., camphylobacter spp, yer-30 sinia spp., pasturella spp., francisella spp., listeria spp. en dergelijke.

Het bij de uitvinding gebruikte EDE vertoont B-celmitogeniciteit, dat wil zeggen, EDE aktiveert bij toediening aan een warmbloedig dier in een geschikte dosis B-lymfocyten, 35 die de cellen zijn, die voor de vervaardiging van antilichamen 8402515 * ·5 - 5 - verantwoordelijk zijn.

Proeven.

5 (1) B-cellmitogeniciteit. EDE wordt gekenmerkt door zijn vermogen tot het aktiveren van B-lymfocyten, die de cellen zijn, die verantwoordelijk zijn voor de vervaardiging van antilichamen en wel als volgt: 10 Hitogene werking van gezuiverd, ontgiftigd endotoxine.

3 . .

Dosis H-thymxdxneopneming

CyUg/ml) CPM* SI** 15 ' BALB/c nu/+ 10 34.500 5,0 - * BALB/c nu/nu 10 ~ 38.693 5,6

Protocol: 1 x 10^ cellen/ml van elke stam met of zonder 20 mytogenen gekweekt in 0,2 mg RPM1-1640 (5% FCS) in 96 puts mikrotiterplaten. Men voegde 1 ^ucl H-thymidine toe aan elke put gedurende de laatste 18 uur van een 48-uurs incuhatie en 3 . .

H-opnemmg werd gemeten door standaardscxntxllatxemethoden.

*CPM: tellingen per minuut. **SI: stimulerings- 25 index.

(2) Interleukine I produktie.

Men kan het EDE gebruiken voor de stimulering van de produktie van lymfokinen, die door makrofagen worden af-30 gegeven. Interleukine-I is een oplosbare immuunregulator, die wordt afgegeven door makrofagen en verantwoordelijk is voor de aktivering van lymfocyten ter plaatse van een infektie. Inter-leukine-I speelt een kritische rol als versterker van de immuun-respons. · 35 Murine-makrofagen werden gehecht op mikro- 8402515 - 6 - g titerplaten ( 1 x 10 /put ), waarbij elke bepaling in drievoud werd gedaan. De eerste putten ontvingen 1 ml 50 ^ug/'ml oplossing van standaardendotoxine, dat bereid was volgens de proce- ' dure, beschreven in bovengenoemde lopende octrooiaanvrage. Aan 5 de tweede reeks putten voerde men 1 ml 50 ^ug/ml oplossing van RDE volgens de uitvinding toe. Elk middel werd gesolubiliseerd in M 199 medium met 5% FCS (foetaal kalfsserum) 1 ml. M 199 medium met 5% FCS werd aan de derde reeks putten toegevoegd, teneinde als controle te dienen.

10 Men ineubeerde de platen 20 uur bij 37°C. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en verdund onder verkrijging van een oplossing met een 1:10 verhouding van bovenstaande vloeistof tot gedestilleerd water. Men beproefde de bovenstaande vloeistof op interleukine-I produktie volgens de methode van 15 Gery, et al. Cellular Immun. 64, 293 (1981).

De na verwijdering van de bovenstaande vloeistof overblijvende cellen werden gelyseerd onder gebruikmaking van 0,12 Triton X-100. De resulterende oplossing werd verdund met RPMI 1640 medium met 5% foetaal kalfsserum bij een verdun-20 ningsverhouding 1:10.

Men beproefde de verdunde oplossing op Inter-leukine-I produktie door meting van een verhoging van door PHA

3 opgewekte makrofaagopneming van H -thymidine als beschreven in Gery et al boven. De resultaten worden getoond in tabel A.

25

TABEL A

Proefmateriaal Bovenstaande vloeistof Lysaat (50 ^ug/ml) Respons Respons 30 __(1:10 verdunning) _(1:10 verdunning)

Endotoxine standaard 31.137 ± 1.721 51.695 ± 2.797 SDE 16.782 ±Ί.295 66.178 ± 2.332

Controle 3.323 ± 31 12.153 + 497 35 8402515 - 7 -

Zoals in tabel A. wordt getoond overschreed de Interleukine-I produktie uit EDE van de uitvinding in de ge-lyseerde cellen sterk de Interleukine-I produktie uit het stan-daardendoxineextrakt.

5 Dezelfde proef werd uitgevoerd met menselijke monocyten in plaats van murine-makrofagen.

De resultaten zijn als volgt: TABEL Aa 10

Proef materiaal Bovenstaande vloeistof Lysaat (10 ^ug/ml) Respons Respons _(1:50 verdunning)_(1:50 verdunning)

Endoxine 15 standaard. 42.418 ± 1.763 51.821 ± 1.348 EDE 17.910 ±1.983 50.626 ± 813

Controle 1.693 ± 289 15.173 ± 1.292 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 8402515

Makrafaagaktivering.

2 20 BDE van de uitvinding stimuleert ook makra- 3 fagen als gemeten aan het vermogen van makrofagën tot fagocyti- 4 seren (verzwelgen) van fluorescerende parels.

5 1 x 10 peritoneaalexudaatcellen werden ver 6 mengd met 5 yul oplossing van een proefmateriaal, dat respek- 7 25 tievelijk bestond uit standaardendotoxine, RDE van de uitvinding 8 en zout ter controle, teneinde drie proefoplossingen te vormen.

9

Elke oplossing bevatte 1 ^ug proefmateriaal en 20 ^ul suspensie 10 van fluorescerende parels. De proefoplossingen werden op af 11 zonderlijke mikroskoopglaasjes gebracht en daarna 90 minuten 12 30 bij 37°C geincuheerd.

13

Na incubatie werden de glaasjes geobserveerd 14 onder een f luorescerende mikroskoop. Door visuele waarneming 15 bepaalde men het aantal cellen, dat de fluorescerende parels 16 gefagocytoseerd had, alsmede het aantal parels/cel.

17 35 De fagocytische index werd berekend volgens / '< v- - 8 - s' de formule: % fagocytoserende cellen x aantal parels/ FAGOCYTISCHE INDEX --100 .c.?lleS-- 1000 5 en de resultaten van de twee proeven worden gegeven in tabel B.

TABEL B

Fagocytische index* 10 Proef 1_Proef 2

Endotoxinestandaard 5,0 3,6 EDE 5,4 4,1

Controle 1,0 0,5 15 Zoals uit tabel B blijkt was de fagocytische index voor EDE van de uitvinding aanzienlijk groter dan die van standaardendotoxine, waardoor is vastgesteld, dat EDE een uitermate potente stimulator van makrofagen is. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 8402515 (4) Hulpwerking.

2

Teneinde het gebruik van EDE als stimulator 3 van het immuunsysteem van warmbloedige dieren verder te onder 4 zoeken beproef de men EDE op hulpwerking als bepaald door zijn 5 vermogen tot het versterken van de immuunrespons op schape- 6 rodebloedcellen (SEBC) door meting van het vermogen van anti- 7 lichamen tot het lyseren van. de schaperodehloedcellen. Men be 8 reidde drie proefmaterialen, die elk een hoeveelheid van 1 x 10^ 9 SEBC bevatte. Proefmateriaal nummer 2 bevatte bovendien 20 mcg 10 standaardendotoxine + SEBC, terwijl proefmateriaal nummer 3 11 20 mcg EDE van de uitvinding + SEBC bevatte.

12

Het proefmateriaal werd interperitoneaal gein- 13 jekteerd in muizen van de stam BALB/C. Na 4-5 dagen werden de 14 proefdieren af gemaakt en werden de milten verwijderd en fijn 15 gemalen in een weefselmolen. Men bereidde een standaardcellen- 16 suspensie van elke milt onder gebruikmaking van een hemocytometer * - 9 - en elk van de bovengenoemde suspensies werd op mikroskoopglaasjes gebracht samen met het doel SKBC, medium en agar.

Men incubeerde de glaasjes 2 uur bij 37°C en bracht op elk glaasje als complementbron serum van de guinese 5 big aan, gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37°C.

Daarna onderzocht men de glaasjes ter bepaling van de hoeveelheid plaatvormende cellen, die gebieden zijn, waarin antilichamen de SRBC-cellen vernietigden met behulp van het complement, dat wordt aangetroffen in het serum van de gui- 10 nese big.

De resultaten worden getoond in tabel C.

TABEL C

15 Proefmateriaal PFC/2x10~* milt cellen SRBC 88 SKBC + endo- toxinestandaard 165 SKBC + RDE 219 20

Zoals uit tabel C blijkt is het aantal plaatvormende cellen, dat resulteert uit het gebruik van RDE, vergeleken bij standaardendotoxine aanzienlijk hoger, waaruit blijkt, dat EDE een potent hulpmiddel is.

25 Men kan het RDE van de uitvinding toedienen in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbaar medium, zoals zout of een oliedruppelemulsie. Bovengenoemd preparaat kan bijvoorbeeld worden gestabiliseerd volgens een vriesdroogmethode en daarna zonder potentieverlies worden gereconstitueerd.

30 Als boven beschreven kan men het preparaat ter behandeling van warmbloedige dieren en mensen gebruiken in de vorm van een oliedruppelemulsie. De gebruikte hoeveelheid olie bedraagt 0,5-3,0 vol%, berekend op het totale volume van het preparaat. Het verdient de voorkeur 0,75-1,5 vol% olie te 35 gebruiken. Voorbeelden van geschikte oliën zijn lichte minerale 8402515 Γ - 10 - olie, squalaan, 7-n-hexyloctadecaan, Conoco superoil en Drakeol 6 VR mineral oil (geproduceerd door Pexmreco Company, Bulter, Pennsylvania).

Daarna combineert men het gehomogeniseerde olie 5 bevattende mengsel met een wasaktieve stof, die voor vermenging eventueel kan worden opgelost in een zoutoplossing. De hoeveelheid wasaktieve stof bedraagt met name 0,02-0,20 vol% en bij voorkeur 0,10-0,20 vol%, berekend op het totale volume van het preparaat. Men kan. elke gewone wasaktieve stof gebruiken, met 10 inbegrip van Tween-80 en Arlacel (geproduceerd door Atlas Chemical Company).

Daarna homogeniseert men het mengsel, dat resulteert na de toevoeging van wasaktieve stof tot een suspensie met een hoog percentage oliedruppels, die met EDE zijn bekleed 15 als. bepaald door observatie onder een mikroskoop.

De hoeveelheid RDE in een enkele injektie bedraagt 5-500 ^ug, bij voorkeur 10-100 ^ug (per totaal lichaamsgewicht van een volwassen mens van 70 kg.

1-3 injekties werden toegediend over een perio- 20 de van 2 maanden.

Het RDE-preparaat van de uitvinding vertoont aanzienlijk minder pyrogene werking dan. een preparaat, dat stan-daard end o t oxine bevat, als blijkt uit het volgende voorbeeld.

Drie konijnen van de Nieuw Zeelandstam werden 25 geinjekteerd (in een oorader) met een standaardendotoxine bevattend preparaat. De voor het veroorzaken van een lichaamstemperatuur sverhoging van tenminste 0,46°C in 50% van de proefpopulatie benodigde hoeveelheid standaard endotoxine werd bepaald over een periode van 3 uur onder gebruikmaking van een rectaal thermometer. 30 Drie andere proefkonijnen werden ook geinjek teerd met een EDE bevattend preparaat en men voerde dezelfde proef op pyrogene werking uit. De resultaten worden getoond in de volgende tabel D. 1 8402515

O

- 11 .-TABEL D

Pyrogeniciteit 5 Proefmateriaal Werking bij konijn* (in /txg 1/kg)

Endotoxinestandaard 0,012 EDE 10 (dat wil zeggen geen 10 koorts bij hoogste dosis = 10 yUg) *De dosis, die nodig is voor het veroorzaken van een koortsres-15 pons van meer dan 0,46°C bij 50% van een proefpopulatie.

Zoals uit tabel D blijkt, gaf standaardendo-toxine een koortsrespons bij 50% van de proefdieren bij een dosis 20 van 0,012 yUg/kg. EDE gaf echter geen koortsrespons bij >10 yUg/ kg, wat 850 maal het dosispeil van standaardendotoxine is.

8402515

Claims (6)

1. Preparaat, dat bij een warmbloedig dier een doeltreffende hulprespons kan geven of de immuunrespons kan stimuleren, met het kenmerk, dat het een doeltreffende hoeveelheid bevat van een gezuiverd, ontgiftigd endotoxine bevattend 5 produkt zonder waarneembaar 2-ketodeoxyoctanaat bij 350-475 nmolen/mg fosfor en 1700-2000 nmolen/mg vetzuur, al dan niet in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de doeltreffende hoeveelheid 5-500 ^ug/kg 10 bedraagt.

3. Preparaat volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de doeltreffende hoeveelheid 10-100 ^ug/kg bedraagt.

4. Preparaat volgens conclusie 1, 15 met het kenmerk, dat het in gevriesdroogde vorm verkeert.

5. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het een*oliedruppelemulsie is.

6. Nieuw preparaat als beschreven in de beschrijving. 20 8402515