FI76494B - Foerfarande foer framstaellning av renat, detoxifierat endotoxin. - Google Patents

Description

1 76494

Menetelmä puhdistetun myrkyttömän endotoksiinin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää puhdistetun myrkyt-5 tömän endotoksiinin valmistamiseksi, joka ei sisällä havaittavia määriä 2-keto-3-deoksioktanoaattia, joka sisältää noin 350-475 nmoolia/mg fosforia ja noin 1700-2000 nmoolia/mg rasvahappoja ja joka valmistetaan hydrolysoimalla Enterobacteriaciae-heimoon kuuluvista mikro-organismeis-10 ta saatu endotoksiiniuute hapolla, kuten kloorivetyhapolla, rikkihapolla, fosforihapolla, tolueenisulfonihapolla tai trikloorietikkahapolla ja lyofilisoimalla hydrolysoitu tuote, jolloin saadaan raakalidipi A. Endotoksiinituote (RDE) muodostaa yhdistettynä soluseinämärungon (CWS) kans-15 sa terapeuttisesti vaikuttavan koostumuksen syöpäkasvainten käsittelyyn, jolla koostumuksella ei ole endotoksiinei-hin normaalisti liittyviä vahingollisia sivuvaikutuksia.

Enterobacteriaciae-heimon organismeista ja niiden mutanteista saadut endotoksiiniuutteet ovat tunnettuja.

20 Näitä uutteita on käytetty erilaisten immunogeenisten kasvainten immunoterapiassa /viitejulkaisu: Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi et ai. Cancer Immunol. Immuno-ther., voi. 7, sivut 43-58 (197917. Endotoksiiniuutteiden 25 tiedetään kuitenkin olevan erittäin myrkyllisiä, ja siten niiden käyttö syöpäkasvainten käsittelyyn on rajoitettua. Yrityksiä endotoksiinin saamiseksi myrkyttömäksi siten, että se edelleen vaikuttaa syöpäkasvainten taantumiseen (regressiovaikutus), on tehty. Kuten Ribi et ai. ovat osoit-30 taneet, aiheuttivat kemialliset menetelmät, kuten sukkin-nyyli- tai ftalyylijohdannaisten valmistus, joiden tiedetään tekevän endotoksiinit myrkyttömiksi samalla säilyttäen niiden adjuvanttiominaisuudet, sekä myrkyllisyyden että syöpäkasvaimen regressiovaikutuksen häviämisen. Siten 35 tunnetut yritykset sellaisen endotoksiinituotteen valmistamiseksi, jonka regressiovaikutus syöpäkasvaimeen on hyvä ja joka on vain vähän tai ei lainkaan myrkyllinen, ovat 2 76494 olleet vähemmän menestyksellisiä.

Soluseinämärunko käsittää pääasiallisesti solusei-nämän, josta on poistettu soluseinämässä normaalista runsaina esiintyvät proteiinit ja lipidit. Se on polymeeristä 5 mykolihappo-arabinogalaktaanimukopeptidiä, jossa on jäännöksiä trehaloosimykolaatista ("P^") ja hajoamattomista tuberkuloproteiineista. Soluseinämärunko saadaan mykobak-teereista, joista esimerkkeinä mainittakoon M. smegmatis, M.phlei, Novardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacte-10 rium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M.kansasii, M.tuberculosis (kanta H 37 ja Ayoma B) ja M.bovis, kanta BCG. Lisäksi soluseinämärunko voidaan saada ei-mykobaktee-reista, kuten mikrobeista E.coli, B.abortus ja Coxiella burnettii.

15 Soluseinämärunko saadaan kasvattamalla bakteereja, kuten M.bovis, kanta BCG (Bacillus Calmette-Guerin) ja ottamalla bakteerimassa talteen. Kokonaisista soluista koostuva massa ajetaan solufraktiointilaitteen /Ribi Cell Fractionator (Sorvali, malli RF-li7 lävitse, joka rikkoo solut 20 ja erottaa solun ulkokalvon tai soluseinämän protoplasma-epäpuhtauksista. Saaduille soluseinämille suoritetaan sitten sarja liuotinuuttoja ja entsymaattisia käsittelyltä (esim. trypsiini ja/tai kymotrypsiini) puhdistetun solu-seinämärungon saamiseksi.

25 Keksinnön kohteena on siten sellaisen erityispuh- distetun myrkyttömäksi tehdyn endotoksiinituotteen tuottaminen, jonka regressiovaikutus kasvaimiin on suuri ja jolta endotoksiinin myrkylliset sivuvaikutukset puuttuvat. Tarkoituksena on myös saada aikaan puhdistetun myrkyttö-30 mäksi tehdyn endotoksiinin ja soluseinämärungon yhdistelmä käytettäväksi voimakkaasti vaikuttavana koostumuksena syöpäkasvainten käsittelyssä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on puhdistetun myrkyttömän endotoksiinin valmistamiseksi, joka ei sisäl-35 lä havaittavia määriä 2-keto-3-deoksioktanoaattia, joka sisältää noin 350-475 nmoolia/mg fosforia ja noin 1700-2000 nmoolia/mg rasvahappoja, ja joka valmistetaan hydro- 3 76494 lysoimalla Enterobacteriaciae-heimoon kuuluvista mikro-organismeista saatu endotoksiiniuute hapolla, kuten kloo-rivetyhapolla, rikkihapolla, fosforihapolla, tolueenisul-fonihapolla tai trikloorietikkahapolla, ja lyofilisoimalla 5 hydrolysoitu tuote, jolloin saadaan raakalidipi A, jolle on tunnusomaista, että a) raakalipidi A:ta käsitellään ensimmäisellä liuottimena, kuten asetonilla, sen sisältämien rasvahappojen liuottamiseksi, 10 b) saatu liukenematon tuote liuotetaan toiseen liuottimeen, kuten metanoliin, kloroformiin, asetoniin tai näiden liuottimien seokseen, ja c) saatu liuos johdetaan kromatografiakolonnin lävitse halutun tuotteen saamiseksi.

15 Sentyyppisiä endotoksiiniuutteita, joita käytetään lähtömateriaalina RDE:n tuottamisessa, voidaan saada mistä tahansa Entreobacteriaciae-organismista tai sellaisen mutantista. Valaisevina esimerkkeinä käytettäviksi sopivista mikro-organismityypeistä voidaan mainita seuraavat 20 suvut: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Borde-tella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella ja Serratia.

Tyypillisesti käytetään seuraavia lajeja: S. minne-sota, S. typhimurium. B.pertussis, B.abortus, S.enteriti-25 dis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa, Shigella flexni ja S.abortus equi.

Lähtömateriaalina käytettyjä endotoksiiniuutteita voidaan valmistaa monilla tunnetuilla menetelmillä (katso esim. Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M. ja Johnson 30 A.G., J.Immunol. 1955, 744, 55; Westphal, 0., Luderitz, 0., ja Bister, F., Z.Naturforsch, 76, 148 (1952); Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr.Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957, 115; Galanos, C., Ludertiz, 0., Westphal, 35 0., Eur.J.Biochem. 9, 245 (1969); Chen, C.H., Johnson, A.G. ,

Kasai, N., Key, B.A. Levin, J., Nowotny, A., J.Infect.

Dis. 128, 543 (1973); Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., 4 76494

Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961); Leive, L., Biochem.Biophys.Res.Comm. 21, 290 (1965); ja Ribi, E., Milner, K.C., ja Perrine, T., J.Immunol. 82, 75 (1959)).

5 Edullisen menetelmän endotoksiiniuutteen valmista miseksi ovat esittäneet Chen et. ai.; tässä menetelmässä käytetään metanoli-kloroformisaostusta.

Metanoli-kloroformisakka (MCP) saatetaan sitten reagoimaan orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa ja 10 lyofilisoidaan, jolloin saadaan hydrolysoitu raakalipidi A, jonka myrkyllisyys ja pyrogeenipitoisuus on lähtöaine-endotoksiinimateriaaliin verrattuna alentunut. Saatua tuotetta käsitellään sitten liuottimena, joka pystyy erityisesti liuottamaan rasvahapot ja muut epäpuhtaudet ilman, 15 että raakalipidi A liukenee. Edullinen liuotin tähän tarkoitukseen on asetoni. Myrkyttömäksi tehdyn puhdistetun lipidi A:n fosfaattipitoisuus on noin puolet vastaavan myrkyllisen tuotteen fosfaattipitoisuudesta, mistä voidaan päätellä endotoksiinin fosfaattipitoisuuden ja myrkkyvai-20 kutuksen olevan yhteydessä toisiinsa.

MCP:n kanssa reagoivia edullisia epäorgaanisia happoja ovat kloorivetyhappo, rikkihappo ja fosforihappo ja edullisia orgaanisia happoja ovat tolueenisulfonihappo ja trikloorietikkahappo. Reaktio voidaan sopivasti suorittaa 25 noin 90-130°C:ssa hydrolyysin täydelliseen suorittamiseen riittävän pitkän ajan, tavallisesti noin 15-60 minuuttia.

Myrkyttömäksi tehtyä raakaendotoksiinia voidaan valmistaa myös saattamalla raakamateriaali reagoimaan hapon kanssa orgaanisen liuottimen, kuten kloroformin, meta-30 nolin tai etanolin tai näiden yhdistelmän läsnäollessa.

Saatu raakalipidi A liuotetaan asetoniin, joka on erityisen sopiva rasvahappokomponenttien poistamiseen. Sitten liuotin poistetaan, jolloin saadaan myrkyttömäksi tehtyä raakaendotoksiinia.

35 Myrkyttömäksi tehty raakendotoksiini liuotetaan liuottimeen ja lasketaan sopivan kromatografiakolonnin, kuten esimerkiksi ekskluusio-kromatografiakolonnin lävitse i k s 76494 b RDE-fraktioiden erottamiseksi; liuottimen poistamisen jälkeen fraktiot yhdistetään. Eräässä suoritusmuodossa myrkyttömäksi tehty raakaendotoksiini lasketaan Sephadex-ko-lonnin lävitse liuottimen, kuten kloroformin, metanolin 5 tai asetonin tai näiden yhdistelmän läsnäollessa. Kolonnin paine voi vaihdella, mutta tyypillisesti se on noin normaalipaineen ja 690 kPa:n välillä, ja virtausnopeus on noin 0,1-10 ml/min.

Toisessa suoritusmuodossa myrkyttömäksi tehty raa-10 kaendotoksiiniliuos lasketaan DEAE-selluloosakolonnin lävitse samoissa paineolosuhteissa kuin edellä Sephadex-ko-lonnin yhteydessä mainittiin. Virtausnopeus voidaan pitää noin 2-15 ml:na/min. Liuottimet voivat olla myös samat kuin Sephadex-kolonnia käytettäessä, vaikka kaikkiin seoksiin 15 voidan myös lisätä vettä ja/tai dietyyliamiinia aina noin 1 %:n konsentraatioon asti.

Vielä eräässä menetelmässä RDE:n valmistamiseksi myrkyttömäksi tehdystä raakaendotoksiinista liuos lasketaan alhaisessa paineesa silikageelikolonnin lävitse, jossa si-20 likageelin raekoko on noin 15-63 ^im, käyttäen liuottimena kloroformin, metanolin ja ammoniakin seoksia. Näiden liuottimien edullinen tilavuussuhde seoksessa on noin 50:25:4:2.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuotettu RDE ja CWS yhdistetään koostumukseksi, jolla on vahva kasvainten 25 vastainen aktiviteetti. RDE-CWS-koostumuksella käsiteltävät syöpäkasvaimet voivat olla eläinten kasvaimia, kuten naudan suomusolukarsinooma, naudan fibrosarkooma, hevosen sarkoidi, hevosen melanooma, hevosen suomusolukarsinooma, koiran nisäkasvain, koiran adenooma ja koiran melanooma, 30 ja ihmisen kasvaimia, kuten rintasyöpä, keuhkosyöpä, paksu-suoli-peräsuolisyöpä, pahanlaatuinen melanooma, suorausolu-karsinooma ja munasarjakasvaimet.

Koostumusta annetaan edullisesti injektiona farmaseuttisesti hyväksyttävässä väliaineessa, kuten öljypisara-35 emulsiona suoraan kasvaimeen olosuhteissa, joita kuvataan erikseen seuraavassa. Tällainen koostumus voidaan stabiloida esimerkiksi lyofilisoimalla tuotteeksi, joka voidaan , 76494 o sitten vaikutusvoimakkuuden alenematta jälleen rekonsti-tuoida.

Eläinten käsittelyyn käytetty yksi injektio sisältää RDE:tä noin 6,26-250 yug/ml. CWS-määrä on noin 125-750 5 ^ug/ml. Kasvaimeen injektoitu biologisen aineen ml-määrä riippuu kasvaimen koosta seuraavan taulukon mukaisesti: Eläinten annos kasvaimen koosta riippuvaisena:

Kasvaimen Biologisen aineen injektoitu läpimitta (cm)_määrä (ml)_ 0- 1 0,5 ml:aan asti 1- 2 0,5-2,5 2- 3 2,5-5 3- 5 5-10 5-8 10-15 ^ yli 8 cm 15-20

Maksimiannos injektiota kohti on noin 1500 ;ug RDE:tä ja noin 4500 pg CWS:ää. Käsittelysarja sisältää jopa 5 injektiota viikon väliajoin.

RDE-CWS-koostumus sopivassa injektoitavassa väli-20 aineessa, kuten Ö1jypisaraemulsiossa, injektoidaan suoraan ihmisen kasvaimeen. Yhden 70 kg painavalle aikuiselle tarkoitetun injektioannoksen sisältämät RDE- ja CWS-määrät ovat noin 50-1000 jug, edullisesti molempien määrä on noin 275-325 pg. Injektioita annetaan noin kerran viikossa ja 25 kaikkiaan aina 15 injektioon asti. Yleensä on edullista antaa koostumusta, joka sisältää noin 50-500 yug/ml RDE:tä ja noin 50-500 pg/ml CWS:ää.

Kuten edellä kuvattiin, lämminveristen eläinten ja ihmisten käsittelyyn käytettävä koostumus voi olla öljypisa-30 raemulsiona. Käytetty öljyn märää voi olla noin 0,5-3,0 ti-lavuus-% koko koostumuksen tilavuudesta. Edullisesti öljyä käytetään noin 0,75-1,5 tilavuus-%. Esimerkkejä sopivasta öljyistä ovat kevyt mineraaliöljy, skvalaani, 7-n-heksyyli-oktadekaani, "Conoco superoil" ja "Drakeol 6 VR" mineraa-35 liöljy (tuottaa Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).

Homogenoitu öljyä sisältävä seos yhdistetään sit- 7 76494 ten pinta-aktiivisen aineen kanssa, joka voidaan ennen sekoittamista liuottaa suolaliuokseen. Pinta-aktiivisen aineen määrä on tyypillisesti noin 0,02-0,2 tilavuus-% ja edullisesti noin 0,10-0,20 tilavuus-% koko koostumuksen 5 tilavuudesta. Mikä tahansa tavallinen pinta-aktiivinen aine sopii käytettäväksi, esimerkiksi "Tween-80" ja "Arlacel" (tuottaa Atlas Chemical Company).

Pinta-aktiivisen aineen lisäyksen jälkeen seos homogenoidaan suspensioksi, jossa on suuri %-osuus öljy-10 pisaroita, joiden päällysteenä on RDE ja CWS, kuten mikroskoopilla voidaan todeta.

Koostumuksen käyttö ja vaikutus kuvataan seuraa- vassa.

13 marsua (kanta 2), joilla oli noin 9 mm läpi-15 mittaiset linja-10:n kasvaimet, saivat injektiona suoraan kasvainkudokseen 0,4 ml steriiliä Ö1jypisaraemulsiota "Drakeol 6 VR" mineraaliöljyssä (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), joka sisälsi 50 jxq RDE:tä ja 50 pg CWS:ää.

20 Kolmen kuukauden kuluttua eläimet tarkastettiin, ja 13 eläimestä 12:11a kasvain oli täysin hävinnyt. Kont-rollikokeessa 6:lie marsulle (kanta 2), joilla oli Iinjalo : n kasvain, kooltaan noin 9 mm, annettiin suoraan kasvainkudokseen kerran 0,4 ml:n injektio, joka sisälsi pel-25 kästään 50 pg RDEstä. 6:sta kasvaimesta ei yksikään 3 kuukauden kuluttua osoittanut merkkejä taantumisesta.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu valaisemaan keksintöä.

Esimerkki 1 30 Myrkyttömän raakaendotoksiinin valmistus

Chen'in et ai. (J.Infect.Dis. 128, 543, 1973) kuvaamalla menetelmällä valmistettu metanoli-kloroformisak-ka (650 mg) suspendoitiin 150 ml:aan 0,l-n-HCl:ää jäähdyt-timellä varustetussa kolmikaulapyörökolvissa, joka sitten 35 pantiin sonikaattoriin. Ultraäänikäsittelyn jälkeen kolvi pantiin 120°C:n Ö1jyhauteeseen, ja kolvin sisällön lämpö- 8 76494 tilan annettiin kohota liuoksen kiehumispisteeseen. Liuoksen ylikuumeneminen minimoitiin sovittamalla kolvin yhden kaulan lävitse kapillaariputki, jonka kautta johdettiin typpikaasua. Koko hydrolyysin ajan pulloon johdettiin jat-5 kuva typpivirta.

Hydrolyysiä jatkettiin 30 minuuttia, sitten liuos jäähdytettiin jäähauteessa, sitä käsiteltiin ultraäänellä kiinteän aineksen dispergoimiseksi, ja suspensio jaettiin corex-putkiin. Kolvi pestiin tislatulla vedellä kaiken 10 kolvin seinämiin tarttuneen kiinteän aineen poistamiseksi, ja pesuneste lisättiin corex-putkissa olevaan suspensioon. Suspensio lingottiin 80 minuuttia kierrosnopeudella 12000 rpm. Supernatantti dekantoitiin ja hyljättiin. Kiinteä jäännös suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen, suspen-15 siota käsiteltiin ultraäänellä, kunnes kiinteä aine oli hyvin dispergoitunut, sitten lingottiin jälkeen. Linkoa-misprosessi toistettiin. Jäännökseen lisättiin tislattua vettä, seos jäähdytettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 382 mg raakaa lipidi A:ta. Sitä (150 mg) käsiteltiin 20 kylmällä (0°C) asetonilla rasvahappojen poistamiseksi, sitten ultraäänellä, seos suodatettiin painovoimasuodatus-laitteessa 5°C:ssa Whatman nro 1 suotimella. Kuivaamalla saatiin 100 mg myrkyttömäksi tehtyä raakaendotoksiinia.

Esimerkki 2 25 Myrkyttömän raakaendotoksiinin valmistus 120 mg MCP:tä (metanoli-kloroformisakka) suspendoitiin 12 ml:aan vedetöntä metanolia, suspensiota käsiteltiin ultraäänellä kiinteän aineksen dispergoimiseksi ja suspensio jaettiin 6:een (1 x 10 cm) kierretulpalliseen 30 putkeen. Kuhunkin putkeen lisättiin 2 ml 0,2-n HCl:ää ja saatua suspensiota inkuboitiin kiehuvassa vesihauteessa 45 minuuttia. Hydrolyysin päätyttyä putket jäähdytettiin jäävesihauteessa ja niitä lingottiin noin 10 minuuttia kierrosnopeudella 2500 rpm. Supernatantti dekantoitiin, ja 35 jäännökseen lisättiin 5 ml kloroformi/metanoliseosta 2:1 materiaalin liuottamiseksi. Kaksifaasiliuos lingottiin 9 76494 jälleen 10 minuuttia kierrosnopeudella 2500 rpm. Päällä oleva vesifaasi hyljättiin, ja jokaiseen putkeen lisättiin kloroformi/metanoliseosta 4:1, jolloin saatiin kirkas liuos. Liuokset yhdistettiin ja liuotin haihdutettiin kier- 5 tohaihduttimessa. Jäännös kuivattiin suurvakuumissa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 45 mg raakaa lipidi A:ta.

20 mg tätä ainesta käsiteltiin kylmällä asetonilla (0°C), o ultraäänellä, ja seos suodatettiin 5 C:ssa pamovoimasuoda-tuslaitteella Whatman nro 1 suotimella. Kuivaamisen jälkeen 10 saatiin 13 mg myrkyttömäksi tehtyä raakaendotoksiinia. Esimerkki 3

Puhdistetun myrkyttömän endotoksiinin valmistus 110 g LH-20-100 (25-100 pm raekoko; Pharmacia) ja 600 ml kloroformi/metanoliseosta 2:1 sekoitettiin. Seos 15 sai seistä 30 minututia, saatu liete lisättiin lasiseen kromatografiakolonniin (25 x 1000 mm), joka oli varustettu paineliittimellä. Täytön päätyttyä kolonni liitettiin teflon-paineputkilla ISCO Model 132 pumppuun. Kolonnin lävitse pumpattiin nopeudella 3 ml/minuutti 400 ml kloro-20 formi/metanoliseosta 4:1. Esimerkin 1 mukaisesti valmistettua myrkyttömäksi tehtyä raakaendotoksiinia (100 mg) lisättiin kolonniin 2,5 ml:ssa kloroformi/metanoli-seosta 4:1 näyteaukon kautta. Virtausnopeus alennettiin 1 ml:ksi/ minuutti ja eluenttia koottiin 150 ml, sitten effluentti 25 yhdistettiin fraktiokerääjään. Kerättiin 4 ml:n fraktioita, ja niistä määritettiin puhdistettua myrkyttömäksi tehtyä endotoksiinia sisältävät fraktiot ohutkerroskroma-tografisesti (3· Merck, 0,25 mm paksu kerros, kloroformi/ metanoli/H20/NH40H (50:25:4:2) eluentt^?· 30 Puhdistettua, myrkyttömäksi tehtyä endotoksiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 30 mg puhdistettua myrkyttömäksi tehtyä endotoksiinia valkeana jauheena.

Esimerkki 4 35 Puhdistetun myrkyttömän endotoksiinin valmistus 33 mg DEAE-selluloosaa (Wahtman DE-32) suspendoi- 76494 10 tiin 150 ml:aan jääetikkaa, ja suspensiota sekoitettiin hiljalleen 10 minuuttia jauhelietteen saamiseksi. Liete sai seistä yli yön.

Liete kaadettiin kolonniin (25 x 400 mm), sen annet-5 tiin laskeutua, laskeutumista edistettiin naputtelemalla kolonnia, ja ylimääräinen happo poistettiin. Kolonni pestiin 2000 ml :11a metanolia ja sitten 200 ml:11a klorofor-mi/metanoliseosta 4:1. Esimerkin 1 mukaisesti valmistettua epäpuhdasta myrkyttömäksi tehtyä endotoksiinia lisättiin 10 kolonniin 3 ml:ssa kloroformi/metanoliseosta 4:1 tai klo-roformi/metanoli/vesiseosta 80:21:1. Kolonni eluoitiin kloroformi/metanoliseoksella 4:1 (350 ml) ja sitten meta-noli/vesiseoksella 99:1 (300 ml). Lineaarisen gradientti-laitteen avulla kolonni eluoitiin 2000 ml:11a lineaarista 15 gradienttia alkaen 100-%:isesta metanolista ja päätyen 0,2-m etikkahapon metanoliliuokseen. Kolonni eluoitiin virtausnopeudella 6 ml/minuutti, ja 15 ml:n fraktioita koottiin. Joka toisesta fraktiosta määritettiin kokonais-fosforipitoisuus G.R. Bartlett'in (J.Biol.Chem. 234, 466-20 471, 1959) menetelmällä. Fraktiot yhdistettiin ja haihdu tettiin lähes kuiviin kiertohaihduttimessa, jäännökseen lisättiin erotussuppilossa 10 ml kloroformi/metanoliseosta 2:1 ja 40 ml 0,001-m etikkahappoa. Alempi kerros erotettiin, suodatettiin Whatman nro 2 suodatinpaperilla ja 25 suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 19,2 mg puhdistettua myrkyttömäksi tehtyä endotoksiinia.

Claims (1)

11 76494 Patenttivaatimus Menetelmä puhdistetun myrkyttömän endotoksiinin valmistamiseksi, joka ei sisällä havaittavia määriä 2-keto-3-5 deoksioktanoaattia, joka sisältää noin 350-475 nmoolia/mg fosforia ja noin 1700-2000 nmoolia/mg rasvahappoja, ja joka valmistetaan hydrolysoimalla Enterobacteriaciae-heimoon kuuluvista mikro-organismeista saatu endotoksiiniuute hapolla, kuten kloorivetyhapolla, rikkihapolla, fosforihapol-10 la, tolueenisulfonihapolla tai trikloorietikkahapolla, ja lyofilisoimalla hydrolysoitu tuote, jolloin saadaan raaka-lipidi A, tunnettu siitä, että a) raakalipidi A:ta käsitellään ensimmäisellä liuottimena, kuten asetonilla, sen sisältämien rasvahappojen 15 liuottamiseksi, b) saatu liukenematon tuote liuotetaan toiseen liuot-timeen, kuten metanoliin, kloroformiin, asetoniin tai näiden liuottimien seokseen, ja c) saatu liuos johdetaan kromatografiakolonnin lä-20 vitse halutun tuotteen saamiseksi.