KR101958753B1 - 인간 ｃｄ27에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 CD27에 결합하는 단리된 단클론 항체, 그리고 관련된 항체-기초된 조성물과 분자가 개시된다. 또한, 이들 항체를 이용하기 위한 치료적 방법 및 진단적 방법이 개시된다.

Description

인간 ＣＤ27에 결합하는 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES THAT BIND HUMAN CD27 AND USES THEREOF}
인간 CD27에 결합하는 단리된 단클론 항체, 그리고 관련된 항체-기초된 조성물과 분자가 개시된다. 또한, 이들 항체를 이용하기 위한 치료적 방법 및 진단적 방법이 개시된다.
T 세포와 항원-제시 세포 사이에 상호작용은 면역 반응의 발생을 촉진하는 다양한 보조 분자 (accessory molecule)를 필요로 한다. 이와 같은 한 가지 분자는 CD27인데, 이것은 CD70에 결합하고, 그리고 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R) 상과 (superfamily)에 속한다 (Ranheim EA, et al., Blood. 1995 June 15;85(12):3556-65). CD27은 전형적으로, 2개의 단위체를 연결하는 이황화 가교를 갖는 동종이합체의 형태로 빈번하게, 당화된, I형 막통과 단백질로서 존재한다. 이황화 가교는 막에 가까운 세포외 도메인 내에 존재한다 (Camerini et al., J Immunol. 147:3165-69 (1991). CD27은 또한, 가용성 형태 (soluble form)로 발현될 수도 있다 (예로써, van Oers MH, et al., Blood. 1993 Dec 1;82(11):3430-6 및 Loenen WA, et al., Eur . J. Immunol . 22:447, 1992를 참고한다). T 세포 상에서 CD27 항원을 가교-연결하는 것은 T-세포 수용체 가교연결과 협력하여, T-세포 증식 및 세포 면역 활성화를 유도할 수 있는 보조자극 신호를 제공한다.
CD27은 성숙 흉선세포, 대부분의 CD4+와 CD8+ 말초혈 T 세포, 자연 킬러 세포 및 B 세포에서 발현된다 (Kobata T, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U S A. 1995 Nov 21;92(24):11249-53). CD27은 또한, B 세포 비-호지킨 림프종 및 B 세포 만성 림프성 백혈병에서 고도로 발현된다 (Ranheim EA, et al., Blood. 1995 Jun 15;85(12):3556-65). 부가적으로, 증가된 수준의 가용성 CD27 단백질이 기생충 감염, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 감염, 유사 육종증, 다발성 경화증, 그리고 B-세포 만성 림프성 백혈병에서 혈청 또는 질환 활성 부위에서 확인되었다 (Loenen WA, et al., Eur . J. Immunol . 22:447, 1992).
CD27에 대한 작동성 (agonistic) 단클론 항체는 최근에, T 세포 반응을 증진하는 것으로 밝혀졌고, 그리고 항-암 치료제로서 장래성을 보인다 (예로써, Sakanishi T, et al., Biochem Biophys . Res . Commun . 2010 Feb 18 및 WO 2008/051424를 참고한다). 하지만, 현재까지 획득된 결과가 CD27을 면역요법 (immuno요법)을 위한 유용한 표적으로서 확립하긴 하지만, 항-CD27 단클론 항체의 어떤 특정한 특징이 치료적 목적에 특히 유리한 지는 불명확하다. 따라서 항-CD27 항체를 치료 효과적이도록 만드는 특이적 기능적 성질, 그리고 질환을 치료하고 및/또는 예방하는데 더욱 효과적인, CD27에 대한 향상된 치료적 항체에 대한 진전된 통찰력이 당분야에서 요구된다.
본 발명에서는 특히, 유리하고 바람직한 치료적 효과와 연계될 수 있는 특정한 기능적 성질을 갖는 단리된 항-CD27 항체를 제시한다. 구체적으로, 백신 요법과의 복합에 특히 적합한, T 세포 매개된 면역 반응 (가령, 항원-특이적 T 세포 반응의 유도 또는 증강에 의해 증명됨)을 상향 조절할 수 있는 항-CD27 단클론 항체가 본 발명에 의해 산출되고 특성화되었다. 한 구체예에서, 작동약 항-CD27 항체는 활성 예방접종 (active vaccination)과의 복합에 의해, 또는 내인성 면역 반응을 증강시킴에 의해 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 이들 항체는 또한, 사이토킨 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도할 수도 있다. 부가적으로, 면역 질환, 예를 들면, 이식편 거부반응, 알레르기 및 자가면역 질환을 치료하는데 특히 적합한, T 세포 매개된 면역 반응을 하향-조절하는 항-CD27 항체가 산출되고 특성화되었다. 더 나아가, 세포 증식을 수반하는 매우 다양한 질환 (가령, 암)을 치료하는데 특히 효과적인, 직접적인 세포 사멸 기전 (가령, 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포 세포독성 (CDCC))에 의해 CD27 발현 세포의 성장을 저해하는 항-CD27 항체가 산출되고 특성화되었다.
한 구체예에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 하기 성질 중에서 하나 또는 그 이상을 나타낸다:
(a) 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 CD27에 대한 sCD70의 결합을 적어도 약 70% 차단하고;
(b) 10-9 M 또는 그 이하의 평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant) Kd, 또는 대안으로, 10+9 M-1 또는 그 이상의 평형 연합 상수 (equilibrium association constant) Ka로 인간 CD27에 결합하고; 또는
(c) 3 ㎍/㎖의 항체 농도에서 적어도 10%의 CD27 발현 세포의 특정한 보체 매개된 세포독성 (CDC) 및 대략 6% 토끼 혈청 보체를 유도하고;
(d) 3 ㎍/㎖의 항체 농도에서 적어도 10%의 CD27 발현 세포의 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 특정한 용해 및 75:1의 효과기: 표적 세포의 비율을 유도하고;
(e) 항체가 투여되지 않은 생쥐와 비교하여, 3주 동안 적어도 주 2회 0.3mg (i.p.)으로 투여될 때 생체내 종양 세포 접종 (5 x 105개 Raji 세포 또는 1 x 106개 Daudi 세포)후 중증 복합형 면역부전증 (SCID) 생쥐에서 중앙 생존 (median survival)을 적어도 20% 향상시키고;
(f) 백신 또는 내인성 항원과 공동으로 항원-특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키고;
(g) 백신 또는 내인성 항원과 공동으로 항원-특이적 TH1 면역 반응을 유도하거나 증강시키고;
(h) 백신 또는 내인성 항원과 공동으로 항원-특이적 T-세포 증식 또는 활성화를 유도하거나 증강시키고;
(i) T-세포 증식 또는 활성화를 감소시키거나 저해하고;
(j) 동시적, 단독적 또는 순차적 TCR 활성화와 합동될 때 T-세포 활성을 유도하거나 증강시키고;
(k) 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 CD27에 대한 sCD70의 결합을 적어도 약 70% 차단하고, 그리고 Fc 수용체에 결합할 수 없거나, 또는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 가질 때 T-세포 활성을 감소시키거나 저해하고;
(l) 투여 직후에 29일의 기간에 걸쳐 3 ㎎/㎏ (i.v.)으로 투여될 때 짧은꼬리원숭이에서 CD3+ T-세포 (NK 세포 이외)의 50% 이하의 고갈을 유발하고; 또는
(m) 투여 직후에 29일의 기간에 걸쳐 3 ㎎/㎏ (i.v.)으로 투여될 때 짧은꼬리원숭이에서 기억 B-세포의 50% 이하의 고갈을 유발한다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 이들 기능적 성질의 조합을 나타낸다.
따라서 한 측면에서, 본 발명에서는 면역 반응 (가령, T 세포 매개된 면역 반응)을 유도 및/또는 증강시키는 항-CD27 항체를 제시한다. 다른 구체예에서, 이들 항체는 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해한다. 이들 성질의 조합을 갖는 특정한 항체에는 각각, 서열 번호: 37 및/또는 43을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb 1F5가 포함된다. 대안으로, 이들 항체는 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하지 않는다. 이들 성질의 조합을 갖는 특정한 항체에는 각각, 서열 번호: 7 및/또는 13, 또는 각각, 7 및/또는 19를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb 3H8이 포함된다. 이런 항-CD27 항체는 또한, 상기 항체와 상이한 결합 특이성을 갖는 두 번째 분자 (가령, 이중특이적 분자로서), 예를 들면, T 세포 수용체 (가령, CD3, CD25, CD137, CD154_), 또는 Fc 수용체 (가령, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB1 (CD32), FcγRIIB2 (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), FcεRI, FcεRII (CD23), FcαRI (CD89), Fcα/(뮤이크로)R, 그리고 FcRn), 또는 NK 수용체 (가령, CD56), 또는 B 세포 수용체 (가령, CD19, CD20)에 연결될 수 있다.
본 발명에 따라 면역 반응의 유도 또는 증강에 이용되도록 의도되는 항체는 Fc 수용체에 대한 결합을 가능하게 하는 기능적 Fc 도메인을 가질 수 있고, 그리고 Fc 수용체에 대한 증가된 수준의 결합을 갖는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 CD70과 CD27 단백질을 발현하는 세포 상에서 CD70에 대한 CD27의 결합을 저해함으로써 T 세포 매개된 면역 반응을 하향-조절하는 항-CD27 항체를 제시한다. 특정한 구체예에서, 이들 항체는 CD27 발현 세포에 대한 가용성 CD70 (sCD70)의 결합을 적어도 약 70% 저해한다. 이러한 클래스에 속하는 특정한 항체에는 예로써, 서열 번호:37 및/또는 43 (mAb 1F5), 서열 번호: 49 및/또는 55 (mAb 1H8), 또는 서열 번호: 103 및/또는 109 (mAb 3H12)을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb가 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 효과기 세포 기능 (가령, ADCC 및/또는 CDC에 의한 세포 사멸)을 유도하거나 증강시키는 항-CD27 항체를 제시한다. 한 구체예에서, 이들 항체는 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 ADCC에 의한 CD27 발현 세포의 적어도 약 30% 특이적 용해를 유도하고 및/또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 30% CDC를 유도한다. ADCC 효과기 기능을 나타내는 이러한 클래스에 속하는 특정한 항체에는 예로써, 서열 번호: 61 및/또는 67 (mAb 1G5), 서열 번호: 85 및/또는 91, 85 및/또는 97 (mAb 3A10), 서열 번호:37 및/또는 43 (mAb 1F5), 서열 번호: 7 및/또는 13, 7 및/또는 19 (mAb 3H8), 서열 번호: 49 및/또는 55 (mAb 1H8), 또는 서열 번호: 103 및/또는 109 (mAb 3H12)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb가 포함된다. 다른 구체예에서, 이들 항체는 또한, 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해한다. 이들 기능의 조합을 갖는 특정한 항체에는 예로써, 서열 번호: 37 및/또는 43 (mAb 1F5), 서열 번호: 49 및/또는 55 (mAb 1H8), 서열 번호:103 및/또는 109 (mAb 3H12)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb가 포함된다. 대안으로, 이들 항체는 앞서 기술된 바와 같이 ADCC 및/또는 CDC를 유도하지만, 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하지 않는다. 이들 특징을 갖는 특정한 항체에는 예로써, 서열 번호: 61 및/또는 67 (mAb 1G5), 서열 번호: 85 및/또는 91, 85 및/또는 97 (mAb 3A10), 서열 번호:7 및/또는 13, 7 및/또는 19 (mAb 3H8)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb가 포함된다.
효과기 세포 기능 (가령, ADCC 및/또는 CDC)을 유도하거나 증강시킬 수 있는 항-CD27 항체는 또한, 특이적 Fc 수용체 (가령, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB1 (CD32), FcγRIIB2 (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), FcεRI, FcεRII (CD23), FcαRI (CD89), Fcα/(뮤이크로)R, 그리고 FcRn)에 대한 결합 특이성에 적절하게 기여하는 Fc 영역을 포함하도록 작제될 수 있다.
다른 구체예에서, 필요 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법이 제시되고, 상기 방법은 개체에 i) 항-CD27 항체 및 ii) 항원을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항-CD27 항체는 단독적으로, 그리고 항원이 투여되기 전에 투여된다.
전형적으로, 이런 방법에서, 항-CD27 항체는 항원보다 적어도 2시간 내지 96시간 전에 투여될 수 있다. 가령, 이런 방법에서, 항-CD27 항체는 항원보다 적어도 2시간 전에, 예를 들면, 항원보다 적어도 12시간 전에, 바람직하게는 항원보다 적어도 24시간 전에, 항원보다 적어도 48시간 전에, 또는 항원보다 적어도 72시간 전에 투여될 수 있다. 여기서 TLR 작동약은 TLR3 작동약이다.
다른 구체예에서, 필요 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법이 제시되고, 상기 방법은 개체에 i) 항-CD27 항체; ii) TLR 작동약; 그리고 iii) 임의적으로, 항원을 동시적으로, 단독적으로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다.
이런 방법의 바람직한 구체예에서, TLR 작동약은 폴리 IC:LC가 포함되지만 이에 국한되지 않는 TLR3 작동약이다.
CD27 발현 세포에는 B 세포, NK 세포 및 T 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, CD27을 발현하는 임의의 모든 세포가 포함된다. 특정한 구체예에서, CD27 발현 세포에는 암 세포주, 예를 들면, Jurkat 세포, Raji 세포, Ramos 세포 및 Daudi 세포가 포함된다. 다른 구체예에서, CD27 발현 세포는 종양 세포 또는 암 세포이다. 다른 구체예에서, CD27 발현 세포에는 B 세포, NK 세포, 그리고 종양 침윤성 림프구 (tumor infiltrating lymphocyte)로 불리는, 침윤성 종양에서 관찰되는 T 세포를 비롯한 T 세포가 포함된다.
본 발명의 특정한 항체는 특정한 인간 생식계열을 이용하는, 다시 말하면, 생식계열 유전자에 의해 인코딩되지만, 항체 성숙 동안 발생하는 유전자 재정렬과 돌연변이, 예를 들면, 체세포 돌연변이를 포함하는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 생식계열 3-7 또는 3-33 유전자로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 인간 생식계열 3-20, 3-11, 24, 1D-16, 또는 1-13 유전자로부터 유래된다. 특정한 구체예에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 생식계열 VH 3-7 또는 VH 3-33 유전자로부터 유래되고, 그리고 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 인간 생식계열 VK 3-20, VK 3-11, VK 1D-16, 또는 VK 1-13 유전자로부터 유래된다.
VH 3-33 생식계열 서열은 하기와 같이 제공된다 (Genbank 수탁 번호 AAP44382):
1 vqlvesgggv vqpgrslrls caasgftfst ygmhwvrqap gkglewvaii wfdgsntyya
61 dsvrgrftis rdssrktlyl emkslrvedt avyycak (서열 번호: 3)
VH 3-7 생식계열 서열은 하기와 같이 제공된다 (Genbank 수탁 번호 AAP44389):
1 vqlvesgggl vqpggslrls caasgftfsn symtwvrqap gkglewvani kpdgsdknyi
61 nsvrgrftis rdnaekssyl qmnslraedt aiyycvt (서열 번호:4)
다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 번호: 10, 28, 40, 52, 64, 76, 88, 106, 그리고 이들의 보존성 서열 변형 (가령, 보존성 아미노산 치환)으로 구성된 군에서 선택된다. 이들 항체는 서열 번호: 16, 22, 34, 46, 58, 70, 82, 94, 100, 112, 그리고 이들의 보존성 서열 변형으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역 CDR3 서열을 더욱 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 중쇄 CDR2와 CDR1 서열은 각각, 서열 번호: 9, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 105, 그리고 서열 번호: 8, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 104, 그리고 이들의 보존성 서열 변형에서 선택된다. 경쇄 CDR2와 CDR1 서열은 각각, 서열 번호: 15, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 99, 111, 그리고 서열 번호: 14, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 98, 110, 그리고 이들의 보존성 서열 변형에서 선택된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 CD27에 결합하고, 그리고 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 중쇄와 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 단리된 항체를 제시한다:
(i)
서열 번호: 38을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 39를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 40을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(ii)
서열 번호: 50을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 51을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 52를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 56을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 57을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 58을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(iii)
서열 번호: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 110을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 111을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 112를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(iv)
서열 번호: 86을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 92 또는 98을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 93 또는 99를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 94 또는 100을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(v)
서열 번호: 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(vi)
서열 번호: 74를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 75를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 76을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 81을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(vii)
서열 번호: 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 14 또는 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 15 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 16 또는 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형;
(viii)
서열 번호: 62를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 63을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 64를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 번호: 69를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 번호: 70을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
이들의 보존성 서열 변형.
다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 공통 서열: R (G,E,D) (S,L,G,-) (G,L,T,W,-) (N,A,T,H,-) (V,T,-) (M,P,-) (G,V,-) (R,-) (G,M,-) (D,H,L,T,W) (A,G,N,W) (D,F,V,Y) (F,L) (D,E) (H,I,L,Y) (서열 번호: 113)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 "-"는 상기 공통 위치에 존재하는 아미노산 잔기 없음의 옵션을 표시한다. 이들 항체는 공통 서열: Q (F,R,Y) (N,S) (N,T,S) (Y,W) P (F,L,P,R) T (서열 번호: 114)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3 서열을 더욱 포함하고, 여기서 "-" 는 상기 공통 위치에 존재하는 아미노산 잔기 없음의 옵션을 표시한다. 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 공통 서열: I (K,W) (Y,N,Q) D G S (E,N) (K,Q) (서열 번호: 115)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 "-"는 상기 공통 위치에 존재하는 아미노산 잔기 없음의 옵션을 표시한다, 그리고 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 공통 서열: (A,D) A S (서열 번호: 116)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 공통 서열: G F (T,S) (F,L) (S,N) (I,S,H) (Y,H) (서열 번호: 117)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 공통 서열: Q (D,G,S) (I,V) (D,S) (R,S) (A,W,Y) (서열 번호: 118)에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 항체는 인간 CD27에 결합하고, 그리고 서열 번호: 6, 7, 24, 25, 36, 37, 48, 49, 60, 61, 72, 73, 84, 85, 102, 103, 그리고 이들의 보존성 서열 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 항체는 서열 번호: 12, 13, 18, 19, 30, 31, 42, 43, 54, 55, 66, 67, 78, 79, 90, 91, 96, 97, 108, 109, 그리고 이들의 보존성 서열 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 항체는 인간 CD27에 결합하고, 그리고 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(a) 각각, 서열 번호: 37 및/또는 43, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(b) 각각, 서열 번호: 49 및/또는 55, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(c) 각각, 서열 번호: 103 및/또는 109, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(d) 각각, 서열 번호: 85 및/또는 91 및/또는 97, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(e) 각각, 서열 번호: 25 및/또는 31, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(f) 각각, 서열 번호: 73 및/또는 79, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
(g) 각각, 서열 번호: 7 및/또는 13 및/또는 19, 그리고 이들의 보존성 서열 변형; 그리고
(h) 각각, 서열 번호: 61 및/또는 67, 그리고 이들의 보존성 서열 변형;
상기 서열 중에서 어느 하나에 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 역시 본 발명에 포함된다. 앞서 인용된 값의 중간 범위, 예를 들면, 상기 서열 중에서 어느 하나에 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95% 또는 95-100% 서열 동일성을 갖는 중쇄와 경쇄 가변 영역 역시 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
CD27에 대한 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 단리된 항체 역시 본 발명에 포함된다. 특정한 구체예에서, 상기 항체는 CD27에 대한 결합에 대해, 각각 서열 번호: 37과 43, 서열 번호: 49와 55, 서열 번호: 103과 109, 서열 번호: 85와 91, 서열 번호: 85와 97, 서열 번호: 25와 31, 서열 번호: 73과 79, 서열 번호: 7과 13, 서열 번호: 7과 19, 서열 번호: 61과 67에서 설명된 아미노산 서열, 또는 이들에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 CD27에 대한 결합에 대해, 서열 번호: 37과 43 (1F5), 서열 번호: 49과 55 (1H8) 또는 서열 번호: 103과 109 (3H12)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 CD27에 대한 결합에 대해, 서열 번호: 25와 31 (2C2), 서열 번호: 7과 13 (3H8), 서열 번호: 7과 19 (3H8), 서열 번호: 61과 67 (1G5) 또는 서열 번호: 73과 79 (2G9)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 CD27에 대한 결합에 대해, 서열 번호: 85와 91 (3A10) 또는 서열 번호: 85와 97 (3A10)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다.
본 발명의 다른 항체는 본 명세서에서 기술된 항체에 의해 인식되는, CD27 상에서 에피토프에 결합한다. 다른 특정한 구체예에서, 상기 항체는 각각, 서열 번호: 37과 43, 서열 번호: 49와 55, 서열 번호: 103과 109, 서열 번호: 85와 91, 서열 번호: 85와 97, 서열 번호: 25와 31, 서열 번호: 73과 79, 서열 번호: 7과 13, 서열 번호: 7과 19, 서열 번호: 61과 67에서 설명된 아미노산 서열, 또는 이들에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는, CD27 상에서 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 37과 43 (1F5), 서열 번호: 49과 55 (1H8) 또는 서열 번호: 103과 109 (3H12)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는, CD27 상에서 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 25와 31 (2C2), 서열 번호: 7과 13 (3H8), 서열 번호: 7과 19 (3H8), 서열 번호: 61과 67 (1G5) 또는 서열 번호: 73과 79 (2G9)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는, CD27 상에서 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 85와 91 (3A10) 또는 서열 번호: 85와 97 (3A10)에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는, CD27 상에서 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체는 전장, 예를 들면, 하기 아이소타입 중에서 한 가지일 수 있다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, 그리고 IgE. 대안으로, 이들 항체는 항원-결합 부분 또는 단일 사슬 항체 (가령, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 2개 또는 그 이상의 단리된 CDR의 조합과 같은 단편일 수 있다. 이들 항체는 인간, 인간화된, 그리고 키메라 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 종류의 항체일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 종양 항원 (가령, 백신에서, 본 발명의 항-CD27 항체와 공동으로 이용됨)에는 종양 세포 상에 존재하고 (또는 종양 세포와 연관되고) 전형적으로, 정상 세포 상에 존재하지 않는 임의의 항원 또는 항원성 결정 인자, 또는 정상 (비-종양) 세포 상에서보다 더욱 많은 양으로 종양 세포 상에 존재하거나 종양 세포와 연관되는 항원 또는 항원성 결정 인자, 또는 정상 (비-종양) 세포 상에서 관찰되는 것과 상이한 형태로 종양 세포 상에 존재하는 항원 또는 항원성 결정 인자가 포함된다. 이런 항원에는 종양-특이적 막 항원을 비롯한 종양-특이적 항원, 종양-연관된 막 항원을 비롯한 종양-연관된 항원, 종양 상에서 태아 항원, 성장 인자 수용체, 성장 인자 리간드, 그리고 암과 연관된 임의의 다른 유형의 항원이 포함된다. 종양 항원은 예로써, 상피 암 항원 (가령, 유방, 위장, 폐), 전립선 특이적 암 항원 (PSA) 또는 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 방광 암 항원, 폐 (가령, 소세포 폐) 암 항원, 결장 암 항원, 난소 암 항원, 뇌 암 항원, 위 암 항원, 신장 세포 암종 항원, 췌장 암 항원, 간 암 항원, 식도 암 항원, 두경부 암 항원, 또는 결장직장 암 항원일 수 있다. 가령, 항원에는 종양 항원, 예를 들면, βhCG, gp100 또는 Pmel17, CEA, gp100, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), 유전자형, 티로시나아제, 텔로메라아제, SSX2, MUC-1, MAGE-A3, 그리고 고분자량-흑색종 연관된 항원 (HMW-MAA) MART1, 멜란-A, EGFRvIII, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, WT1, Her2, 또는 메소텔린이 포함될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 다른 항원 (가령, 백신에서, 본 발명의 항-CD27 항체와 공동으로 이용됨)에는 감염성 질환 병원체로부터 항원, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 균류가 포함되는데, 이들의 실례는 본 명세서에서 개시된다.
본 발명에서는 또한, 본 발명의 항체를 포함하고, 그리고 상기 항체와 상이한 결합 특이성을 갖는 두 번째 기능적 모이어티가 상기 항체에 연결되는 이중특이적 분자를 제시한다. 가령, 한 구체예에서, 두 번째 분자는 T 세포 수용체 (가령, CD3, CD40)에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 항체 또는 이중특이적 분자를 포함하고 제약학적으로 허용되는 담체로 조제된 조성물 역시 제시된다. 이들 조성물은 어쥬번트, 면역촉진제 (가령, CD40 리간드, FLT 3 리간드, 사이토킨, 집락-촉진 인자, 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-41BB 항체, 항-OX-40 항체, LPS (내독소), ssRNA, dsRNA, 바실리 칼메트-게랭 (BCG), 레바미솔 염산염, 정맥내 면역글로불린과 Toll-유사 수용체 (TLR) 작동약 (가령, TLR3 작동약, 예를 들면, 폴리 IC, TLR4 작동약, TLR5 작동약, TLR7 작동약, TLR8 작동약, 그리고 TLR 9 작동약)), 면역억제제, 다른 항체, 또는 항원을 더욱 포함할 수 있다. 예시적인 항원에는 병원체의 성분, 종양 항원 (가령, βhCG, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, WT1, 메소텔린, CEA, gp100, MART1, TRP-2, 멜란-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), 유전자형, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, 티로시나아제, 텔로메라아제, SSX2 항원, MUC-1 항원, 그리고 생식 세포 유래된 종양 항원), 감염성 질환 항원 (가령, 바이러스 항원, 박테리아와 기생충 항원), 알레르겐, 또는 자기항원이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 개시된 임의의 항원이 본 발명의 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라, 이런 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이런 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 역시 본 발명에 포함된다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명에서는 인간 CD27에 결합하는 단리된 단클론 항체를 제시하고, 상기 항체는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함한다: (a) 각각, 서열 번호: 5와 11; (b) 각각, 서열 번호: 5와 17; (c) 각각, 서열 번호: 23과 29; (d) 각각, 서열 번호: 35와 41; (e) 각각, 서열 번호: 47과 53; (f) 각각, 서열 번호: 59와 65; (g) 각각, 서열 번호: 71과 77; (h) 각각, 서열 번호: 83과 89, (i) 각각, 서열 번호: 83과 95; 그리고 (j) 각각, 서열 번호: 101과 107, 또는 (a)-(h)의 핵산 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 항원에 대한 면역 반응 (가령, T 세포-매개된 면역 반응, 및/또는 NK-매개된 반응 및/또는 B 세포-매개된 면역 반응)을 유도하거나 증강시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 항체 (가령, 전장 항체), 조성물 또는 이중특이적 분자의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 백신 요법에서 이용하는데 특히 적합하다.
본 발명의 항체 및 기타 조성물은 또한, CD27 발현 세포의 성장을 저해하는데 효과적인 양으로 항체 또는 조성물과 이들 세포를 접촉시킴으로써 CD27 발현 세포의 성장을 저해하는데 이용될 수 있다 (가령, 암의 치료에서). CD27 발현 세포의 성장을 저해하는데 유용한 항체에는 전장 항체와 이들의 단편, 그리고 Fc 수용체에 대한 두 번째 결합 특이성을 내포하는 항체가 포함된다. 한 구체예에서, CD27 발현 세포는 표적 세포의 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 유도하는데 충분한 조건 하에, 효과기 세포의 존재에서 항체와 접촉된다 (가령, 항체는 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% 특이적 용해를 유도하고, 그리고 서열 번호:61, 67, 85, 91, 97, 37, 및/또는 43을 포함한다). 다른 구체예에서, 이들 세포는 이들의 보체 매개된 세포독성 (CDC)을 유도하는데 충분한 조건 하에, 항체와 접촉된다 (가령, 항체는 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% 보체 매개된 세포독성 (CDC)을 유도하고, 그리고 서열 번호: 7, 13, 19, 49, 55, 103, 및/또는 109를 포함한다).
다른 구체예에서, CD27 발현 세포의 성장을 저해하는데 이용되는 항체는 또한, 추가적인 기능적 특징을 가질 수 있다 (또는 이들 특징이 결여될 수 있다). 가령, 상기 항체는 또한, 이들 단백질을 발현하는 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해할 수 있다 (가령, 서열 번호: 37 및/또는 43 (mAb 1F5), 서열 번호: 49 및/또는 55 (mAb 1H8), 또는 서열 번호: 103 및/또는 109 (mAb 3H12)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb). 대안으로, 상기 항체는 이런 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하지 않을 수도 있다 (가령, 서열 번호: 61 및/또는 67 (mAb 1G5), 서열 번호: 85 및/또는 91, 85 및/또는 97 (mAb 3A10), 또는 서열 번호:7 및/또는 13, 7 및/또는 19 (mAb 3H8)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 mAb).
CD27 발현 세포에는 NK 세포, B 세포 및 T 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, CD27을 발현하는 임의의 모든 세포가 포함된다. 특정한 구체예에서, CD27 발현 세포에는 Jurkat 세포, Raji 세포, Ramos 세포 및 Daudi 세포와 같은 세포주가 포함된다. 다른 구체예에서, CD27 발현 세포는 종양 세포 또는 암 세포이다. 다른 구체예에서, CD27 발현 세포에는 B 세포, NK 세포, 그리고 종양 침윤성 림프구 (tumor infiltrating 림프구)로 불리는, 침윤성 종양 또는 암 세포에서 관찰되는 T 세포를 비롯한 T 세포가 포함된다.
본 명세서에서 기술된, CD27 발현 세포의 성장을 저해하는 방법은 매우 다양한 질환과 장애를 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 이들 방법은 암 (가령, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수아세포 전골수세포 골수단구성 단구성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 (과립구) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종, 변연부 B세포 림프종, 진성적혈구증가증 림프종, 호지킨병, 비-호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 고형 종양, 육종, 그리고 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 골육종, 척삭종, 맥관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 육종, 결장직장 암종, 췌장 암, 유방 암, 난소 암, 전립선 암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부 암, 자궁 암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌교종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아종, 상인두 암종, 식도 암종, 기저 세포 암종, 담도 암, 방광 암, 골 암, 뇌와 중추신경계 (CNS) 암, 자궁경부 암, 융모막암종, 결장직장 암, 연결 조직 암, 소화기계의 암, 자궁내막 암, 식도 암, 눈 암, 두경부 암, 위 암, 상피 내암, 신장 암, 후두 암, 간 암, 폐 암 (소세포, 대세포), 흑색종, 신경아세포종; 구강 암(가령, 입술, 혀, 입과 인두), 난소 암, 췌장 암, 망막아종, 횡문근육종, 직장 암; 호흡기계의 암, 육종, 피부 암, 위 암, 고환 암, 갑상선 암, 자궁 암, 그리고 비뇨기계의 암으로 구성된 군에서 선택되는 암)을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 선호되는 암에는 만성 림프성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B세포 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 CD27-발현 종양이 포함된다. 다른 구체예에서, 이들 방법은 박테리아, 진균, 바이러스 또는 기생충 감염을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서는 질환을 앓는 개체 내에 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하는 방법을 더욱 제시하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 항체 또는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 또한 질환을 앓는 개체에서 T 세포 반응을 하향-조절하는 방법을 더욱 제시하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 항체 또는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 면역 질환, 예를 들면, 이식편 거부반응, 자가면역 질환, 그리고 알레르기의 치료에 이용하는데 이상적으로 적합하다. 이들 방법에 유용한 항체에는 Fab 단편, 그리고 Fc 수용체에 결합하지 않거나, 또는 Fc 수용체에 대한 유의미하게 감소된 결합을 갖도록 돌연변이된 Fc 영역이 포함된다. 특정한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 37 및/또는 43 (mAb 1F5), 서열 번호: 49 및/또는 55 (mAb 1H8), 또는 서열 번호: 103 및/또는 109 (mAb 3H12)를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하고, 그리고 T 세포 반응을 하향-조절하기 위한 본 명세서에서 기술된 방법은 이식편 거부반응, 알레르기 및 자가면역 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 매우 다양한 질환과 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 질환은 자가면역 질환 (다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 크론병과 기타 염증성 장 질환, 예를 들면, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증 (MG), 만성 임파구성 갑상선염, 굿파스튜어 증후군, 천포창, 그레이브스병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 항-콜라겐 항체로 인한 경피증, 혼성 연결 조직 질환, 다발성근염, 악성 빈혈, 특발성 에디슨병, 자가면역 연관된 불임증, 사구체신염, 반월상 사구체신염, 증식성 사구체신염, 수포성 유천포창, 쇼그렌 증후군, 건선성 관절염, 인슐린 내성, 자가면역성 당뇨병, 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS), 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 포도막망막염, 길렝 바레 증후군, 동맥경화증 및 알츠하이머병)이다.
본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 항체, 조성물 및 이중특이적 분자의 특정한 용도를 더욱 제시한다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 약제의 제조에서 항체, 조성물 또는 이중특이적 분자의 용도를 제시한다. 진전된 구체예에서, 본 발명에서는 CD27 발현 세포의 성장을 저해하기 위한 약제의 제조에서 항체 또는 조성물의 용도, 질환을 앓는 개체 내에 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하기 위한 약제의 제조에서 항체 또는 조성물의 용도, 그리고 질환을 앓는 개체에서 T 세포 반응을 하향-조절하기 위한 약제의 제조에서 항체 또는 조성물의 용도를 제시한다. 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는데 이용을 위한 항체, 조성물 또는 이중특이적 분자, CD27 발현 세포의 성장을 저해하는데 이용을 위한 항체 또는 조성물, 질환을 앓는 개체 내에 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합을 저해하는데 이용을 위한 항체 또는 조성물, 그리고 질환을 앓는 개체에서 T 세포 반응을 하향-조절하는데 이용을 위한 항체 또는 조성물을 더욱 포함한다.
본 발명에서는 또한, 생물학적 샘플에서 CD27의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 본 명세서에서 기술된 항체 (여기서 항체는 검출가능 물질로 표지된다)와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 그리고 (2) CD27에 결합된 항체를 검출하는 단계.
본 발명의 조성물 (가령, 항체 및/또는 이중특이적 분자) 및 임의적으로, 사용설명서를 포함하는 키트 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 적어도 한 가지 추가의 시제, 예를 들면, 사이토킨 또는 보체, 또는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 항체를 더욱 내포할 수 있다.
본 발명의 다른 특징과 이점은 하기 상세한 설명과 청구항으로부터 명백할 것이다.
도 1은 칩 상에 고정된 재조합 인간 CD27을 이용하여 비아코어(Biacore)™ 비아에발류에이션(BiaEvaluation) 소프트웨어 (비아코어 AB)에 의해 측정한 mAb 1G5, 1H8, 3H12, 3H8, 2G9, 1F5, 3A10, 2C2, ms 1A4, ms 9F4 및 ms M-T271에 대한 친화성 및 동역학 파라미터를 도시한다.
도 2는 ELISA를 이용한 재조합 정제된 인간 CD27에 대한 인간 항-CD27 항체 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 및 3H12)의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 3은 ELISA에 의한 정제된 재조합 인간 또는 원숭이 (짧은꼬리원숭이) CD27에 대한 1F5의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 4는 ELISA에 의한 CD27 단백질에 대한 가용성 CD70 (sCD70)의 결합에 대한 인간 항-CD27 항체 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 그리고 3H12) 및 MsIgG’s (1A4, 9F4, 그리고 M-T271)의 효과를 도시하는 그래프이다 (% 차단으로 나타냄).
도 5는 인간 림프아구성 세포주에 대한 1F5 결합, 그리고 sCD70 결합의 차단의 유세포 분석이다.
도 6a-d는 유세포분석법으로 평가한 Jurkat 세포 (도 4A), Raji 세포 (도 4B), Ramos 세포 (도 4C), 그리고 Daudi 세포 (도 4D)상의 CD27에 대한 인간 항-CD27 항체 (2C2, 3H8, 그리고 1F5)의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 7은 유세포분석법으로 평가한 Daudi 세포 상의 CD27에 대한 인간 항-CD27 항체 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 그리고 3H12)의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 8은 항-CD27 교차-차단 ELISA 실험의 결과를 나타내는 막대 그래프로, 항체 1F5, 1H8 및 3H12가 각각 서로를 교차-차단할 수 있고 따라서 동일한 에피토프에 결합함을 증명한다.
도 9는 항-CD27 교차-차단 ELISA 실험의 결과를 나타내는 막대 그래프로, 항체 2C2, 3H8, 1G5 및 2G9가 각각 서로를 교차-차단할 수 있고 따라서 동일한 에피토프에 결합함을 증명한다.
도 10은 항-CD27 교차-차단 ELISA 실험의 결과를 나타내는 막대 그래프로, CD27에 대한 항체 3A10의 결합이 검사된 임의의 다른 항-CD27 항체에 의해 완전하지 않게 교차-차단됨을 증명하고, 따라서 3A10이 고유한 에피토프에 결합함을 가리키지만, 3A10 결합은 항체 1F5, 1H8 및 3H12에 의해 부분적으로 교차-차단되고, 3A10에 대한 에피토프가 항체 1F5, 1H8 및 3H12에 의해 결합된 에피토프와 가까울 수 있음을 가리킨다.
도 11은 mAb 1F5, 2C2, 3H8, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 및 3H12를 이용한 보체 의존성 세포 세포독성 (CDCC) 분석평가의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 12는 mAb 1F5를 이용하는 추가의 보체 의존성 세포 세포독성 (CDCC) 분석평가의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 13은 mAb 2C2, 1F5, 3H8, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10, 3H12, 리툭산(Rituxan) 및 HuIgG을 이용하는 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 분석평가의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 14는 mAb 1F5를 이용하는 추가의 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 15는 인간 항-CD27 항체의 VH 서열의 배열이다(1F5(서열 번호: 36), 1G5(서열 번호: 60), 1H8(서열 번호: 48), 2C2(서열 번호: 24), 2G9(서열 번호: 72), 3A10(서열 번호: 84), 3H12(서열 번호: 102) 및 3H8(서열 번호: 6)).
도 16은 인간 항-CD27 항체의 VL 서열의 배열이다(1F5(서열 번호: 42), 1G5(서열 번호: 66), 1H8(서열 번호: 54), 2C2(서열 번호: 78), 2G9(서열 번호: 30), 3A10(서열 번호: 120), 3H12(서열 번호: 108) 및 3H8(서열 번호: 12)).
도 17 및 18은 mAb 1F5를 이용하는 생체내 비-인간 영장류 연구로부터의 결과를 나타낸다. 특히, 도 17은 단일 투여 후 순환 림프구에 대한 1F5를 나타낸다. 도 18은 1F5이 순환 림프구를 유의미하게 고갈시키지 않음을 나타낸다.
도 19는 생쥐 말초혈 세포 및 비장 세포에 대한 펜타머 염색 분석평가의 결과를 도시한다.
도 20은 항-CD27 항체를 이용한 ELISPOT 분석평가의 결과 및 증강된 IFNγ 생산을 도시한다.
도 21은 펜타머 염색 및 IFN ELISPOT에 의한 유전자도입 생쥐 모델에서 백신 항원에 대한 T 세포 반응의 항-CD27 mAb에 의한 증강을 나타낸다.
도 22A-C는 항-CD27이 APC-표적화된 백신 (α-DEC205-OVA)에 대한 T 세포 반응을 증강시킴을 나타내는 실험에 관한 프로토콜 및 그의 결과이다. 도 22A는 실험에 관한 프로토콜을 나타낸다. 도 22B는 항원-특이적 T 세포를 측정하기 위한 사량체 염색 실험의 결과를 나타낸다. 도 22C는 항원-특이적 T 세포를 측정하기 위한 IFN-감마 ELISPOT 분석평가의 결과를 나타낸다.
도 23A-D은 TLR3 작동약 폴리IC (25 ㎍, 50 ㎍ 또는 100 ㎍에서)와 조합된 항-CD27이 APC-표적화된 백신 (α-DEC205-OVA)에 대한 T 세포 반응을 증강시킴을 나타내는 실험의 결과이다. 도 23A은 폴리 IC 및 항-CD27 mAb 1F5로 처리된 야생형(wild-type) 생쥐, 폴리 IC 및 대조 인간 IgG1 항체로 처리된 huCD27-유전자도입 생쥐 또는 폴리 IC 및 항-CD27 mAb 1F5로 처리된 huCD27-유전자도입 생쥐에 대한 CD8+ T 세포 사이의 IFN-감마 양성 세포의 %를 나타내는 그래프이다.
도 24 및 25는 T:LR 작동약의 존재 또는 부재에서 백신 전에 항-CD27 mAb를 투여한 연구로부터의 결과를 나타내며 백신에 비교한 항체의 투여의 타이밍의 중요성을 나타낸다.
도 26 및 27는 증식 및 사이토킨 생산 둘 다로 나타낸, 인간 CD27 유전자도입 생쥐로부터의 TCR 활성화 T-세포와 조합된 항-CD27 mAb를 투여한 결과를 나타낸다.
도 28A-D는 MO4 (B16-OVA) 흑색종 시험감염(challenge) 모델에서 항-CD27이 α-DEC205-OVA 백신의 효능을 증강시킴을 나타내는 실험의 프로토콜 및 그의 결과이다. 도 24A는 실험에 대한 프로토콜을 나타낸다. 도 24B는 처리안된 생쥐에서 종양 접종 후 일의 수에 대한 종양 크기 (mm2로 나타냄)를 도시하는 그래프이다. 도 24C는 백신 단독으로 처리된 생쥐에서 종양 접종 후 일의 수에 대한 종양 크기 (mm2로 나타냄)를 도시하는 그래프이다. 도 24D는 항-CD27 항체와 조합된 백신으로 처리된 생쥐에서 종양 접종 후 일의 수에 대한 종양 크기 (mm2로 나타냄)를 도시하는 그래프이다.
도 29A 및 B는 동계 림프종의 시험감염 및 다양한 투여량의 항-CD27 mAb 1F5의 투여 후에 인간 CD27-유전자도입 생쥐 (종양 모델)의 연장된 생존을 나타내는 그래프이다.
도 30 내지 32는 SCID 생쥐의 Raji 이종이식 모델에서 항-CD27 처리의 효과를 시험하는 실험의 결과를 나타낸다.
도 30A는 처리안되거나, 대조 인간 IgG1 항체로 처리되거나 또는 항-CD27 1F5 및 3H8 항체로 처리된 생쥐에서 종양 접종 후 일의 수에 대한 종양 크기 (mm3로 나타냄)를 도시한다. 화살표는 항체 처리가 i.p. 주사에 의해 제공된 일을 가리킨다.
도 30B는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 선도에서 생존을 나타낸다.
도 31A는 처리안되거나, 대조 인간 IgG1 항체로 처리되거나 또는 항-CD27 1F5 항체로 처리된 생쥐에서 종양 접종 후 일의 수에 대한 종양 크기 (mm3로 나타냄)를 도시한다. 화살표는 항체 처리가 i.p. 주사에 의해 제공된 일을 가리킨다. 도 31B은 카플란-마이어 선도에서 생존을 나타낸다.
도 32는 카플란-마이어 선도에서 SCID 생쥐의 Raji 이종이식 모델에서 항-CD27 처리의 효과를 시험하는 추가적인 실험의 결과를 나타낸다.
도 33은 SCID 생쥐의 Daudi 이종이식 모델에서 항-CD27 처리의 효과를 시험하는 실험의 결과를 나타낸다. 도 33A는 대조 인간 IgG1 항체로 처리되거나 항-CD27 1F5 항체로 처리된 (0.1 mg 또는 0.3 mg) 생쥐에서 종양 접종 후 일에 대한 종양 크기 (mm3로 나타냄)를 도시한다. 화살표는 항체 처리가 i.p. 주사에 의해 제공된 일을 가리킨다. 도 33B는 카플란-마이어 선도에서 생존을 나타낸다.
도 34는 ELISPOT 분석평가의 결과를 나타내며, IgG의 Fc 부분이 Fc 수용체를 끌어올 수 없는 경우, 항-CD27 항체를 이용하여 증강된 항원-특이적 IFNg 생산이 차폐됨을 나타낸다.
본 발명은 면역 기능의 상향조절 (가령, 백신 요법에서의 T 세포 매개된 면역 반응, 암 요법에서의 NK 활성화), 세포 성장의 저해 (가령, 암 요법에서) 및 T 세포 매개된 면역 반응의 하향-조절 (가령, 자가면역 요법에서)을 비롯한, 유의미한 치료적 이익과 연관성을 가지는 특정한 기능적 성질을 나타내는 항-CD27 항체를 제공한다. 이들 기능적 특징들은, 예를 들면: (1) CD27 발현 세포에 대한 가용성 CD70의 결합을 적어도 약 70%, 추가로 예를 들면 적어도 80% 또는 적어도 90%로 저해(가령, 완전히 또는 부분적으로 차단)하고 (2) 인간 CD27에 대해 1 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고, (3) 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% 보체 매개된 세포독성 (CDC)을 유도하고, (4) 10 ㎍/㎖의 농도에서 ADCC에 의한 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% 특이적 용해를 유도하고, (추가로 예를 들면 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70% 특이적 용해하고)(5) 면역 반응, 특히 TH1 반응을 유도 또는 증강하고 및/또는 (6) T-세포 활성, 특히 특이적 CD8+ T-세포 수 및/또는 활성을 유도 또는 증강하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 특정한 중쇄와 경쇄 가변 영역 및/또는 CDR 서열을 포함한다.
본 발명이 더욱 쉽게 이해될 수 있기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가적인 정의들이 상세한 발명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "CD27" (또한 "CD27 분자", "CD27L 수용체", "S1521", "T 세포 활성화 항원 CD27", "TNFRSF7," "MGC20393," "종양 괴사 인자 수용체 상과, 구성원 7", "T 세포 활성화 항원 S152", "Tp55", "종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 7", "CD27 항원", 그리고 "T-세포 활성화 항원 CD27"으로 지칭됨)은 리간드 CD70에 결합하는 TNF-수용체 상과의 구성원인 수용체를 지칭한다. CD27은 T 세포 면역의 생성 및 장기간 유지를 위해 필요하고 B-세포 활성화 및 면역글로불린 합성의 조절에서 핵심적인 역할을 한다. 용어 "CD27"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 CD27의 임의의 변이체 또는 아형(isoform)을 포함한다 (가령, GENBANK®에 기탁된 수탁 번호 AAH12160.1을 가지는 인간 CD27). 따라서, 본 발명의 항체는 인간이 아닌 종의 CD27와 교차-반응할 수 있다. 대안으로, 항체는 인간 CD27에 특이적일 수 있고 다른 종과 어떠한 교차-반응도 나타내지 않을 수 있다. CD27 또는 임의의 변이체 및 그의 아형은, 이들을 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 단리되거나 또는 당해 분야에 공지인 기술 및/또는 본 명세서에서 기술된 것들을 이용하여 재조합으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 항체는 정상 글리코실화 패턴을 가지는 hCD27에 대해 표적화된다.
Genbank® (수탁 번호 AAH12160.1)는 인간 CD27의 아미노산 서열을 하기와 같이 보고한다 (서열 번호:1):
1 marphpwwlc vlgtlvglsa tpapkscper hywaqgklcc qmcepgtflv kdcdqhrkaa
61 qcdpcipgvs fspdhhtrph cescrhcnsg llvrnctita naecacrngw qcrdkectec
121 dplpnpslta rssqalsphp qpthlpyvse mleartaghm qtladfrqlp artlsthwpp
181 qrslcssdfi rilvifsgmf lvftlagalf lhqrrkyrsn kgespvepae pcryscpree
241 egstipiqed yrkpepacsp
용어 "CD70" (또한 "CD70 분자", "CD27L", "CD27LG", "TNFSF7," "종양 괴사 인자 (리간드) 상과 구성원 7," "CD27 리간드," "CD70 항원," "표면 항원 CD70," "종양 괴사 인자 리간드 상과, 구성원 7," "Ki-24 항원," 및 "CD27-L"으로 지칭됨)은 CD27에 대한 리간드를 지칭한다 (예를 들면, Bowman MR et al., J. Immunol. 1994 Feb 15;152(4):1756-61을 참조). CD70은 종양 괴사 인자 (TNF) 리간드 패밀리에 속하는 제II형 막통과 단백질이다. 이것은 활성화된 T 및 B 림프구상의 표면 항원으로 동시-자극된 T 세포의 증식을 유도하고, 세포용해성 T 세포의 생성을 증강시키고, 그리고 T 세포 활성화에 기여한다. CD70이 또한 B-세포 활성화, 자연 킬러 세포의 세포독성 기능, 그리고 면역글로불린 합성의 조절에서 역할을 수행함이 또한 제안되었다 (Hintzen RQ et al., J. Immunol. 1994 Feb 15;152(4):1762-73).
Genbank® (수탁번호 NP_001243 )는 인간 CD70의 아미노산 서열을 하기와 같이 보고한다 (서열 번호: 2):
1 mpeegsgcsv rrrpygcvlr aalvplvagl viclvvciqr faqaqqqlpl eslgwdvael
61 qlnhtgpqqd prlywqggpa lgrsflhgpe ldkgqlrihr dgiymvhiqv tlaicsstta
121 srhhpttlav gicspasrsi sllrlsfhqg ctiasqrltp largdtlctn ltgtllpsrn
181 tdetffgvqw vrp
본 명세서에 언급된 용어 "항체"는 전(whole) 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 이의 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 한 바람직한 구체예에서, 이황화 결합으로 서로-연결된 적어도 두 개의 중 (H) 쇄 및 두 개의 경 (L) 쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 축약) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 축약) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 더 보존된, 프레임워크(framework) 영역 (FR)으로 명명된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 고도가변성의 영역으로 더욱 분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 다음의 순서로 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (가령, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대해 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 단순히 "항체 부분")은, 본 명세서에서, 특이적으로 항원 (가령, 인간 CD27)에 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 또는 그 이상 단편을 가리킨다. 그러한 "단편"은 예를 들면 약 8 내지 약 1500개 길이의 아미노산, 적절하게는 약 8 내지 약 745개 길이의 아미노산, 적절하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들면 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10 내지 약 50개 또는 100개 길이의 아미노산이다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 나타났다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교로 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al ., (1989) Nature 341:544-546); 그리고 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 연결기에 의해 임의적으로 연결될 수 있는 두 개 또는 그 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱이, 비록 Fv 단편의 두 개의 도메인인 VL 및 VH 가 단독적 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄로 만들수 있게 하는 재조합 방법을 이용하여, 합성 연결기에 의해 연결될 수 있고 여기서 VL 및 VH 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지임; 예컨대, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; 그리고 Huston et al . (1988) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883를 참조). 그러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 내포되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당해 분야의 숙련가에 공지인 종래 기술을 이용하여 얻어지며, 단편은 동일 방식으로 온전한 항체인 것과 같이 유용성에 대해 선별된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이기능적 항체"는 두 가지 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 두 개의 상이한 결합 부위를 가지는 인공적 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, Songsivilai & Lachmann, Clin . Exp . Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol . 148, 1547-1553 (1992)을 참조하라.
본 명세서의 용어 "단클론 항체"는 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체를 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 단클론 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 임의적인 불변 영역을 가지는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 인간 단클론 항체는 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 생쥐로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조되며, 불멸화된(immortalized) 세포에 융합된 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진다.
본 명세서의 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 가령 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그렇게 제조된 하이브리도마에 대해 유전자도입 또는 염색체전이인 동물 (가령, 생쥐)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 형질주입종(transfectoma)으로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 그리고 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 방법으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 그러한 재조합 인간 항체는 생식계열 유전자에 의해 인코딩되고 특정한 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 이용하지만, 예를 들면, 항체 성숙 도중 발생하는 사후 재배열 및 돌연변이를 포함하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 당해 분야에 공지인 바와 같이 (예컨대, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125를 참조), 가변 영역은 다양한 유전자에 의해 인코딩되고 재배열되어 외부 항원에 대해 특이적 항체를 형성하는 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열 외에도, 가변 영역은 복수의 단일 아미노산 변화 (체세포 돌연변이 또는 과돌연변이로 지칭됨)에 의해 추가로 개질되어 외부 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 불변 영역은 항원에 대해 추가로 반응하여 변화할 것이다 (즉, 아이소타입 전환). 그러므로, 항원에 대한 반응에서 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 인코딩하는 재배열되고 체세포적으로 돌연변이된 핵산 분자는 원래의 핵산 분자와 서열 동일성을 갖지 않을 수 있지만, 그 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다 (즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 가변 및 불변 영역을 (만일 있다면) 가지는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기 (가령, 시험관 내 또는 체세포 돌연변이에 의해 생체내에서 랜덤 또는 위치-특이적 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다(Lonberg, N. et al . (1994) Nature 368(6474): 856-859); Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. Vol. 13: 65-93, 그리고 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci 764:536-546)를 참조하라. 그러나, 용어 "인간 항체"는 생쥐와 같은 또다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이, 인간 프레임워크 서열상에 이식된 항체 (즉, 인간화된 항체)를 포함하지 않는다.
본 명세서에서, "이종성(heterologous) 항체"는 그러한 항체를 생산하는 유전자도입 비-인간 생물체와 관련하여 정의된다. 상기 용어는 유전자도입 비-인간 동물을 구성하지 않는 생물체에서, 일반적으로는 유전자도입 비-인간 동물의 종이 아닌 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열을 가지거나 핵산 서열을 인코딩하는 항체를 지칭한다.
본 명세서의 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체 (가령, 특이적으로 인간 CD27에 결합하고 인간 CD27가 아닌 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 단리된 항체)가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 그러나, 상이한 종으로부터의 다른 CD27 단백질에 대해 교차-반응을 가질 수 있다. 그러나, 항체는 바람직하게는 항상 인간 CD27에 결합한다. 게다가, 단리된 항체는 전형적으로, 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다. 본 발명의 한 구체예에서, 상이한 CD27 특이성을 가지는 "단리된" 항체의 조합은 잘 규명된 조성물로 조합된다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정 인자"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 위치를 지칭한다. 에피토프는 단백질의 삼차 접힘에 의해 나란해진 근접한 아미노산 또는 근접하지 않은 아미노산 둘다로부터 형성될 수 있다. 근접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매에 노출 시 유지되는 반면, 삼차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로, 고유한 공간적 입체구조 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산을 포함한다. 어떤 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 측정하기 위한 방법 (즉, 에피토프 맵핑(mapping))은 당해 분야에 공지이며 예를 들면, 면역블로팅 및 면역침강 분석평가를 포함하고, 여기서 CD27에 중첩되거나 근접한 펩티드가 주어진 항-CD27 항체와의 반응에 대해 검사된다. 에피토프의 공간적 입체구조를 측정하는 방법은 당해 분야의 기술 및 본 명세서에서 기술된 것들을 포함하며, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다 (예컨대, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology , Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)를 참조).
또한, 본 발명에 내포된 것은 본 명세서에서 기술된 특정한 항체에 의해 인식되는 모든 또는 일부의 에피토프 (가령, 동일하거나 중첩되는 영역 또는 사이 영역 또는 상기 영역의 신장)을 포함하는 CD27 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.
또한, 본 발명에 내포된 것은 본 명세서에서 기술된 항체와 인간 CD27에 결합하기 위해 경쟁하는 동일한 에피토프 및/또는 항체에 결합하는 항체이다. 동일한 에피토프를 인식하거나 결합을 위해 경쟁하는 항체는 일상의 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 그러한 기술은 예를 들면, 표적 항원에 대한 또다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 면역분석평가, 즉, 경쟁적 결합 분석평가를 포함한다. 경쟁적 결합은 분석평가에서 측정되며 여기서 검사 하의 면역글로불린은 공통된 항원, 가령 CD27에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석평가가 공지이며, 예를 들면: 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석평가 (radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석평가 (enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치(sandwich) 경쟁 분석평가 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)를 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)를 참조); 고체상 직접 표지된 분석평가, 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석평가 (Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)를 참조); I-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA (Morel et al., Mol . Immunol. 25(1):7 (1988)를 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 그리고 직접 표지된 RIA이다. (Moldenhauer et al., Scand . J. Immunol. 32:77 (1990)). 전형적으로, 그러한 분석평가는 고체 표면 또는 이들, 표지되지 않은 검사 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 포함하는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 저해는 검사 면역글로불린의 존재에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정하여 측정된다. 대개의 경우 검사 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 대개의 경우, 경쟁하는 항체가 과량으로 존재할 때, 공통의 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% 또는 그 이상으로 저해할 것이다.
다른 기술은 예를 들면, 에피토프 맵핑 방법, 가령, 항원:항체 복합체의 결정의 x-선 분석을 포함하며 이것은 에피토프의 원자적 분해를 제공한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변형체에 대한 항체의 결합을 관찰하며 여기서 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형에 기인한 결합의 손실은 대개 에피토프 성분을 지시하는 것으로 간주된다. 게다가, 에피토프 맵핑을 위해 컴퓨터를 사용한 조합 방법이 또한 사용될 수 있다. 이들 방법은 특이적인 짧은 펩티드를 조합 파지 전시 펩티드 라이브러리로부터 친화성 단리하는 관심의 항체의 능력에 의존한다. 펩티드는 이후 펩티드 라이브러리를 선별하기 위해 사용되는 항체에 상응하는 에피토프의 규명을 위한 리드(lead)로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해, 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되었고, 이는 입체구조 불연속적인 에피토프를 맵핑하는 것으로 나타났다.
본 명세서에서, 용어 "특이적 결합," "선택적 결합," "선택적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하는"은 소정의 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 재조합 인간 CD27를 분석대상으로 그리고 항체를 리간드로서 이용하는 BIACORE 2000 장비에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술로 측정할 때 대략 10-7 M 미만, 가령 대략 10 -8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 더 낮은 평형 해리 상수 (KD)로 결합하며 소정의 항원 또는 밀접하게-연관된 항원 이외의 비-특이적 항원 (가령, BSA, 카세인)에 대한 결합하는 이의 친화성보다 두-배 더 큰 친화성으로 소정의 항원에 결합한다. 문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서의 용어 "KD"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 전형적으로, 본 발명의 인간 항체는 재조합 인간 CD27을 분석대상으로 그리고 항체를 리간드로서 사용하는 BIACORE 2000 장비에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술로 측정할 때 대략 10 -8 M 또는 그 이하, 가령 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 더 낮은 해리 평형 상수 (KD)로 CD27에 결합한다.
본 명세서의 용어 "kd"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수(off rate constant)를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서의 용어 "ka"는 항원과 항체의 결합에 대한 온 속도 상수(on rate constant)를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서의 용어 "EC50"은 시험관 내 또는 생체내에서 분석평가에서 최대 반응의 50%, 즉, 최대 반응 및 기준선 사이의 중간지점인 반응을 일으키는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.
본 명세서에서, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 클래스(가령, IgM 또는 IgGl)를 지칭한다. 한 구체예에서, 본 발명의 인간 단클론 항체는 IgG1 아이소타입이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 인간 단클론 항체는 IgG2 아이소타입이다.
용어 "고정된 CD27에 결합하는"은 예를 들면, 세포의 표면에 발현되거나 고체 지지체에 부착된 CD27에 결합하는 본 발명의 인간 항체의 능력을 지칭한다.
본 명세서의 용어 "교차-반응하는"은 상이한 종으로부터의 CD27에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다. 가령, 인간 CD27에 결합하는 본 발명의 항체는 또한 또다른 종의 CD27에 결합할 수 있다. 본 명세서에서, 교차-반응은 결합 분석평가 (가령, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응, 또는 생리학적으로 CD27를 발현하는 세포에 대한 결합 또는 다르게는 이것과의 기능적 상호작용을 검출하여 측정된다. 교차-반응을 측정하기 위한 방법은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 표준 결합 분석평가, 예를 들면, 비아코어(Biacore)TM 2000 SPR 장비 (비아코어 AB, Uppsala, Sweden)를 이용하는 비아코어(Biacore)TM 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석, 또는 유세포 기술에 의한 것을 포함한다.
본 명세서에서, "아이소타입 전환"은 항체의 클래스, 또는 아이소타입이 한 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스의 것으로 변화하는 현상을 지칭한다.
본 명세서에서, "비전환된 아이소타입"은 아이소타입 전환이 일어나지 않았을 때 제조된 중쇄의 아이소타입의 클래스를 지칭하고; 비전환된 아이소타입을 인코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 하위에 있는 첫 번째 CH 유전자이다. 아이소타입 전환은 고전적 또는 비-고전적 아이소타입 전환으로 분류되어 있다. 고전적 아이소타입 전환은 전이유전자 내에 적어도 하나의 전환 서열 영역을 포함시키는 재조합 과정에 의해 발생한다. 비-고전적 아이소타입 전환은 예를 들면, 인간 σμ 및 인간 Σμ 사이의 상동성 재조합(δ-연관 결실)에 의해 발생할 수 있다. 대안적인 비-고전적 전환 메커니즘, 가령 그 중에서도 전이유전자간 및/또는 염색체간 재조합은 아이소타입 전환을 발생시키고 유발할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "전환 서열"은 전환 재조합에 관여하는 이들 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, (뮤이크로) 전환 영역인 "전환 공여자" 서열은 전환 재조합 도중 결실되게 될 구조 영역의 5' (즉, 상위)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실될 구조 영역과 대체 불변 영역 (가령, γ, ε, 등)사이일 것이다. 재조합이 항상 발생하는 특이적인 부위는 없기 때문에, 최종 유전자 서열은 전형적으로, 구조로부터 예측가능하지 않을 것이다.
본 명세서에서, "글리코실화 패턴"은 단백질에, 더욱 특이적으로는 면역글로불린 단백질에 공유적으로 부착하는 탄수화물 단위체의 패턴으로 정의된다. 당해 분야의 숙련가가 이종성 항체의 글리코실화 패턴을 전이유전자의 CH 유전자가 유래된 종보다도 비인간 유전자도입 동물의 종에서 글리코실화의 상기 패턴에 더 유사하다고 인식할 경우, 이종성 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 유전자도입된 동물의 종에 의해 제조된 항체 상에 자연적으로 발생하는 글리코실화 패턴과 실질적으로 동일한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 대상에 적용되어 사용된 용어 "자연적으로-발생하는"은 대상을 자연에서 찾을 수 있는 사실을 지칭한다. 가령, 생물체 (바이러스 포함)에 존재하며 천연 원천으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로-발생하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "재배열된"은 V 조각이 각각 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 인코딩하는 입체구조의 D-J 또는 J 조각에 바로 근접하게 위치한 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 자리(locus)의 배열을 지칭한다. 재배열된 면역글로불린 유전자 자리는 생식계열 DNA와 비교하여 확인될 수 있고; 재배열된 자리는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/노나머 상동 요소를 가질 것이다.
본 명세서에 V 조각과 관련하여 사용된 용어 "재배열안된" 또는 "생식계열 배열"은 V 조각이 D 또는 J 조각에 바로 근접하도록 재조합되지 않은 배열을 지칭한다.
본 명세서의 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
본 명세서에 CD27에 결합하는 항체 또는 항체 부분 (가령, VH, VL, CDR3)을 인코딩하는 핵산과 관련하여 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 항체 또는 항체 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CD27 외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지지 않는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도되며, 상기 다른 서열은 자연적으로 인간 유전체 DNA의 핵산의 측면에 존재할 수 있다. 가령, 서열 번호: 35 및 41, 47 및 53, 101 및 107, 83 및 89, 83 및 95, 23 및 29, 71 및 77는 항-CD27 항체 단클론 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 각각 해당된다.
본 발명은 또한 서열 번호: 5-112에 제시된 서열의 "보존성 서열 변형", 즉, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체의, 항원에 대한 결합을 차폐하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 그러한 보존성 서열 변형은 보존성 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 그뿐 아니라, 뉴클레오티드 및 아미노산 첨가 및 결실을 포함한다. 가령, 변형은 당해 분야에 공지인 표준 기술, 가령 위치-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 서열 번호: 5-112 내로 도입될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-CD27 항체 내 예상되는 비필수 아미노산 잔기가 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존성 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(예컨대, Brummell et al., Biochem . 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 그리고 Burks et al. Proc . Natl. Acad . Sci . USA 94:412-417 (1997)을 참조)
대안으로, 다른 구체예에서, 돌연변이는 가령 포화 돌연변이유발에 의해 항-CD27 항체 코딩 서열의 전부 또는 부분을 따라 랜덤하게 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-CD27 항체는 결합 활성을 위해 선별될 수 있다.
핵산에 대하여, 용어 "실질적 상동성"은 두 개의 핵산, 또는 이의 지정된 서열이, 최적으로 나란히 배열되고 비교했을 때, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가지고 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 대개의 경우 적어도 약 90% 내지 95%, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 가리킨다. 대안으로, 실질적 상동성은 조각이 선택적 혼성 조건 하에, 가닥의 보체와 혼성할 경우 존재한다.
두 개의 서열 간의 백분율 동일성은 간격(gap)의 수, 그리고 각 간격의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100), 이는 두 서열의 최적 배열을 위해 도입되어야 한다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 백분율 동일성의 측정은 하기 비-제한적 실시예에 기술되는 것과 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 성취될 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램을 사용하고, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이를 이용하여 측정될 수 있다. 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성은 또한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리즘을 사용하고, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티(penalty) 및 4의 간격 페널티를 이용하여 측정될 수 있다. 추가로, 두 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 포함된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol . (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하고, 블라섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예를 들면, 연관 서열을 확인하기 위한 "쿼리(query) 서열"로서 사용될 수 있다. 그러한 검색은 Altschul, et al . (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 대한 뉴클레오티드 서열 상동성을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어(score) = 100, 단어길이(wordlength) = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 대한 아미노산 서열 상동성을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 간격을 갖는(gapped) 배열을 얻기 위해, Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 갭드(Gapped) BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용할 때는, 개별 프로그램 (가령, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라.
핵산은 전(whole) 세포로, 세포 용해물로, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터, 알칼리성/SDS 처리, CsCl 띠분리(banding), 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 공지인 기타 방법을 비롯한 표준 기술에 의해 정제되어 나오는 경우에, "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 만들어진"다. F. Ausubel, et al ., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)을 참고하라.
cDNA, 유전체 또는 이들의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은, 대개의 경우 자연 서열이지만 (변형된 제한 부위 등은 제외), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열에 대하여, 이들 돌연변이는, 원하는 경우 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 자연 V, D, J, 불변, 전환 및 본 명세서에서 기술된 기타 그러한 서열과 실질적으로 상동성이거나 이로부터 유래된 DNA 서열이 포함된다 (여기서 "유래된"은 서열이 또다른 서열과 동일하거나 이로부터 변형된 것을 가리킨다).
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 경우 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동가능하게 연결된은 연결된 DNA 서열이 근접하며, 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우, 근접하며 해독틀 내에 있음을 의미한다. 전환 서열에 대하여, 작동가능하게 연결된은 서열이 전환 재조합을 일으킬 수 있음을 가리킨다.
본 명세서의 용어 "벡터"는 이것에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가적인 DNA 조각이 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 벡터의 또다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 조각이 바이러스 유전체 내에 결찰될 수 있다. 특정한 벡터는 이들이 침입한 숙주 세포 (가령, 박테리아 복제 개시점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀(episomal) 포유류 벡터)에서 자가 복제가 가능하다. 다른 벡터 (가령, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포에 칩입시 숙주 세포의 유전체 내로 끼어들어갈 수 있고, 따라서 숙주 유전체와 함께 복제된다. 게다가, 특정한 벡터는 유전자 이들의 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 발현 벡터의 사용은 대개 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하는 그러한 다른 형태의 발현 벡터, 가령 바이러스 벡터 (가령, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서의 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 침입하는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 용어가 특정한 대상 세포는 물론이고 그러한 세포의 자손을 역시 지칭하는 것을 의도함이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 이후 세대에서 특정한 변형이 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은, 실제로는, 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위내에 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "항원"은 임의의 자연 또는 합성 면역원성 물질, 가령 단백질, 펩티드, 또는 합텐(hapten)을 지칭한다. 본 발명에서 (가령, 본 발명의 항-CD27 항체와 조합되는 백신에서) 사용되기에 적절한 항원은 예를 들면, 이에 대해 보호적 또는 치료적 면역 반응이 요망되는 감염성 질환 항원 및 종양 항원, 예컨대, 종양 세포 또는 병원성 생물체에 의해 발현되는 항원 또는 감염성 질환 항원을 포함한다. 가령, 적절한 항원은 암의 예방 또는 치료를 위해 종양-연관된 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원의 예는 βhCG, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, WT1, 메소텔린, CEA, gp100, MART1, TRP-2, 멜란-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), 유전자형, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, 티로시나아제, 텔로메라아제, SSX2 및 MUC-1 항원, 그리고 생식 세포 유래된 종양 항원의 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 종양 연관된 항원은 또한 혈액군 항원, 예를 들면, Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2 항원을 포함한다. 대안으로, 하나 초과 항원이 본 발명의 항원-항체 구조물 내에 포함될 수 있다. 가령, MAGE 항원이 GM-CSF 또는 IL-12과 같은 어쥬번트와 함께 멜라닌 A, 티로시나아제, 그리고 gp100와 같은 다른 항원과 조합될 수 있고, 그리고 항-APC 항체에 연결될 수 있다.
다른 적절한 항원은 바이러스 질환의 예방 또는 치료를 위해 바이러스 항원을 포함한다. 바이러스 항원의 예는 HIV-1 gag, HIV-1 env, HIV-1 nef, HBV (표면 또는 중심 항원), HPV, FAS, HSV-1, HSV-2, p17, ORF2 및 ORF3 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 박테리아 항원의 예는 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii) 또는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체-박테리아 항원 접합체는 다양한 박테리아 질환 가령 탄저병(Anthrax), 보툴리눅스 중독증(Botulism), 파상풍(Tetanus), 클라미디아(Chlamydia), 콜레라(Cholera), 디프테리아(Diphtheria), 라임(Lyme) 질환, 매독(Syphilis) 및 결핵(Tuberculosis)의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 감염성 질환 병원체, 가령 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균으로부터의 다른 적절한 항원이 하기에 개시된다.
전술한 항원의 서열은 당해 분야에 공지이다. 가령, MAGE-3 cDNA 서열의 예가 US 6,235,525 (루드비히(Ludwig) 암 연구 센터)에 제공되고; NY-ESO-1 핵산 및 단백질 서열의 예가 US 5,804,381 및 US 6,069,233 (루드비히 암 연구 센터)에 제공되고; 멜란-A 핵산 및 단백질 서열의 예가 US 5,620,886 및 US 5,854,203 (루드비히 암 연구 센터)에 제공되고; NY-BR-1 핵산 및 단백질 서열의 예가 US 6,774,226 및 US 6,911,529 (루드비히 암 연구 센터)에 제공되고 NY-CO-58 핵산 및 단백질 서열의 예가 WO 02090986 (루드비히 암 연구 센터)에 제공되고; HER-2/neu 단백질에 대한 아미노산 서열의 예가 GENBANK®수탁번호 AAA58637로 입수가능하고; 인간 암태아성 항원-유사 1 (CEA-1)에 대한 뉴클레오티드 서열 (mRNA)이 GENBANK®수탁번호 NM__020219로 입수가능하다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 HPV 항원은 예를 들면 HPV-16 항원, HPV- 18 항원, HPV-31 항원, HPV-33 항원 및/또는 HPV-35 항원을 포함할 수 있고; 적절하게는 HPV-16 항원 및/또는 HPV-18 항원이다. HPV-16의 유전체가 Virology, 145:181 - 185 (1985)에 기술되어 있고, HPV-18를 인코딩하는 DNA 서열이 US 특허 제5,840,306호에 기술되어 있으며, 이들 개시는 그 전체로서 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. HPV-16 항원 (가령, HPV-16의 El 및/또는 E2 단백질의 혈청반응성(seroreactive) 영역)이 US 특허 제6,531,127호에 기술되어 있고, HPV-18 항원 (가령, HPV-18의 Ll 및/또는 L2 단백질의 혈청반응성 영역)이 US 특허 제5,840,306호에 기술되어 있고, 이들 개시는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 유사하게, HBV에 대한 완전 유전체가 GENBANK® 수탁번호 NC_003977로 입수가능하며, 상기 개시는 본 명세서에 포함된다. HCV의 유전체는 유럽 특허 출원 제318 216호에 기술되어 있고, 상기 개시는 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 참고로서 포함되는 PCT/US90/01348는 HCV 유전체의 클론의 서열 정보, HCV 바이러스 단백질의 아미노산 서열 그리고 HCV 단백질 및 이로부터 유래한 펩티드를 포함하는 HCV 백신을 위해 그러한 조성물을 만들고 사용하는 방법을 개시한다.
단백질의 항원성 펩티드 (즉, T 세포 에피토프를 함유하는 것들)는 당해 분야에 공지인 다양한 방식으로 확인될 수 있다. 가령, T 세포 에피토프는 웹(web)-기초된 예측 알고리즘 (BIMAS & SYFPEITHI)을 사용하여 단백질의 서열을 분석하여 예측하고 CTL로 미리 정의된 10,000가지 잘 규명된 MHC 결합 펩티드의 내부 데이터베이스와 대응되는 가능한 MHC 클래스 I 및 II - 결합 펩티드를 생성할 수 있다. 높은 점수의 펩티드는 주어진 MHC 분자에 대한 높은 친화성을 기초로 하여 "관심있는" 것으로서 순위를 매기고 선별할 수 있다.
T 세포 에피토프를 함유하는 항원성 펩티드를 확인하기 위한 또다른 방법은 단백질을 원하는 길이의 비-중첩 펩티드 또는 원하는 길이의 중첩 펩티드로 나누는 것이고 이들은 재조합으로, 합성으로, 또는 특정의 제한된 경우에는, 단백질의 화학적 절단에 의해 제조될 수 있고 예컨대, T 세포 반응 (즉, 증식 또는 림포카인 분비)을 이끌어내는 면역원성 성질에 대해 검사할 수 있다.
단백질의 정확한 T 세포 에피토프를 예를 들면, 미세한 맵핑 기술에 의해 측정하기 위해, T 세포 생물학 기술로 측정할 때 T 세포 자극 활성을 가지고 따라서 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드는 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 아미노산 잔기의 첨가 또는 결실에 의해 변형되고 검사되어 변형된 펩티드에 대한 T 세포 반응의 변화를 측정할 수 있다. 자연 단백질 서열 내 중첩 영역을 공유하는 두 개 또는 그 이상의 펩티드가 T 세포 생물학 기술로 측정할 때 인간 T 세포 자극 활성을 가지는 것으로 발견되는 경우, 추가적인 펩티드가 그러한 펩티드의 전부 또는 일부를 포함하여 제조될 수 있고 이들 추가적인 펩티드를 유사한 절차로 검사할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 펩티드는 재조합으로 또는 합성으로 선별되고 제조된다. 펩티드는 펩티드에 대한 T 세포 반응의 강도 (가령, 자극 지수)를 비롯한 다양한 요인을 기초로 선별된다. 이후 펩티드가 치료적 조성물에 사용하기에 적절한지 또는 펩티드가 변형을 요구하는 지 결정하기 위해 이들 선별된 펩티드의 물리적 및 화학적 성질 (가령, 용해성, 안정성)을 검사할 수 있다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 표면 상에 MHC와 복합체를 이룬 외부 항원을 전시하는 세포이다. T-세포는 T-세포 수용체 (TCR)를 이용하여 상기 복합체를 인식한다. APC의 예는 수지상 세포 (DC), 말초혈 단핵성 세포 (PBMC), 단핵구 (가령 THP-1), B 림프아구성 세포 (가령 C1R.A2, 1518 B-LCL) 및 단핵구-유래된 수지상 세포 (DC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 APC는 항원을 식세포 작용이나 수용체-매개된 세포내 섭취에 의해 내화한다. APC 수용체의 예는 C-유형 렉틴, 가령, 인간 수상돌기 및 상피 세포 205 수용체 (CD27), 그리고 인간 대식세포 만노스 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원 제시"는 이를 통해 APC가 항원을 포획하고 예컨대, MHC-I 및/또는 MHC-II 접합체의 성분으로서 T-세포에 의한 인식을 가능하게 하는 과정을 지칭한다.
"MHC 분자"는 두 가지 유형의 분자, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II를 포함한다. MHC 클래스 I 분자는 특이적 CD8+ T 세포에 항원을 제시하고 MHC 클래스 II 분자는 특이적 CD4+ T 세포에 항원을 제시한다. 외부로부터 APC에 전달된 항원은 주로 MHC 클래스 II와 연합되기 위해 처리된다. 반대로, 내부로부터 APC에 전달된 항원은 MHC 클래스 I과 연합되기 위해 처리된다.
본 명세서에서, 용어 "면역촉진제"는 DC 및 대식세포와 같은 APC를 자극할 수 있는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가령, 본 발명에 사용하기에 적절한 면역촉진제는 APC를 자극할 수 있어서, APC의 성숙 과정이 가속화되며, APC의 증식이 증가되고, 및/또는 동시-자극 분자 (가령, CD80, CD86, ICAM-1, MHC 분자 및 CCR7) 및 염증-유발 사이토킨 (가령, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-15, 그리고 IFN-γ)의 동원 또는 방출이 상향조절된다. 적절한 면역촉진제는 또한 T 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 그러한 면역촉진제는 CD40 리간드; FLT 3 리간드; 사이토킨, 가령 IFN-α, IFN-β, IFN-γ 및 IL-2; 집락-촉진 인자, 가령 G-CSF (과립성 집락-촉진 인자) 및 GM-CSF (과립성-대식세포 집락-촉진 인자); 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-41BB 항체, 또는 항-OX-40 항체; LPS (내독소); ssRNA; dsRNA; 바실리 칼메트-게랭 (BCG); 레바미솔 염산염; 그리고 정맥내 면역글로불린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서 면역촉진제는 Toll-유사 수용체 (TLR) 작동약일 수 있다. 예를 들면 면역촉진제는 TLR3 작동약 가령 이중-가닥 이노신:시토신 폴리뉴클레오티드 (예를 들면 Hemispherx Bipharma, PA, US에서 AmpligenTM으로 입수가능한 폴리 I:C 또는 Oncovir사의 폴리 IC:LC) 또는 폴리 A:U; TLR4 작동약 가령 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 RC-529 (예를 들면 GSK, UK로부터 입수가능한 것); TLR5 작동약 가령 플라젤린(flagellin); TLR7 또는 TLR8 작동약 가령 이미다조퀴놀린 TLR7 또는 TLR 8 작동약, 예를 들면 이미퀴모드(imiquimod) (예컨대 AldaraTM) 또는 레시퀴모드(resiquimod) 및 관련된 이미다조퀴놀린 물질 (예를 들면 3M Corporation으로부터 입수가능한 것); 또는 TLR 9 작동약 가령 비메틸화 CpG 모티프(motif) 를 갖는 데옥시뉴클레오티드 (소위 "CpG", 예를 들면 Coley Pharmaceutical로부터 입수가능한 것)일 수 있다. 바람직한 면역촉진제는 TLR3 작동약, 바람직하게는 폴리 I:C이다. 그러한 면역촉진제는 동시에, 단독으로 또는 순차적으로 본 발명의 항체 및 구조물과 함께 투여될 수 있고 또한 항체 및 구조물에 물리적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "연결된"은 둘 또는 그 이상의 분자의 연합을 지칭한다. 연결은 공유적이거나 비-공유적일 수 있다. 연결은 또한 유전학적 (즉, 재조합으로 융합된 것)일 수 있다. 그러한 연결은 매우 다양한 분야내 공지 기술, 가령 화학적 접합 및 재조합 단백질 생산을 이용하여 성취될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 항원 "교차-제시"는 APC 상의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 통해 T 세포에 외인성 단백질 항원을 제시하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "T 세포-매개된 반응"은 효과기 T 세포 (가령, CD8+ 세포) 및 보조자(helper) T 세포 (가령, CD4+ 세포)를 비롯한 T 세포에 의해 매개된 임의의 반응을 지칭한다. T 세포 매개된 반응은 예를 들면, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "세포독성 T 림프구 (CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유발된 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8+ T 세포에 의해 매개된다.
본 명세서에서, 용어 "저해" 또는 "차단" (가령, 세포 상에서 CD27에 대한 CD70의 결합의 저해/차단에 대하여)은 상호교환적으로 사용되며 부분 및 완전 저해/차단을 모두 포괄한다. CD70의 저해/차단은 바람직하게는 저해 또는 차단 없이 CD70 결합이 발생할 때 나타나는 정상 수준 또는 유형의 활성을 줄이거나 변화시킨다. 저해 및 차단은 또한 항-CD27 항체와 접촉하지 않는 CD70와 비교할 때 항-CD27 항체와 접촉한 경우의 CD70의 결합 친화성에서의 임의의 측정가능한 감소를 포함하는 것으로 의도되며, 예컨대, CD70의 결합은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%로 저해된다. 바람직한 구체예에서, 항-CD27 항체는 CD70의 결합을 적어도 약 70%로 저해한다. 다른 구체예에서, 항-CD27 항체는 CD70의 결합을 적어도 80%로 저해한다.
본 명세서에서, 용어 "성장을 저해" (가령, 세포에 대하여)하는 것은 세포의 성장에서의 임의의 측정가능한 감소를 포함하는 것으로 의도되며, 예컨대, 세포의 성장의 저해는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100%이다.
용어 "면역 반응을 유도함" 및 "면역 반응을 증강시킴"은 상호교환적으로 사용되며 특정한 항원에 대한 면역 반응의 자극 (즉, 수동적이든 적응성이든)을 지칭한다. CDC 또는 ADCC을 유발하는 것과 관련하여 사용된 용어 "유발"은 특정한 직접적 세포 사멸 메커니즘의 촉진을 지칭한다. 가령, 한 구체예에서, 항체는 10㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 CDC를 통해 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 % 용해를 유발한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 10㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 CDC를 통해 적어도 약 40 % 용해를 유발한다. 다른 구체예에서, 항체는 10㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 ADCC를 통해 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 또는 85% 용해(즉, 특이적 용해)를 유발한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 10㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 ADCC를 통해 적어도 약 40 % 용해를 유발한다.
본 명세서의 용어 "치료", "치료하는" 및 "치료"는 본 명세서에 기술된 치료적 또는 예방적 절차를 지칭한다. "치료"의 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 개체, 예를 들면, 그러한 질환을 결국 획득할 수 있는 특정한 항원 또는 개체에 대해 증강된 면역 반응을 필요로 하는 개체에게, 질환의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 재발 질환을 예방, 치유, 지연, 중증을 감소, 또는 개선하기 위해 또는 그러한 처리의 부재에서 예상되는 것 이상으로 개체의 생존을 연장하기 위해, 본 발명의 인간 항체를 투여하는 것을 사용한다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 원하는 효과를 성취하거나 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양으로 정의된다. 용어 "치료적으로 유효한 용량"은 질환 및 이미 그 질환으로 고통받는 환자에서 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 정의된다. 이러한 용도를 위한 유효량은 치료되는 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적 상태에 의존할 것이다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 처리를 제공받는 인간 및 다른 포유류 개체를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "개체"는 어떠한 인간 또는 비-인간 동물도 포함한다. 가령, 본 발명의 방법 및 조성물은 면역 질환을 갖는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대, 포유동물 및 비-포유동물, 가령 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류, 등을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면이 이어지는 하위 단락에서 추가로 상세하게 기술된다.
I. CD27 에 대한 항체의 생산
본 발명은 항체, 예컨대, CD27에 결합하는 전부 인간인 항체, 예컨대, 인간 CD27를 포괄한다. CD27에 결합하는 예시적인 단클론 항체는 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5를 포함한다. 본 발명의 단클론 항체는 다양한 공지의 기술, 가령 Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)에 기술된 표준 체세포 세포 혼성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 비록 체세포 세포 혼성 절차가 바람직하지만, 이론적으로, 단클론 항체를 제조하기 위한 다른 기술, 예컨대, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용하는 파지 전시 기술이 또한 사용될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 인간 CD27에 결합하는 항체를 제조하기 위해 하이브리도마 방법이 사용된다. 본 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 사용되는 항원에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 이끌어내기 위해 적절한 항원으로 면역화될 수 있다. 대안으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 림프구는 이후 적절한 융합제, 가령 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성할 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 하이브리도마 세포가 자라는 배양 배지는 항원에 대항하여 지향된 단클론 항체의 생산을 위해 분석평가된다. 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 제한 희석 절차에 의해 계대클로닝(subclone)하고 표준 방법을 통해 기를 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 용도를 위한 적절한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 게다가, 하이브리도마 세포를 생체내에서 동물 내 복수 종양으로서 기를 수 있다. 계대클론에 의해 분비된 단클론 항체는 배양 배지, 복수 액체, 또는 혈청으로부터 종래의 면역글로불린 정제 절차 가령, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
다른 구체예에서, 인간 CD27에 결합하는 항체 및 항체 부분은 예를 들면, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991) 및 Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348 ; Ladner et al .의 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 그리고 제5,571,698호; Dower et al .의 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; McCafferty et al .의 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 그리고 Griffiths et al .의 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기술된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 추가적으로, 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 연쇄 셔플링(chain shuffling)에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 그뿐 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res., 21:2265-2266 (1993))이 또한 사용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 인간 CD27에 결합하는 항체는 Hoet et al., 상기 동일 문헌에 기술된 파지 전시 기술을 이용하여 제조된다. 이러한 기술은 인간 공여자로부터 단리된 고유한 조합의 면역글로불린 서열을 가지고 중-쇄 CDR에서 합성 다양성을 가지는 인간 Fab 라이브러리의 생성을 수반한다 생성된다. 라이브러리는 이후 인간 CD27에 결합하는 Fab에 대해 선별된다.
본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마 생산은 당해 분야에 공지이며, 면역화된 비장 세포를 단리하고 융합하기 위한 면역화 프로토콜 및 기술을 포함한다.
한 구체예에서, CD27에 대항하여 지향된 항체는 생쥐 시스템 대신 인간 면역 시스템의 부분을 보유하는 유전자도입 또는 염색체전이 생쥐를 이용하여 생성된다. 한 구체예에서, 본 발명은 내인성 μ 및 κ 쇄 자리를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열안된 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 작은자리(miniloci)를 함유하는, 본 명세서에서 "HuMAb 생쥐"로 지칭되는 유전자도입 생쥐를 사용한다 (Lonberg, N. et al . (1994) Nature 368(6474): 856-859). 따라서, 생쥐는 생쥐 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응에 있어서, 도입된 인간 중쇄와 경쇄 전이유전자는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화성 인간 IgGκ 단클론 항체를 생성한다 (Lonberg, N. et al . (1994), 상기 동일 문헌; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. Vol. 13: 65-93, 그리고 Harding, F. 및 Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci 764:536-546 에서 리뷰됨). HuMAb 생쥐의 제조는 하기의 단락 II 및 Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al . (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci USA 90:3720-3724; Choi et al . (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al . (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al . (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al ., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al . (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern. Rev . Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. 및 Lonberg, N. (1995) Ann . N.Y. Acad . Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 상세하게 기술된다. 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 그리고 제5,770,429호; 모두 Lonberg 및 Kay, 그리고 GenPharm International로 등록됨; Surani et al .의 U.S. 특허 제5,545,807호; 1998년 6월 11일자 공개된 국제 공보 WO 98/24884; 1994년 11월 10일자 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일자 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일자 공개된 WO 92/22645; 1992년 3월 19일자 공개된 WO 92/03918를 참조하라.
면역화
CD27에 대한 전부 인간인 항체를 생성하기 위해, 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 유전자도입 또는 염색체전이 생쥐 (가령, HCo12, HCo7 또는 KM 생쥐)를 예를 들면, Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 WO 98/24884에 기술된 바와 같이 CD27 항원 및/또는 CD27을 발현하는 세포의 정제된 또는 농축된 제제로 면역화할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, HuMAb 생쥐는 면역원으로서 재조합 CD27 단백질 또는 CD27를 발현하는 세포주를 이용하여 면역화된다. 대안으로, 생쥐를 인간 CD27을 인코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 생쥐는 1차 주입시 6-16주령일 것이다. 가령, 재조합 CD27 항원의 정제된 또는 농축된 제제(5-50 ?)를 HuMAb 생쥐를 복막내로 면역화하기 위해 사용할 수 있다. 만일 CD27 항원의 정제된 또는 농축된 제제를 이용한 면역화로 항체가 생성되지 않은 경우, 생쥐는 또한 면역 반응을 증진하기 위해 CD27을 발현하는 세포, 예컨대, 세포주로 면역화될 수 있다. 예시적인 세포주는 CD27를-과다발현하는 안정한 CHO 및 Raji 세포주를 포함한다.
다양한 항원을 이용한 누적된 실험을 통해 HuMAb 유전자도입 생쥐가 복막내 (IP) 또는 피하로 (SC) 완전 프로인드 어쥬번트 내 항원으로 초기 면역화하고, 이후 불완전 프로인드 어쥬번트 내 항원으로 격주로 IP/SC 면역화 (합계는 최대 10)할 때 가장 잘 반응함이 나타났다. 면역 반응은 면역화 프로토콜의 과정 동안 후안와 출혈에 의해 수득하는 혈장 샘플을 이용하여 관찰할 수 있다. 혈장은 ELISA (하기 기술된 바와 같음)를 통해 선별될 수 있고, 그리고 충분한 역가의 항-CD27 인간 면역글로불린을 갖는 생쥐를 융합을 위해 사용할 수 있다. 생쥐는 항원을 이용하여 정맥으로 부스팅(boosting)하고 3일 후 희생시킨 뒤 비장을 제거할 수 있다.
CD27 에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
CD27에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성하기 위해, 면역화된 생쥐로부터의 비장 세포 및 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화된 세포주, 가령 생쥐 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 수득된 하이브리도마는 이후 항원-특이적 항체의 생산을 위해 선별될 수 있다. 가령, 면역화된 생쥐로부터의 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 50% PEG (w/v)를 이용하여 SP2/0-Ag8.653 비분비 생쥐 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)에 융합시킬 수 있다. 세포를 편평한 바닥 마이크로역가 평판에 대략 1 x 105로 도말하고, 이후 기본 시약외에도 10% 태아 클론 혈청, 5-10% 오리젠(origen) 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN) 및 1X HAT (Sigma)를 함유하는 선택적 배지에 두 주간 배양할 수 있다. 대략 두 주 후에, 세포를 HAT를 HT로 대체시킨 배지에 배양할 수 있다. 개별 웰을 이후 인간 항-CD27 단클론 IgM 및 IgG 항체에 대하여 ELISA로, 또는 CD27을 발현하는 세포, 예컨대, CD27를 발현하는 CHO 세포주의 표면에 대한 결합에 대하여, FLISA (형광-결합 면역흡착분석, fluorescence-linked immunosorbent assay)로 선별할 수 있다. 다량의 하이브리도마 성장이 발생하면, 대개의 경우 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 도말하고, 다시 선별할 수 있고, 여전히 IgG에 대해 양성일 경우, 항-CD27 단클론 항체를 제한 희석으로 적어도 2회 계대클로닝할 수 있다. 안정한 계대클론을 이후 시험관 내 배양하여 특성규명을 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성할 수 있다.
CD27 에 대한 단클론 항체를 생산하는 형질주입종의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들면, 당해 분야에 공지인 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질도입 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 형질주입종으로 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 한 구체예에서, 관심의 유전자(들), 예컨대, 인간 항체 유전자는 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당해 분야에 공지인 다른 발현 시스템에 의해 사용되는 바와 같이 발현 벡터 가령 진핵생물 발현 플라스미드에 결찰될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 진핵생물 숙주 세포 가령 CHO-세포 또는 NSO-세포 또는 대안으로 다른 진핵생물 세포 가령 식물 유래된 세포, 진균 또는 효모 세포에 도입될 수 있다. 이들 유전자를 도입하기 위해 사용되는 방법은 전기천공법, 리포펙틴(lipofectine), 리포펙타민(lipofectamine) 등과 같은 당해 분야에 기술되어 있는 방법일 수 있다. 숙주 세포에 이들 항체 유전자를 도입한 후에, 항체를 발현하는 세포를 확인하고 선별할 수 있다. 이들 세포는 형질주입종을 나타내며 이를 이후에 발현 수준에 대해 증폭하고 항체를 제조하기 위해 확장(upscale)시킬 수 있다. 재조합 항체를 이들 배양 상층액 및/또는 세포로부터 단리하고 정제할 수 있다.
대안으로 이들 클로닝된 항체 유전자는 E. coli 또는 완전 생물체와 같은 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있거나 합성적으로 발현될 수 있다.
온전한 항체를 발현하기 위한 부분적 항체 서열의 사용
항체는 대부분 6개 중쇄와 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 개별 항체 사이에서 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하기 때문에, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열상에 접목된 특정 자연적으로 발생하는 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성하여, 특정 자연적으로 발생하는 항체의 성질을 흉내내는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예컨대, Riechmann, L. et al ., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al ., 1986, Nature 321:522-525; 그리고 Queen, C. et al ., 1989, Proc . Natl . Acad . See . U.S.A. 86:10029-10033를 참조). 그러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 생식계열 서열은 성숙 항체 유전자 서열과는 상이할 것인데, 왜냐하면 이들이 B 세포 성숙 도중에 V(D)J 연결에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식계열 유전자 서열은 또한 높은 친화성의 두 번째 레퍼토리(repertoire) 항체 서열과 각각 가변영역에 걸쳐 균등하게 상이할 것이다. 가령, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역의 아미노-말단 부분에서 상대적으로 덜 빈번하다. 가령, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 상대적으로 덜 빈번하다. 더욱이, 많은 체세포 돌연변이가 항체의 결합 성질을 상당하게 변화시키지 않는다. 이러한 이유로, 원래의 항체의 것과 유사한 결합 성질을 가지는 온전한 재조합 항체를 재생성하기 위해 특정한 항체의 전체 DNA 서열을 얻는 것이 필요하지 않다 (1999년 3월 12일자 출원된 PCT/US99/05535를 참조). CDR 영역을 잇는 부분적 중쇄와 경쇄 서열이 전형적으로, 이러한 목적을 위해 충분하다. 상기 부분적 서열은 어떤 생식계열 가변 및 연결 유전자 조각이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여했는지 결정하기 위해 사용된다. 생식계열 서열은 이후 가변 영역의 빠진 부분을 채우기 위해 사용된다. 중쇄와 경쇄 선도 서열은 단백질 성숙 도중 절단되며 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 빠진 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열을 결찰 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합할 수 있다. 대안으로, 전체 가변 영역을 짧은, 중첩된, 올리고뉴클레오티드의 집합으로 합성하고 PCR 증폭에 의해 조합하여 전체적으로 합성된 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 상기 공정은 특정한 제한 부위의 소거 또는 통합, 또는 특정한 코돈의 최적화와 같은 특정한 장점을 가진다.
하이브리도마로부터의 중쇄와 경쇄 전사물의 뉴클레오티드 서열은 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩된 집합을 설계하기 위해 사용되어 자연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성한다. 합성 중쇄 및 카파 쇄 서열은 자연 서열과 세 가지 방식에서 상이할 수 있다: 반복된 뉴클레오티드 염기의 열(string)이 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위해 중단된다; 최적의 해독 개시 부위가 코작의 법칙(Kozak's rule)에 따라 포함되고 (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); 그리고, HindIII 부위가 해독 개시 부위의 상류로 조작된다.
중쇄와 경쇄 가변 영역 모두에 대하여, 최적화 코팅, 그리고 상응하는 비-코딩, 가닥 서열은 대략 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 중간점으로 30 - 50 뉴클레오티드로 쪼개진다. 따라서, 각각의 쇄에 대해, 올리고뉴클레오티드는 150 - 400 뉴클레오티드의 조각을 잇는 중첩하는 이중 가닥 집합으로 조립될 수 있다 상기 풀(pool)은 이후 150 - 400 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 생산하기 위한 주형으로 사용된다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 집합은 개별적으로 증폭되어 두개의 중첩 PCR 산물을 생성하는 두 개의 풀로 나누어질 것이다. 이들 중첩 산물은 이후 PCR 증폭에 의해 조합되어 완전 가변 영역을 형성한다. 또한 PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (카파 경쇄의 BbsI 부위, 또는 감마 중쇄의 경우는 AgeI 부위를 포함)의 중첩 단편을 포함하여 발현 벡터 구조물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하는 것이 바람직할 것이다.
재구성된 중쇄와 경쇄 가변 영역은 이후 클로닝된 프로모터, 선도 서열, 해독 개시, 선도 서열, 불변 영역, 3' 미해독된, 폴리아데닐화, 그리고 전사 종료, 서열과 조합되어 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄와 경쇄 발현 구조물은 단일 벡터와 조합되거나, 숙주 세포로 동시-형질감염되거나, 연속으로 형질감염되거나, 또는 개별적으로 형질감염될 수 있고 이는 이후 융합되어 두 가지 쇄를 모두 발현하는 숙주 세포를 형성한다.
발현 벡터의 구성에 사용하기 위한 플라스미드가 구성되며 그래서 PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 재구성된 완전 중쇄와 경쇄 꼬마유전자(minigene)를 위해 사용될 수 있다. 이들 플라스미드는 완전히 인간인 IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 전부 인간 및 키메라인 본 발명의 항체는 또한 IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM, 그리고 IgD 항체를 포함한다. 유사한 플라스미드가 다른 중쇄 아이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 항-CD27 항체의 구조적 특징이 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 연관된 항-CD27 항체를 생성하기 위해 사용되며, 상기 특성은 예를 들면 이하와 같다,
(1) CD27 발현 세포에 대한 CD70의 결합을 적어도 약 70% (가령, 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 적어도 약 70%, 또는 적어도 70%) 저해 (가령, 완전히 또는 부분적으로 차단);
(2) 10-9 M 또는 그 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안으로, 10+9 M-1 또는 그 이상의 평형 연합 상수 Ka로 인간 CD27에 결합;
(3) 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 30% 보체 매개된 세포독성 (CDC)을 유발 (또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 30%, 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 40% CDC를 유발);
(4) 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 30% ADCC-매개된 특이적 용해를 유발 (또는 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 30%, 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 40% ADCC-매개된 특이적 용해를 유발);
(5) 이종이식 모델에서 CD27-발현 종양 세포의 성장을 방지 또는 저해 (가령, 중증 복합형 면역부전증 (SCID) 생쥐에서 적어도 6일간 0.5mg ip로 생체내 종양 세포 접종후 20-일에 종양 크기를 적어도 약 50%로 감소);
(6) 백신 또는 다른 항원과 조합될 경우 항원 특이적 면역 반응을 유도 또는 증강;
(7) 면역 반응, 특히 이에 제한되지 않지만 TH1 면역 반응을 유도 또는 증강;
(8) T-세포 활성, 특히 이에 제한되지 않지만 특이적 CD8+ T-세포 수 또는 기능적 활성, 또는 T 세포 증식 또는 활성화를 유도 또는 증강; 및/또는
(9) T 세포 증식 또는 활성화를 감소 또는 저해. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 하나 또는 그 이상 CDR 영역이 공지의 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합으로 조합되어 추가적인, 재조합으로-조작된, 본 발명의 항-CD27 항체를 생성할 수 있다. 중쇄와 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일한 또는 상이한 항체 서열로부터 유래할 수 있다. 항체 서열은 자연적으로 발생하는 항체의 서열일 수 있거나 여러 항체의 공통 서열일 수 있다. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) 및 Carter et al., WO 92/22653을 참조하라.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-CD27 항체를 제조하기 위한 방법을 제공한다: (1) 중쇄 프레임워크 영역 및 중쇄 CDR, 여기서 적어도 하나의 중쇄 CDR은 서열 번호: 8, 9, 10, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 50, 51, 52, 62, 63, 64, 74, 75, 76, 86, 87, 88, 104, 105, 106에 나타난 CDR의 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함함; 그리고 (2) 경쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 CDR, 여기서 적어도 하나의 경쇄 CDR은 서열 번호: 서열 번호: 14, 15, 16, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 44, 45, 46, 56, 57, 58, 68, 69, 70, 80, 81, 82, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 110, 111, 112 에 나타난 CDR의 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함함, 을 포함하는 항체를 제조하는 단계; 여기서 상기 항체는 CD27에 결합하는 능력을 보유한다. CD27에 결합하는 항체의 능력은 실시예에서 설명된 것과 같은 표준 결합 분석평가를 이용하여 측정할 수 있다 (가령, ELISA 또는 FLISA).
항체 중쇄와 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 담당함이 당해 분야에 공지되어 있다 (Hall et al., J. Imunol., 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152:5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193:400-419 (1995); Klimka et al., Brit . J. Cancer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol . Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am . Chem . Soc., 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157:739-749 (1996)을 참조). 따라서, 상기 제시된 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함한다. 상기 항체는 추가로 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 CDR2를 포함할 수 있다. 항체는 추가로 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 CDR1을 포함할 수 있다. 항체는 추가로 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 추가로 다음: (1) 중쇄 프레임워크 영역, 중쇄 CDR1 영역, 중쇄 CDR2 영역, 그리고 중쇄 CDR3 영역, 여기서 상기 중쇄 CDR3 영역은 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 CDR3로부터 선택됨 (2) 경쇄 프레임워크 영역, 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역, 그리고 경쇄 CDR3 영역, 여기서 상기 경쇄 CDR3 영역은 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 CDR3로부터 선택됨, 을 포함하는 항-CD27 항체를 제공하며, 여기서 항체는 CD27에 결합한다. 항체는 추가로 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 중쇄 CDR2 및/또는 경쇄 CDR2을 포함할 수 있다. 항체는 추가로 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 중쇄 CDR1 및/또는 경쇄 CDR1를 포함할 수 있다.
변형된 서열을 가지는 항체의 생성
다른 구체예에서, 본 발명의 항-CD27 항체의 가변 영역 서열, 또는 이의 부분은 변형되어 결합을 보유하는 (즉, 변형되지 않은 항체와 동일한 에피토프에 대해) 구조적으로 연관된 항-CD27 항체를 생성하며, 따라서, 기능적으로 동등하다. 항원 결합을 제거하지 않고 변형될 수 있는 잔기를 확인하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 (예컨대, Marks et al . (Biotechnology (1992) 10(7):779-83 (경쇄 가변 영역, 이후 고정된 CDR3 서열 변화를 갖는 중쇄 가변 영역의 셔플링에 의한 단클론 항체 다양화), Jespers et al.(1994) Biotechnology 12(9):899-903 (항원의 단일 에피토프에 대한 파지 전시 레퍼토리로부터 인간 항체의 선택), Sharon et al . (1986) PNAS USA 83(8):2628-31 (항체의 다양한-다양성 조각 이음부에서 불변 아미노산 잔기의 위치-지정 돌연변이유발); Casson et al. (1995) J. Immunol. 155(12):5647-54 (항체 중쇄 가변 영역의 랜덤 돌연변이유발로 유발되는 특이성의 손실 및 변화의 발전)을 참조).
따라서, 본 발명의 한 측면에서, 상기 기술된 조작된 항체의 CDR1, 2, 및/또는 3 영역은 본 명세서에 개시된 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 것과 같이 정확한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 또다른 측면에서, 항체는 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 정확한 CDR 서열로부터의 유도체를 포함하지만 여전히 CD27에 효과적으로 결합하는 능력을 보유한다. 그러한 서열 변형은 하나 또는 그 이상 아미노산 첨가, 결실, 또는 치환, 예컨대, 상기 기술된 바와 같은 보존성 서열 변형을 포함할 수 있다. 서열 변형은 또한 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 특정한 CDR1, CDR2, 그리고 CDR3 서열에 대해 상기 기술된 공통 서열을 기초로 할 수 있다.
따라서, 다른 구체예에서, 조작된 항체는 예를 들면, 항체 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8, 그리고 1G5의 하나 또는 그 이상 CDR과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 또는 그 이상 CDR로 구성될 수 있다. 상기-나열된 값에 대해 중간인 범위, 예컨대, 상기 서열의 하나 또는 그 이상에 90-95%, 95-98%, 또는 98-100% 동일한 동일성의 CDR이 또한 본 발명에 의해 내포되는 것으로 의도된다.
다른 구체예에서, 더 바람직한 결합의 부착-비율(on-rate), 더 바람직한 결합의 해리-비율(off-rate), 또는 둘 다를 성취하여, 이상적인 결합 상수를 얻기 위해 CDR의 하나 또는 그 이상 잔기를 변화하여 결합을 변형시킬 수 있다. 이러한 전략을 사용하여, 예를 들면, 1010 M-1 또는 그 이상의 매우 높은 결합 친화성을 가지는 항체를 얻을 수 있다. 당해 분야에 공지이고 본 명세서에서 기술된 친화성 성숙 기술이 CDR 영역(들)을 변화시키고 이후 원하는 결합의 변화를 위해 수득된 결합 분자를 선별하는데 사용될 수 있다. 따라서, CDR(들)이 변화하면서, 결합 친화성 그뿐 아니라 면역원성의 변화가 관찰되고 수득될 수 있고, 따라서 최선의 조합된 결합 및 낮은 면역원성을 위해 최적화된 항체가 얻어진다.
CDR 내의 변형에 더하여 또는 그 대신에, 변형은 또한 이들 변형이 항체의 결합 친화성을 제거하지 않는 한, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4 내에서 만들어 질 수 있다. 가령, 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 하나 또는 그 이상의 비-생식계열 아미노산 잔기는 항체와 유의미한 서열 동일성을 갖는, 생식계열 아미노산 잔기, 즉, 상기 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대한 인간 생식계열 서열의 상응하는 아미노산 잔기로 치환된다. 가령, 항체 쇄가 유의미한 서열 동일성을 공유하는 생식계열 항체 쇄와 나란히 배열될 수 있고, 항체 프레임워크 서열 및 생식계열 쇄 프레임워크 사이에 대응되지 않는 아미노산 잔기는 생식계열 서열로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 항체 가변 프레임워크 영역 및 등가의 인간 생식계열 서열 가변 프레임워크 영역 간에 아미노산이 상이한 경우, 그 아미노산이 다음의 카테고리 중 하나에 속하는 것이 합리적으로 예상된다면, 항체 프레임워크 아미노산은 대개의 경우 등가의 인간 생식계열 서열 아미노산으로 치환되어야 한다:
(1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 아미노산 잔기,
(2) CDR 영역에 인접한 아미노산 잔기,
(3) 달리 CDR 영역과 상호작용하는 아미노산 잔기 (가령, 컴퓨터 모델링에 의해 결정시 CDR 영역의 약 3-6 Å 이내에 존재), 또는
(4) VL-VH 공유영역에 포함된 아미노산 잔기.
"항원에 직접 비공유적으로 결합하는"잔기는 예를 들면, 수소 결합, 반데르발스(Van der Waals) 힘, 소수성 상호작용, 등에 의한 공인된 화학적 힘에 따라 항원 상의 아미노산과 직접 상호작용할 양호한 확률을 가지는 프레임워크 영역 내 위치한 아미노산을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 프레임워크 영역 내 아미노산 잔기는 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 상응하는 생식계열 아미노산 잔기로 치환된다.
"CDR 영역에 인접한" 잔기는 항체의 주요 서열 내 하나 또는 그 이상의 CDR에 바로 근접한 위치, 예를 들면, 카밧(Kabat)에 의해 정의된 CDR, 또는 초티아(Chothia)에 의해 정의된 CDR (예컨대, Chothia 및 Lesk J. Mol . Biol. 196:901 (1987)참조)에 바로 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기는 CDR 영역에 인접한 상응하는 생식계열 아미노산 잔기로 치환된다.
"달리 CDR 영역과 상호작용하는"잔기는 2차 구조 분석에 의해 CDR 영역에 영향을 주기에 충분한 공간적 배향인 것으로 결정된 것들을 포함한다. 그러한 아미노산은 일반적으로 CDR의 일부 원자의 약 3 옹스트롬 단위 (Å) 이내에 측쇄 원자를 가질 것이며 상기 나열된 바와 같은 공인된 화학적 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 반드시 함유할 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기는 달리 CDR 영역과 상호작용하는 상응하는 생식계열 아미노산 잔기로 치환된다.
프레임워크의 여러 위치에 있는 아미노산은 많은 항체에서 CDR 확정 (가령, CDR과 상호작용할 수 있는)을 결정하기 위해 중요한 것으로 공지되어 있다 (Chothia 및 Lesk, 상기 동일 문헌, Chothia et al ., 상기 동일 문헌 및 Tramontano et al ., J. Mol. Biol. 215:175 (1990), 상기 모두는 참조로서 본 명세서에 포함됨). 이들 저자는 여러 공지의 항체 구조를 분석하여 CDR 입체구조에 있어서 중요한 보존된 프레임워크 잔기를 확인했다. 분석된 항체는 CDR의 입체구조를 기초로 제한된 수의 구조적 또는 "정규(canonical)" 클래스에 속한다. 정규 클래스의 구성원 내의 보존된 프레임워크 잔기는 "정규" 잔기로 지칭된다. 정규 잔기는 경쇄의 잔기 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 및 95 및 중쇄의 잔기 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 및 94를 포함한다. 추가적인 잔기 (가령, CDR 구조-결정 잔기)가 Martin 및 Thorton (1996) J. Mol . Biol. 263:800의 방법론에 따라 확인될 수 있다. 특히, 경쇄의 위치 2, 48, 64 및 71 및 중쇄의 26-30, 71 및 94 (카밧에 따른 번호매김)의 아미노산은 많은 항체에서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 공지이다. 경쇄의 위치 35 및 중쇄의 93 및 103의 아미노산이 또한 CDR과 상호작용할 수 있을 것이다. CDR의 입체구조에 영향을 줄 수 있는 추가적인 잔기는 Foote 및 Winter (1992) J. Mol . Biol. 224:487의 방법론에 따라 확인될 수 있다. 그러한 잔기는 "베르니에(vernier)" 잔기로 명명되고 이들은 CDR 아래에 가까이 위치한(즉, 아래에서 "대(platform)"를 형성하는) 프레임워크 영역 내 잔기이다.
"VL-VH 공유영역에 포함된" 잔기 또는 "결속하는(packing) 잔기"는 예를 들면, Novotny 및 Haber, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:4592-66 (1985) 또는 Chothia et al, 상기 동일 문헌에 정의된 바와 같이 VL 및 VH 사이의 공유영역에 있는 잔기들을 포함한다.
가끔, 특정한 아미노산이 하나 또는 그 이상의 상기-언급된 카테고리 내에 속하는지에 대하여 일부 모호성이 존재한다. 그러한 경우에, 대안적인 변이체 항체가 제조되며, 이중 하나는 특정한 치환을 가지고, 다른 것들은 그렇지 않다. 그렇게 제조된 대안적인 변이체 항체는 원하는 활성에 대해 본 명세서에서 기술된 임의의 분석평가로 검사될 수 있고, 바람직한 항체가 선별된다.
프레임워크 영역 내 치환을 위한 추가적인 후보는 항체에 있어서 그 위치에 이례적이거나 "희귀한" 아미노산이다. 이들 아미노산은 인간 생식계열 서열의 동등한 위치로부터 또는 더 전형적인 항체의 동등한 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 가령, 항체의 프레임워크 영역 내 아미노산이 그 위치에 있어서 희귀하고 생식계열 서열 내 상응하는 아미노산이 면역글로불린 서열 내 그 위치에 있어서 흔한 경우; 또는 항체 내 아미노산이 그 위치에 있어서 희귀하고 생식계열 서열 내 상응하는 아미노산이 또한 다른 서열에 비해 희귀한 경우, 치환이 바람직할 수 있다. 이례적 아미노산을 생식계열 서열로부터의 항체에 있어 전형적인 것으로 나타나는 아미노산으로 대체하여, 항체가 덜 면역원성으로 될 수 있음이 고려된다.
용어 "희귀한"은, 본 명세서에서, 서열의 대표적인 샘플에서 서열의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 더욱 바람직하게는 약 5% 미만, 더더욱 바람직하게는 약 3% 미만, 더더욱 바람직하게는 약 2% 미만 및 더더욱 바람직하게는 약 1% 미만으로 그 위치에서 발생하는 아미노산을 가리키고, 그리고 용어 "흔한"은, 본 명세서에서, 대표적인 샘플에서 서열의 약 25% 이상, 그러나 대개의 경우 약 50% 이상으로 발생하는 아미노산을 가리킨다. 가령, 모든 경쇄와 중쇄 가변 영역 서열은 각각 특히 서로 상동이고 특정한 결정적 위치에 동일한 아미노산을 가지는 서열의 "하위군"으로 집합된다 (Kabat et al., 상기 동일 문헌). 어떤 항체 서열 내 아미노산이 서열 사이에 "희귀"하거나 "흔한"지 결정할 때는, 대개 항체 서열로서 동일한 하위군 내의 서열들만 고려하는 것이 바람직할 것이다.
일반적으로, 항체의 프레임워크 영역은 이들이 유래한 인간 생식계열 서열의 프레임워크 영역과 대개의 경우 실질적으로 동일하고, 더욱 빈번한 경우, 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내의 많은 아미노산이 항체의 특이성 또는 친화성에 거의 또는 전혀 직접적으로 기여하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기의 많은 개별적인 보존성 치환이 수득된 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 주목할만한 변화 없이 용인될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서 항체의 가변 프레임워크 영역은 인간 생식계열 가변 프레임워크 영역 서열 또는 그러한 서열의 공통 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 항체의 가변 프레임워크 영역은 인간 생식계열 가변 프레임워크 영역 서열 또는 그러한 서열의 공통 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다.
단순히 CD27에 결합하는 것 외에도, 항체가 본 발명의 항체의 다른 기능적 성질의 점유를 위해 선택될 수 있고, 이들 성질은, 예를 들면 다음과 같다:
(1) CD27 발현 세포에 대한 CD70의 결합을 적어도 약 70%로 저해(가령, 완전히 또는 부분적으로 차단);
(2) 10-9 M 또는 그 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안으로, 10+9 M-1 또는 그 이상의 평형 연합 상수 Ka로 인간 CD27에 결합;
(3) 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% 보체 매개된 세포독성 (CDC)을 유발; 및/또는
(4) 10 ㎍/㎖의 농도에서 CD27 발현 세포의 적어도 약 40% ADCC 매개된 특이적 용해를 유발.
CD27 에 대한 단클론 항체의 특성분석
본 발명의 단클론 항체는 다양한 공지의 기술을 이용하여 CD27에 대한 결합에 대해 특성분석될 수 있다. 일반적으로, 항체는 먼저 ELISA에 의해 분석될 수 있다. 간략하게는, 마이크로역가 평판을 PBS 내 정제된 CD27로 코팅하고, 이후 PBS에 희석한 관련없는 단백질 가령 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단할 수 있다. CD27-면역화된 생쥐로부터의 혈장의 희석물을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 배양한다. 평판을 PBS/Tween 20으로 세척하고 이후 알칼리성 포스파타제와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클론 시약으로 37℃에서 1 시간 동안 배양한다. 세척 후에, 평판을 ABTS 기질로 전개시키고, 405의 OD에서 분석한다. 바람직하게는, 최대 역가를 발현한 생쥐가 융합을 위해 사용될 것이다.
상기 기술된 바와 같은 ELISA 분석평가는 항체, 그러므로, CD27 면역원과 함께 양성 반응을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마에 대한 선별에 사용될 수 있다. CD27에, 바람직하게는 높은 친화성으로, 결합하는 하이브리도마를 이후 계대클로닝할 수 있고 추가로 분석할 수 있다. 모세포의 반응을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 한 클론은 (ELISA에 의해), 이후 세포 은행을 만들기 위해, 그리고 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.
항-CD27 항체을 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 회전(roller) 병, 2-리터 회전(spinner)-플라스크 또는 다른 배양 시스템에서 기를 수 있다. 상층액을 여과하고 농축한 후 단백질 A-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용한 친화성 크로마토그래피하여 단백질을 정제한다. 완충액을 PBS로 교환한 후에, 1.43 흡광 계수를 이용하는 OD280 또는 바람직하게는 비탁(nephelometric) 분석에 의해 농도를 측정할 수 있다. 겔 전기영동 및 항원 특이적 방법으로 IgG를 확인할 수 있다.
선택된 항-CD27 단클론 항체가 고유한 에피토프에 결합하는 지 측정하기 위해, 각각의 항체를 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 비오틴화할 수 있다. 비오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 탐침으로 검출할 수 있다. 정제된 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 당해 분야에 확인된 기술을 이용하여 아이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 가령, 마이크로역가 평판의 웰을 10 mg/㎖의 항- Ig로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 5% BSA로 차단한 후, 평판을 10 mg/㎖의 단클론 항체 또는 정제된 아이소타입 대조와, 주변 온도에서 2시간 동안 반응시킨다. 이후 웰을 IgGl 또는 다른 아이소타입 특이적으로 접합된 탐침과 반응시킬 수 있다. 평판을 전개시키고 상기 기술된 바대로 분석한다.
생존하는 CD27을 발현하는 세포에 대한 단클론 항체의 결합을 검사하기 위해, 유세포분석법이 사용될 수 있다. 간략하게, 막-결합된 CD27을 발현하는 세포주 및/또는 인간 PBMC (표준 성장 조건 하에 성장된 것)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 내 다양한 농도의 단클론 항체와 4℃에서 1 시간 동안 혼합한다. 세척후에, 세포를 플루오레세인-표지된 항- IgG 항체와 1차 항체 염색과 동일한 조건하에 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 게이팅(gate)하기 위해 광 및 측방 산란(side scatter) 성질을 이용하는 FACScan 장비로 분석될 수 있고 표지된 항체의 결합이 측정된다. 형광 현미경을 이용하는 대안적인 분석평가가 (유세포분석법 분석평가 이외에 또는 그 대신에) 사용될 수 있다. 세포를 상기 기술된 바와 똑같이 염색하고 형광 현미경법에 의해 검사할 수 있다. 이러한 방법은 개별적인 세포의 시각화를 가능하게 하지만, 항원의 밀도에 따라 줄어든 민감성을 가질 수 있다.
항-CD27 IgG는 추가로 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 CD27 항원과의 반응에 대해 검사될 수 있다. 간략하게, CD27을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하고 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 처리할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 20% 생쥐 혈청으로 차단되고, 검사될 단클론 항체로 탐침표지될 것이다. IgG 결합은 항- IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 타블렛(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)으로 전개될 수 있다.
다양한 항-CD27 항체의 결합 친화성, 교차-반응, 그리고 결합 동역학을 분석하기 위한 방법은 당해 분야에 공지인 표준 분석평가, 예를 들면, 본 명세서의 실시예 2에 기술된, 비아코어TM 2000 SPR 장비 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하는 비아코어TM 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 포함한다.
II. 면역독소
다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 치료적 모이어티, 가령 세포독소, 약물 또는 방사성동위원소에 연결된다. 세포독소에 접합된 경우, 이들 항체 접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 (가령, 세포를 죽이는) 임의의 물질을 포함한다. 예시는 탁솔(taxol), 시토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신(anthracin) 디온, 미토잔트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 그리고 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동종체를 포함한다. 치료제는 항대사물질 (가령, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(decarbazine)), 알킬화제 (가령, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine) (BSNU) 및 로무스틴(lomustine) (CCNU), 시클로포스파미드, 부설판(busulfan), 디브로모만니톨, 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신(mitomycin) C, 그리고 cis-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안트라시클린(anthracycline) (가령, 다우노루비신(daunorubicin) (정식으로는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제 (가령, 닥티노마이신(dactinomycin) (정식으로는 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 그리고 안트라마이신(anthramycin) (AMC)), 그리고 항-유사분열제 (가령, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 방사성동위원소, 예컨대, 방사성 요오드에 접합되어 수상돌기-관련 질환, 가령 자가면역 또는 염증성 질환, 또는 이식편대숙주 질환을 치료하기 위한 세포독성 방사성의약품을 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제에 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 가령, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들면, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 활성 단편, 가령 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 가령 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는, 생물학적 반응 개질제 가령, 예를 들면, 림포카인, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립성 대식세포 집락 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립성 집락 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.
그러한 치료적 모이어티을 항체에 접합하는 기술은 공지되어 있고, 예컨대, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", 단클론 항체 및 암 치료(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy), Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", 제어 약물 수송(Controlled Drug Delivery) (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", 단클론 항체 ’84: 생물학적 및 임상적 용도(Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications), Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", 암 검출 및 치료를 위한 단클론 항체(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy), Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 그리고 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)를 참조하라.
III. 조성물
다른 구체예에서, 본 발명은 조성물, 예컨대, 본 발명의 단클론 항체 중 하나 또는 조합을 함유하고, 담체 (가령, 제약학적으로 허용되는 담체)와 함께 제형화된 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 조성물은 복수의 (가령, 둘 또는 그 이상의) 본 발명의 단리된 항체의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 조성물의 각각의 항체는 CD27의 구별된, 미리-선택된 에피토프에 결합한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉, 다른 물질과 조합으로 투여될 수 있다. 가령, 병용 요법은 적어도 하나의 또는 그 이상의 추가적인 치료제, 가령 항-염증제, DMARD (질환-조절 항-류머티즘약), 면역억제제, 그리고 화학요법제와 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 또한 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 항체와의 병용-투여가 또한 본 발명에 포괄된다.
본 명세서에서, 용어 "담체" 및 "제약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여 (가령, 주사 또는 주입에 의해)하기에 적절하다. 투여의 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위해 화합물을 불활성화하지 않을 수 있는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 항체 및 구조물과 함께 사용될 수 있는 어쥬번트의 예는 다음을 포함한다: 프로인드(Freund's) 불완전(Incomplete) 어쥬번트 및 완전(Complete) 어쥬번트 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck 어쥬번트 65 (Merck 및 Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 알루미늄 염 가령 수산화 알루미늄 겔 (alum) 또는 인화 알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온으로 또는 음이온으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 미소구체; 사이토킨, 가령 GM-CSF, 인터류킨-2, -7, -12, 그리고 기타 유사 인자; 3D-MPL; CpG 올리고뉴클레오티드; 그리고 모노포스포릴 지질 A, 예를 들면 3-de-O-아실화 모노포스포릴 지질 A.
MPL 어쥬번트는 Corixa Corporation (Seattle, Wash)로부터 입수가능하다(예를 들면, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호를 참조하라). CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (여기서 CpG 디뉴클레오티드는 비메틸화됨)는 공지되어 있고 예를 들면, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기술되어 있다. 면역자극성 DNA 서열이 또한 예를 들면, Sato et al., Science 273:352, 1996에 기술되어 있다.
추가적인 대안적 어쥬번트는 예를 들면, 사포닌(saponin), 가령 QS21 및 QS7를 비롯한 퀼(Quil) A, 또는 이의 유도체 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); 에스신(Escin); 디기토닌(Digitonin); 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 체포디움 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌; 몬타니드(Montanide) ISA 720 (Seppic, France); SAF (Chiron, California, United States); ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron); SBAS 시리즈의 어쥬번트 (가령, SBAS-2 또는 SBAS-4, SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium로부터 입수가능); 디톡스(Detox) (EnhanzynTM) (Corixa, Hamilton, Mont.); RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트 (AGP); 폴리옥시에틸렌 에테르 어쥬번트 가령 WO 99/52549A1에 기술된 것들; 합성 이미다조퀴놀린 가령 이미퀴모드 [S-26308, R-837], (Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001; 그리고 레시퀴모드 [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al., Cellular immunology 204: 64-74, 2000; 항원 제시 세포 및 T-세포 표면에 구성적으로 발현되는 카르보닐 및 아민의 쉬프(Schiff) 염기, 가령 투카레솔(tucaresol) (Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995); 사이토킨, 케모킨 및 단백질 또는 펩티드로서의 동시-자극성 분자, 가령 예를 들면 염증-유발 사이토킨 가령 인터페론, GM-CSF, IL-1 알파, IL-1 베타, TGF-알파 및 TGF-베타, Th1 유도제 가령 인터페론 감마, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21, Th2 유도제 가령 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13 및 기타 케모킨 및 동시-자극성 유전자 가령 MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 및 CD40L; 리간드를 표적으로 하는 면역촉진제 가령 CTLA-4 및 L-셀렉틴(selectin), 아폽토시스(apoptosis) 촉진 단백질 및 펩티드 가령 Fas; 합성 지질 기반 어쥬번트, 가령 박스펙틴(vaxfectin), (Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001) 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 폴리소르베이트 80, DOPC 및 콜레스테롤; 내독소, [LPS], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); Toll 수용체를 촉발하여 Th1-유도 사이토킨을 생성하는 리간드, 가령 합성 마이코박테리아 지질단백질, 마이코박테리아 단백질 p19, 펩티도글리칸, 테이코산 및 지질 A; 그리고 CT (콜레라 독소, 아단위 A 및 B) 및 LT (E. coli로부터의 열민감성 장독소, 아단위 A 및 B), 열충격(heat shock) 단백질 패밀리 (HSP), 그리고 LLO (리스테리오리신 O; WO 01/72329)를 포함한다. 이들 및 다양한 추가적인 Toll-유사 수용체 (TLR) 작동약은 예를 들면 Kanzler et al, Nature Medicine, May 2007, Vol 13, No 5에 기술되어 있다. 본 발명의 항-CD27 항체와 병용으로 사용하기 위해 바람직한 면역촉진제는 TLR3 작동약, 가령 폴리 IC이다.
"제약학적으로 허용되는 염"은 모화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원치않는 독성학적 효과를 나타내지 않는 염을 지칭한다 (예컨대, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19를 참고). 그러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 무독성 무기산, 가령 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인 등, 그뿐 아니라 무독성 유기산 가령 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 가령 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 그뿐 아니라 무독성 유기 아민, 가령 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지인 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 숙련된 기술자에게 이해될 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치, 그리고 미세캡슐화된 수송 시스템을 비롯한, 서방성 제제와 같이 화합물을 빠른 방출로부터 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 그리고 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조를 위한 많은 방법들이 특허화되거나 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조하라.
특정한 투여의 경로로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 이와 함께 병용-투여하는 것이 필요할 수 있다. 가령, 화합물은 적절한 담체, 예를 들면, 리포좀, 또는 희석제 내로 개체에 투여될 수 있다. 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 리포좀은 수중유중수적형(water-in-oil-in-water) CGF 에멀전뿐 아니라 종래의 리포좀을 포함한다 (Strejan et al . (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약학적으로 활성인 물질을 위한 그러한 매체 및 물질의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 종래의 매체 또는 물질이 활성 화합물과 양립불가한 경우가 아닌 한, 본 발명의 제약학적 조성물 내 이들의 사용이 포함된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물 내에 포함될 수 있다.
치료적 조성물은 전형적으로, 멸균되어야 하고 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세에멀전, 리포좀, 또는 높은 약물 농도를 위해 적절한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올 가령 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함하여 얻어질 수 있다.
멸균 주사용 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 포함하고, 필요한 경우, 이후 멸균 정말여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물 및 상기 열거한 것 중의 요구되는 기타 성분을 염기성 분산매를 함유하는 멸균 비히클(vehicle)에 포함시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 이들의 앞서 멸균-여과한 용액으로부터 수득하는 진공 건조 및 얼림-건조(동결건조)이다.
투여 계획은 조정되어 최적의 원하는 반응 (가령, 치료적 반응)을 제공한다. 가령, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있고, 여러 개의 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 치료적 상황의 긴급시 지시되는 바와 같이 용량을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 가령, 본 발명의 항체는 한 주에 한 번 또는 두 번 피하 또는 근육내 주사로 또는 한 달에 한 번 또는 두 번 피하 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다.
특히 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 개체에 단일적으로 투여하기 위해 적합한 물리적으로 구별된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약학적 담체와 함께 원하는 치료적 효과를 만들 것으로 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태를 위한 상세 내용은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 얻게될 특정한 치료적 효과, 그리고 (b) 개체에서 민감성을 치료하기 위한 그러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재된 한계에 의해 설명되며 직접적으로 여기에 의존한다.
제약학적으로-허용되는 항산화제의 예는: (1) 수용성 항산화제, 가령 아스코르브산, 시스테인 염산염, 황산수소 나트륨, 메타중아황산 나트륨, 아황산 나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 가령 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 등; 그리고 (3) 금속 킬레이트제, 가령 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산, 등을 포함한다.
치료적 조성물에 있어서, 본 발명의 제형은 경구, 비내, 국소 (가령 구강내 및 설하), 직장내, 질내 및/또는 비경구 투여를 위해 적절한 것들을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있고 제약 분야에 공지인 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 담체 물질와 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 개체, 그리고 투여의 특정한 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질와 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료적 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 전체를 100 퍼센트로 하여, 이러한 양은 활성 성분의 약 0.001 퍼센트 내지 약 90 퍼센트, 바람직하게는 약 0.005 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 0.01 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
질내 투여를 위해 적절한 본 발명의 제형은 또한 적절한 것으로 당해 분야에 공지인 담체를 함유하는 질 좌제(pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼(foam) 또는 스프레이 제형을 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에 제약학적으로 허용되는 담체, 그리고 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진제(propellant)와 함께 혼합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로로 투여된"은 경장 및 국소 투여가 아닌 투여의 방식을 의미하며, 대개의 경우 주사에 의하며, 그리고 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 발명의 제약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (가령 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 가령 올리브 오일, 그리고 주사용 유기 에스테르, 가령 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅 물질, 가령 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 어쥬번트 가령 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물체의 존재의 방지는 상기와 같은 멸균 절차, 그리고 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 등의 포함 모두에 의해 보장될 수 있다. 또한 등장화제, 가령 당, 염화나트륨, 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 주사용 제약학적 형태의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질 가령 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함하여 달성될 수 있다.
본 발명의 화합물이 의약품으로서, 인간 및 동물에 투여되는 경우, 이들은 단독으로 또는 예를 들면, 0.001 내지 90% (더욱 바람직하게는, 0.005 내지 70%, 가령 0.01 내지 30%)의 활성 성분을 제약학적으로 허용되는 담체와 조합으로 함유하는 제약학적 조성물로서 제공될 수 있다.
선택된 투여의 경로와 상관없이, 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 제약학적 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 공지인 종래의 방법으로 제약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여 수준은 특정한 환자를 위해 환자에게 독이 되지 않는 원하는 치료적 반응을 성취하기에 효과적인 활성 성분, 조성물의 양, 그리고 투여의 방식을 얻을 수 있도록 달라질 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물, 또는 에스테르, 염 또는 이들의 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여하는 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력, 그리고 의학 분야에 공지인 유사 요인들을 비롯한 다양한 약물동태학 요인에 의존할 것이다. 당해 분야의 숙련된 전문의 또는 수의사는 요구되는 제약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 가령, 전문의 또는 수의사는 원하는 치료적 효과를 성취하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준으로 제약학적 조성물 내 사용된 본 발명의 화합물의 용량으로 출발하여 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있을 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적절한 하루 용량은 치료적 효과를 생성하기에 효과적인 가장 낮은 용량인 화합물의 양일 것이다. 그러한 유효 용량은 일반적으로 상기 기술된 요인에 의존적일 것이다. 투여가 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하로 되는 것, 바람직하게는 표적하는 부위에 가깝게 투여되는 것이 바람직하다. 필요한 경우, 치료적 조성물의 효과적인 하루 용량은 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 단독적으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 하위-용량으로, 임의적으로는, 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 화합물을 제약학적 배합물 (조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
치료적 조성물은 당해 분야에 공지인 의료 기기를 이용하여 투여될 수 있다. 가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 무바늘 피하 주사 기기, 가령 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호, 또는 제4,596,556호에 기술된 기기를 이용하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 공지된 임플란트 및 모듈(module)의 예는 다음을 포함한다: U.S. 특허 제4,487,603호는 약을 제어된 속도로 투여하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시함; U.S. 특허 제4.,486,194호는 피부를 통해 약을 투여하는 치료 기기를 개시함; U.S. 특허 제4,447,233호는 정확한 주입 속도로 약을 수송하기 위한 약 주입 펌프를 개시함; U.S. 특허 제4,447,224호는 연속적인 약물 수송을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 개시함; U.S. 특허 제4,439,196호는 다중-챔버 구획을 가지는 삼투적 약물 수송 시스템을 개시함; 그리고 U.S. 특허 제4,475,196호는 삼투적 약물 수송 시스템을 개시함. 많은 다른 그러한 임플란트, 수송 시스템, 그리고 모듈이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 적절히 분배되는 것이 보장되도록 제형화될 수 있다. 가령, 혈뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료적 화합물이 BBB를 넘도록 보장하기 위해 (필요한 경우), 이들은 예를 들면, 리포좀 내로 제형화될 수 있다. 리포좀을 제조하기 위한 방법에 대해, 예컨대, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 그리고 제5,399,331호를 참조하라. 리포좀은 선택적으로 특유한 세포 또는 기관으로 운반되는 하나 또는 그 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화된 약물 수송을 증강시킨다 (예컨대, V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685를 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴 (예컨대, Low et al .의 미국 특허 제5,416,016호를 참조); 만노시드 (Umezawa et al ., (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al . (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al . (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al . (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), 본 발명의 제형 및 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있는 상이한 종; p120 (Schreier et al . (1994) J. Biol . Chem. 269:9090); 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273을 참조)을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 치료적 화합물은 리포좀 내로 제형화되고; 더욱 바람직한 구체예에서, 리포좀은 표적화 모이어티를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 리포좀 내의 치료적 화합물은 볼루스 주사에 의해 종양 또는 감염에 가까운 부위로 수송된다. 조성물은 용이한 주사가능성이 존재할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장의 조건하에서 안정해야 하며 미생물체 가령 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다.
암을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템으로 평가될 수 있다. 대안으로, 조성물의 이러한 특성은 화합물의 저해하는 능력을 검사하여, 가령 저해를 숙련된 전문의에게 공지인 시험관 내 분석평가하여 평가할 수 있다. 치료적 유효량의 치료적 화합물은 개체에서 종양 크기를 감소시키거나 아니면 증상을 개선할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 개체의 크기, 개체의 증상의 중증도, 그리고 선택된 특정한 조성물 또는 투여의 경로와 같은 요인을 기초로 하여 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균되어야 하고 조성물을 주사기로 수송가능할 정도로 유동성이어야 한다. 물외에도, 담체는 등장성 완충된 식염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅 물질, 가령 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올 가령 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함하여 달성될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 활성 화합물이 적절하게 보호되는 경우, 화합물은 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화되는 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
IV. 본 발명의 사용 및 방법
한 구체예에서, 본 발명의 항체, 이중특이적 분자, 그리고 조성물은 다양한 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방 (가령, 이에 대해 면역화)하기 위해 사용될 수 있다.
치료될 수 있는 주요 질환 현상의 하나는 암이다. 특히, 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 항-CD27 항체가 암의 치료에 사용될 수 있다. 암의 유형은 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수아세포 전골수세포 골수단구성 단구성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 (과립구) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B세포 림프종, 진성적혈구증가증 림프종, 호지킨병, 비-호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 고형 종양, 육종, 그리고 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 골육종, 척삭종, 맥관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 육종, 결장직장 암종, 췌장 암, 유방 암, 난소 암, 전립선 암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부 암, 자궁 암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌교종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아종, 상인두 암종, 식도 암종, 기저 세포 암종, 담도 암, 방광 암, 골 암, 뇌와 중추신경계 (CNS) 암, 자궁경부 암, 융모막암종, 결장직장 암, 연결 조직 암, 소화기계의 암, 자궁내막 암, 식도 암, 눈 암, 두경부 암, 위 암, 상피 내암, 신장 암, 후두 암, 간 암, 폐 암 (소세포, 대세포), 흑색종, 신경아세포종; 구강 암(가령, 입술, 혀, 입과 인두), 난소 암, 췌장 암, 망막아종, 횡문근육종, 직장 암; 호흡기계의 암, 육종, 피부 암, 위 암, 고환 암, 갑상선 암, 자궁 암, 그리고 비뇨기계의 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 암은 만성 림프성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B세포 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 CD27-발현 종양을 포함한다.
면역 반응을 유도하거나 증강시키는 항-CD27 항체의 사용하기 위한 다른 질환 현상은 박테리아, 진균, 바이러스 및 기생충 감염성 질환을 포함한다. 면역 반응을 저해하거나 감소시키는 항-CD27 항체를 사용하기 위한 다른 질환 현상은 이식편 거부반응, 알레르기 및 자가면역 질환을 포함한다.
예시적인 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 크론병 및 기타 염증성 장 질환 가령 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증 (MG), 만성 임파구성 갑상선염, 굿파스튜어 증후군, 천포창, 그레이브스병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소성 자반병, 항- 콜라겐 항체로 인한 경피증, 혼성 연결 조직 질환, 다발성근염, 악성 빈혈, 특발성 에디슨병, 자가면역 연관된 불임증, 사구체신염, 반월상 사구체신염, 증식성 사구체신염, 수포성 유천포창, 쇼그렌 증후군, 건선성 관절염, 인슐린 내성, 자가면역성 당뇨병, 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS), 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 포도막망막염, 길렝 바레 증후군, 동맥경화증 및 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알레르기성 질환은 알레르기성 결막염, 춘계 결막염, 춘계 각결막염, 그리고 거대 유두 각막염; 비내 알레르기성 질환, 가령 알레르기성 비염 및 부비동염; 귀의 알레르기성 질환, 가령 유스타키오관 소양증; 상하기도의 알레르기성 질환, 가령 내인성 및 외인성 천식; 피부의 알레르기성 질환, 가령 피부염, 습진 및 두드러기; 그리고 위장관의 알레르기성 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체는, 백신 항원, 예를 들면 종양 항원 (이를 통해 종양에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해) 또는 감염성 질환 병원체로부터의 항원 (이를 통해 감염성 질환 병원체 대한 면역 반응을 증강시키기 위해)에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 백신과 조합되어 투여된다. 따라서, 이러한 구체예에서, 백신 항원은 예를 들면, 종양에 대해 또는 감염성 질환 병원체 가령 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 포함할 수 있다. 항원 또는 항원들은 예를 들면, 펩티드/단백질, 다당류 및/또는 지질일 수 있다. 항원 또는 항원들은 종양, 가령 본 명세서에 앞서 기술된 다양한 종양 항원으로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 항원 또는 항원들은 병원체 가령 바이러스, 박테리아, 기생충 및/또는 진균, 가령 본 명세서에 앞서 기술된 다양한 병원체 항원으로부터 유래될 수 있다. 적절한 병원체 항원의 추가적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
바이러스 항원 또는 항원성 결정 인자는 예를 들면 다음에서 유래될 수 있다: 사이토메갈로바이러스 (특히 인간, 가령 gB 또는 이의 유도체); 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 (가령 gp350); 플라비바이러스 (가령, 황열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 진드기매개 뇌염바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 일본뇌염 바이러스); 간염 바이러스 가령 B형 간염 바이러스 (예를 들면 B형 간염 표면 항원 가령 EP-A-414 374; EP-A-0304 578, 그리고 EP-A-198474에 기술된 PreSl, PreS2 및 S 항원), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스; HIV-1, (가령 tat, nef, gpl20 또는 gpl60); 인간 헤르페스 바이러스, 가령 gD 또는 이의 유도체 또는 전초기(Immediate Early) 단백질 가령 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27; 인간 유두종 바이러스 (예를 들면 HPV6, 11, 16, 18); 인플루엔자 바이러스 (난(egg) 또는 MDCK 세포, 또는 Vero 세포에서 성장한 전생존 또는 비활성화 바이러스, 스플리트 인플루엔자 바이러스, 또는 전(whole) 독감 비로좀(virosome) (Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920에 기술됨) 또는 이들의 정제된 또는 재조합 단백질, 가령 NP, NA, HA, 또는 M 단백질); 홍역 바이러스; 볼거리 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스; 광견병 바이러스; 호흡장애(Respiratory Syncytial) 바이러스 (가령 F 및 G 단백질); 로타바이러스 (약독화(live attenuated) 바이러스 포함); 천연두 바이러스; 수두 대상포진(Varicella Zoster) 바이러스 (가령 gpI, II 및 IE63); 그리고 자궁경부암의 원인이 되는 HPV 바이러스 (예를 들면 단백질 D 담체와 융합되어 HPV 16로부터 단백질 D-E6 또는 E7 융합을 형성하는 초기 단백질 E6 또는 E7, 또는 이들의 조합; 또는 E6 또는 E7와 L2의 조합 (예를 들면 WO 96/26277을 참조).
박테리아 항원 또는 항원성 결정 인자는 예를 들면 다음으로부터 유래될 수 있다: 바실러스 종(Bacillus spp), 가령 비. 안트라시스(B. anthracis) (예컨대 보툴리눔 독소); 보르데텔라 종(Bordetella spp), 가령 비. 퍼르투시스(B. pertussis) (예를 들면 퍼탁틴, 백일해 독소, 섬유성 혈구응집소, 아데닐레이트 시클라제, 선모(fimbriae)); 보렐리아 종(Borrelia spp.), 가령 비. 부르그도르퍼리(B. burgdorferi) (예컨대 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 가르니이(B. garinii) (예컨대 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 아프젤리이(B. afzelii) (예컨대 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 안데르소니이(B. andersonii) (예컨대 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 헤름시이(B. hermsii); 캄필로박터 종(Campylobacter spp), 가령 씨. 제주니(C. jejuni) (예를 들면 독소, 부착소(adhesin) 및 침입소(invasin)) 및 씨. 콜라이(C. coli); 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 가령 씨. 트라코마티스(C. trachomatis) (예컨대 MOMP, 헤파린-결합 단백질), 씨. 뉴모니(C. pneumonie) (예컨대 MOMP, 헤파린-결합 단백질), 씨. 프시타시(C. psittaci); 클로스트리디움 종(Clostridium spp.), 가령 씨. 테타니(C. tetani) (가령 파상풍 독소), 씨. 보툴리눔(C. botulinum) (예를 들면 보툴리눔 독소), 씨. 디피실레(C. difficile) (예컨대 클로스트리디움 독소 A 또는 B); 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 가령 씨. 디프테리에(C. diphtheriae) (예컨대 디프테리아 독소); 에를리키아 종(Ehrlichia spp.), 가령 이. 에키(E. equi) 및 인간 과립구 에를리히 증(Granulocytic Ehrlichiosis)의 물질; 리케치아 종(Rickettsia spp), 가령 알. 리케치(R.rickettsii); 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.), 가령 이. 파에칼리스(E. faecalis), 이. 파에시움(E. faecium); 에셔리아 종(Escherichia spp), 가령 장독성 이. 콜라이(E. coli) (예를 들면 집락형성 인자, 이열성(heat-labile) 독소 또는 이의 유도체, 또는 내열성(heat-stable) 독소), 장출혈성 이. 콜라이(E. coli), 장병원성 이. 콜라이(E. coli) (예를 들면 쉬가(shiga) 독소-유사 독소); 헤모필러스 종(Haemophilus spp.), 가령 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) B형 (예컨대 PRP), 비-피막형 에이치. 인플루엔자(H. influenzae), 예를 들면 OMP26, 고분자량 부착소, P5, P6, 단백질 D 및 지질단백질 D, 그리고 핌브린 및 핌브린 유래된 펩티드 (예를 들면 US 5,843,464를 참조); 헬리코박터 종(Helicobacter spp), 가령 에이치. 파이로리(H. pylori) (예를 들면 우레아제, 카탈라제, 액포성 독소); 슈도모나스 종(Pseudomonas spp), 가령 피. 에루기노사(P. aeruginosa); 레지오넬라 종(Legionella spp), 가령 엘. 뉴모필라(L. pneumophila); 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 가령 엘. 인테로간스(L. interrogans); 리스테리아 종(Listeria spp.), 가령 엘. 모노시토젠스(L. monocytogenes); 모락셀라 종(Moraxella spp), 가령 브란하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis)로도 알려진 엠 카타르할리스(M catarrhalis) (예를 들면 고 및 저분자량 부착소 및 침입소); 모렉셀라 카타르할리스(Morexella Catarrhalis) (이의 외부 막 소포, 및 OMP106 (예를 들면 W097/41731를 참조)를 포함); 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.), 가령 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) (예를 들면 ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), 엠. 보비스(M. bovis), 엠. 레프레(M. leprae), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 파라투버쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 스메그마티스(M. smegmatis); 나이세리아 종(Neisseria spp), 가령 엠. 고노레아(N. gonorrhea) 및 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) (예를 들면 이들의 캡슐성 다당류 및 접합체, 트랜스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 부착소); 나이세리아 멩기티디스(Neisseria mengitidis) B (이의 외부 막 소포, 그리고 NspA (예를 들면 WO 96/29412를 참조)를 포함; 살모넬라 종(Salmonella spp), 가령 에스. 티피(S. typhi), 에스. 파라티피(S. paratyphi), 에스. 콜레라에수이스(S. choleraesuis), 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis); 쉬젤라 종(Shigella spp), 가령 에스. 소네이(S. sonnei), 에스. 디센테리에(S. dysenteriae), 에스. 플렉스네리이(S. flexnerii); 스트라필로코쿠스 종(Staphylococcus spp.), 가령 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 에피더미디스(S. epidermidis); 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp), 가령 에스. 뉴이모니에(S. pneumonie) (예컨대 이들의 캡슐성 다당류 및 접합체, PsaA, PspA, 스트렙토리신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴이몰리신(Pneumolysin) (Biochem Biophys Acta, 1989,67,1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342), 그리고 이의 돌연변이 무독화 유도체 (예를 들면 WO 90/06951; WO 99/03884를 참조); 트레포네마 종(Treponema spp.), 가령 티. 팔리듐(T. pallidum) (예컨대 외막 단백질), 티. 덴티콜라(T. denticola), 티. 히오디센테리에(T. hyodysenteriae); 비브리오 종(Vibrio spp), 가령 브이. 콜레라(V. cholera) (예를 들면 콜레라 독소); 및 예르시니아 종(Yersinia spp), 가령 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) (예를 들면 Yop 단백질), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis).
기생충/진균 항원 또는 항원성 결정 인자는 예를 들면 다음으로부터 유래될 수 있다: 바베시아 종(Babesia spp.), 가령 비. 미크로티(B. microti); 칸디다 종(Candida spp.), 가령 씨. 알비칸스(C. albicans); 크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 가령 씨. 네오포르만스(C. neoformans); 엔트아메바 종(Entamoeba spp.), 가령 이. 히스톨리티카(E. histolytica); 지아르디아 종(Giardia spp.), 가령; 쥐. 람빌라(G. lamblia); 레슈마니아 종(Leshmania spp.), 가령 엘. 메이저(L. major); 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium. faciparum) (MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀴스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모디움 종(Plasmodium spp.) 내 이들의 유사체); 뉴모시스티스 종(Pneumocystis spp.), 가령 피. 카르니이(P. carinii); 쉬소스토마 종(Schisostoma spp.), 가령 에스. 만소니(S. mansoni); 트리코모나스 종(Trichomonas spp.), 가령 티. 바기날리스(T. Vaginalis); 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp.), 가령 티. 곤디이(T. gondii) (예를 들면 SAG2, SAG3, Tg34); 트리파노소마 종(Trypanosoma spp.), 가령 티. 크루지(T. cruzi).
본 발명의 측면에 따라 항원 및 항원성 결정 인자가 많은 상이한 형태로 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 가령, 항원 또는 항원성 결정 인자는 단리된 단백질 또는 펩티드로서 (예를 들면 소위 "아단위 백신(subunit vaccine)"으로서) 또는, 예를 들면, 세포-연관된 또는 바이러스-연관된 항원 또는 항원성 결정 인자로서 (예를 들면 생존하거나 사멸된 병원체 균주로) 존재할 수 있다. 생존 병원체는 바람직하게는 공지의 방식으로 약독화될 것이다. 대안으로, 항원 또는 항원성 결정 인자는 항원 또는 항원성 결정 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 (소위 "DNA 백신화"로서) 개체에서 제자리(in situ)로 생성될 수 있고, 다만 이러한 접근법으로 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드가 DNA에 제한되지 않으며, 또한 RNA 및 상기 논의된 바와 같은 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
한 구체예에서, 백신 항원은 또한, 예를 들면 특정한 세포 유형 또는 특정한 조직에 대해 표적화될 수 있다. 가령, 백신 항원은 예를 들면 항체 가령 DEC-205와 같은 APC-표면 수용체에 대해 표적화된, 예를 들면 WO 2009/061996에 논의된 바와 같은 항체 (Celldex Therapeutics, Inc), 또는 예를 들면 WO 03040169에 논의된 바와 같은 만노스 수용체 (CD206) (Medarex, Inc.)의 사용을 통해 항원 제시 세포 (APC)에 대해 표적화될 수 있다.
치료에서 사용하기 위해, 본 발명의 항체는 단독으로 또는 면역촉진제, 백신, 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 다른 요법과 함께 개체에 직접 (즉, 생체내에서) 투여될 수 있다. 모든 경우에, 항체, 이중특이적 물질, 조성물, 그리고 면역촉진제 및 다른 요법이 이들의 원하는 치료적 효과를 발휘하기에 효과적인 양으로 투여된다. 용어 "효과적인 양"은 원하는 생물학적 효과를 실현하기에 요구되거나 충분한 양을 지칭한다. 가령, 효과적인 양은 종양, 암, 또는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 제거하기에 요구되는 양일 수 있다. 임의의 특정한 용도를 위한 효과적인 양은 치료되는 질환 또는 장애, 투여되는 특정한 항체, 개체의 크기, 또는 질환 또는 장애의 중증도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 끝없이 실험할 필요없이 특정한 분자의 효과적인 양을 경험적으로 결정할 수 있다.
백신을 위한 바람직한 투여의 경로는 예를 들면, 주사 (가령, 피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 척추강내)를 포함한다. 주사는 볼루스 또는 연속적 주입으로 이루어질 수 있다. 다른 투여의 경로는 경구 투여를 포함한다.
본 발명의 항체 및 이중특이적 분자는 또한 어쥬번트 및 다른 치료제와 함께 병용투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "병용투여된"은 투여 계획의 일부로서 투여하는 것을 비롯하여 본 발명의 항체 및 접합체를 어쥬번트 및 다른 물질과 함께 동시적, 단독적, 또는 순차적으로 투여하는 것의 어느 하나 또는 모두를 포함한다는 점이 이해될 것이다. 항체는 전형적으로, 담체 만으로 또는 그러한 물질과 조합으로 제형화된다. 그러한 담체의 예는 용액, 용매, 분산매, 지연제, 에멀전 등을 포함한다. 제약학적으로 활성인 물질을 위한 그러한 매체의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 분자와 사용하기에 적절한 임의의 다른 종래의 담체가 본 발명의 범위내에 속한다.
항체, 접합체, 이중특이적 물질, 그리고 조성물과 함께 병용-투여하기에 적절한 물질은 다른 항체, 세포독소 및/또는 약물, 그뿐 아니라 어쥬번트, 면역촉진제 및/또는 면역억제제를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 물질은 화학요법제이다. 항체, 이중특이적 물질, 그리고 조성물은 방사선과 병용으로 투여될 수 있다.
종양의 치료에서 본 발명의 항체 및 접합체와 함께 병용투여하기에 적절한 화학요법제는 예를 들면: 탁솔(taxol), 시토칼라신 (cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신(anthracin) 디온, 미토잔트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 그리고 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동종체를 포함한다. 추가적인 물질은 예를 들면, 항대사물질 (가령, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(decarbazine)), 알킬화제 (가령, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine) (BSNU) 및 로무스틴(lomustine) (CCNU), 시클로포스파미드, 부설판(busulfan), 디브로모만니톨, 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신(mitomycin) C, 그리고 cis-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안트라시클린(anthracycline) (가령, 다우노루비신(daunorubicin) (정식으로는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제 (가령, 닥티노마이신(dactinomycin) (정식으로는 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 그리고 안트라마이신(anthramycin) (AMC)), 그리고 항-유사분열제 (가령, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine)) 및 테모졸로미드(temozolomide)를 포함한다.
예를 들면, 면역 세포 (예를 들면 조절 T-세포, NKT 세포, 대식세포, 골수-유래된 억제제 세포, 미성숙 또는 억제적 수상돌기 세포) 또는 종양의 국부 미세환경에서 종양 또는 숙주 세포에 의해 생산되는 억제 인자 (예를 들면, TGF베타, 인돌아민 2,3 디옥시게나제 - IDO)에 의해 면역억제적 활성을 제거하거나 저해하는 물질이 또한 본 발명의 항체 및 접합체와 함께 투여될 수 있다. 그러한 물질은 항체 및 소형 분자 약물 가령 1 메틸 트립토판 또는 유도체와 같은 IDO 저해제를 포함한다.
그러한 면역 질환의 치료를 위해 본 발명의 항체 및 이중특이적 물질과 병용투여하기에 적절한 물질은 예를 들면, 면역억제제 가령 라파마이신(rapamycin), 시클로스포린(cyclosporin) 및 FK506; 항-TNFa 물질 가령 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab) 및 인플릭시맙(infliximab); 그리고 스테로이드를 포함한다. 특유한 자연 및 합성 스테로이드의 예는 예를 들면: 알도스테론(aldosterone), 베클로메타손(beclomethasone), 베타메타손(betamethasone), 부데소니드(budesonide), 클로프레드놀(cloprednol), 코르티손(cortisone), 코르티바졸(cortivazol), 데옥시코르톤(deoxycortone), 데소니드(desonide), 데속시메타손(desoximetasone), 덱사메타손(dexamethasone), 디플루오로코르톨론(difluorocortolone), 플루클로롤론(fluclorolone), 플루메타손(flumethasone), 플루니솔리드(flunisolide), 플루오시놀론(fluocinolone), 플루오시노니드(fluocinonide), 플루오코르틴(fluocortin) 부틸, 플루오로코르티손(fluorocortisone), 플루오로코르톨론(fluorocortolone), 플루오로메톨론(fluorometholone), 플루란드레놀론(flurandrenolone), 플루티카손(fluticasone), 할시노니드(halcinonide), 히드로코르티손(hydrocortisone), 이코메타손(icomethasone), 메프레드니손(meprednisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 파라메타손(paramethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 틱소코르톨(tixocortol) 및 트리암시놀론(triamcinolone)을 포함한다.
면역 반응의 유도 또는 증강을 위해 본 발명의 항체 및 이중특이적 물질과 함께 병용투여하기에 적절한 물질은 예를 들면, 어쥬번트 및/또는 면역촉진제를 포함하며, 이들 중 비-제한적인 예가 상기에 개시되어 있다. 바람직한 면역촉진제는 TLR3 작동약, 가령 폴리 IC이다.
본 발명은 추가로 다음 실시예에 의해 예시되는데 이들은 추가적인 제한으로서 간주되어서는 안된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 서열 목록, 도면 및 모든 참고 문헌, 특허 및 공개공보의 내용은 명백하게 참고로서 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1
CD27 -특이적 인간 단클론 항체의 산출
인간 항-CD27 단클론 항체는 HuMAb®유전자도입 생쥐의 HC2/KCo7 계통 ("HuMAb"는 Medarex, Inc. (Princeton, New Jersey)의 상표명이다)을 가용성 인간 CD27 항원으로 면역화시킴으로써 산출되었다. HC2/KCo7 HuMAb 생쥐는 U.S. 특허 제5,770,429호 및 제5,545,806호에서 기술된 바와 같이 산출되고, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다.
항원 및 면역화: 항원은 항체 Fc 도메인 (재조합 인간 CD27-Fc 키메라 단백질 (R&D Systems)과 융합된 CD27 세포외 도메인을 포함하는 가용성 융합 단백질이었다. 항원을 1차 면역화를 위해 완전 프로인드 (Sigma) 어쥬번트와 혼합했다. 그 후에, 항원을 불완전 프로인드 (Sigma)와 혼합했다. 추가적인 생쥐를 RIBI MPL 더하기 TDM 어쥬번트 시스템 (Sigma) 내 가용성 CD27 단백질을 이용하여 면역화했다. 5-25 마이크로그램의 PBS 내 가용성 재조합 CD27 항원 또는 PBS 내 인간 CD27의 표면 발현을 위해 형질감염된 5 x 106 CHO 세포를 1:1로 어쥬번트와 혼합했다. 생쥐에 100 마이크로리터의 제조된 항원을 복강내로 매 14일 마다 주사했다. 융합하기 3-4일 전에 항-CD27 역가가 발생한 동물에 10 마이크로그램의 가용성 재조합 CD27 항원으로 iv 주사했다. 생쥐 비장을 수확하고, 단리된 비장 세포를 하이브리도마 제조를 위해 사용했다.
하이브리도마 제조: P3x63Ag8.653 쥐 골수종 세포주 (ATCC CRL 1580)를 이들 융합에 사용했다. 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 (Invitrogen)를 골수종 세포를 배양하기 위해 사용했다. 추가적인 배지 보충물질을 하이브리도마 성장 배지에 부가했고, 상기 배지는 다음을 포함했다: 3% Origen-하이브리도마 클로닝 인자 (Igen), 10% FBS (Sigma), L-글루타민 (Gibco) 0.1% 젠타마이신 (Gibco), 2-메르캅토에탄올 (Gibco), HAT (Sigma; 1.0 x 104 M 히폭산틴, 4.0 x 10-7 M 아미노프테린, 1.6 x 10-5 M 티미딘), 또는 HT (Sigma; 1.0 x 10-4 M 히폭산틴, 1.6 x 10-5 M 티미딘) 배지.
비장 세포를 6:1 비율로 P3x63Ag8.653골수종 세포와 혼합하고 원심분리를 통해 펠렛화했다. 융합을 촉진하기 위해 조심스럽게 혼합하면서 폴리에틸렌 글리콜을 점적하여 부가했다. 하이브리도마를 가시적 집락이 확립될 때까지 1 내지 2주 동안 길렀다. 상층액을 수확하고, 인간 카파 사슬 특이적 포획 및 인간 Fc 특이적 검출을 이용한 ELISA를 통해 인간 IgG에 대한 초기 스크리닝에 사용했다. IgG 양성 상층액은 이후, 유세포분석법에 의해 또는 항-CD27을 검출하는 ELISA를 이용하여 CD27 특이성에 대해 분석평가되었다.
특유한 인간 단클론 항체 (인간 mAb; IgG)를 생산하는 하이브리도마를 계대클로닝하고 증가시켰다. 생산된 인간 mAb를 이후, 표준 조건에 따라 단백질 A 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하고, 이것은 특정한 목적되는 다수의 항체의 분리를 유발하고, 이들 항체는 4B7-1B3 (본 명세서에서 4B7로 지칭됨), 3H12-1C8 (본 명세서에서 3H12로 지칭됨), 1F5-1H5 (본 명세서에서 1F5로 지칭됨), 2C2-1A10 (본 명세서에서 2C2로 지칭됨), 2G9-1D11 (본 명세서에서 2G9로 지칭됨), 1H8-B4 (본 명세서에서 1H8로 지칭됨), 3H12-1E12 (본 명세서에서 3H12로 지칭됨), 3G1-1A11 (본 명세서에서 3G1로 지칭됨) (1B10), 4A2-B11 (본 명세서에서 4A2로 지칭됨), 3A10-G10 (본 명세서에서 3A10로 지칭됨), 2G11-B5 (본 명세서에서 2G11로 지칭됨), 4H11-G11 (본 명세서에서 4H11로 지칭됨), 2H3-E8 (본 명세서에서 2H3으로 지칭됨), 4A7-B3 (본 명세서에서 4A7로 지칭됨), 3H8-1B11 (본 명세서에서 3H8로 지칭됨) 및 1G5-1B9 (본 명세서에서 1G5로 지칭됨)로서 표시되었다. 이들 하이브리도마를 또한, 히말라야 짧은꼬리원숭이(rhesus macaque) CD27과의 교차 반응에 대해 선별했고 모두 결합에 대해 양성이었다.
실시예 2
표면 플라즈몬 공명 ( SPR )에 의한 인간 mAb 의 친화성 및 속도 상수의 측정
실시예 1로부터의 다양한 인간 항-CD27 항체의 결합 친화성 및 결합 동역학을 제조업체의 가이드라인에 따라 비아코어TM 2000 SPR 장비 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 비아코어TM 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석으로 검사했다.
정제된 재조합 인간 CD27/TNFRSF7/Fc 키메라 (R&D Systems 카탈로그 번호 382-CD) 단백질을 제조업체의 가이드라인에 따라 비아코어에서 제공하는 아민 커플링 키트(커플링 시약 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 염산염 (EDC)을 포함, 비아코어 제품번호 BR-1000-50)와 함께 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 비아코어TM CM5 센서 칩 (금 표면에 공유적으로 부착된 카르복시메틸화 덱스트란; 비아코어 제품번호 BR-1000-14)에 공유적으로 연결시켰다. 동역학 파라미터에 있어서 분석대상의 다량 이동의 임의의 영향을 제한하기 위해 낮은 수준의 리간드를 고정시켰고, 그러므로 관찰된 RMAX는 100-400 RU의 규모였다.
HBS-EP 완충액 (HBS-EP 완충액, 비아코어 제품번호 BR-1001-88: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) 0.01M, 염화나트륨 0.15M 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 3mM, 계면활성제 P20 0.005%)내에서, 1.56 내지 50 nM 범위의 농도 및 180 초 동안 30 ㎕/분의 유동 속도로 센서 칩 위로 항체를 유동시켜 결합을 측정했다. 항원-항체 연합 및 해리 동역학은 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체에 있어서 480 초 또는 1200 초 동안 이어졌다.
상응하는 대조는 각각의 경우에서 "백그라운드" 감산을 위해 어떠한 단백질도 고정되지 않은 블랭크 유세포를 이용하여 수행했다. 10 mM HCl을 10 초 동안 50 ㎕/min으로 이후 pH 2.0의 10mM 글리신을 30 초 동안 50 ㎕/min으로 순차적으로 주사하는 것을 연구 전반의 재생성 조건으로서 사용하였다.
비아코어의 비아에발류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 버전 3.2 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 각각의 경우에서 HBS-EP 러닝(running) 완충액에 희석된 분석대상의 농도 일련으로부터 동역학 파라미터를 유도하기 위해 사용했다. 연합 및 해리 곡선을 제조업체의 가이드라인에 따라 비아코어TM 비아에발류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 (Biacore AB)를 이용하여 1:1 랭뮤이어(Langmuir) 결합 모델에 정합시켰다.
측정된 친화성 및 동역학 파라미터 (백그라운드가 감산된 것)가 도 1에 나타난다.
각각의 항체에 대해, 나타낸 도면은 각각의 경우에 단독적으로 제조된 유세포를 이용한 두 번의 단독적인 일련의 실험의 평균이다 (여기서 ka = 연합의 속도 상수, kd = 해리의 속도 상수, KD = 해리 평형 상수 (친화성의 척도), KA = 연합 평형 상수, Rmax = 최대 SPR 반응 신호).
실시예 3
CD27 에서 인간 mAb 결합 특징을 측정하는 ELISA 분석평가
마이크로역가 평판을 PBS 내 가용성 또는 재조합 인간 또는 짧은꼬리원숭이 CD27로 코팅하고, 이후 PBS 내 5% 소 혈청 알부민으로 차단했다. 단백질 A 정제된 인간 mAb 및 아이소타입 대조를 포화 농도로 부가하고 37 ℃에서 배양했다. 평판을 PBS/Tween으로 세척하고 이후 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클론 시약으로 37 ℃에서 배양했다. 세척후에, 평판을 pNPP 기질 (1 mg/㎖)을 이용하여 전개시키고, 마이크로역가 평판 판독기를 이용하여 OD 405-650에서 분석했다. 대표적인 결합 곡선이 도 2에 나타난다. 또한 결과를 하기 표 1에 나타낸 50% 포화 농도 (4-파라미터 정합 곡선에서 C 값)를 추정하기 위해 사용했다.
짧은꼬리원숭이가 항-CD27 mAb를 검사하기 위한 연관된 모델인 것을 확립하기 위해, 다양한 농도의 정제된 짧은꼬리원숭이 CD27 또는 인간 CD27를 ELISA 평판에 항-Flag 항체와 함께 포착시키고, 이후 항-인간 CD27 mAb와 함께 배양했다. 염소 항-인간 IgG Fc-HRP 항체 및 기질 수퍼 블루(Super Blue) TMB를 검출을 위해 사용했다. 결과가 표 1에 나타나며, 이는 짧은꼬리원숭이 및 인간으로부터의 CD27에 대한 유사한 결합을 의미한다. 항체 1F5에 대한 대표적인 결합 곡선 역시 도 3에 도시된다.
선별된 항- CD27 mAb 의 특성화
mAb 인간 CD27에 대한
반-극대 결합(M) ** 		인간 CD27에 대한
반-극대 결합(㎍/㎖) ** 		원숭이 CD27에 대한
반-극대 결합(㎍/㎖) **
1 G5 4.9E-10 0.074 0.065
1 H8 4.3E-10 0.064 0.105
3 H12 5.7E-10 0.085 0.123
3 H8 4.6E-10 0.069 0.065
2 G9 4.3E-10 0.064 0.069
1F5 3.9E-10 0.059 0.12
3A10 6.3E-10 0.094 결합 없음
2 C2 3.0E-10 0.045 0.034
** ELISA 형식에서 CD27 코팅된 평판에 결합에 의해 예측됨
추가의 실험에서, 말초혈 세포에 결합하는 1F5의 유사한 분포를 확립하기 위해, PBMC를 3 명의 인간 및 3 마리의 시아노몰구스(cynomolgus) 짧은꼬리원숭이의 전혈로부터 단리했다. CD27을 발현하는 주요 T 세포 및 B 세포 집단을 묘사하기 위해 세포를 마커(marker)와 함께 1F5로 염색했다. 다음의 표 (표 2)는 CD27을 발현하는 세포의 백분율 및 발현의 강도 (MFI)와 관련한 인간 및 짧은꼬리원숭이 세포의 결과의 평균 ± 표준 편차를 요약한다. 이들 데이터는 인간과 원숭이로부터 말초혈 세포에 결합하는 1F5의 유사한 분포를 확립한다.
특성분석 CD4 + T 세포 CD8 + T 세포 B 세포( CD20 +) NK 세포
인간 원숭이 인간 원숭이 인간 원숭이 인간 원숭이
% CD27+b 84±5 81±1 70±12 90±1 37±4 15±1 11±4 88±6
MFIc 1517±123 416±14 1415±153 519±11 893±101 491±113 667±28 1050±42
실시예 4
4A: ELISA 에 의한 sCD70 결합의 차단
CD27 단백질에의 가용성 CD70 (sCD70)의 결합에 대한 실시예 1로부터의 인간 mAb의 효과를 ELISA를 통해 측정했다. 마이크로역가 평판을 R&D Systems의 1 ㎍/㎖ 가용성 재조합 인간 CD27/Fc 키메라를 1㎍/㎖.로 코팅하고, 이후 5% PBA로 차단했다. 항-CD27 항체 ([최종] = 25㎍/㎖)를 US Biologicals의 가용성 인간 재조합 CD70-비오틴으로 예비혼합하고 ([최종] = 0.5㎍/㎖) 및 평판에 부가했다. CD27-포착된 rCD70을 스트렙타비딘-HRP 및 기질 수퍼 블루 TMB로 검출했다. 결과 (% 차단으로 나타냄)는 지시되는 바와 같은 대조와 함께 도 4에 나타난다. 이들 결과는 여러 항체 (1F5, 1H8, 3H12 및 1A4를 포함)가 sCD70의 결합을 차단 또는 적어도 유의미하게 저해하는 특성을 가짐을 나타낸다.
4B: CD27 mAb 는 인간 림프아구성 세포주 상의 CD27 에 결합하고 리간드 ( CD70 ) 결합을 차단한다
인간 림프아구성 세포주에 대한 항-인간 CD27 mAb 1F5의 결합, 및 sCD70 결합의 차단을 Becton Dickinson FACSCanto II 유세포분석기를 이용하여 유세포분석법으로 분석했다. 결과가 도 5에 나타나고, 1F5가 다양한 세포주에 효과적으로 결합하고 sCD70의 결합을 경쟁적으로 저해함을 나타낸다.
실시예 5
인간 CD27 을 발현하는 세포에 대한 인간 mAb 의 결합
표면에 인간 CD27을 발현하는 세포상의 CD27에 결합하는 항-CD27 인간 mAb의 능력을 다음과 같이 유세포분석법으로 조사했다.
표면에 인간 CD27을 발현하는 인간 세포주에의 결합에 대해 항체를 검사했다. 단백질 A 정제된 인간 mAb 2C2, 3H8 및 1F5를 인간 CD27을 발현하는 Jurkat, Raji, Ramos 및 Daudi 세포뿐 아니라 대조 세포와 함께 4℃에서 배양했다. 모든 항체는 포화 농도로 사용했다. 1 시간 후에, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3 (PBA)를 함유하는 PBS로 세척하고 결합된 항체는 세포를 PE 표지된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 탐침과 함께, 4℃에서 배양하여 검출했다. 세포로부터 과량의 탐침을 PBA로 세척하고 세포 연관된 형광을 제조업체의 설명에 따라 LSRTM 장비 (BD Biosciences, NJ, USA)를 사용하는 분석에 의해 측정했다.
도 6 및 7에 나타난 바와 같이, 인간 mAb는 인간 CD27을 발현하는 세포에 대해 높은 수준의 결합을 나타냈다. 이들 데이터는 이들 항체가 대조 세포에 비하여 생존 세포에서 발현된 인간 CD27에 효율적이고 특이적으로 결합함을 나타낸다.
실시예 6
ELISA 에 의해 결정된 인간 mAb 의 교차-차단/경쟁
마이크로역가 평판을 재조합 인간 CD27-Fc 키메라 융합 단백질로 코팅하고, 이후 PBS 내 5% BSA로 차단했다. 접합되지 않은 인간 mAb (20 ㎍/㎖)를 양고추냉이 과산화효소로 표지된 두 번째 항체 (0.5 ㎍/㎖)와 혼합하고, 이후 평판에 부가하고 37℃에서 배양했다. 평판을 PBS/Tween으로 세척하고 TMB 기질로 전개하고 OD 450에서 마이크로역가 평판 판독기를 이용하여 분석했다. 도 8 내지 10에 나타낸 결과는 첫 번째 세트의 인간 mAb (mAb 1F5, 1H8 및 3H12을 포함)가 서로 교차-경쟁했음(도 8 참조), 추가적인 세트의 인간 mAb (mAb 2C2, 3H8, 1G5, 그리고 2G9를 포함)가 또한 서로 교차-경쟁했음 (도 9 참조), 그리고 인간 mAb 3A10이 고유한 에피토프에 결합하지만, 이들 항체가 CD27에 대한 3A10의 결합을 부분적으로 교차-차단할 수 있기 때문에, mAb 1F5, 1H8, 그리고 3H12의 결합 부위와 구별되지만 가능하게는 가까운 부위에 결합할 수 있음 (도 10 참조)을 알려준다.
실시예 7
보체 의존성 세포 세포독성 ( CDCC 또는 CDC )
표적 세포 (림프종 Raji 세포)를 37℃, 5% CO2에서 항-CD27 항체 및 토끼 보체의 존재에서 (1:15의 최종 희석도) 150㎕의 최종 부피로 1-2시간 동안 (AIM-V 배지에서) 배양했다. 누출 신호 (표적 단독) 및 MAX 신호 (4%의 최종 농도에 대해 12%의 LysolTM 세제를 갖는 표적)를 갖는 적절한 대조를 또한 포함시켰다. 세포를 1 x 106/㎖로 조정하고 50㎕을 각 웰에 부가했다 (50,000 세포/웰을 제공하기 위함). 이후 웰을 재현탁시키고 100㎕의 세포 현탁액을 불투명, 백색 평판으로 옮겼다. 이들 웰 각각에, 100㎕의 Promega 세포역가 Glo 시약을 부가하고, 평판을 실온에서 2 분간 혼합했다. 발광 신호를 안정화하기 위해 평판을 10 분 동안 배양되도록 두었다. 발광을 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기에서 기록했다. 세포독성을 하기 공식: (100-((샘플 - MAX)/(누출 - MAX))) x 100으로 결정했다. 결과 (% 용해로서 표시됨)는 도 11에 도시되며, 이로부터 다수의 항-CD27 항체가 유의미한 CDCC 활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
추가의 실험에서, 표적 세포 (Ramos 세포)를 세척하고 Calcein AM (Molecular Probes)을 로딩했다. 이후 로딩된 세포를 다시 세척하고 배양 배지 (RPMI + 10% FBS) 내 1x106/㎖로 재현탁했다. 표적 세포를 37℃, 5% CO2에서 항-CD27 항체 및 토끼 보체의 존재에서 (1:15의 최종 희석도) 150㎕의 최종 부피로 2시간 동안 배양했다. 누출 신호 (표적 단독) 및 MAX 신호 (2%의 최종 농도에 대해 20%의 Triton X-100을 갖는 표적)를 갖는 적절한 대조를 또한 포함시켰다. 배양 후에, 웰로부터 75㎕의 상층액을 불투명, 검정 평판으로 옮겼다. 형광 (Ex 485; Em 535)을 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기에서 기록했다. 특이적인 세포독성을 하기 공식을 이용하여 결정했다: (실험적 - 자발적 용해)/(최대 용해 - 자발적 용해) x 100. 도 12에 도시된 결과는 항-CD27 mAb (1F5)가 Ramos 세포에서 3㎍/㎖의 항체 농도에서 적어도 10% CDC 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 8
항체 의존성 세포- 매개된 세포독성 ( ADCC )
표적 세포 (림프종 Raji 세포)를 세척하고 BATDA 시약 (Perkin Elmer)으로 로딩했다. 로딩된 세포를 이후 다시 세척하고 배양 배지 (RPMI + 10% FBS) 내에 2x105/㎖로 재현탁했다. 효과기 세포를 제조하고 배양 배지에서 적절한 농도로 조정하여 원하는 효과기:표적 비율 (100:1 - 50:1)을 수득했다. 둥근 바닥 평판에서, 표적 세포, 효과기 세포 및 항체를 150㎕의 최종 부피로 부가했다. 적절한 대조를 사용했고, 이것은 누출 신호 (표적 단독), 자발적 용해 신호 (표적 + 효과기), 그리고 최대 용해 신호 (표적 + 4%의 최종 농도에 대해 12%의 LysolTM 세정제)를 포함한다. 세포을 평판에서 펠렛화하고 37℃, 5% CO2에서 2 시간 동안 배양했다. 배양 후에, 웰로부터의 20㎕의 상층액을 불투명, 백색 평판으로 옮겼다. 이들 각각의 웰에, 200㎕의 Europium 용액 (Perkin Elmer)을 부가하고 평판을 15 분 동안 혼합했다. 시간-분해(Time-resolved) 형광은 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기에서 기록했다. 특이적인 세포독성을 하기 공식을 이용하여 결정했다: (실험적 - 자발적 용해)/(최대 용해 - 자발적 용해) x 100. 결과 (% 용해로서 제시됨)가 도 13에 도시되며, 이로부터 다수의 항-CD27 항체가 유의미한 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
추가의 실험에서, 표적 세포 (림프종 Ramos 및 Daudi 세포)를 세척하고 Calcein AM (Molecular Probe)으로 로딩했다. 로딩된 세포를 이후, 다시 세척하고 배양 배지 (RPMI + 10% FBS)에서 1x105/㎖로 재현탁시켰다. 효과기 세포를 제조하고, 원하는 효과기:표적 비율 (75:1)을 산출하기 위해 배양 배지 내 적절한 농도로 조정하였다. 둥근 바닥 평판에서, 표적 세포, 효과기 세포 및 항체를 150㎕의 최종 부피로 부가했다. 누출 신호 (표적 단독), 자발적 용해 신호 (표적 + 효과기), 그리고 최대 용해 신호 (표적 + 2%의 최종 농도에 대해 20%의 Triton X-100)를 포함하는 적절한 대조를 이용했다. 세포를 평판에서 펠렛화하고 37℃, 5%CO2에서 4시간 동안 배양했다. 배양 이후에, 웰로부터 75㎕의 상층액을 불투명, 검은색 평판으로 옮겼다. 형광 (Ex 485; Em 535)을 Perkin Elmer Victor X4 평판 판독기에서 기록했다. 특이적인 세포독성을 하기 공식을 이용하여 결정했다: (실험적 - 자발적 용해)/(최대 용해 - 자발적 용해) x 100. 도 14에 도시된 결과는 항-CD27 mAb (1F5)가 3㎍/㎖의 항체 농도 및 75:1의 효과기: 표적 세포의 비율의 Daudi와 Ramos 세포에서 적어도 10% ADCC 활성 (특이적인 세포독성으로서 측정됨)을 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 9
항체 염기서열분석
실시예 1에서 앞서 기술된 바와 같이, 특이적인 인간 mAb IgG를 생산하는 하이브리도마로부터의 인간 mAb를 단백질 A 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이것은 특정한 목적되는 항체 (인간 mAb)의 패널의 분리를 유발하였다. 인간 mAb 4B7, 3H12, 1F5, 2C2, 2G9, 1H8, 3H12, 3G1 (1B10) 4A2, 3A10, 2G11, 4H11, 2H3, 4A7, 3H8 및 1G5의 VH와 VL 코딩 영역은 상응하는 하이브리도마로부터 RNA를 이용하여 확인했다. RNA를 cDNA로 역전사하고, V 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭하고, 그리고 PCR 산물을 염기서열분석했다. 하기는 인간 mAb의 VH와 VL 영역의 핵산과 아미노산 서열이다 (아미노산 서열의 경우에, 상보성 결정 영역 (CDR)은 밑줄로 표시된다).
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Figure 112012091474877-pct00018
정렬은 도 15와 16에 도시된다.
실시예 10
생체내 비-인간 영장류 연구
비-인간 영장류에서 항-인간 CD27 mAb 1F5의 내성을 평가하기 위해, 3마리 시아노몰구스 원숭이를 1, 3 또는 10 ㎎/㎏의 1F5의 1회 i.v. 투약으로 처리했다. 동물을 29일 동안 추적했다. 총 림프구 (측방과 전방 산란 크기에 기초됨), 기억 B 세포 (CD20+와 CD95 브라이트(bright)), 그리고 단핵구 (측방과 전방 산란 크기에 기초됨)를 항-인간 IgG 항체 (굵은 선)로 염색하고 염색되지 않은 대조 (음영처리 부분)와 비교했다. 결과가 도 17에 나타난다. 이들 결과는 1F5 mAb가 연구의 전 기간 동안 CD27을 발현하는 것으로 공지인 순환 림프구의 표면에 결합했음을 나타낸다. CD27를 발현하지 않는 세포인 단핵구는 1F5 결합을 갖지 않았다.
게다가, 순환 림프구 집단에 대한 1F5의 영향을 측정하기 위해, 림프구를 하위 집합의 마커로 염색하고 도 17에서 시간에 대해 도시된 % 양성 세포를 상이한 용량(사각형 점 = 1 ㎎/㎏; 원형 점 = 3 ㎎/㎏; 삼각형 점 = 10 ㎎/㎏)으로 처리된 각각의 동물에 대해 도시했다. 결과가 도 18에 나타난다.
종합적으로, 도 17 및 18에 나타난 이들 연구로부터의 결과는 단일 1 - 10 ㎎/㎏ 투여 후 1F5가 우수하게 내화되었고 순환 림프구를 (NK 세포의 일부 일시적인 고갈 외에)유의미하게 고갈시키지 않았음을 입증한다. 게다가, 어떠한 체온 상승 및 검출가능한 수준의 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β도 존재하지 않았다.
실시예 11
항- CD27 mAb 는 항원-특이적 CD8 + T-세포 증식 및 생쥐 말초혈 세포 및 비장 세포에서 펜타머 염색 활성화를 증강시켰다
인간 CD27 유전자도입 생쥐 (huCD27-Tg)에 5 mg의 닭 오브알부민 및 실시예 1에서와 같이 생성된 인간 CD27를 인식하는 전부 인간인 항체의 패널 (CD27 인간 mAb)을 정맥으로 주사했다. 래트(Rat) 항-생쥐 CD27 클론 AT124 및 관련없는 인간 IgG1을 양성 및 음성 대조로서, 각각 포함했다. 각각의 항체 (250 ㎍)를 제0일에 오브알부민과 함께 동시-주사하고 제1일에 추가적인 250 ㎍의 항체 단독으로 주사했다. 말초혈 및 비장 세포는 제7일에 수확했다. 비장 세포 (1x 106) 또는 전혈 (100 ㎕)을 염색을 위해 사용했다. Fc-수용체를 차단한 후에, 세포를 10 ㎕의, 오브알부민 (Beckman Coulter)으로부터의 펩티드 T 세포 에피토프와 복합체를 이룬 생쥐 MHC의 테트라머 복합체인 H-2Kb/SIINFEKL(서열 번호: 119), 또는 유사한 펜타머 복합체 (ProImmune), 항-CD8 (eBioscience) 및 항-huCD27 mAb 또는 항-msCD27 mAb (BD Biosciences)로 실온에서 30 분 동안 염색했다. 이후 세포를 RBC-용해하고, 세척하고 고정하고, 적어도 100,000 회(event)를 유세포분석기(Flow Cytometer) LSR (BD Biosciences)에서 획득했다. CD8+ 또는 CD27+ 게이팅된 집단 내 테트라머- 또는 펜타머-양성 세포의 분율을 측정했다. 결과가 도 19 및 21에 나타나며 이로부터 항-CD27 항체가 면역 반응을 유의미하게 증강했음을 확인할 수 있다.
실시예 12
ELISPOT 분석평가
상기 실시예 8의 펜타머 염색 표본으로부터의 비장 세포 (2.5 x 105 및 0.5 x 105)를 RBC 용해 후 항-IFNγ 단클론 항체 (mAb) 코팅된 평판에 삼중복 웰로 배치했다. SIINFEKL(서열 번호: 119) 펩티드를 2 ㎍/㎖의 최종 농도로 부가했다. 백그라운드 대조를 펩티드의 부재에서 삼중복으로 된 각 샘플에 대해 설정했다. 자극을 조직 배양 항온기에서 밤새 37 ℃로 유지했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISPOT 키트 (BD Biosciences)를 이용하여 ELISPOT 검출을 수행했다. IFNγ-스폿 개수를 계수했다. 결과가 도 20 및 21에 나타나며, 이로부터 항-CD27 mAb가 T-세포 활성을 유의미하게 증강했음을 확인할 수 있다.
실시예 13
항- CD27 mAb 가 백신 항원에 대한 T 세포 반응을 증강시킨다
HuCD27 유전자도입 생쥐를 오브알부민 (OVA) (α-mDEC-205-OVA로 지칭됨)에 융합된 항-생쥐 DEC-205 IgG 항체를 포함하는 5 ㎍ (s.c.)의 APC-표적화된 백신으로, 다양한 용량 (25, 50, 100, 200 또는 400 ㎍)의 항-CD27 인간 mAb 1F5 (i.p.)과 조합으로 면역화했다. 일주일 후에 비장 세포를 OVA SIINFEKL(서열 번호: 119) 펩티드 (OVA 펩티드 257- 264)에 대한 CD8+ T 세포 반응 (나타난 모든 CD8+의 % 테트라머 양성)을 테트라머 염색에 의해 그리고 각각 실시예 8 및 9에 일반적으로 기술된 절차에 의해 IFN-γ ELISPOT에 대해 분석했다. 결과가 도 22A-C에 나타나며, 여기서 도 22A는 사용된 프로토콜을 나타내고, 도 22B는 테트라머 염색 실험의 결과를 나타내고 도 22C는 IFN-감마 ELISPOT 실험의 결과를 나타낸다. 이들 결과는 병용-투여된 인간 mAb 1F5가 투여된 백신 성분에 대한 T-세포 반응을 유의미하게 증강했음을 의미한다.
실시예 14
백신 (항- DEC205 - OVA )에의 T 세포 반응에 대한 항- CD27 mAb (1F5) 및 TLR 작동약 ( 폴리 IC )의 상승 효과
huCD27-Tg (유전자도입) 및 야생형 (WT) 생쥐 형제(littermate)에 제-3일에 항-CD27 mAb 1F5 (50 ㎍)을 복막내로, 그리고 이후 제0일에 항-mDec205-OVA (5 ㎍)에 더하여 폴리 IC 0, 25, 50 또는 100 ㎍을 주사된 4개 발을 통해 피하로 주사했다. 제7일에 비장을 수집하고 테트라머 염색, IFNγ-ELISPOT 및 IFNγ-ICS에 의해 평가했다. 그룹당 3 생쥐로부터의 게이팅된 CD8 T 세포 중에서 양성 IFNγ-ICS의 평균 ± SD를 산출하고 대표적인 도트 선도(Dot Plot)의 패널을 수집했다. 도 23A-D에 나타난 결과는 항-CD27 인간 mAb가 투여된 백신 성분에 대한 T-세포 반응을 TLR3 작동약 폴리 IC와 함께 상승적으로 증강시키도록 작용했음을 의미한다.
실시예 15
TLR 작동약의 부재 또는 존재에서 Dec205 - 표적화된 백신 전에 항- CD27 mAb 의 투여
huCD27-Tg 생쥐 및 야생형 (WT) 형제에 도 28에 지시된 대로 백신과 관련된 다양한 일에 항-CD27 mAb (50 ㎍)로 복막내로, 그리고 제0일에 TLR 작동약 폴리 IC-LC (20 ㎍)를 더하거나 뺀 항-mDec205-OVA (5 ㎍)로 주사된 4개의 발을 통해 피하로 주사했다. 제7일에 비장을 수집하고 테트라머 염색 및 IFNγ-ELISPOT으로 평가했다. 게이팅된 CD8 T 세포 중에서 테트라머 염색의 대표적인 패널이 도 24 및 25에 나타난다. IFNγ-ELISPOT은 유사한 패턴을 나타냈다.
이들 결과는 놀랍게도, 항-CD27 항체가 TLR 작동약의 존재 또는 부재에서 백신과 병용으로 투여되는 경우에, 백신 전에, 예를 들면 백신 (항원)을 투여하기 하루 또는 그 이상 전에 항체가 투여되는 경우에서 T-세포 활성화가 더 높음을 나타낸다.
실시예 16
TCR 활성화와 조합된 항- CD27 mAb 가 인간 CD27 유전자도입 생쥐로부터의 T-세포를 활성화시킴
1F5 mAb의 T 세포 활성화 성능을 평가하기 위해, 비드를 이용한 음성 선별을 이용하여 hCD27-Tg 생쥐의 비장으로부터 T 세포를 정제했다. 세포를 CFSE로 표지하고 0.2㎍/㎖의 항-CD27 인간 mAb 1F5 또는 아이소타입 대조로 3일 동안 배양했다. 교차-연결 항-인간 IgG를 사용전에 내독소 제거 칼럼을 통해 통과시켰다. CD8 및 CD4 T 세포 중에서 IFNγ-ICS 및 CSFE 희석물이 도 26 및 27에 나타난다. TNFa-ICS는 IFNg와 동일한 패턴을 나타냈다. 도 26 및 27에 나타난 바와 같이, TCR 활성화와 조합된 경우에, 1F5 mAb는 시험관 내에서 T 세포로부터 증식 및 사이토킨 생산을 효과적으로 유발한다. 상기 데이터는 항-인간 IgG 및 T 세포 수용체 활성화 및 항-CD3 mAb 둘 다와의 교차-연결이 1F5 유도된 증식 및 사이토킨 생산을 위해 요구되었음을 나타낸다.
실시예 17
항- CD27 mAb 가 MO4 흑색종 시험감염 모델에서 백신의 효능을 증강시킨다
생체내에서 항-종양 활성을 평가하기 위해, huCD27-Tg 및 WT 대조인, 그룹당 8마리의 생쥐에 제0일에 0.3 x 105 MO4 세포를 피하로 접종했다. 제5일 및 제12일에, 이들 생쥐에 항-CD27 mAb 1F5 (50 ㎍)를 복막내로; 제8일 및 제15일에, 추가적인 용량의 CD27 HuMab (50 ㎍)을 주사하고 항-mDec205-OVA (5 ㎍)으로 면역화했다. 종양 성장을 직경측정기(caliper)로 한 주에 2 회 측정했다. 결과가 도 24에 나타난다.
추가의 연구에서, huCD27-Tg 및 WT 대조인, 그룹당 5마리의 생쥐에 제0일에 1 x 105 MO4 세포를 피하로 접종했다. 제5일 및 제12일에, 이들 생쥐에 항-mDec205-OVA (5 ㎍)에 더하여 TLR 작동약 폴리 IC-LC (10 ㎍)를 복막내로 면역화했다. 제6일 및 제13일에, 생쥐에 항-CD27 mAb 1F5 (50 ㎍)를 주사했다. 종양 성장을 도 285A에 예시된 프로토콜에 지시된 바와 같이 한 주에 2회 직경측정기로 측정했다. 도 28B, C 및 D에 나타난 결과는 종양 접종후 일의 개수의 함수로서 생쥐의 종양 크기에 대한 무 처리 (도 28B), 백신 처리 단독 (도 28C), 또는 항-CD27 처리와 조합된 백신 처리 (도 28D)의 효과를 나타낸다. 상기 결과는 항-CD27 mAb (1F5)와의 병용 치료가 종양 시험감염된 생쥐의 생존을 유의미하게 연장했음을 증명한다.
실시예 18
1F5는 BCL 1 B-림프종의 동계 유전자도입 생쥐 종양 시험감염 모델에서 강력한 항-종양 활성을 나타낸다
생체내에서 1F5의 항-종양 활성을 평가하기 위해, 9-10 hCD27 유전자도입 생쥐 (Balb/c 백그라운드)의 그룹을 제0일에 정맥으로 투여된 107 BCL1 B-림프종 세포로 시험감염시켰다. 이후 동물을 지시되는 바와 같이 5회 용량의 항-인간 CD27 mAb 1F5로 처리했다. 도 29A 및 29B에 나타난 바와 같이, 종양 시험감염된 생쥐의 생존을, 용량 의존적 방식으로 유의미하에 연장시켰다.
실시예 19
Raji 제노그래프 ( Xenograph ) SCID 생쥐 모델에서 종양 사멸
CB.17 SCID 생쥐 (Taconic에서 구매)를 병원체-없는 생쥐 설비에서 유지했다. 림프종 Raji 세포 (1 x 105)를 그룹당 4마리 생쥐의 SCID 생쥐에 피하로 주사했다. 제6일에, 이들 생쥐를 CD27 인간 mAb로 복강내 투여를 통해 용량당 0.5 mg 처리하고, 3주 동안 한 주에 2회 투여했다. 종양 성장을 한 주에 3회 직경측정기로 측정했다. 종양 성장 및 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석의 결과가 도 30A 및 30B에 나타나고, 이로부터 항-CD27 mAb가 종양 시험감염된 생쥐의 생존을 유의미하게 연장했음을 확인할 수 있다.
추가의 실험에서, CB.17 SCID 생쥐 (Taconic에서 구매)를 병원체-없는 생쥐 설비에서 유지했다. 인간 림프종 Raji 세포 (5 x 105)를 제0일에 그룹당 6마리 생쥐의 SCID 생쥐에 피하로 주사했다. 제5일에, 이들 생쥐를 항-CD27 mAb 1F5로 복강내 투여를 통해, 용량당 0.033, 0.1 또는 0.3 mg 처리하고 3주 동안 한 주에 2회 투여했다. 종양 성장을 한 주에 2회 직경측정기로 측정했다.
도 31A에 나타난 결과는 항-CD27 mAb (1F5)가 종양 성장을 유의미하게 저해했고 따라서 종양 시험감염된 생쥐의 생존을 유의미하게 연장했음을 의미한다. 데이터의 카플란-마이어 생존 선도가 또한 도 31B에 제공되며, 이는 대조 그룹에 비해 치료 그룹의 생쥐에서 중앙 생존이 적어도 10일 정도 증가했음을 나타낸다. 추가로 이종이식 실험을 1G5를 이용하여 수행했고 결과가 도 32에 나타난다.
실시예 20
Daudi 이종이식 SCID 생쥐 모델에서 종양 사멸
CB.17 SCID 생쥐 (Taconic에서 구매)를 병원체-없는 생쥐 설비에서 유지했다. 인간 림프종 Daudi 세포 (1 x 106)를 제0일에 그룹당 6마리 생쥐의 SCID 생쥐에 피하로 주사했다. 제5일에, 이들 생쥐를 항-CD27 mAb 1F5로 복강내 투여를 통해, 용량당 0.033, 0.1 또는 0.3 mg 처리하고 3주 동안 한 주에 2회 투여했다. 종양 성장을 한 주에 2회 직경측정기로 측정했다.
도 33에 나타난 결과는 항-CD27 mAb (1F5)가 종양 성장을 유의미하게 저해했고 (도 33A) 따라서 종양 시험감염된 생쥐의 생존을 유의미하게 연장했음을 의미한다 (도 33B의 카플란-마이어 선도).
실시예 21
Fc 수용체에 결합되지 않게 조작된 항- CD27 mAb 는 백신 항원에 대한 T 세포 반응을 증강시키지 않는다
HuCD27 유전자도입 생쥐를 항-CD27 인간 mAb 1F5 (i.p.) 또는 mAb 1F5 돌연변이 (Fc 수용체 결합을 방지하기 위해 Fc 부분이 돌연변이된 것) 또는 대조 IgG mAb와 조합된, 오브알부민 (OVA) (α-mDEC-205-OVA으로 지칭됨)에 융합된 항-생쥐 DEC-205 IgG 항체를 포함하는 5 ㎍ (s.c.)의 APC-표적화된 백신으로 면역화했다. 일주일 후에, 비장 세포를 일반적으로 기술되는 바와 같은 절차에 의한 IFN-γ ELISPOT을 통해 OVA SIINFEKL(서열 번호: 119) 펩티드 (OVA 펩티드 257- 264)에 대한 CD8+ T 세포 반응에 관하여 분석했다.
도 34에 나타난 결과는 변형된 인간 mAb 1F5가 백신에 대한 T-세포 반응을 증강시키지 않으며, 따라서 CD70/CD27 경로를 차단하기 위한 효과적인 물질이 될 것임을 입증한다.
균등물
당해 분야의 숙련가는 단순한 일상 실험만으로도, 본 명세서에서 기술된 본 발명의 특정한 구체예의 많은 균등물을 인식하게 되거나 알아낼 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 다음의 청구 범위에 의해 내포되는 것으로 의도된다.
서열 목록의 요약
Figure 112012091474877-pct00019
Figure 112012091474877-pct00020
Figure 112012091474877-pct00021
Figure 112012091474877-pct00022
Figure 112012091474877-pct00023
Figure 112012091474877-pct00024
SEQUENCE LISTING <110> KELER, TIBOR MARSH, HENRY C. HE, LIZHEN VITALE, LAURA A. THOMAS, LAWRENCE J. <120> ANTIBODIES THAT BIND HUMAN CD27 AND USES THEREOF <130> CDJ-367PC <140> PCT/US2011/032355 <141> 2011-04-13 <150> 61/471,459 <151> 2011-04-04 <150> 61/323,720 <151> 2010-04-13 <160> 120 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His 130 135 140 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu 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Gly Gln Leu 85 90 95 Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu 100 105 110 Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu 115 120 125 Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro 145 150 155 160 Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu 165 170 175 Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg 180 185 190 Pro <210> 3 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Arg Lys Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Lys Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys <210> 4 <211> 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cgaggacacg gctgtgtatt actgtgtgag ggaactgggg 360 atggactggt acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca 414 <210> 6 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Trp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Leu Gly Met Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 115 120 125 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Synthetic peptide <400> 10 Val Arg Glu Leu Gly Met Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttgac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcaa cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 12 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Asp Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 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ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 18 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 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Synthetic polynucleotide <400> 23 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcaactgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gcgactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatgacatac actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggaatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccacgaactc gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgtggg aggaactgct 360 gaccttgaac actgggacca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 405 <210> 24 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Val Gly Gly Thr Ala Asp Leu Glu His Trp Asp Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa a 381 <210> 30 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr 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atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagt tatgacatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctc 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtagtggt 360 aactggggtt tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 414 <210> 36 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Ala Arg Gly Ser Gly Asn Trp Gly Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatactt accctcggac 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atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcaatatc tatgacatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaatca atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca ttttgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtactcac 360 tgggggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 411 <210> 48 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Ile Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr Asp 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln 1 5 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Ala Arg Gly Thr His Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 54 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 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ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcaactgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcag cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaagggac tggagtgggt ggcacttcta tggtatgatg gtagccataa agactttgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctagatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agagggttta 360 gcagtacctg gtcactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 420 tca 423 <210> 60 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Leu Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Asp Phe Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val 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caacttatta ctgtcaacag tttaatactt accctcggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 66 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn 100 105 110 Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gcgactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cctcagtagc catgacatac actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggaatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccacgaactc gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgtgag aggaactgct 360 gaccttgaac actgggacca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 405 <210> 72 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Ser His Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gly Phe Thr Leu Ser Ser His Asp 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Val Arg Gly Thr Ala Asp Leu Glu His Trp Asp Gln 1 5 10 <210> 77 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt 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polynucleotide <400> 83 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtcat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc cggagtgggt ggcaattata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctggatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatggatgg 360 actactatgg ttcggggact taatgttttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 420 gtctcttca 429 <210> 84 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser 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gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac cttcggccaa 360 gggacacgac tggagattaa a 381 <210> 90 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Gln Asp Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 93 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Ala Ala Ser 1 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 95 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctt ctgctgctct ggctcccagg tgccagatgt 60 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac cttcggccaa 360 gggacacgac tggagattaa a 381 <210> 96 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Ser 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Gln Gly Ile Ser Ser Ala 1 5 <210> 99 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Ala Ala Ser 1 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 101 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcaacgt ctggattcac cttcagtagc tatgacatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttatt tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctc 300 caaatgaaca gcctgggaga cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtagtggt 360 aactggggtt tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 414 <210> 102 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Asp Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Gly Asn Trp Gly Phe Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 103 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Gly Asn Trp Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 106 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Ala Arg Gly Ser Gly Asn Trp Gly Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 107 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 107 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 180 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatactt accctcggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 108 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 108 Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 109 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Gln Gly Ile Ser Arg Trp 1 5 <210> 111 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Ala Ala Ser 1 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Gly, Glu, or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Leu, Gly, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly, Leu, Thr, Trp, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asn, Ala, Thr, His, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val, Thr, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Met, Pro, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Gly, Val, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Gly, Met, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Asp, His, Leu, Thr, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ala, Gly, Asn, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Asp, Phe, Val, or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Phe or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> His, Ile, Leu, or Tyr <400> 113 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Phe, Arg, or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asn, Thr, or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Phe, Leu, Pro, or Arg <400> 114 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Lys or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr, Asn, or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Glu or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Lys or Gln <400> 115 Ile Xaa Xaa Asp Gly Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 116 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ala or Asp <400> 116 Xaa Ala Ser 1 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ile, Ser, or His <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Tyr or His <400> 117 Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asp, Gly, or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Arg or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ala, Trp, or Tyr <400> 118 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus sp. <400> 119 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 120 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 120 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn 100 105 110 Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125

Claims (120)

  1. 인간 CD27에 결합하고, T-세포 매개된 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 단리된 단클론 항체로서, 상기 항체는 서열 번호 38을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 40을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3를 포함하는 것인 단리된 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (i) 서열 번호 37 및 43의 아미노산 서열에 각각 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역;
    (ii) 서열 번호 37 및 43의 아미노산 서열에 각각 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는
    (iii) 서열 번호 35 및 41의 핵산 서열에 각각 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 단리된 단클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 37 및 43의 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단리된 단클론 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 35 및 41의 핵산 서열 각각에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단리된 단클론 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 하기 성질 (a)∼(k) 중 적어도 하나를 나타내는 것인 단리된 단클론 항체:
    (a) 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 CD27에 대한 sCD70의 결합을 적어도 70% 차단하는 것;
    (b) 10-9 M 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안으로, 10+9 M-1 이상의 평형 연합 상수 Ka로 인간 CD27에 결합하는 것;
    (c) 3 ㎍/㎖의 항체 농도 및 약 6% 토끼 혈청 보체에서, 적어도 10%의 CD27 발현 세포의 특이적인 보체 매개된 세포독성(CDC)을 유도하는 것;
    (d) 3 ㎍/㎖의 항체 농도 및 75:1의 효과기:표적 세포의 비율에서, 적어도 10%의 CD27 발현 세포의 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC) 특이적 용해를 유도하는 것;
    (e) 생체내 종양 세포 접종(5 x 105개 Raji 세포 또는 1 x 106개 Daudi 세포) 후 중증 복합형 면역부전증(SCID) 생쥐에서, 3주 동안 적어도 주 2회 0.3 mg(i.p.)으로 투여될 때, 항체가 투여되지 않은 생쥐와 비교하여, 중앙 생존기간(median survival)을 적어도 20% 향상시키는 것;
    (f) 백신 또는 내인성 항원과의 조합으로 생체내 항원 특이적 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 것;
    (g) 백신 또는 내인성 항원과의 조합으로 생체내 항원 특이적 TH1 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 것;
    (h) 백신 또는 내인성 항원과의 조합으로 생체내 항원 특이적 T-세포 증식 또는 활성화를 유도하거나 증강시키는 것;
    (i) 동시적, 개별적 또는 순차적 TCR 활성화와 조합될 때 T-세포 활성을 유도하거나 증강시키는 것;
    (j) 짧은꼬리원숭이에서 29일의 기간에 걸쳐 3 ㎎/㎏(i.v.)으로 투여될 때 투여 직후 CD3+ T-세포(NK 세포 이외)의 50% 미만의 고갈을 유발하는 것; 또는
    (k) 짧은꼬리원숭이에서 29일의 기간에 걸쳐 3 ㎎/㎏(i.v.)으로 투여될 때 투여 직후 기억 B-세포의 50% 미만의 고갈을 유발하는 것.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE 항체인 것인 단리된 단클론 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인 것인 단리된 단클론 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 이 항체와 다른 결합 특이성을 갖는 제2 분자에 연결되어 있는 이중특이적 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 분자가 Fc 수용체, NK 수용체, 또는 CD3, CD40 및 CD25로 구성된 군에서 선택되는 T 세포 수용체에 결합하는 것인 이중특이적 분자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제10항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 및 담체를 포함하는, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 어쥬번트를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 면역촉진제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역촉진제가 CD40 리간드, FLT 3 리간드, 사이토킨, 집락 촉진 인자, 항-CTLA-4 항체, LPS(내독소), ssRNA, dsRNA, 바실리 칼메트-게랭(BCG), 레바미솔 염산염, 정맥주사용 면역글로불린 및 Toll-유사 수용체(TLR) 작동약으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체 작동약이 TLR3 작동약, TLR4 작동약, TLR5 작동약, TLR7 작동약, TLR8 작동약, 및 TLR9 작동약으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 면역억제제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 다른 항체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  20. 제13항에 있어서, 항원을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원, 알레르겐, 또는 자기항원을 포함하는 것인 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 종양 항원이 βhCG, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, WT1, 메소텔린, CEA, gp100, MART1, TRP-2, 멜란-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN(gp250), 유전자형(idiotype), MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, 티로시나아제, 텔로메라아제, SSX2 항원, MUC-1 항원, 및 생식 세포 유래의 종양 항원으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  23. 제13항에 있어서, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수아세포 전골수세포 골수단구성 단구성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성(과립구) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 진성적혈구증가증 림프종, 호지킨병, 비-호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 고형 종양, 육종 및 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 골육종, 척삭종, 맥관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 육종, 결장직장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아종, 상인두 암종, 식도 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌와 중추신경계(CNS) 암, 결장직장암, 연결조직암, 소화기계의 암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암, 상피내암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암(소세포, 대세포), 흑색종, 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입과 인두), 난소암, 췌장암, 망막아종, 횡문근육종, 직장암; 호흡기계의 암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 및 비뇨기계의 암으로 구성된 군에서 선택되는 암을 치료하기 위한 것인 약학 조성물.
  24. (a) 생물학적 샘플을 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체는 검출 가능한 물질로 표지되는 것인 단계; 및
    (b) CD27에 결합된 항체를 검출함으로써, 생물학적 샘플 중의 CD27의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 중 CD27의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 박테리아, 진균, 바이러스 및 기생충 감염성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
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  30. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고 이 항체와 다른 결합 특이성을 갖는 제2 분자에 연결되어 있는 이중특이적 분자를 포함하는, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키기 위한 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 분자가 Fc 수용체, NK 수용체, 또는 CD3, CD40 및 CD25로 구성된 군에서 선택되는 T 세포 수용체에 결합하는 것인 약학 조성물.
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