CN113939319A - 靶向cd19的基因工程化t细胞针对b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法 - Google Patents

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T.何
D.卡莱奇迪斯
E.莫拉瓦
J.A.特雷特
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Abstract

披露了用于治疗B细胞恶性肿瘤的基因工程化免疫细胞(例如，T细胞)群，其表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)并含有被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M基因或两者。

Description

靶向CD19的基因工程化T细胞针对B细胞恶性肿瘤的同种异体 细胞疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月30日提交的美国临时申请号62/840,913的提交日期的权益，其全部内容通过引用结合在此。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是用于治疗人类恶性肿瘤的过继性T细胞疗法。尽管CAR T细胞疗法已经取得了巨大的临床成功，包括对复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)和小儿急性淋巴母细胞白血病(ALL)的持久缓解，但批准的产品是自体的，需要收集和制造患者特异性细胞。因此，一些患者在等待治疗期间经历了疾病进展或死亡。因此，仍然需要改进的CAR T细胞疗法。
发明内容
本披露至少部分基于使用表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)且具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的基因工程化T细胞(例如，CTX110细胞，又名TC1细胞)开发用于B细胞恶性肿瘤(诸如转化型FL或DLBCL)的同种异体细胞疗法。本文披露的同种异体CAR-T细胞疗法在患有本文披露的B细胞恶性肿瘤的人类患者中显示出治疗功效，包括在某些患者中的完全反应和反应的长期持久性。此外，本文披露的同种异体CAR-T细胞疗法在人类患者中表现出所需的药代动力学特征，包括延长的CAR-T细胞扩增和输注后的持久性。
因此，本披露的一些方面提供了一种用于治疗人类患者中B细胞恶性肿瘤的方法，该方法包括：(i)对患有B细胞恶性肿瘤的人类患者进行淋巴细胞清除治疗；以及(ii)在步骤(i)之后向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实施例中，可在步骤(ii)之前约2-7天进行步骤(i)。在一些实施例中，基因工程化T细胞群是同种异体的。
基因工程化T细胞群可包含含有如下项的T细胞：(a)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，(b)编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中该CAR包含抗CD19单链可变片段(scFv)，其包含SEQ ID NO:51中所阐述的重链可变区和SEQ ID NO:52中所阐述的轻链可变区，且其中将该核酸插入到被破坏的TRAC基因中，和(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因。在一些实施例中，被破坏的TRAC基因包含含有SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失。
在一些实施例中，以约1x107至约1x109个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实施例中，以约1x107个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实例中，以约3x107个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实施例中，以约1x108个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实施例中，以约3x108个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在一些实施例中，以约1x109个CAR+ T细胞的剂量向人类患者施用基因工程化T细胞群。在任何情况下，施用给人类患者的基因工程化T细胞群每剂量包含不超过7x104个TCR+ T细胞/kg。
在一些实施例中，步骤(i)中的淋巴细胞清除治疗包括向人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和约500-750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。例如，步骤(i)中的淋巴细胞清除治疗包括向人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。在其他实例中，步骤(i)中的淋巴细胞清除治疗包括向人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
在一些实施例中，在步骤(i)之前，人类患者不显示以下特征中的一项或多项：(a)临床状况显著恶化，(b)需要补充氧气以维持高于91％的饱和度水平，(c)不受控制的心律失常，(d)需要血管升压药支持的低血压，(e)活动性感染，以及(f)≥2级急性神经毒性。
在一些实施例中，在步骤(i)之后和步骤(ii)之前，人类患者不显示以下特征中的一项或多项：(a)活动性不受控制的感染；(b)与步骤(i)之前的临床状态相比，临床状态恶化；以及(c)≥2级急性神经毒性。
本文披露的任何方法还可以包括(iii)在步骤(ii)之后监测人类患者的急性毒性的发展；以及(iv)管理该急性毒性(如果发生)。在一些实施例中，可以在施用基因工程化T细胞群之后进行步骤(iii)至少28天。示例性的急性毒性可包括肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全或其组合。
在一些实施例中，B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。实例包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤(FL)或3b级FL。在一些情况下，DLBCL是未另行指定(NOS)的DLBCL。在一些实例中，B细胞恶性肿瘤是难治的和/或复发的。
在一些实施例中，人类患者可具有至少一个氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性的可测量病灶。在一些实施例中，人类患者已经经历了一个或多个先前的抗癌疗法线。在一些实例中，人类患者已经经历了两个或更多个先前的抗癌疗法线。示例性的先前的抗癌疗法可包含抗CD20抗体、含蒽环类药物的方案或其组合。
在一些实例中，人类患者患有难治性或复发性转化型FL并且在转化为DLBCL后经历了针对疾病的至少一个化学疗法线。在其他实例中，B细胞恶性肿瘤是难治性的，并且人类患者在最后一次治疗疗法时具有疾病进展，或者在至少两个疗法周期后疾病稳定，而疾病稳定持续时间长达6个月。在又其他实例中，人类患者先前自体造血干细胞移植(HSCT)失败或不符合先前自体HSCT的条件。可替代地或另外，人类患者在用基因工程化T细胞群治疗后经受另外的抗癌疗法。
在本文披露的任何方法中，人类患者具有以下特征中的一项或多项：
(a)东部肿瘤协作组(ECOG)性能状态为0或1；
(b)足够的肾、肝、心脏和/或肺功能；
(c)未接受过先前的基因疗法或改良的细胞疗法；
(d)未接受过包含抗CD19抗体的先前治疗；
(e)未接受过先前的同种异体HSCT；
(f)没有可检测到的来自脑脊液的恶性细胞；
(g)没有脑转移；
(h)没有先前的中枢神经系统障碍；
(i)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗塞；
(j)没有不受控制的感染；
(k)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷障碍或自身免疫性障碍；以及(l)没有人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
在本文披露的任何方法中，由基因工程化T细胞表达的抗CD19 CAR可以包含胞外抗原结合结构域，其是包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的抗CD19 scFv。在一些实施例中，抗CD19 CAR可以包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，将编码抗CD19 CAR的核酸插入到被破坏的TRAC基因中的缺失的位点。在一些实例中，被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:54的核苷酸序列。可替代地或另外，基因工程化T细胞群中被破坏的β2M基因包含SEQ ID NO:9-14所阐述的核苷酸序列中的至少一种。
在一些实施例中，基因工程化T细胞群中的至少90％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。例如，
基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白；基因工程化T细胞群中的至少50％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白；和/或基因工程化T细胞群中的至少30％的T细胞表达可检测水平的CAR。在一些实例中，基因工程化T细胞群中的至少99.5％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。在一些实例中，基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。在具体实例中，基因工程化T细胞群中的至少85％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。在一些实例中，基因工程化T细胞群中的至少50％的T细胞表达可检测水平的CAR。在具体实例中，基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞表达可检测水平的CAR。
在一个具体实例中，用于本文披露的任何方法中的基因工程化T细胞群是CTX110细胞。
在本文披露的任何方法中，基因工程化T细胞群通过静脉内输注施用于人类患者。在一些实例中，基因工程化T细胞群可以悬浮在冷冻保存溶液中。
在本披露的范围内的还有如本文披露的用于治疗B细胞恶性肿瘤的药物组合物、包含本文披露的任何基因工程化T细胞(例如，CTX110细胞)群的药物组合物、以及基因工程化T细胞用于制造用以治疗B细胞恶性肿瘤的药物的用途。
本发明的一个或多个实施例的细节在以下说明书中阐述。从以下附图和几个实施例的详细描述，以及从所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。
附图说明
图1是编辑后8天，人原代T细胞、TRAC-/B2M-CD19CAR+T细胞(TC1)的一系列流式细胞术图。这些图显示降低的TRAC和B2M的表面表达。TCR/MHC I双敲除细胞表达高水平的CAR转基因(下图)。用纯化珠进行TC1细胞的阴性选择导致TCR阳性细胞降低(右图)。
图2是描绘在TRAC-/B2M-CD19CAR+T细胞(TC1)中的TRAC和B2M基因座处实现高编辑率的图。测量TCR和MHCI的表面表达(这是基因编辑的功能输出)并在y轴上绘制为编辑百分比。从TRAC基因座检测到高效率(例如，大于50％)的位点特异性整合和CAR的表达。这些数据证明TRAC-/B2M-/抗CD19CAR+T细胞的产生效率大于50％。
图3是描绘在用TRAC-/β2M-/CD19 CAR+ T细胞(TC1)治疗后的NOG Raji小鼠中肿瘤体积(mm3)的统计学显著减少(p＝0.007)的图。
图4是存活率曲线图，该图证明与未接受治疗的NOG Raji小鼠相比，用TC1细胞治疗的NOG Raji小鼠的存活率增加。
图5是存活率曲线图，证明与在第1天未接受治疗的对照小鼠相比，在第4天用TC1细胞治疗的NOG Raji小鼠的存活期增加。
图6A和6B包括显示TC1细胞在小鼠中的持久性和抗肿瘤活性的图。图6A：一系列流式细胞术图，这些图证明TC1细胞在NOG Raji小鼠中持续存在。图6B：证明与对照(未治疗的NOG Raji小鼠或NOG小鼠)相比，TC1细胞选择性根除用TC1治疗的NOG Raji小鼠中的脾Raji细胞的图。与对照组相比，该作用被描绘为在用TC1治疗的NOG Raji小鼠中脾肿块减少。
图7是一系列流式细胞术图，这些图证明在TC1治疗的两只独立的NOG Raji小鼠中编辑了持续存在的脾TC1细胞。
图8是Kaplan-Meier存活率图，证明与在第1天未接受治疗的对照小鼠相比，在第4天用TC1细胞治疗的NOG Nalm6小鼠的存活期增加。
图9是Kaplan-Meier存活率图，证明与未接受治疗的对照小鼠相比，在用不同浓度的TC1治疗后，携带播散性Nalm6 B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)的小鼠的存活期增加。
图10是描绘在用TC1细胞治疗后在播散性Nalm6 B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)肿瘤模型中肿瘤细胞扩增的统计学显著抑制的图。
图11是辐射后用TC1细胞或各种对照细胞(PBMC或电穿孔(EP)T细胞)治疗的健康小鼠或仅接受辐射(“仅RT”)的小鼠的Kaplan-Meier存活率图。
图12是显示图18中治疗的小鼠的体重变化百分比的图。
图13是辐射后用低剂量(2x107个)或高剂量(4x107个)TC1细胞或未编辑的T细胞治疗的健康小鼠或仅接受辐射(“媒介物-RT”)的小鼠的Kaplan-Meier存活率图。
图14是显示图20中治疗的小鼠以及未辐照和未给予细胞的小鼠(“媒介物-无RT”)的体重变化百分比的图。
图15是显示来自六个不同供体的外周血细胞的未编辑CD8+ T细胞亚群内CD27+CD45RO-细胞的百分比的柱状图。
图16提供了在清除TCRαβ+细胞之前和之后TC1细胞上TCRαβ和B2M表达的流式细胞术结果。
图17是在来自各个批次TC1生产的经编辑TC1细胞中基因编辑后TCR-和MHC I-(B2M)的蛋白损失百分比以及表达抗CD19 CAR的细胞的百分比的图。
图18提供显示了编辑前后来自六个不同供体的T细胞群中PD1+(左上)、LAG3+(右上)、TIM3+(左下)或CD57+(右下)的百分比的图。
图19是显示在与TC1细胞或未编辑的T细胞以不同比例共培养时CD19阳性细胞系(Nalm6；Raji；和K562-CD19)和CD19阴性细胞(K562)的细胞溶解的百分比的图。
图20是显示在存在T细胞培养基(血清+IL2+IL7；完全培养基)、含有血清但不含IL2或IL7细胞因子的培养基(5％血清，无细胞因子)或者无血清或细胞因子(无血清，无细胞因子)的情况下培养时有活力的TC1细胞的数量的图。在基因编辑后的指示天数对细胞进行计数。三个批次的平均值±SD显示。
图21是描绘用于评价在淋巴细胞清除后向患有CD19+恶性肿瘤的人类受试者施用的CTX110细胞(又名TC1细胞)的临床研究设计的示意图。
具体实施方式
分化簇19(CD19)是可在白血病前体细胞上检测到的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以登录号NM_001178098找到。CD19在大多数B谱系癌症上表达，包括例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见，例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)。
本披露提供了用于B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法涉及表达抗CD19 CAR并具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的基因工程化T细胞群，编码插入TRAC基因座的抗CD19 CAR的核酸，从而破坏TRAC基因的表达。同种异体抗CD19 CAR-T细胞是使用从健康供体获得的亲本T细胞制备的。因此，CAR-T疗法可用于诊断后立即患有靶B细胞恶性肿瘤的患者，而不是在自体CAR-T疗法中诊断和治疗之间至少有三周的间隔才能从患者自身的T细胞制造CAR-T细胞。同种异体CAR T疗法可以在护理地点储存和库存，以便在诊断后立即进行治疗。同种异体抗CD19CAR-T疗法的即时可用性消除了桥接化疗的需要，当从患者自己的细胞制造自体CAR-T细胞时可能需要桥接化疗。本文披露的同种异体抗CD19CAR-T细胞疗法在患有本文披露的B细胞恶性肿瘤的人类患者中显示出疗法功效，包括在某些患者中的完全反应和反应的长期持久性。此外，本文披露的同种异体CAR-T细胞疗法在人类患者中表现出所需的药代动力学特征，包括延长的CAR-T细胞扩增和输注后的持久性。
因此，本文提供了使用基因工程化免疫细胞群诸如T细胞治疗人类患者中B细胞恶性肿瘤的方法，这些细胞共同包含被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M和编码抗CD19 CAR(例如，SEQ ID NO:40，通过SEQ ID NO:39编码)的核酸。可以将编码抗CD19 CAR并任选包含启动子序列和一个或多个调节元件的核酸插入到被破坏的TRAC基因座中，例如替换TRAC基因中SEQ ID NO:26的片段。人类患者在施用基因工程化T细胞群之前经受淋巴细胞清除治疗。
I.抗CD19 CAR T细胞
本文披露了用于治疗B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110细胞)。在一些实施例中，抗CD19 CAR T细胞是表达抗CD19 CAR并具有被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M基因或其组合的人T细胞。在具体实例中，该抗CD19 CAR T细胞表达抗CD19 CAR并且具有被破坏的内源性TRAC和B2M基因。
(i)抗CD19嵌合抗原受体(CAR)
此处披露的基因工程化免疫细胞(诸如T细胞)表达结合CD19(抗CD19CAR)的嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体(CAR)是指人工免疫细胞受体，其经工程化以识别并结合不希望的细胞表达的抗原，例如疾病细胞表达的抗原，例如癌细胞表达的抗原。表达CAR多肽的T细胞被称为CAR T细胞。CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别赋予CAR-T细胞识别独立于抗原加工的抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞上表达时，CAR不会有利地与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚。
CAR的各代每者含有不同组分。第一代CAR通过铰链结构域和跨膜结构域将抗体衍生的scFv与T细胞受体的CD3ζ(ζ或z)细胞内信号传导结构域连接。第二代CAR掺入了另外的共刺激结构域(例如CD28、4-1BB(41BB)或ICOS)以提供共刺激信号。第三代CAR包含与TCRCD3ζ链融合的两个共刺激结构域(例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的组合)。Maude等人,Blood.[血液]2015；125(26):4017-4023；Kakarla和Gottschalk,Cancer J.[癌症杂志]2014；20(2):151-155。CAR构建体的各代中的任何一代都在本披露的范围内。
一般地说，CAR是融合多肽，其包含识别靶抗原的胞外结构域(例如，抗体的单链可变片段(scFv)或其他抗体片段)和胞内结构域，所述胞内结构域包含T细胞受体(TCR)复合物的信号传导结构域(例如，CD3ζ)，并且在大多数情况下包含共刺激结构域。(Enblad等人,Human Gene Therapy.[人类基因疗法]2015；26(8):498-505)。CAR构建体可以进一步包含位于胞外结构域和胞内结构域之间的铰链和跨膜结构域，以及用于表面表达的N末端的信号肽。信号肽的实例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:30)和MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:31)。可以使用其他信号肽。
抗CD19 CAR可以包含对CD19特异的抗CD19单链可变片段(scFv)，随后是与细胞内共信号传导结构域(例如，CD28共刺激结构域)和CD3ζ信号传导结构域融合的铰链结构域和跨膜结构域(例如，CD8铰链和跨膜结构域)。用于构建本文披露的抗CD19 CAR的示例性组分可以在下面提供的序列表中找到。
(a)抗原结合胞外结构域
抗原结合胞外结构域是当CAR在细胞表面表达时暴露于胞外流体的CAR多肽的区域。在一些情况下，信号肽可以位于N末端，以促进细胞表面表达。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是单链可变片段(scFv，其可以包括抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)(在任一取向上)。在一些情况下，VH和VL片段可通过肽接头连接。在一些实施例中，接头包括亲水性残基，即，多段甘氨酸和丝氨酸用于柔性，以及多段谷氨酸和赖氨酸用于增加溶解度。scFv片段保留了scFv片段衍生自的亲本抗体的抗原结合特异性。在一些实施例中，scFv可包含人源化VH和/或VL结构域。在其他实施例中，scFv的VH和/或VL结构域完全是人的。
本文披露的CAR多肽中的胞外抗原结合结构域对CD19(例如人CD19)具有特异性。在一些实例中，抗原结合胞外结构域可包含能够结合CD19的scFv胞外结构域。该抗CD19scFv可以包含具有与SEQ ID NO:51中的那些相同的重链互补决定区(CDR)的重链可变结构域(VH)和/或具有与SEQ ID NO:52中的那些相同的轻链CDR的轻链可变结构域(VL)。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意味着当通过相同的方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法)确定时，它们的CDR是相同的。参见，例如，bioinf.org.uk/abs/)。在一些实例中，抗CD19scFv包含SEQ ID NO:51的VH片段和/或SEQID NO:52的VL片段。在具体实例中，该抗CD19 scFv可以包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
(b)跨膜结构域
本文披露的抗CD19 CAR多肽可以包含跨膜结构域，其可以是跨膜的疏水性α螺旋。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。跨膜结构域可以提供含有其的CAR的稳定性。
在一些实施例中，如本文提供的CAR的跨膜结构域可以是CD8跨膜结构域。在其他实施例中，跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域。在又其他实施例中，跨膜结构域是CD8和CD28跨膜结构域的嵌合体。如本文提供的，可以使用其他跨膜结构域。在具体实例中，抗CD19 CAR中的跨膜结构域是具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
(c)铰链结构域
在一些实施例中，铰链结构域可以位于CAR的胞外结构域(包含抗原结合结构域)与跨膜结构域之间或者CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间。铰链结构域可以是起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的功能的任何寡肽或多肽。铰链结构域可以起到向CAR或其结构域提供柔性或防止CAR或其结构域的空间位阻的功能。
在一些实施例中，铰链结构域可以包含多达300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸或5至20个氨基酸)。在一些实施例中，一个或多个铰链结构域可以包括在CAR的其他区域中。在一些实施例中，铰链结构域可以是CD8铰链结构域。可以使用其他铰链结构域。
(d)细胞内信号传导结构域
本文披露的任何抗CD19 CAR构建体均包含一个或多个细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ，和任选地一个或多个共刺激结构域)，其是受体的功能性末端。抗原识别后，受体聚簇，并且信号被传递到细胞。
CD3ζ是T细胞受体复合物的细胞质信号传导结构域。CD3ζ包含三(3)个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，在T细胞与关联抗原接合后，它们将活化信号传输到T细胞。在许多情况下，CD3ζ提供主要的T细胞活化信号，但不提供完全感受态的活化信号，这需要共刺激信号传导。在一些实例中，本文披露的抗CD19 CAR构建体包含CD3ζ细胞质信号传导结构域，其可以具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文披露的抗CD19 CAR多肽可进一步包含一个或多个共刺激信号传导结构域。例如，CD28和/或4-1BB的共刺激结构域可用于传递完整的增殖/存活信号，以及CD3ζ介导的主要信号传导。在一些实例中，本文披露的CAR包含CD28共刺激分子，例如，具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CD28共刺激信号传导结构域。在其他实例中，本文披露的CAR包含4-1BB共刺激分子，例如，具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的4-1BB共刺激信号结构域。
在具体实例中，本文披露的抗CD19 CAR可包括CD3ζ信号传导结构域(例如，SEQ IDNO:38)和CD28共刺激结构域(例如，SEQ ID NO:36)。
应当理解，本文描述的方法涵盖多于一种可用于产生表达CAR的基因工程化T细胞的合适的CAR，例如，本领域已知的或本文披露的那些。实例可以在例如2018年5月11日提交的国际申请号PCT/IB 2018/001619(公开为WO 2019/097305 A2)和2019年5月10日提交的国际申请号PCT/IB 2019/000500中找到，每个在先申请的相关披露通过引用结合于此以用于本文引用的目的和主题。
在具体实例中，本文披露的抗CD19 CAR可以包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:39的核苷酸序列编码。参见下面提供的序列表。
在本文披露的基因工程化T细胞中，可以将包含抗CD19 CAR的编码序列和任选的用于表达抗CD19 CAR的调控序列(例如，启动子，诸如序列表中提供的EF1a启动子)的核酸插入到目的基因组基因座。在一些实例中，将该核酸插入内源性TRAC基因座中，从而破坏TRAC基因的表达。在具体实例中，该核酸可以替换TRAC基因中的片段，例如，包含SEQ IDNO:26的核苷酸序列的片段。
(ii)敲除TRAC和B2M基因
本文披露的抗CD19 CAR-T细胞还可具有被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M基因或其组合。TRAC基因座的破坏导致T细胞受体(TCR)表达缺失，目的是降低移植物抗宿主病(GvHD)的概率，而β2M基因座的破坏导致主要组织相容性复合物I型(MHC I)蛋白表达缺失，目的是通过降低宿主排斥的概率来改善持久性。添加抗CD19 CAR将修饰的T细胞定向至表达CD19的肿瘤细胞。
如本文所用，术语“被破坏的基因”是指基因含有相对于野生型对应物的一个或多个突变(例如，插入、缺失或核苷酸取代等)以实质上降低或完全消除编码的基因产物的活性。该一个或多个突变可以位于非编码区，例如，启动子区，调节转录或翻译的调节区；或内含子区。可替代地，该一种或多种突变可以位于编码区(例如，外显子中)。在一些情况下，被破坏的基因不表达或以大大降低的水平表达编码蛋白。在其他情况下，被破坏的基因以突变形式表达编码的蛋白质，该蛋白质没有功能性或活性大大降低。在一些实施例中，被破坏的基因是不编码功能蛋白的基因。在一些实施例中，包含被破坏的基因的细胞不表达(例如，不在细胞表面表达)所述基因编码的可检测水平(例如，通过抗体，例如，通过流式细胞术)的蛋白质。不表达可检测水平的蛋白质的细胞可以称为敲除细胞。例如，如果使用特异性结合β2M蛋白的抗体在细胞表面不能检测到β2M蛋白，则具有β2M基因编辑的细胞可以认为是β2M敲除细胞。
在一些实施例中，可将被破坏的基因描述为包含相对于野生型对应物突变的片段。该突变的片段可以包含缺失、核苷酸取代、添加或其组合。在其他实施例中，可将被破坏的基因描述为缺失野生型对应物中存在的片段。在一些情况下，该缺失片段的5′端可以位于设计的指导RNA(如本文披露的那些)的靶标基因区域内(称为中靶序列)，并且该缺失片段的3′端可以超出靶标区域。可替代地，该缺失片段的3′端可以位于靶标区域内，而该缺失片段的5′端可以超出靶标区域。
在一些情况下，本文披露的抗CD19 CAR-T细胞中的被破坏的TRAC基因可以包含缺失，例如TRAC基因座的外显子1中的片段的缺失。在一些实例中，被破坏的TRAC基因包含含有SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失，所述核苷酸序列是TRAC指导RNA TA-1的靶位点。参见下面的序列表。在一些实例中，SEQ ID NO:26的片段可以被编码抗CD19 CAR的核酸替代。该被破坏的TRAC基因可以包含SEQ ID NO:39的核酸序列。
本文披露的抗CD19 CAR-T细胞中的被破坏的B2M基因可以使用CRISPR/Cas技术产生。在一些实例中，可以使用如下序列表中提供的B2M gRNA。被破坏的B2M基因可包含SEQID No:9-14中任一个的核苷酸序列。(iii)用于同种异体疗法的示例性抗CD19 CAR-T细胞群
本文还提供了包含本文披露的抗CD19 CAR-T细胞的基因工程化免疫细胞群(例如，T细胞，诸如人T细胞)，其表达本文披露的任何抗CD19 CAR(例如，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的抗CD19 CAR)，以及本文还披露的被破坏的TRAC基因和/或被破坏的B2M基因。在一些实例中，基因工程化T细胞群是CTX110细胞，它们是具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的CD19定向T细胞。可以将编码抗CD19 CAR的核酸插入到被破坏的SEQ ID NO:26位点的TRAC基因，被编码抗CD19 CAR的核酸取代，从而破坏TRAC基因的表达。该CTX110细胞中被破坏的TRAC基因可以包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
可以通过体外基因修饰产生使用CRISPR/Cas9(规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)技术来破坏靶基因(TRAC和B2M基因)和腺相关病毒(AAV)转导以递送抗CD19 CAR构建体来产生CTX110细胞。CRISPR-Cas9介导的基因编辑涉及两个指导RNA(sgRNA)：TA-1 sgRNA(SEQ ID NO:18)，其靶向TRAC基因座；和B2M-1 sgRNA(SEQ ID NO:20)，其靶向β2M基因座。对于本文提供的任何gRNA序列，未明确指示修饰的那些意在包括未修饰的序列和具有任何合适的修饰的序列。
CTX110细胞的抗CD19 CAR由抗CD19单链抗体片段(scFv，其可包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列)，随后是与CD28的细胞内共信号结构域(例如，SEQ ID NO:36)和CD3ζ信号传导结构域(例如，SEQ ID NO:38)融合的CD8铰链和跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列)组成。在具体实例中，CTX110细胞中抗CD19 CAR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，CTX110细胞群的至少30％表达可检测水平的抗CD19 CAR。例如，CTX110细胞中的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％表达可检测水平的抗CD19 CAR。
在一些实施例中，至少50％的CTX110细胞群可以不表达可检测水平的β2M表面蛋白。例如，CTX110细胞的至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％可以不表达可检测水平的β2M表面蛋白。在一些实施例中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M表面蛋白。
可替代地或另外，至少50％的CTX110细胞群可以不表达可检测水平的TCR表面蛋白。例如，CTX110细胞的至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％可以不表达可检测水平的TCR表面蛋白。在一些实施例中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的TRAC表面蛋白。在具体实例中，超过90％(例如，超过99.5％)的CTX110细胞不表达可检测的TCR表面蛋白。
在一些实施例中，相当大百分比的CTX110 T细胞群可包含多于一个基因编辑，这导致一定百分比的细胞不表达多于一个基因和/或蛋白。
例如，至少50％的CTX110细胞群可以不表达可检测水平的两种表面蛋白，例如，不表达可检测水平的β2M和TRAC蛋白。在一些实施例中，50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的CTX110 T细胞不表达可检测水平的TRAC和B2M表面蛋白。在另一个实例中，至少50％的CTX110细胞群不表达可检测水平的TRAC和B2M表面蛋白。
在一些实施例中，CTX110 T细胞群可以包含多于一种基因编辑(例如，在多于一种基因中)，其可为本文所述的编辑。例如，CTX110 T细胞群可以包含通过CRISPR/Cas技术使用TA-1 TRAC gRNA被破坏的TRAC基因。在一些实例中，相对于未修饰的T细胞，该CTX110细胞可包含TRAC基因中的缺失。例如，该CTX110 T细胞可包含TRAC基因中片段AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQ ID NO:26)的缺失。该片段可以被编码抗CD19 CAR的核酸(例如，SEQ ID NO:39)替代。可替代地或另外，该CTX110细胞群可包含通过CRISPR/Cas9技术使用B2M-1的gRNA被破坏的β2M基因。此类CTX110细胞可以在β2M基因中包含插入缺失，其包含SEQ ID NO:9-14的一个或多个核苷酸序列。在具体实例中，CTX110细胞包含≥30％CAR+T细胞、≤50％B2M+细胞和≤30％TCRαβ+细胞。在另外的具体实例中，CTX110细胞包含≥30％CAR+T细胞、≤30％B2M+细胞和≤0.5％TCRαβ+细胞。
还参见WO 2019/097305 A2和WO 2019215500，它们各自的相关披露内容通过引用结合于此用于本文引用的主题和目的。
(iv)药物组合物
在一些方面，本披露提供了药物组合物，其包含本文披露的任何基因工程化抗CD19 CAR T细胞群，例如，CTX110细胞和药学上可接受的载体。此类药物组合物可用于在人患者中的癌症治疗，其也在本文中披露。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与受试者的组织、器官和/或体液接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂或类似物。组合物可以包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。参见，例如，Berge等人,(1977)J Pharm Sci[药物科学杂志]66:1-19。
在一些实施例中，该药物组合物进一步包括药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的非限制性实例包括酸加成盐(由多肽的游离氨基与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成)。在一些实施例中，与游离羧基形成的盐衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。
在一些实施例中，本文披露的药物组合物包含悬浮在冷冻保存溶液(例如，
Figure BDA0003377063530000151
C55)中的基因工程化抗CD19CAR-T细胞群(例如，CTX110细胞)。用于本披露中使用的冷冻保存液还可包含腺苷、右旋糖、葡聚糖-40、乳糖酸、蔗糖、甘露醇、缓冲剂诸如N-)2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、一种或多种盐(例如，氯化钙、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾等)、一种或多种碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾等)、或其组合。冷冻保存液的组分可以溶解在无菌水中(注射质量)。任何冷冻保存溶液可以基本上不含血清(常规方法检测不到)。
在一些情况下，可以将包含悬浮在冷冻保存溶液(例如，基本上不含血清)中的基因工程化抗CD19 CAR-T细胞群诸如CTX110细胞的药物组合物置于储存瓶中。
本文披露的任何药物组合物，包含如本文也披露的基因工程化抗CD19CAR T细胞群(例如，CTX110细胞)，其任选地可以悬浮在如本文披露的冷冻保存溶液中，可以储存在如下环境中：不会显著影响未来使用的T细胞的存活率和生物活性，例如，在通常用于储存细胞和组织的条件下。在一些实施例中，药物组合物可以在≤-135℃下储存在液氮的汽相中。在这些条件下储存一段时间后，在外观、细胞计数、存活率、％CAR+ T细胞、％TCR+ T细胞和％B2M+ T细胞方面没有观察到显著变化。
II.基因工程化免疫细胞的制备
可以使用本领域已知的任何合适的基因编辑方法来制备本文披露的基因工程化免疫细胞(例如，T细胞，诸如CTX110细胞)，例如，使用锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或RNA指导的CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；规律间隔成簇短回文重复序列相关9)来进行核酸酶依赖性靶向编辑。在具体实例中，通过CRISPR技术结合同源重组，使用腺相关病毒载体(AAV)作为供体模板，产生基因工程化免疫细胞，诸如CTX110细胞。
(i)CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统
CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA指导的DNA靶向平台。它依赖于DNA核酸酶Cas9和两个非编码RNA(crisprRNA(crRNA)和反式活化RNA(tracrRNA))来靶向DNA的切割。CRISPR是规律间隔成簇短回文重复序列的缩写，是在细菌和古细菌基因组中发现的DNA序列家族，其包含与先前暴露于细胞(例如病毒)的外源DNA(例如，由感染或攻击原核生物的病毒暴露于细胞的外源DNA)相似的DNA片段(间隔子DNA)。这些DNA片段被原核生物用来在重新引入后，例如在随后的攻击中从相似的病毒中检测和破坏相似的外源DNA。CRISPR基因座的转录导致包含间隔子序列的RNA分子的形成，所述RNA分子缔合并靶向Cas(CRISPR相关)蛋白以能够识别和剪切外源(外源DNA)。已经描述了许多类型和种类的CRISPR/Cas系统(参见例如，Koonin等人,(2017)CurrOpin Microbiol[微生物学当前观点]37:67-78)。
crRNA通过典型地与靶DNA中的20个核苷酸(nt)序列的沃森-克里克碱基配对来驱动CRISPR-Cas9复合物的序列识别和特异性。改变crRNA中5’20nt的序列可将CRISPR-Cas9复合物靶向特定基因座。如果靶序列后面是特定的短DNA序列(序列为NGG)作为原型间隔子相邻基序(PAM)，CRISPR-Cas9复合物仅结合包含与crRNA的前20nt序列匹配的DNA序列。
TracrRNA与crRNA的3’末端杂交形成RNA双链体结构，所述双链体结构与Cas9内切核酸酶结合形成催化活性的CRISPR-Cas9复合物，其然后可以切割靶DNA。
一旦CRISPR-Cas9复合物在靶位点与DNA结合，Cas9酶内的两个独立的核酸酶结构域各自切割PAM位点上游的DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。
CRISPR-Cas9复合物在特定靶位点处与DNA结合并形成位点特异性DSB之后，下一个关键步骤是修复DSB。细胞使用两种主要的DNA修复途径来修复DSB：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。
NHEJ是一种稳健的修复机制，在包括非分裂细胞在内的大多数细胞类型中显现出高活性。NHEJ容易出错，并且通常会在DSB的位点导致在一个到几百个核苷酸之间的去除或添加，尽管此类修饰典型地<20nt。产生的插入和缺失(插缺)可以破坏基因的编码或非编码区域。可替代地，HDR使用内源性或外源性提供的长段同源供体DNA来以高保真度修复DSB。HDR仅在分裂的细胞中有效，并且在大多数细胞类型中以相对较低的频率发生。在本披露的许多实施例中，NHEJ被作为自发的修复来利用。
(a)Cas9
在一些实施例中，Cas9(CRISPR相关蛋白9)核酸内切酶用于CRISPR方法中，所述方法用于制备本文披露的基因工程化T细胞。Cas9酶可以是酿脓链球菌中的一种，尽管也可以使用其他Cas9同源物。应当理解，如本文所提供的，可以使用野生型Cas9或可以使用Cas9的修饰版本(例如，Cas9的进化版本，或Cas9直向同源物或变体)。在一些实施例中，Cas9包含酿脓链球菌衍生的Cas9核酸酶蛋白，其已被工程化为包括C末端和N末端SV40大T抗原核定位序列(NLS)。所得的Cas9核酸酶(sNLS-spCas9-sNLS)是162kDa蛋白，其通过重组大肠杆菌发酵产生并通过色谱法纯化。spCas9氨基酸序列可作为UniProt登录号Q99ZW2找到，其在本文中作为SEQ ID NO:55提供。
(b)指导RNA(gRNA)
如本文所述，CRISPR-Cas9介导的基因编辑包括指导RNA或gRNA的使用。如本文所用，“gRNA”是指基因组靶向核酸，其可以将Cas9定向至TRAC基因或β2M基因内的特定靶序列，以在特定靶序列处进行基因编辑。指导RNA至少包含与靶基因内用于进行编辑的靶核酸序列杂交的间隔子序列，以及CRISPR重复序列。
SEQ ID NO:18或22中提供了靶向TRAC基因的示例性gRNA。参见下面的序列表。还参见WO 2019/097305 A2，其相关披露内容通过引用结合于此用于本文引用的主题和目的。可以使用位于第14号染色体上的TRAC基因序列(GRCh38：第14号染色体：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)设计其他gRNA序列。在一些实施例中，靶向TRAC基因组区域的gRNA和Cas9在TRAC基因组区域中产生断裂，导致TRAC基因中的插入缺失，其破坏mRNA或蛋白质的表达。
SEQ ID NO:20或24中提供了靶向β2M基因的示例性gRNA。参见下面的序列表。还参见WO 2019/097305 A2，其相关披露内容通过引用结合于此用于本文引用的目的和主题。可以使用位于第15号染色体上的β2M基因序列(GRCh38坐标：染色体15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)设计其他gRNA序列。在一些实施例中，靶向β2M基因组区域的gRNA和RNA指导的核酸酶在β2M基因组区域中产生断裂，导致β2M基因中的插入缺失，其破坏mRNA或蛋白质的表达。
在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。在V型gRNA中，crRNA形成双链体。在这两个系统中，双链体都结合定点多肽，使得指导RNA和定点多肽形成复合物。在一些实施例中，靶向基因组的核酸由于其与定点多肽的缔合而为复合物提供了靶特异性。因此，靶向基因组的核酸定向定点多肽的活性。
如本领域普通技术人员所理解的，每个指导RNA设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔子序列。参见Jinek等人,Science[科学],337,816-821(2012)和Deltcheva等人,Nature[自然],471,602-607(2011)。
在一些实施例中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是双分子指导RNA。在一些实施例中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是单分子指导RNA。
双分子指导RNA包含两条链的RNA分子。第一条链在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二条链包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子指导RNA(称为“sgRNA”)在5'至3'方向上包含任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子指导接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以包含为指导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子指导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸包括一个或多个发夹。V型系统中的单分子指导RNA在5'至3'方向上包含最小CRISPR重复序列和间隔子序列。
“靶序列”在与PAM序列相邻的靶基因中，并且是要被Cas9修饰的序列。“靶序列”在“靶核酸”中的所谓的PAM链上，所述靶核酸是包含PAM链和互补的非PAM链的双链分子。本领域技术人员认识到，gRNA间隔子序列与位于目的靶核酸的非PAM链中的互补序列杂交。因此，gRNA间隔子序列是靶序列的RNA等同物。
例如，如果TRAC靶序列是5′-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3′(SEQ ID NO:26)，则gRNA间隔子序列是5′-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3′(SEQ ID NO:19)。在另一个实例中，如果β2M靶序列是5′-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3′(SEQ ID NO:27)，则gRNA间隔子序列是5′-GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3′(SEQ ID NO:21)。gRNA的间隔子经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与目的靶核酸相互作用。因此，间隔子的核苷酸序列根据目的靶核酸的靶序列而变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，将间隔子序列设计成与靶核酸的区域杂交，该区域位于该系统中使用的Cas9酶可识别的PAM的5'。间隔子可以与靶序列完全匹配或可以有错配。每个Cas9酶都有特定的PAM序列，使得该酶识别靶DNA。例如，酿脓链球菌识别靶核酸中的包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。
在一些实施例中，靶核酸序列的长度是20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸的长度小于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸的长度超过20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，靶核酸至多具有：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，靶核酸序列具有20个紧邻PAM第一个核苷酸的5'的碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'的序列中，靶核酸可以是对应于所述多个N的序列，其中N可以是任何核苷酸，并且该加下划线的NRG序列是酿脓链球菌PAM。实例提供为SEQID NO:15-17。
本文披露的指导RNA可以经由crRNA中的间隔子序列靶向任何目的序列。在一些实施例中，指导RNA的间隔子序列与靶基因中的靶序列之间的互补程度可以是约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，指导RNA的间隔子序列与靶基因中的靶序列是100％互补的。在其他实施例中，指导RNA的间隔子序列和靶基因中的靶序列可以包含多达10个错配，例如，多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达3个、多达2个或多达1个错配。
在WO 2019/097305 A2和WO 2019/215500中提供了可如本文所提供的那样使用的gRNA的非限制性示例，其中每一个的相关披露内容通过引用结合在此用于本文所引用的目的和主题。对于本文提供的任何gRNA序列，未明确指示修饰的那些意在包括未修饰的序列和具有任何合适的修饰的序列。
本文披露的任何gRNA中的间隔子序列的长度可以取决于CRISPR/Cas9系统和用于编辑本文披露的任何靶基因的组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas9蛋白具有不同的最佳间隔子序列长度。因此，间隔子序列的长度可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、或超过50个的核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度可以具有18-24个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列的长度可以具有19-21个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度可包含20个核苷酸。
在一些实施例中，gRNA可以是sgRNA，其可以在sgRNA序列的5’末端包含20个核苷酸间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含少于20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含大于20个核苷酸的间隔子序列。在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的5’末端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔子序列。
在一些实施例中，sgRNA在sgRNA序列的3’末端不包含尿嘧啶。在其他实施例中，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含一个或多个尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含1-8个尿嘧啶残基，例如，在sgRNA序列的3’末端包含1、2、3、4、5、6、7或8个尿嘧啶残基。
本文披露的任何gRNA，包括任何sgRNA，可以是未修饰的。可替代地，它可以包含一个或多个经修饰的核苷酸和/或经修饰的主链。例如，经修饰的gRNA(例如sgRNA)可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可以位于5’末端、3’末端或这两个末端。
在某些实施例中，一种以上的指导RNA可以与CRISPR/Cas核酸酶系统一起使用。每种指导RNA可包含不同的靶向序列，以使CRISPR/Cas系统切割一种以上的靶核酸。在一些实施例中，一种或多种指导RNA可以在Cas9 RNP复合物中具有相同或不同的性质，例如活性或稳定性。当使用一种以上指导RNA时，每种指导RNA可以在相同或不同的载体上编码。用于驱动一种以上指导RNA表达的启动子是相同或不同的。
应当理解，在本文所述的方法中可以使用一种以上的合适的Cas9和一种以上的合适的gRNA，例如，本领域已知的或本文披露的那些。在一些实施例中，方法包括本领域已知的Cas9酶和/或gRNA。实例可在例如WO 2019/097305 A2和WO 2019/215500中找到，其中每一个的相关披露内容通过引用结合在此用于本文所引用的目的和主题。
(ii)用于将CAR构建体递送至T细胞的AAV载体
可使用腺相关病毒(AAV)将编码本文披露的抗CD19 CAR构建体的核酸递送至细胞。AAV是小病毒，其位点特异性整合到宿主基因组中，并且因此可以递送转基因，例如CAR。存在反向末端重复序列(ITR)，位于AAV基因组和/或目的转基因的侧翼，并用作复制起点。AAV基因组中还存在rep和cap蛋白，它们在转录时形成衣壳，所述衣壳封装了AAV基因组以递送到靶细胞中。这些衣壳上的表面受体会赋予AAV血清型，其决定衣壳主要结合哪个靶器官，并且因此决定AAV将最有效地感染哪些细胞。目前已知十二种人AAV血清型。在一些实施例中，用于递送CAR编码核酸的AAV是AAV血清型6(AAV6)。
出于多种原因，腺相关病毒是用于基因疗法的最常用病毒之一。首先，AAV在施用于包括人在内的哺乳动物后不会引起免疫反应。第二，将AAV有效地递送至靶细胞，尤其是在考虑选择合适的AAV血清型时。最后，因为基因组可以在宿主细胞中持续存在而不整合，AAV具有感染分裂和非分裂细胞的能力。这种特性使它们成为基因疗法的理想候选。
可以设计编码抗CD19 CAR的核酸，以插入宿主T细胞中的目的基因组位点中。在一些实施例中，靶基因组位点可以在安全港基因座中。
在一些实施例中，编码抗CD19 CAR的核酸(例如，经由供体模板，其可由病毒载体例如腺相关病毒(AAV)载体携带)可被设计成使得其可插入TRAC基因内的位置以破坏基因工程化T细胞中的TRAC基因并表达CAR多肽。TRAC的破坏导致内源性TCR的功能丧失。例如，TRAC基因中的破坏可以用核酸内切酶(如本文所述的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNAs来产生。对TRAC基因和靶区域特异的任何gRNA可用于此目的，例如，本文披露的那些。
在一些实例中，TRAC基因中的基因组缺失和由CAR编码片段的替换可以通过同源定向修复或HDR(例如，使用供体模板，其可以是病毒载体例如腺相关病毒(AAV)载体的一部分)来产生。在一些实施例中，TRAC基因中的破坏可以利用核酸内切酶(如本文所披露的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNA并将CAR编码片段插入TRAC基因中来产生。
如本文披露的供体模板可以包含CAR的编码序列。在一些实例中，CAR编码序列的两侧可以有两个同源区，以允许使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在目的基因组位置处(例如，在TRAC基因处)的有效HDR。在这种情况下，靶基因座处的DNA的两条链都可以被CRISPRCas9酶切割，所述CRISPR Cas9酶由靶位点特异性的gRNA指导。然后发生HDR，以修复双链断裂(DSB)并插入编码CAR的供体DNA。为了使此正确发生，设计供体序列的侧翼残基与靶基因(例如TRAC基因)中DSB位点周围的序列(以下简称“同源臂”)互补。这些同源臂用作DSB修复的模板，并使HDR成为基本无错误的机制。同源定向修复(HDR)的速率是突变与切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或附近的靶位点很重要。模板可以包括同源区侧翼的额外序列或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而可以进行序列编辑。
可替代地，供体模板可以与DNA中的靶位置不具有同源区域，并且可以通过在靶位点切割后通过NHEJ依赖性末端连接而整合。
供体模板可以是单链和/或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，以防止核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'末端和/或将自身互补的寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如，Chang等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science[科学]272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于一个或多个末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间键的使用，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
可以将供体模板作为载体分子的一部分引入细胞中，所述载体分子具有另外的序列，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体模板可以作为裸露的核酸引入细胞(作为与试剂(例如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸引入)，或可以通过病毒递送(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))。
在一些实施例中，供体模板可以插入在内源启动子附近的位点(例如，下游或上游)，从而其表达可以由内源启动子驱动。在其他实施例中，供体模板可包含外源启动子和/或增强子，例如组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，以控制CAR基因的表达。在一些实施例中，外源启动子是EF1α启动子。可以使用其他启动子。
此外，外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。
为了制备基因工程化免疫细胞(例如，本文披露的T细胞)，可以从合适的来源获得免疫细胞，例如T细胞，例如，来自人供体的血细胞，人供体可以是健康供体或需要CAR-T细胞疗法的患者。可以使用来自一个或多个健康人供体的血细胞制备CTX110细胞。由健康的供体细胞制造可最大程度地减少意外转导恶性淋巴瘤/白血病细胞的风险，并可以潜在地改善CAR T细胞的功能。CRISPR系统的组分(例如Cas9蛋白和gRNA)，任选地AAV供体模板，可以通过常规方法递送到宿主免疫细胞中。在一些实例中，Cas9和gRNA可以形成核糖核蛋白复合物(RNP)，其可以通过电穿孔递送至宿主免疫细胞。任选地，可以将AAV供体模板与RNP复合物同时递送至免疫细胞。可替代地，可以顺序地执行RNP和AAV供体模板的递送。在一些实例中，可以在递送基因编辑组分之前活化T细胞。
递送基因编辑组分和任选的供体模板后，可回收细胞并在体外扩增。可以使用常规方法评估基因编辑效率，以确认抗CD19 CAR的敲入和靶基因(例如TRAC，B2M或两者)的敲除。在一些实例中，可以去除TCRαβ+ T细胞。在美国专利申请号62/934,991中可以找到用于制备本文披露的基因工程化免疫细胞(诸如CTX110细胞)的其他信息，其相关披露通过引用并入以用于本文中引用的目的和主题。
III.B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法
在一些方面，本文提供了使用如本文披露的任何基因工程化抗CD19 CAR T细胞(诸如CTX110 T细胞)群治疗患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的方法。该同种异体抗CD19CAR T细胞疗法可以包含两个治疗阶段：(i)调理方案(淋巴细胞清除治疗)，其包括给予合适的人类患者一剂或多剂一种或多种淋巴细胞清除剂，和(ii)治疗方案(同种异体抗CD19CAR T细胞疗法)，其包括向人类患者施用如本文披露的同种异体抗CD19 CAR T细胞群，诸如CTX110 T细胞。
(i)患者群
人类患者可以是期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何人类受试者。人类患者可以是任何年龄。在一些实施例中，该人类患者是成年人(例如，至少18岁的人)。在一些实例中，该人类患者可能具有50kg或更高的体重。在一些实施例中，该人类患者可以是儿童。
待通过本文所述方法治疗的人类患者可以是患有、怀疑患有或有患有B细胞恶性肿瘤的风险的人类患者。怀疑患有B细胞恶性肿瘤的受试者可能会表现出一种或多种B细胞恶性肿瘤的症状，例如，不明原因的体重减轻、疲劳、盗汗、气短或腺体肿胀。处于B细胞恶性肿瘤风险中的受试者可以是具有一种或多种B细胞恶性肿瘤风险因素的受试者，例如，免疫系统减弱、年龄、男性或感染(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒感染)。需要抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110 T细胞)治疗的人类患者可以通过常规医学检查(例如，体检、实验室检查、活检(例如，骨髓活检和/或淋巴结活检)、磁共振成像(MRI)扫描或超声检查)来鉴定。
可以使用本文所述方法治疗的B细胞恶性肿瘤的实例包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤(FL)、3b级FL、或慢性淋巴细胞白血病(CLL)的Richter转化。在一些实例中，该B细胞恶性肿瘤是DLBCL，例如，高分级DLBCL或未另外指明的DLBCL(NOS)。在一些实例中，该B细胞恶性肿瘤是转化型FL或3b级FL。在一些实例中，该人类患者具有至少一个氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性的可测量病灶。
在一些实施例中，待治疗的人类患者患有DLBCL并且表现出直肠旁肿块、腹膜后肿块、弥漫性淋巴结(LN)、溶解性病灶、扁桃体病灶或其组合。可替代地或另外，该人类患者可能患有骨髓扩散。在其他实例中，该人类患者没有骨髓扩散。
在一些实施例中，待治疗的人类患者患有转化型FL。这样的人类患者可能会表现出弥漫性LN。在一些情况下，该人类患者可能患有骨髓扩散。在其他情况下，该人类患者可能没有骨髓扩散。
待通过本文所述方法治疗的人类患者可以是在治疗后复发和/或对治疗产生抗性和/或对治疗无反应的人类患者。如本文所用，“复发的”或“复发”是指B细胞恶性肿瘤，诸如本文披露的那些在完全反应期后恢复的B细胞恶性肿瘤。疾病进展是指在最后一次评估后疾病恶化的情况(例如，疾病稳定或部分反应)。在一些实施例中，进展发生在治疗期间。在一些实施例中，复发发生在治疗之后。缺乏反应可由常规医疗实践确定。例如，待通过本文所述方法治疗的人类患者可以是已经接受过一个或多个先前的抗癌疗法线的人类患者。在一些情况下，该人类患者可能已经经历了两个或更多个先前的抗癌疗法线，例如，化疗、免疫疗法、手术或其组合。在一些实例中，先前的抗癌疗法可以包含抗CD20抗体疗法、含蒽环类药物的疗法或其组合。
在一些情况下，该人类患者患有难治性B细胞恶性肿瘤。如本文所用，“难治性”是指诸如本文所披露的那些对治疗无反应或变得对治疗具有抗性的B细胞恶性肿瘤。患有难治性B细胞恶性肿瘤的人类患者可能在最后一次疗法时具有疾病进展，或者在至少两个疗法周期后疾病稳定，而疾病稳定持续时间长达6个月(例如，长达5个月、长达4个月、或长达3个月或长达2个月或长达1个月)。在一些情况下，人类患者可能已经接受了先前的自体造血干细胞移植(HSCT)并且对这种移植没有反应(失败)，或者在达到某种反应后进展或复发。在其他情况下，该人类患者可能不适合先前的自体HSCT。
可以筛选人类患者以确定该患者是否适合接受如本文披露的调理方案(淋巴细胞清除治疗)和/或同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法。例如，适合接受淋巴细胞清除治疗的人类患者不显示以下一项或多项特征：(a)临床状况显著恶化，(b)需要补充氧气以维持高于90％的饱和度水平，(c)不受控制的心律失常，(d)需要血管升压药支持的低血压，(e)活动性感染，以及(f)≥2级急性神经毒性。在另一个实例中，适合治疗方案的人类患者没有表现出以下一个或多个特征：(a)活动性不受控制的感染，(b)与淋巴细胞清除治疗前的临床状态相比临床状态恶化，以及(c)≥2级急性神经毒性。
可以基于这样的筛选结果筛选人类患者并将其排除在调理方案和/或治疗方案之外。例如，如果患者符合以下一项或多项排除标准，则可以将人类患者排除在调理方案和/或同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法之外：(a)东部肿瘤协作组(ECOG)性能状态为0或1；(b)足够的肾、肝、心脏和/或肺功能；(c)未接受过先前的基因疗法或改良的细胞疗法；(d)未接受过包含抗CD19抗体的先前治疗；(e)未接受过先前的同种异体HSCT；(f)没有可检测到的来自脑脊液的恶性细胞；(g)没有脑转移；(h)没有先前的中枢神经系统障碍；(i)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗塞；(j)没有不受控制的感染；(k)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷障碍或自身免疫性障碍；以及(l)没有人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
(ii)调理方案(淋巴细胞清除疗法)
适用于本文披露的治疗方法的任何人类患者可接受淋巴细胞清除疗法，以降低或清除受试者的内源性淋巴细胞。
淋巴细胞清除是指内源性淋巴细胞和/或T细胞的破坏，所述破坏常用于免疫移植和免疫疗法前。淋巴细胞清除可以通过辐照和/或化疗来实现。“淋巴细胞清除剂”可以是当施用给受试者时能够降低、清除或消除内源性淋巴细胞和/或T细胞的任何分子。在一些实施例中，淋巴细胞清除剂以将淋巴细胞数量与施用前的淋巴细胞数量相比有效降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、97％、98％或至少99％的量施用。在一些实施例中，淋巴细胞清除剂以有效降低淋巴细胞数量的量施用，使得受试者中的淋巴细胞数量低于检测限度。在一些实施例中，给受试者施用至少一种(例如2、3、4、5或更多种)淋巴细胞清除剂。
在一些实施例中，淋巴细胞清除剂是特异性杀伤淋巴细胞的细胞毒性剂。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲氨蝶呤、达卡巴嗪、马法兰、阿霉素、长春碱、顺铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、伊立替康、依托泊甙磷酸酯、米托蒽醌、克拉屈滨、地尼白介素(denileukin diftitox)或DAB-IL2。在一些情况下，淋巴细胞清除剂可能伴随低剂量辐照。调理方案的淋巴细胞清除效果可以经由常规实践进行监测。
在一些实施例中，本文所述的方法涉及包含一种或多种淋巴细胞清除剂例如氟达拉滨和环磷酰胺的调理方案。待通过本文所述方法治疗的人类患者可在调理阶段的合适时间段(例如，1-5天)内接受多剂量的一种或多种淋巴细胞清除剂。在淋巴细胞清除期间，患者可以每天一次接受一种或多种淋巴细胞清除剂。在一个实例中，人类患者每天接受约20-50mg/m2(例如，30mg/m2)的氟达拉滨，持续2-4天(例如，3天)和每天约500-750mg/m2(例如，500或750mg/m2)的环磷酰胺，持续2-4天(例如，3天)。在具体实例中，该人类患者可以每天接受约30mg/m2的氟达拉滨和约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。在其他具体实例中，该人类患者可以每天接受约30mg/m2的氟达拉滨和约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
然后可以在如本文披露的淋巴细胞清除疗法之后的合适时期内向人类患者施用任何抗CD19 CAR T细胞，诸如CTX110细胞。例如，人类患者可以在施用抗CD19 CAR+ T细胞(例如，CTX110细胞)前约2-7天(例如，2、3、4、5、6、7天)经受一种或多种淋巴细胞清除剂。在一些情况下，在淋巴细胞清除疗法后约4-5天内，向人类患者施用抗CD19 CAR+ T细胞(例如，CTX110细胞)。
由于同种异体抗CD19 CAR-T细胞诸如CTX110细胞可以提前制备并且可以储存在治疗部位，所以本文披露的淋巴细胞清除疗法可以在人类患者被鉴定为适合本文披露的同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法之后的短时间窗口内(例如，在2周内)应用于患有B细胞恶性肿瘤的人类患者。例如，在人类患者被鉴定为适合同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法后，可以在两周内(例如，在10天内、9天内、8天内、7天内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内或更少)向人类患者施用第一剂淋巴细胞清除疗法(例如，约30mg/m2的氟达拉滨和约500mg/m2或750mg/m2的环磷酰胺)。在一些实例中，可在该人类患者被鉴定为适合治疗后24-72小时内(例如，24小时内)对该人类患者进行淋巴细胞清除疗法。然后可以在淋巴细胞清除治疗后的2-7天内(例如，2、3、4、5、6或7天)向患者施用CAR-T细胞。这允许在疾病诊断和/或患者鉴定后及时用本文披露的同种异体抗CD19 CAR-T细胞诸如CTX110细胞治疗人类患者而没有延迟(例如，由于治疗细胞的制备而延迟)。在某些情况下，患者可能会在住院期间接受治疗。在某些情况下，患者可能会在门诊接受治疗。
在任何淋巴细胞清除步骤之前，可以针对一个或多个特征筛选人类患者以确定患者是否适合进行淋巴细胞清除治疗。例如，在淋巴细胞清除之前，适合淋巴细胞清除治疗的人类患者不显示以下一项或多项特征：(a)临床状况显著恶化，(b)需要补充氧气以维持高于90％的饱和度水平，(c)不受控制的心律失常，(d)需要血管升压药支持的低血压，(e)活动性感染，以及(f)≥2级急性神经毒性。
淋巴细胞清除后，可以对人类患者进行一项或多项特征筛选，以确定患者是否适合用抗CD19 CAR T细胞(诸如CTX110细胞)治疗。例如，在抗CD19 CAR T细胞治疗之前和淋巴细胞清除治疗之后，适合抗CD19 CAR T细胞治疗条件的人类患者不会表现出以下一项或多项特征：(a)活动性不受控制的感染，(b)与淋巴细胞清除治疗前的临床状态相比临床状态恶化，以及(c)≥2级急性神经毒性。
(iii)施用抗CD19 CAR T细胞
施用抗CD19 CAR T细胞可以包括通过一种方法或路线将基因工程化T细胞群至少部分定位于所需部位(诸如肿瘤部位)将如本文所披露的基因工程化T细胞群(例如，CTX110细胞)放置(例如，移植)入人类患者体内，从而产生一种或多种所需效果。基因工程化T细胞群可以通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者中的所需位置，在该位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用于受试者后，细胞的活力期可以短至数小时(例如二十四小时)、几天、数周或月，长达数年，或甚至受试者的寿命(即长期植入)。在某些情况下，患者可能会在住院期间接受基因工程化T细胞群(例如，CTX110细胞)。在某些情况下，患者可能会在门诊接受基因工程化T细胞群(例如，CTX110细胞)。
例如，在本文所述的一些方面，有效量的基因工程化T细胞群可以经由全身性施用途径(如腹膜内或静脉内途径)施用。
在一些实施例中，全身性施用基因工程化T细胞群，这是指将细胞群以不同于直接施用至靶部位、组织或器官的方式施用，而是使其进入受试者的循环系统，从而经受代谢和其他类似过程。施用的合适模式包括注射、输注、滴注或摄取。注射包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，该途径是静脉内。
有效量是指预防或减轻医学病症(例如，B细胞恶性肿瘤)的至少一种或多种体征或症状所需的基因工程化T细胞群的量，且涉及足以提供所希望的效果(例如，治疗患有医学病症的受试者)的基因工程化T细胞群的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应当理解，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以使用常规实验来测定适当的有效量。
有效量的基因工程化T细胞群可包含约1x107个CAR+细胞至约1x109个CAR+细胞，例如约1x107个细胞至约1x109个细胞，其表达结合CD19的CAR(CAR+细胞)。在一些实施例中，基因工程化T细胞群的有效量可以包含至少1x107个CAR+ CTX110细胞、至少3x107个CAR+CTX110细胞、至少1x108个CAR+ CTX110细胞、至少3x108个CAR+ CTX110细胞、或至少1x109个CAR+ CTX110细胞。在一些实施例中，有效量的基因工程化T细胞群可以包含一定剂量的基因工程化T细胞群，例如，包含约1x107个CTX110细胞至约1x109个CTX110细胞的剂量。
本文所述的抗CD19 CAR T细胞疗法的功效可由熟练的临床医生确定。然而，如果B细胞恶性肿瘤的任何一种或所有体征或症状(举一个例子，以有益的方式改变CD19的水平(例如，增加至少10％))或其他临床上可接受的症状或标志物得到改善或减轻，则抗CD19CAR T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)被认为是“有效的”。功效还可以通过如通过住院治疗或需要医疗干预所评估的受试者恶化的失败(例如，B细胞恶性肿瘤进展停止或至少减慢)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。治疗包括对人类患者中B细胞恶性肿瘤的任何治疗，包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状的进展；或(2)减轻疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或降低症状发展的可能性。
在每次给药抗CD110 CAR T细胞后，可以监测人类患者的急性毒性，诸如肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全或其组合。
当人类患者表现出一种或多种急性毒性症状时，该人类患者可能需要进行毒性管理。对表现出一种或多种急性毒性症状的患者的治疗是本领域已知的。例如，可以对表现出CRS症状(例如，心脏、呼吸和/或神经异常)的人类患者施用抗细胞因子疗法。另外，未表现出CRS症状的人类患者可能会施用抗细胞因子疗法以促进抗CTX110 CAR T细胞的增殖。
可替代地，或除此之外，当人类患者表现出一种或多种急性毒性症状时，可以终止对人类患者的治疗。如果患者表现出一种或多种不良事件(AE)的体征，例如，患者的实验室发现异常和/或患者显示出疾病进展的体征，则也可以终止患者治疗。
本文所述的同种异体抗CD19 CAR T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)也可用于组合疗法。例如，本文所述的抗CD19 CAR T细胞治疗方法可以与其他治疗剂共同使用，用于治疗B细胞恶性肿瘤，或用于增强基因工程化T细胞群的功效和/或降低基因工程化T细胞群的副作用。
IV.用于B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法的试剂盒
本披露还提供了用于在治疗B细胞恶性肿瘤的方法中使用如本文所述的抗CD19CAR T细胞群诸如CTX110细胞的试剂盒。这样的试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器包含第一药物组合物和第二药物组合物以及药学上可接受的载剂，所述第一药物组合物包含一种或多种淋巴细胞清除剂，所述第二药物组合物包含任何核酸或基因工程化T细胞群(例如，本文描述的那些)。包含如本文披露的基因工程化CAR-T细胞(诸如CTX110细胞)的试剂盒可以在护理场所储存和库存，允许在诊断后对人类患者进行快速治疗。
在一些实施例中，试剂盒可包含用于本文所述任何方法的说明书。所包括的说明书可以包括对受试者施用第一和/或第二药物组合物以在人患者中实现预期活性的描述。试剂盒还可以包括基于鉴定人患者是否需要治疗来选择适合于治疗的人患者的描述。在一些实施例中，说明书包括对需要治疗的人患者施用第一和第二药物组合物的描述。
与使用本文所述的抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110 T细胞群有关的说明书通常包括关于剂量、给药时间表和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本披露的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指示基因工程化T细胞群用于治疗、延迟发作和/或缓解受试者的T细胞或B细胞恶性肿瘤。
本文提供的试剂盒在适当的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装等等。还考虑了与特定装置(例如吸入器、鼻施用装置或输注装置)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌的进口端(例如，容器可以是静脉内注射溶液袋或具有能够被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌的进入口。药物组合物中的至少一种活性剂是如本文披露的CTX110 T细胞的抗CD19 CAR-T细胞群。
试剂盒可以任选地提供另外组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本披露提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本披露的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分的解释，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook,等人,1989)Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社]；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑1984)；Methods inMolecular Biology[分子生物学方法],Humana Press[哈玛纳出版社]；Cell Biology:ALaboratory Notebook[细胞生物学：实验室笔记本](J.E.Cellis编辑,1989)AcademicPress[学术出版社]；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编辑1987)；Introuction to Cell and Tissue Culture[细胞和组织培养导论](J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press[普莱纽姆出版社]；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures[细胞和组织培养：实验室程序](A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编辑1993-8)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology[酶学方法](AcademicPress,Inc.[学术出版社公司])；Handbook of Experimental Immunology[实验免疫学手册](D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳动物细胞的基因转移载体](J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987)；Current Protocolsin Molecular Biology[分子生物学当前方案](F.M.Ausubel,等人编辑1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction[PCR:聚合酶链反应],(Mullis,等人编辑1994)；CurrentProtocols in Immunology[免疫学当前方案](J.E.Coligan等人编辑,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology[分子生物学简短方案](Wiley and Sons[威利父子出版社],1999)；Immunobiology[免疫生物学](C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies[抗体](P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach[抗体：实用方法](D.Catty.编辑,IRL Press[IRL出版社],1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach[单克隆抗体：一种实用的方法](P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社,2000)；Using antibodies:a laboratory manual[使用抗体：实验室手册](E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1999)；The Antibodies[抗体](M.Zanetti和J.D.Capra编辑Harwood Academic Publishers[哈伍德学术出版社],1995)；DNA Cloning:A practical Approach[DNA克隆：实用方法]，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；Nucleic Acid Hybridization[核酸杂交](B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)；Transcription and Translation[转录和翻译](B.D.Hames&S.J.Higgins,编辑(1984)；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney,编辑(1986)；Immobilized Cells and Enzymes[固定化细胞和酶](lRL出版社),(1986)；以及B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning[分子克隆实用指南](1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细阐述，相信本领域的普通技术人员可以基于以上描述在其最大程度上利用本发明。因此以下特定实施例将被解释为仅是说明性的，并且无论如何并非以任何方式限制本披露的其余内容。本文引用的所有出版物均为本文引用的目的或主题通过引用并入。
实例1：CD19靶向同种异体CAR-T细胞的制备。
如美国公开号US 2018-0325955中所述，从健康供体外周血单核细胞制备表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的同种异体T细胞，该文献通过引用并入本文。简而言之，原代人T细胞首先用Cas9或Cas9进行电穿孔：靶向TRAC(AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQID NO:26))和B2M(GCTACTCTCTCTTTCTGGCC(SEQ ID NO:27))的sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物。使用含有侧翼于嵌合抗原受体(CAR)盒的TRAC基因座的右和左同源臂的AAV6-递送的DNA模板(SEQ ID NO:56)，TRAC基因座处的DNA双链断裂通过同源定向修复进行修复。该CAR包含源自对CD19具有特异性的鼠抗体的单链可变片段(scFv)、CD8铰链区和跨膜结构域以及包含CD3z和CD28信号传导结构域的信号传导结构域。该CAR的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:40和39中阐述。用于此实例中的gRNA包含以下间隔子序列：TRAC gRNA间隔子(AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(SEQ ID NO:19))；和B2M gRNA间隔子(GCUACUCUCUCUUUCUGGCC(SEQ ID NO:21))。包含TRAC-/β2M-/抗CD19 CAR+ T细胞的细胞群在本文中称为“TC1细胞”或“CTX110细胞”。
利用CRISPR/Cas9编辑技术，实现了TCRα基因的恒定区(TRAC)的高频敲除，其中在健康供体的人原代T细胞中TCR表面表达降低约98％，这旨在显著损害移植物抗宿主疾病(GVHD)。还可以获得β-2-微球蛋白(B2M)基因的高频敲除，其目的是增加患者的持久性，从而有可能导致总体效力增加。在约80％的T细胞(没有任何随后的基于抗体的纯化或富集)中获得了TRAC/B2M双敲除频率。从破坏的TRAC基因座(通过使用AAV6递送的供体模板进行的同源定向修复产生)以及B2M基因的敲除获得的表达CD19特异性CAR的人T细胞一直被高效地持续产生。CAR的这种位点特异性整合可防止CD3+CAR+细胞的潜在生长，进一步降低GVHD的风险，同时还降低与逆转录病毒或慢病毒递送机制相关的插入诱变的风险。这些工程化的同种异体CAR-T细胞显示出CD19依赖性T细胞细胞因子分泌和强效的CD19特异性癌细胞溶解。
同种异体抗CD19 CAR-T产品的生产(图1)显示出效率编辑(例如，大于50％的TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+T细胞效率)(图2)。
实例2：剂量递增研究，以确定CAR-T细胞在NOG小鼠中在皮下Raji人伯基特淋巴瘤异种移植模型中的功效。
使用转化药物开发公司(Translational Drug Development,LLC)(亚利桑那州斯科茨代尔市)采用的方法评估CD19靶向CAR-T细胞对NOG小鼠皮下Raji人伯基特淋巴瘤异种移植模型的疗效。简言之，开始研究前5-7天，将12只5-8周龄雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠单独圈养在通风微隔离的笼子里，在无病原体的条件下维持。在第1天，小鼠接受皮下接种5x106个Raji细胞/小鼠。如表1所示，将小鼠进一步分为3个治疗组。根据表1，在第8天(用Raji细胞接种后7天)，治疗组2和组3接受TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)的单次200μl的静脉内剂量。
表1.治疗组。
分组 Raji细胞(s.c.) TC1治疗(i.v.) N
1 5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 无 4
2 5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 4
3 5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 1x10<sup>7</sup>个细胞/小鼠 4
测量肿瘤体积和体重，并且当肿瘤体积≥500mm3时对每只小鼠实施安乐死。
到第18天，数据显示，与未治疗的小鼠相比，对TC1细胞有反应的肿瘤体积有统计学上显著的减少(图3)。对肿瘤体积的影响是剂量依赖性的(表2)；与接受较低剂量TC1细胞或不接受治疗的小鼠相比，接受较高剂量TC1细胞的小鼠显示显著降低的肿瘤体积。在治疗组中还观察到存活期增加(表2)。
表2.肿瘤反应和存活期。
分组 肿瘤体积(第18天) 肿瘤体积(第20天) 存活期(天) N
1 379.6±67.10 482±47.37 20-22 4
2 214.0±20.73 372.2±78.21 25 4
3 107.5±7.33* 157.1±10.62** 27(研究结束) 4
与对照(组1)相比，p＝0.007
与对照(组1)相比，**p＝0.0005
实例3：NOG小鼠中静脉内播散模型中的CD19靶向CAR-T细胞功效的评估。
为了进一步评估TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)的功效，使用了播散性小鼠模型。
静脉内播散性Raji人伯基特淋巴瘤异种移植模型
使用利用NOG小鼠中Raji人伯基特淋巴瘤肿瘤细胞系的静脉内播散模型(播散模型)以进一步证明TC1的功效。使用转化药物开发公司(亚利桑那州斯科茨代尔市)采用的和本文所述的方法，在播散模型中对TC1的疗效进行了评估。简言之，开始研究前5-7天，将24只5-8周龄雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠单独圈养在通风微隔离的笼子里，在无病原体的条件下维持。在研究开始时，将小鼠分为5个治疗组，如表9所示。在第1天，第2-5组的小鼠接受了0.5x106个Raji细胞/小鼠的静脉内注射。对小鼠进行静脉内接种以对播散性疾病建模。在第8天(用Raji细胞注射后7天)，治疗组3-5接受了TC1细胞的单次200μl静脉内剂量(表3)。
表3.治疗组。
Figure BDA0003377063530000361
在研究过程中，每天监测小鼠，并且每周两次测量体重。一个重要的终点是围发病(peri-morbidity)时间，并且还评估了T细胞植入的效果。记录了研究中每个组的动物死亡数的百分比和死亡时间。在达到垂死状态之前对小鼠实施安乐死。如果满足以下一项或多项标准，则可以将小鼠定义为垂死并处死：
体重减轻20％或以上持续超过1周的时间；
抑制正常生理功能(如进食、饮水、活动以及排尿和/或排便能力)的肿瘤；
延长的过度腹泻导致体重过度减轻(>20％)；或者
持续的喘息和呼吸窘迫。
如果临床观察到所定义的延长的或过度的疼痛或痛苦，动物也被认为是垂死的，诸如：虚脱、驼背姿势、瘫痪/麻痹、腹部膨胀、溃疡、脓肿、癫痫发作和/或出血。
类似于皮下异种移植模型(实例2)，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中播散模型显示统计学上显著的存活优势，如图4所示，p<0.0001。TC1治疗对播散模型中存活期的影响也是剂量依赖性的(表4)。
表4.动物存活期。
Figure BDA0003377063530000362
Figure BDA0003377063530000371
使用上述静脉内播散模型进行第二个实验。
在第1天，第2-4组的小鼠接受了0.5x106个Raji细胞/小鼠的静脉内注射。对小鼠进行静脉内接种以对播散性疾病建模。根据表5，在第4天(用Raji细胞注射后3天)，治疗组2-4接受了TC1细胞的单次200μl静脉内剂量。
表5.治疗组。
分组 Raji细胞(i.v.) TC1治疗(i.v.) N
1 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 无 6
2 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 0.6x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 7
3 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 1.2x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 5
4 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 2.4x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 5
再一次，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中播散模型显示统计学上显著的存活优势，如图5所示，p＝0.0016。TC1治疗对播散模型中存活期的影响也是剂量依赖性的(表6)。
表6.动物存活期。
Figure BDA0003377063530000372
脾对TC1治疗的反应的评估
在注射Raji后2-3周，从小鼠中收集脾，并通过流式细胞术评估组织中TC1细胞的持久性和脾中Raji细胞的根除。
将脾转移至C管中的3mL 1X DPBS CMF中，并使用MACS Octo解离器进行解离。将样品通过100微米筛网转移到15mL锥形管中，离心(1700rpm，5分钟，带制动的ART)，并重悬于1mL 1X DPBS CMF中，以使用Guava PCA进行计数。将骨髓离心并重悬于1mL的1X DPBS CMF中，以使用Guava PCA进行计数。将细胞以10x106个细胞/mL的浓度重悬于1XDPBS CMF中用于流式细胞术染色。
将试样(50μL)添加到1mL 1X Pharm Lyse中，并在室温(RT)下孵育10-12分钟。离心样品，然后用1X DPBS CMF洗涤一次。将样品重悬于50μL的1X DPBS中，并在RT下用人和小鼠TruStain孵育10-15分钟。样品用1mL 1X DPBS CMF洗涤一次，并重悬于50μL的1X DPBSCMF中进行染色。添加表面抗体，并将细胞在RT在黑暗中孵育15-20分钟，然后用1mL 1XDPBS CMF洗涤。然后将样品重悬于125μL的1X DPBS CMF中，以在流式细胞仪上进行采集。用以下表面抗体系列对细胞进行染色：
表7.抗体系列。
Figure BDA0003377063530000381
基于正向散射与侧向散射，通过电子门控(Pl＝总白细胞)确定细胞群。在使用来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Ultra Comp珠进行初始仪器设置后，进行补偿以解决从一个通道到另一个通道的溢出。流式细胞仪设置为在每个试管中收集10,000个CD45+事件。流式细胞术数据采集是使用FACSCantollTM流式细胞仪进行的。使用BO FACSDivaTM软件(版本6.1.3或8.0.1)获得数据。流式细胞术数据分析是以流式细胞图的形式进行的，流式细胞图是为测量每种细胞类型的相对百分比而生成的图形表示。
此实例证明，在TC1细胞治疗后，治疗上有益的TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞持续存在于脾中并选择性地从该组织根除Raji细胞(图6A)。另外，用TC1细胞治疗未表现出Raji诱导的细胞质量增加(图6A)。此外，图7显示，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞治疗的小鼠的脾中剩余的人类细胞是CD8+。这些CD8+ T细胞也是CD3阴性的，这证明此模型中持续的T细胞仍然为TCR/CD3阴性的并因此被编辑。
静脉内播散的Nalm-6人急性淋巴母细胞白血病肿瘤
异种移植模型
使用利用NOG小鼠中Nalm-6人急性淋巴母细胞白血病肿瘤细胞系的静脉内播散模型(播散模型)以进一步证明TC1的功效。使用转化药物开发公司(亚利桑那州斯科茨代尔市)采用的和本文所述的方法，在播散模型中对TC1的疗效进行了评估。简言之，开始研究前5-7天，将24只5-8周龄雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠单独圈养在通风微隔离的笼子里，在无病原体的条件下维持。在研究开始时，将小鼠分为5个治疗组，如表14所示。在第1天，第2-4组的小鼠接受了0.5x106个Nalm6细胞/小鼠的静脉内注射。对小鼠进行静脉内接种以对播散性疾病建模。根据表8，在第4天(用Nalm6细胞注射后3天)，治疗组2-4接受了TC1细胞的单次200μl静脉内剂量。
表8.治疗组。
分组 Nalm6细胞(i.v.) TC1治疗(i.v.) N
1 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 无 6
2 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 1x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 6
3 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 2x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 6
4 0.5x10<sup>6</sup>个细胞/小鼠 4x10<sup>6</sup>个CAR<sup>+</sup>细胞/小鼠 6
在研究过程中，每天监测小鼠，并且每周两次测量体重(如上所述)。
类似于Raji静脉内播散模型(以上)，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中Nalm6模型还显示出统计学上显著的存活优势，如图8所示，p＝0.0004。TC1治疗对Nalm6播散模型中存活期的影响也是剂量依赖性的(表9)。
表9.动物存活期。
Figure BDA0003377063530000391
实例4：NOG小鼠中静脉内播散模型中的CD19靶向CAR-T细胞功效的进一步评估。
本研究的目的是评估多剂量水平的抗CD19 CAR+ T细胞对NOG小鼠Nalm6-Fluc-GFP急性淋巴母细胞白血病肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。对小鼠进行静脉内接种以对播散性疾病建模。重要的终点是围发病(peri-morbidity)时间。进行生物发光成像以监测播散性疾病的进展。
简言之，开始研究前5-7天，将6周龄雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠圈养在通风微隔离的笼子里，在无病原体的条件下维持。第1天小鼠接受静脉内接种5×104个Nalm6-Fluc-GFP(Nalm6-Fluc-Neo/eGFP--Puro；伊马尼斯生命科学公司(Imanis Life Sciences)(明尼苏达州罗切斯特))细胞/小鼠。接种Nalm6 Fluc GFP细胞后三(3)天，将小鼠分为治疗组，并给予包含TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+ T细胞的T细胞群，如表10所示。捕获和报告目的区域值(ROI)。从第4天(接种Nalm6 Fluc GFP细胞后3天)开始到第67天，每天测量两次体重，每周测量两次生物发光；从第74天开始到研究结束，每周测量一次。为了测量生物发光小鼠，用200μl的D-萤光素150mg/kg腹膜内注射。在研究开始时以及整个过程中根据需要拍摄动力学图像，以确定最佳的D-萤光素后剂量和暴露时间，从而对小鼠进行成像。使用软件版本为1.2.0(光谱仪器成像公司(Spectral Instrumentsimaging Inc)；亚利桑那州图森市)的AMI 1000成像装置，通过捕获发光信号(开放发射)对小鼠进行成像。
表10.治疗组。
Figure BDA0003377063530000401
在围发病(临床体征表明肿瘤负荷高(例如缺乏运动能力、驼背、活动不足)或体重减轻20％或更大，持续时间超过1周)对单个小鼠实施安乐死。在达到垂死状态之前对小鼠实施安乐死。当最终的小鼠被安乐死为长期存活者时，该研究于第99天结束。
图9显示了相对于未治疗的小鼠接受不同剂量的TC1细胞的小鼠的延长的存活期。图10显示了接受最高剂量TC1细胞(12x106细胞/小鼠)的小鼠的低至不可检测的生物发光水平，并且所述剂量导致了图9所示的最长存活期。在第74天，在所有4只小鼠中检测到生物发光，指示治疗组中的肿瘤细胞扩增。
总体而言，这些结果表明，单次注射TC1细胞可以延长施用致死剂量的Nalm6 B-ALL细胞的小鼠的存活期。这种延长的存活期是依赖于低、中和高剂量TC1细胞之间观察到的分级存活反应的剂量。
实例5：施用同种异体CD19靶向CAR T细胞的小鼠中的移植物抗宿主病分析。
进行小鼠的研究以评估未编辑的人类T细胞和TC1细胞导致移植物抗宿主病的可能性(GvHD)。在用200cGy全身辐照后，NOG雌性小鼠被单次静脉内施用缓慢推注未编辑的人类T细胞或TC1细胞。在仅辐射(组1)或辐射加单剂量施用PBMC(组2)、电穿孔T细胞(组3)或TC1细胞(组4)后，对动物进行长达119天的随访。在第1天辐射后约6小时施用细胞。表11总结了组和研究设计。
表11.治疗组。
Figure BDA0003377063530000411
研究的终点是存活期、GvHD症状显现的动力学和体重测量。
在治疗后的前30天内，观察到组1(12只动物中的3只)、组2(6只动物中的6只)和组3(6只动物中的2只)的死亡率(图11)。第4组(TC1细胞)中的所有动物都存活到预定的尸检(图11)。1组、2组和3组垂死的动物经历了与GvHD发展一致的体重减轻和/或临床观察(轻度至重度触摸寒冷、轻度至中度消瘦、轻度至明显驼背姿势、重度体重减轻、轻度至重度脱发)、重度活动减退、中度呼吸困难和明显的呼吸急促)。组1和组4的动物以及组3的非垂死动物在辐射后经历了轻微的体重减轻，这在研究过程中有所改善(图12)。没有记录显著的临床观察结果。
该研究证明，未编辑的人类PBMC在所有动物(组2)的受辐照的NOG小鼠中诱导致命的GvHD，并在施用细胞后2至3周发作。相比之下，在研究期间(119天)，接受TC1细胞的小鼠(组4)没有发生GvHD，尽管施用给这些动物的细胞数量更多(与每只小鼠6x106个PBMC相比，每只小鼠3x107个TC1细胞)。辐照程序在所有组中诱导短暂体重减轻，并在未接受未编辑的PBMC的所有组中恢复。
进行了第二项研究以进一步评估未编辑的人类T细胞和TC1细胞引起GvHD的可能性。具体来说，NOD/SCID/IL2Rγ空(NSG)雌性小鼠在全身辐照后单次静脉内缓慢推注未编辑的人类T细胞或TC1细胞(总辐照剂量为200cGy，160cGy/min；靶向LDR0/140R)。该研究的终点是存活期、GvHD症状显现的动力学和体重测量。还对所有收集的组织进行了组织病理学检查。在适当的情况下，通过流式细胞术和免疫组织化学(IHC)评估小鼠血液和组织中的暴露情况。
如表12中所述，作为单剂量通过静脉内缓慢推注来施用细胞。
表12.研究设计。
Figure BDA0003377063530000421
a组1动物没有受到辐照，也没有给予细胞(给动物施用媒介物，PBS1X)。组2动物接受照射但未给予细胞(给动物施用媒介物、磷酸盐缓冲盐水[PBS])。
使用经验证的临床前软件系统(Provantis)将动物按体重随机分配到治疗组中。由于这项研究的规模很大，给药和尸检活动在九天内交错进行。为了最小化偏差，来自对照组和TC1组(第4组和第5组)的动物在同一天给药并进行尸检。在研究第85天对所有组进行尸检。
对接受未编辑的人类T细胞的所有动物(组3)观察死亡率，在第14天发作(图13)。到第29天，所有接受未编辑的人类T细胞(组3)的小鼠都被发现死亡或被送往计划外的安乐死。这些动物的临床体征与GvHD的发展相一致，包括毛发暗淡、轻度至重度活动减少、驼背姿势、轻度至中度消瘦和呼吸频率增加。在接受未编辑的人类T细胞(组3)的小鼠安乐死时，观察到血液学参数的显著变化，包括红细胞、血红蛋白、血小板、白细胞和网织红细胞计数的减少。在组3动物的肝、肺、肾、脾和胸腺中观察到最小至中度炎症。坏死通常伴随着这些组织的炎症。这些发现与GvHD的发展一致。另外，大多数组3动物的股骨和胸骨骨髓中也存在轻度至重度细胞不足，这可能归因于全身辐照的影响。由于早期尸检日期(放疗后2-4周)，这可能仅在该组中观察到，而所有其他组为12周。与GvHD的存在一致，组3动物的免疫组织化学分析显示在所有检查的组织(肾、肝、脾、肺、皮肤和消化道)中都存在人CD45P+P细胞。其他组中的所有动物都存活到预定的尸检。
此外，在第1、2、4或5组中没有观察到显著的体重减轻(图14)。在这些组中没有记录与GvHD一致的显著临床观察，其特征是观察到至少两种被认为可能表示GvHD的症状。在整个研究过程中，来自第4组和第5组的几只动物表现出诸如毛皮暗淡、活动轻微至中度减少和/或轻微变瘦等症状。尽管这些症状通常与GvHD相关，但它们显现与TC1无关，因为它们很少被观察到，短暂且持续时间很短，并且在一些受过辐照的对照动物中也可见到(组2)。
总的来说，这两项研究的结果证实TC1细胞不会诱导移植物抗宿主病。
实例6：靶向CAR T细胞的同种异体CD19的开发批次的制备和表征。
用于临床研究目的的TC1细胞是从健康供体外周血单核细胞中制备的，这些细胞是通过标准的白细胞去除术程序获得的。将单核细胞富集T细胞，并用抗CD3/CD28抗体包被珠活化，然后用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物电穿孔，并用含有重组腺相关病毒(AAV)载体的CAR基因转导。将修饰的T细胞在细胞培养物中扩增、纯化、配制成悬浮液并冷冻保存。
在修饰细胞之前，评估了来自六个不同健康供体的T细胞的各种细胞表面标志物的表达。CD8+亚群中的CD27+CD45RO-T细胞先前显示与在用抗CD19 CAR T细胞疗法治疗时的慢性淋巴细胞白血病(CLL)完全反应相关(Fraietta等人,Nat Med[自然·医学],第24卷(5):563-571,2018)。因此，通过流式细胞术评估六个不同供体CD8+亚群中CD27+CD45O-T细胞的百分比。简而言之，将1x106个细胞与Fab-生物素或IgG-生物素抗体一起孵育，作为阴性对照。用染色缓冲液洗涤细胞，并与小鼠抗IgG一起孵育以捕获过量的一抗。将细胞再次洗涤并与二抗全系列(CD8，百进公司(Biolegend)：目录号300924，CD45RO，百进公司：目录号304230，CD27，百进公司：目录号560612)和活力染料一起孵育。最后一次用染色缓冲液洗涤细胞并在流式细胞仪上运行以捕获各种染色的群体。图15显示了CD8+亚群中CD27+CD45RO-T细胞的水平。同种异体CAR-T制造允许选择具有有利特征的供体输入材料，诸如目的供体的CD8+部分中的高CD27+CD45RO-细胞。
更具体地说，来自18至40岁男性供者的白细胞被用于分离CD4+和CD8+ T细胞。在分离、富集和活化CD4+和CD8+ T细胞后，用包含Cas9核酸酶蛋白、TRAC sgRNA(SEQ ID NO:26)或B2M sgRNA(SEQ ID NO:27)的核糖核蛋白复合物对细胞进行电穿孔。在电穿孔之前将TRAC和B2M核糖核蛋白复合物合并。电穿孔后，将包含编码抗CD19 CAR(SEQ ID NO:40)的供体模板(SEQ ID NO:54)的新鲜解冻的rAAV加入细胞中，并孵育细胞。然后在培养物中扩增细胞并每三到四天补充rhIL-2和rhIL-7。使用TCR系列(CD5、CD4、CD8、TCRαβ、B2M和CD45)测试设置进行监测的细胞的T细胞身份和基因编辑。在确认T细胞身份后，通过将细胞与生物素偶联的抗TCRαβ抗体和抗生物素珠一起孵育来清除TCRαβ。回收经过清除的细胞并配制用于施用。所得细胞群具有少于0.5％的TCRαβ+细胞。图16显示了纯化前后TCRαβ+细胞的分析。
测试了八个开发批次的TC1细胞的T细胞身份。八个测试批次的平均结果显示84.58％的B2M敲除率(即，15.42％B2M+细胞)，且99.98％的细胞为TCR-(即，0.2％TCR+)，以及约50％的抗CD19 CAR敲除率(图17)。
另外，在T细胞编辑之前和之后，对供体的耗竭和衰老标志物进行了评估。具体而言，由总T细胞群确定PD1+、LAG3+、TIM3+和CD57+细胞的百分比。如上所述，使用以下二抗通过流式细胞术评估标志物的表达：小鼠抗PD1 PeCy7，百进公司，目录号329918；小鼠抗TIM3BV421，百进公司，目录号345008；小鼠抗CD57 PerCp Cy5.5，百进公司，目录号359622；以及小鼠抗LAG3 PE，百进公司，目录号369306。图18显示了在基因组编辑后，耗竭或衰老标志物从未增加超过总T细胞群的15％。
另外，在体外评估了三个不同批次的TC1细胞的选择性杀伤。具体而言，将TC1细胞与CD19阳性细胞系(K562-CD19；Raji；和Nalm6)或CD19阴性细胞系(K562)一起孵育。大约24小时后，使用基于流式细胞术的细胞毒性测定来测量杀伤。具体而言，将靶细胞用5μMefluor670(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)标记，洗涤并在共培养物中用TC1或对照T细胞以不同的比例(从0.1:1到4:1的T细胞与靶细胞)孵育过夜(50,000个靶细胞/孔；96孔U型底板[康宁公司(Corning)，图克斯伯里，马萨诸塞州])。第二天，洗涤微孔并用200μL新鲜培养基替换培养基，该新鲜培养基含有5mg/mL4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)的1:500稀释液，以计数死亡/垂死的细胞。最后，向每个孔中添加25μL CountBright珠(赛默飞世尔科技公司)，然后使用Novocyte流式细胞仪(ACEA生物科学公司(ACEA Biosciences)，圣地亚哥，加利福尼亚州)通过流式细胞术对细胞进行分析。Flowjo软件(v10,Flowjo，亚什兰，俄勒冈州)用于分析流式细胞术数据文件(fcs文件)。将TCRαβ+ T细胞(未编辑的细胞)用作对照。TC1细胞比未编辑的T细胞有效地杀死更高比率的CD19阳性细胞，而CD19阴性细胞在TC1细胞存在时显示出低细胞溶解水平，不超过与未编辑的T细胞共培养时的情况(图19)。
从三个独特的供体产生的TC1细胞也用于评估在没有细胞因子和/或血清的情况下的生长。具体而言，TC1细胞在全T细胞培养基中生长14天。第0天，来自培养物的细胞在完全T细胞培养基(包含X-VIVO 15(龙沙公司(Lonza)，巴塞尔，瑞士)、5％的人类AB血清(生物医学谷(Valley Biomedical)，温彻斯特，弗吉尼亚州)、IL-2(美天旎公司(Miltenyi)，伯吉斯奇·格拉巴赫，德国)和IL-7(Cellgenix公司，弗里堡，德国))(完全培养基)中生长，该培养基包含血清但不含IL-2或IL-7细胞因子(5％血清，无细胞因子)或者无血清或细胞因子(无血清，无细胞因子)。在去除细胞因子和/或血清后，如上计数细胞长达35天。在没有细胞因子和/或血清的情况下没有观察到TC1细胞的生长(图20)。
对于施用，将TC1细胞重新悬浮在冷冻保存液(CryoStor CS-5)中，并装入6mL输液瓶中。总剂量包含在一个或多个小瓶中。每个小瓶的输注在解冻后20分钟内进行。
实例7：同种异体CRISPR-Cas9工程化T细胞(CTX110)在复发性或难治性B细胞恶性肿瘤患者中的安全性和有效性的I期、开放标签、多中心、剂量递增和队列扩展研究。
CTX110是一种CD19定向的嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法，包括使用CRISPR-Cas9(规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)基因编辑组分(单指导RNA和Cas9核酸酶)基因修饰的同种异体T细胞。这些修饰包括靶向破坏T细胞受体(TCR)α恒定(TRAC)和β-2微球蛋白(B2M)基因座，以及通过腺相关病毒表达盒将抗CD19 CAR转基因插入TRAC基因座。抗CD19 CAR(SEQ ID NO:40)由包含SEQ ID NO:47的抗CD19单链可变片段、SEQ IDNO:32的CD8跨膜结构域、SEQ ID NO:36的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO:38的CD3ζ信号传导结构域组成。
在这项研究中，适合的人类患者在淋巴细胞清除(LD)化疗后接受了CTX110的静脉内(IV)输注。
研究群体
剂量递增和队列扩展包括患有B细胞恶性肿瘤的成年受试者。基于疾病组织学将受试者分配到独立的剂量递增组。招募的成年受试者包括患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)特定亚型的受试者，包括未另行指定(NOS)的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤(FL)、3b级FL或CLL的Richter转化。
研究目的和基本原理
1期剂量递增研究的目的是评估抗CD19同种异体CRISPR-Cas9工程化T细胞(CTX110细胞)在复发性或难治性B细胞恶性肿瘤患者中的安全性和有效性。
复发性/难治性B细胞恶性肿瘤患者的预后历来都很差。然而，在这种情况下使用自体CAR T细胞疗法产生了完全和持久的反应，而以前的治疗方案是姑息性的(June等人,(2018)Science[科学],359,1361-1365；Maus和June,(2016)Clin Cancer Res[临床癌症研究],22,1875-1884；Neelapu等人,(2017)N Engl J Med[新英格兰医学杂志],377,2531-2544；Schuster等人,(2019)N Engl J Med[新英格兰医学杂志],380,45-56；Schuster等人,(2017)NEngl J Med[新英格兰医学杂志],377,2545-2554)。自体CAR T细胞疗法需要患者特异性的细胞收集和制造。不幸的是，一些患者不适合接受白细胞去除术，或者他们在等待治疗时经历了疾病进展或死亡。同种异体现成CAR T细胞产品(诸如CTX110)可以提供即时可用性的好处，降低制造变异性，并防止个别受试者制造失败。
此外，接受多轮化疗的患者可能会出现具有耗竭或衰老表型的T细胞。用自体CART细胞疗法治疗的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的低反应率部分归因于耗尽的T细胞表型(Fraietta等人,(2018)Nat Med[自然·医学],24,563-571；Riches等人,(2013)Blood[血液],121,1612-1621)。与自体产品相比，通过从来自健康供体的未接受化疗的T细胞开始的同种异体方法可以提高CAR T疗法的一致性和效力。
使用同种异体CAR T细胞的主要障碍是移植物抗宿主病(GvHD)的风险。CRISPRCas9基因编辑技术可实现可靠的多重细胞编辑。CTX110制造过程通过同源重组将CAR构建体的引入与TRAC基因座的破坏相结合。使用AAV递送的DNA供体模板和HDR在TRAC基因组基因座处递送和精确插入CAR与使用慢病毒和逆转录病毒转导方法随机插入遗传物质形成对比。在TRAC基因座处插入CAR基因导致几乎所有表达CAR的细胞中的TCR消除，从而最大限度地降低GvHD的风险。此外，从健康供体细胞制造可消除无意转导恶性B细胞的风险(Ruella等人,(2018)Nat Med[自然·医学],24,1499-1503)。这项针对复发性/难治性B细胞恶性肿瘤受试者的首次人体试验旨在评估CTX110与这种CRISPR-Cas9修饰的同种异体CAR T细胞方法的安全性和有效性。
CTX110，一种CD19定向的基因修饰同种异体T细胞免疫疗法，由健康供体的细胞制成；因此，由此产生的制造细胞旨在为每个受试者提供质量可靠的一致最终产品。此外，通过使用AAV和同源定向修复(HDR)在TRAC位点精确递送和插入CAR，CTX110的制造不存在与随机插入慢病毒和逆转录病毒载体相关的风险。
目标
主要目标，A部分(剂量递增)：评估CTX110与各种淋巴细胞清除剂联合对复发性或难治性B细胞恶性肿瘤患者的安全性，以确定推荐的B部分剂量。
主要目标，B部分(队列扩展)：评估CTX110在复发性或难治性B细胞恶性肿瘤受试者中的疗效，通过客观反应率(ORR)清除。
次要目标(A部分和B部分)：进一步表征CTX110的功效、安全性和药代动力学。
探索性目标(A部分和B部分)：鉴定与CTX110相关的基因组、代谢和/或蛋白质组生物标志物，这些生物标志物可能指示或预测临床反应、耐药性、安全性或药效学活性。
终点
主要终点
·A部分：不良事件的发生率，定义为剂量限制性毒性。
·B部分：根据恶性淋巴瘤卢加诺反应标准(Cheson等人,(2014)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志],32,3059-3068)，客观反应率(ORR)定义为完全反应(CR)+部分反应(PR)，由独立中枢放射学回顾确定。
卢加诺分类提供了一种评估淋巴瘤受试者成像的标准化方法。它包括诊断CT上肿瘤负荷的放射学评估，以及嗜FDG组织学上F18 FDG-PET的代谢评估(参见表13-14)。
表13.卢加诺分类评估组分。
Figure BDA0003377063530000481
Figure BDA0003377063530000491
CT：计算机断层摄影术；F18 FDG：氟脱氧葡萄糖F18；LDi：最长直径；MRI：磁共振成像；PET：正电子发射断层扫描。
*参见(Barrington等人,(2014)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志],32,3048-3058)。
表14.卢加诺反应评估标准。
在每个随访时间点，根据以下定义进行基于PET的反应和基于CT的反应。
Figure BDA0003377063530000492
Figure BDA0003377063530000501
Figure BDA0003377063530000511
FDG：氟脱氧葡萄糖；IHC：免疫组织化学；LDi：最长直径；N/A：不适用；PPD：垂直直径；SDi：最短直径；SPD：直径的乘积之和。
*多维尔评分为3表示完全代谢反应(Barrington等人,(2014)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志],32,3048-3058)。
注意：已经认识到，在具有高生理吸收或具有脾或骨髓内活化(例如，用化疗或骨髓集落刺激因子)的Waldeyer环或结外部位，吸收可能大于正常纵隔和/或肝。在这种情况下，如果初始受累部位的吸收不大于周围正常组织，即使该组织具有高生理吸收，也可以推断出完全代谢反应。
次要终点(剂量递增和队列扩展)
功效
·反应/缓解持续时间(中枢读数/评估)。仅针对有客观反应事件的受试者报告反应/缓解持续时间。这计算为首次客观反应与疾病进展或因任何原因死亡的日期之间的时间。
·无进展/无事件存活期(中枢读取/评估)。无进展存活期(PFS)和无事件存活期计算为CTX110输注日期与疾病进展或因任何原因死亡日期之间的差异。在数据截止日期未取得进展且仍在研究的受试者在其最后评估日期进行审查。
·总存活期。总存活期计算为CTX110首次剂量日期与任何原因导致的死亡之间的时间。对在数据截止日期活着的受试者在他们已知活着的最后日期进行审查。
安全性
·AE的频率和严重程度以及临床上显著的实验室异常。
药代动力学
·随着时间的推移，血液中CTX110的水平。
探索性终点(剂量递增和队列扩展)
·组织中CTX110的水平(例如，骨髓、CSF和/或肿瘤组织中CTX110的运输可以在根据方案特异性采样收集的任何样品中进行评估)。
·血液和其他组织中细胞因子的水平。
·抗CTX110抗体的发生率。
·随着时间的推移，B细胞和免疫球蛋白的水平。
·抗细胞因子疗法对CTX110增殖、CRS和反应的影响。
·CTX110疗法后自体或同种异体HSCT的发生率。
·后续抗癌疗法的发生率和类型。
·完全反应/缓解的时间。
·首次后续无疗法存活期。
·其他基因组、蛋白质、代谢或药效学终点。
研究设计
这是一种评估CTX110在复发性或难治性B细胞恶性肿瘤受试者中的安全性和有效性的开放标签、多中心、1期研究。该研究分为2个部分：剂量递增(A部分)，随后是队列扩展(B部分)。
A部分研究了队列A中具有以下NHL亚型之一的成年受试者中的CTX110的剂量递增：DLBCL NOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、3b级FL、或转化型FL。
在研究的剂量递增部分，添加了1个与队列A相似的具有NHL群体的队列(队列B)，以探索相对于队列A(500mg/m2)的环磷酰胺(750mg/m2)剂量增加。队列B中的受试者接受增加剂量的环磷酰胺治疗，以探索CTX110输注后更长时间抑制淋巴细胞对CAR T细胞扩增的影响(参见表15)。
表15.队列A和队列B。
Figure BDA0003377063530000521
Figure BDA0003377063530000531
DL1/2：剂量水平1或2；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；FL：滤泡性淋巴瘤；IV：静脉内注射；LD：淋巴细胞清除。
该研究分为2个部分：剂量递增(A部分)，随后是队列扩展(B部分)。研究的两个部分将包括3个主要阶段：筛选、治疗和随访。研究方案的示意性描绘示于图21中。
表16和表17中提供了评估时间表。
阶段1-筛选以确定治疗资格(最多14天)。
阶段2-淋巴细胞清除(LD)化疗和CTX110输注(1-2周)。在开始LD化疗和输注CTX110之前，必须重新确认受试者的临床资格。
阶段2A-LD化疗：
队列A：每天静脉内(IV)共同施用氟达拉滨30mg/m2和环磷酰胺500mg/m2，持续3天。
队列B：每天静脉内(IV)共同施用氟达拉滨30mg/m2和环磷酰胺750mg/m2，持续3天。
阶段2B-CTX110输注：
队列A(NHL亚群)：在CTX110输注前至少48小时(但不超过7天)完成淋巴细胞清除(LD)化疗(每天静脉内注射[IV]氟达拉滨30mg/m2和环磷酰胺500mg/m2，持续3天)(从剂量水平[DL]1开始剂量递增)。
队列B(更高的LD化疗剂量)：在CTX110输注前至少48小时(但不超过7天)完成LD化疗(每天静脉内注射氟达拉滨30mg/m2和环磷酰胺750mg/m2，持续3天)(从剂量水平[DL]2开始剂量递增)。
阶段3-随访(最后一次CTX110输注后5年)。
对于剂量递增和队列扩展，受试者必须在CTX110输注后28天内保持在研究站点附近(即1小时的转运时间)。在此急性毒性监测期间，受试者将定期评估不良事件(AE)，包括细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性和GvHD。研究方案中提供了毒性管理指南。在剂量递增期间，所有受试者将在CTX110输注后的前7天住院，如果当地法规或站点实践需要，则更长时间。
在急性毒性监测期之后，受试者将在CTX110输注后进行长达5年的随访，包括体检、定期实验室和影像学评估以及AE评估。完成这项研究后，受试者将需要参加另外10年的单独长期随访研究，以评估长期安全性和存活期。
如果出现以下任何体征或症状，则延迟LD化疗：
·根据研究人员的说法，临床状态的显著恶化会增加与LD化疗相关的AE的潜在风险。
·需要补充氧气以维持>91％的饱和度水平。
·新的不受控制的心律失常。
·需要血管升压药支持的低血压。
·活动性感染：对治疗无反应的细菌、真菌或病毒的阳性血培养物。
·≥2级急性神经毒性。
Figure BDA0003377063530000551
Figure BDA0003377063530000561
12在研究招募后7天内开始LD化疗。LD化疗完成后，确保CTX110输注前≥48小时(但≤7天)的洗脱期。在第一剂LD化疗之前进行的体格检查、体重和凝血实验室检查。在LD化疗期间每天(即3次)评估和记录生命体征、CBC、临床化学和AE/伴随用药。
13在完成LD化疗后48小时至7天施用CTX110。
14在CTX110输注前28天内进行基线疾病评估(NHL受试者的PET/CT)。如果CT有临床禁忌症，或当地法规要求，则允许使用增强MRI。
15BM活检以确认完全缓解，作为疾病评估的一部分。BM活检也可在疾病复发时进行。CTX110输注后来自BM抽吸物的样品应发送用于CTX110PK和探索性生物标志物。执行±5天的访视日期。
16任选的：对于患有适合活检的疾病并提供单独同意书的受试者。执行±5天的访视日期。
17优选受试者在筛选期间进行肿瘤活检。但是，如果在招募前3个月内和最近一个疗法线后对复发性/难治性疾病进行了活检，则可以使用存档组织。如果研究中出现复发，应尽一切努力对复发肿瘤进行活检并送至中枢病理学。肿瘤活检是指骨髓以外的组织。
18在第2个月和第3个月进行评估以确认第1个月未达到的CR。
19仅在先前接受过同种异体的HSCT的受试者中进行。
20感染性疾病测试(HIV-1、HIV-2、HCV抗体/PCR、HBV表面抗原、HBV表面抗体、HBV核心抗体)≤30天签署ICF可被视为受试者资格。
21筛选时、LD化疗第一天开始前、CTX110输注前以及所有列出的时间点的淋巴细胞亚群评估。包括6色TBNK系列，或T、B和自然杀伤细胞的等效物。
22血型和抗体筛选。
23CTX110 PK的样品应从CTX110输注后进行的任何LP、BM活检或组织活检中发送。如果发生CRS，将在计划访视之间每48小时收集一次用于评估CTX110水平的样品，直到CRS消退。
24如果连续测试呈阴性，申办方可以要求停止样品采集。继续所有列出的时间点的样品收集，直到申办方另有指示。
25第1天采集的两个样品：一次CTX110前输注和一次CTX110输注结束后20(±5)分钟。
26在CRS期间应每天收集另外的细胞因子样品。在CTX110输注前收集第1天样品。
27探索性生物标志物样品应从CTX110输注后进行的任何LP或BM活检中发送。如果发生CRS，将在计划访视之间每48小时收集一次用于评估探索性生物标志物的样品，直到CRS消退。
28仅在LD化疗的第一天之前。
Figure BDA0003377063530000581
淋巴细胞清除的目的是允许输注后显著的CAR T细胞扩增。由不同剂量的氟达拉滨和环磷酰胺组成的LD化疗已成功应用于若干自体CAR T细胞试验。使用LD化疗的基本原理是消除调节性T细胞和免疫系统中充当‘细胞因子沉没(cytokine sink)’的其他竞争性成分，提高白细胞介素7(IL-7)和白细胞介素15(IL-15)等细胞因子的可用性(Dummer等人,(2002)J Clin Invest[临床研究杂志],110,185-192；Gattinoni等人,(2005)J Exp Med[实验医学杂志],202,907-912)。另外，假设当原始T细胞总数降低到某个阈值以下时，原始T细胞开始增殖并分化为记忆样T细胞(Dummer等人,(2002)J Clin Invest[临床研究杂志],110,185-192)。队列A将使用环磷酰胺(500mg/m2)和氟达拉滨(30mg/m2)，剂量与阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)注册临床试验中使用的剂量一致。队列B将使用更高剂量的环磷酰胺(750mg/m2)来评估增加的淋巴细胞清除强度是否可能促进同种异体CAR T细胞产品的扩增。在此范围内的环磷酰胺剂量(总剂量>120mg/kg或3g/m2)已用于血液恶性肿瘤的先前CAR T细胞疗法研究(Brentjens等人,(2011)Blood[血液],118,4817-4828；Kochenderfer等人,(2015)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志],33,540-549；Turtle等人,(2016)Sci Transl Med[科学·转化医学],8,355ra116)。当作为高强度LD化疗的一部分使用时，环磷酰胺剂量的增加与疗效的提高有关(Hirayama等人,(2019)Blood[血液],133,1876-1887)。
如果出现以下任何体征或症状，将延迟CTX110输注：
·新的活动性的不受控制的感染。
·与LD化疗开始前相比，临床状态恶化，在研究人员看来，这使受试者处于增加的毒性风险中。
·≥2级急性神经毒性。
CTX110剂量
使用基于CAR+ T细胞数量的平给药方案静脉内施用CTX110细胞。起始剂量为3x107个CAR+ T细胞，比目前批准用于NHL的自体CAR T细胞(包括
Figure BDA0003377063530000591
(共5x108个CAR T细胞)和
Figure BDA0003377063530000592
(2x106kg，最大2x108个CAR T细胞)的剂量低约1log。
剂量递增
将使用标准的3+3设计进行剂量递增。以下CTX110剂量基于CAR+ T细胞，可在本研究中从队列A的DL1开始进行评估。只有在安全审查委员会(SRC)对队列A中DL2的安全性进行评估和确认后，才可开放/招募后续队列B，并从DL2开始剂量递增。由于研究的剂量限制为7x104个TCR+细胞/kg，如果受试者体重≥60kg，研究可能会在队列A和/或队列B中使用DL4(参见表18)。
表18.剂量水平。
剂量水平 CAR+ T细胞总剂量
-1 1x10<sup>7</sup>
1 3x10<sup>7</sup>
2 1x10<sup>8</sup>
3 3x10<sup>8</sup>
4 1x10<sup>9</sup>
CAR：嵌合抗原受体。
DLT评估期从CTX110输注开始，持续28天。每个队列中的前3名受试者将以交错的方式进行治疗，以便第2名和第3名受试者仅在前一名受试者完成DLT评估期后才会接受CTX110。在随后的剂量水平或相同剂量水平的扩展中，最多可招募3名受试者的队列并同时给药。
受试者必须接受CTX110才能进行DLT评估。如果受试者在CTX110输注之前的任何时间停止研究，将不会对受试者进行DLT评估，并且将以与中止受试者相同的剂量水平招募替代受试者。如果DLT可评估受试者具有潜在DLT的体征或症状，则DLT评估期将根据方案定义的窗口延长，以使得在宣布DLT之前改善或消退。
毒性根据国家癌症研究所不良事件通用术语标准(CTCAE)第5版进行分级和记录，CRS(Lee标准)、神经毒性(ICANS、免疫效应细胞相关神经毒性综合征标准和CTCAE v5.0)和GvHD(西奈山急性GVHD国际联合会[MAGIC]标准)除外。
DLT将被定义为在DLT评估期间发生的超过指定持续时间(相对于发作时间)的以下任何事件：
·≥2级类固醇难治性GvHD(例如，类固醇治疗3天后疾病进展[例如，1mg/kg/天]，7天后疾病稳定，或治疗14天后部分反应)。
·在DLT期间死亡(由于疾病进展除外)。
·根据研究人员的判断具有临床意义且在72小时内未改善的任何3级或4级毒性。
·以下内容不会被视为DLT：
ο3级或4级CRS，在72小时内改善至≤2级。
ο3级或4级神经毒性(例如，脑病、意识模糊)，在14天内改善至≤2级。
ο3级或4级发热。
ο血小板减少症的情况下出血(血小板计数<50x109个/L)；在中性粒细胞减少症(绝对中性粒细胞计数<1000/mm3)的情况下有记录的细菌感染或发热。
ο3级或4级低丙种球蛋白血症。
ο3级或4级肺毒性在7天内消退至≤2级。对于因支持性护理导致体液超负荷而插管的受试者，这可能会延长至14天。
ο3级或4级肝功能研究在14天内改善至≤2级。
ο3级或4级肾功能不全在21天内改善至≤2级。
ο将回顾性评估3级或4级血小板减少症或中性粒细胞减少症。至少6名受试者输注后，如果≥50％的受试者有延长的细胞减少症(即，输注后持续超过28天)，剂量递增将暂停，等待SRC评估。
与CTX110没有合理因果关系的AE不会被视为DLT。
毒性管理
受试者必须在CTX110输注后密切监测至少28天。自体CAR T细胞疗法报告了显著毒性，研究人员需要根据方案指南主动监测和治疗所有不良事件。
根据CD19定向的自体CAR T细胞疗法的先前经验，提供以下一般建议：
·发热是细胞因子释放综合征(CRS)最常见的早期表现；然而，受试者也可能在首次出现时经历虚弱、低血压或意识模糊。
·CRS的诊断应基于临床症状而不是实验室值。
·在对CRS特异性管理没有反应的受试者中，始终考虑败血症和耐药性感染。应持续评估受试者的耐药性或紧急细菌感染，以及真菌或病毒感染。
·CRS、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)和肿瘤溶解综合征(TLS)可能在CART细胞输注后同时发生。应持续监测受试者的所有病症的体征和症状，并进行适当管理。
·神经毒性可能发生在CRS时、CRS消退期间或CRS消退后。神经毒性的分级和管理将与CRS分开进行。
·托珠单抗必须在订购后2小时内施用。
在整个研究过程中，将持续评估CTX110的安全性概况，研究人员将定期更新关于潜在CTX110相关毒性鉴定和管理的新信息。
输注反应
在自体CD19定向的CAR T细胞试验中已经报告了输注反应，包括短暂的发热、寒战和/或恶心。如果发生输注反应，根据需要，可在CTX110输注后每6小时重复对乙酰氨基酚(扑热息痛)和盐酸苯海拉明(或另一种H1-抗组胺药)。如果受试者继续有无法通过对乙酰氨基酚缓解的发热，则可以根据需要开具非类固醇抗炎药。除非在危及生命的紧急情况下，否则不应使用全身性类固醇，因为这种干预可能对CAR T细胞产生有害影响。
发热反应和感染预防
感染预防应根据免疫功能低下环境中B细胞恶性肿瘤患者的护理机构标准进行。在出现发热反应的情况下，应开始对感染进行评估，并根据医学指示并由治疗医师确定对受试者进行适当的抗生素、液体和其他支持性护理来管理。如果发热持续存在，应在受试者的整个医疗管理过程中考虑病毒和真菌感染。如果受试者在CTX110输注后出现败血症或全身性菌血症，应开始适当的培养和医疗管理。另外，在输注CTX110后30天内，如果出现任何发热情况，应考虑CRS。
肿瘤溶解综合征(TLS)
接受CAR T细胞疗法的受试者患TLS的风险增加。从LD化疗开始到CTX110输注后28天，应通过实验室评估和症状密切监测受试者的TLS。所有受试者都应在筛选期间和开始LD化疗之前接受预防性别嘌呤醇(或非别嘌呤醇替代品，诸如非布索坦)并增加口服/静脉内补液。可以在CTX110输注后28天后，或一旦TLS风险过去，停止预防。
站点应根据其机构护理标准或根据已发布的指南监测和治疗TLS(Cairo和Bishop,(2004)Br J Haematol[英国血液学杂志],127,3-11)。在临床上指示时应立即开始TLS管理，包括施用拉布立酶。
细胞因子释放综合征(CRS)
CRS是自体CD19定向的CAR T细胞疗法报告的主要毒性。CRS归因于响应于靶抗原的CAR接合的免疫系统过度活化，导致快速T细胞刺激和增殖所致多细胞因子升高(Frey等人,(2014)Blood[血液],124,2296；Maude等人,(2014)Cancer J[癌症杂志],20,119-122)。当细胞因子被释放时，可能会出现多种与CRS相关的临床体征和症状，包括心脏、消化道(GI)、神经系统、呼吸系统(呼吸困难、缺氧)、皮肤、心血管系统(低血压、心动过速)和全身性(发热、寒战、出汗、厌食、头痛、不适、疲劳、关节痛、恶心和呕吐)症状和实验室(凝血、肾和肝)异常。
CRS管理的目的是防止危及生命的后遗症，同时保留CTX110抗肿瘤作用的潜力。症状通常在自体CAR T细胞疗法后1至14天出现，但对于同种异体CAR T细胞，症状发作的时间尚未完全确定。
CRS应根据临床表现而不是实验室细胞因子测量值来鉴定和治疗。如果怀疑存在CRS，应根据表19中的建议进行分级和管理，该建议改编自已发布的指南(Lee等人,(2014)Blood[血液],124,188-195)。自从最初的Lee CRS分级标准制定以来，使用CAR T细胞疗法的医生对CRS的表现和时间进程有了进一步的了解。最近的美国血液和骨髓移植学会(ASBMT)共识标准(Lee等人,(2018)Biol Blood Marrow Transplant[血液和骨髓移植生物学])建议分级应基于是否存在发热伴低血压和/或缺氧，并且另一终末器官毒性应在支持性护理下单独管理。因此，在本方案中，神经毒性将使用不同的尺度进行分级和管理(参见标题为“免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)”的部分)，在CRS管理背景下的终末器官毒性仅指肝和肾系统(如Penn评分标准；(Porter等人,(2018)J Hematol Oncol,11,35)。申办方可以选择修改CRS分级标准和毒性管理算法，以反映基于CTX110和其他CAR T细胞疗法的临床经验的ASBMT共识提案。
表19.细胞因子释放综合征分级和管理指南。
Figure BDA0003377063530000641
CRS：细胞因子释放综合征；FiO2：吸入氧的分数；IV：静脉内注射；N/A：不适用。
1参见(Lee等人,(2014)Blood[血液],124,188-195)。
2有关神经毒性的管理，请参阅题为“免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)”的部分。器官毒性仅指肝和肾系统。
3请参阅托珠单抗处方信息。
4有关高剂量血管升压药的信息，请参见表20。
表20.高剂量血管升压药。
Figure BDA0003377063530000651
*所有剂量都需要≥3小时。
**VASST试验血管升压药当量方程式：去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(μg/min)]+[多巴胺(μg/min)/2]+[肾上腺素(μg/min)]+[去氧肾上腺素(μg/min)/10]
在CRS的整个过程中，应为受试者提供支持性护理，包括退热药、静脉内输液和氧气。应使用连续心电遥测和脉搏血氧饱和度仪监测经历≥2级CRS(例如，低血压、对液体无反应或缺氧需要补充氧合)的受试者。对于经历3级CRS的受试者，考虑进行超声心动图以评估心脏功能。对于3级或4级CRS，考虑重症监护支持疗法。由于神经毒性(例如，癫痫发作)而非缺氧而进行的气道保护插管不应被视为4级CRS。同样，由于神经毒性而没有其他CRS体征(例如，缺氧)的延长插管不被视为4级CRS。研究人员应始终考虑严重CRS病例中潜在感染的可能性，因为表现(发热、低血压、缺氧)是相似的。CRS的消退定义为发热(体温≥38℃)、缺氧和低血压的消退(Lee等人,(2018)Biol Blood Marrow Transplant[血液和骨髓移植生物学])。
免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)
已经观察到自体CD19定向的CAR T细胞疗法具有神经毒性。它可能在CRS时、CRS消退期间或CRS消退后发生，其病理生理学尚不清楚。最近的ASBMT共识进一步将与CRS相关的神经毒性定义为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)，这是一种以任何免疫疗法后涉及CNS的病理过程为特征的障碍，导致内源性或输注T细胞和/或其他免疫效应细胞的活化或接合(Lee等人,(2018)Biol Blood Marrow Transplant[血液和骨髓移植生物学])。体征和症状可能是进展性的，并且可能包括失语、意识水平改变、认知技能受损、运动无力、癫痫发作和脑水肿。ICANS分级是根据先前在自体CAR T细胞试验中使用的CAR T细胞疗法相关毒性(CARTOX)工作组标准制定的(Neelapu等人,(2018)N Engl J Med[新英格兰医学杂志],377,2531-2544)。ICANS通过使用一种称为ICE(免疫效应细胞相关性脑病)评估工具的改良评估工具，对意识水平、癫痫发作的存在/不存在、运动发现、脑水肿的存在/不存在以及神经系统区域的整体评估进行了评估(参见表21)。
任何新发神经毒性的评估应包括作为临床上指示的神经学检查(包括ICE评估工具，表22)、脑部MRI、和CSF检查(通过腰椎穿刺)。如果无法进行脑部MRI，则所有受试者都应接受非增强CT以排除大脑内出血。按临床上指示的，也应考虑脑电图。在严重的情况下，可能需要气管插管以保护气道。
所有受试者在CTX110输注后或神经系统症状消退后至少21天内应考虑非镇静、抗癫痫预防(例如，左乙拉西坦)(除非研究人员认为抗癫痫药物导致有害症状)。应使用连续心电遥测和脉搏血氧饱和度仪监测经历ICANS≥2级的受试者。对于严重或危及生命的神经系统毒性，应提供重症监护支持疗法。应始终考虑神经科会诊。监测血小板和凝血障碍的体征，并适当输注血液制品以减少大脑内出血的风险。表21提供了神经毒性分级，表23提供了管理指南。
对于接受积极类固醇管理超过3天的受试者，建议进行抗真菌和抗病毒预防，以降低延长使用类固醇导致严重感染的风险。还应考虑使用抗生素预防。
表21.ICANS分级。
Figure BDA0003377063530000671
CTCAE：不良事件的通用术语标准；EEG：脑电图；ICANS：免疫效应细胞相关神经毒性综合征；ICE：免疫效应细胞相关脑病(评估工具)；ICP：颅内压；N/A：不适用。
ICANS分级由不能归因于任何其他原因的最严重事件(ICE评分、意识水平、癫痫发作、运动发现、升高的ICP/脑水肿)确定。
1ICE评分为0的受试者如果清醒时患有全面性失语症，则可归类为3级ICANS，但如果无法唤醒，则ICE评分为0的受试者可归类为4级ICANS。
2意识水平低下不应归因于其他原因(例如，镇静药物)。
3与免疫效应疗法相关的震颤和肌阵挛应根据CTCAE v5.0进行分级，但不影响ICANS分级。
表22.ICE评估。
Figure BDA0003377063530000681
ICE评分将报告为所有评估的总得分数(0-10)。
ICE评估将在筛选时、在第1天和第2、3、5、8和28天施用CTX110之前进行。如果受试者经历CNS症状，则应继续大约每2天进行一次ICE评估，直到症状消退。为了最小化可变性，评估应尽可能由熟悉或受过ICE评估管理培训的同一研究人员进行。
表23.ICANS管理指南。
Figure BDA0003377063530000682
头痛可能发生在发热或化疗后，是一种非特异性症状。单独的头痛不一定是ICANS的表现，应该进行进一步的评估。ICANS的定义不包括因失调和肌肉损失导致的虚弱或平衡问题。类似地，由于这些受试者中的凝血障碍，可能有或没有相关水肿的颅内出血，并且也被排除在ICANS的定义之外。这些和其他神经毒性应按照CTCAE v5.0捕获。
B细胞发育不全
可能发生B细胞发育不全，并将通过以下免疫球蛋白G血液水平监测。根据机构护理标准，将静脉内施用丙种球蛋白用于临床上显著的低丙球蛋白血症(全身感染)。
嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)
报道了在用自体CD19定向的CAR T细胞进行治疗后的HLH(Barrett等人,(2014)Curr Opin Pediatr,26,43-49；Maude等人,(2014)N Engl J Med[新英格兰医学杂志],371,1507-1517；Maude等人,(2015)Blood[血液],125,4017-4023；Porter等人,(2015)SciTransl Med[科学·转化医学],7,303ra139；Teachey等人,(2013)Blood[血液],121,5154-5157。HLH是一种临床综合征，其是在输注CAR T细胞后炎症反应的结果，其中自活化的T细胞产生细胞因子导致过度巨噬细胞活化。HLH的体征和症状可包括发热、细胞减少症、肝脾肿大、高胆红素血症引起的肝功能障碍、纤维蛋白原显著减少的凝血障碍、铁蛋白和C反应蛋白(CRP)显著升高。也观察到神经系统学发现(Jordan等人,(2011)Blood[血液],118,4041-4052；La Rosée,(2015)Hematology Am Soc Hematol Educ Program,190-196。
CRS和HLH可具有相似的临床综合征，具有重叠的临床特征和病理生理学。HLH可能会在CRS或CRS消退时出现。如果有无法解释的肝功能检查升高或细胞减少症(有或没有其他CRS证据)，则应考虑HLH。CRP和铁蛋白的监测可以有助于诊断和定义临床进程。
如果怀疑HLH：
·经常监测凝血参数，包括纤维蛋白原。这些测试可以比评估时间表中更频繁地进行，并且应基于实验室发现来驱动频率。
·纤维蛋白原应保持≥100mg/dL以减少出血的风险。
·凝血障碍应用血液产品校正。
·鉴于CRS重叠，也应根据表19中的CRS治疗指南管理受试者。
血细胞减少症
据报道，使用自体CD19定向的CAR T细胞产品治疗的受试者出现3级中性粒细胞减少症和血小板减少症，有时持续输注后超过28天(Kymriah USPI,2017；Yescarta USPI,2017)。因此，应针对这种毒性监测接受CTX110的受试者，并适当地支持。针对患有延长的中性粒细胞减少症的任何受试者应考虑抗微生物和抗真菌预防。
当CRS的风险通过时，在CTX110输注后21天的4级中性粒细胞减少症的情况下，可以考虑G-CSF。
移植物抗宿主病
在同种异体HSCT的环境中看到GvHD，是免疫活性供体T细胞(移植物)识别作为外源物的受体(宿主)的结果。随后的免疫反应活化供体T细胞以攻击受体以消除携带外源抗原的细胞。GvHD根据同种异体HSCT的时间和临床表现分为急性、慢性和重叠综合征。急性GvHD的体征可能包括斑丘疹；由于小胆管损伤导致胆汁淤积导致的高胆红素血症伴黄疸；恶心、呕吐和厌食；以及水样或血性腹泻和痉挛性腹痛(Zeiser和Blazar,(2017)N Engl JMed[新英格兰医学杂志],377,2167-2179。
为了支持提议的临床研究，在免疫功能低下的小鼠中进行了一项符合非临床良好实验室规范(GLP)的GvHD和耐受性研究，以2个超过所有提议的临床剂量水平至少10倍的剂量。此外，由于CAR在TRAC基因座插入的特异性，T细胞极不可能同时是CAR+和TCR+。在制造过程中，通过抗TCR抗体柱上的免疫亲和层析去除剩余的TCR+细胞，以在最终产品中获得<0.5％的TCR+细胞。对所有剂量水平施加的剂量限制为7x104个TCR+细胞/kg。该限制低于1x105个TCR+细胞/kg的限制，这是基于已发表的关于在使用半相合供体的SCT期间能够导致严重GvHD的同种异体细胞数量的报告(Bertaina等人,(2014)Blood[血液],124,822-826。通过这种特定的编辑、纯化和严格的产品发布标准，CTX110后GvHD的风险应该很低，尽管真正的发病率尚不清楚。应密切监测受试者在输注CTX110后是否出现急性GvHD的体征。潜在症状出现的时间未知。然而，鉴于CAR T细胞扩增是抗原驱动的，并且可能只发生在TCR-细胞中，TCR+细胞的数量不太可能明显增加到超过输注的数量。
GvHD的诊断和分级应基于已发布的标准(Harris等人,(2016)Biol Blood MarrowTransplant[血液和骨髓移植生物学],22,4-10)，如表24中所述。
表24.急性GvHD分级标准
Figure BDA0003377063530000711
BSA：体表面积；GI：胃肠道；GvHD：移植物抗宿主病。
总体GvHD级将根据最严重的靶器官受累情况确定。
·0级：没有任何器官受累的阶段1-4。
·1级：无肝、上GI或下GI受累的阶段1-2皮肤。
·2级：阶段3皮疹和/或阶段1肝和/或阶段1上GI和/或阶段1下GI。
·3级：阶段2-3肝和/或阶段2-3下GI，与阶段0-3皮肤和/或阶段0-1上GI。
·4级：阶段4皮肤、肝或下GI受累，具有阶段0-1上GI。
应排除可能模仿GvHD的潜在混杂因素，诸如感染和对药物的反应。应在治疗开始前或治疗开始后不久进行皮肤和/或GI活检以进行确认。在肝受累的情况下，如果临床上可行，应尝试肝活检。所有活检的一个或多个样品也将被送到中心实验室进行病理学评估。样品制备和运输的详细信息包含在实验室手册中。
表25概述了管理急性GvHD的建议。为了在试验结束时实现受试者间的可比性，研究人员应遵循这些建议，除非在特定的临床情况下遵循这些建议可能会使受试者处于危险之中。
表25.急性GvHD管理
Figure BDA0003377063530000721
GI：胃肠道；IV：静脉内。
对于患有更严重GvHD的受试者，应尽早决定开始二线疗法。例如，可在GvHD进展性表现3天后、持续3级GvHD 1周后或持续2级GvHD 2周后适用二线疗法。在不耐受高剂量糖皮质激素治疗的受试者中，可能更早适用二线全身疗法(Martin等人,(2012)Biol BloodMarrow Transplant[血液和骨髓移植生物学],18,1150-1163)。二级疗法的选择和何时开始将基于治疗研究人员的临床判断和当地实践。
难治性急性GvHD或慢性GvHD的管理将按照机构指南进行。在使用免疫抑制剂(包括类固醇)治疗受试者时，应根据当地指南制定抗感染预防措施。
低血压和肾功能不全
据报道，CAR T细胞疗法会导致低血压和肾功能不全，应根据机构实践指南静脉内施用生理盐水推注进行治疗。适当时应考虑透析。
研究资格
纳入标准
要被视为有资格参加本研究，受试者必须符合下列纳入标准(除非指示为任选的)：
1.≥18岁且体重>50kg(任选的)。
2.能够理解并遵守方案需要的研究程序，并自愿签署书面知情同意文件。
3.诊断出下列B细胞恶性肿瘤之一：
经组织学证实的B细胞NHL：DLBCL NOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、转化型FL、或3b级FL。
·来自当地病理学实验室的肿瘤组织学确认(上次复发/进展的档案组织[招募后3个月内]或筛选期间的活检)。
·至少1个可测量的病灶是氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性，如卢加诺标准所定义(卢加诺标准5分制评分为4或5)。只有在完成放射疗法后记录到进展时，才认为以前受过照射的病灶是可测量的。
4.难治性或复发性疾病，如以下队列特异性标准所证明的：
先前接受过两个或更多个疗法线，包括抗CD20单克隆抗体和含蒽环类药物的方案，并且先前自体造血干细胞移植(HSCT)失败或不符合先前自体HSCT的条件或拒绝先前自体HSCT。曾接受自体HSCT的受试者必须已从HSCT相关的毒性中恢复。
·对于难治性疾病，受试者必须在最后一次疗法时具有疾病进展，或者在至少2个疗法周期后疾病稳定，疾病稳定持续时间长达6个月。
·对于患有转化型FL的受试者，受试者必须在转化为DLBCL后接受针对疾病的至少一个化学疗法线。
5.东部肿瘤协作组(ECOG)性能状态为0或1。
6.符合接受LD化疗和CAR T细胞输注的标准。
7.足够的器官功能：
·肾：估计肾小球滤过率>50mL/min/1.73m2。
·肝：天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶<3x正常上限(ULN)；总胆红素<1.5 x ULN(对于患有吉尔伯特综合征的受试者，总胆红素<2mg/dL)。
·心脏：超声心动图显示血流动力学稳定且左心室射血分数≥45％。
·肺：根据脉搏血氧饱和度仪，室内空气的氧饱和度水平>91％。
8.有生育能力的女性受试者(月经初潮后有完整的子宫和至少1个卵巢，绝经后不到1年)必须同意使用可接受的一种或多种避孕方法，从招募开始到CTX110输注后至少12个月。
9.男性受试者必须同意在从招募开始到CTX110输注后至少12个月内使用有效避孕措施。
10.同意在完成本研究后参加另外的长期随访研究。
排除标准
为了有资格参加研究，受试者不得满足下列任何排除标准：
1.符合并同意自体HSCT。
2.使用以下疗法进行治疗，如下所述：
·先前接受过任何基因疗法或基因修饰细胞疗法(包括CAR T细胞)的治疗。
·当前治疗采用CD19定向抗体、双特异性T细胞接合剂或抗体-药物偶联物，除非在最近的CD19定向治疗后进展或复发后确认CD19表达(通过免疫组织化学或流式细胞术)。
3.先前的同种异体HSCT。
4.对环磷酰胺、氟达拉滨或任何CTX110产品赋形剂的已知禁忌症。
5.脑脊液(CSF)或磁共振成像(MRI)中可检测到的恶性细胞表明筛选期间存在脑转移，或中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤受累(CSF或成像)的病史。
6.癫痫发作障碍、脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病或任何累及CNS的自身免疫性疾病的病史。
7.筛选前6个月内出现不稳定型心绞痛、有临床意义的心律失常或心肌梗塞。
8.不受控制的、危及生命的急性细菌、病毒或真菌感染。
9.人类免疫缺陷病毒(HIV)1型或2型存在或活动性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染呈阳性。允许有HBV或HBC感染先前病史、已记录病毒载量无法检测(通过定量聚合酶链反应[PCR]或核酸测试)的受试者。针对受试者资格，可考虑在签署知情同意书后30天内进行感染性疾病测试(HIV-1、HIV-2、HCV抗体和PCR、HBV表面抗原、HBV表面抗体、HBV核心抗体)。
10.先前或并发恶性肿瘤，基底细胞或鳞状细胞皮肤癌除外，充分切除的原位宫颈癌，或既往恶性肿瘤已完全切除且缓解≥5年。
11.招募后14天内接受放射疗法。
12.在招募后14天或5个半衰期(以较长者为准)内使用全身性抗肿瘤疗法或研究药物。例外情况是1)先前的抑制性/刺激性免疫检查点分子疗法，禁止在招募后3个半衰期内进行，以及2)禁止在筛选前30天内使用利妥昔单抗。
13.需要类固醇和/或其他免疫抑制疗法的原发性免疫缺陷障碍或活动性自身免疫性疾病。
14.诊断出可能妨碍受试者参与研究的严重精神障碍或其他医疗状况。
15.怀孕或哺乳的妇女。
统计方法
样品量
研究的剂量递增部分的样品量约为6至54名受试者，具体取决于评估的剂量水平和队列数量，以及DLT的发生情况。
如果研究继续进行队列扩展，将采用最佳Simon 2阶段设计。每个队列的样品量将取决于特定适应症的效应量假设。
为了扩展队列A，第一阶段将招募最多30名受试者。如果完整分析集中的前30名受试者中有10名或更多获得客观反应，则该研究将扩展招募范围，以在第二阶段包括另外的47名受试者(总共77名)。77名受试者的最终样品量将有90％的功效(α＝0.05，2侧检验)来检验CTX110的45％的ORR和26％的ORR(复发性/难治性DLBCL患者中的标准补救疗法的估计ORR)之间的差异。
与队列A一样，在完成研究的剂量递增部分后，队列B可能会在方案修订后继续进行队列扩展。
迄今为止，参与本研究的所有受试者都在14天内完成了阶段1(资格筛选)。一名受试者在2天内完成了阶段1。符合资格标准的受试者在完成第1阶段后24小时内开始进行淋巴细胞清除疗法。所有符合条件的受试者都已完成筛选期(阶段1)并在不到15天的时间内接受了LD化疗，其中一名患者在72小时内完成了筛选并开始了LD化疗剂量。一些符合条件的受试者患有DLBCL(例如，NOS，高分级)；其他人患有转化型FL和Richter转化。
在完成LD化疗后的2-7天内，所有接受LD化疗的受试者都进展到接受DL1或DL2剂量的CTX110。迄今为止从这些患者获得的结果总结如下。
DL1和DL2剂量的受试者经历肿瘤代谢活性减少(PET扫描中的FDG吸收)和/或肿瘤大小减少。已观察到剂量依赖性反应，包括在DL2时的完全和持久反应>60天。到目前为止，所有治疗的患者都没有表现出任何DLT。此外，同种异体CAR-T细胞疗法在治疗的人类受试者中表现出所需的药代动力学特征，包括CAR-T细胞扩增和输注后的持久性。在CTX110扩增和持久性上也观察到剂量依赖性效应。DL2中的所有受试者均表现出CTX110扩增和持久性。在一名受试者中观察到外周血中CTX110扩增高达90倍。此外，可在治疗后至少8-10天在DL2受试者中检测到CTX110细胞的持久性，并且已在输注后长达28天检测到。
序列表
Figure BDA0003377063530000771
Figure BDA0003377063530000781
Figure BDA0003377063530000791
Figure BDA0003377063530000801
Figure BDA0003377063530000811
Figure BDA0003377063530000821
Figure BDA0003377063530000831
Figure BDA0003377063530000841
Figure BDA0003377063530000851
Figure BDA0003377063530000861
*指示具有2′-O甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
“n”是指5′末端处的间隔子序列。
其他实施例
在本说明书中披露的所有特征能以任何组合来组合。在本说明书中披露的每个特征可以由用于相同，等同或类似目的替代特征替换。因此，除非另有说明，所披露的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的示例。
通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明作不同变化和变更，以使它适应不同用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求书范围内。
等同适用
尽管已经在此描述并展示几个发明实施例，但本领域普通技术人员将容易想象用于执行功能和/或获得结果和/或在此描述的优点中的一个或多个的多种其他装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每一个被视为是在在此描述的发明实施例的范围内。更一般地说，本领域的技术人员将容易理解，在此描述的所有参数、尺寸、材料以及配置意味着为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于发明传授内容所用于的一种或多种具体应用。本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确认在此描述的具体发明实施例的许多等效物。因此，应了解，前述实施例是仅藉助于实例来呈现，并且在所附权利要求书和其相等形式的范围内，发明实施例可以按与具体地描述和要求不同的方式实践。本披露的发明实施例涉及在此描述的每个单独特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本披露的发明范围内。
在此限定并使用的所有定义应当被理解成凌驾于所限定术语的字典定义、通过引用而结合的文件中的定义、和/或一般含义。
在此披露的所有参考文献、专利和专利申请都相对于每个被引用的主题通过引用而并入，这在一些情况下可以包括文件的全部内容。
除非清楚地作相反指示，否则在说明书中和在权利要求中，如在此使用的不定冠词“一个/种)”(a/an)应当理解为意思指“至少一个(种)”。
在说明书中和在权利要求中，如在此使用的短语“和/或”应当理解为意思指如此联在一起的要素中的“任何一个或两个”，即，要素在一些情形中联合地存在并且在其他情形中分离性地存在。用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即，这样结合的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”从句具体鉴定的元素，其他元素可以任选地存在，无论是与具体鉴定的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言诸如“包括”使用时，对“A和/或B”的提及可以在一个实施例中仅指A(任选地包括除了B的元素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包括除了A的元素)；在又另一个实施例中，指A和B(任选地包括其他元素)；等。
在说明书中和在权利要求中，如在此使用的“或”应理解为具有与如以上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔一个清单中的项目时，“或”或“和/或”应当解释为包容性的，即，包括多个元素或元素清单中的至少一个，而且包括其中的多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。仅相反地清楚指示的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”，或者当用于权利要求中时，“由……组成”将指恰好包括一些或一列元素中的一个元素。总体而言，如在此使用的术语“或”当前面加有排他性的术语，诸如“任何一个”、“……中一个”、“……中仅一个”或“……中只有一个”时，应当仅解释为指示排他性的替代形式(即，“一个或另一个，但非两者”)。“主要由……组成”当用于权利要求中时，应具有如在专利法领域中所用的其普通含义。
在说明书中和在权利要求中，如在此所使用，关于具有一个或多个要素的清单的短语“至少一个”应理解为意思指选自该要素清单中的任一个或多个要素的至少一个要素，但未必包括在该要素清单内具体地列出的每一个要素中的至少一个，并且不排除该要素清单中多个要素的任何组合。这一定义还允许，可以任选地存在除该短语“至少一个”所指元素清单内具体地鉴别出的元素外的元素，无论是与具体地鉴别出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除了B的元素)；在另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除了A的元素)；在又另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，以及至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他元素)；等。
还应当理解，除非明确指出相反，在包括多于一个步骤或动作的在此所要求保护的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于其中方法的步骤或动作被列举的顺序。
序列表
<110> 克里斯珀医疗股份公司（CRISPR THERAPEUTICS AG）
<120> 靶向CD19的基因工程化T细胞针对B细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法
<130> 105965-653962-004WO00
<150> 62/840,913
<151> 2019-04-30
<160> 56
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 1
aagagcaaca aatctgact 19
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 2
aagagcaaca gtgctgtgcc tggagcaaca aatctgacta agagcaacaa atctgact 58
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 3
aagagcaaca gtgctggagc aacaaatctg actaagagca acaaatctga ct 52
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 4
aagagcaaca gtgcctggag caacaaatct gactaagagc aacaaatctg act 53
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 5
aagagcaaca gtgctgacta agagcaacaa atctgact 38
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 6
aagagcaaca gtgctgtggg cctggagcaa caaatctgac taagagcaac aaatctgact 60
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 7
aagagcaaca gtgctggcct ggagcaacaa atctgactaa gagcaacaaa tctgact 57
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 8
aagagcaaca gtgctgtgtg cctggagcaa caaatctgac taagagcaac aaatctgact 60
<210> 9
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 9
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgcc tggaggctat ccagcgtgag 60
tctctcctac cctcccgct 79
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 10
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttcgcct ggaggctatc cagcgtgagt 60
ctctcctacc ctcccgct 78
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 11
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga ggctatccag cgtgagtctc 60
tcctaccctc ccgct 75
<210> 12
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 12
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga tagcctggag gctatccagc 60
gtgagtctct cctaccctcc cgct 84
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 13
cgtggcctta gctgtgctcg cgctatccag cgtgagtctc tcctaccctc ccgct 55
<210> 14
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 14
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgtg gcctggaggc tatccagcgt 60
gagtctctcc taccctcccg ct 82
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 15
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 16
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 16
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 17
<211> 114
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (18)..(30)
<223> 位置18到30处的n是任选的
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (107)..(114)
<223> 位置2到8处的u是任选的
<400> 17
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau 60
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 114
<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 18
agagcaacag ugcuguggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 19
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 20
gcuacucucu cuuucuggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 21
gcuacucucu cuuucuggcc 20
<210> 22
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (97)..(99)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<400> 22
agagcaacag ugcuguggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<400> 23
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 24
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (97)..(99)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<400> 24
gcuacucucu cuuucuggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(3)
<223> 具有2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸
<400> 25
gcuacucucu cuuucuggcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 26
agagcaacag tgctgtggcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 27
gctactctct ctttctggcc 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 28
agagcaacag tgctgtggcc tgg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 29
gctactctct ctttctggcc tgg 23
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 32
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
20
<210> 33
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 33
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 34
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 35
tcaaagcgga gtaggttgtt gcattccgat tacatgaata tgactcctcg ccggcctggg 60
ccgacaagaa aacattacca accctatgcc cccccacgag acttcgctgc gtacaggtcc 120
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 37
cgagtgaagt tttcccgaag cgcagacgct ccggcatatc agcaaggaca gaatcagctg 60
tataacgaac tgaatttggg acgccgcgag gagtatgacg tgcttgataa acgccggggg 120
agagacccgg aaatgggggg taaaccccga agaaagaatc cccaagaagg actctacaat 180
gaactccaga aggataagat ggcggaggcc tactcagaaa taggtatgaa gggcgaacga 240
cgacggggaa aaggtcacga tggcctctac caagggttga gtacggcaac caaagatacg 300
tacgatgcac tgcatatgca ggccctgcct cccaga 336
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 39
atgcttcttt tggttacgtc tctgttgctt tgcgaacttc ctcatccagc gttcttgctg 60
atccccgata ttcagatgac tcagaccacc agtagcttgt ctgcctcact gggagaccga 120
gtaacaatct cctgcagggc aagtcaagac attagcaaat acctcaattg gtaccagcag 180
aagcccgacg gaacggtaaa actcctcatc tatcatacgt caaggttgca ttccggagta 240
ccgtcacgat tttcaggttc tgggagcgga actgactatt ccttgactat ttcaaacctc 300
gagcaggagg acattgcgac atatttttgt caacaaggta ataccctccc ttacactttc 360
ggaggaggaa ccaaactcga aattaccggg tccaccagtg gctctgggaa gcctggcagt 420
ggagaaggtt ccactaaagg cgaggtgaag ctccaggaga gcggccccgg tctcgttgcc 480
cccagtcaaa gcctctctgt aacgtgcaca gtgagtggtg tatcattgcc tgattatggc 540
gtctcctgga taaggcagcc cccgcgaaag ggtcttgaat ggcttggggt aatatggggc 600
tcagagacaa cgtattataa ctccgctctc aaaagtcgct tgacgataat aaaagataac 660
tccaagagtc aagttttcct taaaatgaac agtttgcaga ctgacgatac cgctatatat 720
tattgtgcta aacattatta ctacggcggt agttacgcga tggattattg ggggcagggg 780
acttctgtca cagtcagtag tgctgctgcc tttgtcccgg tatttctccc agccaaaccg 840
accacgactc ccgccccgcg ccctccgaca cccgctccca ccatcgcctc tcaacctctt 900
agtcttcgcc ccgaggcatg ccgacccgcc gccgggggtg ctgttcatac gaggggcttg 960
gacttcgctt gtgatattta catttgggct ccgttggcgg gtacgtgcgg cgtccttttg 1020
ttgtcactcg ttattacttt gtattgtaat cacaggaatc gctcaaagcg gagtaggttg 1080
ttgcattccg attacatgaa tatgactcct cgccggcctg ggccgacaag aaaacattac 1140
caaccctatg cccccccacg agacttcgct gcgtacaggt cccgagtgaa gttttcccga 1200
agcgcagacg ctccggcata tcagcaagga cagaatcagc tgtataacga actgaatttg 1260
ggacgccgcg aggagtatga cgtgcttgat aaacgccggg ggagagaccc ggaaatgggg 1320
ggtaaacccc gaagaaagaa tccccaagaa ggactctaca atgaactcca gaaggataag 1380
atggcggagg cctactcaga aataggtatg aagggcgaac gacgacgggg aaaaggtcac 1440
gatggcctct accaagggtt gagtacggca accaaagata cgtacgatgc actgcatatg 1500
caggccctgc ctcccaga 1518
<210> 40
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 41
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 41
gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60
gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120
tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180
ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240
ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300
gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360
ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420
agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480
atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540
tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600
gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660
gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720
aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780
catgaggtct atggacttca 800
<210> 42
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 42
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 60
gacaccttct tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt 120
gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg 180
attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga 240
gccttgttct ggcagtccag agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca 300
ggagagggca cgtggcccag cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg 360
ctcagactgt ttgcccctta ctgctcttct aggcctcatt ctaagcccct tctccaagtt 420
gcctctcctt atttctccct gtctgccaaa aaatctttcc cagctcacta agtcagtctc 480
acgcagtcac tcattaaccc accaatcact gattgtgccg gcacatgaat gcaccaggtg 540
ttgaagtgga ggaattaaaa agtcagatga ggggtgtgcc cagaggaagc accattctag 600
ttgggggagc ccatctgtca gctgggaaaa gtccaaataa cttcagattg gaatgtgttt 660
taactcaggg ttgagaaaac agctaccttc aggacaaaag tcagggaagg gctctctgaa 720
gaaatgctac ttgaagatac cagccctacc aagggcaggg agaggaccct atagaggcct 780
gggacaggag ctcaatgaga aagg 804
<210> 43
<211> 1178
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 43
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360
agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600
cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900
cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960
agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020
agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080
tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140
tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178
<210> 44
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 44
atgcttcttt tggttacgtc tctgttgctt tgcgaacttc ctcatccagc gttcttgctg 60
atcccc 66
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 46
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 46
gatattcaga tgactcagac caccagtagc ttgtctgcct cactgggaga ccgagtaaca 60
atctcctgca gggcaagtca agacattagc aaatacctca attggtacca gcagaagccc 120
gacggaacgg taaaactcct catctatcat acgtcaaggt tgcattccgg agtaccgtca 180
cgattttcag gttctgggag cggaactgac tattccttga ctatttcaaa cctcgagcag 240
gaggacattg cgacatattt ttgtcaacaa ggtaataccc tcccttacac tttcggagga 300
ggaaccaaac tcgaaattac cgggtccacc agtggctctg ggaagcctgg cagtggagaa 360
ggttccacta aaggcgaggt gaagctccag gagagcggcc ccggtctcgt tgcccccagt 420
caaagcctct ctgtaacgtg cacagtgagt ggtgtatcat tgcctgatta tggcgtctcc 480
tggataaggc agcccccgcg aaagggtctt gaatggcttg gggtaatatg gggctcagag 540
acaacgtatt ataactccgc tctcaaaagt cgcttgacga taataaaaga taactccaag 600
agtcaagttt tccttaaaat gaacagtttg cagactgacg ataccgctat atattattgt 660
gctaaacatt attactacgg cggtagttac gcgatggatt attgggggca ggggacttct 720
gtcacagtca gtagt 735
<210> 47
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 48
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 48
gctgctgcct ttgtcccggt atttctccca gccaaaccga ccacgactcc cgccccgcgc 60
cctccgacac ccgctcccac catcgcctct caacctctta gtcttcgccc cgaggcatgc 120
cgacccgccg ccgggggtgc tgttcatacg aggggcttgg acttcgcttg tgatatttac 180
atttgggctc cgttggcggg tacgtgcggc gtccttttgt tgtcactcgt tattactttg 240
tattgtaatc acaggaatcg c 261
<210> 49
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 49
tttgtcccgg tatttctccc agccaaaccg accacgactc ccgccccgcg ccctccgaca 60
cccgctccca ccatcgcctc tcaacctctt agtcttcgcc ccgaggcatg ccgacccgcc 120
gccgggggtg ctgttcatac gaggggcttg gacttcgctt gtgatattta catttgggct 180
ccgttggcgg gtacgtgcgg cgtccttttg ttgtcactcg ttattacttt gtattgtaat 240
cacaggaatc gc 252
<210> 50
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn Arg
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 54
<211> 4358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 54
gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60
gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120
tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180
ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240
ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300
gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360
ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420
agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480
atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540
tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600
gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660
gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720
aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780
catgaggtct atggacttca ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 840
cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc 900
gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 960
gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 1020
ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 1080
gcccttgcgt gccttgaatt acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct 1140
tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg 1200
tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct 1260
tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc 1320
tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg 1380
tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc 1440
ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg 1500
ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag 1560
gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc 1620
agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca 1680
aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc 1740
gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg 1800
ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc 1860
agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt 1920
cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgacc 1980
accatgcttc ttttggttac gtctctgttg ctttgcgaac ttcctcatcc agcgttcttg 2040
ctgatccccg atattcagat gactcagacc accagtagct tgtctgcctc actgggagac 2100
cgagtaacaa tctcctgcag ggcaagtcaa gacattagca aatacctcaa ttggtaccag 2160
cagaagcccg acggaacggt aaaactcctc atctatcata cgtcaaggtt gcattccgga 2220
gtaccgtcac gattttcagg ttctgggagc ggaactgact attccttgac tatttcaaac 2280
ctcgagcagg aggacattgc gacatatttt tgtcaacaag gtaataccct cccttacact 2340
ttcggaggag gaaccaaact cgaaattacc gggtccacca gtggctctgg gaagcctggc 2400
agtggagaag gttccactaa aggcgaggtg aagctccagg agagcggccc cggtctcgtt 2460
gcccccagtc aaagcctctc tgtaacgtgc acagtgagtg gtgtatcatt gcctgattat 2520
ggcgtctcct ggataaggca gcccccgcga aagggtcttg aatggcttgg ggtaatatgg 2580
ggctcagaga caacgtatta taactccgct ctcaaaagtc gcttgacgat aataaaagat 2640
aactccaaga gtcaagtttt ccttaaaatg aacagtttgc agactgacga taccgctata 2700
tattattgtg ctaaacatta ttactacggc ggtagttacg cgatggatta ttgggggcag 2760
gggacttctg tcacagtcag tagtgctgct gcctttgtcc cggtatttct cccagccaaa 2820
ccgaccacga ctcccgcccc gcgccctccg acacccgctc ccaccatcgc ctctcaacct 2880
cttagtcttc gccccgaggc atgccgaccc gccgccgggg gtgctgttca tacgaggggc 2940
ttggacttcg cttgtgatat ttacatttgg gctccgttgg cgggtacgtg cggcgtcctt 3000
ttgttgtcac tcgttattac tttgtattgt aatcacagga atcgctcaaa gcggagtagg 3060
ttgttgcatt ccgattacat gaatatgact cctcgccggc ctgggccgac aagaaaacat 3120
taccaaccct atgccccccc acgagacttc gctgcgtaca ggtcccgagt gaagttttcc 3180
cgaagcgcag acgctccggc atatcagcaa ggacagaatc agctgtataa cgaactgaat 3240
ttgggacgcc gcgaggagta tgacgtgctt gataaacgcc gggggagaga cccggaaatg 3300
gggggtaaac cccgaagaaa gaatccccaa gaaggactct acaatgaact ccagaaggat 3360
aagatggcgg aggcctactc agaaataggt atgaagggcg aacgacgacg gggaaaaggt 3420
cacgatggcc tctaccaagg gttgagtacg gcaaccaaag atacgtacga tgcactgcat 3480
atgcaggccc tgcctcccag ataataataa aatcgctatc catcgaagat ggatgtgtgt 3540
tggttttttg tgtgtggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca 3600
gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg 3660
caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt 3720
ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta 3780
ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg 3840
aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg 3900
cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc ttctaggcct cattctaagc 3960
cccttctcca agttgcctct ccttatttct ccctgtctgc caaaaaatct ttcccagctc 4020
actaagtcag tctcacgcag tcactcatta acccaccaat cactgattgt gccggcacat 4080
gaatgcacca ggtgttgaag tggaggaatt aaaaagtcag atgaggggtg tgcccagagg 4140
aagcaccatt ctagttgggg gagcccatct gtcagctggg aaaagtccaa ataacttcag 4200
attggaatgt gttttaactc agggttgaga aaacagctac cttcaggaca aaagtcaggg 4260
aagggctctc tgaagaaatg ctacttgaag ataccagccc taccaagggc agggagagga 4320
ccctatagag gcctgggaca ggagctcaat gagaaagg 4358
<210> 55
<211> 1368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 56
<211> 4682
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多聚核苷酸
<400> 56
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgagatg taaggagctg ctgtgacttg ctcaaggcct 180
tatatcgagt aaacggtagt gctggggctt agacgcaggt gttctgattt atagttcaaa 240
acctctatca atgagagagc aatctcctgg taatgtgata gatttcccaa cttaatgcca 300
acataccata aacctcccat tctgctaatg cccagcctaa gttggggaga ccactccaga 360
ttccaagatg tacagtttgc tttgctgggc ctttttccca tgcctgcctt tactctgcca 420
gagttatatt gctggggttt tgaagaagat cctattaaat aaaagaataa gcagtattat 480
taagtagccc tgcatttcag gtttccttga gtggcaggcc aggcctggcc gtgaacgttc 540
actgaaatca tggcctcttg gccaagattg atagcttgtg cctgtccctg agtcccagtc 600
catcacgagc agctggtttc taagatgcta tttcccgtat aaagcatgag accgtgactt 660
gccagcccca cagagccccg cccttgtcca tcactggcat ctggactcca gcctgggttg 720
gggcaaagag ggaaatgaga tcatgtccta accctgatcc tcttgtccca cagatatcca 780
gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg 840
cctattcacc gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta 900
tatcacagac aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaggctcc ggtgcccgtc 960
agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt 1020
gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc 1080
tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg 1140
ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg 1200
ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc actggctgca 1260
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1320
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1380
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1440
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1500
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1560
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1620
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1680
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1740
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1800
gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1860
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1920
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1980
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 2040
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 2100
tcttccattt caggtgtcgt gaccaccatg cttcttttgg ttacgtctct gttgctttgc 2160
gaacttcctc atccagcgtt cttgctgatc cccgatattc agatgactca gaccaccagt 2220
agcttgtctg cctcactggg agaccgagta acaatctcct gcagggcaag tcaagacatt 2280
agcaaatacc tcaattggta ccagcagaag cccgacggaa cggtaaaact cctcatctat 2340
catacgtcaa ggttgcattc cggagtaccg tcacgatttt caggttctgg gagcggaact 2400
gactattcct tgactatttc aaacctcgag caggaggaca ttgcgacata tttttgtcaa 2460
caaggtaata ccctccctta cactttcgga ggaggaacca aactcgaaat taccgggtcc 2520
accagtggct ctgggaagcc tggcagtgga gaaggttcca ctaaaggcga ggtgaagctc 2580
caggagagcg gccccggtct cgttgccccc agtcaaagcc tctctgtaac gtgcacagtg 2640
agtggtgtat cattgcctga ttatggcgtc tcctggataa ggcagccccc gcgaaagggt 2700
cttgaatggc ttggggtaat atggggctca gagacaacgt attataactc cgctctcaaa 2760
agtcgcttga cgataataaa agataactcc aagagtcaag ttttccttaa aatgaacagt 2820
ttgcagactg acgataccgc tatatattat tgtgctaaac attattacta cggcggtagt 2880
tacgcgatgg attattgggg gcaggggact tctgtcacag tcagtagtgc tgctgccttt 2940
gtcccggtat ttctcccagc caaaccgacc acgactcccg ccccgcgccc tccgacaccc 3000
gctcccacca tcgcctctca acctcttagt cttcgccccg aggcatgccg acccgccgcc 3060
gggggtgctg ttcatacgag gggcttggac ttcgcttgtg atatttacat ttgggctccg 3120
ttggcgggta cgtgcggcgt ccttttgttg tcactcgtta ttactttgta ttgtaatcac 3180
aggaatcgct caaagcggag taggttgttg cattccgatt acatgaatat gactcctcgc 3240
cggcctgggc cgacaagaaa acattaccaa ccctatgccc ccccacgaga cttcgctgcg 3300
tacaggtccc gagtgaagtt ttcccgaagc gcagacgctc cggcatatca gcaaggacag 3360
aatcagctgt ataacgaact gaatttggga cgccgcgagg agtatgacgt gcttgataaa 3420
cgccggggga gagacccgga aatggggggt aaaccccgaa gaaagaatcc ccaagaagga 3480
ctctacaatg aactccagaa ggataagatg gcggaggcct actcagaaat aggtatgaag 3540
ggcgaacgac gacggggaaa aggtcacgat ggcctctacc aagggttgag tacggcaacc 3600
aaagatacgt acgatgcact gcatatgcag gccctgcctc ccagataata ataaaatcgc 3660
tatccatcga agatggatgt gtgttggttt tttgtgtgtg gagcaacaaa tctgactttg 3720
catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag 3780
gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct 3840
gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc 3900
attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc cttgttctgg cagtccagag 3960
aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga aggtggcagg agagggcacg tggcccagcc 4020
tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc tgcctttgct cagactgttt gccccttact 4080
gctcttctag gcctcattct aagccccttc tccaagttgc ctctccttat ttctccctgt 4140
ctgccaaaaa atctttccca gctcactaag tcagtctcac gcagtcactc attaacccac 4200
caatcactga ttgtgccggc acatgaatgc accaggtgtt gaagtggagg aattaaaaag 4260
tcagatgagg ggtgtgccca gaggaagcac cattctagtt gggggagccc atctgtcagc 4320
tgggaaaagt ccaaataact tcagattgga atgtgtttta actcagggtt gagaaaacag 4380
ctaccttcag gacaaaagtc agggaagggc tctctgaaga aatgctactt gaagatacca 4440
gccctaccaa gggcagggag aggaccctat agaggcctgg gacaggagct caatgagaaa 4500
ggtaaccacg tgcggaccga ggctgcagcg tcgtcctccc taggaacccc tagtgatgga 4560
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 4620
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 4680
gg 4682

Claims (42)

1.一种用于治疗人类患者中B细胞恶性肿瘤的方法，该方法包括：
(i)对患有B细胞恶性肿瘤的人类患者进行淋巴细胞清除治疗；以及
(ii)在步骤(i)之后向该人类患者施用基因工程化T细胞群，其中该基因工程化T细胞群包含含有如下项的T细胞：
(a)被破坏的T细胞受体α链恒定(TRAC)基因，
(b)编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中该CAR包含抗CD19单链可变片段(scFv)，该抗CD19单链可变片段包含SEQ ID NO:51中所阐述的重链可变区和SEQ ID NO:52中所阐述的轻链可变区，且其中将该核酸插入到该被破坏的TRAC基因中，和
(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因；
其中以约1x107至约1x109个CAR+T细胞的剂量向该人类患者施用该基因工程化T细胞群。
2.如权利要求1所述的方法，其中该被破坏的TRAC基因包含含有SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中施用给该人类患者的该基因工程化T细胞群每剂量包含不超过7x104个TCR+T细胞/kg。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的该淋巴细胞清除治疗包括向该人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和约500-750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
5.如权利要求4所述的方法，其中步骤(i)中的该淋巴细胞清除治疗包括向该人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天，或每天约30mg/m2的氟达拉滨和约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中以约1x107、约3x107、约1x108、约3x108或约1x109CAR+T细胞的剂量向该人类患者施用该基因工程化T细胞群。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前，该人类患者不显示以下特征中的一项或多项：
(a)临床状态显著恶化，
(b)需要补充氧气以维持大于91％的饱和度水平，
(c)不受控制的心律失常，
(d)需要血管升压药支持的低血压，
(e)活动性感染，和
(f)≥2级急性神经毒性。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前约2-7天进行步骤(i)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之后和步骤(ii)之前，该人类患者不显示以下特征中的一项或多项：
(a)活动性不受控制的感染；
(b)与步骤(i)之前的临床状态相比，临床状态恶化；以及
(c)≥2级急性神经毒性。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，该方法进一步包括(iii)在步骤(ii)后监测该人类患者的急性毒性发展；以及(iv)如果发生则管理该急性毒性。
11.如权利要求10所述的方法，其中在施用该基因工程化T细胞群之后进行步骤(iii)至少28天。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中该急性毒性包括肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全或其组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤，其任选地选自由以下各项组成的组：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高分级B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤(FL)或3b级FL。
14.如权利要求13所述的方法，其中DLBCL是未另行指定(NOS)的DLBCL。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该人类患者具有至少一个氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性的可测量病灶。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是难治性的和/或复发性的。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该人类患者已经经历了一个或多个先前的抗癌疗法线。
18.如权利要求17所述的方法，其中该人类患者已经经历了两个或更多个先前的抗癌疗法线。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中该先前的抗癌疗法包含抗CD20抗体、含蒽环类药物的方案或其组合。
20.如权利要求17所述的方法，其中该人类患者患有难治性或复发性转化型FL并且在转化为DLBCL后经历了针对疾病的至少一个化学疗法线。
21.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是难治性的，并且该人类患者在最后一次疗法时具有疾病进展，或者在至少两个疗法周期后疾病稳定，而疾病稳定持续时间长达6个月。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中该人类患者先前自体造血干细胞移植(HSCT)失败或不符合先前自体HSCT的条件。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中该人类患者在用该基因工程化T细胞群治疗后经受另外的抗癌疗法。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该人类患者具有以下特征中的一项或多项：
(m)东部肿瘤协作组(ECOG)性能状态为0或1；
(n)足够的肾、肝、心脏和/或肺功能；
(o)未接受过先前的基因疗法或改良的细胞疗法；
(p)未接受过包含抗CD19抗体的先前治疗；
(q)未接受过先前的同种异体HSCT；
(r)没有可检测到的来自脑脊液的恶性细胞；
(s)没有脑转移；
(t)没有先前的中枢神经系统障碍；
(u)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗塞；
(v)没有不受控制的感染；
(w)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷障碍或自身免疫性障碍；以及
(x)没有人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该抗CD19 scFv包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的方法，其中该结合CD19的CAR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中将编码该抗CD19CAR的核酸插入到该被破坏的TRAC基因中的缺失的位点。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中该被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:54的核苷酸序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中被破坏的β2M基因包含SEQ ID NO:9-14所阐述的核苷酸序列中的至少一种。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群是同种异体的。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少90％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白，其中该基因工程化T细胞群中的至少50％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白；和/或其中该基因工程化T细胞群中的至少30％的T细胞表达可检测水平的该CAR。
33.如权利要求32所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少99.5％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。
35.如权利要求34所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少85％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少50％的T细胞表达可检测水平的该CAR。
37.如权利要求36所述的方法，其中该基因工程化T细胞群中的至少70％的T细胞表达可检测水平的该CAR。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群通过静脉内输注施用于该人类患者。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中该基因工程化T细胞群被悬浮在冷冻保存溶液中。
40.一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的药物组合物，该药物组合物包含含有如下项的基因工程化T细胞群：
(a)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，其任选地包含含有SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失，
(b)编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中该CAR包含抗CD19单链可变片段(scFv)，该抗CD19单链可变片段包含SEQ ID NO:51中所阐述的重链可变区和SEQ ID NO:52中所阐述的轻链可变区，并且其中将该核酸插入到该被破坏的TRAC基因中，和
(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因；
其中该组合物包含约1x107至约1x109个CAR+T细胞。
41.如权利要求40所述使用的药物组合物，其中该基因工程化T细胞群在权利要求1、2、25-37和39的任一项中阐述。
42.如权利要求40或权利要求41所述使用的药物组合物，其中该药物组合物用于在如权利要求1-24和38中任一项所阐述的方法中使用。
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