CN116685337A - 使用靶向cd19的基因工程化t细胞的b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法 - Google Patents

使用靶向cd19的基因工程化t细胞的b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN116685337A
CN116685337A CN202180082222.0A CN202180082222A CN116685337A CN 116685337 A CN116685337 A CN 116685337A CN 202180082222 A CN202180082222 A CN 202180082222A CN 116685337 A CN116685337 A CN 116685337A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
population
genetically engineered
human patient
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180082222.0A
Other languages
English (en)
Inventor
M·本顿
T·霍
D·卡拉伊齐迪斯
E·莫拉瓦
J·A·特雷特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CRISPR Therapeutics AG
Original Assignee
CRISPR Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CRISPR Therapeutics AG filed Critical CRISPR Therapeutics AG
Priority claimed from PCT/IB2021/059633 external-priority patent/WO2022084862A1/en
Publication of CN116685337A publication Critical patent/CN116685337A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

一种基因工程化免疫细胞(例如，T细胞)群体，所述细胞表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)并且含有被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因或两者，所述细胞群体用于治疗B细胞恶性肿瘤。

Description

使用靶向CD19的基因工程化T细胞的B细胞恶性肿瘤的同种异 体细胞疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月20日提交的美国临时申请第63/094,252号、于2021年1月22日提交的美国临时申请第63/140,664号、于2021年3月23日提交的美国临时申请第63/164,690号、于2021年6月25日提交的美国临时申请第63/215,191号和于2021年10月11日提交的美国临时申请第63/254,226号的申请日的权益。将每个在先临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是用于治疗人类恶性肿瘤的过继性T细胞治疗剂。尽管CAR T细胞疗法已经取得巨大的临床成功，包括复发性/难治性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和儿科急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的持久缓解，但经过批准的产品是自体的并且需要患者特异性细胞的收集和制造。因为如此，一些患者在等待治疗时经历了疾病进展或死亡。因此，仍然需要改良的CAR T细胞治疗剂。
发明内容
本公开至少部分地基于使用表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)并且具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的基因工程化T细胞(例如，CTX110细胞，又称为TC1细胞)开发用于B细胞恶性肿瘤诸如转化FL或DLBCL的同种异体细胞疗法。本文公开的同种异体CAR-T细胞疗法在患有本文公开的B细胞恶性肿瘤的人类患者中显示出治疗功效，包括在某些患者中的完全反应以及反应的长期耐久性。此外，本文公开的同种异体CAR-T细胞疗法在人类患者中表现出期望的药代动力学特征，包括延长的CAR-T细胞扩增和输注后的持久性。
因此，本公开的一些方面的特征在于一种用于治疗人类患者的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(i)对患有B细胞恶性肿瘤的人类患者进行淋巴细胞清除治疗；以及(ii)在步骤(i)之后向所述人类患者施用第一剂量的基因工程化T细胞群体，其中所述基因工程化T细胞群体包括T细胞，所述T细胞包含：(a)编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。所述基因工程化T细胞群体可以以约1.0x107至约9x108个CAR+T细胞的剂量施用于所述人类患者。每剂量施用于所述人类患者的所述基因工程化T细胞群体含有不超过7x104个TCR+T细胞/kg。
在一些实施方案中，步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500-750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
在一些实施方案中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约3.5x108至约9x108个。例如，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约3.5x108至约6x108个。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约3x107个CAR+T细胞。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约1x108个CAR+T细胞。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约3x108个CAR+T细胞。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约4.5x108个CAR+T细胞。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约6x108个CAR+T细胞。在一些实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体为约9x108个CAR+T细胞。在具体实例中，第一剂量的基因工程化T细胞群体以约4.5x108、约6x108或约7.5x108个CAR+T细胞的剂量施用于所述人类患者。
在一些实施方案中，步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2至约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。在一些情况下，步骤(i)可以在步骤(ii)之前约2-7天进行。
在步骤(i)之前，人类患者可能未显示出以下特征中的一种或多种：(a)临床状态显著恶化，(b)需要补充氧气以维持大于91％的饱和度，(c)心律失常不受控制，(d)低血压需要血管加压药支持，(e)活动性感染，和(f)≥2级急性神经毒性。在一些实施方案中，在步骤(i)之后并且在步骤(ii)之前，人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：(a)不受控制的活动性感染；(b)与步骤(i)之前的所述临床状态相比，临床状态恶化；和(c)≥2级急性神经毒性。
本文公开的任何方法还可包括(iii)在步骤(ii)之后监测所述人类患者的急性毒性发展；以及(iv)如果发生则管理所述急性毒性。在一些情况下，步骤(iii)可以在施用所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体后进行至少28天。示例性的急性毒性包括肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全、病毒性脑炎或其组合。
可替代地或另外，本文公开的方法还可包括任选地在所述人类患者显示出进行性疾病(PD)之后向所述人类患者施用一个或多个后续剂量的所述基因工程化T细胞群体，其中所述人类患者具有既往反应。在一些实施方案中，所述人类患者可以在所述后续剂量的所述基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受淋巴细胞清除治疗。可替代地，如果所述人类患者表现出显著的血细胞减少症，则在后续剂量的基因工程化T细胞群体之前，可以不向所述人类患者给予淋巴细胞清除治疗。
在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤可以是非霍奇金氏淋巴瘤。实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤(FL)和3b级FL。在一些实例中，DLBCL是非特指型(NOS)的DLBCL。所述人类患者可以具有至少一个可测量的病变，所述病变为氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性。
在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是难治性的和/或复发性的。患有难治性和/或复发性B细胞恶性肿瘤的人类患者可能已经经历过一个或多个线数的既往抗癌疗法。例如，所述人类患者已经经历过两个或更多个线数的既往抗癌疗法。在一些实例中，所述既往抗癌疗法包括抗CD20抗体、含蒽环类药物的方案或其组合。
在一些实例中，所述人类患者具有难治性或复发性的转化FL，并且在转化为DLBCL后已经经历过至少一个线数的针对疾病的化疗。在一些实例中，所述B细胞恶性肿瘤是难治性的，并且所述人类患者在最后的治疗中具有进行性疾病，或在至少两个治疗周期后具有疾病稳定，其中疾病稳定的持续时间长达6个月。在一些实例中，所述人类患者既往自体造血干细胞移植(HSCT)失败或不符合既往自体HSCT的条件。可替代地或另外，所述人类患者在用所述基因工程化T细胞群体治疗后进行另外的抗癌疗法。
在本文公开的任何方法中，所述人类患者具有以下特征中的一种或多种：(a)具有美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)体能状态0或1；(b)充分的肾功能、肝功能、心脏功能和/或肺功能；(c)没有既往基因疗法或改良细胞疗法；(d)没有包含抗CD19抗体的既往治疗；(e)没有既往同种异体HSCT；(f)没有来自脑脊液的可检测的恶性细胞；(g)没有脑部转移；(h)没有既往中枢神经系统病症；(i)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗死；(j)没有不受控制的感染；(k)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷病症或自身免疫病症；以及(l)没有受人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
在一些实施方案中，本文公开的方法在步骤(i)中可以涉及淋巴细胞清除治疗，其包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。可替代地或另外，第一剂量的基因工程化T细胞群体可为至少3x107个CAR+T细胞。在一些情况下，在第一剂量的基因工程化T细胞群体之后约4至8周，可以向所述人类患者施用第二剂量的基因工程化T细胞群体。所述人类患者可以在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后至少约4周实现疾病稳定(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)。在一些实例中，所述人类患者在第二剂量的基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受第二次淋巴细胞清除治疗。可替代地，所述人类患者在第二剂量的基因工程化T细胞群体之前可以不接受淋巴细胞清除治疗，例如，对于表现出显著的血细胞减少症并且未接受的人类患者。
在一些实施方案中，本文公开的方法在步骤(i)中可以涉及淋巴细胞清除治疗，其包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。在一些情况下，第一剂量的基因工程化T细胞群体为至少3x108个CAR+T细胞。在一些实例中，在第一剂量的基因工程化T细胞群体之后约4至8周，可以向所述人类患者施用第二剂量的基因工程化T细胞群体。此类人类患者可以在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后至少约4周实现疾病稳定(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)。在一些情况下，所述人类患者在第二剂量的基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受第二次淋巴细胞清除治疗。第二次淋巴细胞清除治疗可包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。可替代地，所述人类患者在第二剂量的基因工程化T细胞群体之前可以不接受淋巴细胞清除治疗，例如，对于表现出显著的血细胞减少症并且未接受的人类患者。
在本文公开的任何方法中，所述人类患者可以接受至少一个附加剂量的基因工程化T细胞群体。在一些情况下，所述人类患者接受淋巴细胞清除治疗，其包括在所述附加剂量的基因工程化T细胞群体之前2-7天内向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
在本文公开的任何方法中，所述基因工程化T细胞可表达包含抗CD19单链可变片段(scFv)的CAR。在一些实例中，抗CD19 scFv可包含与SEQ ID NO:51中所示的重链可变区中的重链互补决定区(CDR)相同的重链互补决定区，和/或与SEQ ID NO:52中所示的轻链可变区中的轻链CDR相同的轻链CDR。在一些情况下，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些具体实例中，结合CD19的CAR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
所述基因工程化T细胞群体还可包含(b)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，和/或(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因。在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞群体包含(b)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，和(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因。在一些实例中，将编码抗CD19 CAR的核酸插入被破坏的TRAC基因中。在一些具体实例中，被破坏的TRAC基因可包含含有SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失。可以将编码抗CD19CAR的核酸插入到被破坏的TRAC基因的缺失位点。在一些实例中，被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:54的核苷酸序列。
可替代地或另外，所述基因工程化T细胞群体中的被破坏的β2M基因包含SEQ IDNO:9-14所示的核苷酸序列中的至少一种。
在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞群体是同种异体的。在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞群体中至少90％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。在一些实例中，所述基因工程化T细胞群体中至少70％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白，其中所述基因工程化T细胞群体中至少50％的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白；和/或其中所述基因工程化T细胞群体中至少30％的T细胞表达可检测水平的CAR。可替代地或另外，所述基因工程化T细胞群体中至少99.5％的T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。可替代地或另外，所述基因工程化T细胞群体中至少70％(例如，至少85％)的T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。可替代地或另外，所述基因工程化T细胞群体中至少50％(例如，至少70％)的T细胞表达可检测水平的CAR。
在一些实施方案中，所述基因工程化T细胞群体经由静脉输注施用于所述人类患者。所述基因工程化T细胞群体可悬浮于冻存溶液中。
在治疗B细胞恶性肿瘤中(例如，在本文公开的任何方法中)使用的药物组合物也在本公开的范围内，所述药物组合物包含本文公开的任何基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)，以及所述基因工程化T细胞用于制造在治疗如本文公开的B细胞恶性肿瘤中使用的药物的用途也在本公开的范围内。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下说明书中阐述。根据以下附图和对几个实施方案的详细描述，并且还根据所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。
附图说明
图1是编辑后8天，人原代T细胞即TRAC-/B2M-CD19CAR+T细胞(TC1)的一系列流式细胞术图。该图表显示TRAC和B2M的表面表达降低。TCR/MHC I双敲除细胞表达高水平的CAR转基因(下图)。用纯化珠粒阴性选择TC1细胞导致TCR阳性细胞减少(右图)。
图2是描绘在TRAC-/B2M-CD19CAR+T细胞(TC1)中的TRAC和B2M基因座处实现高编辑率的图表。测量作为基因编辑的功能性输出的TCR和MHCI表面表达，并以编辑百分比的形式绘制在y轴上。检测来自TRAC基因座的CAR的高效(例如，大于50％)位点特异性整合和表达。这些数据证明生成TRAC-/B2M-/抗CD19CAR+T细胞的效率大于50％。
图3是描绘在NOG Raji小鼠中在用TRAC-/β2M-/CD19 CAR+T细胞(TC1)处理后，肿瘤体积(mm3)统计学显著降低(p＝0.007)的图表。
图4是生存曲线图，证明与未接受处理的NOG Raji小鼠相比，用TC1细胞处理的NOGRaji小鼠的生存率增加。
图5是生存曲线图，证明与第1天未接受处理的对照小鼠相比，第4天用TC1细胞处理的NOG Raji小鼠的生存率增加。
图6A和图6B包括显示TCl细胞在小鼠中的持久性和抗肿瘤活性的图示。6A：证明TC1细胞在NOG Raji小鼠中持久存在的一系列流式细胞图。6B：证明与对照(未处理的NOGRaji小鼠或NOG小鼠)相比，TC1细胞选择性根除用TC1处理的NOG Raji小鼠中的脾脏Raji细胞的图表。将该作用描绘为与对照相比，在用TC1处理的NOGRaji小鼠中脾脏肿块减小。
图7是一系列流式细胞图，证明经TC1处理的两只独立的NOGRaji小鼠中持久性脾脏TC1细胞经过编辑。
图8是Kaplan-Meier生存率图，证明与第1天未接受处理的对照小鼠相比，第4天用TC1细胞处理的NOG Nalm6小鼠的生存率增加。
图9是Kaplan-Meier生存率图，证明与未接受处理的对照小鼠相比，用不同浓度的TC1治疗后，携带播散性Nalm6 B细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)的小鼠的生存率增加。
图10是描绘在用TC1细胞处理后，播散性Nalm6 B-细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)肿瘤模型中对肿瘤细胞扩增的统计学显著抑制的图表。
图11是用TC1细胞或各种对照细胞(PBMC或电穿孔(EP)T细胞)处理的健康小鼠在辐照后或仅接受辐照(“仅RT”)的小鼠的Kaplan-Meier生存率图。
图12是显示图18中治疗的小鼠的体重变化百分比的图表。
图13是用低剂量(2x107)或高剂量(4x107)的TC1细胞或未编辑的T细胞处理的健康小鼠在辐照后，或仅接受辐照的小鼠(“媒介物-RT”)的Kaplan-Meier生存率图。
图14是显示除了未辐照和未用细胞给药的小鼠(“媒介物-无RT”)以外，图20中经过处理的小鼠的体重变化百分比的图表。
图15是显示来自六个不同供体的外周血细胞的未编辑的CD8+T细胞亚群内CD27+CD45RO-细胞的百分比的条形图。
图16提供了TCRaβ+细胞清除前后TC1细胞上TCRαβ和B2M表达的流式细胞术结果。
图17是显示基因编辑后TCR-和MHC I-(B2M)的蛋白质损失百分比，以及来自各批TC1生产的经过编辑的TC1细胞中表达抗CD19CAR的细胞百分比的图表。
图18提供了显示编辑前后来自六个不同供体的T细胞群体中PD1+(左上)、LAG3+(右上)、TIM3+(左下)或CD57+(右下)的百分比的图表。
图19是显示CD19阳性细胞系(Nalm6；Raji；和K562-CD19)和CD19阴性细胞(K562)在与TC1细胞或未编辑的T细胞以不同比率共培养时的细胞溶解百分比的图表。
图20是活性TC1细胞在T细胞培养基(血清+IL2+IL7；完全培养基)、含有血清但无IL2或IL7细胞因子(5％血清，无细胞因子)或无血清或无细胞因子(无血清，无细胞因子)的培养基的存在下培养时的数量的图表。在基因编辑后指定的天数对细胞进行计数。所示三个批次的平均值±SD。
图21是描绘对淋巴细胞清除后施用于患有CD19+恶性肿瘤的人类受试者的CTX110细胞(又称为TC1细胞)进行评价的临床研究设计的示意图。队列A和队列B将包括NHL亚型：DLBCL NOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、3b级FL或转化FL。对于队列A，LD化疗包括每日静脉(IV)共同施用30mg/m2氟达拉滨和500mg/m2环磷酰胺，持续3天。对于队列B，LD化疗包括每日IV共同施用30mg/m2氟达拉滨和750mg/m2环磷酰胺，持续3天。对于队列A，如果受试者符合方案规定的标准，可以在第28天(第一剂量后4-8周)在有或没有LD化疗的情况下施用计划的第二剂量的CTX110。如果队列A和队列B中的受试者已经有既往客观反应，则受试者可在疾病进展时再次给药。如适用，第一疗程可包括第一次(第1天)和第二次(第35天)CTX110输注及相关LD方案。对于队列A和队列B两者，如果受试者在第一次输注后具有既往临床反应并符合额外输注的标准，则患者可在疾病进展时接受单次CTX110输注与LD化疗的第二疗程。D：天；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；DLT：剂量限制性毒性；FL：滤泡性淋巴瘤；IV：静脉内；LD：淋巴细胞清除；M：月；MRD：微小残留病；NHL：非霍奇金氏淋巴瘤；NOS：非特指型。
图22是显示CTX110(包括再次给药)使肿瘤尺寸深度减小的图示。SD＝疾病稳定，CR＝完全反应。1：值超出轴顶部(215％)。
图23是显示以DL2至DL4治疗的患者中外周血CAR-T细胞水平的图示。值表示平均值±SEM。在每个时间点N＝15-21。
图24A和图24B包括显示CTX110的巩固剂量的强有力的基本原理的图示。图24A：显示在接受DL2-DL4剂量的患者中的完全反应(CR)率和总体反应(ORR)率的图示。图24B：显示在具有所示不同反应的患者中细胞剂量和基线肿瘤体积之间的比率的图示。通过CAR+T细胞(百万)除以基线SPD(mm2)计算基线肿瘤体积。
具体实施方式
分化簇19(CD19)是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠类氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD19的氨基酸序列可以按照UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以按照登录号NM_001178098找到。CD19在大多数B谱系癌症上表达，包括例如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见，例如，Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)。
本公开提供了用于B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法涉及表达抗CD19CAR并且具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的基因工程化T细胞群体，将编码抗CD19 CAR的核酸插入TRAC基因座中，从而破坏TRAC基因的表达。使用从健康供体获得的亲本T细胞制备同种异体抗CD19 CAR-T细胞。因此，与自体CAR-T疗法中诊断与治疗之间需要至少三周间隙从患者自身的T细胞制造CAR-T细胞相反，CAR-T疗法在诊断后立即可用于具有靶B细胞恶性肿瘤的患者。同种异体CAR T疗法可以在护理中心储存和存货，以便于诊断后立即治疗。同种异体抗CD19 CAR T疗法的即时可用性消除了对桥接化疗的需要，当由患者自身的细胞制造自体CAR-T细胞时可能需要桥接化疗。总之，同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法(例如，涉及使用本文公开的CTX110细胞)将允许立即治疗而没有制造失败的风险，节省了患者疾病可能进展的宝贵时间。此外，它提供了更一致的产品、灵活给药(例如，如果需要，可以再次给药)、可扩展的制造和更简单的后勤以及更广泛的接近。同种异体抗CD19CAR-T细胞疗法(例如，涉及使用CTX110细胞)也可避免对更具毒性的淋巴细胞清除方案的需要。
本文公开的同种异体抗-CD19CAR-T细胞疗法在患有本文公开的B细胞恶性肿瘤的人类患者中显示治疗功效，包括在某些患者中的完全反应和反应的长期耐久性。此外，本文公开的同种异体CAR-T细胞疗法在人类患者中表现出期望的药代动力学特征，包括延长的CAR-T细胞扩增和输注后的持久性。
因此，本文提供了使用表达抗CD19 CAR(例如，SEQ ID NO：40，由SEQ ID NO：39编码)的基因工程化免疫细胞(诸如T细胞)群治疗人类患者的B细胞恶性肿瘤的方法。此类基因工程化T细胞还可包含被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M或其组合。可以将编码抗CD19CAR并且任选地包含启动子序列和一个或多个调控元件的核酸插入到被破坏的TRAC基因的基因座中，例如置换TRAC基因中SEQ ID NO：26的区段。在施用所述基因工程化T细胞群体之前，对人类患者进行淋巴细胞清除治疗。
I.抗CD19 CAR T细胞
本文公开了用于治疗B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110细胞)。在一些实施方案中，抗CD19 CAR T细胞是表达抗CD19 CAR并且具有被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M基因或其组合的人T细胞。在具体实例中，抗CD19 CAR T细胞表达抗CD19CAR并且具有被破坏的内源TRAC和B2M基因。
(i)抗CD19嵌合抗原受体(CAR)
此处公开的基因工程化免疫细胞诸如T细胞表达结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)(抗CD19 CAR)。嵌合抗原受体(CAR)是指人工免疫细胞受体，其经工程化以识别并结合不希望的细胞(例如疾病细胞，诸如癌细胞)表达的抗原。表达CAR多肽的T细胞被称为CAR T细胞。CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别赋予CAR-T细胞识别独立于抗原加工的抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。而且，当在T细胞上表达时，有利地CAR不会与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
有不同代的CAR，每一代都含有不同的组分。第一代CAR通过铰链结构域和跨膜结构域将抗体来源的scFv与T细胞受体的CD3ζ(ζ或z)细胞内信号传导结构域连接。第二代CAR并入另外的共刺激结构域，例如CD28、4-1BB(41BB)或ICOS，以提供共刺激信号。第三代CAR含有与TCR CD3ζ链融合的两个共刺激结构域(例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的组合)。Maude等人，Blood.2015；125(26)：4017-4023；Kakarla和Gottschalk，Cancer J.2014；20(2)：151-155)。不同代CAR构建体中的任何一代都在本公开的范围内。
通常，CAR是一种融合多肽，其包含识别靶抗原的胞外结构域(例如，抗体或其他抗体片段的单链片段(scFv))和胞内结构域，该胞内结构域包含T细胞受体(TCR)复合物(例如，CD3ζ)的信号传导结构域并且在大多数情况下包含共刺激结构域。(Enblad等人，HumanGene Therapy.2015；26(8)：498-505)。CAR构建体还可包含位于胞外结构域和胞内结构域之间的铰链和跨膜结构域，以及在N末端用于表面表达的信号肽。信号肽的实例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO：30)和MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：31)。可以使用其他信号肽。
抗CD19 CAR可以包含对CD19具有特异性的抗CD19单链可变片段(scFv)，随后是铰链结构域和跨膜结构域(例如，CD8铰链和跨膜结构域)，其与细胞内协同信号传导结构域(例如，CD28共刺激结构域)和CD3ζ信号传导结构域融合。在构建本文公开的抗CD19 CAR中使用的示例性组分可见于下面提供的序列表。
(a)抗原结合胞外结构域
抗原结合胞外结构域是当CAR在细胞表面表达时暴露于细胞外液的CAR多肽的区域。在一些情况下，信号肽可以位于N末端，以促进细胞表面表达。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是单链可变片段(scFv，其可以包括抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)(以任一取向))。在一些情况下，VH和VL片段可经由肽接头连接。在一些实施方案中，接头包括亲水性残基，即，多段甘氨酸和丝氨酸用于柔性，以及多段谷氨酸和赖氨酸用于增加溶解度。scFv片段保留了scFv片段所来源的亲本抗体的抗原结合特异性。在一些实施方案中，scFv可包含人源化VH和/或VL结构域。在其他实施方案中，scFv的VH和/或VL结构域是全人的。
本文公开的CAR多肽中的抗原结合胞外域对CD19(例如，人CD19)具有特异性。在一些实例中，抗原结合胞外结构域可以包含能够结合CD19的scFv胞外结构域。抗CD19 scFv可包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO：51中的重链互补决定区(CDR)相同的重链互补决定区，所述轻链可变结构域具有与SEQ IDNO：52中的轻链CDR相同的轻链CDR。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意指当通过相同的方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法。参见，例如，bioinf.org.uk/abs/)确定时，它们的CDR是相同的。在一些实例中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO：51的VH和/或SEQ ID NO：52的VL。在具体实例中，抗CD19 scFv可包含SEQ IDNO：47的氨基酸序列。
(b)跨膜结构域
本文公开的抗CD19 CAR多肽可以含有跨膜结构域，该跨膜结构域可以是跨膜的疏水性α螺旋。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白结构。跨膜结构域可以提供含有其的CAR的稳定性。
在一些实施方案中，如本文提供的CAR的跨膜结构域可以是CD8跨膜结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域。在又其他实施方案中，跨膜结构域是CD8和CD28跨膜结构域的嵌合体。如本文提供的，可使用其他跨膜结构域。在一个具体实例中，抗CD19 CAR中的跨膜结构域是具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
(c)铰链结构域
在一些实施方案中，铰链结构域可以位于CAR的胞外结构域(包含抗原结合结构域)与跨膜结构域之间或者CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间。铰链结构域可以是起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的功能的任何寡肽或多肽。铰链结构域可以起到向CAR或其结构域提供柔性或防止CAR或其结构域的空间位阻的功能。
在一些实施方案中，铰链结构域可包含至多300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸，或5至20个氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个铰链结构域可以包括在CAR的其他区域中。在一些实施方案中，铰链结构域可以是CD8铰链结构域。可以使用其他铰链结构域。
(d)细胞内信号传导结构域
本文公开的任何抗CD19 CAR构建体均含有一个或多个细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ，和任选地一个或多个共刺激结构域)，其是受体的功能性末端。抗原识别后，受体聚簇，并且信号被传输到细胞。
CD3ζ是T细胞受体复合物的细胞质信号传导结构域。CD3ζ含有三(3)个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，它们在T细胞与同源抗原接合后，将激活信号传输到T细胞。在许多情况下，CD3ζ提供主要的T细胞激活信号，但不提供完全感受态的激活信号，这需要共刺激信号传导。在一些实例中，本文公开的抗CD19 CAR构建体包含CD3α细胞质信号传导结构域，其可具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗CD19 CAR多肽还可包含一个或多个共刺激信号传导结构域。例如，CD28和/或4-1BB的共刺激结构域可用于传输完整的增殖/生存信号，以及CD3ζ介导的主要信号传导。在一些实例中，本文公开的CAR包含CD28共刺激分子，例如，具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CD28共刺激信号传导结构域。在其他实例中，本文公开的CAR包含4-1BB共刺激分子，例如，具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的4-1BB共刺激信号传导结构域。
在具体实例中，本文公开的抗CD19 CAR可以包括CD3ζ信号传导结构域(例如，SEQID NO：38)和CD28共刺激结构域(例如，SEQ ID NO：36)。
应理解，本文描述的方法涵盖多于一种可用于产生表达CAR的基因工程化T细胞的合适的CAR，例如，本领域已知的或本文公开的那些。实例可以在例如2018年5月11日提交的国际申请号PCT/IB2018/001619(已公开为WO 2019/097305A2)和2019年5月10日提交的国际申请号PCT/IB2019/000500中找到，这些在先申请中的每一者的相关公开内容通过引用并入本文用于本文提及的目的和主题。
在具体实例中，本文公开的抗CD19 CAR可包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，该氨基酸序列可由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码。参见下面提供的序列表。
在本文公开的基因工程化T细胞中，可以将包含抗CD19 CAR的编码序列且任选地包含用于表达抗CD19 CAR的调控序列(例如，序列表中提供的启动子诸如EF1a启动子)的核酸插入目标基因组基因座中。在一些实例中，将核酸插入内源TRAC基因的基因座中，从而破坏TRAC基因的表达。在具体实例中，该核酸可以置换TRAC基因中的片段，例如包含SEQ IDNO：26的核苷酸序列的片段。
(ii)TRAC和B2M基因的敲除
本文公开的抗CD19 CAR-T细胞还可具有被破坏的TRAC基因、被破坏的B2M基因或其组合。TRAC基因座的破坏导致T细胞受体(TCR)表达丧失，目的是降低移植物抗宿主病(GvHD)的概率，而β2M基因座的破坏导致主要组织相容性复合物I型(MHC I)蛋白表达缺失，目的是通过降低宿主排斥的概率来改善持久性。添加抗CD19 CAR将修饰的T细胞定向至表达CD19的肿瘤细胞。在一些情况下，在不使用慢病毒或逆转录病毒的情况下将CAR表达构建体精确插入TRAC基因座(参见本文的公开内容)，产生改善的一致性和安全性。
如本文所用，术语“被破坏的基因”是指相对于野生型对应物含有一个或多个突变(例如，插入、缺失或核苷酸取代等)以实质上减少或完全消除编码的基因产物的活性的基因。所述一个或多个突变可以位于非编码区，例如，启动子区、调控转录或翻译的调控区；或内含子区。可替代地，所述一个或多个突变可以位于编码区中(例如，外显子中)。在一些情况下，被破坏的基因不表达或以大大降低的水平表达编码蛋白。在其他情况下，被破坏的基因以突变形式表达编码的蛋白质，该蛋白质没有功能性或活性大大降低。在一些实施方案中，被破坏的基因是不编码功能蛋白的基因。在一些实施方案中，包含被破坏的基因的细胞不表达(例如，不在细胞表面表达)可检测水平(例如，通过抗体，例如，通过流式细胞术可检测水平)的由该基因编码的蛋白。不表达可检测水平的蛋白的细胞可以称为敲除细胞。例如，如果使用特异性结合β2M蛋白的抗体在细胞表面不能检测到β2M蛋白，则具有ββ2M基因编辑的细胞可以认为是β2M敲除细胞。
在一些实施方案中，被破坏的基因可以描述为相对于野生型对应物包含突变片段。突变片段可包含缺失、核苷酸取代、添加或其组合。在其他实施方案中，被破坏的基因可以描述为具有野生型对应物中存在的片段的缺失。在一些情况下，缺失片段的5′末端可以位于设计的引导RNA诸如本文公开的那些引导RNA所靶向的基因区域(称为中靶序列)内，并且缺失片段的3′末端可超出靶向区域。可替代地，缺失片段的3′末端可位于靶向区域内，而缺失片段的5′末端可超出靶向区域。
在一些情况下，本文公开的抗CD19CAR-T细胞中被破坏的TRAC基因可包含缺失，例如TRAC基因的基因座的外显子1中的片段的缺失。在一些实例中，被破坏的TRAC基因包含含有SEQ ID NO：26的核苷酸序列的片段的缺失，所述核苷酸序列是TRAC引导RNA TA-1的靶位点。参见下面的序列表。在一些实例中，SEQ ID NO：26的片段可被编码抗CD19 CAR的核酸置换。此类被破坏的TRAC基因可以包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。
本文公开的抗CD19 CAR-T细胞中被破坏的B2M基因可以使用CRISPR/Cas技术生成。在一些实例中，可以使用在下面的序列表中提供的B2M gRNA。被破坏的B2M基因可包含SEQ ID No：9-14中任一个的核苷酸序列。
(iii)用于同种异体疗法的示例性抗CD19 CAR-T细胞群体
本文还提供了基因工程化免疫细胞(例如，T细胞诸如人T细胞)群，其包含本文公开的抗CD19 CAR-T细胞，其表达本文公开的抗CD19 CAR中的任一种(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的抗CD19 CAR)，以及也如本文公开的被破坏的TRAC基因和/或被破坏的B2M基因。在一些实例中，基因工程化T细胞群体是CTX110细胞，其是具有被破坏的TRAC基因和B2M基因的CD19定向的T细胞。编码抗CD19 CAR的核酸可以插入被破坏的TRAC基因中SEQID NO：26的位点，该位点被编码抗CD19 CAR的核酸置换，从而破坏TRAC基因的表达。CTX110细胞中被破坏的TRAC基因可包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。
CTX110细胞可以经由使用CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)技术破坏靶向基因(TRAC和B2M基因)进行离体基因修饰，以及经由递送抗CD19CAR构建体的腺相关病毒(AAV)转导来产生。CRISPR-Cas9介导的基因编辑涉及两个引导RNA(sgRNA)：靶向TRAC基因座的TA-1sgRNA(SEQ ID NO：18)，和靶向β2M基因座的B2M-1sgRNA(SEQ ID NO：20)。对于本文提供的任何gRNA序列，未明确指示修饰的那些意在涵盖未经修饰的序列和具有任何合适的修饰的序列。
CTX110细胞的抗CD19 CAR由以下组成：抗CD19单链抗体片段(scFv，其可以包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列)，随后是CD8铰链和跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列)，该跨膜结构域与CD28的细胞内协同信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：36)和CD3ζ信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：38)融合。在具体实例中，CTX110细胞中的抗CD19CAR包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CTX110细胞群体的至少30％表达可检测水平的抗CD19 CAR。例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CTX110细胞表达可检测水平的抗CD19 CAR。
在一些实施方案中，CTX110细胞群体的至少50％可能不表达可检测水平的β2M表面蛋白。例如，至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CTX110细胞可能不表达可检测水平的β2M表面蛋白。在一些实施方案中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的β2M表面蛋白。
可替代地或另外，CTX110细胞群体的至少50％可能不表达可检测水平的TCR表面蛋白。例如，至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CTX110细胞可能不表达可检测水平的TCR表面蛋白。在一些实施方案中，群体的50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的工程化T细胞不表达可检测水平的TRAC表面蛋白。在具体实例中，超过90％(例如，超过99.5％)的CTX1 10细胞不表达可检测的TCR表面蛋白。
在一些实施方案中，CTX110 T细胞群体中相当大百分比的细胞可包含多于一个基因编辑，这导致一定百分比的细胞不表达多于一种基因和/或蛋白。
例如，CTX110细胞群体的至少50％可能不表达可检测水平的两种表面蛋白，例如，不表达可检测水平的β2M和TRAC蛋白。在一些实施方案中，50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的CTX110 T细胞不表达可检测水平的TRAC和B2M表面蛋白。在另一个实例中，CTX110细胞群体的至少50％不表达可检测水平的TRAC和B2M表面蛋白。
在一些实施方案中，CTX110 T细胞群体可以包含多于一种基因编辑(例如，在多于一个基因中)，该基因编辑可以是本文所述的编辑。例如，CTX110 T细胞群体可以包含使用TA-1TRAC gRNA经由CRISPR/Cas技术破坏的TRAC基因。在一些实例中，相对于未经修饰的T细胞，CTX110细胞可在TRAC基因中包含缺失。例如，CTX110 T细胞可在TRAC基因中包含片段AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQ ID NO：26)的缺失。该片段可被编码抗CD19 CAR的核酸(例如，SEQ ID NO：39)置换。可替代地或另外，CTX110细胞群体可以包含使用B2M-1的gRNA经由CRTSPR/Cas9技术破坏的β2M基因。此类CTX110细胞可以在β2M基因中包含插入缺失(Indel)，其包含SEQ IDNO：9-14中的一个或多个核苷酸序列。在具体实例中，CTX110细胞包含≥30％CAR+T细胞，≤50％B2M+细胞和≤30％TCRαβ+细胞。在另外的具体实例中，CTX1 10细胞包含≥30％CAR+T细胞，≤30％B2M+细胞和≤0.5％TCRαβ+细胞。
还参见WO 2019/097305A2和WO2019215500，其各自的相关公开内容通过引用并入以用于本文提及的主题和目的。
(iv)药物组合物
在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含如本文公开的任何基因工程化抗CD19 CAR T细胞群体，例如CTX110细胞，和药学上可接受的载剂。此类药物组合物可用于人类患者的癌症治疗，所述癌症治疗也在本文中公开。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医学判断范围内，适合接触人类和动物的组织使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。参见，例如，Berge等人，(1977)J Pharm Sci 66：1-19。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的非限制性实例包括酸加成盐(由多肽的游离氨基与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成)。在一些实施方案中，与游离羧基形成的盐衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含悬浮于冻存溶液(例如，C55)中的基因工程化抗CD19CAR-T细胞(例如，CTX110细胞)群。在本公开中使用的冻存溶液还可以包含腺苷、右旋糖、葡聚糖-40、乳糖酸、蔗糖、甘露醇、缓冲剂诸如N-)2-羟乙基)哌嗪N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、一种或多种盐(例如，氯化钙、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾等)、一种或多种碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾等)或其组合。冻存溶液的组分可以溶解在无菌水中(注射质量)。任何冻存溶液都可以基本上不含血清(通过常规方法不可检测)。
在一些情况下，可将包含悬浮于冻存溶液(例如，基本上不含血清)中的基因工程化抗CD19 CAR-T细胞(诸如CTX110细胞)群的药物组合物置于储存小瓶中。
本文公开的任何药物组合物，包含任选地可悬浮在如本文公开的冻存溶液中的也如本文公开的基因工程化抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110细胞)群，可储存在基本上不影响T细胞的活力和生物活性的环境中以供将来使用，例如，储存在通常应用于细胞和组织储存的条件下。在一些实例中，所述药物组合物可在≤-135℃下储存在液氮的蒸气相中。在细胞在此类条件下储存一段时间后，没有观察到关于外观、细胞计数、活力、％CAR+T细胞、％TCR+T细胞和％B2M+T细胞的显著变化。在具体实例中，所述药物组合物可置于小瓶中，每个小瓶包含约1.5x108个CAR+T细胞，诸如CTX110细胞。在其他实例中，所述药物组合物可置于小瓶中，每个小瓶包含约3x108个CAR+T细胞，诸如CTX110细胞。
II.基因工程化免疫细胞的制备
本领域已知的任何合适的基因编辑方法可用于制备本文公开的基因工程化免疫细胞(例如，T细胞诸如CTX1 10细胞)，例如，使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或RNA引导的CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；规律间隔成簇短回文重复序列相关蛋白9)。在具体实例中，使用腺相关病毒载体(AAV)作为供体模板，通过CRISPR技术结合同源重组产生基因工程化免疫细胞诸如CTX1 10细胞。
(i)CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统
CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA引导的DNA靶向平台。它依赖于DNA核酸酶Cas9和两个非编码RNA(crisprRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA))来靶向DNA的切割。CRISPR是成簇规律间隔短回文重复序列的缩写，是在细菌和古细菌基因组中发现的DNA序列家族，其包含与既往暴露于细胞(例如病毒)的外源DNA(例如，由感染或攻击原核生物的病毒暴露于细胞的外源DNA)相似的DNA片段(间隔区DNA)。这些DNA片段被原核生物用来在重新引入后，例如在随后的攻击中从相似的病毒中检测和破坏相似的外源DNA。CRISPR基因座的转录导致包含间隔区序列的RNA分子的形成，该RNA分子缔合并靶向Cas(CRISPR相关)蛋白以能够识别和剪切外来(外源)DNA。已经描述了许多类型和种类的CRISPR/Cas系统(参见例如，Koonin等人，(2017)CurrOpin Microbiol 37：67-78)。
crRNA通过典型地与靶DNA中的20个核苷酸(nt)序列的沃森-克里克碱基配对来驱动CRISPR-Cas9复合物的序列识别和特异性。改变crRNA中5’20nt的序列可将CRISPR-Cas9复合物靶向特定基因座。如果靶序列后面是特定的短DNA序列(序列为NGG)作为原型间隔区相邻基序(PAM)，CRISPR-Cas9复合物仅结合包含与crRNA的前20nt序列匹配的DNA序列。
TracrRNA与crRNA的3′末端杂交形成RNA双链体结构，该双链体结构与Cas9内切核酸酶结合形成催化活性的CRISPR-Cas9复合物，其然后可以切割靶DNA。
一旦CRISPR-Cas9复合物在靶位点与DNA结合，Cas9酶内的两个独立的核酸酶结构域各自切割PAM位点上游的DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。
CRISPR-Cas9复合物在特定靶位点处与DNA结合并形成位点特异性DSB之后，下一个关键步骤是修复DSB。细胞使用两种主要的DNA修复途径来修复DSB：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。
NHEJ是一种稳健的修复机制，在包括非分裂细胞在内的大多数细胞类型中显现出高活性。NHEJ易错且通常可在DSB的位点导致在一个到几百个核苷酸之间的去除或添加，尽管此类修饰典型地＜20nt。所得插入和缺失(插入缺失)可以破坏基因的编码区或非编码区。可替代地，HDR使用内源性或外源性提供的长段同源供体DNA来以高保真度修复DSB。HDR仅在分裂的细胞中有效，并且在大多数细胞类型中以相对较低的频率发生。在本公开的许多实施方案中，NHEJ被作为自发的修复来利用。
(a)Cas9
在一些实施方案中，Cas9(CRISPR相关蛋白9)核酸内切酶用于CRISPR方法中，该方法用于制备本文公开的基因工程化T细胞。Cas9酶可以是来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的一种，但是也可以使用其他Cas9同源物。应理解，如本文所提供的，可以使用野生型Cas9或可以使用Cas9的修饰版本(例如，Cas9的进化版本，或Cas9直向同源物或变体)。在一些实施方案中，Cas9包含酿脓链球菌来源的Cas9核酸酶蛋白，其已被工程化为包括C末端和N末端SV40大T抗原核定位序列(NLS)。所得Cas9核酸酶(sNLS-spCas9-sNLS)是162kDa蛋白，其通过重组大肠杆菌(E.coli)发酵产生并通过色谱法纯化。spCas9氨基酸序列可按照UniProt登录号Q99ZW2找到，其在本文中作为SEQ ID NO：55提供。
(b)引导RNA(gRNA)
如本文所述，CRISPR-Cas9介导的基因编辑包括引导RNA或gRNA的使用。如本文所用，“gRNA”是指基因组靶向核酸，其可以将Cas9定向至TRAC基因或β2M基因内的特定靶序列，以在特定靶序列处进行基因编辑。引导RNA至少包含与靶基因内用于进行编辑的靶核酸序列杂交的间隔区序列，以及CRISPR重复序列。
SEQ ID NO:18或22中提供了靶向TRAC基因的示例性gRNA。参见下面的序列表。还参见WO 2019/097305A2，其相关公开内容通过引用并入本文以用于本文提及的主题和目的。可以使用位于第14号染色体上的TRAC基因序列(GRCh38：第14号染色体：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)设计其他gRNA序列。在一些实施方案中，靶向TRAC基因组区域的gRNA和Cas9在TRAC基因组区域中产生断裂，在TRAC基因中产生插入缺失，其破坏mRNA或蛋白质的表达。
SEQ ID NO:20或24中提供了靶向β2M基因的示例性gRNA。参见下面的序列表。还参见WO 2019/097305A2，其相关公开内容通过引用并入本文以用于本文提及的目的和主题。可以使用位于第15号染色体上的β2M基因序列(GRCh38坐标：第15号染色体：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)设计其他gRNA序列。在一些实施方案中，靶向β2M基因组区域的gRNA和RNA引导的核酸酶在β2M基因组区域中产生断裂，在β2M基因中产生插入缺失，其破坏mRNA或蛋白质的表达。
在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。在V型gRNA中，crRNA形成双链体。在这两个系统中，双链体都结合定点多肽，使得引导RNA和定点多肽形成复合物。在一些实施方案中，靶向基因组的核酸由于其与定点多肽的缔合而为复合物提供了靶特异性。因此，靶向基因组的核酸定向定点多肽的活性。
如本领域普通技术人员所理解的，每个引导RNA设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔区序列。参见Jinek等人，Science，337，816-821(2012)和Deltcheva等人，Nature，471，602-607(2011)。
在一些实施方案中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是双分子引导RNA。在一些实施方案中，靶向基因组的核酸(例如，gRNA)是单分子引导RNA。
双分子引导RNA包含两条链的RNA分子。第一条链在5′至3′方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和最小CRISPR重复序列。第二条链包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子引导RNA(称为“sgRNA”)在5′至3′方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小CRISPR重复序列、单分子引导接头、最小tracrRNA序列、3′tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸序列可以包含为引导RNA贡献另外的功能(例如，稳定性)的元件。单分子引导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸包括一个或多个发夹。V型系统中的单分子引导RNA在5’至3′方向上包含最小CRISPR重复序列和间隔区序列。
“靶序列”在与PAM序列相邻的靶基因中，并且是要被Cas9修饰的序列。“靶序列”在“靶核酸”中的所谓的PAM链上，该靶核酸是包含PAM链和互补的非PAM链的双链分子。本领域技术人员认识到，gRNA间隔区序列与位于目标靶核酸的非PAM链中的互补序列杂交。因此，gRNA间隔区序列是靶序列的RNA等效物。
例如，如果TRAC靶序列是5′-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3′(SEQ ID NO：26)，则gRNA间隔区序列是5′-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3′(SEQ ID NO：19)。在另一个实例中，如果β2M靶序列是5′-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3′(SEQ IDNO：27)，则gRNA间隔区序列是5′-GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3′(SEQ ID NO：21)。gRNA的间隔区经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与目标靶核酸相互作用。因此，间隔区的核苷酸序列根据目标靶核酸的靶序列而变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，将间隔区序列设计成与靶核酸的区域杂交，该区域位于该系统中使用的Cas9酶可识别的PAM的5′。间隔区可以与靶序列完全匹配或可以有错配。每个Cas9酶都有特定的PAM序列，使得该酶识别靶DNA。例如，酿脓链球菌识别靶核酸中的包含序列5′-NRG-3′的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3′。
在一些实施方案中，靶核酸序列的长度是20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的长度小于20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的长度超过20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的长度是至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的长度是至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸序列具有20个紧邻PAM第一个核苷酸的5′的碱基。例如，在包含5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3′的序列中，靶核酸可以是对应于该多个N的序列，其中N可以是任何核苷酸，并且加下划线的NRG序列是酿脓链球菌PAM。实例作为SEQ ID NO：15-17提供。
本文公开的引导RNA可以经由crRNA中的间隔区序列靶向任何目标序列。在一些实施方案中，引导RNA的间隔区序列与靶基因中的靶序列之间的互补程度可以是约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，引导RNA的间隔区序列与靶基因中的靶序列是100％互补的。在其他实施方案中，引导RNA的间隔区序列和靶基因中的靶序列可以包含多达10个错配，例如，多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达3个、多达2个或多达1个错配。
可如本文提供那样使用的gRNA的非限制性实例在WO 2019/097305A2和WO2019/215500中提供，其各自的相关公开内容通过引用并入本文以用于本文提及的目的和主题。对于本文提供的任何gRNA序列，未明确指示修饰的那些意在涵盖未经修饰的序列和具有任何合适的修饰的序列。
本文公开的任何gRNA中的间隔区序列的长度可以取决于CRISPR/Cas9系统和用于编辑也在本文公开的任何靶基因的组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas9蛋白具有不同的最佳间隔区序列长度。因此，间隔区序列的长度可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、或超过50个的核苷酸。在一些实施方案中，间隔区序列的长度可以具有18-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度可以具有19-21个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区序列的长度可包含20个核苷酸。
在一些实施方案中，gRNA可以是sgRNA，其可以在sgRNA序列的5'末端包含20个核苷酸间隔区序列。在一些实施方案中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含少于20个核苷酸的间隔区序列。在一些实施方案中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含大于20个核苷酸的间隔区序列。在一些实施方案中，sgRNA在sgRNA序列的5’末端包含具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔区序列。
在一些实施方案中，sgRNA在sgRNA序列的3’末端不包含尿嘧啶。在其他实施方案中，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含一个或多个尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含1-8个尿嘧啶残基，例如，在sgRNA序列的3’末端包含1、2、3、4、5、6、7或8个尿嘧啶残基。
本文公开的任何gRNA，包括任何sgRNA，可以是未经修饰的。可替代地，它可以包含一个或多个经修饰的核苷酸和/或经修饰的主链。例如，经修饰的gRNA(诸如sgRNA)可以包含一个或多个2′-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可以位于5’末端、3′末端或这两个末端。
在某些实施方案中，一种以上的引导RNA可以与CRISPR/Cas核酸酶系统一起使用。每种引导RNA可包含不同的靶向序列，以使CRISPR/Cas系统切割一种以上的靶核酸。在一些实施方案中，一种或多种引导RNA可以在Cas9 RNP复合物中具有相同或不同的性质，诸如活性或稳定性。当使用一种以上引导RNA时，每种引导RNA可以在相同或不同的载体上编码。用于驱动一种以上引导RNA表达的启动子是相同或不同的。
应理解，在本文所述的方法中可以使用一种以上的合适的Cas9和一种以上的合适的gRNA，例如，本领域已知的或本文公开的那些。在一些实施方案中，方法包括本领域已知的Cas9酶和/或gRNA。实例可见于例如WO 2019/097305A2和WO2019/215500，其各自的相关公开内容通过引用并入本文用于本文提及的目的和主题。
(ii)用于将CAR构建体递送至T细胞的AAV载体
可以使用腺相关病毒(AAV)将编码本文公开的抗CD19 CAR构建体的核酸递送至细胞。AAV是小病毒，其位点特异性整合到宿主基因组中，并且因此可以递送转基因，例如CAR。存在反向末端重复序列(ITR)，位于AAV基因组和/或目标转基因的侧翼，并用作复制起点。AAV基因组中还存在rep和cap蛋白，它们在转录时形成衣壳，这些衣壳封装AAV基因组以递送到靶细胞中。这些衣壳上的表面受体会赋予AAV血清型，其决定衣壳主要结合哪个靶器官，并且因此决定AAV将最有效地感染哪些细胞。目前已知十二种人AAV血清型。在一些实施方案中，在递送CAR编码核酸中使用的AAV是AAV血清型6(AAV6)。
出于多种原因，腺相关病毒是用于基因疗法的最常用病毒之一。首先，AAV在施用于包括人在内的哺乳动物后不会引起免疫反应。第二，将AAV有效地递送至靶细胞，尤其是在考虑选择合适的AAV血清型时。最后，因为基因组可以在宿主细胞中持续存在而不整合，AAV具有感染分裂和非分裂细胞的能力。这种特性使它们成为基因疗法的理想候选。
可以设计编码抗CD19 CAR的核酸，以插入宿主T细胞中的目标基因组位点中。在一些实施方案中，靶基因组位点可以在安全港基因座中。
在一些实施方案中，编码抗CD19 CAR的核酸(例如，经由供体模板，其可由病毒载体诸如腺相关病毒(AAV)载体携带)可被设计成使其可插入TRAC基因内的位置以破坏基因工程化T细胞中的TRAC基因并表达CAR多肽。TRAC的破坏导致内源性TCR的功能丧失。例如，TRAC基因中的破坏可以用核酸内切酶(诸如本文所述的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNA来产生。对TRAC基因和靶区域具有特异性的任何gRNA可用于此目的，例如，本文公开的那些。
在一些实例中，TRAC基因中的基因组缺失和由CAR编码区段的置换可以通过同源定向修复或HDR(例如，使用供体模板，其可以是病毒载体诸如腺相关病毒(AAV)载体的一部分)来产生。在一些实施方案中，TRAC基因中的破坏可以利用核酸内切酶(如本文所公开的那些)和靶向一个或多个TRAC基因组区域的一个或多个gRNA并将CAR编码区段插入TRAC基因中来产生。
如本文公开的供体模板可以包含CAR的编码序列。在一些实例中，CAR编码序列的两侧可以有两个同源区，以允许使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在目标基因组位置处(例如，在TRAC基因处)的有效HDR。在这种情况下，靶基因座处的DNA的两条链都可以被CRISPRCas9酶切割，该酶由对靶基因座有特异性的gRNA引导。然后发生HDR，以修复双链断裂(DSB)并插入编码CAR的供体DNA。为了使此正确发生，设计供体序列的侧翼残基与靶基因(诸如TRAC基因)中DSB位点周围的序列(以下简称“同源臂”)互补。这些同源臂用作DSB修复的模板，并使HDR成为基本无错误的机制。同源定向修复(HDR)的速率是突变与切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或附近的靶位点很重要。模板可以包括同源区侧翼的额外序列或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而允许进行序列编辑。
可替代地，供体模板可以与DNA中的靶向位置不具有同源区域，并且可以在靶位点切割后通过NHEJ依赖性末端连接而整合。
供体模板可以是单链和/或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，防止免受核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3′末端和/或将自身互补的寡核苷酸连接到一端或两端。参见，例如，Chang等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4959-4963；Nehls等人，(1996)Science 272：886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于一个或多个末端氨基基团的添加和经修饰的核苷酸间键的使用，例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
可以将供体模板作为载体分子的一部分引入细胞中，该载体分子具有另外的序列，诸如例如，复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体模板可以作为裸核酸、作为与试剂诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸引入细胞，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))递送。
在一些实施方案中，供体模板可以插入在内源启动子附近的位点(例如，下游或上游)，从而其表达可以由内源启动子驱动。在其他实施方案中，供体模板可包含外源启动子和/或增强子，例如组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，以控制CAR基因的表达。在一些实施方案中，外源启动子是EF1α启动子。可以使用其他启动子。
此外，外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。
为了制备基因工程化免疫细胞(例如，本文公开的T细胞)，可以获得来自合适来源的免疫细胞诸如T细胞，例如，来自人类供体的血细胞，所述人类供体可以是健康供体或需要CAR-T细胞疗法的患者。CTX110细胞可以使用来自一个或多个健康人类供体的血细胞制备。由健康供体细胞制造使无意中转导恶性淋巴瘤/白血病细胞的风险最小化，并且可能改善CAR T细胞的功能性。CRISPR系统的组分(例如，Cas9蛋白和gRNA)，任选地AAV供体模板，可以经由常规方法递送到宿主免疫细胞中。在一些实例中，Cas9和gRNA可以形成核糖核蛋白复合物(RNP)，其可以通过电穿孔递送至宿主免疫细胞。任选地，AAV供体模板可以与RNP复合物同时递送至免疫细胞。可替代地，RNP和AAV供体模板的递送可以依序进行。在一些实例中，T细胞可以在递送基因编辑组分之前被激活。
在递送基因编辑组分和任选地递送供体模板之后，可以回收细胞并在体外扩增。可以使用常规方法评价基因编辑效率以确认抗CD19CAR的敲入和靶基因(例如，TRAC、B2M或两者)的敲除。在一些实例中，可以去除TCRαβ+T细胞。用于制备本文公开的基因工程化免疫细胞诸如CTX110细胞的其他信息可在美国专利申请62/934,991中找到，其相关公开内容通过引用并入用于本文提及的目的和主题。
III.B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法
在一些方面，本文提供了使用如本文公开的任何基因工程化抗CD19 CAR T细胞群体诸如CTX110T细胞群体治疗患有B细胞恶性肿瘤的人类患者的方法。同种异体抗CD19 CART细胞疗法可包括两个治疗阶段：(i)调节方案(淋巴细胞清除治疗)，其包括向合适的人类患者给予一个或多个剂量的一种或多种淋巴细胞清除剂，和(ii)治疗方案(同种异体抗CD19 CAR T细胞疗法)，其包括向人类患者给予同种异体抗CD19 CAR T细胞群体，诸如本文公开的CTX110 T细胞。在一些情况下，在有或无伴随淋巴细胞清除治疗的情况下，可以将一个或多个附加剂量的抗CD19 CAR-T细胞施用于人类患者。
(i)患者群体
人类患者可以是对其而言期望诊断、治疗或疗法的任何人类受试者。人类患者可以是任何年龄。在一些实施方案中，人类患者是成人(例如，至少18岁的人)。在一些实例中，人类患者可以具有50kg或更高的体重。在一些实施方案中，人类患者可以是儿童。
要通过本文所述的方法治疗的人类患者可以是患有B细胞恶性肿瘤，怀疑患有B细胞恶性肿瘤或具有B细胞恶性肿瘤风险的人类患者。怀疑患有B细胞恶性肿瘤的受试者可能显示出B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状，例如不明原因的体重减轻、疲劳、盗汗、呼吸短促或腺体肿胀。处于B细胞恶性肿瘤风险中的受试者可以是具有B细胞恶性肿瘤风险因素中的一种或多种的受试者，所述风险因素例如免疫系统减弱、年龄、男性或感染(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)感染)。需要抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110 T细胞)治疗的人类患者可以通过常规医学检查，例如身体检查、实验室测试、活组织检查(例如，骨髓活组织检查和/或淋巴结活组织检查)、磁共振成像(MRI)扫描或超声检查来鉴定。
在一些实施方案中，CD19+B细胞恶性肿瘤是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，其是起源于B淋巴细胞、T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞的异质性恶性肿瘤群。世界卫生组织根据癌症起源的细胞类型、组织学、突变分析和细胞表面上的蛋白质标志物定义了60多种不同的NHL亚类，并且NHL是全世界第10种最常见的恶性肿瘤(Chihara等人，2015；Trask等人，2012)。NHL占所报告的所有新癌症病例的4.3％，是美国癌症死亡的第8大原因。NHL的主要亚型包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)和滤泡性淋巴瘤(FL；(Teras等人，2016；Trask等人，2012)。CD19表达普遍存在于B细胞恶性肿瘤上，并在NHL的无痛和侵袭性亚型中维持(Scheuermann和Racila，1995)，这已促使这些适应症中CD19定向疗法的开发增加。
在一些实例中，可使用本文所述的方法治疗的B细胞恶性肿瘤包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤(FL)、3b级FL或慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)的Richter转化。在一些实例中，B细胞恶性肿瘤是DLBCL，例如高级别DLBCL或非特指型(NOS)的DLBCL。在一些实例中，B细胞恶性肿瘤是转化FL或3b级FL。在一些实例中，人类患者具有至少一个可测量的病变，所述病变为氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性。在一些实例中，人类患者可患有具有大体积表现的难治性NHL疾病(高危受试者)。
DLBCL是最常见的NHL类型，占诊断病例的30-40％(Sehn和Gascoyne，2015)。使用由利妥昔单抗(rituximab)、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松组成的一线化学免疫疗法，大约30-50％实现治愈(R-CHOP；Coiffier等人，2010；Maurer等人，2016)。然而，大约20％是R-CHOP难治性的，并且30％在完全反应后复发(CR；(Maurer等人，2016)。
FL是异质性疾病，通常无痛，并且占所报告的NHL的约20％。该过程的特征在于对疗法的初始反应，随后复发，并且有时转化为更具侵袭性形式的淋巴瘤。通常认为在更晚期是不可治愈的，但是基于滤泡性淋巴瘤国际预后指数评分，具有早期疾病和0至1个风险因素的受试者的10年生存率为71％(Solal-Céligny等人，2004)。基于组织学评估和中心细胞与成中心细胞的比例，将FL分为1-3级，并且将3级细分为3a和3b。3b级FL现在被认为是生物学上不同的实体，经常不存在t(14；18)和CD10表达，并且p53和MUM1/IRF4表达增加(Horn等人，2011)。对500多例FL病例的大型回顾性分析进一步证实，3b级FL的临床病程与1-2级FL相似，而3b级FL的临床病程与DLBCL更为相似(Kahl和Yang，2016；Wahlin等人，2012)。因此，3b级FL的管理通常类似于DLBCL(Kahl和Yang，2016)。
在一些实施方案中，待治疗的人类患者患有DLBCL并且表现出直肠旁肿块、腹膜后肿块、弥漫性淋巴结(LN)、溶解性病变、扁桃体病变或其组合。可替代地或另外，人类患者可具有骨髓扩散。在其他实例中，人类患者没有骨髓扩散。
在一些实施方案中，待治疗的人类患者患有转化FL。此类人类患者可能表现出弥漫性LN。在一些情况下，人类患者可具有骨髓扩散。在其他情况下，人类患者可没有骨髓扩散。
待通过本文所述的方法治疗的人类患者可以是在治疗后复发和/或已变得对治疗有抗性和/或已经对治疗无反应的人类患者。如本文所用，“复发的”或“复发”是指在一段时间的完全反应后恢复的B细胞恶性肿瘤，诸如本文所公开的那些。进行性疾病是指在最后一次评价后疾病恶化的情况(例如，疾病稳定或部分反应)。在一些实施方案中，在治疗期间发生进展。在一些实施方案中，在治疗之后发生复发。缺乏反应可通过常规医疗实践确定。例如，待通过本文所述的方法治疗的人类患者可以是已经具有一个或多个线数的既往抗癌疗法的人类患者。在一些情况下，人类患者可能已经历两个或更多个线数的既往抗癌疗法，例如化疗、免疫疗法、手术或其组合。在一些实例中，既往抗癌疗法可包括抗CD20抗体疗法、含蒽环类药物的疗法或其组合。
在一些情况下，人类患者患有难治性B细胞恶性肿瘤。如本文所用，“难治性”是指对治疗不反应或变得耐受的B细胞恶性肿瘤，诸如本文所公开的那些。患有难治性B细胞恶性肿瘤的人类患者可在最后治疗时具有进行性疾病，或在至少两个治疗周期后具有疾病稳定，其中疾病稳定的持续时间为至多6个月(例如，至多5个月、至多4个月或至多3个月或至多2个月或至多1个月)。在一些情况下，人类患者可能已经经历了既往自体造血干细胞移植(HSCT)，并且对此类造血干细胞移植没有显示出反应(失败)，或者在达到一定反应后已经发展或复发。在其他情况下，人类患者可能不符合既往自体HSCT的条件。
可筛选人类患者以确定患者是否符合经历如本文公开的调节方案(淋巴细胞清除治疗)和/或同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法的条件。例如，符合淋巴细胞清除治疗条件的人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：(a)临床状态显著恶化，(b)需要补充氧气以维持大于90％的饱和度，(c)心律失常不受控制，(d)低血压需要血管加压药支持，(e)活动性感染，和(f)≥2级急性神经毒性。在另一个实例中，符合治疗方案条件的人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：(a)不受控制的活动性感染；(b)与淋巴细胞清除治疗之前的临床状态相比，临床状态恶化；和(c)≥2级急性神经毒性。
可以基于此类筛选结果筛选人类患者并将其从调节方案和/或治疗方案中排除。例如，如果患者符合以下排除标准中的一个或多个，则可将人类患者从调节方案和/或同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法中排除：(a)具有美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态0或1；(b)充分的肾功能、肝功能、心脏功能和/或肺功能；(c)没有既往基因疗法或改良细胞疗法；(d)没有包含抗CD19抗体的既往治疗；(e)没有既往同种异体HSCT；(f)没有来自脑脊液的可检测的恶性细胞；(g)没有脑部转移；(h)没有既往中枢神经系统病症；(i)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗死；(j)没有不受控制的感染；(k)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷病症或自身免疫病症；以及(l)没有受人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
在一些实施方案中，人类患者是在筛选之前14天或5个半衰期内(以较长者为准)没有全身性抗肿瘤疗法或研究剂的NHL患者。在一些情况下，人类患者先前可进行免疫疗法(例如，利妥昔单抗、伊妥珠单抗(inotuzumab)等)，免疫疗法可在筛选前30天内(例如，14天内)停止。
(ii)调节方案(淋巴细胞清除疗法)
适于本文公开的治疗方法的任何人类患者都可接受淋巴细胞清除疗法以减少或消除受试者的内源性淋巴细胞。
淋巴细胞清除是指内源性淋巴细胞和/或T细胞的破坏，其通常在免疫移植和免疫疗法之前使用。淋巴细胞清除可以通过辐照和/或化疗来实现。“淋巴细胞清除剂”可以是当施用于受试者时能够减少、清除或消除内源性淋巴细胞和/或T细胞的任何分子。在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂以与所述药剂施用之前的淋巴细胞数量相比，有效地使淋巴细胞数量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、97％、98％或至少99％的量施用。在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂以有效减少淋巴细胞数量的量施用，使得受试者中的淋巴细胞数量低于检测限。在一些实施方案中，向受试者施用至少一种(例如，2、3、4、5种或更多种)淋巴细胞清除剂。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂是特异性杀伤淋巴细胞的细胞毒性剂。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀(bendamustin)、5-氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨蝶呤、达卡巴嗪(dacarbazine)、美法仑(melphalan)、多柔比星(doxorubicin)、长春碱、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、磷酸依托泊苷、米托蒽醌、克拉屈滨(cladribine)、地尼白介素(denileukin diftitox)或DAB-IL2。在一些情况下，淋巴细胞清除剂可以伴随低剂量辐照。调节方案的淋巴细胞清除作用可经由常规实践进行监测。
在一些实施方案中，本文所述的方法涉及包含一种或多种淋巴细胞清除剂，例如氟达拉滨和环磷酰胺的调节方案。待通过本文所述的方法治疗的人类患者可以在调节阶段接受多个剂量的所述一种或多种淋巴细胞清除剂，持续合适的时间(例如，1-5天)。在淋巴细胞清除期间，患者可以接受所述淋巴细胞清除剂中的一种或多种，每天一次。在一个实例中，人类患者接受每天约20-50mg/m2(例如，30mg/m2)的氟达拉滨持续2-4天(例如，3天)和每天约500-750mg/m2(例如，500或750mg/m2)的环磷酰胺持续2-4天(例如，3天)。在具体实例中，人类患者可以接受每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
在其他具体实例中，人类患者可以接受每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。当人类患者接受这种初始淋巴细胞清除治疗方案时，任何后续淋巴细胞清除治疗，例如，与抗CD19 CAR T细胞诸如本文公开的CTX110的再次给药联合，可以包含每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续2-4天，诸如三天。
然后可以在本文公开的淋巴细胞清除疗法后的合适时期内，向人类患者施用任何抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110细胞。例如，人类患者可在施用抗CD19 CAR+T细胞(例如，CTX110细胞)之前约2-7天(例如，2、3、4、5、6、7天)接受一种或多种淋巴细胞清除剂。在一些情况下，在淋巴细胞清除疗法后约4-5天内，向人类患者施用抗CD19 CAR+T细胞(例如，CTX110细胞)。
由于同种异体抗CD19 CAR-T细胞诸如CTX110细胞可提前制备并且可储存在治疗部位，因此本文公开的淋巴细胞清除疗法可在人类患者被鉴定为适于本文公开的同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法后的短时间窗口内(例如，2周内)施用于患有B细胞恶性肿瘤的人类患者。例如，可以在人类患者被鉴定为适于同种异体抗CD19 CAR-T细胞疗法后的两周内(例如，10天内、9天内、8天内、7天内、6天内、5天内、4天内、3天内、两天内或更少)向人类患者施用第一剂量的淋巴细胞清除疗法(例如，约30mg/m2的氟达拉滨和约500mg/m2或750mg/m2的环磷酰胺)。在一些实例中，可在人类患者被鉴定为适于治疗后的24-72小时内(例如，24小时内)对人类患者进行淋巴细胞清除疗法。然后可以在淋巴细胞清除治疗后的2-7天(例如，2、3、4、5、6或7天)内向患者施用CAR-T细胞。这允许在疾病诊断和/或患者鉴定之后用本文公开的同种异体抗CD19 CAR-T细胞诸如CTX110细胞及时治疗人类患者而没有延迟(例如，由于治疗细胞的制备而延迟)。在某些情况下，患者可以在住院治疗期间接受治疗。在某些情况下，患者可以在门诊治疗时接受治疗。
在任何淋巴细胞清除步骤之前，可以筛选人类患者的一个或多个特征以确定患者是否符合淋巴细胞清除治疗条件。例如，在淋巴细胞清除之前，符合淋巴细胞清除治疗条件的人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：(a)临床状态显著恶化，(b)需要补充氧气以维持大于90％的饱和度，(c)心律失常不受控制，(d)低血压需要血管加压药支持，(e)活动性感染，和(f)≥2级急性神经毒性。
在淋巴细胞清除后，可以筛选人类患者的一种或多种特征以确定患者是否符合用抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110细胞治疗的条件。例如，在抗CD19 CAR T细胞治疗之前和淋巴细胞清除治疗之后，符合抗CD19 CAR T细胞治疗条件的人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：(a)不受控制的活动性感染；(b)与淋巴细胞清除治疗之前的临床状态相比，临床状态恶化；和(c)≥2级急性神经毒性。
(iii)抗CD19 CAR T细胞的施用
施用抗CD19 CAR T细胞可包括通过引起基因工程化T细胞群体至少部分定位在所需部位(诸如肿瘤部位)的方法或途径将如本文所公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)置于(例如，移植到)也如本文所公开的人类患者中，使得可产生所需的效果。基因工程化T细胞群体可以通过任何适当的途径施用，该途径导致递送至受试者中的所需位置，在该位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用于受试者后，细胞的活力期可以短至几小时(例如，二十四小时)、几天、数周或数月，长达数年或甚至受试者的寿命(即，长期植入)。在某些情况下，患者可以在住院治疗期间接受基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)。在某些情况下，患者可在门诊治疗中接受基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)。
例如，在本文所述的一些方面，有效量的基因工程化T细胞群体可以经由全身性施用途径(诸如腹膜内或静脉内途径)施用。
在一些实施方案中，全身性施用基因工程化T细胞群体，这是指将细胞群体以不同于直接施用至靶部位、组织或器官的方式施用，而是使其进入受试者的循环系统，从而经受代谢和其他类似过程。施用的合适模式包括注射、输注、滴注或摄取。注射包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，该途径是静脉内。
有效量是指预防或减轻医学病状(例如，B细胞恶性肿瘤)的至少一种或多种体征或症状所需的基因工程化T细胞群体的量，且涉及足以提供所希望的效果(例如，治疗患有医学病状的受试者)的基因工程化T细胞群体的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应理解，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可以使用常规实验来确定适当的有效量。
基因工程化T细胞群体的有效量可包含约1x107个抗CD19CAR+细胞至约1x109个抗CD19 CAR+细胞，例如约1x107个细胞至约1x109个细胞，所述细胞表达结合CD19的CAR(CAR+细胞)，例如CAR+CTX110细胞。在一些实施方案中，抗CD19 CAR+T细胞的有效量的范围可为约3x107至约1x108个CAR+T细胞，约3x107至约3x108个CAR+T细胞，约3x107至约4.5x108个CAR+T细胞，或约3x107至约6x108个CAR+T细胞。在其他实施方案中，抗CD19CAR+T细胞的有效量的范围可为约1x108至约3x108个CAR+T细胞，约1x108至约4.5x108个CAR+T细胞，或约1x108至约6x108个CAR+T细胞。在其他实施方案中，抗CD19CAR+T细胞的有效量的范围可为约3x108至约4.5x108个CAR+T细胞或约3x108至约6x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，抗CD19 CAR+T细胞的有效量的范围可为约4.5x108至约6x108个CAR+T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化T细胞群体有效量可包含一定剂量的基因工程化T细胞群体，例如包含约1x107个CTX110细胞至约1x109个CTX110细胞的剂量。在一些实施方案中，抗CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约3x107至约1x108个CAR+CTX110细胞，约3x107至约3x108个CAR+CTX110细胞，约3x107至约4.5x108个CAR+CTX110细胞，或约3x107至约6x108个CAR+CTX110细胞。在其他实施方案中，抗CD19 CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约1x108至约3x108个CAR+CTX110细胞，约1x108至约4.5x108个CAR+CTX110细胞，或约1x108至约6x108个CAR+CTX110细胞。在其他实施方案中，抗CD19 CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约3x108至约4.5x108个CAR+CTX110细胞或约3x108至约6x108个CAR+CTX110细胞。在一些实施方案中，抗CD19CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约4.5x108至约6x108个CAR+CTX110细胞。在一些实施方案中，抗CD19 CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约6.0x108至约7.5x108个CAR+CTX110细胞。在一些实施方案中，抗CD19 CAR+CTX110细胞的有效量的范围可为约7.5x108至约9.0x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约1x107个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约3x107个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约1x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约3x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约4.5x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约6x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，基因工程化T细胞群体的有效量可为约1x109个CAR+CTX110细胞。
在一些情况下，基因工程化T细胞群体的有效量可包含约3.0x108个(例如，3.5x108个)CAR+细胞至约9x108个细胞，所述细胞表达结合CD19的CAR(CAR+细胞)。在一些实施方案中，基因工程化T细胞群体的有效量可包含至少3.5x108个CAR+CTX110细胞、至少4x108个CAR+CTX110细胞、至少4.5x108个CAR+CTX110细胞、至少5x108个CAR+CTX110细胞、至少5.5x108个CAR+CTX110细胞、至少6x108个CAR+CTX110细胞、至少6.5x108个CAR+CTX110细胞、至少7x108个CAR+CTX110细胞、至少7.5x108个CAR+CTX110细胞、至少8x108个CAR+CTX110细胞、至少8.5x108个CAR+CTX110细胞或至少9x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约3.0x108至约9x108个CAR+T细胞，例如约3.5x108至约6x108个CAR+T细胞或约3.5x108至约4.5x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约4.5x108至约9x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约4.5x108至约6x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约6x108至约9x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约7.5x108至约9x108个CAR+T细胞。
在具体实例中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量可包含约3.5x108个CAR+T细胞。例如，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量可包含约4.5x108个CAR+T细胞。在其他实例中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量可包含约6x108个CAR+T细胞。在一些实例中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量可包含约7.5x108个CAR+T细胞。在还有其他实例中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量可包含约9x108个CAR+T细胞。
在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约3x108至约9x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约3x108至约7.5x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约3x108至约6x108个CAR+T细胞。在一些实施方案中，如本文公开的基因工程化T细胞群体(例如，CTX110细胞)的有效量的范围可为约3x108至约4.5x108个CAR+T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化T细胞群体的有效量可包含一定剂量的基因工程化T细胞群体，例加包含约3.5x108个CAR+CTX110细胞至约9x108个CAR+CTX110细胞的剂量，例如本文公开的任何剂量或剂量范围。在一些实例中，有效量为4.5x106个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，有效量为6x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，有效量为7.5x108个CAR+CTX110细胞。在一些实例中，有效量为9x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实例中，可给予患有DLBCL(例如，复发性和/或难治性)的患者合适剂量的CTX110细胞，例如约3x107至约6x108个CAR+CTX110细胞。此类DLBCL患者可以施用约3x107个CAR+CTX110细胞。可替代地，DLBCL患者可以施用约1x108个CAR+CTX110细胞。在另一个实例中，DLBCL患者可以施用约3x108个CAR+CTX110细胞。在另一个实例中，DLBCL患者可以施用约6x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实例中，可以给予患有转化滤泡性淋巴瘤(tFL；复发性和/或难治性)的患者合适剂量的CTX110细胞，例如约3x107至约6x108个CAR+CTX110细胞。此类tFL患者可以施用约3x107个CAR+CTX110细胞。可替代地，此类tFL患者可以施用约1x108个CAR+CTX110细胞。在另一个实例中，tFL患者可以施用约3x108个CAR+CTX110细胞。在再另一个实例中，tFL患者可以施用约6x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实例中，待在异源抗CD19 CAR-T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)中治疗的患者可患有III期疾病，其可按照Lugano 2014确定。可给予III期患者合适剂量的CTX110，例如范围约3x107至约6x108个CAR+CTX110细胞。此类III期患者可以施用约3x107个CAR+CTX110细胞。可替代地，此类III期患者可以施用约1x108个CAR+CTX110细胞。在另一个实例中，III期患者可以施用约3x108个CAR+CTX110细胞。在再另一个实例中，III期患者可以施用约6x108个CAR+CTX110细胞。
在一些实例中，待在异源抗CD19 CAR-T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)中治疗的患者可患有IV期疾病，其可按照Lugano 2014确定。可给予IV期患者合适剂量的CTX110，例如范围约3x107至约6x108个CAR+CTX110细胞。此类IV期患者可以施用约3x107个CAR+CTX110细胞。可替代地，此类IV期患者可以施用约1x108个CAR+CTX110细胞。在另一个实例中，IV期患者可以施用约3x108个CAR+CTX110细胞。在再另一个实例中，IV期患者可以施用约6x108个CAR+CTX110细胞。
本文所述的抗CD19 CAR T细胞疗法的功效可由熟练的临床医师确定。如果仅作为一个实例，CD19水平的任何一种或所有体征或症状以有益的方式改变(例如，降低至少10％)，或B细胞恶性肿瘤的其他临床上接受的症状或标志物得到改善或好转，则认为抗CD19CAR T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)是“有效的”。功效还可以通过如通过住院治疗或需要医疗干预所评估的受试者恶化的失败(例如，B细胞恶性肿瘤进展停止或至少减慢)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。治疗包括对人类患者中B细胞恶性肿瘤的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；和(3)预防或降低症状发展的可能性。
当需要时，可以给予接受一个剂量的抗CD19 CAR-T细胞的同一患者第二剂量(或在一些情况下，更多剂量，诸如总共至多3个剂量)的任何基因工程化抗CD19 CAR-T细胞诸如CTX110细胞。符合再次给药条件的患者可显示出进行性疾病(PD)并具有既往反应。后续剂量或附加剂量可与第一剂量相同。可替代地，第二剂量或附加剂量可与第一剂量不同，更高或更低。在一些实例中，第二剂量的范围可为约3.0x108至约9x108个CAR+T细胞，例如约4.5x108至约6x108个CAR+T细胞。在具体实例中，第二剂量可为约3x108个CAR+T细胞。
在一些实例中，第二剂量的抗CD19 CAR T细胞(例如，CTX110)可以在施用第一剂量的抗CD19 CAR T细胞后4周左右施用于人类患者。符合第二剂量条件的人类患者可在第一剂量后约4周达到疾病稳定(SD)或更好(例如，基于Lugano标准)。第二剂量可以伴随本文公开的LD化疗(例如，在第二剂量的抗CD19 CAR T细胞之前2-7天内)。对于接受与第一剂量的抗CD19 CAR T细胞联合的高剂量LD化疗(例如，每天静脉(IV)注射氟达拉滨30mg/m2+环磷酰胺750mg/m2，持续3天)的患者，后续LD化疗可以是低剂量，例如，每天静脉共同施用氟达拉滨30mg/m2+环磷酰胺500mg/m2，持续3天)。可替代地，第二剂量(或附加剂量)的抗CD19CAR T细胞可以不伴随LD化疗，例如对于表现出显著血细胞减少症的患者。
抗CD19 CAR T细胞每次给药后，可以监测人类患者的急性毒性，诸如肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全或其组合。
当人类患者表现出一种或多种急性毒性症状时，可以对人类患者进行毒性管理。对表现出一种或多种急性毒性症状的患者的治疗是本领域已知的。例如，表现出CRS症状(例如，心脏、呼吸和/或神经学异常)的人类患者可以施用抗细胞因子疗法。另外，不表现CRS症状的人类患者可以施用抗细胞因子疗法以促进抗CTX110 CAR T细胞的增殖。
可替代地或另外，当人类患者表现出一种或多种急性毒性症状时，可终止对人类患者的治疗。如果患者表现出不良事件(AE)的一种或多种体征，例如患者具有异常的实验室检查结果和/或患者显示出疾病进展的体征，则也可以终止患者治疗。
本文所述的同种异体抗CD19 CAR T细胞疗法(例如，涉及CTX110细胞)也可用于组合疗法中。例如，本文所述的抗CD19 CART细胞治疗可以与其他治疗剂共同使用，用于治疗B细胞恶性肿瘤，或用于增强基因工程化T细胞群体的功效和/或降低基因工程化T细胞群体的副作用。
(iv)示例性治疗方案
患有CD19+B细胞恶性肿瘤的人类患者可以使用抗CD19CAR-T细胞(例如，CTX110)通过本文公开的任何治疗方法治疗。图21中提供了示例性治疗方案。下面提供一些实例。
在一些实施方案中，可以鉴定患有NHL的人类患者进行本文公开的治疗。此类人类患者可患有NHL亚型，诸如非特指型(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤，转化滤泡性淋巴瘤(FL)或3b级FL。人类患者可以符合下面实施例7中提供的入选和排除标准。人类患者可接受LD化疗，其包括每日IV共同施用30mg/m2氟达拉滨和500mg/m2环磷酰胺，持续3天。在一些情况下，两种药剂可在同一天开始并连续3天施用且在CTX110输注之前至少48小时(但不超过7天)完成。抗CD19 CAR-T细胞(例如，CTX110)以至少3x107个CAR+T细胞的剂量经由静脉输注施用于人类患者。计划的第二剂量的抗CD19CAR-T细胞(例如，CTX110)可以在第一剂量后约4-8周(例如，在第28天，输注第一剂量的抗CD19 CAR-T细胞是在第1天)对人类患者进行，其可以与另外的LD化疗联合。第二剂量的时间段可从第28天开始(第1天是输注第一剂量当天)延长至20天，例如0-20天之间的任何时间段。在一些情况下，人类患者在第28天扫描时达到SD或更好(例如，基于Lugano标准)。第二剂量可以在没有LD化疗的情况下进行，例如，如果受试者正在经历显著的血细胞减少症。在一些情况下，如果受试者具有既往反应，则接受该疗程(第一疗程)的人类患者可在有或无LD化疗的情况下，在PD后接受再次剂量的抗CD19CAR T细胞(例如，CTX110)(第二疗程)。
在一些实施方案中，可以鉴定患有NHL的人类患者进行本文公开的治疗。此类人类患者可患有NHL亚型，诸如非特指型(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤，转化滤泡性淋巴瘤(FL)或3b级FL。人类患者可以符合下面实施例7中提供的入选和排除标准。人类患者可接受LD化疗，其包括每日IV共同施用30mg/m2氟达拉滨和750mg/m2环磷酰胺，持续3天。在一些情况下，两种药剂可在同一天开始并连续3天施用且在CTX110输注之前至少48小时(但不超过7天)完成。抗CD19 CAR-T细胞(例如，CTX110)以至少3x108个CAR+T细胞的剂量经由静脉输注施用于人类患者。可以在第一剂量的抗CD19 CAR T细胞后4-8周左右，例如在第28天，给予人类患者计划的第二剂量的CTX1 10，任选与LD化疗组合，所述LD化疗包括每日IV共同施用30mg/m2氟达拉滨和500mg/m2环磷酰胺，持续3天。第二剂量的时间段可以从第28天开始(第1天是输注第一剂量当天)延长至20天(例如，0-20天之间的任何时间段)。接受第二剂量的患者可以在第28天扫描时达到SD或更好(例如，基于Lugano标准)。在一些情况下，第二剂量在没有LD化疗的情况下施用，例如，如果受试者正在经历显著的血细胞减少症。在接受上述第一疗程后，如果受试者具有既往反应，患者在PD后也可以选择再次剂量的抗CD19 CAR T细胞诸如CTX1 10(第二疗程)。再次给药可以伴随LD化疗，其包括每日IV共同施用30mg/m2氟达拉滨和500mg/m2环磷酰胺，持续3天。
本文所述的第一疗程，包含抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110的两次输注，也命名为如本文所述的巩固剂量。在一些实施方案中，第一次输注和第二次输注可以间隔4-8周(例如，第1天第一次输注和第35天(-7天/+21天)第二次输注)。当适用时，第一次和/或第二次输注可以与本文公开的任何LD方案联合。接受第一疗程的任何患者可以进一步接受第二疗程，第二疗程可以包含单次剂量的抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110，如果适用，则伴随LD方案。第二疗程可在疾病进展时施用于患者，条件是患者在第一次输注后具有既往临床反应(如执业医师确定的)并符合本文提供的额外输注的标准。
抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110再次给药的选择对于人类患者是可用的，用于在PD和人类患者具有既往反应后，通过本文公开的任何方法进行治疗。对于NHL患者，可以在初始CTX110输注后至少2个月在PD后进行再次给药。
IV.用于B细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法的试剂盒
本公开还提供了在用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法中使用本文所述的抗CD19 CART细胞群体诸如CTX110细胞的试剂盒。此类试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含一种或多种淋巴细胞清除剂，所述第二药物组合物包含任何核酸或基因工程化T细胞群体(例如，本文所述的那些)和药学上可接受的载剂。包含如本文公开的基因工程化CAR-T细胞(诸如CTX110细胞)的试剂盒可以在护理中心储存和存货，允许在诊断后快速治疗人类患者。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于本文所述的任何方法中的说明书。所包括的说明书可以包含对第一和/或第二药物组合物向受试者施用以在人类患者中实现预期活性的描述。试剂盒可进一步包含基于鉴定人类患者是否需要治疗来选择适于治疗的人类患者的描述。在一些实施方案中，说明书包含向需要治疗的人类患者施用第一和第二药物组合物的描述。
与使用本文所述的抗CD19 CAR T细胞诸如CTX110 T细胞有关的说明书通常包括关于剂量、给药时间表和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指示基因工程化T细胞群体用于治疗、延迟受试者中T细胞或B细胞恶性肿瘤的发作和/或缓解受试者中的T细胞或B细胞恶性肿瘤。
本文提供的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装等等。还考虑了与特定装置诸如吸入器、鼻部施用装置或输注装置组合使用的包装。试剂盒可具有无菌接入孔(例如，容器可以是静脉溶液包或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌的进入口。药物组合物中的至少一种活性剂是如本文公开的抗CD19 CAR-T细胞群体，诸如CTX110T细胞。
试剂盒可以任选地提供另外组分，诸如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施方案中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分解释，诸如MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；MethodsinMolecularBiology，Humana Press；CellBiology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis编辑，1989)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Introuction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编辑，1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑，1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practice approach(D.Catty.编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)；DNA Cloning：ApracticalApproach，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1986；ImmobilizedCells and Enzymes(lRL Press，(1986；和B.Perbal，Apractical Guide To MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可以基于以上描述在其最大程度上利用本发明。因此以下特定实施方案将被解释为仅是说明性的，并且无论如何并非以任何方式限制本公开的其余内容。本文引用的所有出版物均通过引用并入用于本文提及的目的或主题。
实施例1：靶向CD19的同种异体CAR-T细胞的制备。
表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的同种异体T细胞从健康供体外周血单核细胞，如美国公开号US 2018-0325955中所述那样制备，所述公开通过引用并入本文。简言之，首先用靶向TRAC(AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(SEQ ID NO：26))和B2M(GCTACTCTCTCTTTCTGGCC(SEQ ID NO：27))的Cas9或Cas9：sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物对原代人T细胞进行电穿孔。通过用AAV6递送的DNA模板(SEQ ID NO：56)进行同源定向修复来修复TRAC基因座处的DNA双链断裂，所述模板包含位于嵌合抗原受体(CAR)盒侧翼的TRAC基因座的右同源臂和左同源臂。CAR包含源自对CD19具有特异性的鼠类抗体的单链可变片段(scFv)，CD8铰链区和跨膜结构域以及包含CD3z和CD28信号传导结构域的信号传导结构域。CAR的氨基酸序列和编码CAR的核苷酸序列分别在SEQ ID NO：40和39中示出。本实施例中使用的gRNA包含以下间隔区序列：TRAC gRNA间隔区(AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(SEQ ID NO：19))；和B2M gRNA间隔区(GCUACUCUCUCUUUCUGGCC(SEQ ID NO：21))。包含TRAC-/β2M-/抗CD19 CAR+T细胞的细胞群体在本文中称为“TC1细胞”或“CTX110细胞”。
用CRISPR/Cas9编辑技术，在来自健康供体的人类原代T细胞中实现TCRα基因(TRAC)的恒定区的高频敲除，其中TCR表面表达减少约98％，其目的是显著损害移植物抗宿主病(GVHD)。还可以获得β-2-微球蛋白(B2M)基因的高频敲除，其目的是增加在患者中的持久性，潜在地引起整体效力增加。在约80％的T细胞中获得了TRAC/B2M双重敲除频率，无需任何后续基于抗体的纯化或富集。通过使用AAV6递送的供体模板进行同源定向修复，连同B2M基因的敲除产生的从被破坏的TRAC基因座内表达CD19特异性CAR的人T细胞已经一致地以高效率产生。CAR的这种位点特异性整合防止CD3+CAR+细胞的潜在长出，进一步降低了GVHD的风险，同时也降低了与逆转录病毒或慢病毒递送机制相关的插入诱变的风险。这些工程化的同种异体CAR-T细胞显示出CD19依赖性T细胞细胞因子分泌和有效的CD19特异性癌细胞溶解。
同种异体抗CD19 CAR-T产物的产生(图1)表现出高效编辑(例如，大于50％TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+T细胞的效率)(图2)。
实施例2：确定CAR-T细胞在NOG小鼠皮下人伯基特淋巴瘤异种移植模型中的功效的剂量递增研究。
使用Translational Drug Development，LLC(Scottsdale，AZ)采用的方法评价靶向CD19的CAR-T细胞对NOG小鼠皮下人伯基特淋巴瘤异种移植模型的功效。简言之，研究开始前5-7天，将12只5-8周龄的雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠单独饲养在通风的微型隔离笼中，保持在无病原体的条件下。在第1天，小鼠接受皮下接种5x106个Raji细胞/小鼠。如表1所示，将小鼠进一步分成3个治疗组。在第8天(用Raji细胞接种后7天)，根据表1，治疗组2和治疗组3接受单次200μl静脉内剂量的TRAC-/B2M-/抗CD19CAR+细胞(TC1)。
表1.治疗组。
组 Raji细胞(s.c.) TC1治疗(i.v.) N
1 5x106个细胞/小鼠 无 4
2 5x106个细胞/小鼠 5x106个细胞/小鼠 4
3 5x106个细胞/小鼠 1x107个细胞/小鼠 4
测量肿瘤体积和体重，并且当肿瘤体积≥500mm3时，对个体小鼠实施安乐死。
到第18天，数据显示与未治疗的小鼠相比，肿瘤体积响应于TC1细胞在统计学上显著减少(图3)。对肿瘤体积的影响是剂量依赖性的(表2)；与接受较低剂量TCl细胞或未接受治疗的小鼠相比，接受较高剂量TCl细胞的小鼠显示肿瘤体积显著减小。在治疗组中也观察到生存期增加(表2)。
表2.肿瘤反应和生存期。
组 肿瘤体积(第18天) 肿瘤体积(第20天) 生存期(天) N
1 379.6±67.10 482±47.37 20-22 4
2 214.0±20.73 372.2±78.21 25 4
3 107.5±7.33* 157.1±10.62** 27(研究结束) 4
与对照(第1组)相比，p＝0.007
**与对照(第1组)相比，p＝0.0005
实施例3：评估靶向CD19的CAR-T细胞在NOG小鼠静脉内播散性模型中的功效。
为了进一步评估TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)的功效，利用小鼠播散性模型。
静脉内播散性Raji人伯基特淋巴瘤异种移植模型
在NOG小鼠中使用Raji人伯基特淋巴瘤细胞系的静脉内播散性模型(播散性模型)用于进一步证明TC1的功效。在播散性模型中使用Translations Drug Development，LLC(Scottsdale，AZ)采用的和本文所述的方法评价TC1的功效。简言之，研究开始前5-7天，将24只5-8周龄的雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtmlSug/JicTac)小鼠单独饲养在通风的微型隔离笼中，保持在无病原体的条件下。在研究开始时，将小鼠分为5个治疗组，如表3所示。在第1天，第2-5组的小鼠接受了0.5x106个Raji细胞/小鼠的静脉内注射。对小鼠进行静脉内接种以模拟播散性疾病。在第8天(注射Raji细胞后7天)，治疗组3-5接受了单次200μl静脉内剂量的TC1细胞(表3)。
表3.治疗组。
在研究过程中，每天监测小鼠，并且每周两次测量体重。一个重要的终点是围发病时间，并且还评估了T细胞植入的效果。记录了研究中每个组的动物死亡数的百分比和死亡时间。在达到濒死状态之前对小鼠实施安乐死。如果符合以下一项或多项标准，则可将小鼠定义为濒死并处死：
体重减轻20％或以上持续超过1周的时间；
肿瘤抑制正常生理功能(诸如进食、饮水、活动以及排尿和/或排便能力)；
长期过度腹泻导致体重减轻过度(＞20％)；或
持续喘息和呼吸窘迫。
如果出现通过临床观察定义的长期或过度的疼痛或窘迫，也认为动物濒死，诸如：虚脱、驼背姿势、麻痹/轻瘫、腹部饱胀、溃疡、脓肿、癫痫发作和/或出血。
与皮下异种移植模型(实施例2)相似，如图4所示，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中，播散性模型揭示统计学显著的生存优势，p＜0.0001。TC1治疗对播散性模型中生存的影响也是剂量依赖性的(表4)。
表4.动物生存期。
使用上述静脉内播散性模型进行第二个实验。
在第1天，第2-4组的小鼠接受静脉内注射0.5x106个细胞/小鼠。对小鼠进行静脉内接种以模拟播散性疾病。在第4天(注射Raji细胞后3天)，治疗组2-4按照表5接受了单次200μl静脉内剂量的TCl细胞。
表5.治疗组。
同样，如图5所示，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中，播散性模型揭示统计学显著的生存优势，p＝0.0016。TC1治疗对播散性模型中生存的影响也是剂量依赖性的(表6)。
表6.动物生存期。
脾脏对TC1治疗的反应评价
在Raji注射后2-3周从小鼠收集脾脏，并通过流式细胞术评价组织中TC1细胞的持久性和脾脏中Raji细胞的根除。
将脾脏转移到C管中3mL的1X DPBS CMF中，并使用MACS Octo解离器解离。将样品通过100微米筛转移到15mL锥形管中，离心(1700rpm，5分钟，带有制动器的ART)并重悬于1mL的1XDPBS CMF中用于使用Guava PCA计数。将骨髓离心并重悬于1mL的1X DPBS CMF中用于使用Guava PCA计数。将细胞以10x106个细胞/mL的浓度重悬于1X DPBS CMF中用于流式细胞术染色。
将样本(50μL)添加到1mL 1X Pharm Lyse中并在室温(RT)下孵育10-12分钟。将样品离心，然后用1X DPBS CMF洗涤一次。将样品重悬于50μL的1X DPBS中，并在室温下与人和小鼠TruStain一起孵育10-15分钟。将样品用1mL 1X DPBS CMF洗涤一次并重悬于50μL的1XDPBS CMF中用于染色。添加表面抗体并将细胞在黑暗中在室温下孵育15-20分钟，然后用1mL 1X DPBS CMF洗涤。然后将样品重悬于125μL的1X DPBS CMF中，在流式细胞仪上进行采集。将细胞用以下表面抗体组染色：
表7.抗体组。
基于前向与侧向散射，通过电子门控(PI＝总白细胞)测定细胞群体。使用来自Thermo Fisher的Ultra Comp珠粒在初始仪器设置时进行补偿以解决从一个通道到另一个通道的溢出。设置流式细胞仪以在每个管中收集10,000个CD45+事件。使用FACSCantollTM流式细胞仪进行流式细胞数据采集。使用BO FACSDivaTM软件(版本6.1.3或8.0.1)获取数据。流式细胞数据分析采用流式细胞图的形式，所述流式细胞图是为测量每种细胞类型的相对百分比而生存的图形表示。
该实施例证明，在TC1细胞治疗后，治疗上有益的TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞在脾脏中持续存在并从组织中选择性根除Raji细胞(图6A)。另外，用TC1细胞治疗未表现出Raji诱导的细胞质量增加(图6A)。此外，图7显示用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞治疗的小鼠脾脏中剩余的人细胞为CD8+。这些CD8+T细胞也是CD3阴性的，证明该模型中持久的T细胞保持TCR/CD3阴性并因此被编辑。
静脉内播散性Nalm-6人急性成淋巴细胞性白血病肿瘤
异种移植模型
在NOG小鼠中使用Nalm-6人急性成淋巴细胞性白血病肿瘤细胞系的静脉内播散性模型(播散性模型)用于进一步证明TC1的功效。在播散性模型中使用Translations DrugDevelopment，LLC(Scottsdale，AZ)采用的和本文所述的方法评价TC1的功效。简言之，研究开始前5-7天，将24只5-8周龄的雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠单独饲养在通风的微型隔离笼中，保持在无病原体的条件下。在研究开始时，将小鼠分为5个治疗组，如表8所示。在第1天，第2-4组的小鼠接受静脉内注射0.5x106个Nalm6细胞/小鼠。对小鼠进行静脉内接种以模拟播散性疾病。在第4天(注射Nalm6细胞后3天)，治疗组2-4按照表8接受了单次200μl静脉内剂量的TC1细胞。
表8.治疗组。
组 Nalm6细胞(i.v.) TC1治疗(i.v.) N
1 0.5x106个细胞/小鼠 无 6
2 0.5x106个细胞/小鼠 1x106个CAR+细胞/小鼠 6
3 0.5x106个细胞/小鼠 2x106个CAR+细胞/小鼠 6
4 0.5x106个细胞/小鼠 4x106个CAR+细胞/小鼠 6
在研究过程中，每天监测小鼠，并且每周两次测量体重(如上所述)。
与Raji静脉内播散性模型(上述)相似，如图8所示，在用TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+细胞(TC1)治疗的小鼠中，Nalm6模型也显示出统计学显著的生存优势，p＝0.0004。TC1治疗对Nalm6播散性模型中生存的影响也是剂量依赖性的(表9)。
表9.动物生存期。
实施例4：进一步评估靶向CD19的CAR-T细胞在NOG小鼠静脉内播散性模型中的功效。
本研究的目的是评价多剂量水平的抗CD19 CAR+T细胞对NOG小鼠中的Nalm6-Fluc-GFP急性成淋巴细胞性白血病肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。对小鼠进行静脉内接种以模拟播散性疾病。重要的终点是围发病时间。进行生物发光成像以监测播散性疾病的进展。
简言之，研究开始前5-7天，将6周龄的雌性CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)小鼠饲养在通风的微型隔离笼中，保持在无病原体的条件下。在第1天，小鼠接受静脉内接种5x104个Nalm6-Fluc-GFP(Nalm6-Fluc-Neo/eGFP--Puro；Imanis Life Sciences(Rochester，MN))细胞/小鼠。用Nalm6-Fluc-GFP细胞接种后三(3)天，将小鼠分成治疗组，并以包含TRAC-/B2M-/抗CD19 CAR+T细胞的T细胞群体进行给药，如表10所示。捕获并报告目标区域值(ROI)。从第4天(接种Nalm6-Fluc-GFP细胞后3天)开始到第67天每天两次测量体重并每周两次测量生物发光，从第74天开始到研究结束每周测量一次。为了测量生物发光，小鼠腹膜内注射200μl的D-荧光素150mg/kg。在研究开始时和根据需要在整个研究期间拍摄动力学图像以确定最佳的D-荧光素后剂量和对小鼠成像的曝光时间。使用具有1.2.0版软件的AMI 1000成像装置(Spectral Instruments Imaging Inc.；Tucson，AZ)，通过捕获发光信号，对小鼠进行成像。
表10.治疗组。
在围发病期对个体小鼠实施安乐死(临床体征表明高肿瘤负荷(例如，缺乏运动力、驼背、活动减退)或持续超过1周有20％或更大的体重减轻)。在达到濒死状态之前对小鼠实施安乐死。在第99天当最终小鼠作为长期存活者被实施安乐死时，研究结束。
图9显示接受不同剂量的TC1细胞的小鼠相对于未治疗的小鼠的生存期延长。图10显示在接受最高剂量的TC1细胞(12x106个细胞/小鼠)并且如图9所示产生最长生存期的小鼠中低至不可检测水平的生物发光。在第74天，在所有4只小鼠中检测到生物发光，指示治疗组中的肿瘤细胞扩增。
总的来说，这些结果显示单次注射TCl细胞可延长施用致死剂量的Nalm6 B-ALL细胞的小鼠的生存期。这种延长的生存期是剂量依赖性的，在低剂量、中剂量和高剂量的TC1细胞之间观察到分级生存反应。
实施例5：在施用靶向CD19的同种异体CAR T细胞的小鼠中移植物抗宿主病的分析。
进行小鼠研究以评价未编辑的人T细胞和TC1细胞引起移植物抗宿主病(GvHD)的潜力。在用200cGy全身辐照后，向NOG雌性小鼠施用单次静脉内缓慢推注未编辑的人T细胞或TC1细胞。在仅辐照(第1组)或辐照加单剂量施用PBMC(第2组)、电穿孔T细胞(第3组)或TC1细胞(第4组)后对动物进行长达119天的随访。在第1天辐照后大约6小时施用细胞。表11汇总了各组和研究设计。
表11.治疗组。
研究的终点是生存、GvHD症状出现的动力学和体重测量。
在治疗后的前30天期间，在第1组(12只动物中有3只)、第2组(6只动物中有6只)和第3组(6只动物中有2只)中观察死亡率(图11)。第4组(TC1细胞)中的所有动物存活到计划的尸检(图11)。第1组、第2组和第3组中的濒死动物经历体重减轻和/或与GvHD的发展相符的临床观察(轻度至重度冷触、轻度至中度恶病质、轻度至明显的驼背姿势、重度体重减轻、轻度至重度脱发、重度活动减退、中度呼吸困难和明显的呼吸急促)。第1组和第4组中的动物以及第3组中的非濒死动物在辐照后经历了轻度体重减轻，体重减轻在研究过程中得到改善(图12)。未记录到显要的临床观察。
本研究证明在所有动物(第2组)中，未编辑的人PBMC在经过辐照的NOG小鼠中诱导致命性GvHD，在细胞施用后2至3周发作。相反，接受TC1细胞的小鼠(第4组)在研究期间(119天)没有发展出GvHD，尽管施用于这些动物的细胞数量更高(3x107个TC1细胞/小鼠对比6x106个PBMC/小鼠)。辐照程序在所有组中都诱导瞬时体重减轻并且在没有接受未编辑的PBMC的所有组中恢复。
进行第二项研究以进一步评价未编辑的人T细胞和TC1细胞引起GvHD的潜力。具体地，NOD/SCID/IL2Rγ空(NSG)雌性小鼠在全身辐照(总辐照剂量为200cGy，160cGy/min；目标LDR0/140R)后施用单次静脉缓慢推注未编辑的人T细胞或TC1细胞。本研究的终点是生存、GvHD症状出现的动力学和体重测量。还对所有收集的组织进行了组织病理学检查。适当时，通过流式细胞术和免疫组织化学法(IHC)评估小鼠血液和组织中的暴露。
如表12所述，经由静脉内缓慢推注以单剂量形式施用细胞。
表12.研究设计。
a第1组动物未经辐照并且未以细胞给药(动物施用媒介物，即PBS 1X)。第2组动物经辐照但未以细胞给药(动物施用媒介物，即磷酸盐缓冲盐水[PBS])。
使用经确认的临床前软件系统(Provantis)根据体重将动物随机分成治疗组。由于本研究规模较大，给药和尸检活动在九天内交错进行。为了使偏倚最小化，对照组和TC1组(第4组和第5族)的动物给药并在同一天进行尸检。所有组在研究第85天进行尸检。
观察接受未编辑的人T细胞(第3组)的所有动物的死亡率，在第14天开始(图13)。接受未编辑的人T细胞的所有小鼠(第3组)被发现死亡或到第29天送去实施事先未计划的安乐死。这些动物的临床体征与GvHD的发展相符并且包括皮毛暗沉、轻度至重度活动降低、背部姿势驼背、轻度至中度瘦弱和呼吸频率增加。在接受未编辑的人T细胞的小鼠(第3组)中，在安乐死时观察到血液学参数的明显变化，包括红细胞、血红蛋白、血小板、白细胞和网织红细胞计数的减少。在第3组动物的肝脏、肺、肾脏、脾脏和胸腺中观察到最低至中度炎症。坏死通常伴随这些组织中的炎症。这些发现与GvHD的发展相符。另外，第3组大多数动物的股骨和胸骨骨髓中也存在轻度至重度细胞过少，这可能归因于全身辐照的影响。与所有其他组的12周相比，由于尸检日期早(辐照后2-4周)，这可能仅在该组中观察到。与GvHD的存在相符，第3组动物的免疫组织化学分析揭示在检查的所有组织(肾脏、肝脏、脾脏、肺、皮肤和消化道)中存在人CD45P+P细胞。其他组中的所有动物存活到计划的尸检。
此外，在第1、2、4或5组中没有观察到显著的体重减轻(图14)。在这些组中没有记录到与GvHD相符的显要临床观察，GvHD的特征在于观察到至少两种被认为可能表示GvHD的症状。在整个研究过程中，第4组和第5组的几只动物表现出诸如皮毛暗淡、轻度至中度活动减少和/或轻度瘦弱的症状。尽管这些症状通常与GvHD相关，但它们似乎不与TCl有关，因为它们很少被观察到，是瞬时的且持续时间短，并且在一些受辐照的对照动物(第2组)中也可见。
总的来说，这两项研究的结果证实TC1细胞不会诱导移植物抗宿主病。
实施例6：靶向CD19的同种异体CAR T细胞的开发批次的制备和表征。
用于临床研究目的的TC1细胞由经由标准白细胞除去法获得的健康供体外周血单核细胞制备。单核细胞富集T细胞并用抗CD3/CD28抗体包被的珠粒活化，然后用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物电穿孔并用含有CAR基因的重组腺相关病毒(AAV)载体转导。经修饰的T细胞在细胞培养物中扩增，纯化，配制成悬浮液，并冻存。
在修饰细胞之前，评价来自六名不同健康供体的T细胞的各种细胞表面标志物的表达。先前证实CD8+亚群内的CD27+CD45RO-T细胞在用抗CD19 CAR T细胞疗法治疗时与慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的完全反应相关(Fraietta等人，Nat Med，第24卷(5)：563-571，2018)。因此，通过流式细胞术评价六名不同供体的CD8+亚群内CD27+CD45O-T细胞的百分比。简言之，将1x106个细胞与Fab-生物素或IgG-生物素抗体一起孵育作为阴性对照。用染色缓冲液洗涤细胞并且将细胞与小鼠抗IgG一起孵育以捕获多余一抗。再次洗涤细胞并且将细胞与全组二抗(CD8，Biolegend：目录号300924；CD45RO，Biolegend：目录号304230；CD27，Biolegend：目录号560612)和活性染料一起孵育。用染色缓冲液洗涤细胞最后一次并且使细胞在流式细胞仪上运行以捕获各种染色群体。图15显示在其CD8+亚群内CD27+CD45RO-T细胞的水平。同种异体CAR-T制造允许选择具有有利特征的供体输入材料，诸如目标供体的CD8+级分中的高CD27+CD45RO-细胞。
更具体地，使用来自18至40岁男性供体的白细胞单采组分(leukopaks)分离CD4+和CD8+T细胞。分离、富集和活化CD4+和CD8+T细胞后，用包含Cas9核酸酶蛋白、TRAC sgRNA(SEQ ID NO：26)或B2M sgRNA(SEQ ID NO：27)的核糖核蛋白复合物对细胞进行电穿孔。在电穿孔之前将TRAC和B2M核糖核蛋白复合物合并。电穿孔后，将包含编码抗CD19 CAR(SEQID NO：40)的供体模板(SEQID NO：54)的新鲜解冻的rAAV添加到细胞中，并孵育细胞。然后在培养物中扩增细胞，每三至四天补充rhIL-2和rhIL-7。用TCR组(CD5、CD4、CD8、TCRaβ、B2M和CD45)测试建立用于监测的细胞的T细胞特性和基因编辑。在确认T细胞特性后，通过将细胞与生物素缀合的抗TCRαβ抗体和抗生物素珠粒一起孵育来进行TCRαβ清除。回收清除的细胞并配制用于施用。所得细胞群体具有少于0.5％的TCRαβ+细胞。图16显示纯化前后对TCRαβ+细胞的分析。
测试了TC1细胞的八个开发批次的T细胞特性。来自八个测试批次的平均结果显示84.58％的B2M敲除(即，15.42％B2M+细胞)和99.98％的细胞为TCR-(即，0.2％TCR+)，和约50％的抗CD19CAR敲入(图17)。
另外，在T细胞编辑前后评价供体中的衰竭和衰老标志物。具体地，从总T细胞群体确定PD1+、LAG3+、TIM3+和CD57+细胞的百分比。如上所述，使用以下二抗通过流式细胞术评估标志物的表达：小鼠抗PD1 PeCy7，Biolegend，目录号329918；小鼠抗TIM3BV421，Biolegend，目录号345008；小鼠抗CD57 PerCp Cy5.5，Biolegend，目录号359622；和小鼠抗LAG3 PE，Biolegend，目录号369306。图18显示在基因组编辑后在超过15％的总T细胞群体中衰竭或衰老标志物从未增加。
另外，在体外评价三个不同批次的TC1细胞的选择性杀伤。具体地，将TC1细胞与CD19阳性细胞系(K562-CD19；Raji；和Nalm6)或CD19阴性细胞系(K562)一起孵育。约24小时后使用基于流式细胞术的细胞毒性测定测量杀伤。具体地，用5μM efluor670(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)标记靶细胞，洗涤并与TC1或对照T细胞以不同比率(0.1∶1至4∶1的T细胞与靶细胞)共培养孵育过夜(50,000个靶细胞/孔；96孔U形底板[Coming，Tewksbury，MA])。第二天，将孔洗涤并将培养基更换为200μL含有5mg/mL 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的1：500稀释液的新鲜培养基，以对死亡/濒死细胞进行计数。最后，向每个孔中添加25μL的CountBright珠粒(ThermoFisher Scientific)，然后使用Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences，San Diego，California)通过流式细胞术对细胞进行分析。使用Flowjo软件(v10，Flowjo，Ashland，OR)分析流式细胞数据文件(fcs文件)。TCRαβ+T细胞(未编辑的细胞)用作对照。TC1细胞以比未编辑的T细胞更高的速率有效杀伤CD19阳性细胞，而CD19阴性细胞在TC1细胞的存在下显示出低水平的细胞溶解，该水平不超过与未编辑的T细胞共培养时的水平(图19)。
从三个独特供体产生的TC1细胞也用于评估在细胞因子和/或血清不存在时的生长。具体地，使TC1细胞在全T细胞培养基中生长14天。在第0天，使来自培养物的细胞在完全T细胞培养基(含有X-VIVO 15(Lonza，Basel，Switzerland)、5％人AB血清(ValleyBiomedical，Winchester，VA)、IL-2(Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)和IL-7(Cellgenix，Frieburg，Germany))(完全培养基)，含有血清但不含IL-2或IL-7细胞因子(5％血清，无细胞因子)，或不含血清或细胞因子(无血清，无细胞因子)的培养基中生长。在去除细胞因子和/或血清后长达35天，如上对细胞进行计数。在细胞因子和/或血清不存在时没有观察到TC1细胞长出(图20)。
对于施用，将TC1细胞重悬于冻存液(CryoStor CS-5)中，并在6mL输注小瓶中提供。总剂量容纳在一个或多个小瓶中。在解冻后20分钟内输注每个小瓶。
实施例7：在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中同种异体CRISPR-Cas9工程化T细胞(CTX110)的安全性和功效的I期、开放标记、多中心、剂量递增和队列扩展研究。
CTX110是一种CD19定向的嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法，其由使用CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)基因编辑组分(单引导RNA和Cas9核酸酶)离体基因修饰的同种异体T细胞构成。修饰包括靶向破坏T细胞受体(TCR)α恒定区(TRAC)和β-2微球蛋白(B2M)基因座，以及经由腺相关病毒表达盒将抗CD19 CAR转基因插入TRAC基因座中。抗CD19 CAR(SEQ ID NO：40)由包含SEQ ID NO：47的抗CD19单链可变片段、SEQ ID NO：32的CD8跨膜结构域、SEQ ID NO：36的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO：38的CD3ζ信号传导结构域构成。
CTX110细胞由经由标准白细胞除去法获得的健康供体外周血单核细胞制备。单核细胞富集T细胞并用抗CD3/CD28抗体包被的珠粒活化，然后用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物电穿孔并用含有CAR基因的重组腺相关病毒(AAV)载体转导。经修饰的T细胞在细胞培养物中扩增，纯化，配制成悬浮液，并冻存。CTX110可现场储存并在施用前立即解冻。
CTX110同种异体CAR-T疗法能够简化试验设计：筛选时间范围短，无单采血液成分法，无桥接化疗，以及CAR-T细胞产品的现场可用性。从患者入选到开始淋巴细胞清除的中位时间可为2天。
在本研究中，符合条件的人类患者在淋巴细胞清除(LD)化疗后接受静脉内(IV)输注CTX110。符合本文公开的标准的患者可以接受额外剂量(例如，总共至多三个剂量)的CTX110。本研究的当前结果显示CTX110实现了针对CD19+癌细胞的剂量依赖性抗肿瘤活性。结果还证明使用标准LD方案，CTX110细胞在体内的扩增和持久性持续至少6个月，具有持久反应(与结合其他基于细胞的疗法使用的毒性更大的LD方案完全不同)。
1.概述
11研究群体
剂量递增和队列扩展包括患有B细胞恶性肿瘤的成年受试者。基于疾病组织学将受试者分配到独立的剂量递增组。入选的成年受试者包括患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的选择亚型的成年受试者，所述亚型包括非特指型(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤(FL)、3b级FL或CLL的Richter转化。此外，入选的受试者包括患有复发性或难治性B细胞急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的成人。
1.2研究目的和基本原理
1期剂量递增研究的目的是评价抗CD19同种异体CRISPR-Cas9工程化T细胞(CTX110细胞)在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的安全性和功效。
复发性/难治性B细胞恶性肿瘤患者的结局在历史上较差。然而，在这种情况下使用自体CAR T细胞疗法已经产生了完全和持久的反应，其中先前的治疗选择是姑息性的(June等人，(2018)Science，359，1361-1365；Maus和June,(2016)Clin Cancer Res,22,1875-1884；Neelapu等人,(2017)N Engl J Med,377,2531-2544；Schuster等人,(2019)NEngl J Med,380,45-56；Schuster等人,(2017)N Engl J Med,377,2545-2554)。自体CAR T细胞疗法需要收集和制造患者特异性细胞。不幸的是，一些患者不是进行白细胞除去法的候选者，或者他们在等待治疗时经历疾病进展或死亡。同种异体的现用CAR T细胞产品诸如CTX110可提供即时可用性的益处，降低制造可变性，并防止个体受试者制造失败。
此外，用多轮化疗治疗的患者可能具有衰竭或衰老表型的T细胞。在用自体CAR T细胞疗法治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者中的低反应率部分归因于衰竭的T细胞表型(Fraietta等人,(2018)Nat Med,24,563-571；Riches等人,(2013)Blood,121,1612-1621)。通过从来自健康供体的未经化疗的T细胞开始，与自体产品相比，同种异体方法可以增加CAR T疗法的一致性和效力。
使用同种异体CAR T细胞的主要障碍是移植物抗宿主病(GvHD)的风险。CRISPRCas9基因编辑技术允许可靠的多重细胞编辑。CTX110制造方法通过同源重组将CAR构建体的引入与TRAC基因座的破坏结合。使用AAV递送的DNA供体模板和HDR在TRAC基因组基因座处递送和精确插入CAR与使用慢病毒和逆转录病毒转导方法随机插入遗传物质形成对比。在TRAC基因座处插入CAR基因导致在几乎所有表达CAR的细胞中消除TCR，从而将GvHD的风险最小化。此外，由健康供体细胞制造去除了无意中转导恶性B细胞的风险(Ruella等人,(2018)Nat Med,24,1499-1503)。在患有复发性/难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的这项首次人体试验旨在评价用这种CRISPR-Cas9修饰的同种异体CAR T细胞方法的CTX110的安全性以及功效。
CTX110，一种CD19定向的基因修饰同种异体T细胞免疫疗法，由健康供体的细胞制备；因此，最终制造的细胞旨在为每个受试者提供一致、质量可靠的最终产品。此外，通过使用AAV和同源定向修复(HDR)在TRAC位点精确递送和插入CAR来制造CTX110不存在与慢病毒和逆转录病毒载体的随机插入相关的风险。
2.研究目标
主要目标，A部分(剂量递增)：评估在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中递增剂量的CTX110与各种淋巴细胞清除剂组合的安全性，以确定推荐的B部分剂量。
主要目标，B部分(队列扩展)：评估CTX110在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的功效，如通过客观反应率(ORR)所测量。
次要目标(剂量递增和队列扩展)：进一步表征CTX110的功效、安全性和药代动力学。
评价与CTX110相关的患者报告结局(PRO)随时间的变化。
探索性目标(剂量递增和队列扩展)：鉴定与CTX110相关的基因组、代谢和/或蛋白质组生物标志物，其可指示或预测临床反应、抗性、安全性或药效学活性。
3.研究资格
31入选标准
为被视为符合参与本研究的条件，除非另有说明，否则受试者必须符合下文列出的适用于所有队列的所有入选标准。
1.年龄≥18岁
2.能够理解并遵守方案要求的研究程序，并自愿签署书面知情同意书文件
3.诊断为患有以下B细胞恶性肿瘤中的1种：
组织学确认的B细胞NHL：DLBCL NOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化FL或3b级FL
·来自当地病理学实验室的肿瘤组织学确认(来自最后一次复发/进展的存档组织[入选后3个月内]或筛选期间的活检)
·至少1个可测量病变，是氟脱氧葡萄糖(FDG)正电子发射断层扫描(PET)阳性的，如Lugano标准所定义(在Lugano标准5分量表上Deauville评分为4或5；表14)。注：只有在放射疗法完成后记录到进展时，先前经过辐照的病变才会被视为可测量的。
4.难治性或复发性疾病，如通过以下队列特异性标准证明的：
2个或更多个线数的既往疗法，包括抗CD20单克隆抗体和含蒽环类药物的方案，且既往自体HSCT失败或不符合既往自体HSCT条件或拒绝既往自体HSCT。已经接受过自体HSCT的受试者必须从HSCT相关毒性中恢复。
·对于难治性疾病，受试者在最后一次治疗时必须患有PD，或在至少2个治疗周期后患有疾病稳定(MacMillan等人，2010)，SD持续时间长达6个月。
·对于患有转化FL的受试者，在转化为DLBCL后，受试者必须接受过至少1个线数的针对疾病的化疗。
5.美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态0或1(表28)
6.符合经历LD化疗和CAR T细胞输注的标准
7.充分的器官功能：
·肾：估算肾小球滤过率＞50mL/min/1.73m2
·肝脏：天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)＜3×正常上限(ULN)；总胆红素＜1.5×ULN(对于患有吉尔伯特综合征的受试者，总胆红素＜2mg/dL)
·心脏：血流动力学稳定且超声心动图显示左心室射血分数≥45％
·肺部：根据脉搏血氧测定，在室内空气下的氧饱和度水平＞91％
8.具有生育潜力的女性受试者(月经初潮后具有完整子宫和至少1个卵巢，绝经后小于1年)必须同意从入选到CTX110输注后至少12个月使用可接受的避孕方法。
9.男性受试者必须同意从入选到CTX1 10输注后至少12个月使用有效的可接受的避孕方法。
10.将在NHL队列扩展(B部分)中入选最多20名患有难治性NHL疾病且有大体积表现的受试者(高危受试者)。具有大体积表现的难治性NHL疾病定义为：
·如通过局部和/或中心分析评估，最大直径≥7.5cm和/或直径乘积总和(SPD)≥5000mm2的单一病变(LD化疗前)
和/或
·入选后6个月内没有对任何化疗方案的反应史(PR或更好)和/或诊断出大B细胞淋巴瘤
Lugano分类提供了评估在淋巴瘤受试者中成像的标准化方式。它由诊断性CT上肿瘤负荷的放射学评估和F18 FDG-PET上对于FDG亲和性(FDG-avid)组织学的代谢评估组成(参见表13和14)。
表13.Lugano分类评估组成部分。
CT：计算机断层扫描；F18FDG：氟脱氧葡萄糖F18；LDi：最长直径；
MRI：磁共振成像；PET：正电子发射断层扫描。
*参见(Barrington等人，2014，J Clin Oncol，32，3048-3058)。
表14.用于反应评估的Lugano标准。
在每个随访时间点，根据以下定义产生基于PET的反应和基于CT的反应。
/>
FDG：氟脱氧葡萄糖；IHC：免疫组织化学；LDi：最长直径；N/A：不适用；PPD：垂直直径；SDi：最短直径；SPD：直径乘积总和。
*Deauville评分为3表示完全代谢反应(Barrington等人，2014；J Clin Oncol，32，3048-3058)。
注：公认的是，在脾脏或骨髓内具有高生理摄取或具有活化(例如，用化疗或髓系集落刺激因子)的Waldeyer环或结外部位中，摄取可能大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果初始累及部位的摄取不大于周围正常组织，即使该组织具有高生理摄取，也可推断有完全代谢反应。
3.2排除标准
为了符合进入研究的条件，除非另有说明，否则受试者不得符合下文列出的适用于所有队列的任何排除标准。
1.符合条件并同意自体HSCT
2.用如下所述的以下疗法进行治疗：
·用任何基因疗法或基因修饰的细胞疗法(包括CAR T细胞)的既往治疗
·用CD19定向抗体、双特异性T细胞接合物或抗体-药物缀合物的既往治疗，除非在最近的CD19定向治疗后的进展或复发后确认CD19表达(通过免疫组织化学或流式细胞术)。
3.既往同种异体HSCT。
4.诊断出伯基特淋巴瘤/白血病
5.已知对环磷酰胺、氟达拉滨或CTX110产品的任何赋形剂有禁忌症
6.来自脑脊液(CSF)的可检测的恶性细胞或磁共振成像(MRI)指示筛选期间有脑部转移，或恶性肿瘤(CSF或成像)的中枢神经系统(CNS)累及史。
7.癫痫发作、严重脑血管缺血/出血、痴呆、小脑疾病或任何有CNS累及的自身免疫疾病病史
8.入选后6个月内有不稳定型心绞痛，有临床意义的心律失常或心肌梗死，或入选时有3级或以上的心包积液
9.与医学监查员会诊存在不受控制的活性细菌、病毒或真菌感染
10.对于1型或2型人免疫缺陷病毒(HIV)或活动性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染阳性的存在为阳性。容许有HBV或HBC既往感染史，已经记录了不可检测的病毒载量(通过定量PCR或核酸测试)的受试者。对于受试者资格而言，可以考虑入选后45天内进行的感染性疾病测试(HIV-1、HIV-2、HCV抗体和PCR、HBV表面抗原、HBV表面抗体、HBV核心抗体)
11.先前或并发的恶性肿瘤，除充分切除的基底细胞或鳞状细胞皮肤癌以及原位宫颈癌，或完全切除并且入选≥5年已缓解的先前恶性肿瘤以外。
12.入选后14天内放射治疗
13.在入选后14天或5个半衰期(以较长者为准)内使用全身抗肿瘤疗法或研究药剂。例外：1)在入选3个半衰期内禁止既往抑制性/刺激性免疫检查点分子疗法；以及2)入选前30天内禁止使用利妥昔单抗(但PET/CT需要在最后一剂利妥昔单抗后至少2周进行)。例外：1)免疫治疗剂(即，利妥昔单抗、伊妥珠单抗)必须在入选后14天内停止；2)长效化疗剂(例如，聚乙二醇化门冬酰胺酶、甲氨蝶呤＞25mg/m2)必须在入选后14天内停止；以及3)研究药剂必须在入选前经过5个半衰期后停止。受试者必须在入选前从所有先前治疗的急性毒性中(血液学除外)恢复至1级不良事件通用术语标准(CTCAE；国家癌症研究所，5.0版)。容许使用类固醇直至开始LD化疗前2天用于维持或允许控制外周血母细胞。
14.需要类固醇和/或其他免疫抑制疗法的原发性免疫缺陷病症或活动性自身免疫疾病。
15.诊断为严重精神障碍或其他可能妨碍受试者参与研究的能力的医学状况
16.妊娠或哺乳期妇女
17.预期寿命小于6周
18.仅B队列，排除中性白细胞减少症4级、血小板减少症4级或贫血4级(CTCAE)的受试者
4.研究设计
4.1研究计划
这是一项评价CTX1 10在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的安全性和有效性的开放性、多中心、1期研究。研究分为2个部分：剂量递增(A部分)，接着是队列扩展(B部分)。
对每个队列单独进行剂量递增(A部分)，并根据下文概述的标准进行。在A部分中，在具有以下NHL亚型中的1种的成年受试者的A队列中剂量递增正在进行：DLBCL NOS，具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、3b级FL或转化FL(表15)。在研究的剂量递增部分(队列B)中，已经包括了具有类似于队列A的NHL群体的一个附加队列以探索不同的治疗和淋巴细胞清除方案(表15)。
队列B中的受试者将用相对于队列A(500mg/m2)增加的环磷酰胺剂量(750mg/m2)治疗，以探索在CTX110输注后淋巴细胞的更长抑制作用对CAR T细胞扩增的影响。
总之，对于NHL受试者入选的所有队列，可以在第一次CTX110输注后第28天向第28天扫描时实现SD或更好的受试者施用附加剂量的CTX110与LD化疗(表15)。对于所有队列，如果受试者正经历显著的血细胞减少症，如本文所述，则可以在没有LD化疗的情况下施用第28天剂量的CTX1 10。已经接受既往CD19定向疗法诸如贝林妥欧单抗(blinatumomab)的受试者可能受到限制。
剂量递增队列(A部分)汇总在下表15中：
表15：淋巴细胞清除方案和CTX110给药(A部分剂量队列)
/>
ALL：急性成淋巴细胞性白血病；CR：完全反应；DL：剂量水平；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；FL：滤泡性淋巴瘤；IV：静脉内；LD：淋巴细胞清除；NOS：非特指型；PD：进行性疾病；PR：部分反应；SD：疾病稳定。
受试者在开始LD化疗和输注CTX110之前(所有队列)应符合方案中规定的标准，并且在接受任何额外剂量的CTX110之前应符合针对再次给药规定的标准。LD化疗的标准应确认为适用。
1.主要群体(N1)：包括符合以下两个标准的受试者：
·如通过局部和/或中心分析评估，靶病变直径乘积总和(SPD)＜50cm2(LD化疗前)
·入选前NHL＞7个月的受试者开始一线抗癌疗法
2.大体积难治性群体(N2)：包括符合以下任一项标准的受试者：
·如通过局部和/或中心分析评估，靶病变SPD≥50cm2(LD化疗前)
·入选前≤7个月患有NHL的受试者开始一线抗癌疗法。
4.1.1研究设计
在A部分和B部分期间，研究由3个主要阶段：筛选、治疗和随访。研究的剂量递增部分将涉及2个队列的受试者：队列A和队列B。队列A和队列B包括患有NHL的受试者，NHL包括DLBCL NOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化FL和3b级FL。
研究的3个主要阶段如下：
第1阶段-筛选以确定治疗资格(1-2周)
第2阶段-治疗(阶段2A+阶段2B)。参见上表15的队列治疗(1-2周)
第3阶段-所有队列随访(最后一次CTX110输注后5年)注：在开始LD化疗(所有队列)和输注CTX110(所有队列)之前，应根据标准再次确认受试者的临床资格。
有关再次给药的其他标准，参见下文。
对于剂量递增和队列扩展，受试者在每次CTX110输注后28天必须保持在研究中心附近(即，1小时转运时间)。在该急性毒性监测期间，常规评估受试者的AE，包括CRS、神经毒性和GvHD。下文提供了毒性管理指导原则。在剂量递增期间，所有受试者在每次CTX110输注后前7天住院，或如果当地法规或研究中心(site)实践要求则住院更长时间。
在急性毒性监测期后，受试者随后在最后一次CTX1 10输注后接受长达5年的身体检查、定期实验室和成像评估以及AE评价随访。
4.2 CTX110剂量递增
在部分A中，可以在本研究中基于CAR+T细胞的数量，评价CTX110的以下剂量(表16)。
表16.CTX110剂量递增
CAR：嵌合抗原受体
DL3.5是任选的降级剂量水平。
使用标准的3+3设计进行剂量递增。基于CAR+T细胞的总数，上表16中呈现的CTX110的剂量可以在本研究中进行评价，对于队列A而言从DL1开始。对于队列A，评价来自DL3的数据以确定剂量递增是否继续DL4。
后续队列B的入选可仅在队列A的安全性评估和确认之后开始，接着以较高剂量水平进行剂量递增。所有剂量水平的剂量限值均为7×104个TCR+细胞/kg，这决定了给药的最小体重
DLT评价期从第一次CTX110输注开始并持续28天。
4.2.1.剂量限制性毒性(DL T)定义
根据国家癌症研究所CTCAE第5版对毒性进行分级并记录，除了以下提供的CRS和神经毒性(Lee等人，2019)和GvHD(Harris等人，2016)外。
DLT定义为在持续超过指定持续时间(相对于发作时间)的DLT评价期间发生的以下任何事件：
·类固醇难治性的≥2级GvHD(例如，类固醇治疗[例如，1mg/kg/天]3天后PD，治疗7天后SD或治疗14天后PR)
·DLT期间死亡(由于疾病进展除外)
·可能有关或与CTX110有关的任何持续时间的4级神经毒性
·临床上显著并且在72小时内未改善的任何CTX110有关的3级或4级毒性
·以下将不被视为DLT：
○72小时内改善至≤2级的3级或4级CRS
○14天内改善至≤2级的3级神经毒性(例如，脑病、精神混乱)
○3级或4级发热
○在血小板减少情况下的出血(血小板计数＜50×109/L)；中性白细胞减少症情况下记录的细菌感染或发热(绝对中性粒细胞计数[ANC]＜1000/mm3)
○低丙球蛋白血症
○7天内消退至≤2级的3级或4级肺毒性。对于因支持性护理导致液体超负荷而插管的受试者，这可以延长至14天。
○14天内改善至≤2级的3级或4级肝功能研究
○21天内改善至≤2级的3级或4级肾功能不全
○将对3级或4级血小板减少症或中性粒细胞减少症进行回顾性评估。在对至少6名受试者进行输注后，如果≥50％的受试者具有长时间的血细胞减少症(即，输注后持续超过28天)，则可暂停剂量递增。
受试者必须接受CTX110以评价DLT。如果受试者具有潜在的DLT，其方案定义留出时间改善或消退，则在宣布DLT之前相应地延长DLT评价期。在做剂量递增决策时，考虑DLT评价期外发生的被评估为与CTX110有关的AE。与CTX110没有合理因果关系的AE不被视为DLT。
4.3CTX110再次给药(A部分+B部分)
以CTX110给药的受试者已经实现了客观反应，而在外周血中没有多对数CAR T细胞扩增，表明生物学和细胞行为与自体CAR T细胞不同。由于在淋巴细胞恢复时同种异体CAR T细胞可能比自体CAR T细胞易于更快清除，因此可能需要施用多于单个剂量以清除任何剩余的癌细胞。为了实现更大的反应和长期耐久性，提出在第一次输注后没有经历显著毒性的受试者中再次给药。
还基于迄今为止用CTX110证明的安全性提出了再次给药，其包括以5种不同剂量水平(DL1、DL2、DL3、DL3.5和DL4)治疗的16名受试者。CTX110引起的毒性的严重程度和频率等于或低于在NHL中用自体CD19定向CAR T细胞疗法观察到的严重程度和频率。尚无输注反应或GvHD。
4.3.1CTX110的计划给药
本研究允许多达三个剂量的CTX110。
在以下2种情形下可进行再次给药：
1.根据时间安排或疾病反应标准，在有或无LD化疗的情况下计划再次给药。下表17。
2.如果受试者在第一次CTX110输注后已经具有初始反应，则在PD后用随LD化疗一起进行CTX110再次给药(所有队列)。下表17。
表17.计划的CTX110再次给药(巩固剂量)
/>
为了以CTX110再次给药，受试者必须符合再次给药标准并重复本文指定的一些筛选评估。
4.3.2.队列A和队列B中计划的再次给药
对于队列A和队列B中计划的第二剂量，受试者必须符合以下标准：
·剂量递增期间无既往DLT(如果适用)
·CTX110输注后72小时内无既往≥3级CRS，未消退至≤2级
·初始CTX110输注后无既往GvHD
·CTX110输注后没有未消退的既往≥2级ICANS
对于队列A中的受试者，在LD化疗时和第二次CTX110输注之前，附加的再次给药标准如下：
·ECOG体能状态0或1
·不需要补充氧气以维持饱和度水平＞91％
·没有新发的不受控制的心律失常
·没有需要血管加压药支持或液体推注的低血压
·没有不受控制的活动性感染(细菌、真菌或病毒的阳性血液培养物对治疗无反应)
·肾：估算肾小球滤过率＞50mL/min/1.73m2
·肝脏：AST或ALT＜3×ULN；总胆红素＜1.5×ULN(对于患有吉尔伯特综合征的受试者，总胆红素＜2mg/dL)
·与既往CTX110输注相比，没有使受试者处于增加的毒性风险中的临床状态恶化。
·没有新发神经症状提示CNS疾病累及。在LP或脑部MRI上有正常发现的情况下和神经症状消退后，可以考虑再次给药。
·妊娠或哺乳期妇女不符合再次给药的条件。
应按照评估计划(下表26-27)对再次给药的受试者进行随访，与初始给药一致，有以下考虑因素：
·不需要超声心动图(除非出现新发心脏体征或症状)、脑部MRI和腰椎穿刺(除非出现与进展有关的新发神经症状)。
·只要可能，应获得组织活检以证明CD19表达。然而，如果在第二计划剂量之前不可能，如果没有观察到对CTX110的第二计划剂量的反应，则应进行肿瘤活检。
·必须在第二计划剂量的4周内进行PET/CT。
在初始骨髓累及的受试者中，必须在第二计划剂量的4周内重复骨髓活检和抽吸。
队列A和队列B中在第28天实现SD或更好的受试者可在第一次CTX110输注后4至8周接受第二次计划的CTX110输注(第28天剂量)。在患有血细胞减少症(ANC＜1000/mm3和/或血小板＜25,000x109/L)的受试者中，可以选择在没有LD化疗的情况下再次给药。以LD化疗再次给药的受试者有待持续评价长期的血细胞减少症。
在队列扩展中在没有LD化疗的情况下接受第二计划剂量的受试者中，如果对8名受试者进行给药且全部患有进行性疾病或在最后一个剂量后28天基于成像观察到反应没有改善，则可以去除在没有LD化疗的情况下再次给药的选择，并且后续受试者将不会在没有LD化疗的情况下接受额外剂量的CTX110。
4.3.3.所有队列在进行性疾病后再次给药
对于所有队列，如果受试者在第一次输注后具有既往临床反应，则受试者可以在PD后以CTX110再次给药。为了考虑进行再次给药，受试者必须已经取得临床益处的证据，如对于患有NHL并且在初始或最后一次CTX110输注的12个月内同时或随后进展或复发的受试者而言，在CTX110输注后在PET/CT扫描时肿瘤大小和/或FDG亲和力的降低所证明的。
只有在疾病程度低于初始CTX110输注时才进行再次给药，并在与医学监查员会诊后继续。对于NHL队列，在PD后可以向受试者再次给药的最早时间是在初始CTX110输注后≥2个月。不容许在最后一次CTX110输注后＞2个月患有3级或4级中性粒细胞减少症或血小板减少症的受试者中再次给药，除非血细胞减少症可清楚地归因于进行性疾病或其他可逆原因。
为了以CTX110再次给药，受试者必须符合以下标准：
·确认肿瘤(NHL)在复发时保持为CD19+(通过流式细胞术或免疫组织化学)。
·剂量递增期间无既往DLT(如果适用)
·CTX110输注后72小时内无既往≥3级CRS，未消退至≤2级
·CTX110输注后无既往GvHD
·CTX110输注后没有既往≥2级ICANS
·符合初始研究入选标准(#1、#2、#5-10)和排除标准(#2[用CTX110既往治疗除外]-15)，如上文所述
·符合LD化疗和CTX110输注的标准，如本文所述。
·PD后再次给药的受试者应按照表26(评估计划[筛选至M24])进行随访，与初始给药一致。
必须重复所有第1阶段的筛选评估，包括以下附加考虑因素：
·如果在再次给药时存在基于国际预后指数[IPI]标准(Schmitz等人，2016)的高CNS复发风险或存在CNS累及体征，则有待重复脑部MRI和腰椎穿刺。
·超声心动图：如果在CTX110给药的3个月内发生再次给药并且如果没有出现新发心脏症状，则可以省略。
·对于NHL队列：证明疾病复发或进展的PET/CT扫描可用作肿瘤反应评价的新基线。必须在该扫描后28天内进行再次给药。如果在复发/进展时未进行，则必须重复骨髓抽吸和活检。
PD后经历再次给药的受试者可以接受与先前接受的相同的淋巴细胞清除方案和CTX110剂量。队列B中可以接受类似于队列A的淋巴细胞清除的受试者除外。
在疾病进展前经历再次给药的受试者中，将使用筛选期间进行的基线PET/CT和骨髓活检继续疾病反应评估。对于PD后再次给药的受试者，相对于最近的PET/CT扫描和再次给药前的骨髓评估疾病反应。
5.研究治疗
5.1淋巴细胞清除化疗
所有队列中的所有受试者在输注第一剂量的CTX1 10之前和再次给药之前接受LD化疗，如本文所述。
对于队列A，LD化疗可由以下组成：
·氟达拉滨30mg/m2 IV，每日一次，3剂和
·环磷酰胺500mg/m2 IV，每日一次，3剂。
对于队列B，LD化疗可由以下组成：
·氟达拉滨30mg/m2 IV，每日一次，3剂和
·环磷酰胺750mg/m2 IV，每日一次，3剂。
两种药剂在同一天开始并连续施用3天。受试者应在研究入选的7天内开始LD化疗。肾功能中度受损(肌酐清除率30-70mL/min/1.73m2)的成年受试者应根据适用的处方信息接受降低剂量的氟达拉滨。
关于LD化疗相关的储存、制备、施用、支持性护理说明和毒性管理的指南，请参考氟达拉滨和环磷酰胺的当前完整处方信息。
对于所有队列中的受试者，如果存在以下任何体征或症状，则可延迟LD化疗：
·增加LD化疗相关AE的潜在风险的临床状态显著恶化
·需要补充氧气以维持饱和度水平＞91％
·新发的不受控制的心律失常
·低血压需要血管加压药支持
·活动性感染：细菌、真菌或病毒的阳性血液培养物对治疗无反应
·≥2级急性神经毒性
本文规定了再次给药前队列A进行LD化疗需要符合的其他标准。对于毒性由基础疾病驱动并需要抗癌疗法的受试者，在重新开始LD化疗之前，他们随后必须符合疾病入选标准、治疗洗脱和终末器官功能标准。另外，入选后接受抗癌疗法的任何受试者(除了队列A和队列B的LD化疗以外)必须在开始LD化疗前进行疾病评价(包括PET/CT扫描)。
5.2.CTX110的施用
CTX110由用CRISPR-Cas9修饰，重悬于冻存液(CryoStor CS-5)中并于6mL输注瓶中提供的同种异体T细胞组成。以单次IV输注的形式施用平剂量的CTX110(基于CAR+T细胞)。对所有剂量水平施加7×104个TCR+细胞/kg的剂量限值。总剂量可以容纳在1个或多个小瓶中。输注应优选通过中心静脉导管进行。不得使用白细胞过滤器。
在CTX110输注开始之前，研究中心药房必须确保治疗的每个特定受试者有2个剂量的托珠单抗(tocilizumab)和应急设备可用。受试者应在CTX110输注前大约30至60分钟按照研究中心实践标准用醋氨酚PO(即，对乙酰氨基酚或其等效物，按照研究中心处方集)和盐酸苯海拉明IV或PO(或另一种H1-抗组胺药，按照研究中心处方集)进行术前用药。不应施用预防性全身性皮质类固醇，因为它们可能干扰CTX110的活性。
CTX110输注前必须中断的药物列表，见下文。
对于所有队列，如果存在以下任何体征或症状，则可延迟每次CTX110输注：
·新发不受控制的活动性感染
·与LD化疗开始之前相比临床状态恶化，使受试者处于增加的毒性风险中
·≥2级急性神经毒性
队列A的每次CTX110输注在LD化疗完成后至少48小时(但不超过7天)施用。如果CTX110输注延迟10天以上，则必须重复LD化疗。对于再次给药，参见本文的公开内容。
5.2.1.CTX110输注后监测
在CTX110输注后，应每30分钟监测受试者的生命体征，在输注后持续2小时或直至任何潜在临床症状消退。A部分中的受试者可在CTX110输注后住院至少7天，或如果当地法规或研究中心实践需要可住院更长时间。在A部分和B部分中，受试者必须在CTX110输注后至少28天保持在研究中心附近(即，1小时转运时间)。
根据评估计划(表26和表27)监测受试者的CRS体征、肿瘤溶解综合征(TLS)、神经毒性、GvHD和其他AE。本文描述了管理CAR T细胞相关毒性的指导原则。受试者应保持住院直至CTX110相关的非血液学毒性(例如，发热低、血压、缺氧、持续神经毒性)恢复至1级。如果认为必要，受试者可保持住院更长时间。
5.2.1.2 CTX110后续输注的施用计划
本研究允许在队列A和队列B中最多输注3次CTX110。第1天后的额外CTX110输注可发生在以下2种情形中：
1.在第一个疗程中，额外输注基于如下的时间或疾病反应标准：第35天(-7天/+21天)向在第28天扫描时实现SD或更好(基于Lugano标准)的受试者，随LD化疗一起施用CTX110的第二次输注。注：对于队列B的LD化疗，环磷酰胺剂量在第一次CTX110输注前为750mg/m2，并且在后续CTX110输注前为500mg/m2。
2.对于所有队列，如果受试者在初始CTX110输注后已展示出临床益处，则在PD后可施用由单次CTX110输注与LD化疗组成的第二疗程。PD后的额外输注必须在初始CTX110输注的18个月内且距离既往CTX110输注≥4周。
为了在第1天后接受额外的CTX110输注，受试者必须符合本实施例中规定的标准并重复一些筛选评估。
5.2.1.3第一疗程内第8天和第35天CTX110输注的标准
对于队列A和队列B中CTX110的第二次输注(第35天)，受试者必须符合以下标准：
·剂量递增期间无既往DLT(如果适用)
·CTC110输注后72小时内无既往≥3级CRS，未消退至≤2级
·初始CTX110输注后无既往GvHD
·CTX110输注后没有未消退的既往≥2级ICANS。
另外，在LD化疗时且在额外输注前(对于队列A和队列B中的受试者的第二次CTX110输注[第35天]，受试者必须符合以下标准：
·ECOG体能状态0或1
·不需要补充氧气以维持饱和度水平＞91％
·没有新发的不受控制的心律失常
·没有需要血管加压药支持或液体推注的低血压
·没有不受控制的活动性感染(细菌、真菌或病毒的阳性血液培养物对治疗无反应)
·肾：估算肾小球滤过率＞50mL/min/1.73m2
·肝脏：AST或ALT＜3×ULN；总胆红素＜1.5×ULN(对于患有吉尔伯特综合征的受试者，总胆红素＜2mg/dL)
·与既往CTX110输注相比，据研究者的见解，没有使受试者处于增加的毒性风险中的临床状态恶化。
·没有新发神经症状提示CNS疾病累及。在腰椎穿刺或脑部MRI上有正常发现的情况下和神经症状消退后，可以考虑额外CTX110输注。
·妊娠或哺乳期妇女不符合额外CTX110输注的条件。
在计划开始淋巴细胞清除的14天内进行的当地实验室试验可用于确认进行后续CTX110输注的资格。在第一疗程中，在队列A和队列B的受试者第二次输注CTX110之前，对于血小板计数＜25,000个细胞/μL或ANC＜500/mm3的受试者，可以省略LD化疗(除非提供血细胞减少症的替代病因)。
应按照表26和表27中的评估计划对接受额外输注的受试者进行随访，与其初始输注一致，有以下考虑因素：
·不需要超声心动图(除非出现新发心脏体征或症状)、脑部MRI和腰椎穿刺(除非出现与进展有关的新发神经症状)。
·只要可能，应获得组织活检(NHL)或骨髓样品(B细胞ALL)以证明CD19表达。
·然而，如果对于队列A和队列B而言在第二次输注之前不可能，如果没有观察到对这次后续CTX110输注的反应，则应在下一次疾病评估时收集肿瘤或骨髓样品。
·必须在额外输注的4周内进行PET/CT。
·在患有NHL和B细胞ALL且有初始骨髓累及的受试者中，必须在额外输注的28天内重复骨髓活检和抽吸。
5.2.1.3.1细胞减少症和LD化疗
在第一疗程期间，在患有显著血细胞减少症(ANC＜500/mm3和/或血小板＜25,000个细胞/μL)的受试者中，研究者可在第二次CTX110输注之前省略LD化疗(队列A和队列B)。
5.3既往和伴随用药
5.3.1允许用药
在整个研究中给出了最佳医疗护理的必要支持措施，包括治疗感染的IV抗生素、生长因子、血液组分等，下面列出的禁止用药除外。
在CTX110输注后3个月内必须记录所有并发疗法，包括处方和非处方用药。从CTX110输注后3个月开始，仅收集以下选定的伴随用药：IV免疫球蛋白、疫苗接种、抗癌治疗(例如，化学疗法、辐照、免疫疗法)、免疫抑制剂(包括类固醇)和任何研究药剂。
5.3.2禁止用药
在本研究的某些阶段，禁止以下用药，如下所述：
·如本文所述，除非医学上指明治疗新发毒性或作为管理与CTX110相关的CRS或神经毒性的一部分，否则在CTX110施用后应避免药理学剂量的皮质类固醇疗法(≥5mg/天的泼尼松或当量剂量的其他皮质类固醇)和其他免疫抑制药物。
·由于可能使CRS症状恶化，CTX11O输注后禁止粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
·粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可以在CTX110输注后≥21天施用。
·鞘内CNS预防必须在CTX110输注前至少1周停止。
·疾病进展前禁止任何抗癌疗法(例如，化疗、免疫疗法、靶向疗法、辐照或其他研究药剂)或LD化疗(所有队列)
6.毒性管理
61通用指南
必须在CTX110输注后至少28天密切监测受试者。自体CAR T细胞疗法已经报告了显著毒性，并且根据方案指南，需要对所有不良事件的主动监测和治疗。
尽管这是首次人体研究并且CTX110的临床安全性尚未进行描述，但基于CD19定向的自体CAR T细胞疗法的既往经验提供了以下通用建议：
·发热是CRS最常见的早期表现；然而，作为第一表现，受试者也可能经历虚弱、低血压或精神混乱。
·CRS的诊断应基于临床症状而非实验室值。
·在对CRS特异性管理没有反应的受试者中，始终考虑脓毒症和抗性感染。应持续评价受试者的抗性或突发性细菌感染以及真菌或病毒感染。
·CRS、HLH和TLS可在CAR T细胞输注后同时发生。应始终如一地监测受试者的所有病状的体征和症状并进行适当管理。噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)观察到的体征和症状是CRS的表现，因此不会单独进行分级。
·神经毒性可发生在CRS时，CRS消退期间或CRS消退后。神经毒性的分级和管理将与CRS分开进行。
·托珠单抗必须在订购后2小时内施用。
6.2毒性特异性指南
6.2.1.输注反应
在自体CD19定向的CAR T细胞试验中已经报道了输注反应，包括短暂性发热、寒战和/或恶心。如果发生输注反应，则可以根据需要在CTX110输注后每6小时重复醋氨酚(对乙酰氨基酚)和盐酸苯海拉明(或另一种H1-抗组胺药)。
如果受试者持续发热，不能通过对乙酰氨基酚缓解，可以根据需要开出非甾体抗炎药物的处方。除了在危及生命的紧急情况下，否则不应施用全身性类固醇，因为这种干预可能对CAR T细胞具有有害作用。
6.2.2发热反应和感染预防
感染预防应根据机构护理标准进行。
如果发生发热反应，应开始对感染进行评价，并用治疗医师在医学上指明和确定的抗生素、液体和其他支持性护理对受试者进行适当管理。如果发热持续，应在受试者的整个医疗管理中考虑病毒和真菌感染。如果受试者在CTX110输注后发展出脓毒症或系统性菌血症，应开始适当的培养和医学管理。另外，在CTX110输注后，在输注后30天内出现发热的情况下，应考虑CRS。
对于接受多次CTX输注和LD化疗的受试者，推荐进行耶氏肺孢子菌(pneumocystisjirovecii)预防。
6.2.3肿瘤溶解综合征(TLS)
接受CAR T细胞疗法的受试者处于增加的TLS风险中。从LD化疗开始到CTX110输注后28天，应通过实验室评估和症状密切监测受试者的TLS。所有受试者应在筛选期间和LD化疗开始之前接受预防性别嘌呤醇(或非别嘌呤醇替代物，诸如非布索坦(febuxostat))并增加口服/IV水合作用。可以在CTX110输注后28天或一旦TLS的风险过去后停止预防。
研究中心应按照其机构护理标准或根据已公布指导原则(Cairo和Bishop，(2004)BrJHaematol，127，3-11)监测和治疗TLS。在临床指示时，应立即开始TLS管理，包括施用拉布立酶(rasburicase)。
6.2.4细胞因子释放综合征(CRS)
CRS是自体CD19定向CAR T细胞疗法报告的主要毒性。CRS是由于免疫系统响应于靶抗原的CAR接合的过度活化引起的，从而由快速T细胞刺激和增殖导致多细胞因子升高(Frey等人，(2014)Blood，124，2296；Maude等人，(2014)CancerJ，20，119-122)。当细胞因子释放时，可能出现与CRS相关的多种临床体征和症状，包括心脏、胃肠(GI)、神经学、呼吸(呼吸困难、缺氧)、皮肤、心血管(低血压、心动过速)和体质(发热、僵直、出汗、厌食、头痛、不适、疲劳、关节痛、恶心和呕吐)症状，以及实验室(凝血、肾和肝)异常。
CRS管理的目标是防止危及生命的后遗症，同时保持CTX110抗肿瘤作用的潜力。通常在自体CAR T细胞疗法后1至14天出现症状，但是对于同种异体CAR T细胞而言，症状发作的时间尚未完全确定。
应基于临床表现而非实验室细胞因子测量结果来鉴定和治疗CRS。如果怀疑CRS，应根据表18-20中的建议进行分级和管理，该表根据已公布的指导原则(Lee等人，(2014)Blood，124，188-195)修改。由于最初Lee CRS分级标准的开发，使用CAR T细胞疗法的医师已经获得对CRS的表现和时程的进一步理解。最新的美国血液和骨髓移植学会(ASBMT)共识标准(Lee等人，(2018)Biol Blood Marrow Transplant)推荐分级应基于伴有低血压和/或缺氧的发热的存在，并且应使用支持性护理单独管理其他最终器官毒性。因此，在本方案中，使用不同的量表对神经毒性进行分级和管理(参见标题为“免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)”的部分)，并且在CRS管理的情况下终末器官毒性仅涉及肝和肾系统(如在Penn分级标准中一样；(Porter等人，(2018)J Hematol Oncol，11，35)。
表18.根据ASTCT共识标准的A部分和B部分对CRS进行分级
ASTCT：美国移植和细胞治疗学会；BiPAP：双相气道正压通气；C：摄氏度；CPAP：持续气道正压通气；CRS：细胞因子释放综合征
注：与CRS相关的器官毒性可根据CTCAE v5.0分级，但不影响CRS分级。CTCAE：通用不良事件术语标准
1发热定义为温度≥38℃，不可归因于任何其他原因。在患有CRS，然后接受退热剂或抗细胞因子疗法诸如托珠单抗或类固醇的受试者中，不再需要发热来对后续CRS严重程度进行分级。在这种情况下，CRS分级由低血压和/或缺氧驱动。
2CRS等级由更严重的事件决定：不可归因于任何其他原因的低血压或缺氧。例如，温度为39.5℃，低血压需要1种血管加压药以及缺氧需要低流量鼻插管的患者归类为3级CRS。
3低流量鼻插管定义为以≤6L/分钟输送氧气。低流量还包括漏气氧输送，有时用于儿科。高流量鼻插管定义为以＞6L/分钟输送氧气。
表19.细胞因子释放综合征分级和管理指南。
CRS：细胞因子释放综合征；IV：静脉内；N/A：不适用。
1参见Lee等人，2019。
2参考托珠单抗处方信息。
表20.高剂量血管加压药。
*所有剂量需要≥3小时。
**VASST试验血管加压药当量方程式：去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(μg/min)]+[多巴胺(μg/min)/2]+[肾上腺素(μg/min)]+[苯肾上腺素(μg/min)/10]。
在整个CRS持续期间，应向受试者提供由退热剂、IV液体和氧气组成的支持性护理。应使用连续心脏遥测和脉搏血氧测定监测经历≥2级CRS(例如，低血压，对液体无反应性或缺氧需要补充氧合)的受试者。对于经历3级CRS的受试者，考虑进行超声心动图评估心脏功能。对于3级或4级CRS，考虑重症监护支持治疗。因神经毒性(例如，癫痫发作)而非缺氧引起的气道保护插管不应视为4级CRS。类似地，由于神经毒性而无其他CRS体征(例如，缺氧)延长插管不被视为4级CRS。由于表现(发热、低血压、缺氧)相似，在严重CRS的情况下应考虑潜在感染。CRS的消退定义为发热(温度≥38℃)、缺氧和低血压的消退(Lee等人，(2018)BiolBlood Marrow Transplant)。
6.2.5神经毒性
任何≥3级神经毒性均需要腰椎穿刺，并且如果临床可行，强烈推荐1级和2级事件进行腰椎穿刺。除非临床上不可行，否则必须在症状发作48小时内进行腰椎穿刺。
对于在接受CTX110后经历神经认知症状的受试者，在鉴别诊断中必须考虑病毒性脑炎(例如，HHV-6脑炎；见下文)。每当进行腰椎穿刺时，除了在研究中心进行的标准组(应至少包括细胞计数、革兰氏染色和脑膜炎奈瑟氏球菌)外，还必须进行以下病毒组：HSV-1和HSV-2、肠道病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)和HHV-6的CSF PCR分析。必须在腰椎穿刺后5个工作日内提供感染性疾病组的结果，以便对受试者进行适当管理。如果研究中心无法进行组测试，则必须与医学监查员进行讨论。
用自体CD19定向CAR T细胞疗法已经观察到神经毒性。神经毒性可发生在CRS时，CRS消退期间或CRS消退后并且不清楚其病理生理学。ASTCT共识进一步将与CRS相关的神经毒性定义为ICANS，ICANS是一种特征在于在任何免疫疗法后涉及CNS的病理过程的病症，所述免疫疗法导致内源性或输注的T细胞和/或其他免疫效应细胞的活化或接合(Lee等人，2019)。
体征和症状可以是进行性的，并且可以包括失语症、意识水平改变、认知能力受损、运动无力、癫痫发作和脑水肿。基于先前在自体CAR T细胞试验(Neelapu等人，2018)中使用的CAR T细胞疗法相关的毒性(CARTOX)工作组标准开发ICANS分级(表21)。通过使用称为ICE(免疫效应细胞相关脑病)评估工具的改良评估工具，ICANS并入了意识水平评估、癫痫发作的存在/不存在、运动发现、脑水肿的存在/不存在和神经领域的总体评估(表22)。
对任何新发作的神经毒性的评价应包括神经学检查(包括ICE评估工具，表22)、脑部MRI和如临床指示的CSF检查(经由腰椎穿刺)。如果不可能进行脑部MRI，所有受试者应接受非造影CT以排除脑内出血。如临床指示，还应考虑脑电图。在严重的情况下，可能需要气管内插管用于气道保护。
在所有受试者中，在CTX110输注后或在神经症状消退后至少21天，应考虑非镇静、抗癫痫预防(例如，左乙拉西坦(levetiracetam))(除非认为抗癫痫用药会造成有害症状)。应采用连续心脏遥测和脉搏血氧测定监测ICANS等级≥2的受试者。对于严重或危及生命的神经毒性，应提供重症监护支持疗法。应始终考虑神经内科会诊。监测血小板和凝血病体征，并适当输注血液制品以降低脑内出血的风险。表21提供了神经毒性分级，表23提供了管理指南，并且表22提供了使用ICE评估进行的神经认知评估(见下文)。除表23中提供的治疗指导原则外，在与CRISPR医学监查员讨论后，可考虑将非类固醇药剂(例如，阿那白滞素等)用于ICANS管理(Neill等人，2020)。
对于接受活性类固醇管理超过3天的受试者，推荐抗真菌和抗病毒预防以减轻长期使用类固醇导致严重感染的风险。还应考虑抗微生物预防。
表21.ICANS分级
CTCAE：通用不良事件术语标准；EEG：脑电图；ICANS：免疫效应细胞相关神经毒性综合征；ICE：免疫效应细胞相关脑病(评估工具)；ICP：颅内压；N/A：不适用。
ICANS等级由不可归因于任何其他原因的最严重的事件(ICE评分、意识水平、癫痫发作、运动发现、ICP升高/脑水肿)确定。
1ICE评分为0的受试者如果清醒伴完全性失语可归类为3级ICANS，但ICE评分为0的受试者如果无法唤醒可归类为4级ICANS。
2意识水平低下应该可归因于其他原因(例如，镇静药物)。
3应根据CTCAE v5.0对与免疫效应疗法相关的震颤和肌阵挛进行分级，但不影响ICANS分级
表22.ICE评估。
在筛选时，在第1天和第2、3、5、8和28天施用CTX110之前进行ICE评估。如果受试者经历CNS症状，应继续大约每2天进行ICE评估，直至症状消退。为了将变异性减到最低，只要可能应由熟悉或培训过ICE评估施用的同一研究人员进行评估。
表23.ICANS管理指南。
CRS：细胞因子释放综合征；ICANS：免疫效应细胞相关神经毒性综合征；IV：静脉内。
可能发生在发热情况下或化疗后的头痛，是一种非特异性症状。单独的头痛可能不一定是ICANS的表现，应进行进一步评价。从ICANS的定义中排除因去适应和肌肉损失导致的虚弱或平衡问题。类似地，有或没有相关水肿的颅内出血可能由于这些受试者的凝血病而发生，并且也从ICANS的定义中排除。应根据CTCAE v5.0捕获这些和其他神经毒性。
6.2.5.1人疱疹病毒6型脑炎
大多数人在儿童时期暴露于HHV-6，在成人中血清阳性率可接近100％。认为HHV-6在初次感染后在大多数个体中保持临床潜伏并且在具有严重免疫抑制的人中再活化以引起疾病(Agut等人，2015；Hanson等人，2018)。已经鉴定了两种类型的HHV-6(A和B)。尽管尚无疾病明确与HHV-6A感染有联系，但HHV-6B是造成儿童期疾病猝发疹(exanthem subitem)的原因。该病毒还表现出亲神经性，并以潜伏形式持续存在于脑组织中。HHV-6脑炎主要在同种异体HSCT后的免疫受损患者中有描述，并且还在接受自体CAR T细胞疗法的免疫受损患者中有描述(Bhanushali等人,2013；Hanson等人,2018；Hill和Zerr,2014)。基于来自同种异体HSCT的数据，用类固醇治疗的免疫受损患者处于发生HHV-6脑炎的较高风险中。
在CTX110输注后具有神经症状(例如，精神错乱、记忆丧失、癫痫发作)的任何免疫受损受试者中应考虑诊断HHV-6脑炎。除脑部MRI外，诊断测试还需要以下样本：用于HHV-6DNA PCR的腰椎穿刺(如果临床可行，应在出现症状48小时内进行)和用于HHV-6DNA PCR的血液(优选血浆)。在通过PCR检测到CSF HHV-6DNA升高，通过PCR检测到血液(优选血浆)HHV-6DNA升高和具有急性精神状态发现(脑病)或短期记忆丧失或癫痫发作的受试者中，应考虑诊断HHV-6脑炎(Hill和Zerr，2014)。相关的脑部MRI异常(典型地，但不排他地，在内侧颞叶，特别是海马和扁桃体中的非增强、高信号病变)最初可能看不到(Ward等人，2019)。由于最初可能不存在脑部MRI结果，应在神经系统发现和高HHV-6CSF病毒载量的情况下考虑治疗HHV-6脑炎。CSF蛋白和细胞计数往往可能不显著，但是可能存在轻度的蛋白升高和轻度的脑脊液细胞增多。受试者也可能经历发热和/或皮疹(Ward等人，2019)。对于怀疑患有HHV-6脑炎的受试者，必须联系CRISPR医学监查员。
在诊断患有HHV-6脑炎的受试者中，应开始用更昔洛韦(ganciclovir)或膦甲酸治疗。药物选择应取决于药物的副作用、受试者的合并症和研究中心的临床实践。推荐的治疗持续时间为3周或按照研究中心临床实践(Hill和Zerr，2014；Ward等人，2019)。
一旦开始治疗，应每周通过PCR检查外周血HHV-6病毒载量。应在治疗开始后1-2周内看到血液病毒载量降低。如果治疗1至2周后病毒载量没有降低，则应考虑转换为另一种抗病毒剂(更昔洛韦或膦甲酸)。抗病毒治疗应持续至少3周，直至PCR测试证明血液中的HHV-6DNA清除。在治疗结束时，应进行腰椎穿刺以确认CSF中的HHV-6DNA清除。如果可能，在治疗HHV-6脑炎期间应减少免疫抑制药物(包括类固醇)；然而，这需要与受试者对类固醇的需要平衡，尤其是如果还怀疑ICANS时。
对于怀疑HHV-6脑炎的受试者，如果可用，应从CTX110输注前收集的血样中通过PCR对HHV-6IgG、IgM和HHV-6DNA进行回顾性评估。
在具有持续升高的HHV-6DNA病毒载量(例如，＞10,000拷贝/mL)的受试者中，并且尤其是当病毒载量在抗病毒治疗开始后不降低时，应尝试区分HHV-6再活化与染色体整合的HHV-6(CIHHV-6)。如果研究中心具有这样的能力，则CIHHV-6可通过病毒DNA/细胞基因组或毛囊/指甲中的病毒DNA的1个拷贝的证据，或通过证明HHV-6整合到人染色体中的荧光原位杂交来确认。
在疑似终末器官疾病中，如果进行活检，则应通过培养、免疫化学、原位杂交或mRNA的逆转录PCR(如果研究中心能够进行)测试来自患病器官的组织的HHV-6感染。
6.2.6B细胞发育不全
B细胞发育不全可能发生并且可以通过以下免疫球蛋白G血液水平来监测。根据机构护理标准，对于有临床意义的低丙球蛋白血症(全身性感染)可以施用IV丙种球蛋白。
6.2.7噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)
已经报道了用自体CD19定向CAR T细胞治疗后的HLH(Barrett等人，(2014)CurrOpin Pediatr，26，43-49；Maude等人，(2014)NEngl JMed，371，1507-1517；Maude等人，(2015)Blood，125，4017-4023；Porter等人，(2015)Sci Transl Med，7，303ra139；Teachey等人，(2013)Blood，121，5154-5157。HLH是临床综合征，它是输注CAR T细胞后炎症反应的结果，其中来自活化T细胞的细胞因子产生导致过度巨噬细胞活化。HLH的体征和症状可包括发热、血细胞减少症、肝脾肿大、肝功能障碍伴高胆红素血症、凝血病伴纤维蛋白原显著降低以及铁蛋白和C反应蛋白(CRP)明显升高。还已观察到了神经学发现(Jordan等人，(2011)Blood，118，4041-4052；La Rosée，(2015)Hematology Am SocHematol EducProgram，190-196。
CRS和HLH可能具有相似的临床综合征，具有重叠的临床特征和病理生理学。HLH可能发生在CRS时或CRS正在消退时。如果有不明原因的肝功能检查升高或血细胞减少症，有或没有其他CRS证据，则应考虑HLH。监测CRP和铁蛋白可帮助诊断和定义临床过程。
如果怀疑HLH：
·频繁监测凝血参数，包括纤维蛋白原。这些测试可以比评估计划中指示的更频繁地进行，并且频率应当基于实验室发现来驱动。
·纤维蛋白原应维持≥100mg/dL，以降低出血风险。
应使用血液制品纠正凝血病。
考虑到与CRS的重叠，还应按照表18-20中的CRS治疗指南对受试者进行管理。与医学监查员一起讨论后也可以考虑IL-1抑制剂、阿那白滞素或其他抗细胞因子疗法(诸如依帕伐单抗(emapalumab)-lzsg)。
6.2.8血细胞减少症
在用自体CD19定向CAR T细胞产品治疗的受试者中已经报道了在输注后有时持续超过28天的3级中性粒细胞减少症和血小板减少症(Kymriah USPI，2017；Yescarta USPI，2017)。因此，应监测接受CTX110的受试者的此类毒性并进行适当支持。应考虑对患有长期中性白细胞减少症的任何受试者进行抗微生物和抗真菌预防。
对于正在经历≥3级中性粒细胞减少症、血小板减少症或贫血，在CTX110输注的28天内尚未消退的受试者，应每周进行有差异的全血细胞计数直至消退到≤2级或每周施用新的全身抗癌疗法直至每个剂量CTX110后的第3个月，然后每月最少一次，直到符合机构实践。
当CRS风险已过去，CTX110输注后21天，在4级中性粒细胞减少症的情况下可以考虑G-CSF。可以较早考虑施用G-CSF，但必须先与医学监查员一起讨论。对于患有长期中性粒细胞减少症或服用高剂量类固醇的任何受试者，应考虑进行抗微生物和抗真菌预防。
6.2.9移植物抗宿主病(GvHD)
在同种异体HSCT的情况下看到GvHD，并且是免疫活性供体T细胞(移植物)将受体(宿主)识别为外源的结果。后续免疫反应激活供体T细胞以攻击受体以消除携带外源抗原的细胞。基于距离同种异体HSCT的时间和临床表现，将GvHD分为急性、慢性和重叠综合征。急性GvHD的体征可包括斑丘疹；小胆管损伤引起的高胆红素血症伴黄疸，导致胆汁淤积；恶心、呕吐和厌食；以及水样或血性腹泻和痉挛性腹痛(Zeiser和Blazar，(2017)NEngl JMed，377，2167-2179。
为支持提出的临床研究，在免疫受损小鼠中以超过提出的所有临床剂量水平至少10倍的2个剂量进行非临床良好实验室规范(GLP)-顺应性GvHD和耐受性研究。此外，由于在TRAC基因座处CAR插入的特异性，T细胞非常不可能同时为CAR+和TCR+。在制造过程中，通过在抗TCR抗体柱上的免疫亲和色谱法去除剩余的TCR+细胞，以在最终产物中获得＜0.15％的TCR+细胞。可对所有剂量水平施加7x104个TCR+细胞/kg的剂量限值。基于公布的关于单倍同一性供体在SCT期间能够引起严重GvHD的同种异体细胞数量的报道，该限值低于1x105个TCR+细胞/kg的限值(Bertaina等人，(2014)Blood，124，822-826。通过这种特异性编辑、纯化和严格的产品发布标准，CTX110后发生GvHD的风险应较低，但真实发生率未知。应密切监测受试者在输注CTX110后的急性GvHD体征。潜在症状的时间未知。然而，考虑到CAR T细胞扩增是抗原驱动的并且可能仅在TCR-细胞中发生，TCR+细胞的数量不可能明显增加高于输注的数量。
GvHD的诊断和分级应基于已公布的标准(Harris等人，(2016)Biol Blood MarrowTransplant，22，4-10)，如表24所概述。
表24.急性GvHD分级标准
BSA：体表面积；GI：胃肠；GvHD：移植物抗宿主病。
总体GvHD等级可基于最严重的靶器官累及情况来确定。
·0级：没有任何器官的1-4期。
·1级：1-2期皮肤，无肝脏、上胃肠道或下胃肠道累及。
·2级：3期皮疹和/或1期肝脏和/或1期上胃肠道和/或1期下胃肠道。
·3级：2-3期肝脏和/或2-3期下胃肠道，伴有0-3期皮肤和/或0-1期上胃肠道。
·4级：4期皮肤、肝脏或下胃肠道累及，伴有0-1期上胃肠道累及。
应排除可能模拟GvHD的潜在混杂因素，诸如感染和药物反应。在开始治疗前或开始治疗后不久，应获得皮肤和/或胃肠道活检进行确认。在肝脏累及的情况下，如果临床上可行，应尝试进行肝脏活检。
表25中概述了急性GvHD管理的建议。为考虑到在试验结束时的受试者间可比性，应遵循这些建议，除非在特定临床情形下遵循这些建议会使受试者处于风险中。
表25.急性GvHD管理
GI：胃肠；IV：静脉内。
对于患有更严重的GvHD的受试者，应更快地做出开始二线治疗的决定。例如，可在有GvHD进行性表现3天后，在持续性3级GvHD 1周后，或在持续性2级GvHD 2周后指示使用二次疗法。在无法耐受高剂量糖皮质激素治疗的受试者中，可更早地指示使用二线系统疗法(Martin等人，(2012)BiolBloodMarrow Transplant，18，1150-1163)。二次疗法和何时开始的选择可基于常规实践。
难治性急性GvHD或慢性GvHD的管理可按照机构指导原则进行。用免疫抑制剂(包括类固醇)治疗受试者时，应按照当地指导原则制定抗感染预防措施。
6.2.10低血压和肾功能不全
用CAR T细胞疗法已经报道了低血压和肾功能不全，应根据机构实践指导原则通过IV推注施用生理盐水进行治疗。适当时应考虑透析。
6.2.11.COVID-19大流行期间的特殊考虑因素
入选本研究的受试者经历LD化疗，免疫受损，且感染风险增加。因此，临床研究方案要求排除在筛选期间，在LD化疗之前和在CTX110输注或延迟输注之前处于任何持续活动性感染的情况下的受试者(参见第4.2节)。
该措施将包括具有严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS CoV2)，即COVID19的致病因子(冠状病毒疾病2019)的活动性感染的受试者。由于快速变化的证据以及局部区域差异，如果当前情况允许在给定时间对个体受试者安全进行研究，则应遵循当地法规和机构指导原则。
7.研究程序
研究的剂量递增和扩展部分将由3个不同阶段组成：
(1)筛选和资格确认；(2)治疗由取决于队列分配的LD化疗和CTX110输注组成；以及(3)随访。在筛选阶段，根据以上概述的资格标准对受试者进行评估。
入选后，队列A和队列B的受试者接受LD化疗，接着输注CTX110。在随访期间，将评估受试者的肿瘤反应、疾病进展和生存。在所有研究阶段，定期监测受试者的安全性。
在表26和表27(所有队列)中提供了完整的评估计划。在本节中提供了所有所需研究程序的描述。除方案规定的评估外，应按照机构指导原则对受试者进行随访，并在临床指示时进行事先未计划的评估
应重新计划错过的评价，并尽可能接近计划的原日期进行评价。当因为在时间上太接近计划的下一评价，重新计划在医学上变得不必要或不安全时，产生例外。在这种情况下，应当放弃错过的评价。
为了本方案的目的，没有第0天。所有访视日期和窗口均使用第1天作为首次CTX110输注的日期计算。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
7.1受试者筛选、入选和退出
7.1.1受试者筛选
筛选期从受试者签署知情同意书(ICF)当日开始，并继续进行资格确认和入选研究。一旦获得知情同意书，就将按照评估计划(表26-27)中概述的那样对受试者进行筛选，以确认研究资格。受试者签署知情同意书后14天内完成筛选评估。
将允许受试者进行一次重新筛选，这可在初始同意的3个月内进行。
7.1.2.将受试者分配到治疗队列
队列A和队列B包括患有NHL的受试者，包括DLBCLNOS、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤、转化FL和3b级FL。在队列B中CTX110输注可以DL3开始。给药将如本文所述交错进行。
对于B部分(NHL队列扩展)，患有难治性NHL疾病且有大体积表现的受试者(大体积难治性群体N2)的入选限于20名受试者。如果以下任何一种情况适用(如有歧义，将采取先例进行中心分析)，则具有大体积表现的难治性NHL疾病用当地结果前瞻性定义为高风险和/或用中心分析回顾性定义为高风险：
·通过当地和/或中心分析评估的SPD≥50cm2(LD化疗前)[SPD＝直径乘积总和]；和/或
·入选后6个月内没有对任何化疗方案的反应史(PR或更好)和/或诊断出DLBCL
·入选前≤7个月患有NHL的受试者开始一线抗癌疗法
7.2研究评估
所需程序的时间，参考评估计划(表26和表27)。
7.2.1.病史
收集人口数据。获得病史，包括受试者疾病、先前癌症治疗从诊断当日起对治疗的反应的完整病史。获得心脏、神经和手术史。对于试验进入，所有受试者必须符合本文所述的所有入选标准，并且没有本文所述的排除标准。
7.2.2身体检查
在每次研究访视时进行身体检查，包括主要身体系统的检查，包括总体外观、皮肤、颈部、头部、眼睛、耳朵、鼻子、咽喉、心脏、肺、腹部、淋巴结、四肢和神经系统，并记录结果。从筛选时进行的检查中注意到的变化记录为AE。
7.2.3.生命体征，包括身高和体重
将在每次研究访视时记录生命体征，包括坐位血压、心率、呼吸率、脉搏血氧饱和度、体温和身高。将根据表26-27中的计划获得体重并且将仅在筛选时获得身高。
7.2.4 ECOG体能状态
使用ECOG量表在筛选、CTX110输注(第1天)、第28天和第3个月访视时评估体能状态，以确定受试者的一般健康状况和进行日常生活活动的能力。ECOG体能状态量表在下表28中提供。
表28.美国东部肿瘤协作组体能状态量表
/>
由美国东部肿瘤协作组，集团主席Robert L.Comis，MD(Oken等人，1982)开发。
7.2.5起声心动图
将进行经胸心脏超声心动图(用于评估左心室射血分数)，并由经过培训的医务人员在筛选时读取，以确认资格。在3级或4级CRS期间，对于因低血压需要＞1次液体推注，转移至重症监护室进行血液动力学管理，或因低血压需要任何剂量的血管加压药的所有受试者建议进行额外的心脏评估(Brudno和Kochenderfer，2016)。
7.2.6心电图
在筛选期间，在治疗第一天LD化疗之前(队列A和队列B)，以及第1天和第28天施用CTX110之前，将获得十二(12)导联心电图(ECG)。由ECG确定QTc和QRS间隔。
7.2.7 NHL肿瘤病理学
NHL亚型的组织病理学诊断基于当地实验室评估。优选受试者在筛选期间经历肿瘤活检。然而，如果在最后一个线数的疗法完成后和入选前3个月内进行复发性/难治性疾病的活检，则可以使用存档组织。由于干扰下游测定，骨活检和其他脱钙组织不可接受。
部分组织活检将被提交给中心实验室进行分析。组织制备和运输的要求可在实验室手册中找到。如果存档组织的体积或质量不足以符合中心实验室要求，则必须在筛选期间进行活检。可以分析存档肿瘤组织样品的侵袭性NHL标志物(例如，MYC、BCL2、BCL6)以及肿瘤和周围微环境中的免疫标志物(例如，程序性细胞死亡蛋白1、程序性细胞死亡配体1)。
7.2.8脑部MRI
为了排除CNS转移，将在筛选期间进行脑部MRI。将在成像手册中概述这种MRI的采集、处理和传输的要求。
7.2.9腰椎穿刺
腰椎穿刺将在处于CNS累及高风险的受试者中进行。这些受试者包括患有具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤的受试者；有睾丸淋巴瘤累及的受试者；或在CNS IPI(一种用于估计用R-CHOP治疗的DLBCL患者中的CNS复发/进展风险的工具)上具有高风险评分的受试者(Schmitz等人，2016)。如果临床上可行，对于在神经毒性期间进行的腰椎穿刺，应将CSF样品送至中心实验室检查探索性生物标志物和CTX110的存在(通过PCR)。当在神经毒性评价环境中进行腰椎穿刺时，除了在研究中心进行的标准组(应至少包括细胞计数、革兰氏染色和脑膜炎奈瑟氏球菌)外，还必须进行以下病毒组：
·HSV-1和-2、肠道病毒、VZV、CMV和HHV-6的CSF PCR分析
病毒组的结果应在距抽取5个工作日内可用，以支持受试者的适当管理。
7.2.10免疫效应细胞相关脑病(ICE)评估
将使用ICE评估进行神经认知评估。ICE评估是CARTOX-10筛选工具的略微修改版本，现在包括对感觉性失语症的测试。ICE评估(表22)检查认知功能的各方面：取向、命名、遵循命令、书写和注意力。
在筛选时，在第1天和第2、3、5、8和28天施用CTX110之前进行ICE评估。如果受试者经历CNS症状，应继续大约每2天进行ICE评估，直至症状消退。为了将变异性减到最低，只要可能应由熟悉或培训过ICE评估施用的同一研究人员进行评估。
7.2.11对NHL的PET/CT和放射学疾病反应评估
需要对所有疾病部位(包括颈部、胸部、腹部和骨盆)进行PET/CT(CT必须包括IV造影剂)扫描。PET/CT的CT部分应为诊断质量，或者应进行用IV造影剂的独立CT。当CT是临床禁忌的，或根据当地法规的要求，可用使用含造影剂的MRI。基线PET/CT(含IV造影剂)必须在施用CTX110前28天内进行，并且输注后扫描将按照表26-27中的评估计划进行。如果受试者具有与可能的疾病进展相符的症状，则应进行事先未计划的PET/CT(含IV造影剂)。
对于在第35天(-7天/+21天)接受第二次CTX110输注的所有受试者，在该次输注后28天需要PET/CT扫描以评估功效。如果第二次CTX110输注的PET/CT扫描发生在最初第3个月扫描的14天内(包括窗口)，则容许该扫描代替第3个月成像。
将在成像手册中概述扫描的采集、处理和传输的要求。可能时，用于采集PET/CT的成像模式、机器和扫描参数应在研究期间保持一致。在基线时根据Lugano标准(本文公开的)对肿瘤负荷进行定量。肿瘤负荷评估将包括通过对最多六个靶病变的每个靶(结节或结节外)病变的尺寸进行聚合，乘以病变的两个最长垂直直径来计算垂直直径总和(SPD)。靶病变应选自可重复测量的最大尺寸的病变，表示多个部位和/或器官上的总肿瘤负荷。
7.2.12对于NHL的骨髓活检和抽吸
在筛选时和第28天进行骨髓活检和抽吸以评价疾病程度。在PET/CT扫描时确定实现CR的有骨髓累及史的受试者将进行骨髓活检以确认反应评估。如果受试者显示出复发迹象，应重复活检收集。在进行骨髓分析时的任何时间点，应将用于检测CTX110的存在(经由PCR检测)的抽吸物样品送去进行中心实验室评价。应遵循骨髓活检的标准机构指导原则。在实验室手册中提供了更多关于处理和运输的说明。将储存过量的样品(如果可用)用于探索性研究。
7.2.13 NHL的任选肿瘤活检
为了关于CTX110运输到肿瘤组织中和肿瘤环境对CTX110功能的影响了解更多，将从具有适合活检的肿瘤并为该程序提供单独的同意书的受试者获得任选的肿瘤活检。在第28天进行任选肿瘤活检。应遵循肿瘤活检的标准机构指导原则。
7.2.14实验室试验
根据评估计划(表26和表27)收集和分析实验室样品。在下表29中提供了一些详情。
表29.当地实验室试验
ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；CRP：C反应蛋白；CRS：细胞因子释放综合征；eGFR：估算肾小球滤过率；HHV-6：人疱疹病毒6；HIV-1/-2：1型或2型人免疫缺陷病毒；HLH：噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；IgA/G/M：免疫球蛋白A、G或M；LD：淋巴细胞消除；PCR：聚合酶链反应；SGOT：血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶；SGPT：血清谷氨酸丙酮酸转氨酶；TNBK：T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。
2仅对于具有生育潜力的女性。筛选时需要进行血清妊娠试验。LD化疗或第二剂量的CTX1 10开始72小时内的血清或尿液妊娠试验，包括各队列的再次给药方案。
7.3.生物标志物
收集血液、骨髓、肿瘤和CSF样品(仅在患有ICANS的受试者中)以鉴定可能指示临床反应、抗性、安全性、药效学活性或CTX110的作用机制的基因组、代谢和/或蛋白质组学生物标志物。
在中心实验室抽取以下实验室进行分析。有关送至中心实验室进行处理的血液抽取和试验用样品处理的信息，参考实验室手册。将储存过量的样品(如果可用)用于探索性研究。
7.3.1.CTX110药代动力学分析
CTX110细胞的PK分析将根据表26和表27中描述的计划对收集的血样进行。在经历CRS、神经毒性和HLH的体征或症状的受试者中，应按照实验室手册中概述的间隔抽取额外血样。使用测量每μgDNA中的CAR构建体拷贝数的PCR测定来描述CTX110在血液中的分布时程(Tsai等人，2017)。还可以使用流式细胞术进行互补分析以确认细胞表面上CAR蛋白的存在。可以在按照方案特异性取样收集的任何这些样品中评价CSF、骨髓或肿瘤组织中CTX110的运输。
7.3.2.细胞因子
将在中心实验室分析细胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17a、干扰素γ、肿瘤坏死因子α和GM-CSF。如最近的综述(Wang和Han，2018)所汇总的，在多个既往CART细胞临床研究中进行的相关性分析已经将这些细胞因子和其他细胞因子鉴定为严重CRS和/或神经毒性的潜在预测标志物。在如表26和表27所述的指定时间收集用于检测细胞因子的血液。在经历CRS、神经毒性和HLH的体征或症状的受试者中，应抽取额外样品(按照实验室手册中概述的计划)。
7.3.3抗CTX110抗体
CAR构建体由鼠类scFv构成。按照表26-27，将在整个研究期间收集血液以评估潜在免疫原性。
7.3.4探索性研究生物标志物
可进行探索性研究以鉴定指示或预测临床反应、抗性、安全性、药代动力学活性和/或治疗作用机制的分子(基因组、代谢和/或蛋白质组学)生物标志物和免疫表型。
8.安全性、不良事件、研究疏忽
在整个研究中，在常规基础上监测每个受试者的AE的临床和实验室证据。记录响应于询问，研究中心人员观察到的或受试者自发报告的AE。所有AE均得到满意的结论。
8.1.不良事件
AE是施用了药物产品的患者或临床研究受试者中发生的任何不良医学事件，并且不一定与该治疗有因果关系。因此，AE可能是与医药(研究)产品的使用暂时相关的任何不利或非预期的体征(例如，包括异常的实验室发现)、症状或疾病，而无论是否认为与医药(研究)产品有关。[(GCP)E6(R2)]在临床研究中，AE可以包括在任何时间(包括基线或洗脱期)发生的不希望的医学病症，即使尚未施用研究治疗。定义AE的其他标准如下所述。
将以下认为是不良事件：
·早先存在的疾病或永久性病症加重(早先存在的疾病的特性、严重程度、频率或持续时间出现任何临床上显著的恶化)
·由方案规定的程序引起的事件(例如，侵入性程序的并发症)
不认为以下是不良事件：
·医疗或外科手术，包括选择性的或预先计划的手术，诸如外科手术、内窥镜检查、拔牙、输血。
注：在预先计划的择期手术或常规计划的治疗期间发生的不良医疗事件应记录为AE或SAE
·在研究医药产品施用期间或之后未恶化的早先存在的疾病或病症
·计划住院治疗进行研究治疗输注或观察
·研究中的恶性肿瘤或与该疾病相关的体征和症状以及潜在恶性肿瘤的进展或复发
只有认为有临床意义的异常实验室结果才应报告为AE(例如，与临床症状相关，长期持续或需要额外监测和/或医疗干预的异常实验室结果)。只要可能，这些应报告为临床诊断，而不是异常参数本身(即中性白细胞减少症与中性粒细胞计数下降)。没有临床意义的异常实验室结果不应记录为AE。
不良事件可以发生在治疗之前、期间或之后，并且可以是治疗紧急的(即，发生在CTX110输注之后)或非治疗紧急的。非治疗紧急性AE是在受试者接受CTX110之前获得书面知情同意书后发生的任何新发体征或症状、疾病或其他不良医疗事件。
8.2.严重不良事件
如果不良医疗后果的AE符合以下任何标准，则必须将其归类为SAE：
·导致死亡
·危及生命(即，使受试者处于立即死亡的风险中的AE)
·需要住院治疗或延长现有住院治疗(进行计划的医疗或外科手术或进行计划的治疗的住院治疗不符合这些标准)
·导致持续性或显著性残疾或能力丧失
·导致新生儿先天性异常或出生缺陷
·其他重要/重大医疗事件。基于适当的医疗判断，当重要的医疗事件可能会危及患者或受试者并且可能需要医疗或手术干预以防止此定义列出的结局之一时，可以将这些可能不会导致死亡、危及生命或需要住院治疗的重要的医疗事件认为是严重的。
进行研究治疗输注的住院治疗或CTX110输注后计划的住院治疗不被视为SAE。此外，除非与符合其他SAE标准的医学显著性事件相关，否则不应将仅为了观察的住院治疗或为了观察延长住院治疗报告为SAE。
8.3.特别感兴趣的不良事件
除非另有说明，否则所有AESI应该是发生在CTX110输注后和开始新的抗癌疗法前时报告的。必须报告CTX110输注后的AESI，包括：
·CTX110输注反应
·≥3级感染
·肿瘤溶解综合征
·细胞因子释放综合征，包括有HLH重叠表现的病例
·ICANS
·B细胞发育不全
·低丙球蛋白血症
·移植物抗宿主病
·继发性恶性肿瘤
·不受控制的T细胞增殖
·研究者确定的任何新发血液学或自身免疫性病症可能有关或与CTX110有关。
所需AESI报告收集期的附加信息在下表30和表31中有详述。
7.4.不良事件严重程度
将根据CTCAE 5.0版对AE进行分级，CRS、神经毒性和GvHD除外，这些将根据本文公开的标准进行分级。
当CTCAE等级或方案指定的标准不可用时，可以使用表30中的毒性分级。
表30：不良事件严重程度
ADL：日常生活活动；AE：不良事件。
1工具性ADL是指做饭，购买杂货或衣服，使用电话，理财等。
2自理性ADL是指洗澡、穿衣和脱衣，自己进食，上厕所，服药并且不卧床。
8.5不良事件因果关系
将会评估每种AE与CTX110、LD化疗、达雷木单抗施用和任何方案规定的研究程序(全部单独评估)之间的关系。将基于以下定义进行关系的评估：
·相关：研究治疗或程序与AE之间存在明确的因果关系。
·可能有关：有一些证据表明研究治疗或程序与AE之间存在因果关系，但也存在替代性的潜在原因。
·无关：没有证据表明研究治疗或程序与AE之间存在因果关系。
在进行它们的因果关系评估时，应考虑事件的时间与治疗或程序的施用、合理的生物学机制和事件的其他潜在原因(例如，伴随疗法、基础疾病)之间的时间关联。
如果将SAE评估为与任何研究干预无关，则必须在CRF中提供替代病因。如果SAE与研究产品之间的关系被确定为“可能”，则必须提供评估的理论基础。
8.6结局
AE或SAE的结局分类和报告如下：
·致命
·未恢复/未消退
·恢复/消退
·恢复/消退伴后遗症
·正在恢复/正在消退
·未知
表31.按研究时间段收集不良事件
/>
AE：不良事件；AESI：特别感兴趣的不良事件；SAE：严重不良事件。
如果受试者在最后一次CTX110输注的3个月内接受新的抗癌疗法，应报告所有SAE和AESI直至第3个月。如果受试者在第3个月研究访视后开始新的抗癌疗法，则仅报告CTX110有关的SAE、CTX110有关的AESI和新发恶性肿瘤。如果受试者在入选后未接受CTX110疗法，则AE报告周期在最后一次研究有关的程序(例如，活检、成像、LD化疗)后30天结束。
8.7疾病进展
疾病进展及疾病进展的体征和症状不应报告为AE，以下例外：
正在研究的恶性肿瘤的非典型或加速进展，在其特性、表现或严重程度方面不同于疾病的正常过程，症状符合严重标准。在这种情况下，基础病状恶化应报告为SAE。
无论与CTX110的关系如何，研究剂量30天内具有死亡结局的疾病进展均应记录为SAE并按章节报告。
8.8.终止
如果发生以下事件中的一个或多个，则可延迟、暂停或终止治疗：
·可归因于CTX110的危及生命(4级)的毒性，难以管理，非预期并且与LD化疗无关
·输注后30天内与CTX110有关的死亡
·在开始任何新的抗癌疗法(包括HSCT)之前接受＞7×104个TCR+细胞/kg的受试者中＞2级GvHD
·在至少12名受试者入选队列扩展并且发生以下情况中的至少1种之后：
○＞35％3级或4级神经毒性，在2周内未消退至≤2级
○＞20％≥2级GvHD，是类固醇难治性的。
○＞30％4级CRS
·新发恶性肿瘤(与先前治疗的恶性肿瘤复发/进展不同)
·缺乏功效，定义为队列扩展中的15名受试者进行3个月的CTX1 10后评估之后，有2项或更少的客观反应(按照中心审查)。
·在连续的研究有关的治疗或随访期间会将受试者置于风险中的任何医学病状
9.统计方法
9.1研究目标和假设
A部分的主要目标是评估递增剂量的CTX1 10在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的安全性，以确定推荐的B部分剂量。
B部分的主要目标是评估CTX110在患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的受试者中的功效，如通过客观反应率所测量。
92研究终点
9.2.1主要终点
所有队列的剂量递增：不良事件发生率，定义为每个队列的剂量限制性毒性
队列扩展：按照恶性淋巴瘤的Lugano反应标准，通过独立中心审查确定的客观反应率(CR+PR)(Cheson等人，2014)
9.2.2.剂量递增和队列扩展的次要功效终点
将仅对发生客观反应事件的受试者报告反应/缓解持续时间。这要使用第一次客观反应与第一次客观反应后由于任何原因导致的第一次疾病进展或死亡之间间隔的时间来评估。自第一次客观反应以来尚未进展且在数据截止日期仍在研究中的受试者将在其最后评估日期进行检查。
临床受益持续时间(DOCB)按照第一次客观反应与最后一次疾病进展或死亡之间间隔的时间来计算。尚未进展且在数据截止日期仍在研究中的受试者将在其最后评估日期进行检查。
无治疗失败的生存期(TFFS)按照第一次CTX1 10输注与由于任何原因引起的最后一次疾病进展或死亡之间间隔的时间来计算。尚未进展且在数据截止日期仍在研究中的受试者在其最后评估日期进行检查。
总生存期按照第一剂量的CTX1 10的日期与由于任何原因引起的死亡之间间隔的时间来计算。在数据截止日期活着的受试者在其已知活着的最后日期进行检查。
9.2.3.次要安全性终点
除CRS(Lee和ASTCT标准)、神经毒性(ICANS和CTCAE v5.0)和GvHD(西奈山急性GVHD国际联盟[MAGIC]标准)外，将根据CTCAE 5.0版汇总和报告AE和有临床意义的实验室异常的频率和严重程度。
9.2.4.药代动力学
药代动力学数据将包括通过测量CAR构建体的拷贝数的PCR测定评估的血液中CTX110随时间的水平。对血液中CTX1 10的分析也可以使用检测细胞表面上CAR蛋白的流式细胞术进行。此类分析可用于证实血液中CTX110的存在并进一步表征其他细胞免疫表型。
9.2.5.患者报告的次要结局终点
与CTX110相关的PRO随时间的变化将如本文对于各队列中受试者施用的PRO调查所公开的那样进行评价和分析。
9.2.6.剂量递增和队列扩展的探索性终点
·组织中CTX110的水平(可以评价按照方案特定取样收集的任何样品中骨髓、CSF和/或肿瘤组织中CTX110的运输)
·血液和其他组织中的细胞因子水平
·抗CTX110抗体的发生率
·B细胞和免疫球蛋白随时间的水平
·抗细胞因子疗法对CTX110增殖、CRS和反应的影响
·CTX110疗法后自体或同种异体HSCT的发生率
·后续抗癌疗法的发生率和类型
·完全反应/缓解的时间，定义为第一次CTX110输注日期至第一次记录的完全反应之间的时间
·第一次后续无治疗生存期，定义为第一次CTX110输注日期与由于任何原因导致的第一次后续治疗或死亡的日期之间的时间
·其他基因组、蛋白质组、代谢或药效学终点
9.3分析集合
将对以下分析集合进行评价，并用于数据呈现。
A部分(剂量递增)
DLT可评价集合(DES)：接受CTX110并完成DLT评价期或在经历DLT后早期停止的所有受试者。DLT评价期从第一次CTX110输注开始并持续28天。DES用于确定推荐的B部分剂量。
部分A+部分B(剂量递增+队列扩展)
入选集合：所有入选研究的受试者。将根据指定的CTX110剂量水平对入选集合进行分类。
治疗集合：研究中接受任何研究治疗的所有受试者。治疗集合中的受试者将根据接受的研究治疗进行分类。
修改意向治疗的集合(mITT)：接受CTX110输注的所有受试者。将根据指定的CTX110剂量水平对mITT中的受试者进行分类。mITT将是用于临床活动评估的初步分析集合。
安全性分析集合(SAS)：接受CTX110输注的所有受试者。将根据接受的CTX110剂量水平对SAS中的受试者进行分类。SAS将是用于表征CTX110安全性的初步分析集合。
9.4.中期分析
9.4.1.功效中期分析
一项早期功效和无效性的中期分析将由独立统计员进行，并由DSMB进行审查。中期分析将在NHL扩展队列的富集子集中计划的77名受试者中的38名(50％)已入选B部分并具有3个月的可评价肿瘤反应数据或早前已经终止时进行。
根据Lan-Demets(Lan和Demets，1983)的α-消耗函数将用于在中期分析中构建O’Brien-Fleming类型的功效边界。基于α-消耗函数的这种选择，如果对38名受试者(77名的50％)进行中期分析，ORR的双侧99.26％精确置信区间的下界将需要大于26％，以说明统计学显著性。因此，在中期分析时将需要至少19/38＝50％的ORR以声明早期功效。早期功效的证明可用于支持监管互动和/或出版物。在初步分析中，当对富集子集中的76名受试者进行治疗并随访至少3个月时，相应地将使用双侧95.14％的精确置信区间，要求ORR为至少29/76＝38％以声明成功。
对于无效性，如果在中期分析时这38名受试者中最多有10名受试者实现客观反应，则NHL受试者的入选将停止。基于成功概率的无信息先验，如果在中期分析时39名受试者中不超过10名实现客观反应，则在最终分析时76名受试者中有至少29名反应者的贝叶斯预测概率小于5％。如果在第39名受试者入选时有至少11名反应者(基于中心成像审查)，则不会暂停筛选和入选，因为将符合继续入选的最低标准。如果对CTX110的真实反应率与护理标准无差异，则在该分析时因无效而停止的可能性为60.1％。
95计划分析方法
在研究B部分FAS中的所有受试者在CTX1 10输注后3个月有机会评估反应之后进行功效的初步分析。当所有受试者完成或退出研究时，将进行最终分析。
为适当的处置、人口统计学、基线、功效和安全性参数制作表格。除非另有说明，否则将为所有数据提供按受试者的列表。
9.5.1.功效分析
所有分析(中期分析和初步分析)的ORR主要终点将基于FAS中疾病评估的独立中心审查。分层测试将首先以在扩展队列的富集子集中测试的零假设进行，接着如果零假设在第一步被拒绝，则在整个扩展队列中进行测试。
可以进行ORR的灵敏度分析。对于NHL，使用Lugano反应标准(Cheson等人，2014)并且ORR是指CR+PR的比率(表13和表14)。
客观反应率汇总为精确95％置信区间的比例。对于事件发生时间变量，诸如DOR、DOCB、TFFS和总生存率，将使用Kaplan-Meier法计算95％置信区间的中位数。
9.5.2.安全性分析
安全性分析集合中包括接受CTX110、LD化疗和/或达雷木单抗的所有受试者。将根据CTCAE第5版对临床AE进行分级，以下除外：CRS，将根据Lee标准和(Lee等人，2019)进行分级；神经毒性，将根据ICANS(Lee等人，2019)和CTCAE进行分级；以及GvHD，将根据MAGIC标准(Harris等人，2016)进行分级。根据表31中的间隔汇总和报告AE、SAE和AESI，其中描述了按研究时间段进行的AE收集。
治疗紧急不良事件定义为在初始CTX110输注时或之后开始或恶化的AE。使用描述性统计汇总生命体征。经历至少1个AE的受试者的频率将按身体系统和根据MedDRA术语的首选术语进行报告。对每个AE收集的详细信息将包括事件的描述、持续时间、AE是否严重、强度、与研究药物的关系、采取的措施、临床结局以及是否为DLT。分析的重点放在归类为剂量限制性的AE上。
9.5.3.药代动力学和药效学分析
将汇总抗CTX110抗体的发生率、血液中CTX110 CAR+T细胞的水平及血清中细胞因子的水平。
9.5.4.生物标志物分析
对另外的生物标志物的研究可以包括血细胞、肿瘤细胞和其他受试者来源的组织的评估。这些评估可以评价DNA、RNA、蛋白质和其他源自这些组织的生物分子。此类评价将告知对与受试者对CTX110的反应有关的因素以及研究产品的作用机制的的了解。
结果
患者已入选本研究并且全部已经接受CTX110。剂量递增以3千万CAR阳性T细胞(剂量水平1或DL1)开始，并且以大约2倍或3倍的增量递增到6亿CAR阳性T细胞的最高剂量，其为剂量水平4(DL4)。剂量水平，参见上表16。
下面提供了26名患者在≥28天随访期内的额外功效和安全性结果。其中，3名患者接受DL1剂量，3名患者接受DL2剂量，6名患者接受DL3剂量，6名患者接受DL3.5剂量，和8名患者接受DL4剂量。所有这些患者患有大B细胞淋巴瘤(例如，DLBCLNOS、高级别淋巴瘤(例如，三重命中)或转化滤池性淋巴瘤)并且具有有显著基线肿瘤体积的高疾病负担。这些患者全部是复发性和难治性患者，包括对任何抗癌疗法没有既往反应的原发性难治性患者。患者具有快速进行性疾病史，包括31％已经通过2个或更多个线数的疗法并且在其第一次淋巴瘤治疗的9个月内接受了CTX110的患者。
下文表32中提供了26名患者的基线患者特征：
表32.基线患者特征
N(％)(除非另有说明)
(1)包括DLBCL NOS、高级别淋巴瘤(例如，三重命中)，转化滤泡性淋巴瘤(tFL)和Richter转化；
(2)定义为对于任何线的既往抗癌疗法，从未实现部分反应或更好
参与本研究的所有患者均已在14天内完成了第1阶段(资格筛选)，有至少一名受试者在2天内完成第1阶段。至少一名符合资格标准的受试者在完成第1阶段后的24小时内开始淋巴细胞清除疗法。
所有符合条件的受试者均已完成筛选期(第1阶段)并在不到15天内接受LD化疗，有至少一名患者完成筛选并在72小时内开始LD化疗剂量。所有患者在入选的中位数2天内开始LD化疗。
接受LD化疗的所有受试者在LD化疗完成后2-7天内进展为接受CTX110。下面汇总了迄今为止从这些患者获得的结果。
功效
对治疗实现完全反应的患者百分比随着剂量的增加而增加。参见下表33。用CTX110治疗的患者中的肿瘤减小水平也参见图22。
表33.依据2014Lugano标准，第一CTX110剂量后的D28反应
对于接受剂量DL2或更高剂量的患者，约60％显示总体反应(ORR)并且40％左右显示完全反应(CR)。在6个月时完全反应的所有患者至今仍然活着，没有疾病的影像学证据，没有接受除CTX110之外的任何其他全身癌症治疗。
在一个实例中，患有DLBCL且在包括自体SCT在内的两个线数的既往疗法之后复发的女性患者正在用CTX110以DL3治疗并且在单次剂量后第28天显示出完全反应而无可见肿瘤。完全反应在12+个月时持续。该患者在输注CTX110后未显示出发热、CRS或ICANS。
安全性
还发现CTX1 10在所有剂量水平都良好耐受。参见下表34。
表34.接受CTX110的患者的安全性
(1)按照ASTCT标准进行分级；按照CTCAE进行分级的其他AE；
(2)免疫效应细胞相关神经毒性综合征；
(3)包括所有感染(细菌、真菌和病毒)
CTX110输注后的严重不良事件(SAE)与治疗的患者中的疾病进展无关：ICANS(N＝1)，CRS(N＝1)，眶周蜂窝织炎(N＝1)，发热性中性粒细胞减少症(N＝1)。
下面提供了安全性结果汇总(包括再次给药的患者)
·无GvHD
·无超过2级的CRS，仅一例ICANS超过2级
·低感染率
·仅2名患者显示出由于HHV6感染所致的病毒性脑炎和假单胞菌性脓毒症，在4天内消退
研究了CTX110的药代动力学特征。对于接受DL2及以上的患者，在所有患者中在多个时间点检测CAR-T细胞。在输注后八天左右，在外周血中观察到一致的峰扩展。在再次给药的患者中观察到类似的扩展。在许多患者中，外周血组中的CTX110水平到3-4周下降到用ddPCR的检测下限。参见图23。
CTX110的药代动力学特征支持在一个月左右使用巩固剂量的CTX110(参见，例如上文的队列A或队列B)。例如，CTX110显示出明显的剂量反应，用更高的效应物：靶标(E：T)比率实现更好的反应。图24A和图24B。因此，巩固具有以有利的E：T比率产生第2轮肿瘤杀伤的潜力以增加深度持久反应。
再次给药
至少三名受试者已经以DL3用第二剂量的CTX110再次给药。一名受试者患有DLBCL并且最初以DL2治疗，并实现CR。受试者在初始CTX110输注后大约6个月经历进行性疾病，并以DL3再次给药。受试者在第二剂量之前接受标准的淋巴细胞清除化疗(例如，氟达拉滨和环磷酰胺)。在第二剂量后通过PET/CT确认，受试者实现PR。第二名受试者在第28天也实现PR。用第一或第二剂量均未观察到发热、CRS、ICANS或GvHD。这些结果证明可以安全地施用附加剂量的CTX110并且可以产生临床反应。
一名患有IV期DLBCL(NOS)且对两个线数的既往疗法(R-CHOP、R-GDP)都是难治性的男性患者以DL2接受第一次CTX110输注，并在第28天实现CR，但在约7个月时进展。患者以DL3接受第2次CTX110输注并且在第28天实现CR。患者至今仍处于完全反应中。未观察到CRS、ICANS或其他特别感兴趣的对任一输注的不良事件。
结论
总的来说，涉及CTX110的该临床试验的结果提供了剂量反应的早期证据。
24名患有DLBCL患者的数据显示：(a)意向治疗(ITT)功效(例如，ORR、CR和6个月CR)优于或类似于批准的自体CAR-T疗法(包括知/>)；和(b)有区别的安全性，与批准的自体CAR-T疗法相比，3+级和总体CRS、ICANS和感染率低得多。
在不使用毒性更大的淋巴细胞清除剂的情况下实现反应，这与CTX110经工程化用于免疫逃避一致。所有入选患者均进行快速治疗-无需桥接化疗或存在制造失败的风险。在由不同供体制造的多个产品批次中看到反应。这些结果验证了如本文公开的CRISPR编辑的同种异体CAR-T方法。
序列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
*指示具有2’-O甲基硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
“n”是指5’末端处的间隔区序列。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以组合成任何组合。本说明书中公开的每个特征可以由起到相同、等效或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是一系列等效或类似特征的实例。
通过以上的说明，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明作不同变化和变更，以使它适应不同用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求范围内。
等效内容
虽然本文已经描述和说明了若干发明性实施方案，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且每个这样的变型和/或修改都被认为是在本文描述的发明实施方案的范围内。更一般地说，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料以及配置意味着为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于发明传授内容所用于的一种或多种具体应用。本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确认本文描述的具体发明实施方案的许多等效内容。因此，应了解，前述实施方案是仅借助于实例来呈现，并且在所附权利要求书和其等效内容的范围内，发明实施方案可以按与具体地描述和要求不同的方式实践。本公开的发明实施方案涉及本文描述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并无相互不一致，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本公开的发明范围内。
如本文限定并使用的所有定义应当被理解成凌驾于所限定术语的字典定义、通过引用而并入的文件中的定义、和/或一般含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请通过关于所引用的每一个的主题的引用并入，在一些情况下可以涵盖整个文档。
除非明确指出相反，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个(种)”应理解为意指“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求中所用，短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即在某些情况下结合地存在且在其他情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应当以相同的方式来解释，即，这样结合的要素中的“一个或多个”。除了用“和/或”分句明确标识的要素之外，不管与明确标识的那些要素相关还是无关，其他要素可以任选存在。因此，作为非限制性实例，连同开放式语言如“包含”使用时，提到“A和/或B”在一个实施方案中可以仅指A(任选包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选包括除A以外的要素)；再一个实施方案中，指A和B(任选包括其他要素)；等等。
在说明书中和在权利要求中，如本文使用的“或”应理解为具有与如以上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔一个清单中的项目时，“或”或“和/或”应当解释为包容性的，即，包括多个要素或要素清单中的至少一个，而且包括其中的多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。仅相反地清楚指示的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”，或者当用于权利要求中时，“由……组成”将指恰好包括一些或一列要素中的一个要素。总体而言，如本文使用的术语“或”当前面加有排他性的术语，诸如“任何一个”、“……中一个”、“……中仅一个”或“……中只有一个”时，应当仅解释为指示排他性的替代形式(即，“一个或另一个，但非两者”)。“主要由……组成”当用于权利要求中时，应具有如在专利法领域中所用的其普通含义。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可意指在可接受的标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多±20％，优选至多±10％，更优选至多±5％，且更优选至多±1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程而言，该术语可以意指在数值的一个数量级内，优选在2倍内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的并且在该上下文中意指在特定值的可接受误差范围内。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应该理解为意指选自该要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括该要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个并且不排除该要素列表中的要素的任何组合。这一定义还允许，可以任选地存在除该短语“至少一个”所指要素清单内具体地鉴别出的要素外的要素，无论是与具体地鉴别出的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个(任选包括多于一个)A，不存在B(并且任选包括除了B以外的要素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选包括多于一个)B，不存在A(并且任选包括除了A以外的要素)；再一个实施方案中指至少一个(任选包括多于一个)A和至少一个(任选包括多于一个)B(并且任选包括其他要素)；等等。
还应该理解的是，除非明确指出相反，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不一定限于叙述该方法的步骤或操作的顺序。
序列表
<110> 克里斯珀医疗股份公司
<120> 使用靶向CD19的基因工程化T细胞的B细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法
<130> 095136-0382-038WO1
<140> 尚未分配
<141> 同时随函附上
<150> US 63/094,252
<151> 2020-10-20
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 1
aagagcaaca aatctgact 19
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 2
aagagcaaca gtgctgtgcc tggagcaaca aatctgacta agagcaacaa atctgact 58
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 3
aagagcaaca gtgctggagc aacaaatctg actaagagca acaaatctga ct 52
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 4
aagagcaaca gtgcctggag caacaaatct gactaagagc aacaaatctg act 53
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 5
aagagcaaca gtgctgacta agagcaacaa atctgact 38
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 6
aagagcaaca gtgctgtggg cctggagcaa caaatctgac taagagcaac aaatctgact 60
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 7
aagagcaaca gtgctggcct ggagcaacaa atctgactaa gagcaacaaa tctgact 57
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 8
aagagcaaca gtgctgtgtg cctggagcaa caaatctgac taagagcaac aaatctgact 60
<210> 9
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 9
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgcc tggaggctat ccagcgtgag 60
tctctcctac cctcccgct 79
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 10
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttcgcct ggaggctatc cagcgtgagt 60
ctctcctacc ctcccgct 78
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga ggctatccag cgtgagtctc 60
tcctaccctc ccgct 75
<210> 12
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 12
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgga tagcctggag gctatccagc 60
gtgagtctct cctaccctcc cgct 84
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 13
cgtggcctta gctgtgctcg cgctatccag cgtgagtctc tcctaccctc ccgct 55
<210> 14
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 14
cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc tctttctgtg gcctggaggc tatccagcgt 60
gagtctctcc taccctcccg ct 82
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n为a、c、g或u
<400> 15
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 16
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n为a、c、g或u
<400> 16
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 17
<211> 114
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> n为a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(30)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (108)..(114)
<223> 可能不存在
<400> 17
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau 60
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 114
<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 18
agagcaacag ugcuguggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 19
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gcuacucucu cuuucuggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 21
gcuacucucu cuuucuggcc 20
<210> 22
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<400> 22
agagcaacag ugcuguggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<400> 23
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 24
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<400> 24
gcuacucucu cuuucuggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 经2’-O-甲基硫代磷酸酯修饰
<400> 25
gcuacucucu cuuucuggcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 26
agagcaacag tgctgtggcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 27
gctactctct ctttctggcc 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
agagcaacag tgctgtggcc tgg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gctactctct ctttctggcc tgg 23
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 32
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
20
<210> 33
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 34
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
tcaaagcgga gtaggttgtt gcattccgat tacatgaata tgactcctcg ccggcctggg 60
ccgacaagaa aacattacca accctatgcc cccccacgag acttcgctgc gtacaggtcc 120
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
cgagtgaagt tttcccgaag cgcagacgct ccggcatatc agcaaggaca gaatcagctg 60
tataacgaac tgaatttggg acgccgcgag gagtatgacg tgcttgataa acgccggggg 120
agagacccgg aaatgggggg taaaccccga agaaagaatc cccaagaagg actctacaat 180
gaactccaga aggataagat ggcggaggcc tactcagaaa taggtatgaa gggcgaacga 240
cgacggggaa aaggtcacga tggcctctac caagggttga gtacggcaac caaagatacg 300
tacgatgcac tgcatatgca ggccctgcct cccaga 336
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
atgcttcttt tggttacgtc tctgttgctt tgcgaacttc ctcatccagc gttcttgctg 60
atccccgata ttcagatgac tcagaccacc agtagcttgt ctgcctcact gggagaccga 120
gtaacaatct cctgcagggc aagtcaagac attagcaaat acctcaattg gtaccagcag 180
aagcccgacg gaacggtaaa actcctcatc tatcatacgt caaggttgca ttccggagta 240
ccgtcacgat tttcaggttc tgggagcgga actgactatt ccttgactat ttcaaacctc 300
gagcaggagg acattgcgac atatttttgt caacaaggta ataccctccc ttacactttc 360
ggaggaggaa ccaaactcga aattaccggg tccaccagtg gctctgggaa gcctggcagt 420
ggagaaggtt ccactaaagg cgaggtgaag ctccaggaga gcggccccgg tctcgttgcc 480
cccagtcaaa gcctctctgt aacgtgcaca gtgagtggtg tatcattgcc tgattatggc 540
gtctcctgga taaggcagcc cccgcgaaag ggtcttgaat ggcttggggt aatatggggc 600
tcagagacaa cgtattataa ctccgctctc aaaagtcgct tgacgataat aaaagataac 660
tccaagagtc aagttttcct taaaatgaac agtttgcaga ctgacgatac cgctatatat 720
tattgtgcta aacattatta ctacggcggt agttacgcga tggattattg ggggcagggg 780
acttctgtca cagtcagtag tgctgctgcc tttgtcccgg tatttctccc agccaaaccg 840
accacgactc ccgccccgcg ccctccgaca cccgctccca ccatcgcctc tcaacctctt 900
agtcttcgcc ccgaggcatg ccgacccgcc gccgggggtg ctgttcatac gaggggcttg 960
gacttcgctt gtgatattta catttgggct ccgttggcgg gtacgtgcgg cgtccttttg 1020
ttgtcactcg ttattacttt gtattgtaat cacaggaatc gctcaaagcg gagtaggttg 1080
ttgcattccg attacatgaa tatgactcct cgccggcctg ggccgacaag aaaacattac 1140
caaccctatg cccccccacg agacttcgct gcgtacaggt cccgagtgaa gttttcccga 1200
agcgcagacg ctccggcata tcagcaagga cagaatcagc tgtataacga actgaatttg 1260
ggacgccgcg aggagtatga cgtgcttgat aaacgccggg ggagagaccc ggaaatgggg 1320
ggtaaacccc gaagaaagaa tccccaagaa ggactctaca atgaactcca gaaggataag 1380
atggcggagg cctactcaga aataggtatg aagggcgaac gacgacgggg aaaaggtcac 1440
gatggcctct accaagggtt gagtacggca accaaagata cgtacgatgc actgcatatg 1500
caggccctgc ctcccaga 1518
<210> 40
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 41
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60
gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120
tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180
ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240
ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300
gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360
ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420
agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480
atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540
tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600
gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660
gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720
aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780
catgaggtct atggacttca 800
<210> 42
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 42
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 60
gacaccttct tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt 120
gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg 180
attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga 240
gccttgttct ggcagtccag agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca 300
ggagagggca cgtggcccag cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg 360
ctcagactgt ttgcccctta ctgctcttct aggcctcatt ctaagcccct tctccaagtt 420
gcctctcctt atttctccct gtctgccaaa aaatctttcc cagctcacta agtcagtctc 480
acgcagtcac tcattaaccc accaatcact gattgtgccg gcacatgaat gcaccaggtg 540
ttgaagtgga ggaattaaaa agtcagatga ggggtgtgcc cagaggaagc accattctag 600
ttgggggagc ccatctgtca gctgggaaaa gtccaaataa cttcagattg gaatgtgttt 660
taactcaggg ttgagaaaac agctaccttc aggacaaaag tcagggaagg gctctctgaa 720
gaaatgctac ttgaagatac cagccctacc aagggcaggg agaggaccct atagaggcct 780
gggacaggag ctcaatgaga aagg 804
<210> 43
<211> 1178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360
agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600
cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900
cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960
agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020
agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080
tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140
tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178
<210> 44
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
atgcttcttt tggttacgtc tctgttgctt tgcgaacttc ctcatccagc gttcttgctg 60
atcccc 66
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 46
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 46
gatattcaga tgactcagac caccagtagc ttgtctgcct cactgggaga ccgagtaaca 60
atctcctgca gggcaagtca agacattagc aaatacctca attggtacca gcagaagccc 120
gacggaacgg taaaactcct catctatcat acgtcaaggt tgcattccgg agtaccgtca 180
cgattttcag gttctgggag cggaactgac tattccttga ctatttcaaa cctcgagcag 240
gaggacattg cgacatattt ttgtcaacaa ggtaataccc tcccttacac tttcggagga 300
ggaaccaaac tcgaaattac cgggtccacc agtggctctg ggaagcctgg cagtggagaa 360
ggttccacta aaggcgaggt gaagctccag gagagcggcc ccggtctcgt tgcccccagt 420
caaagcctct ctgtaacgtg cacagtgagt ggtgtatcat tgcctgatta tggcgtctcc 480
tggataaggc agcccccgcg aaagggtctt gaatggcttg gggtaatatg gggctcagag 540
acaacgtatt ataactccgc tctcaaaagt cgcttgacga taataaaaga taactccaag 600
agtcaagttt tccttaaaat gaacagtttg cagactgacg ataccgctat atattattgt 660
gctaaacatt attactacgg cggtagttac gcgatggatt attgggggca ggggacttct 720
gtcacagtca gtagt 735
<210> 47
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 48
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gctgctgcct ttgtcccggt atttctccca gccaaaccga ccacgactcc cgccccgcgc 60
cctccgacac ccgctcccac catcgcctct caacctctta gtcttcgccc cgaggcatgc 120
cgacccgccg ccgggggtgc tgttcatacg aggggcttgg acttcgcttg tgatatttac 180
atttgggctc cgttggcggg tacgtgcggc gtccttttgt tgtcactcgt tattactttg 240
tattgtaatc acaggaatcg c 261
<210> 49
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 49
tttgtcccgg tatttctccc agccaaaccg accacgactc ccgccccgcg ccctccgaca 60
cccgctccca ccatcgcctc tcaacctctt agtcttcgcc ccgaggcatg ccgacccgcc 120
gccgggggtg ctgttcatac gaggggcttg gacttcgctt gtgatattta catttgggct 180
ccgttggcgg gtacgtgcgg cgtccttttg ttgtcactcg ttattacttt gtattgtaat 240
cacaggaatc gc 252
<210> 50
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn Arg
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 54
<211> 4358
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 54
gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60
gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120
tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180
ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240
ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300
gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360
ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420
agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480
atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540
tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600
gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660
gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720
aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780
catgaggtct atggacttca ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 840
cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc 900
gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 960
gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 1020
ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 1080
gcccttgcgt gccttgaatt acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct 1140
tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg 1200
tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct 1260
tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc 1320
tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg 1380
tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc 1440
ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg 1500
ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag 1560
gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc 1620
agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca 1680
aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc 1740
gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg 1800
ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc 1860
agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt 1920
cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgacc 1980
accatgcttc ttttggttac gtctctgttg ctttgcgaac ttcctcatcc agcgttcttg 2040
ctgatccccg atattcagat gactcagacc accagtagct tgtctgcctc actgggagac 2100
cgagtaacaa tctcctgcag ggcaagtcaa gacattagca aatacctcaa ttggtaccag 2160
cagaagcccg acggaacggt aaaactcctc atctatcata cgtcaaggtt gcattccgga 2220
gtaccgtcac gattttcagg ttctgggagc ggaactgact attccttgac tatttcaaac 2280
ctcgagcagg aggacattgc gacatatttt tgtcaacaag gtaataccct cccttacact 2340
ttcggaggag gaaccaaact cgaaattacc gggtccacca gtggctctgg gaagcctggc 2400
agtggagaag gttccactaa aggcgaggtg aagctccagg agagcggccc cggtctcgtt 2460
gcccccagtc aaagcctctc tgtaacgtgc acagtgagtg gtgtatcatt gcctgattat 2520
ggcgtctcct ggataaggca gcccccgcga aagggtcttg aatggcttgg ggtaatatgg 2580
ggctcagaga caacgtatta taactccgct ctcaaaagtc gcttgacgat aataaaagat 2640
aactccaaga gtcaagtttt ccttaaaatg aacagtttgc agactgacga taccgctata 2700
tattattgtg ctaaacatta ttactacggc ggtagttacg cgatggatta ttgggggcag 2760
gggacttctg tcacagtcag tagtgctgct gcctttgtcc cggtatttct cccagccaaa 2820
ccgaccacga ctcccgcccc gcgccctccg acacccgctc ccaccatcgc ctctcaacct 2880
cttagtcttc gccccgaggc atgccgaccc gccgccgggg gtgctgttca tacgaggggc 2940
ttggacttcg cttgtgatat ttacatttgg gctccgttgg cgggtacgtg cggcgtcctt 3000
ttgttgtcac tcgttattac tttgtattgt aatcacagga atcgctcaaa gcggagtagg 3060
ttgttgcatt ccgattacat gaatatgact cctcgccggc ctgggccgac aagaaaacat 3120
taccaaccct atgccccccc acgagacttc gctgcgtaca ggtcccgagt gaagttttcc 3180
cgaagcgcag acgctccggc atatcagcaa ggacagaatc agctgtataa cgaactgaat 3240
ttgggacgcc gcgaggagta tgacgtgctt gataaacgcc gggggagaga cccggaaatg 3300
gggggtaaac cccgaagaaa gaatccccaa gaaggactct acaatgaact ccagaaggat 3360
aagatggcgg aggcctactc agaaataggt atgaagggcg aacgacgacg gggaaaaggt 3420
cacgatggcc tctaccaagg gttgagtacg gcaaccaaag atacgtacga tgcactgcat 3480
atgcaggccc tgcctcccag ataataataa aatcgctatc catcgaagat ggatgtgtgt 3540
tggttttttg tgtgtggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca 3600
gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg 3660
caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt 3720
ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta 3780
ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg 3840
aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg 3900
cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc ttctaggcct cattctaagc 3960
cccttctcca agttgcctct ccttatttct ccctgtctgc caaaaaatct ttcccagctc 4020
actaagtcag tctcacgcag tcactcatta acccaccaat cactgattgt gccggcacat 4080
gaatgcacca ggtgttgaag tggaggaatt aaaaagtcag atgaggggtg tgcccagagg 4140
aagcaccatt ctagttgggg gagcccatct gtcagctggg aaaagtccaa ataacttcag 4200
attggaatgt gttttaactc agggttgaga aaacagctac cttcaggaca aaagtcaggg 4260
aagggctctc tgaagaaatg ctacttgaag ataccagccc taccaagggc agggagagga 4320
ccctatagag gcctgggaca ggagctcaat gagaaagg 4358
<210> 55
<211> 1368
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 56
<211> 4682
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 56
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgagatg taaggagctg ctgtgacttg ctcaaggcct 180
tatatcgagt aaacggtagt gctggggctt agacgcaggt gttctgattt atagttcaaa 240
acctctatca atgagagagc aatctcctgg taatgtgata gatttcccaa cttaatgcca 300
acataccata aacctcccat tctgctaatg cccagcctaa gttggggaga ccactccaga 360
ttccaagatg tacagtttgc tttgctgggc ctttttccca tgcctgcctt tactctgcca 420
gagttatatt gctggggttt tgaagaagat cctattaaat aaaagaataa gcagtattat 480
taagtagccc tgcatttcag gtttccttga gtggcaggcc aggcctggcc gtgaacgttc 540
actgaaatca tggcctcttg gccaagattg atagcttgtg cctgtccctg agtcccagtc 600
catcacgagc agctggtttc taagatgcta tttcccgtat aaagcatgag accgtgactt 660
gccagcccca cagagccccg cccttgtcca tcactggcat ctggactcca gcctgggttg 720
gggcaaagag ggaaatgaga tcatgtccta accctgatcc tcttgtccca cagatatcca 780
gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg 840
cctattcacc gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta 900
tatcacagac aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaggctcc ggtgcccgtc 960
agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt 1020
gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc 1080
tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg 1140
ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg 1200
ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc actggctgca 1260
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1320
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1380
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1440
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1500
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1560
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1620
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1680
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1740
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1800
gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1860
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1920
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1980
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 2040
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 2100
tcttccattt caggtgtcgt gaccaccatg cttcttttgg ttacgtctct gttgctttgc 2160
gaacttcctc atccagcgtt cttgctgatc cccgatattc agatgactca gaccaccagt 2220
agcttgtctg cctcactggg agaccgagta acaatctcct gcagggcaag tcaagacatt 2280
agcaaatacc tcaattggta ccagcagaag cccgacggaa cggtaaaact cctcatctat 2340
catacgtcaa ggttgcattc cggagtaccg tcacgatttt caggttctgg gagcggaact 2400
gactattcct tgactatttc aaacctcgag caggaggaca ttgcgacata tttttgtcaa 2460
caaggtaata ccctccctta cactttcgga ggaggaacca aactcgaaat taccgggtcc 2520
accagtggct ctgggaagcc tggcagtgga gaaggttcca ctaaaggcga ggtgaagctc 2580
caggagagcg gccccggtct cgttgccccc agtcaaagcc tctctgtaac gtgcacagtg 2640
agtggtgtat cattgcctga ttatggcgtc tcctggataa ggcagccccc gcgaaagggt 2700
cttgaatggc ttggggtaat atggggctca gagacaacgt attataactc cgctctcaaa 2760
agtcgcttga cgataataaa agataactcc aagagtcaag ttttccttaa aatgaacagt 2820
ttgcagactg acgataccgc tatatattat tgtgctaaac attattacta cggcggtagt 2880
tacgcgatgg attattgggg gcaggggact tctgtcacag tcagtagtgc tgctgccttt 2940
gtcccggtat ttctcccagc caaaccgacc acgactcccg ccccgcgccc tccgacaccc 3000
gctcccacca tcgcctctca acctcttagt cttcgccccg aggcatgccg acccgccgcc 3060
gggggtgctg ttcatacgag gggcttggac ttcgcttgtg atatttacat ttgggctccg 3120
ttggcgggta cgtgcggcgt ccttttgttg tcactcgtta ttactttgta ttgtaatcac 3180
aggaatcgct caaagcggag taggttgttg cattccgatt acatgaatat gactcctcgc 3240
cggcctgggc cgacaagaaa acattaccaa ccctatgccc ccccacgaga cttcgctgcg 3300
tacaggtccc gagtgaagtt ttcccgaagc gcagacgctc cggcatatca gcaaggacag 3360
aatcagctgt ataacgaact gaatttggga cgccgcgagg agtatgacgt gcttgataaa 3420
cgccggggga gagacccgga aatggggggt aaaccccgaa gaaagaatcc ccaagaagga 3480
ctctacaatg aactccagaa ggataagatg gcggaggcct actcagaaat aggtatgaag 3540
ggcgaacgac gacggggaaa aggtcacgat ggcctctacc aagggttgag tacggcaacc 3600
aaagatacgt acgatgcact gcatatgcag gccctgcctc ccagataata ataaaatcgc 3660
tatccatcga agatggatgt gtgttggttt tttgtgtgtg gagcaacaaa tctgactttg 3720
catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag 3780
gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct 3840
gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc 3900
attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc cttgttctgg cagtccagag 3960
aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga aggtggcagg agagggcacg tggcccagcc 4020
tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc tgcctttgct cagactgttt gccccttact 4080
gctcttctag gcctcattct aagccccttc tccaagttgc ctctccttat ttctccctgt 4140
ctgccaaaaa atctttccca gctcactaag tcagtctcac gcagtcactc attaacccac 4200
caatcactga ttgtgccggc acatgaatgc accaggtgtt gaagtggagg aattaaaaag 4260
tcagatgagg ggtgtgccca gaggaagcac cattctagtt gggggagccc atctgtcagc 4320
tgggaaaagt ccaaataact tcagattgga atgtgtttta actcagggtt gagaaaacag 4380
ctaccttcag gacaaaagtc agggaagggc tctctgaaga aatgctactt gaagatacca 4440
gccctaccaa gggcagggag aggaccctat agaggcctgg gacaggagct caatgagaaa 4500
ggtaaccacg tgcggaccga ggctgcagcg tcgtcctccc taggaacccc tagtgatgga 4560
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 4620
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 4680
gg 4682

Claims (62)

1.一种用于治疗人类患者的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
(i)对患有B细胞恶性肿瘤的人类患者进行淋巴细胞清除治疗；以及
(ii)在步骤(i)之后向所述人类患者施用第一剂量的基因工程化T细胞群体，其中所述基因工程化T细胞群体包括T细胞，所述T细胞包含：(a)编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，
其中所述基因工程化T细胞群体以约1.0x107至约9x108个CAR+T细胞的剂量施用于所述人类患者。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CAR包含抗CD19单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含与SEQ ID NO:51中所示的重链可变区中的重链互补决定区(CDR)相同的重链互补决定区以及与SEQ ID NO:52中所示的轻链可变区中的轻链CDR相同的轻链CDR。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体包含(b)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，和/或(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体包含(b)被破坏的T细胞受体α恒定(TRAC)基因，和(c)被破坏的β2-微球蛋白(β2M)基因。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500-750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体为约3x107、约1x108、约3x108、约4.5x108、约6x108或约9x108个CAR+T细胞。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体以约3.5x108至约9x108，任选地约3.5x108至约6x108的剂量施用于所述人类患者。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体以约4.5x108、约6x108或约7.5x108个CAR+T细胞的剂量施用于所述人类患者。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2至约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前，所述人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：
(a)临床状态显著恶化，
(b)需要补充氧气以维持大于91％的饱和度，
(c)心律失常不受控制，
(d)低血压需要血管加压药支持，
(e)活动性感染，和
(f)≥2级急性神经毒性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(i)在步骤(ii)之前约2-7天进行。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之后且在步骤(ii)之前，所述人类患者未显示出以下特征中的一种或多种：
(a)不受控制的活动性感染；
(b)与步骤(i)之前的所述临床状态相比，临床状态恶化；以及
(c)≥2级急性神经毒性。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其还包括(iii)在步骤(ii)之后监测所述人类患者的急性毒性发展；以及(iv)如果发生则管理所述急性毒性。
14.如权利要求11所述的方法，其中步骤(iii)在施用所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体后进行至少28天。
15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述急性毒性包括肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)、B细胞发育不全、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、血细胞减少症、移植物抗宿主病(GvHD)、高血压、肾功能不全、病毒性脑炎或其组合。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括任选地在所述人类患者显示出进行性疾病(PD)之后向所述人类患者施用一个或多个后续剂量的所述基因工程化T细胞群体，其中所述人类患者具有既往反应。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述人类患者在所述后续剂量的所述基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受淋巴细胞清除治疗。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述人类患者表现出显著的血细胞减少症，并且在所述后续剂量的所述基因工程化T细胞群体之前未接受淋巴细胞清除治疗。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金氏淋巴瘤，所述非霍奇金氏淋巴瘤任选地选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别淋巴别B细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤(FL)和3b级FL。
20.如权利要求19所述的方法，其中DLBCL是非特指型(NOS)的DLBCL。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述人类患者具有至少一个可测量的病变，所述病变为氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(PET)阳性。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是难治性的和/或复发性的。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述人类患者已经经历过一个或多个线数的既往抗癌疗法。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述人类患者已经经历过两个或更多个线数的既往抗癌疗法。
25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述既往抗癌疗法包括抗CD20抗体、含蒽环类药物的方案或其组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述人类患者具有难治性或复发性的转化FL，并且在转化为DLBCL后已经经历过至少一个线数的针对疾病的化疗。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是难治性的，并且所述人类患者在最后的治疗中具有进行性疾病，或在至少两个治疗周期后具有疾病稳定，其中疾病稳定的持续时间长达6个月。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述人类患者既往自体造血干细胞移植(HSCT)失败或不符合既往自体HSCT条件。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述人类患者在用所述基因工程化T细胞群体治疗后进行另外的抗癌疗法。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述人类患者具有以下特征中的一种或多种：
(a)具有美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态0或1；
(b)充分的肾功能、肝功能、心脏功能和/或肺功能；
(c)没有既往基因疗法或改良细胞疗法；
(d)没有包含抗CD19抗体的既往治疗；
(e)没有既往同种异体HSCT；
(f)没有来自脑脊液的可检测的恶性细胞；
(g)没有脑部转移；
(h)没有既往中枢神经系统病症；
(i)没有不稳定型心绞痛、心律失常和/或心肌梗死；
(j)没有不受控制的感染；
(k)没有需要免疫抑制疗法的免疫缺陷病症或自身免疫病症；以及
(l)没有受人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体为至少3x107个CAR+T细胞。
33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其中在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后约4至8周，向所述人类患者施用第二剂量的所述基因工程化T细胞群体。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述人类患者在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后至少约4周实现疾病稳定(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)。
35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述人类患者在所述第二剂量的所述基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受第二次淋巴细胞清除治疗。
36.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述人类患者表现出显著的血细胞减少症，并且在所述第二剂量的所述基因工程化T细胞群体之前未接受淋巴细胞清除治疗。
37.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约750mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
38.如权利要求31所述的方法，其中所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体为至少3x108个CAR+T细胞。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后约4至8周，向所述人类患者施用第二剂量的所述基因工程化T细胞群体。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述人类患者在所述第一剂量的所述基因工程化T细胞群体之后至少约4周实现疾病稳定(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)。
41.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述人类患者在所述第二剂量的所述基因工程化T细胞群体之前2-7天内接受第二次淋巴细胞清除治疗，并且其中所述第二次淋巴细胞清除治疗包括向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
42.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述人类患者表现出显著的血细胞减少症，并且在所述第二剂量的所述基因工程化T细胞群体之前未接受淋巴细胞清除治疗。
43.如权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述人类患者接受至少一个附加剂量的所述基因工程化T细胞群体，任选地其中所述人类患者接受淋巴细胞清除治疗，所述淋巴细胞清除治疗包括在所述附加剂量的所述基因工程化T细胞群体之前2-7天内向所述人类患者共同施用每天约30mg/m2的氟达拉滨和每天约500mg/m2的环磷酰胺，持续三天。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中每剂量施用于所述人类患者的所述基因工程化T细胞群体含有不超过7x104个TCR+T细胞/kg。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述抗CD19scFv包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
46.如权利要求45所述的方法，其中结合CD19的所述CAR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
47.如权利要求3-46中任一项所述的方法，其中将编码所述抗CD19 CAR的所述核酸插入到所述被破坏的TRAC基因中。
48.如权利要求3-47中任一项所述的方法，其中所述被破坏的TRAC基因包含含有SEQID NO:26的核苷酸序列的片段的缺失。
49.如权利要求48所述的方法，其中将编码所述抗CD19 CAR的所述核酸插入到所述被破坏的TRAC基因的缺失位点。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述被破坏的TRAC基因包含SEQ ID NO:54的核苷酸序列。
51.如权利要求3-49中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中的所述被破坏的β2M基因包含SEQ ID NO:9-14所示的所述核苷酸序列中的至少一种。
52.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体是同种异体的。
53.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少90％的所述T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。
54.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少70％的所述T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白，其中所述基因工程化T细胞群体中至少50％的所述T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白；和/或其中所述基因工程化T细胞群体中至少30％的所述T细胞表达可检测水平的所述CAR。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少99.5％的所述T细胞不表达可检测水平的TCR表面蛋白。
56.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少70％的所述T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。
57.如权利要求55所述的方法，所述基因工程化T细胞群体中至少85％的所述T细胞不表达可检测水平的B2M表面蛋白。
58.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少50％的所述T细胞表达可检测水平的所述CAR。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体中至少70％的所述T细胞表达可检测水平的所述CAR。
60.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体经由静脉输注施用于所述人类患者。
61.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述基因工程化T细胞群体悬浮在冻存溶液中。
62.一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含基因工程化T细胞群体，所述基因工程化T细胞包含编码结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述药物组合物用于如权利要求1-59中任一项所述的方法。
CN202180082222.0A 2020-10-20 2021-10-19 使用靶向cd19的基因工程化t细胞的b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法 Pending CN116685337A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/094,252 2020-10-20
US63/140,664 2021-01-22
US63/164,690 2021-03-23
US63/215,191 2021-06-25
US202163254226P 2021-10-11 2021-10-11
US63/254,226 2021-10-11
PCT/IB2021/059633 WO2022084862A1 (en) 2020-10-20 2021-10-19 Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116685337A true CN116685337A (zh) 2023-09-01

Family

ID=87781390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180082222.0A Pending CN116685337A (zh) 2020-10-20 2021-10-19 使用靶向cd19的基因工程化t细胞的b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116685337A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220387571A1 (en) Therapy for hematopoietic cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd70
US11389481B2 (en) Allogeneic cell therapy of B cell malignancies using genetically engineered T cells targeting CD19
US20230355761A1 (en) Cd70+ solid tumor therapy using genetically engineered t cells targeting cd70
US20220118019A1 (en) Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
US20220387572A1 (en) Renal cell carcinoma (rcc) therapy using genetically engineered t cells targeting cd70
US20220202859A1 (en) Cancer treatment using cd38 inhibitor and/or lenalidomide and t-cells expressing a chimeric antigen receptor
US20230220059A1 (en) Genetically engineered t cells expressing bcma-specific chimeric antigen receptors and uses thereof in cancer therapy
CN116685337A (zh) 使用靶向cd19的基因工程化t细胞的b细胞恶性肿瘤的同种异体细胞疗法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination