JP2022531185A - 遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法 - Google Patents

遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法 Download PDF

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Abstract

Ｂ細胞悪性病変を治療するのに使用される、ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子又は両方を含む、遺伝子改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，９１３号明細書の出願日の利益を主張するものであり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ヒトの悪性病変を治療するために用いられる養子Ｔ細胞治療法である。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の持続的な寛解を含む大きい臨床的成功をもたらしているものの、承認された製品は、自家性であり、患者固有の細胞の採取及び量産が必要とされる。このため、治療を待つ間に疾患進行を経験するか又は死亡する患者もいる。従って、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞治療法が依然として必要とされている。
本開示は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞、別名ＴＣ１細胞）を使用する、形質転換ＦＬ又はＤＬＢＣＬなどのＢ細胞悪性病変のための同種細胞療法の開発に少なくとも部分的に基づく。本明細書で開示される同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、本明細書で開示されるＢ細胞悪性病変を有するヒト患者において、特定の患者での完全奏効及び反応の長期持続性などの治療有効性を示した。更に、本明細書で開示される同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ヒト患者において、注入後、長期間のＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を含む所望の薬物動態特性を示した。
従って、本開示のいくつかの態様は、ヒト患者のＢ細胞悪性病変を治療するための方法を提供し、方法は、ｆ（ｉ）Ｂ細胞悪性病変を有するヒト患者にリンパ球除去治療を受けさせることと、（ｉｉ）工程（ｉ）後、遺伝子改変Ｔ細胞の集団をヒト患者に投与することとを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の約２～７日前に実施され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、同種である。
遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、（ａ）破壊されたＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子と、（ｂ）ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸であって、ＣＡＲは、配列番号５１に記載される重鎖可変領域と、配列番号５２に記載される軽鎖可変領域とを含む抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、核酸と、（ｃ）破壊されたβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子とを含むＴ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０７～約１×１０９個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与され。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０７個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約３×１０７個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約３×１０８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０９個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。いずれにせよ、ヒト患者に投与される遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、１用量あたり７×１０４個以下のＴＣＲ＋Ｔ細胞／ｋｇを含有する。
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）のリンパ球除去治療は、ヒト患者に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００～７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって同時投与することを含む。例えば、工程（ｉ）のリンパ球除去治療は、ヒト患者に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって同時投与することを含む。他の実施例では、工程（ｉ）のリンパ球除去治療は、ヒト患者に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって同時投与することを含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）前に、ヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９１％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）コントロール不良な心不整脈、（ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）後及び工程（ｉｉ）前に、ヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性のコントロール不良な感染症、（ｂ）工程（ｉ）前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。
本明細書で開示される方法のいずれも、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）後の急性毒性の発症についてヒト患者を経過観察すること、及び（ｉｖ）発生する場合に急性毒性を管理することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、遺伝子改変Ｔ細胞の集団の投与後の少なくとも２８日間にわたって実施され得る。例示的な急性毒性としては、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧症、腎不全又はこれらの組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性病変は、非ホジキンリンパ腫である。例としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ並びにＢＣＬ２及び／若しくはＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）又はグレード３ｂのＦＬが挙げられるが、それらに限定されない。場合により、ＤＬＢＣＬは、ＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性病変は、難治性及び／又は再発性である。
いくつかの実施形態では、ヒト患者は、フルオロデオキシグルコース陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有し得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、１種類以上の先行抗癌療法を受けている。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、２種類以上の先行抗癌療法を受けている。例示的な先行抗癌療法は、抗ＣＤ２０抗体治療計画、アントラサイクリン含有治療計画又はこれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施例では、ヒト患者は、難治性又は再発性の形質転換ＦＬを有し、且つＤＬＢＣＬへの形質転換後の疾患について少なくとも１種類の化学療法を受けている。他の実施例では、Ｂ細胞悪性病変は、難治性であり、及びヒト患者は、最後の治療で進行性疾患を有するか、又は最大で６ヵ月の安定疾患の期間で治療の少なくとも２つのサイクル後に安定疾患を有する。更に他の実施例では、ヒト患者は、以前の自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に失敗しているか、又は以前の自家ＨＳＣＴに不適格になっている。代わりに又は加えて、ヒト患者は、遺伝子改変Ｔ細胞の集団での治療後に追加の抗癌療法を受ける。
本明細書で開示される方法のいずれかにおいて、ヒト患者は、以下の特徴：
（ａ）米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態０又は１を有すること、
（ｂ）十分な腎臓、肝臓、心臓及び／又は肺機能、
（ｃ）以前の遺伝子療法又は改変細胞療法がないこと、
（ｄ）抗ＣＤ１９抗体を含む以前の治療がないこと、
（ｅ）以前の同種ＨＳＣＴがないこと、
（ｆ）脳脊髄液からの検出可能な悪性細胞がないこと、
（ｇ）脳転移がないこと、
（ｈ）以前の中枢神経系疾患がないこと、
（ｉ）不安定狭心症、不整脈及び／又は心筋梗塞がないこと、
（ｊ）コントロール不良な感染症がないこと、
（ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないこと、及び
（ｌ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスに感染していないこと
の１つ以上を有する。
本明細書で開示される方法のいずれかにおいて、遺伝子改変Ｔ細胞によって発現された抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含み得、この細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９のｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の欠失部位に挿入される。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。代わりに又は加えて、遺伝子改変Ｔ細胞の集団の破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。例えば、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、及び／又は遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも３０％は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも９９．５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。特定の実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも８５％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。特定の実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団のＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。
特定の実施例では、本明細書で開示される方法のいずれかに使用される遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、ＣＴＸ１１０細胞である。
本明細書で開示される方法のいずれかにおいて、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、静脈内注入を介してヒト患者に投与される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、凍結保存溶液中に懸濁され得る。
Ｂ細胞悪性病変を治療するのに使用するための薬学的組成物であって、本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の集団のいずれかを含む薬学的組成物及び本明細書で開示されるような、Ｂ細胞悪性病変を治療するのに使用される薬剤を製造するための遺伝子改変Ｔ細胞の使用も本開示の範囲内である。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が下記の説明に記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及び発明を実施するための形態におけるいくつかの実施形態並びに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
編集して８日後のヒト初代Ｔ細胞、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）の一連のフローサイトメトリープロットである。グラフは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの表面発現が減少したことを示す。ＴＣＲ／ＭＨＣ Ｉダブルノックアウト細胞は、高レベルのＣＡＲ導入遺伝子を発現する（下段パネル）。精製ビーズによるＴＣ１細胞の負の選択により、ＴＣＲ陽性細胞の減少がもたらされる（右のパネル）。 ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）における、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ座位で達成された高い編集比率を表すグラフである。遺伝子編集の機能的生成物であるＴＣＲ及びＭＨＣＩの表面発現を測定し、ｙ軸を編集割合としてプロットした。ＴＲＡＣ座位からＣＡＲの高効率（例えば、５０％超）な部位特異的な組み込み及び発現が検出された。これらのデータは、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生成効率が５０％超であることを立証するものである。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）処置後のＮＯＧラージマウスにおいて腫瘍体積（ｍｍ３）が統計的に有意に減少した（ｐ＝０．００７）ことを示すグラフである。 ＴＣ１細胞で処置したＮＯＧラージマウスの生存期間が、処置を受けなかったＮＯＧラージマウスと比較して増加したことを示す生存曲線グラフである。 ４日目にＴＣ１細胞で処置したＮＯＧラージマウスの生存期間が、１日目の処置を受けなかった対照マウスと比較して増加したことを示す生存曲線グラフである。 マウスにおけるＴＣ１細胞の持続性及び抗腫瘍活性を示す図が含まれる。図６Ａは、ＴＣ１細胞がＮＯＧラージマウスで持続していることを示す一連のフローサイトメトリーのプロットである。図６Ｂは、ＴＣ１で処置したＮＯＧラージマウスにおいて、対照（処置しなかったＮＯＧラージマウス又はＮＯＧマウス）と比較して、ＴＣ１細胞が脾臓ラージ細胞を選択的に根絶したことを示すグラフである。この効果は、ＴＣ１で処置したＮＯＧラージマウスの脾臓重量が対照と比較して減少したこととして示されている。 持続性の脾臓ＴＣ１細胞が、ＴＣ１で処置された独立した２匹のＮＯＧラージマウスにおいて編集されていることを示す一連のフローサイトメトリーのプロットである。 ４日目にＴＣ１細胞で処置したＮＯＧ Ｎａｌｍ６マウスの生存期間が、１日目の処置を受けなかった対照マウスと比較して増加したことを示すカプランマイヤー生存期間のプロットである。 異なる濃度のＴＣ１で処置した後の播種性Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）を有するマウスの生存期間が、処置を受けなかった対照マウスと比較して増加したことを示すカプランマイヤー生存期間のプロットである。 ＴＣ１細胞処置後の播種性Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞の増殖を統計的に有意に阻害したことを示すグラフである。 放射線照射後にＴＣ１細胞若しくは様々な対照細胞（ＰＢＭＣ若しくは電気穿孔された（ＥＰ）Ｔ細胞）で処置した健康なマウス又は放射線照射のみを受けたマウス（「ＲＴのみ」）のカプランマイヤー生存期間のプロットである。 図１８で処置したマウスの体重変化率を示すグラフである。 放射線照射後にＴＣ１細胞若しくは未編集のＴ細胞を低用量（２×１０７個）若しくは高用量（４×１０７個）で処置した健康なマウス又は放射線照射のみを受けたマウス（「ビヒクル－ＲＴ」）のカプランマイヤー生存期間のプロットである。 放射線を照射せず、且つ細胞を投与しなかったマウス（「ビヒクル－ＲＴなし」）に加えて、図２０で処置したマウスの体重変化率を示すグラフである。 異なる６人のドナーに由来する末梢血の未編集のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内におけるＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－細胞の割合を示す棒グラフである。 ＴＣＲαβ＋細胞を除去した前後のＴＣ１細胞上に発現したＴＣＲαβ及びＢ２Ｍのフローサイトメトリー結果を示す。 遺伝子編集後のＴＣＲ－及びＭＨＣ Ｉ－（Ｂ２Ｍ）のタンパク質の減少の割合及びＴＣ１生成物の個々のロットからの編集されたＴＣ１細胞における抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の割合のグラフである。 異なる６人のドナー由来のＴ細胞集団におけるＰＤ１＋（左上）、ＬＡＧ３＋（右上）、ＴＩＭ３＋（左下）又はＣＤ５７＋（右下）の割合を図示するグラフを示す。 ＴＣ１細胞又は未編集のＴ細胞を異なる比率で共培養した場合の、ＣＤ１９陽性細胞株（Ｎａｌｍ６、ラージ及びＫ５６２－ＣＤ１９）並びにＣＤ１９陰性細胞（Ｋ５６２）の細胞溶解の割合を示すグラフである。 Ｔ細胞培地（血清＋ＩＬ２＋ＩＬ７、完全培地）、血清を含むがＩＬ２若しくはＩＬ７サイトカインを含まない培地（５％の血清、サイトカインなし）又は血清若しくはサイトカインを含まない培地（血清なし、サイトカインなし）の存在下で培養した場合に生存するＴＣ１細胞の数を示すグラフである。遺伝子編集後の指示された日に細胞を計数した。３つのロットからの平均値を±ＳＤとして示す。 リンパ球除去後にＣＤ１９＋悪性病変を有するヒト対象に投与されたＣＴＸ１１０細胞（別名ＴＣ１細胞）を評価するための臨床試験デザインを概略的に示す。
分化抗原群１９（ＣＤ１９）は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公的データベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列は、受入番号ＮＭ＿００１１７８０９８で見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病及び非ホジキンリンパ腫を含む大部分のＢ細胞系統の癌に発現している。ＣＤ１９は、Ｂ細胞前駆体の初期マーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）を参照されたい。
本開示は、Ｂ細胞悪性病変のための同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子改変Ｔ細胞の集団を含み、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されており、それによってＴＲＡＣ遺伝子の発現が阻害される。同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、健康なドナーから入手した親Ｔ細胞を使用して調製される。従って、患者自身のＴ細胞に由来するＣＡＲ－Ｔ細胞の量産が必要となる自家ＣＡＲ－Ｔ療法では、診断と治療との間隔が少なくとも３週間あるのと対照的に、ＣＡＲ－Ｔ療法は、標的のＢ細胞悪性病変を有する診断直後の患者に対して利用することができる。同種ＣＡＲ Ｔ療法は、診断直後に容易に治療することができるように、治療する場所に保存して在庫管理することができる。同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ療法が即時に利用できることにより、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞を患者自身の細胞から量産するときに必要となる可能性のあるブリッジング化学療法が不要となる。本明細書で開示される同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、本明細書で開示されるＢ細胞悪性病変を有するヒト患者において、特定の患者での完全奏効及び反応の長期持続性などの治療有効性を示した。更に、本明細書で開示される同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ヒト患者において、注入後、長期間のＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性などの所望の薬物動態特性を示した。
従って、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸（例えば、配列番号３９によってコードされる配列番号４０）を合わせて含む遺伝子改変Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を使用して、ヒト患者のＢ細胞悪性病変を治療するための方法が本明細書に提供される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードし、任意選択によりプロモーター配列及び１つ以上の調節エレメントを含む核酸を、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座に挿入し得、例えばＴＲＡＣ遺伝子の配列番号２６のセグメントと置換し得る。ヒト患者は、遺伝子改変Ｔ細胞の集団の投与前にリンパ球除去治療を受ける。
Ｉ．抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞
Ｂ細胞悪性病変を治療するのに使用される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子又はこれらの組み合わせを有するヒトＴ細胞である。特定の実施例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、内在性ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子が破壊されている。
（ｉ）抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞などの免疫細胞は、ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を意味する。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利には、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
様々な世代のＣＡＲが存在し、その各々は、異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して抗体に由来するｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳを組み込んでいる。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲのＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせ）を含む。Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。様々な世代のＣＡＲ構築物は、いずれも本開示の範囲内である。
一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）又は別の抗体フラグメント）を認識する細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、そのほとんどの場合に共刺激ドメインである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲ構築物は、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得、且つ表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号３０）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３１）が挙げられる。他のシグナルペプチドを使用し得る。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的な抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み得、次に細胞内共シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン）とＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとに融合されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン）を含み得る。本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを構築するのに使用される例示的な構成要素は、下記に示す配列表に見出すことができる。
（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶＨフラグメント及びＶＬフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖフラグメントが誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、完全ヒト型である。
本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドの抗原結合細胞外ドメインは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に特異的である。いくつかの実施例では、抗原結合細胞外ドメインは、ＣＤ１９に結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含み得る。抗ＣＤ１９のｓｃＦｖは、配列番号５１のものと同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５２のものと同一の軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み得る。同一のＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲを有する２つの抗体とは、同一の手法（当技術分野において既知の通り、例えばＫａｂａｔ手法、Ｃｈｏｔｈｉａ手法、ＡｂＭ手法、Ｃｏｎｔａｃｔ手法又はＩＭＧＴ手法）によって決定したとき、それらのＣＤＲが同一であることを意味する。例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照されたい）。いくつかの実施例では、抗ＣＤ１９のｓｃＦｖは、配列番号５１のＶＨ及び／又は配列番号５２のＶＬを含む。特定の実施例では、抗ＣＤ１９のｓｃＦｖは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み得る。
（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲポリペプチドは、膜をまたがる疎水性のαヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含み得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞の細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を意味する。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に記載されているような他の膜貫通ドメインを使用し得る。特定の一実施例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインである。
（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインを使用し得る。
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物のいずれかは、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ及び任意選択により１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。
ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、一次Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物は、配列番号３８のアミノ酸配列を含み得るＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共に、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの共刺激ドメインを使用して、十分な増殖シグナル／生存シグナルを伝達し得る。いくつかの実施例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子、例えば配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の実施例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子、例えば配列番号３４のアミノ酸配列を有する４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施例では、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３８）とＣＤ２８共刺激ドメイン（例えば、配列番号３６）とを含み得る。
本明細書に記載される方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞を生成するために使用することができる２つ以上の好適なＣＡＲを包含することが理解されるであろう。実施例は、例えば、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして発行された、２０１８年５月１１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号明細書及び２０１９年５月１０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号明細書に見出すことができ、各先行出願の関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題に対して本明細書に参照として組み込まれる。
特定の実施例では、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３９のヌクレオチド配列によってコードされ得る配列番号４０のアミノ酸配列を含み得る。下記に示す配列表を参照されたい。
本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのコード配列を含む核酸及び任意選択により抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現させるための調節配列（例えば、配列表に示されるＥＦ１ａプロモーターなどのプロモーター）が目的のゲノム遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施例では、内在性ＴＲＡＣ遺伝子座に核酸が挿入され、それによってＴＲＡＣ遺伝子の発現を阻害する。特定の実施例では、核酸を、ＴＲＡＣ遺伝子内のフラグメント、例えば配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントと置換し得る。
（ｉｉ）ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト
本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子又はこれらの組み合わせを更に有し得る。ＴＲＡＣ座位を破壊することで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の減少がもたらされ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低減させることが意図される一方、β２Ｍ座位を破壊することで、主要組織適合複合体タイプＩ（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の減少がもたらされ、宿主拒絶反応の可能性を低減させることによって持続性を向上させることが意図される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを加えることにより、改変Ｔ細胞がＣＤ１９発現腫瘍細胞に誘導される。
本明細書で使用する場合、「破壊された遺伝子」という用語は、コードされている遺伝子産物の活性を実質的に減少させるか又は完全に排除するように、野生型の対応物に対して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失又はヌクレオチド置換など）を含む遺伝子を意味する。非コード領域、例えばプロモーター領域、転写若しくは翻訳を調節する調節領域又はイントロン領域に１つ以上の変異が位置し得る。代わりに、コード領域に（例えば、エクソンに）１つ以上の変異が位置し得る。場合により、破壊された遺伝子は、コード化タンパク質を発現しないか、又は大幅に減少したレベルのコード化タンパク質を発現する。他の場合、破壊された遺伝子は、変異形態でのコード化タンパク質を発現し、そのいずれも機能しないか、又は活性が大幅に減少している。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体による、例えばフローサイトメトリーによる）のタンパク質を（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用してβ２Ｍタンパク質を細胞表面で検出することができない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型の対応物に対して変異したフラグメントを含むものと説明することができる。変異したフラグメントは、欠失、ヌクレオチド置換、付加又はこれらの組み合わせを含み得る。他の実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型の対応物に存在するフラグメントに欠失があるものと説明することができる。場合により、欠失させたフラグメントの５’末端が、本明細書で開示されるような設計されたガイドＲＮＡ（オンターゲット配列として公知である）によって標的化される遺伝子領域内に位置し得、欠失させたフラグメントの３’末端が標的領域の範囲を超え得る。代わりに、欠失させたフラグメントの３’末端が標的領域内に位置し得、欠失させたフラグメントの５’末端が標的領域の範囲を超え得る。
場合により、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、欠失、例えばＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１内のフラグメントの欠失を含み得る。いくつかの実施例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＲＡＣのガイドＲＮＡ、ＴＡ－１の標的部位である、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む。下記の配列表を参照されたい。いくつかの実施例では、配列番号２６のフラグメントは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸によって置換され得る。そのような破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＢ２Ｍは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して生成され得る。いくつかの実施例では、下記の配列表に示されるＢ２ＭのｇＲＮＡを使用することができる。破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。
（ｉｉｉ）同種療法のための例示的な抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団
本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲのいずれか（例えば、配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現する、本明細書で開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞並びに更に本明細書で開示されるような破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び／又は破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を含む遺伝子改変免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞などのＴ細胞）の集団も本明細書で提供される。いくつかの実施例では、遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、ＣＴＸ１１０細胞であり、これは、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有するＣＤ１９指向性Ｔ細胞である。抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に配列番号２６の部位で挿入することができ、この部位が抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸によって置換されることによってＴＲＡＣ遺伝子の発現が阻害される。ＣＴＸ１１０細胞の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列を含み得る。
ＣＴＸ１１０細胞は、標的遺伝子（ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子）を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）技術及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を使用する、エキソビボでの遺伝子改変によって生成することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が媒介する遺伝子編集には、２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が関与している。ＴＡ－１のｓｇＲＮＡ（配列番号１８）は、ＴＲＡＣ座位を標的とし、Ｂ２Ｍ－１のｓｇＲＮＡ（配列番号２０）は、β２Ｍ座位を標的とする。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれかに関して、改変を明確に示していないものは、未改変の配列と、任意の好適な改変を有する配列との両方を包含することを意味する。
ＣＴＸ１１０細胞の抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、抗ＣＤ１９の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖであり、配列番号４７のアミノ酸配列を含み得る）、次にＣＤ２８の細胞内共シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３６）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３８）に融合したＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列を含む）で構成されている。特定の実施例では、ＣＴＸ１１０細胞の抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも３０％は、検出可能なレベルの抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルの抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない可能性がある。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
代わりに又は加えて、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない可能性がある。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ表面タンパク質を発現しない。特定の実施例では、ＣＴＸ１１０細胞の９０％超（例えば、９９．５％超）は、検出可能なＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、かなりの割合のＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団に２つ以上の遺伝子編集が含まれ得、これにより２つ以上の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定の割合の細胞がもたらされる。
例えば、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの２つの表面タンパク質を発現しない可能性があり、例えば検出可能なレベルのβ２Ｍ及びＴＲＡＣタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。別の例では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載される編集であり得る２つ以上の遺伝子編集（例えば、２つ以上の遺伝子内における）を含み得る。例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団は、ＴＡ－１ ＴＲＡＣ ｇＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術により、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子内に欠失を含み得る。例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子内にフラグメントＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号２６）の欠失を含み得る。このフラグメントは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸（例えば、配列番号３９）によって置換することができる。代わりに又は加えて、ＣＴＸ１１０細胞の集団は、Ｂ２Ｍ－１のｇＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術により、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み得る。そのようなＣＴＸ１１０細胞は、β２Ｍ遺伝子内に配列番号９～１４のヌクレオチド配列の１つ以上を含む挿入欠失を含み得る。特定の実施例では、ＣＴＸ１１０細胞は、≧３０％のＣＡＲ＋Ｔ細胞、≦５０％のＢ２Ｍ＋細胞及び≦３０％のＴＣＲαβ＋細胞を含む。更なる特定の実施例では、ＣＴＸ１１０細胞は、≧３０％のＣＡＲ＋Ｔ細胞、≦３０％のＢ２Ｍ＋細胞及び≦０．５％のＴＣＲαβ＋細胞を含む。
本明細書で言及される主題及び目的に対してその各々の関連する開示が参考として組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９２１５５００号パンフレットも参照されたい。
（ｉｖ）薬学的組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で開示されるような任意の遺伝子改変抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団、例えばＣＴＸ１１０細胞を含む薬学的組成物及び薬学的に許容されるキャリアを提供する。そのような薬学的組成物は、ヒト患者の癌治療に使用することができ、これも本明細書で開示される。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、妥当なリスク／ベネフィット比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症もなく対象の組織、臓器及び／又は体液と接触させて使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物及び／又は剤形を意味する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤などを意味する。組成物としては、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩又は塩基付加塩を挙げることができる。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１－１９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される塩を更に含む。薬学的に許容される塩の非限定例としては、酸付加塩（無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を含むポリペプチドの遊離アミノ基から形成される）が挙げられる。いくつかの実施形態では、遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄）又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来するものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される薬学的組成物は、凍結保存溶液（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｃ５５）中に懸濁させた、遺伝子改変抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の集団を含む。本開示に使用される凍結保存溶液は、アデノシン、ブドウ糖、デキストラン４０、ラクトビオン酸、ショ糖、マンニトール、Ｎ－）２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、１つ以上の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素カリウム、リン酸カリウムなど）、１つ以上の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）又はこれらの組み合わせも含み得る。凍結保存溶液の構成成分は、滅菌水（注射品質）に溶解され得る。凍結保存溶液は、いずれも血清を実質的に含まない（常法では検出できない）ものであり得る。
場合により、凍結保存溶液（例えば、血清を実質的に含まない）中に懸濁させた、ＣＴＸ１１０細胞などの遺伝子改変抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む薬学的組成物は、保存バイアルに入れられ得る。
本明細書で開示されるような凍結保存溶液中に任意選択により懸濁され得る、本明細書で更に開示されるような遺伝子改変抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の集団を含む、本明細書で開示される薬学的組成物のいずれも、Ｔ細胞の生存及び生理活性に実質的に影響を及ぼさない環境において、例えば細胞及び組織を保存するのに一般的に適用される条件下において、将来使用するために保存され得る。いくつかの実施例では、薬学的組成物は、≦－１３５℃の気相の液体窒素中で保存され得る。細胞をそのような条件でしばらくの間保存した後、外観、細胞数、生存率、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合、ＴＣＲ＋Ｔ細胞の割合及びＢ２Ｍ＋Ｔ細胞の割合に関する著しい変化は、観察されなかった。
ＩＩ．遺伝子改変免疫細胞の調製
本明細書で開示される遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞などのＴ細胞）を作製するために、従来技術において公知の任意の好適な遺伝子編集方法、例えばＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）を使用したヌクレアーゼ依存性標的化編集を使用することができる。特定の実施例では、ＣＴＸ１１０細胞などの遺伝子改変免疫細胞は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＶＶ）をドナー鋳型として使用する相同組み換えと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ技術によって生成される。
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を媒介した遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡのフラグメントが原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外来性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ内の５’ ２０ｎｔの配列を変更することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を特定の座位に標的化させることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いでこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、以下の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用する。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大多数の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位で１～数百個のヌクレオチドの除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような改変は、典型的には、＜２０ｎｔである。結果として生じた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲでは、内在的又は外来的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、修復オペラントとしてＮＨＥＪを利用する。
（ａ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞を製作するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用し得るか、又はＣａｓ９の改変されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号５５として示される。
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、即ちｇＲＮＡを使用することを含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」とは、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を意味する。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する代表的なｇＲＮＡは、配列番号１８又は２２に示される。下記の配列表を参照されたい。本明細書で言及される主題及び目的に対してその関連する開示が参考として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計することができる（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＴＲＡＣゲノム領域に切断を生じさせてＴＲＡＣ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。
β２Ｍ遺伝子を標的化する代表的なｇＲＮＡは、配列番号２０又は２４に示される。下記の配列表を参照されたい。本明細書で言及される目的及び主題に対してその関連する開示が参考として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計することができる（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７～４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に切断を生じさせてβ２Ｍ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。
ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとで複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、この部位特異的ポリペプチドとの会合による複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
「標的配列」とは、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子のことであり、Ｃａｓ９によって改変される配列のことである。「標的配列」は、「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にあり、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含む二本鎖分子である。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。
例えば、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号２６）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１９）である。別の実施例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号：２７）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ－３’である（配列番号：２１）。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変化する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、
Figure 2022531185000001
 を含む配列では、標的核酸は、Ｎ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである）に対応する配列であり得る。実施例を配列番号１５～１７として示す。
本明細書で開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的配列内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的配列内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個又は最大で１個のミスマッチを含み得る。
本明細書で提供されるように使用され得るｇＲＮＡの非限定例は、本明細書で言及される目的及び主題に対してその各々の関連する開示が参考として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに示されている。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれかに関して、改変を明確に示していないものは、未改変の配列と任意の好適な改変を有する配列との両方を包含することを意味する。
本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び更に本明細書で開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。従って、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり得、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。
ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれも未改変であり得る。代わりに、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／又は修飾主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの改変ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。
ある実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。
２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡを本明細書に記載される方法、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される方法に使用することができることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野において公知のＣａｓ９酵素及び／又はｇＲＮＡを含む。実施例は、例えば、本明細書で言及される目的及び主題に対してその各々の関連する開示が参考として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットに見出すことができる。
（ｉｉ）ＣＡＲ構築物をＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
本明細書で開示されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物をコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達することができる。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込まれ、これによってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達することができる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するのか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するのかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物に投与する際、免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮に入れる場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この特質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー座位内に存在し得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子改変Ｔ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入することができるように設計することができる。ＴＲＡＣの破壊により、内在性ＴＣＲの機能の喪失がもたらされる。例えば、本明細書に記載されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。この目的のために、ＴＲＡＣ遺伝子及び標的部位に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば本明細書で開示されるものを使用することができる。
いくつかの実施例では、相同組換え修復、即ちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用した）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失と、ＣＡＲをコードするセグメントによる置換とを生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。
本明細書で開示されるようなドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの実施例では、ＣＡＲをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、目的の遺伝子位置、例えばＴＲＡＣ遺伝子で効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。この場合、標的座位に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的座位で切断することができる。次いで、ＨＤＲが発生して二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。
代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状の形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方又は両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための更なる方法として、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内在性プロモーターによって駆動することができるように、内在性プロモーターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外来性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用し得る。
更に、外来性配列は、転写又は翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。
遺伝子改変免疫細胞（例えば、本明細書で開示されるＴ細胞）を調製するために、好適な供給源由来のＴ細胞などの免疫細胞、例えば健康なドナー又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法を必要とする患者であり得るヒトドナーから血液細胞を入手し得る。１人以上の健康なヒトドナー由来の血液細胞を使用して、ＣＴＸ１１０細胞を作製することができる。健康なドナー細胞から量産することにより、悪性リンパ腫／白血病細胞を意図せずに形質導入するリスクを最小化し、場合によりＣＡＲ Ｔ細胞の機能を向上させることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素（例えば、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ）、任意選択によりＡＡＶドナー鋳型は、従来の手法によって宿主免疫細胞に送達され得る。いくつかの実施例では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、これを電気穿孔によって宿主免疫細胞に送達することができる。任意選択により、ＡＡＶドナー鋳型をＲＮＰ複合体と同時に免疫細胞に送達し得る。代わりに、ＲＮＰ及びＡＡＶドナー鋳型の送達を順次実施し得る。いくつかの実施例では、遺伝子編集構成要素が送達される前にＴ細胞を活性化し得る。
遺伝子編集構成要素及び任意選択によりドナー鋳型が送達された後に細胞を回収し、インビトロで増殖させ得る。遺伝子編集効率は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのノックイン及び標的遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ又は両方）のノックアウトを確認するための常法を使用して評価することができる。いくつかの実施例では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去し得る。ＣＴＸ１１０細胞などの本明細書で開示される遺伝子改変免疫細胞を調製するための更なる情報は、本明細書で言及される目的及び主題に対してその関連する開示が参考として組み込まれる米国特許出願第６２／９３４，９９１号明細書に見出すことができる。
ＩＩＩ．Ｂ細胞悪性病変の同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
いくつかの態様では、Ｂ細胞悪性病変を有するヒト患者を、本明細書で開示されるようなＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの遺伝子改変抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの集団を使用して治療するための方法が本明細書で提供される。同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、２段階の治療：（ｉ）１回以上の用量の１つ以上のリンパ球除去剤を好適なヒト患者に与えることを含む、移植前処置（リンパ球除去治療）と、（ｉｉ）本明細書で開示されるようなＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団をヒト患者に投与することを含む、治療処置（同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法）とを含み得る。
（ｉ）患者集団
ヒト患者は、診断、治療又は療法が望まれる任意のヒト対象であり得る。ヒト患者は、任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、成人である（例えば、少なくとも１８歳の人間）。いくつかの実施例では、ヒト患者は、５０ｋｇ以上の体重を有し得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、小児であり得る。
本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、Ｂ細胞悪性病変を有するか、有する疑いがあるか又は有するリスクのあるヒト患者であり得る。Ｂ細胞悪性病変を有する疑いのある対象は、Ｂ細胞悪性病変の１つ以上の症状、例えば原因不明の体重減少、疲労、寝汗、息切れ又は腫脹した腺を示し得る。Ｂ細胞悪性病変のリスクのある対象は、Ｂ細胞悪性病変のリスク因子、例えば衰弱した免疫系、年齢、男性であること又は感染症（例えば、エプスタイン・バーウイルス感染症）の１つ以上を有する対象であり得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞）治療を必要とするヒト患者は、定期検診、例えば、身体検査、臨床検査試験、生検（例えば、骨髄生検及び／又はリンパ節生検）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）走査又は超音波検査によって同定することができる。
本明細書に記載される方法を使用して治療することができるＢ細胞悪性病変の例としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／若しくはＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、グレード３ｂのＦＬ又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のリヒターの形質転換が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性病変は、ＤＬＢＣＬ、例えば高悪性度ＤＬＢＣＬ又はＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性病変は、形質転換ＦＬ又はグレード３ｂのＦＬである。いくつかの実施例では、ヒト患者は、フルオロデオキシグルコース陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有する。
いくつかの実施形態では、治療を受ける患者は、ＤＬＢＣＬを有し、直腸旁腫瘤、後腹膜腫瘤、びまん性リンパ節（ＬＮ）、渙散性病変、扁桃病変又はこれらの組み合わせを示す。代わりに又は加えて、ヒト患者は、骨髄拡散を有し得る。他の実施例では、ヒト患者は、骨髄拡散を有さない。
いくつかの実施形態では、治療を受ける患者は、形質転換ＦＬを有する。このようなヒト患者は、びまん性ＬＮを示し得る。場合により、ヒト患者は、骨髄拡散を有し得る。他の場合、ヒト患者は、骨髄拡散を有し得ない。
本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、治療後に再発し、且つ／又は治療に対して抵抗性になっており、且つ／又は治療に対して反応を示さないヒト患者であり得る。本明細書で使用する場合、「再発性」又は「再発する」とは、完全奏効の期間後に再発する、本明細書で開示されるようなＢ細胞悪性病変を意味する。進行性疾患とは、最後の評価（例えば、安定疾患又は部分奏効）後に疾患が悪化する場合を意味する。いくつかの実施形態では、治療中に進行が起こる。いくつかの実施形態では、治療後に再発が起こる。反応性の喪失は、定期的な医療行為によって判断され得る。例えば、本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、１種類以上の先行抗癌療法を受けているヒト患者であり得る。場合により、ヒト患者は、２種類以上の先行抗癌療法、例えば化学療法、免疫療法、外科手術又はこれらの組み合わせを受け得る。いくつかの実施例では、先行抗癌療法は、抗ＣＤ２０抗体療法、アントラサイクリン含有療法又はこれらの組み合わせを含み得る。
場合により、ヒト患者は、難治性Ｂ細胞悪性病変を有する。本明細書で使用する場合、「難治性」とは、治療に対して反応を示さないか又は抵抗性となる、本明細書で開示されるようなＢ細胞悪性病変を意味する。難治性Ｂ細胞悪性病変を有するヒト患者は、最後の治療で進行性疾患を有し得るか、又は最大で６ヵ月（例えば、最大で５ヵ月、最大で４ヵ月又は最大で３ヵ月、又は最大で２ヵ月、又は最大で１ヵ月）の安定疾患の期間で治療の少なくとも２つのサイクル後に安定疾患を有し得る。場合により、ヒト患者は、以前の自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けていることができ、それ自体に対して反応を示さない（失敗している）か、又は若干の反応性を達成した後に進行若しくは再発している。他の場合、ヒト患者は、以前の自家ＨＳＣＴに不適格でなくてもよい。
患者が移植前処置（リンパ球除去治療）及び／又は本明細書で開示されるような同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けるのに適しているかどうかを判断するために、ヒト患者をスクリーニングし得る。例えば、リンパ球除去治療に適したヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）コントロール不良な心不整脈、（ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。別の例では、治療処置に適したヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性のコントロール不良な感染症、（ｂ）リンパ球除去治療前の臨床状態と比較して臨床状態が悪化していること、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。
ヒト患者をスクリーニングして、そのようなスクリーニング結果に基づいて移植前処置及び／又は治療処置から除外し得る。例えば、患者が以下の除外基準の１つ以上を満たす場合、ヒト患者を移植前処置及び／又は同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法から除外し得る：（ａ）米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態０又は１を有すること、（ｂ）十分な腎臓、肝臓、心臓及び／又は肺機能、（ｃ）以前の遺伝子療法又は改変細胞療法がないこと、（ｄ）抗ＣＤ１９抗体を含む以前の治療がないこと、（ｅ）以前の同種ＨＳＣＴがないこと、（ｆ）脳脊髄液からの検出可能な悪性細胞がないこと、（ｇ）脳転移がないこと、（ｈ）以前の中枢神経系疾患の既往がないこと、（ｉ）不安定狭心症、不整脈及び／又は心筋梗塞がないこと、（ｊ）コントロール不良な感染症がないこと、（ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないこと、及び（ｌ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスに感染していないこと。
（ｉｉ）移植前処置（リンパ球除去療法）
本明細書で開示される治療方法に好適な任意のヒト患者は、対象の内在性リンパ球を減少又は除去するためにリンパ球除去療法を受け得る。
リンパ球除去とは、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を破壊することを意味し、一般に免疫移植療法及び免疫療法前に使用される。リンパ球除去は、放射線照射及び／又は化学療法によって達成することができる。「リンパ球除去剤」とは、対象に投与したとき、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を減少、除去又は排除することが可能な任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、薬剤を投与する前のリンパ球の数と比較して、リンパ球の数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％だけ減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、対象のリンパ球の数が検出限界以下となるような、リンパ球の数を減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ以上の）リンパ球除去剤が投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、特異的にリンパ球を死滅させる細胞傷害性薬物である。リンパ球除去剤の例としては、フルダラビン、シクロホスファミド、ベンダムスチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ダカルバジン、メルファラン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、リン酸エトポシド、ミトキサントロン、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス又はＤＡＢ－ＩＬ２が挙げられるが、これらに限定されない。場合により、リンパ球除去剤は、低線量の放射線照射と併用され得る。移植前処置のリンパ球除去効果は、通常の診療で経過観察することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つ以上のリンパ球除去剤、例えばフルダラビン及びシクロホスファミドを含む移植前処置に関する。本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、複数用量の１つ以上のリンパ球除去剤を移植前段階の適切な期間（例えば、１～５日間）に受け得る。患者は、リンパ球除去期間中、リンパ球除去剤の１つ以上を１日当たり１回受け得る。一実施例では、ヒト患者は、１日当たり約２０～５０ｍｇ／ｍ２（例えば、３０ｍｇ／ｍ２）のフルダラビンを２～４日間（例えば、３日間）受け、且つ１日当たり約５００～７５０ｍｇ／ｍ２（例えば、５００又は７５０ｍｇ／ｍ２）のシクロホスファミドを２～４日間（例えば、３日間）受ける。特定の実施例では、ヒト患者は、１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって受け得る。他の特定の実施例では、ヒト患者は、１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって受け得る。
ヒト患者は、次いで、本明細書で開示されるようなリンパ球除去療法後の適切な期間内において、ＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを投与され得る。例えば、ヒト患者は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、例としてＣＴＸ１１０細胞）を投与する約２～７日（例えば、２、３、４、５、６、７日）前に１つ以上のリンパ球除去剤を受け得る。場合により、ヒト患者は、リンパ球除去療法後約４～５日以内に、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を投与される。
ＣＴＸ１１０細胞などの同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、事前に調製することができ、且つ治療場所で保存することができるため、本明細書で開示されるようなリンパ球除去療法を、本明細書で開示される同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法にヒト患者が好適であると同定された後の短い時間ウィンドウ内（例えば、２週間以内）において、Ｂ細胞悪性病変を有するヒト患者に適用し得る。例えば、リンパ球除去療法の初回用量（例えば、約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２又は７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミド）を、ヒト患者が同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に好適であると同定された後の２週間以内（例えば、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内又はそれ未満）にヒト患者に投与し得る。いくつかの実施例では、ヒト患者が治療に好適であると同定された後の２４～７２時間以内（例えば、２４時間以内）において、リンパ球除去療法をヒト患者に行い得る。次いで、リンパ球除去治療後の２～７日（例えば、例として２、３、４、５、６又は７日）以内に患者にＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することができる。これにより、疾患の診断後に本明細書で開示されるＣＴＸ１１０細胞などの同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞でヒト患者をタイミングよく治療することが可能になり、且つ／又は遅れることなく（例えば、治療用細胞を調製することによる遅れ）患者を同定することが可能になる。場合により、患者は、入院治療中に治療を受けることができる。場合により、患者は、外来治療中に治療を受けることができる。
リンパ球除去工程のいずれかに先行して、患者がリンパ球除去治療に適しているかどうかを判断するために、ヒト患者を１つ以上の特徴についてスクリーニングし得る。例えば、リンパ球除去前に、リンパ球除去治療に適したヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）コントロール不良な心不整脈、（ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。
リンパ球除去後、患者がＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療に適しているかどうかを判断するために、ヒト患者を１つ以上の特徴についてスクリーニングし得る。例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療前及びリンパ球除去治療後、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療に適したヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性のコントロール不良な感染症、（ｂ）リンパ球除去治療前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。
（ｉｉｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与は、望ましい効果を生じさせることができるように、腫瘍部位などの所望の部位に遺伝子改変Ｔ細胞集団の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路により、本明細書で開示されるような遺伝子改変Ｔ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を、更に本明細書で開示されるようなヒト患者に配置する（例えば、移植する）ことを含み得る。対象の所望の位置に送達をもたらす任意の適切な経路によって遺伝子改変Ｔ細胞集団を投与することができるが、この場合、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部は、生存したままである。対象に投与された後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）という短い期間から数日、数週間若しくは数ヵ月、数年又は更に対象の寿命までの間（即ち長期間の生着）であり得る。場合により、患者は、入院治療中に遺伝子改変Ｔ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を受け得る。場合により、患者は、外来治療中に遺伝子改変Ｔ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を受け得る。
例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞集団を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞集団を全身に投与し、これは、細胞の集団を標的部位、組織又は臓器に直接投与するのではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様のプロセスを受けるように投与することを意味する。好適な投与の様式としては、注射、注入、点滴又は経口摂取が挙げられる。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内注射並びに注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
有効量とは、医学的状態（例えば、Ｂ細胞悪性病変）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な遺伝子改変Ｔ細胞集団の量を意味し、所望の効果をもたらす、例えば医学的状態を有する対象を治療するのに十分な量の遺伝子改変Ｔ細胞集団を意味する。有効量には、疾患の症状の発症を予防若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を元に戻すのに十分な量も含まれる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、通常の実験により当業者によって決定することができることが理解される。
遺伝子改変Ｔ細胞集団の有効量には、約１×１０７個のＣＡＲ＋細胞～約１×１０９個のＣＡＲ＋細胞、例えばＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現させた約１×１０７個の細胞～約１×１０９個の細胞（ＣＡＲ＋細胞）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞集団の有効量には、少なくとも１×１０７個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも３×１０７個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも１×１０８個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも３×１０８個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞又は少なくとも１×１０９個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞集団の有効量には、遺伝子改変Ｔ細胞集団の用量、例えば約１×１０７個のＣＴＸ１１０細胞～約１×１０９個のＣＴＸ１１０細胞を含む用量が含まれ得る。
本明細書に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性は、訓練された臨床医によって判断することができる。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状のＣＤ１９のレベルが有利な様式で変化する（例えば、少なくとも１０％減少する）場合又はＢ細胞悪性病変の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善又は緩和する場合、「有効」であるとみなされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価されるように、対象が悪化しないことによっても測定することができる（例えば、Ｂ細胞悪性病変の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、且つ／又は本明細書に記載されている。治療には、ヒト患者のＢ細胞悪性病変の任意の治療が含まれ、及び（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと；及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることが含まれる。
抗ＣＤ１１０ ＣＡＲ Ｔ細胞をそれぞれ投与した後、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧症、腎不全又はこれらの組み合わせなどの急性毒性についてヒト患者を経過観察し得る。
ヒト患者が急性毒性の１つ以上の症状を示す場合、ヒト患者に毒性管理を施し得る。急性毒性の１つ以上の症状を示す患者に対する治療は、当技術分野において公知である。例えば、ＣＲＳの症状（例えば、心臓、呼吸器及び／又は神経的異常）を示すヒト患者に抗サイトカイン療法を施し得る。加えて、ＣＲＳの症状を示さないヒト患者に抗サイトカイン療法を施して、抗ＣＴＸ１１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進し得る。
代わりに又は加えて、ヒト患者が急性毒性の１つ以上の症状を示す場合、ヒト患者の治療を終了し得る。患者が１つ以上の有害事象（ＡＥ）の徴候を示す、例えば患者に異常な検査所見があり、且つ／又は患者が疾患進行の徴候を示す場合にも患者の治療を終了し得る。
本明細書に記載される同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）は、併用療法でも使用され得る。例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療法は、Ｂ細胞悪性病変を治療するか若しくは遺伝子改変Ｔ細胞集団の有効性を高めるために、且つ／又は遺伝子改変Ｔ細胞集団の副作用を低減させるために他の治療薬と併用され得る。
ＩＶ．Ｂ細胞悪性病変の同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法用キット
本開示は、Ｂ細胞悪性病変を治療するための方法において、本明細書で記載されるようなＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を使用するためのキットも提供する。そのようなキットには、１つ以上のリンパ球除去剤を含む第１の薬学的組成物と、任意の核酸又は遺伝子改変Ｔ細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるような）を含む第２の薬学的組成物と、薬学的に許容されるキャリアとを含む１つ以上の容器が含まれ得る。ＣＴＸ１１０細胞などの本明細書で開示されるような遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むキットは、治療する場所に保存して在庫管理され得、診断後にヒト患者を迅速に治療することを可能にする。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するための指示を含み得る。添付される指示は、ヒト患者に意図する活性を獲得させるために、第１及び／又は第２の薬学的組成物を対象に投与することに関する説明を含み得る。キットは、ヒト患者が治療を必要とするかどうかを同定することに基づいて、治療に好適なヒト患者を選択することに関する説明を更に含み得る。いくつかの実施形態では、指示は、治療が必要なヒト患者に第１及び第２の薬学的組成物を投与することに関する説明を含む。
本明細書に記載されるＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団の使用に関する指示としては、一般に、意図される治療に関する投与量、投与スケジュール及び投与経路などの情報が含まれる。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、マルチドーズ包装）又はサブユニット用量であり得る。本開示のキットで提供される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書に記載された指示である。ラベル又は添付文書は、対象のＴ細胞又はＢ細胞悪性病変を治療し、発症を遅らせ、且つ／又は軽減させるために、遺伝子改変Ｔ細胞の集団を使用することを指示するものである。
本明細書で提供されるキットは、好適に包装されている。好適な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、鼻腔投与器具又は注入器具などの特定の器具と組み合わせて使用するための梱包も考えられる。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能なストッパーのある静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。容器にも無菌のアクセスポートがあり得る。薬学的組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で開示されるようなＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
キットは、任意選択により、緩衝剤などの追加の成分及び説明的な情報を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記に記載されたキットの内容を含む製造品を提供する。
一般的方法
本開示の実施には、特に指示しない限り、当技術分野の範囲内の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が採用される。そのような技術は、文献において十分に説明されており、例えば下記で説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
当業者であれば、更に詳細に述べることなく上記説明に基づいて本発明を最大限利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で言及される目的のために又は主題に対して参考として組み入れられる。
実施例１：ＣＤ１９標的化同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する同種Ｔ細胞は、参考として本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１８－０３２５９５５号明細書で記載されているような、健康なドナーの末梢血単核細胞から調製された。要約すると、最初に、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号２６））及びＢ２Ｍ（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号２７））を標的化するＣａｓ９又はＣａｓ９：ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を、初代ヒトＴ細胞に電気穿孔した。ＴＲＡＣ座位におけるＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）カセットに隣接するＴＲＡＣ座位に対して左右に相同性アームを含有する、ＡＡＶ６で送達されるＤＮＡ鋳型（配列番号５６）による相同組換え修復によって修復した。ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なマウス抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ８ヒンジ領域及び膜貫通ドメインと、ＣＤ３ｚを含むシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインとを含んでいた。ＣＡＲのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４０及び３９に記載されている。本実施例に使用されるｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣ ｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１９））及びＢ２Ｍ ｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号２１））。ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含む細胞の集団は、本明細書において「ＴＣ１細胞」又は「ＣＴＸ１１０細胞」と呼ばれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術により、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を著しく減退させることを目的とする、健康なドナーに由来するヒト初代Ｔ細胞においてＴＣＲ表面発現が約９８％減少した、ＴＣＲα遺伝子（ＴＲＡＣ）の定常領域のノックアウトが高頻度で達成された。患者における持続性を増加させることを目的とする、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の高頻度のノックアウトも獲得することができ、全体的な有効性を潜在的に高める結果となった。ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍのダブルノックアウトの頻度は、任意のその後の抗体を用いた精製又は濃縮をすることなく、約８０％のＴ細胞で獲得されている。Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトと共に、ＡＡＶ６で送達されるドナー鋳型を使用する相同組換え修復により生成された、破壊されたＴＲＡＣ座位内からＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、一貫して高効率で生成されている。この部位特異的なＣＡＲの組み込みにより、レトロウイルス又はレンチウイルスの送達メカニズムに関連する挿入突然変異のリスクも低減しながら、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の潜在的増殖を防御し、更にＧＶＨＤのリスクを低減する。これらの改変された同種ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９依存性Ｔ細胞サイトカイン分泌と強力なＣＤ１９特異的癌細胞溶解とを示す。
同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ生成物を生成することによって（図１）、効率的な編集が行われていることが示された（例えば、５０％超のＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の効率）（図２）。
実施例２： ＮＯＧマウスの皮下ラージヒトバーキットリンパ腫の腫瘍異種移植モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を判断するための用量漸増試験
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）で用いられる方法を使用して、ＮＯＧマウスでの皮下ラージヒトバーキットリンパ腫の腫瘍異種移植モデルに対して、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を評価した。要約すると、１２匹の５～８週齢雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験が開始する５～７日前に病原体を含まない条件下に維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に飼育した。１日目に、マウスに５×１０６ラージ細胞／マウスの皮下接種を受けさせた。更に、マウスを表１に示すような３つの処置群に分けた。８日目（ラージ細胞を接種して７日後）に、処置群２及び処置群３に、表１に従って単回で２００μｌのＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の静脈内投与を受けさせた。
Figure 2022531185000002
腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍体積が≧５００ｍｍ３であった場合に個々のマウスを安楽死させた。
１８日目までに、未処置のマウスと比較して腫瘍体積がＴＣ１細胞に反応して統計的に有意に減少したことがデータによって示された（図３）。腫瘍体積への影響は用量依存的であった（表２）。より高用量のＴＣ１細胞を与えられたマウスは、より低用量のＴＣ１細胞を与えられたマウス又は処置されなかったマウスのいずれかと比較した場合、腫瘍体積が有意に減少したことを示した。処置された群では、生存期間の増加も観察された（表２）。
Figure 2022531185000003
実施例３：ＮＯＧマウスの静脈内播種性モデルにおけるＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性の評価
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の有効性を更に評価するために、播種性マウスモデルを用いた。
静脈内播種性ラージヒトバーキットリンパ腫の腫瘍異種移植モデル
ＮＯＧマウスのラージヒトバーキットリンパ腫腫瘍細胞株を使用した静脈内播種性モデル（播種性モデル）を使用して、ＴＣ１の有効性を更に立証した。Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）で用いられる方法及び本明細書に記載される方法を使用した播種性モデルでＴＣ１の有効性を評価した。要約すると、２４匹の５～８週齢雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験が開始する５～７日前に病原体を含まない条件下に維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に飼育した。試験開始時に、マウスを表９に示すような５つの処置群に分けた。１日目に、群２～５のマウスに０．５×１０６ラージ細胞／マウスの静脈注射を受けさせた。マウスを播腫性疾患のモデルとなるように静脈内に接種した。８日目（ラージ細胞を注射して７日後）に、処置群３～５に単回で２００μｌのＴＣ１細胞の静脈内投与を受けさせた（表３）。
Figure 2022531185000004
試験期間中にマウスを毎日経過観察し、体重を週２回測定した。重要な評価項目は周囲罹患までの時間であり、Ｔ細胞の生着の効果も評価した。試験中に、全ての群で動物の死亡率の百分率及び死に至るまでの時間を記録した。瀕死状態に達する前に、マウスを安楽死させた。マウスは、以下の基準の１つ以上が満たされた場合、瀕死であると定義され、屠殺され得る：
１週間を超えて継続する２０％以上の体重減少、
摂食、飲水、移動、排尿及び若しくは排便をする能力などの正常な生理機能を阻害する腫瘍、
過度の体重減少（＞２０％）をもたらす長期間の過度な下痢、又は
持続的な喘鳴及び呼吸困難。
また、虚脱、円背、完全麻痺／不全麻痺、膨隆腹、潰瘍形成、膿瘍、発作及び／又は出血症状などの臨床観察で定義されるような長期又は過度の痛み又は困難がある場合、動物を瀕死であるとみなした。
皮下異種移植モデル（実施例２）と同様に、図４に示すようにＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で処置したマウスにおいて統計的に有意な生存優位性（ｐ＜０．０００１）があることが、播種性モデルにより明らかとなった。また、播種性モデルにおける生存期間に対するＴＣ１処置の効果も用量依存的であった（表４）。
Figure 2022531185000005
上記に記載した静脈内播種性モデルを使用して、第２の実験を実施した。
１日目に、群２～４のマウスに０．５×１０６ラージ細胞／マウスの静脈注射を受けさせた。マウスを播腫性疾患のモデルとなるように静脈内に接種した。４日目（ラージ細胞を注射して３日後）、処置群２～４に、表５に従って単回で２００μｌのＴＣ１細胞の静脈内投与を受けさせた。
Figure 2022531185000006
やはりこの場合も、図５に示すようにＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で処置したマウスにおいて統計的に有意な生存優位性がある（ｐ＝０．００１６）ことが、播種性モデルにより明らかとなった。また、播種性モデルにおける生存期間に対するＴＣ１処置の効果も用量依存的であった（表６）。
Figure 2022531185000007
ＴＣ１処置に対する脾臓反応の評価
ラージ注射後２～３週間のマウスから脾臓を採取し、この組織にＴＣ１細胞が残存しているか及び脾臓内のラージ細胞が根絶したかをフローサイトメトリーによって評価した。
脾臓をＣチューブ内の３ｍＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦに移し、ＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して解離させた。試料を１００ミクロンのスクリーンを通して１５ｍＬのコニカルチューブに移して遠心分離し（１７００ｒｐｍ、５分間、制動装置によるＡＲＴ）、Ｇｕａｖａ ＰＣＡを使用して計数するために、１ｍＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦ中に再懸濁した。骨髄を遠心分離し、Ｇｕａｖａ ＰＣＡを使用して計数するために、１ｍＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦ中に再懸濁した。フローサイトメトリーで染色するために、細胞を１×ＤＰＢＳ ＣＭＦ中で１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。
１ｍＬの１×Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅに検査材料（５０μＬ）を添加し、室温（ＲＴ）で１０～１２分間インキュベートした。試料を遠心分離し、次いで１×ＤＰＢＳ ＣＭＦで一回洗浄した。５０μＬの１×ＤＰＢＳ中に試料を再懸濁し、ヒト及びマウスＴｒｕＳｔａｉｎと共に室温で１０～１５分間インキュベートした。試料を１ｍＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦで１回洗浄し、染色するために５０μＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦ中に再懸濁した。表面抗体を加え、細胞を室温で１５～２０分、暗所でインキュベートし、次いで１ｍＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦで洗浄した。次いで、フローサイトメーター上で捕捉するために、試料を１２５μＬの１×ＤＰＢＳ ＣＭＦ中に再懸濁した。以下の表面抗体パネルで細胞を染色した。
Figure 2022531185000008
細胞集団を前方散乱対側方散乱に基づいた電子的ゲーティング（Ｐｌ＝総白血球）によって測定した。最初の機器を設定した際、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製のＵｌｔｒａ Ｃｏｍｐ Ｂｅａｄｓを使用して一方のチャネルからもう一方のチャネルへの漏れ込みに対処するための補正を行った。各チューブで１０，０００個のＣＤ４５＋イベントを採取するようにフローサイトメーターを設定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏｌｌ（商標）フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーのデータ収集を実行した。ＢＯ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（バージョン６．１．３又は８．０．１）を使用してデータを取得した。フローサイトメトリーのデータ解析を、各細胞型の相対的な百分率を測定するために生成されたグラフ図であるフローサイトグラムの形式で行った。
本実施例は、以下のＴＣ１細胞処置において、治療的に有益なＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞が脾臓に存続し、且つ選択的に組織からラージ細胞を根絶することを立証するものである（図６Ａ）。加えて、ＴＣ１細胞による処置は、細胞集団におけるラージ誘発性の増加を示さない（図６Ａ）。更に、図７は、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞で処置されたマウスの脾臓内に残存するヒト細胞がＣＤ８＋であることを示している。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ３陰性でもあるが、このモデルにおいて存続するＴ細胞はＴＣＲ／ＣＤ３陰性のままで残存しており、従ってこれらが編集されていることを証明している。
静脈内播種性Ｎａｌｍ－６ヒト急性リンパ性白血病腫瘍
異種移植モデル
ＮＯＧマウスのＮａｌｍ－６ヒト急性リンパ性白血病の腫瘍細胞株を使用した静脈内播種性モデル（播種性モデル）を使用して、ＴＣ１の有効性を更に立証した。Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）で用いられる方法及び本明細書に記載される方法を使用した播種性モデルで、ＴＣ１の有効性を評価した。要約すると、２４匹の５～８週齢雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験が開始する５～７日前に病原体を含まない条件下に維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に飼育した。試験開始時に、マウスを表１４に示すような５つの処置群に分けた。１日目に、群２～４のマウスに０．５×１０６Ｎａｌｍ６細胞／マウスの静脈注射を受けさせた。マウスを播腫性疾患のモデルとなるように静脈内に接種した。４日目（Ｎａｌｍ６細胞を注射して３日後）、処置群２～４に、表８に従って単回で２００μｌのＴＣ１細胞の静脈内投与を受けさせた。
Figure 2022531185000009
試験期間中にマウスを毎日経過観察し、上記に記載したように体重を週２回測定した。
ラージ静脈内播種性モデル（上記）と同様に、図８に示されるように、Ｎａｌｍ６モデルにもＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で処置されたマウスにおいて統計的に有意な生存優位性（ｐ＝０．０００４）があることが示された。また、Ｎａｌｍ６播種性モデルにおける生存期間に対するＴＣ１処置の効果も用量依存的であった（表９）。
Figure 2022531185000010
実施例４：ＮＯＧマウスの静脈内播種性モデルにおけるＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性の更なる評価
本試験の目的は、ＮＯＧマウスにおいてＮａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ急性リンパ性白血病の腫瘍細胞株に対する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性を複数用量レベルで評価することであった。マウスを播腫性疾患のモデルとなるように静脈内に接種した。重要な評価項目は、周囲罹患までの時間であった。播腫性疾患の進行を経過観察するために、生物発光イメージングを行った。
要約すると、６週齢雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験が開始する５～７日前に病原体を含まない条件下に維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。１日目に、マウスに５×１０４Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ（Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ－－Ｐｕｒｏ；Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ））細胞／マウスの静脈内接種を受けさせた。Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を接種して３日後、マウスを治療群に分け、表１０に示されるようなＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を投与した。関心領域（ＲＯＩ）値を取り込み、記録した。体重を１日２回測定し、生物発光を４日目（Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を接種した３日後）から始まり６７日目にわたって週２回、７４日目から始まり試験終了まで週１回測定した。生物発光を測定するために、マウスに２００μｌのＤ－ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。マウスを画像化するのに最適なＤ－ルシフェリン投与後の時間及び露光時間を決定するために、試験開始時及び全体を通して必要に応じて動態画像を撮影した。ソフトウェアバージョン１．２．０のＡＭＩ １０００画像化ユニット（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．；Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を使用して、発光シグナル（オープンエミッション）を捕捉することによってマウスを画像化した。
Figure 2022531185000011
周囲罹患（高い腫瘍負荷を示唆する臨床徴候（例えば、運動性の欠如、亀背、活動性低下）又は１週間を超えて継続する２０％以上の体重減少）があるとき、個々のマウスを安楽死させた。瀕死状態に達する前に、マウスを安楽死させた。長期生存者として最後のマウスを安楽死させた９９日目に、試験を終了した。
図９は、未処置のマウスに対してＴＣ１細胞を異なる用量で受けたマウスの延長された生存期間を示している。図１０は、図９に示すような、結果として最も長期の生存期間となった最高用量のＴＣ１細胞（１２×１０６細胞／マウス）を受けたマウスにおける、低レベルから検出不可能なレベルの生物発光を示している。７４日目に、４匹のマウス全てに生物発光が検出され、処置群における腫瘍細胞の増殖が示された。
全体として、これらの結果は、ＴＣ１細胞を単回注射すると致死量のＮａｌｍ６ Ｂ－ＡＬＬ細胞を投与されたマウスの生存期間を延長することができることを示している。この延長された生存期間は用量依存的であり、ＴＣ１細胞の低用量、中用量及び高用量間に段階的な生存応答が観察される。
実施例５：同種ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたマウスにおける移植片対宿主病の分析
未編集のヒトＴ細胞及びＴＣ１細胞の両方が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性を評価するために、マウスで試験を実施した。２００ｃＧｙでの全身照射後、ＮＯＧ雌性マウスに未編集のヒトＴ細胞又はＴＣ１細胞の静脈内低速ボーラス注射を単回投与した。放射線照射のみ（群１）又は放射線照射に加えてＰＢＭＣ（群２）、電気穿孔されたＴ細胞（群３）若しくはＴＣ１細胞（群４）の単回用量を投与した後、動物を最大１１９日間追跡調査した。１日目の放射線照射の約６時間後に細胞を投与した。表１１は、群及び試験デザインについてまとめたものである。
Figure 2022531185000012
本試験の評価項目は、生存期間、ＧｖＨＤ症状の出現の動態及び体重測定であった。
処置後最初の３０日間中、群１（１２匹の動物のうちの３匹）、群２（６匹の動物のうちの６匹）及び群３（６匹の動物のうちの２匹）に死亡が観察された（図１１）。群４（ＴＣ１細胞）の全ての動物が、予定された剖検まで生存していた（図１１）。群１、２及び３における瀕死の動物は、体重減少及び／又はＧｖＨＤの発症と一致する臨床所見（軽度から重度の触覚の冷たさ、軽度から中程度の痩衰、軽度から顕著な円背、重度の体重減少、軽度から重度の脱毛、重度の活動性低下、中程度の努力呼吸及び顕著な頻呼吸）を示した。群１及び４の動物並びに群３の瀕死でない動物は、放射線照射後に軽度の体重減少を示したが、試験の過程で改善している（図１２）。注目すべき臨床観察は記録されなかった。
本試験は、全ての動物（群２）の放射線照射されたＮＯＧマウスにおいて、未編集のヒトＰＢＭＣが、細胞を投与して２～３週間後に発症した致命的なＧｖＨＤを誘導することを立証するものである。対照的に、ＴＣ１細胞を受けたマウス（群４）は、より多くの細胞がこれらの動物に投与されたにもかかわらず（マウス当たり６×１０６個のＰＢＭＣと比較してマウス当たり３×１０７個のＴＣ１細胞）、試験中（１１９日間）にＧｖＨＤを発症しなかった。放射線照射手法により、全ての群で一過性の体重減少が誘発され、未編集のＰＢＭＣを受けていない全ての群で回復した。
未編集のヒトＴ細胞及びＴＣ１細胞の両方がＧｖＨＤを引き起こす可能性があることを更に評価するために、２回目の試験を実施した。具体的には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）雌性マウスに、全身照射（２００ｃＧｙの総照射線量、１６０ｃＧｙ／分；標的ＬＤＲ０／１４０Ｒ）後、未編集のヒトＴ細胞又はＴＣ１細胞の静脈内低速ボーラス注射を単回投与した。本試験の評価項目は、生存期間、ＧｖＨＤの症状の出現の動態及び体重測定であった。また、全ての採取した組織に病理組織診断を行った。フローサイトメトリー及び必要に応じて免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により、マウスの血液又は組織中の暴露を評価した。
表１２に記載したように、細胞を静脈内低速ボーラスによって単回用量として投与した。
Figure 2022531185000013
有効性の確認された前臨床ソフトウェアシステム（Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ）を使用して、動物を体重により処置群にランダム化した。本試験は規模が大きいため、投与及び剖検作業を９日にわたって交互に行った。バイアスを最小化するために、対照群及びＴＣ１群（群４及び５）からの動物は、同じ日に投与及び剖検を行った。試験の８５日目に、全ての群に剖検を行った。
開始して１４日目に、未編集のヒトＴ細胞を受けた全ての動物（群３）に死亡が観察された（図１３）。未編集のヒトＴ細胞を受けた全てのマウス（群３）は、２９日目までに死亡したことが発見されたか、又は予定外の安楽死に送られたかのいずれかであった。これらの動物の臨床徴候はＧｖＨＤの発症と一致しており、毛並みの悪さ、軽度から重度の活動性の低下、円背姿勢、軽度から中程度のるい痩及び呼吸数の上昇が挙げられる。未編集のヒトＴ細胞を受けたマウス（群３）の安楽死の際、赤血球数、ヘモグロビン数、血小板数、白血球数及び網状赤血球数の減少を含む、血液学的パラメータにおける著しい変化が観察された。群３の動物の肝臓、肺、腎臓、脾臓及び胸腺に、最小から中程度の炎症が観察された。多くの場合、これらの組織では、炎症に壊死が伴っていた。これらの所見は、ＧｖＨＤの発症と一致したものであった。更に、群３の動物の大部分に大腿及び胸骨の骨髄において中程度から重度の低細胞化も存在していたが、これは全身照射の影響に起因するものであると思われた。このことは、全ての他の群では１２週間であったことと比較して剖検日が早かったため（放射線照射後２～４週間）、この群のみで観察されたものと思われた。ＧｖＨＤの存在と一致しているが、群３の動物の免疫組織化学分析により、検査した全ての組織（腎臓、肝臓、脾臓、肺、皮膚及び消化管）にヒトＣＤ４５Ｐ＋Ｐ細胞が存在することが明らかになった。他の群の動物は全て予定された剖検まで生存していた。
更に、群１、２、４又は５では、有意な体重減少は観察されなかった（図１４）。ＧｖＨＤを示す可能性が高いと考えられる少なくとも２つの症状の観測結果を特徴とした、ＧｖＨＤと一致する注目すべき臨床観察は、これらの群では記録されなかった。群４及び５からの数匹の動物は、試験期間の全体にわたって毛並みの悪さ、軽度から中程度の活動性の低下及び／又は軽度のるい痩などの症状を示した。これらの症状はＧｖＨＤと関連することが多いが、それらが観察される頻度は低く、一過性で且つ持続時間も短く、放射線が照射された対照動物（群２）の一部にも見られたことから、ＴＣ１に関連するものではないと思われた。
全体として、これら２つの研究の結果により、ＴＣ１細胞は移植片対宿主病を誘発しないことが確認された。
実施例６：同種ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の開発ロットの調製及び特性解明
臨床研究のために、標準的な白血球アフェレーシス手順によって得られた健康なドナーの末梢血単核細胞からＴＣ１細胞を調製した。Ｔ細胞のために単核細胞を濃縮して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコートしたビーズで活性化し、次いでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質複合体を電気穿孔して、ＣＡＲ遺伝子を含有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって形質導入した。改変Ｔ細胞を細胞培養内で増殖させ、精製し、懸濁液中に配合して凍結保存した。
細胞を改変する前に、異なる６人の健康なドナーからのＴ細胞を、様々な細胞表面マーカーの発現について評価した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法での処置時、ＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の完全奏効と相関することが既に示されている（Ｆｒａｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．２４（５）：５６３－５７１，２０１８）。従って、異なる６人のドナーのＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５Ｏ－Ｔ細胞の存在についてフローサイトメトリーで評価した。要約すると、１×１０６個の細胞を、陰性対照としてＦａｂ－ビオチン又はＩｇＧ－ビオチン抗体と共にインキュベートした。細胞を染色用緩衝液で洗浄し、過剰な一次抗体を捕捉するためにマウス抗ＩｇＧと共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、全てのパネルの二次抗体（ＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号３００９２４、ＣＤ４５ＲＯ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号３０４２３０、ＣＤ２７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号５６０６１２）及び生存率色素と共にインキュベートした。最後に細胞を染色用緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターにかけて様々に染色された集団を捕捉した。図１５は、ＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞のレベルを示している。同種ＣＡＲ－Ｔを量産することにより、目的のドナーのＣＤ８＋分画内に高ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－細胞などの好ましい特性を有するドナーインプット材料を選択することが可能となる。
より具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とを分離するために、１８歳～４０歳の男性ドナーのロイコパックを使用した。単離後、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮して活性化し、細胞にＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（配列番号２６）又はＢ２Ｍ ｓｇＲＮＡ（配列番号２７）を含むリボヌクレオタンパク質複合体を電気穿孔した。電気穿孔前にＴＲＡＣ及びＢ２Ｍリボヌクレオタンパク質複合体を組み合わせた。電気穿孔後、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号４０）をコードするドナー鋳型（配列番号５４）を含む新たに解凍したｒＡＡＶを細胞に加え、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を培養液中で増殖させ、３～４日毎にｒｈＩＬ－２及びｒｈＩＬ－７を補充した。経過観察するように設定した細胞を、ＴＣＲパネル（ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ及びＣＤ４５）を使用してＴ細胞同一性及び遺伝子編集について試験した。Ｔ細胞同一性を確認する際、ビオチン結合抗ＴＣＲαβ抗体及び抗ビオチンビーズと共に細胞をインキュベートすることにより、ＴＣＲαβの除去を行った。除去された細胞を回収し、投与のために製剤化した。得られた細胞の集団は、０．５％未満のＴＣＲαβ＋細胞を有していた。図１６は、精製前後のＴＣＲαβ＋細胞を解析したものを示している。
ＴＣ１細胞の８つの開発ロットをＴ細胞同一性について試験した。試験された８つのロットから得られた平均値により、Ｂ２Ｍの８４．５８％がノックアウトされ（即ち１５．４２％のＢ２Ｍ＋細胞）、細胞の９９．９８％がＴＣＲ－であり（即ち０．２％のＴＣＲ＋）、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの約５０％がノックインされたことが示された（図１７）。
加えて、ドナーの疲弊マーカー及び老化マーカーをＴ細胞編集前後で評価した。具体的には、全体のＴ細胞集団からＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＴＩＭ３＋及びＣＤ５７＋細胞の割合を測定した。マーカーの発現について、以下の二次抗体を使用して、フローサイトメトリーによって上記に記載したように評価した：マウス抗ＰＤ１ ＰｅＣｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８；マウス抗ＴＩＭ３ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５００８；マウス抗ＣＤ５７ ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５９６２２；及びマウス抗ＬＡＧ３ ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６９３０６。図１８は、疲弊マーカー又は老化マーカーが、ゲノム編集後に総Ｔ細胞集団の１５％超に増加しなかったことを示している。
加えて、ＴＣ１細胞の異なる３つのロットによる選択的殺傷をインビトロで評価した。具体的には、ＣＤ１９陽性細胞株（Ｋ５６２－ＣＤ１９、ラージ及びＮａｌｍ６）又はＣＤ１９陰性細胞株（Ｋ５６２）と共にＴＣ１細胞をインキュベートした。フローサイトメトリーをベースにした細胞毒性アッセイを使用して、約２４時間後の殺傷を測定した。具体的には、標的細胞を５μＭのｅｆｌｕｏｒ６７０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で標識し、洗浄して、ＴＣ１又は対照Ｔ細胞とを様々な割合で（Ｔ細胞と標的細胞で０．１：１～最高４：１）共培養して一晩インキュベートした（５０，０００標的細胞／ウェル；９６ウェルＵ底プレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ］）。翌日、ウェルを洗浄し、培地を５ｍｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の１：５００希釈液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有する新しい培地２００μｌと交換し、死滅した／瀕死の細胞を計数した。最後に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに加え、次いで、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用するフローサイトメトリーによって細胞を分析した。フローサイトメトリーのデータファイル（ｆｃｓファイル）の解析には、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ｖ１０、Ｆｌｏｗｊｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用した。対照として、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞（未編集の細胞）を使用した。ＴＣ１細胞によって未編集のＴ細胞よりも高い確率でＣＤ１９陽性細胞が効率的に死滅し、ＣＤ１９陰性細胞は、ＴＣ１細胞の存在下で未編集のＴ細胞と共培養した場合のものに満たない低レベルの細胞溶解を示した（図１９）。
独自の３人のドナーから産生されたＴＣ１細胞を使用して、サイトカイン及び／又は血清の非存在下における増殖についても評価した。具体的には、ＴＣ１細胞を完全Ｔ細胞培地で１４日間増殖させた。０日目に、培養液からの細胞を完全Ｔ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する）、５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ）、ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＩＬ－７（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｆｒｉｅｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａ）のいずれかで増殖させたが、培地は、血清を含むがＩＬ－２若しくはＩＬ－７サイトカインを含まず（５％の血清、サイトカインなし）又は血清若しくはサイトカインを含まない（血清なし、サイトカインなし）ものであった。サイトカイン及び／又は血清を除去した後の最大３５日間に、上記のように細胞を計数した。サイトカイン及び／又は血清の非存在下では、ＴＣ１細胞の増殖が観察されなかった（図２０）。
投与する場合、ＴＣ１細胞は凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－５）中に再懸濁され、６ｍＬの注入バイアルで供給される。総用量が１つ以上のバイアル内に含有される。解凍して２０分以内に各バイアルの注入を行う。
実施例７：再発性又は難治性Ｂ細胞悪性病変を対象とした同種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０）の安全性及び有効性に関する第Ｉ相非盲検多施設用量漸増及びコホート拡大試験
ＣＴＸ１１０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（単一のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、エキソビボで遺伝子改変された同種Ｔ細胞で構成されるＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法である。改変には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α定常（ＴＲＡＣ）座位及びβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）座位を標的とした破壊及びアデノ随伴ウイルス発現カセットによる抗ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子のＴＲＡＣ座位への挿入が含まれる。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号４０）は、配列番号４７を含む抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント、配列番号３２のＣＤ８膜貫通ドメイン、配列番号３６のＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３８のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインで構成されている。
本試験では、適格なヒト患者に、リンパ節除去（ＬＤ）化学療法後にＣＴＸ１１０の静脈内（ＩＶ）注入を受けさせた。
試験集団
用量漸増及びコホート拡大には、Ｂ細胞悪性病変の成人対象が含まれる。対象は、疾患の組織構造に基づいて、独立した用量漸増群に割り当てられる。組み入れられた成人対象には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）非特異型（ＮＯＳ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／若しくはＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、グレード３ｂのＦＬ又はＣＬＬのリヒターの形質転換を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の選択されたサブタイプを有する成人対象が含まれる。
試験目的及び論理的根拠
第１相用量漸増試験の目的は、再発性又は難治性Ｂ細胞悪性病変を対象として、抗ＣＤ１９同種ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０細胞）の安全性及び有効性を評価することである。
再発性／難治性Ｂ細胞悪性病変の患者のアウトカムは、歴史的に見ても良いものではない。しかしながら、この状況で自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法を使用すると、以前の治療選択が緩和的であった場合、完全奏効及び持続的反応が生じている（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９，１３６１－１３６５；Ｍａｕｓ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２２，１８７５－１８８４；Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２５３１－２５４４；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３８０，４５－５６； Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２５４５－２５５４）。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者固有の細胞採取及び量産を必要とする。不都合なことに、一部の患者は白血球アフェレーシスを受ける候補にならないか、又は治療を待つ間に疾患進行を経験するか又は死亡する患者もいる。ＣＴＸ１１０などの既製の同種ＣＡＲ Ｔ細胞生成物は、直ちに入手可能であるという利点をもたらし、量産の際の変動を低減して個々の対象の量産時の不具合を防止することができる。
更に、複数回の化学療法で治療された患者は、疲弊した又は老化した表現型のＴ細胞を有する可能性がある。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法で治療された慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者の奏効率が低いのは、疲弊したＴ細胞表現型に部分的に起因するものであった（Ｆｒａｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，５６３－５７１；Ｒｉｃｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，１６１２－１６２１）。同種による手法は、健康なドナーに由来する化学療法を行っていないＴ細胞から開始することにより、自家生成物と比較してＣＡＲ Ｔ療法の一貫性及び有効性を向上させることができる。
同種ＣＡＲ Ｔ細胞の使用における主な障壁は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクであった。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、信頼性の高い多重細胞編集が可能となる。ＣＴＸ１１０量産プロセスは、ＣＡＲ構築物の導入を相同組み換えによるＴＲＡＣ座位の破壊に結び付けるものである。ＡＡＶで送達されるＤＮＡドナー鋳型及びＨＤＲを使用したＣＡＲの送達及びＴＲＡＣゲノム遺伝子座での正確な挿入は、レンチウイルス及びレトロウイルス形質導入方法を使用したランダムな遺伝物質の挿入とは対照的である。ＴＲＡＣ座位にＣＡＲ遺伝子を挿入すると、ＣＡＲを発現するほぼ全ての細胞でＴＣＲが排除される結果となり、ＧｖＨＤのリスクが最小限に抑えられる。更に、健康なドナー細胞から量産することにより、悪性Ｂ細胞を意図せずに形質導入するリスクが排除される（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，１４９９－１５０３）。再発性／難治性Ｂ細胞悪性病変を対象とした本ヒト初回投与試験は、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変同種ＣＡＲ Ｔ細胞手法によるＣＴＸ１１０の安全性並びに有効性を評価することを目的とするものである。
ＣＴＸ１１０は、ＣＤ１９指向性の遺伝子改変された同種Ｔ細胞免疫療法であり、健康なドナーの細胞から量産される。従って、得られた量産された細胞は、一貫した信頼性の高い品質の最終生成物を各対象に提供することを目的としている。更に、ＡＡＶ及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用してＴＲＡＣ部位にＣＡＲを正確に送達及び挿入することによるＣＴＸ１１０の量産には、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターのランダムな挿入に関連するリスクが存在しない。
目標
主目的、パートＡ（用量漸増）：再発性又は難治性Ｂ細胞悪性病変を対象とした、様々なリンパ節除去剤を併用したＣＴＸ１１０の漸増用量の安全性を評価し、推奨されるパートＢの用量を決定する。
主目的、パートＢ（コホート拡大）：再発性又は難治性Ｂ細胞悪性病変を対象とした、客観的奏効率（ＯＲＲ）によって測定した場合のＣＴＸ１１０の有効性を評価する。
副次的目的（パートＡ及びＢ）：ＣＴＸ１１０の有効性、安全性及び薬物動態を更に特性解明する。
探索的目的（パートＡ及びＢ）：臨床反応、抵抗性、安全性又は薬力学的活性を提示又は予測することができる、ＣＴＸ１１０に関連するゲノム、代謝及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを同定する。
評価項目
主要評価項目
・パートＡ：用量制限毒性として定義される有害事象の発生率。
・パートＢ：独立中央画像判定機関によって決定された、Ｌｕｇａｎｏ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｃｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３２，３０５９－３０６８）による完全奏効（ＣＲ）＋部分奏効（ＰＲ）として定義される客観的奏効率（ＯＲＲ）。
Ｌｕｇａｎｏ分類は、リンパ腫の対象の画像診断を評価するための標準的な方法を提供するものである。これは、診断用ＣＴにおける腫瘍負荷の放射線学的評価及びＦＤＧ集積病理組織のＦ１８ ＦＤＧ－ＰＥＴにおける代謝評価で構成される（表１３～１４を参照されたい）。
Figure 2022531185000014
Figure 2022531185000015
Figure 2022531185000016
副次的評価項目（用量漸増及びコホート拡大）
有効性
・奏効／寛解期間（中央読影／評価）。客観的奏効事象のあった対象のみ、奏効／寛解期間を記録する。この期間は、最初の客観的奏効と、疾患が進行した日又は何らかの原因により死亡した日との間の時間として計算される。
・無増悪生存期間／無イベント生存期間（中央読影／評価）。無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び無イベント生存期間は、ＣＴＸ１１０を注入した日と、疾患が進行した日又は何らかの原因により死亡した日との間の差として計算される。進行せず、データカットオフ日においてもなお試験に参加している対照は、最後の評価日をもって打ち切りとした。
・全生存期間。全生存期間は、ＣＴＸ１１０の初回投与日と、何らかの原因により死亡した日との間の時間として計算される。データカットオフ日に生存している対象は、生存が確認された最後の日をもって打ち切りとした。
安全性
・ＡＥの頻度及び重症度並びに臨床的に重大な検査所見の異常。
薬物動態
・経時的な血中のＣＴＸ１１０濃度。
探索的評価項目（用量漸増及びコホート拡大）
・組織内のＣＴＸ１１０濃度（例えば、プロトコルに指定された試料採取に従って採取された任意の試料で、骨髄、ＣＳＦ及び／又は腫瘍組織中のＣＴＸ１１０のトラフィッキングを評価することができる）。
・血中のサイトカイン及び他の組織の濃度。
・抗ＣＴＸ１１０抗体の発現率。
・経時的なＢ細胞及び免疫グロブリンの濃度。
・ＣＴＸ１１０増殖、ＣＲＳ及び奏効に対する抗サイトカイン療法の影響。
・ＣＴＸ１１０療法後の自家又は同種ＨＳＣＴの発生率。
・その後の抗癌療法の頻度及び種類。
・完全奏効／寛解までの時間。
・初回後の無治療生存期間。
・他のゲノム、タンパク質、代謝又は薬力学的評価項目。
試験デザイン
本試験は、再発性又は難治性Ｂ細胞悪性病変を対象とした、ＣＴＸ１１０の安全性及び有効性を評価する非盲検多施設第１相試験である。試験は、用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の２つのパートに分かれている。
パートＡでは、以下のＮＨＬサブタイプの１つを有する成人対象において、コホートＡでＣＴＸ１１０の漸増投与について検査する：ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／若しくはＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、グレード３ｂのＦＬ又は形質転換ＦＬ。
本試験の用量漸増パートでは、コホートＡと同様のＮＨＬ集団を有する更なる１つのコホート（コホートＢ）を追加し、コホートＡ（５００ｍｇ／ｍ２）と比較して増量した用量（７５０ｍｇ／ｍ２）のシクロホスファミドについて調査した。増量した用量のシクロホスファミドでコホートＢの対象を処置し、ＣＴＸ１１０注入後のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖に対するリンパ球のより長期の抑制効果を調査する（表１５を参照されたい）。
Figure 2022531185000017
試験は、用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の２つのパートに分かれている。本試験の両方のパートは、３つの主要な段階：スクリーニング、処置及び追跡調査で構成されている。試験スキーマの概略図を図２１に示す。
評価スケジュールを表１６及び表１７に示す。
段階１－処置に対する適格性を判断するためのスクリーニング（最大１４日間）。
段階２－リンパ球除去（ＬＤ）化学療法及びＣＴＸ１１０の注入（１～２週間）。ＬＤ化学療法の開始及びＣＴＸ１１０の注入の両方を行う前に、対象の臨床的適格性を再確認する必要がある。
段階２Ａ－ＬＤ化学療法：
コホートＡ：フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を静注（ＩＶ）で毎日３日間併用投与した。
コホートＢ：フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２を静注（ＩＶ）で毎日３日間併用投与した。
段階２Ｂ－ＣＴＸ１１０の注入：
コホートＡ（ＮＨＬサブセット）：リンパ球除去（ＬＤ）化学療法（フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を静注［ＩＶ］で毎日３日間）を、ＣＴＸ１１０注入前の少なくとも４８時間（ただし、７日間以下）に完了した（用量レベル［ＤＬ］１から用量を漸増する）。
コホートＢ（より高用量のＬＤ化学療法）：ＬＤ化学療法（フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２をＩＶで毎日３日間）を、ＣＴＸ１１０注入前の少なくとも４８時間（ただし７日間以下）に完了した（用量レベル［ＤＬ］２から用量を漸増する）。
段階３－追跡調査（最後にＣＴＸ１１０注入を行ってから５年後）。
用量漸増及びコホート拡大のいずれの場合も、対象はＣＴＸ１１０注入後の２８日間、調査現場の近辺の範囲内（即ち１時間の移動時間）に留まる必要がある。この急性毒性の経過観察期間中に、対象はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性及びＧｖＨＤを含む有害事象（ＡＥ）について定期的に評価される。毒性管理ガイドラインは試験プロトコルで提供される。用量増量中、対象全員がＣＴＸ１１０の注入後最初の７日間入院するが、地域の規制又は現場の慣習により必要とされる場合、それより長期間入院することになる。
急性毒性の経過観察期間の後、次にＣＴＸ１１０注入後の最長で５年間、身体検査、定期的な臨床検査評価及び画像評価並びにＡＥ評価によって対象を追跡調査する。本試験の完了後、長期安全性及び生存期間を評価するために、対象は更に１０年間、別の長期追跡調査試験に参加することが必要となる。
ＬＤ化学療法は、以下の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に遅らせなければならない：
・治験責任医師によるとＬＤ化学療法に関連するＡＥの潜在的リスクを増大させる、臨床状態の著しい悪化。
・飽和レベル＞９１％を維持するために、酸素補給を必要とすること。
・新たなコントロール不良な心不整脈。
・血管収縮薬のサポートが必要とされる低血圧。
・活動性感染症：処置に反応しない細菌、真菌又はウイルスの血液培養が陽性であること。
・グレード≧２の急性神経毒性。
Figure 2022531185000018
Figure 2022531185000019
Figure 2022531185000020
Figure 2022531185000021
Figure 2022531185000022
リンパ球除去の目標としては、注入後にＣＡＲ Ｔ細胞を大幅に増殖することを可能にすることである。いくつかの自己ＣＡＲ Ｔ細胞治験では、様々な用量にわたるフルダラビン及びシクロホスファミドからなるＬＤ化学療法を利用することに成功している。ＬＤ化学療法を使用するための論理的根拠は、インターロイキン７（ＩＬ－７）及びインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などのサイトカインの有効性を増強する制御性Ｔ細胞及び他の「サイトカインシンク」として機能する免疫系の競合要素を排除することにある（Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１０，１８５－１９２；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０２，９０７－９１２）。更に、ナイーブＴ細胞の総数が特定の閾値未満に減少すると、ナイーブＴ細胞が増殖し、メモリー様Ｔ細胞に分化し始めると考えられている（Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１０，１８５－１９２）。コホートＡでは、シクロホスファミド（５００ｍｇ／ｍ２）及びフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２）を、アキシカブタゲンシロロイセルの承認申請臨床試験で使用された用量と一致する用量で使用する。コホートＢでは、より高用量のシクロホスファミド（７５０ｍｇ／ｍ２）を使用し、増強されたリンパ節除去の強度によって同種ＣＡＲ Ｔ細胞生成物の増殖を促進することができるかどうかを評価する。この範囲内（合計で＞１２０ｍｇ／ｋｇ又は３ｇ／ｍ２）のシクロホスファミドの用量は、血液悪性病変のＣＡＲ Ｔ細胞療法試験において既に使用されている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ，１１８，４８１７－４８２８；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３３，５４０－５４９；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，８，３５５ｒａ１１６）。より強度の高いＬＤ化学療法の一部として使用するとき、シクロホスファミドの用量を増加すると有効性が向上することが関連付けられている（Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｂｌｏｏｄ，１３３，１８７６－１８８７）。
ＣＴＸ１１０の注入は、以下の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に遅らせなければならない：
・新たな活動性のコントロール不良な感染症。
・治験責任医師の見解で、毒性のリスクの増大した状況に対象が置かれるような、ＬＤ化学療法開始前と比較した臨床状態の悪化。
・グレード≧２の急性神経毒性。
ＣＴＸ１１０の用量
ＣＴＸ１１０細胞は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数に基づいて固定用量スキーマを使用してＩＶ投与する。開始用量は３×１０７個のＣＡＲ＋Ｔ細胞であり、これは、ＫＹＭＲＩＡＨ（登録商標）（５×１０８個の総ＣＡＲ Ｔ細胞）及びＹＥＳＣＡＲＴＡ（登録商標）（２×１０６ｋｇ、最大で２×１０８個のＣＡＲ Ｔ細胞）などの、現時点でＮＨＬに承認されている自家ＣＡＲ Ｔ細胞の用量よりも約１ｌｏｇ低いものである。
用量漸増
用量漸増は、標準的な３＋３デザインで実施する。コホートＡのＤＬ１で開始する本試験では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞に基づくＣＴＸ１１０を投与した後について評価し得る。Ｓａｆｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＲＣ）によってコホートＡのＤＬ２の安全性が評価及び確認されて初めて、後続のコホートＢを開設／組み入れ、ＤＬ２から用量漸増を開始し得る。本試験の用量制限が７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇであるため、対象の体重が≧６０ｋｇである場合、コホートＡ及び／又はコホートＢにおいてＤＬ４で試験を進め得る（表１８を参照されたい）。
Figure 2022531185000023
ＤＬＴ評価期間をＣＴＸ１１０注入時に開始し、２８日間継続する。各コホートの最初の３人の対象は、前の対象がＤＬＴ評価期間を完了した後に２番目及び３番目の対象のみがＣＴＸ１１０を受けるように、時間差で処置される。後続の用量レベル又は同じ用量レベルの拡大では、コホートに最大３人の対象を組み入れて同時に投与し得る。
対象は、ＤＬＴを評価するためにＣＴＸ１１０を受ける必要がある。ＣＴＸ１１０注入前の任意の時点で対象が試験を中断した場合、対象はＤＬＴの評価を受けず、この中断した対象と同じ用量レベルで代替の対象が組み入れられる。ＤＬＴを評価可能な対象に潜在的なＤＬＴの徴候又は症状がある場合、ＤＬＴが宣告される前に改善又は回復することが可能となるように、プロトコルで定義されたウィンドウに従ってＤＬＴ評価期間を延長する。
毒性は、ＣＲＳ（Ｌｅｅ基準）、神経毒性（ＩＣＡＮＳ、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群基準及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０）及びＧｖＨＤ（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ａｃｕｔｅ ＧＶＨＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ［ＭＡＧＩＣ］基準）を除き、米国国立がん研究所の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）第５版に従ってグレード分類及び記録する。
ＤＬＴは、（発症時に対して）特定の期間を超えて持続する、ＤＬＴ評価期間中に発生した以下の事象のいずれかとして定義される。
・ステロイド抵抗性のグレード≧２のＧｖＨＤ（例えば、ステロイド治療［例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日］の３日後の進行性疾患、７日後の安定疾患又は治療して１４日後の部分奏効）。
・ＤＬＴ期間中の死亡（疾患進行に起因するものを除く）。
・治験責任医師の判断により臨床的に重大な、７２時間以内に改善しない任意のグレード３又は４の毒性。
・以下のものはＤＬＴであるとみなさない。
○７２時間以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４のＣＲＳ。
○１４日以内にグレード≦２に改善するグレード３又は４の神経毒性（例えば、脳症、錯乱）。
○グレード３又は４の発熱。
○血小板減少（血小板数＜５０×１０９個／Ｌ）の状態での出血、好中球減少（絶対好中球数＜１０００／ｍｍ３）の状態での確認された細菌感染症又は発熱。
○グレード３又は４の低ガンマグロブリン症。
○７日以内にグレード≦２まで回復したグレード３又は４の肺毒性。支持療法による体液過剰のために挿管されている対象の場合、この期間を１４日間に延長し得る。
○１４日以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の肝機能検査。
○２１日以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の腎不全。
○後ろ向きに評価されるグレード３又は４の血小板減少又は好中球減少。少なくとも６人の対象に注入した後、対象の≧５０％に長期間の血球減少がある（即ち注入後２８日以上継続している）場合、ＳＲＣ評価の結果が出るまで用量漸増を中断する。
ＣＴＸ１１０との妥当な因果関係のないＡＥは、ＤＬＴであるとみなさない。
毒性管理
ＣＴＸ１１０注入後、少なくとも２８日間は対象を注意深く経過観察しければならない。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法では重大な毒性が報告されており、治験責任医師はプロトコルガイダンスに従って全ての有害事象を積極的に経過観察し、処置することが必要となる。
ＣＤ１９指向性自己ＣＡＲ Ｔ細胞療法での以前の経験に基づいて、以下の一般的な推奨事項が提供されている。
・発熱はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の最も一般的な初期症状である。しかしながら、対象は最初の症状として脱力感、低血圧又は錯乱を示す場合もある。
・ＣＲＳの診断は、臨床検査値ではなく臨床症状に基づいて行われるべきである。
・ＣＲＳに固有の管理に反応を示さない対象では、常に敗血症及び抵抗性感染症を考慮する。抵抗性又は緊急を要する細菌感染症並びに真菌又はウイルス感染症について対象を継続的に評価しなければならない。
・ＣＡＲ Ｔ細胞注入後、ＣＲＳ、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）及び腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）が同時に発生する可能性がある。全ての状態の徴候及び症状について対象を一貫して経過観察し、適切に管理しなければならない。
・神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復時又はＣＲＳの回復後に発生する可能性がある。神経毒性のグレード分類及び管理は、ＣＲＳとは別に実施する。
・トシリズマブは指示を受けたときから２時間以内に投与しなければならない。
試験全体を通してＣＴＸ１１０の安全性プロファイルを継続的に評価し、治験責任医師はＣＴＸ１１０に関連する潜在的な毒性の特定及び管理に関する新しい情報による定期的な更新を受ける。
注入反応
自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞の治験において、一過性の発熱、悪寒及び／又は悪心を含む注入反応が報告されている。注入反応が発生した場合、必要に応じてアセトアミノフェン（パラセタモール）及び塩化ジフェンヒドラミン（又は他のＨ１－抗ヒスタミン剤）をＣＴＸ１１０注入後の６時間毎に繰り返し与え得る。対象にアセトアミノフェンで緩和されない発熱が続く場合、必要に応じて非ステロイド系抗炎症薬を処方し得る。全身性ステロイドは、この介入によってＣＡＲ Ｔ細胞に有害な影響を及ぼす可能性があるため、生命を脅かす緊急事態の場合を除いて投与すべきではない。
発熱反応及び感染症予防
感染症予防は、施設の標準治療に従って易感染性状態のＢ細胞悪性病変の患者に対して行わなければならない。発熱反応がある場合、感染症の評価を開始し、治療する医師が医学的に指示し、決定された通りの抗生物質、輸液及び他の支持療法によって対象を適切に管理しなければならない。発熱が持続する場合、対象の医学的管理の全体を通してウイルス及び真菌の感染を考慮すべきである。ＣＴＸ１１０注入後に対象が敗血症又は全身性菌血症を発症した場合、適切な培養及び医学的管理を開始しなければならない。更に、ＣＴＸ１１０注入後の３０日以内に発熱したいずれの場合にもＣＲＳを考慮に入れるべきである。
腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象は、ＴＬＳのリスクが高くなる。ＬＤ化学療法の開始からＣＴＸ１１０注入後２８日までは、臨床検査評価及び症状によりＴＬＳについて対象を注意深く経過観察する必要がある。スクリーニング中及びＬＤ化学療法の開始前に、全ての対象に予防的にアロプリノール（又はフェブキソスタットなどのアロプリノールでない代替薬）を受けさせ、経口／ＩＶでの水分補給を増やす必要がある。ＣＴＸ１１０注入の２８日後又はＴＬＳのリスクが過ぎ去ってから予防を中止することができる。
部位を、それらの標準治療により又は公表されたガイドラインに従って経過観察し、ＴＬＳを治療しなければならない（Ｃａｉｒｏ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，（２００４）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，１２７，３－１１）。ラスブリカーゼの投与を含むＴＬＳの管理は、臨床的に必要である場合、直ちに開始すべきである。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）
ＣＲＳは、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞療法で報告された主要な毒性である。ＣＲＳは、ＣＡＲが標的抗原に結合したことに反応して免疫系が過剰に活性化するために生じるものであり、急激なＴ細胞の刺激及び増殖によりマルチサイトカインの上昇がもたらされる（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，２２９６；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ，２０，１１９－１２２）。サイトカインが放出されると、心臓、胃腸（ＧＩ）、神経、呼吸器（呼吸困難、低酸素）、皮膚、心血管（低血圧、頻脈）及び全身症状（発熱、硬直、発汗、食欲不振、頭痛、倦怠感、疲労、関節痛、悪心及び嘔吐）並びに検査所見の異常（凝固、腎臓及び肝臓）を含む、ＣＲＳに関連した様々な臨床徴候及び症状が生じ得る。
ＣＲＳの管理の目標は、ＣＴＸ１１０の抗腫瘍効果の可能性を維持しながら、生命を脅かす後遺症を防止することである。症状は通常、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法の１～１４日後に発症するが、同種ＣＡＲ Ｔ細胞については、症状の発症するタイミングが完全には定義されていない。
ＣＲＳは、臨床検査でのサイトカイン測定値ではなく、臨床症状に基づいて特定し、治療すべきである。ＣＲＳが疑われる場合、公表されているガイドラインから採用した表１９の推奨事項に従ってグレード分類及び管理を実施する必要がある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，１８８－１９５）。Ｌｅｅによる独自のＣＲＳグレード分類基準が開発されて以来、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を使用する医師は、ＣＲＳの症状及び時間経過についてより深い理解を得ている。近年の米国血液骨髄移植学会（ＡＳＢＭＴ）のコンセンサス基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）では、低血圧及び／又は低酸素を伴う発熱の有無に基づいてグレード分類を行うべきであること及び他の末端臓器毒性は支持療法で個別に管理すべきであることを推奨している。従って、本プロトコルでは、神経毒性を異なるスケールを使用してグレード分類及び管理し（「免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）」と題する項を参照されたい）、ＣＲＳの管理の文脈における末端臓器毒性は、肝臓及び腎臓系のみを指す（Ｐｅｎｎ Ｇｒａｄｉｎｇ ｃｒｉｔｅｒｉａ；（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１１，３５の通り）。治験依頼者は、ＣＴＸ１１０及び他のＣＡＲ Ｔ細胞療法の臨床経験に基づいて、ＣＲＳのグレード分類基準及び毒性管理アルゴリズムを改訂し、ＡＳＢＭＴのコンセンサス案を反映することを決定し得る。
Figure 2022531185000024
Figure 2022531185000025
ＣＲＳの期間全体を通して、対象に解熱剤、ＩＶ輸液及び酸素からなる支持療法を施す必要がある。グレード≧２のＣＲＳ（例えば低血圧、輸液に反応を示さないか、又は酸素補給を必要とする低酸素）を示す対象は、継続的な心電図遠隔測定及びパルスオキシメトリーで経過観察する必要がある。グレード３のＣＲＳを示す対象には、心機能を評価するために心エコーの実施を考慮する。グレード３、４のＣＲＳに関しては、集中治療の支持療法を考慮する。低酸素によるものではなく、神経毒性（例えば、発作）による気道保護のための挿管は、グレード４のＣＲＳとして記録すべきではない。同様に、他のＣＲＳの徴候（例えば、低酸素）を伴わない神経毒性による長時間の挿管は、グレード４のＣＲＳとはみなさない。重度のＣＲＳの場合、症状（発熱、低血圧、低酸素）が類似しているため、治験責任医師は常に潜在的な感染症の可能性を考慮する必要がある。ＣＲＳの回復とは、発熱（体温≧３８℃）、低酸素及び低血圧が回復することとして定義されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）
自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞療法では、神経毒性が観察されている。神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復時又はＣＲＳの回復後に発生する可能性があり、その病態生理は不明である。近年のＡＳＢＭＴのコンセンサスでは、ＣＲＳに伴う神経毒性を、内在性の又は注入されたＴ細胞及び／又は他の免疫エフェクター細胞の活性化又は会合をもたらす任意の免疫療法後のＣＮＳに関与する病理過程を特徴とする障害である免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）であると更に定義している（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。徴候及び症状は進行性である可能性があり、失語症、意識レベルの変化、認知技能の機能障害、運動麻痺、発作及び脳浮腫を含み得る。ＩＣＡＮＳのグレード分類は、ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＯＸｉｃｉｔｙ（ＣＡＲＴＯＸ）ワーキンググループの基準に基づいて開発されており、以前は自家ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床試験で使用されていた（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２５３１－２５４４）。ＩＣＡＮＳでは、ＩＣＥ（免疫エフェクター細胞関連脳症）評価ツールと呼ばれる修正された評価ツールを使用することにより、意識レベル、発作の有無、運動所見、脳浮腫の有無の評価及び神経性領域の全体的な評価を組み入れている（表２１を参照されたい）。
任意の新たに発症した神経毒性の評価には、神経学的検査（ＩＣＥ評価ツールを含む、表２２）、脳ＭＲＩ及び臨床的に必要であればＣＳＦの検査（腰椎穿刺による）が含まれていなければならない。脳ＭＲＩが実行できない場合、脳内出血の可能性を除外するために、対象全員に非造影ＣＴを受けさせる必要がある。臨床的に必要であれば、脳波も考慮に入れる必要がある。重症例では、気道保護のために気管内挿管が必要になる場合がある。
ＣＴＸ１１０注入後の少なくとも２１日間又は神経学的症状が回復した時点で、対象全員に非鎮静性型の抗発作予防（例えば、レベチラセタム）を考慮すべきである（抗発作薬剤が有害な症状の要因となっていると治験責任医師がみなす場合を除く）。ＩＣＡＮＳのグレードが≧２を示す対象は、心電図遠隔測定及びパルスオキシメトリーによって継続的に経過観察する必要がある。重度又は生命を脅かす神経毒性に対しては、集中治療の支持療法を施すべきである。神経内科の受診を常に考慮すべきである。血小板及び凝固障害の徴候について経過観察し、脳内出血のリスクを低減させるために血液製剤を適切に輸液すること。表２１に神経毒性のグレード分類を示し、表２３に管理ガイダンスを示す。
積極的なステロイド処置を、３日を超えて受ける対象には、長期間のステロイドの使用による重症感染のリスクを軽減するために、抗真菌及び抗ウイルス予防が推奨されている。抗微生物の予防も考慮に入れる必要がある。
Figure 2022531185000026
Figure 2022531185000027
ＩＣＥ評価は、スクリーニング時、１日目のＣＴＸ１１０投与前並びに２日目、３日目、５日目、８日目及び２８日目に実施する。対象がＣＮＳの症状を示す場合、症状が回復するまでＩＣＥ評価を約２日毎に継続して実施する必要がある。変動性を最小限に抑えるために、可能であればいつでも、ＩＣＥ評価の実施に精通しているか又は訓練を受けた同一の研究職員によって評価を実施するべきである。
Figure 2022531185000028
発熱状態又は化学療法後に生じる可能性のある頭痛は非特異的症状である。頭痛単独では必ずしもＩＣＡＮＳの症状ではない場合もあり、更なる評価を行う必要がある。体調偏移及び筋力低下から生じる脱力感又は平衡感覚障害は、ＩＣＡＮＳの定義から除外されている。同様に、これらの対象では、随伴する浮腫の有無にかかわらず、凝固障害によって頭蓋内出血が発生する可能性があり、ＩＣＡＮＳの定義からも除外される。これらの及び他の神経毒性は、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って記録しなければならない。
Ｂ細胞形成不全
Ｂ細胞形成不全が起こる可能性があり、その後の免疫グロブリンＧの血中濃度によって経過観察をする。施設の標準治療に従い、臨床的に重大な低ガンマグロブリン症（全身性感染症）に対してγグロブリンがＩＶで投与される。
血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）
ＨＬＨは、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞による治療の後に報告されている（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ，２６，４３－４９；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７１，１５０７－１５１７；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｌｏｏｄ，１２５，４０１７－４０２３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，７，３０３ｒａ１３９；Ｔｅａｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，５１５４－５１５７。ＨＬＨは、活性化Ｔ細胞からのサイトカインの産生によって過剰なマクロファージの活性化をもたらす、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の炎症反応の結果として生じる臨床症候群である。ＨＬＨの徴候及び症状には、発熱、血球減少、肝脾腫、高ビリルビン血症を伴う肝障害、フィブリノーゲンが著しく低下する凝固障害並びにフェリチン及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の顕著な上昇が含まれ得る。神経学的所見も観察されている（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ，１１８，４０４１－４０５２；Ｌａ Ｒｏｓｅｅ，（２０１５）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ，１９０－１９６。
ＣＲＳ及びＨＬＨは、臨床的特徴及び病態生理が重複した、類似する臨床症候群を有し得る。ＨＬＨは、ＣＲＳの発症時又はＣＲＳが回復しているときに発生する可能性が高い。他のＣＲＳのエビデンスの有無にかかわらず、原因不明の肝機能検査値の上昇又は血球減少がある場合、ＨＬＨを考慮すべきである。ＣＲＰ及びフェリチンを経過観察することは、診断の促進し、臨床経過を明確にすることができる。ＨＬＨが疑われる場合、
・フィブリノーゲンを含む凝固パラメータを頻繁に経過観察する。これらの試験は、評価スケジュールで指示されたものよりも頻繁に行われ得、検査所見に基づいて頻度を促進する必要がある。
・出血のリスクを低減するため、フィブリノーゲンは≧１００ｍｇ／ｄＬに維持しなければならない。
・血液製剤によって凝固障害を是正しなければならない。
・ＣＲＳとの重複を考慮して、対象を更に表１９のＣＲＳ治療ガイダンスに従って管理するべきである。
血球減少
自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞生成物で治療した対象において、注入後２８日を超えて持続する際にグレード３の好中球減少及び血小板減少が報告されている（Ｋｙｍｒｉａｈ ＵＳＰＩ，２０１７；Ｙｅｓｃａｒｔａ ＵＳＰＩ，２０１７）。従って、ＣＴＸ１１０を受けた対象は、このような毒性について経過観察を受け、適切な支援を受けなければならない。長期間の好中球減少症の任意の対象に対し、抗微生物及び抗真菌予防を考慮しなければならない。
Ｇ－ＣＳＦは、ＣＲＳのリスクが過ぎ去ったときの、ＣＴＸ１１０を注入して２１日後のグレード４の好中球減少の場合に考慮され得る。
移植片対宿主病
ＧｖＨＤは同種ＨＳＣＴの状態において見られるものであり、免疫適格性のドナーのＴ細胞（移植片）がレシピエント（宿主）を異物と認識した結果として生じるものである。その後の免疫反応では、ドナーのＴ細胞が活性化し、異物である抗原保有細胞を排除するためにレシピエントを攻撃する。ＧｖＨＤは、同種ＨＳＣＴからの時間及び臨床症状の両方に基づいて、急性症候群、慢性症候群及びオーバーラップ症候群に分けられる。急性ＧｖＨＤの徴候には、斑状丘疹状皮疹；胆汁うっ滞をもたらす小胆管の損傷に起因する黄疸を伴う高ビリルビン血症；悪心、嘔吐及び食欲不振；並びに水様性下痢又は血性下痢及び痙性腹痛を挙げることができる（Ｚｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂｌａｚａｒ，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２１６７－２１７９。
提唱されている臨床試験を裏付けるために、免疫不全マウスにおいて、提唱された全ての臨床用量レベルを少なくとも１０倍上回る２つの用量で、非臨床の優良試験所基準（ＧＬＰ）に準拠したＧｖＨＤ及び忍容性試験を実施した。更に、ＴＲＡＣ座位でＣＡＲを挿入するという特異性により、Ｔ細胞がＣＡＲ＋及びＴＣＲ＋の両方である可能性は極めて低い。残りのＴＣＲ＋細胞を、量産過程中に抗ＴＣＲ抗体カラムのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより除去し、最終生成物中＜０．５％のＴＣＲ＋細胞を得た。全ての用量レベルに７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの用量制限が課せられる。この制限値は、ハプロタイプ一致ドナーによるＳＣＴ中に重篤なＧｖＨＤを引き起こす可能性のある同種細胞の数に関して公表された報告書に基づいた１×１０５ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの制限値よりも低い（Ｂｅｒｔａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，８２２－８２６。このような特定の編集、精製及び厳格な製品リリース基準によれば、ＣＴＸ１１０後のＧｖＨＤのリスクは低いはずであるが、真の発生率は未知である。ＣＴＸ１１０の注入後は、急性ＧｖＨＤの徴候について対象を注意深く経過観察する必要がある。潜在的な症状のタイミングは未知である。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖は抗原主導のものであり、且つＴＣＲ細胞でのみ起こる可能性が高いことを考えると、ＴＣＲ＋細胞の数が注入された数を上回り、認識可能な程度まで増加する可能性は低い。
ＧｖＨＤの診断及びグレード分類は、表２４に概説するように、公表されている基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２２，４－１０）に基づいて行わなければならない。
Figure 2022531185000029
全体的なＧｖＨＤのグレードは、最も重篤な標的臓器障害に基づいて決定される。
・グレード０：ステージ１～４の臓器がまったくない。
・グレード１：肝臓、上部ＧＩ又は下部ＧＩ障害を伴わないステージ１～２の皮膚。
・グレード２：ステージ３の発疹及び／又はステージ１の肝臓及び／又はステージ１の上部ＧＩ及び／又はステージ１の下部ＧＩ。
・グレード３：ステージ０～３の皮膚及び／又はステージ０～１の上部ＧＩを伴うステージ２～３の肝臓及び／又はステージ２～３の下部ＧＩ。
・グレード４：ステージ０～１の上部ＧＩを伴うステージ４の皮膚、肝臓又は下部ＧＩ障害。
感染症及び薬剤に対する反応性などの、ＧｖＨＤを模倣する可能性のある潜在的な交絡因子を除外しなければならない。確認のため、治療を開始する前又は治療を開始した直後に皮膚生検及び／又はＧＩ生検を入手する必要がある。肝臓障害がある場合、臨床的に実行可能であれば、肝生検を試みるべきである。また、病理評価のために、全ての生検試料を中央検査機関に送付する。試料の調製及び発送の詳細は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに収録されている。
急性ＧｖＨＤの管理に関する推奨事項を表２５で概説する。治験終了時に対象間の比較ができるように、治験責任医師は、推奨事項に従うことによって対象を危険にさらす恐れのある特定の臨床シナリオを除いて、これらの推奨事項に従わなければならない。
Figure 2022531185000030
より重度のＧｖＨＤの対象に対して、二次治療を開始するという判断を直ちに下さなければならない。例えば、ＧｖＨＤの症状が進行して３日後、グレード３のＧｖＨＤが持続して１週間後又はグレード２のＧｖＨＤが持続して２週間後に二次治療が指示される。高用量のグルココルチコイド治療に忍容性のない可能性のある対象には、より早期の二次全身療法を指示し得る（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１８，１１５０－１１６３）。二次治療の選択及び開始時期は、治験責任医師の臨床的判断及び地域における慣行に基づく。
難治性の急性ＧｖＨＤ又は慢性ＧｖＨＤの管理は、施設のガイドラインに従う。免疫抑制剤（ステロイドを含む）によって対象を治療する場合、地域のガイドラインに従って抗感染症予防対策を導入する必要がある。
低血圧及び腎不全
ＣＡＲ Ｔ細胞療法では、低血圧及び腎不全が報告されており、施設の診療ガイドラインに従って生理食塩水をＩＶでボーラス投与することによって治療する必要がある。適切であれば、透析を考慮する必要がある。
試験適格性
組み入れ基準
本試験に参加するのに適格であるとみなすには、対象は以下に列挙される組み入れ基準を満たさなければならない（任意と示される場合を除く）：
１．≧１８歳且つ体重＞５０ｋｇ（任意）。
２．プロトコルに必要とされる試験手順を理解して遵守することができ、自発的に書面のインフォームドコンセント文書に署名することができる。
３．以下のＢ細胞悪性病変の１つと診断されている：
組織学的に確認されたＢ細胞ＮＨＬ：ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／若しくはＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換ＦＬ又はグレード３ｂのＦＬ。
・地域の病理研究室による腫瘍組織構造（最後に再発／進行してからの保存組織［組み入れから３ヵ月以内］又はスクリーニング中の生検）の確認。
・Ｌｕｇａｎｏ基準によって定義されるようなフルオロデオキシグルコース陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が陽性の、少なくとも１つの測定可能な病変（Ｌｕｇａｎｏ基準５点スケールで４又は５のスコア）。以前に放射線が照射された病変は、放射線療法の完了後に進行が記録された場合に限り、測定可能であるとみなされる。
４．以下のコホート固有の基準によって認められるような、難治性又は再発性疾患。
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体及びアントラサイクリン含有治療計画を含む２種以上の前治療、且つ以前に自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に失敗しているか、又は以前に自家ＨＳＣＴに不適格であったか若しくは拒絶された場合。自家ＨＳＣＴを受けた対象は、ＨＳＣＴに関連する毒性から回復している必要がある。
・難治性疾患の場合、対象が最後の治療で進行性疾患を有するか、又は最大６ヵ月の安定疾患の期間で少なくとも治療の２サイクル後に安定疾患を有する必要がある。
・形質転換ＦＬの対象の場合、対象は、ＤＬＢＣＬに形質転換した後の疾患に対して少なくとも１種類の化学療法を受けている必要がある。
５．米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が０又は１である。
６．ＬＤ化学療法及びＣＡＲ Ｔ細胞注入を受ける基準を満たしている。
７．以下の十分な臓器機能：
・腎臓：推定される糸球体濾過率が＞５０ｍｌ／分／１．７３ｍ２であること。
・肝臓：アスパラギン酸トランスアミナーゼ又はアラニントランスアミナーゼが＜３×正常上限（ＵＬＮ）であり；総ビリルビンが＜１．５×ＵＬＮ（ジルベール症候群の対象の場合、総ビリルビンが＜２ｍｇ／ｄＬ）であること。
・心臓：血行動態的に安定しており、心エコー図による左室駆出分画率が≧４５％であること。
・肺：パルスオキシメトリーによる室温での酸素飽和レベルが＞９１％であること。
８．妊娠可能な女性対象（閉経後１年未満の正常な子宮と少なくとも１つの卵巣とを有する初潮後の女性）は、ＣＴＸ１１０注入後の少なくとも１２ヵ月にわたって、組み入れ時より許容可能な避妊方法を使用することに同意しなければならない。
９．男性対象は、ＣＴＸ１１０注入後の少なくとも１２ヵ月にわたって、組み入れ時より有効な避妊方法を使用することに同意しなければならない。
１０．本試験の完了後、更なる長期間の追跡調査試験に参加することに同意すること。
除外基準
本試験に参加するのに適格となるためには、対象は以下に記載される除外基準のいずれも満たさないことが必要となる。
１．自家ＨＳＣＴに適格であり、且つこれに同意している。
２．後述の以下の療法によって治療されている。
・ＣＡＲ Ｔ細胞を含む任意の遺伝子療法又は遺伝子改変細胞治療による前治療。
・直近のＣＤ１９指向性治療後の進行又は再発後に（免疫組織化学的検査又はフローサイトメトリーによって）ＣＤ１９の発現が確認された場合を除く、ＣＤ１９指向性抗体、二重特異性Ｔ細胞誘導又は抗体薬物複合体による前治療。
３．同種ＨＳＣＴの既往がある。
４．シクロホスファミド、フルダラビン又はＣＴＸ１１０生成物の賦形剤のいずれかの既知の禁忌がある。
５．脳脊髄液（ＣＳＦ）からの検出可能な悪性細胞、又はスクリーニング中に脳転移を示す磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、又は悪性病変による中枢神経系（ＣＮＳ）障害の病歴がある（ＣＳＦ又は画像）。
６．発作性疾患、脳血管虚血／出血、認知症、小脳疾患又はＣＮＳ障害を伴う任意の自己免疫疾患の病歴。
７．スクリーニング前の６ヵ月以内の不安定狭心症、臨床的に重大な不整脈又は心筋梗塞。
８．コントロール不良な、急性の生命を脅かす細菌、ウイルス又は真菌感染症。
９．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型若しくは２型又は活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染の存在が陽性である。ウイルス負荷が検出不可（定量的ポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］又は核酸試験による）と記録されている、ＨＢＶ又はＨＢＣ感染の既往歴のある対象は容認される。インフォームドコンセント用紙に署名して３０日以内に実施する感染症疾患検査（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＣＶ抗体及びＰＣＲ、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶ表面抗体、ＨＢＶコア抗体）により、対象の適格性を考慮し得る。
１０．基底細胞癌又は扁平細胞皮膚癌、十分に切除された子宮頸部の上皮内癌又は完全に切除され、≧５年間寛解している過去の悪性病変を除く、過去又は同時進行の悪性病変。
１１．組み入れて１４日以内の放射線治療。
１２．組み入れて１４日以内又は５半減期のいずれか長い方における全身性抗腫瘍療法又は治験薬の使用。例外としては、１）抑制性／刺激性の免疫チェックポイント分子治療の治療歴があり、これは、組み入れから３半減期以内は禁止されており、及び２）スクリーニング前３０日以内にリツキシマブを使用することが禁止されている。
１３．ステロイド及び／又は他の免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全疾患又は活動性自己免疫疾患。
１４．対象が試験に参加する能力を阻害し得る、重大な精神疾患又は他の医学的状態の診断。
１５．妊娠しているか又は授乳中の女性。
統計方法
症例数
本試験の用量漸増パートにおける症例数は約６～５４人の対象となり、評価を受ける用量レベル及びコホートの数並びにＤＬＴの発現率に依存する。
試験がコホート拡大に進む場合、適切なサイモンの２段階デザインを使用する。各コホートの症例数は、特定の指示に対する効果量の前提に依存する。
コホートＡの拡大では、第１段階において最大３０人の対象が組み入れられる。最大の解析対象集団内の最初の３０人のうちの１０人以上の対象に、客観的奏効が達成された場合、本試験では第２段階で更に４７人（合計で７７人）の対象を含むように組み入れを拡大する。７７人の最終的な症例数は、再発性／難治性ＤＬＢＣＬ患者におけるＣＴＸ１１０による４５％のＯＲＲと、標準的な救援療法に対して推定されたＯＲＲである２６％のＯＲＲとの差を検定するために、９０％の検出力（α＝０．０５、両側検定）を有する。
コホートＡのように、試験の用量漸増パートが完了すると、コホートＢはプロトコルの修正後にコホート拡大に進むことができる。
これまでに本試験に参加した対象全員が、１４日以内に段階１（適格性のスクリーニング）を完了している。ある対象は、２日以内に段階１を完了している。適格基準を満たした対象は、段階１を完了して２４時間以内にリンパ球除去療法を開始した。適格な対象の全員がスクリーニング期間（段階１）を完了して１５日未満にＬＤ化学療法を受けており、ある患者はスクリーニングを完了して７２時間以内にＬＤ化学療法の投与を開始している。一部の適格対象はＤＬＢＣＬ（例えば、ＮＯＳ、高悪性度）を有し、別の適格対象は形質転換ＦＬ及びリヒターの形質転換を有する。
ＬＤ化学療法を受けた対象全員が、ＬＤ化学療法の完了後２～７日以内にＣＴＸ１１０のＤＬ１又はＤＬ２の用量を受けるまで進んだ。これらの患者からこれまでに得られた結果を以下にまとめた。
ＤＬ１及びＤＬ２の両方の用量を受けた対象は、腫瘍代謝活性（ＰＥＴスキャンにおけるＦＤＧの取り込み）の低下及び／又は腫瘍サイズの減少を示した。ＤＬ２では、＞６０日間の完全奏効及び持続的反応を含む、用量依存的な反応が観察されている。これまでのところ、治療を受けた患者はＤＬＴをまったく示さなかった。更に、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、治療を受けたヒト対象において、注入後にＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を含む所望の薬物動態特性を示した。ＣＴＸ１１０の増殖及び持続性の両方においても、用量依存効果が観察されている。ＤＬ２における全ての対象で、ＣＴＸ１１０の増殖及び持続性が示された。ある対象では、末梢血中に最大９０倍のＣＴＸ１１０の増殖が観察されている。更に、ＣＴＸ１１０細胞の持続性については、ＤＬ２の対象において治療後の少なくとも８～１０日目で検出可能であり、注入後の最大２８日目まで検出されている。
Figure 2022531185000031
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Figure 2022531185000041
Figure 2022531185000042
他の実施形態
本明細書で開示された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書で開示されたそれぞれの特徴は、同一の、均等な又は類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられ得る。従って、明示的に別途指示されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等な又は類似の特徴の一例に過ぎない。
上記の説明より、当業者は、それらの趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を容易に把握することが可能であり、これを様々な使用法及び状況に適用させるように本発明に対する様々な変更形態及び修正形態をなし得る。従って、他の実施形態も特許請求の範囲の範疇にある。
均等物
いくつかの本発明の実施形態を本明細書で説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載される機能を実行し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るために、様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するであろう。また、そのような変更形態及び／又は修正形態の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より広義には、当業者であれば、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料及び構成が代表的なものであり、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、特定の用途又は本発明の教示が使用される用途に依存することを意味することが容易に理解されるであろう。当業者であれば、通常の実験を行うのみで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は把握することができる。従って、前述の実施形態は、例として示されているに過ぎず、本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、具体的に記載及び特許請求されるものとは別に実施され得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれの個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法に関するものである。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が互いに矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義され使用されるような全ての定義は、辞書的定義、参考として組み込まれる文献内の定義及び／又は定義された用語の通常の意味に対して優先するものと理解されるべきである。
本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、そのそれぞれが引用されている主題に対して参照として組み込まれており、場合により文献全体を包含し得る。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という不定冠詞は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素、即ちある場合には接続して存在する、別の場合には離れて存在する要素の「一方又は両方」を意味するものと理解されるべきである。「及び／又は」を使用して列挙された複数の要素は、同様の方法で解釈されるべきであり、即ちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かにかかわらず、「及び／又は」という節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が任意選択により存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」の言及は、「含む」などのオープンエンド形式の語と共に使用する場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択によりＢ以外の要素を含む）を指すことができ、他の実施形態では、Ｂのみ（任意選択によりＡ以外の要素を含む）を指すことができ、更に別の実施形態では、ＡとＢとの両方（任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における「又は」とは、上記で定義したような「及び／又は」と同様の意味を有するものと理解されるべきである。例えば、列挙内の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は、包含的なものと解釈されるべきであり、即ち要素の数又は列挙の少なくとも１つを含むが、２つ以上も含むものであり、任意選択により追加の列挙されていない項目を含むものと解釈すべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の正確に１つ」又は特許請求の範囲で使用する場合の「～からなる」など、反対に明確に指示される用語のみが、要素の数又は列挙の正確に１つの要素を含むことを意味する。一般に、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」又は「～の正確に１つ」などの排他的な用語の前に置かれた場合、排他的代替物を示すに過ぎない（即ち「一方又は他方、ただし両方ではない」）ものと解釈するべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「～から本質的になる」とは、特許法の分野で使用されるような通常の意味を有するものとする。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義により、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が意味する要素の列挙内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択により存在し得ることも可能になる。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、更に別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択により２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。
同様に、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (42)

  1. ヒト患者のＢ細胞悪性病変を治療するための方法であって、
    （ｉ）Ｂ細胞悪性病変を有するヒト患者にリンパ球除去治療を受けさせることと、
    （ｉｉ）工程（ｉ）後、遺伝子改変Ｔ細胞の集団を前記ヒト患者に投与することと
    を含み、前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、
    （ａ）破壊されたＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子と、
    （ｂ）ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸であって、前記ＣＡＲは、配列番号５１に記載される重鎖可変領域と、配列番号５２に記載される軽鎖可変領域とを含む抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、前記核酸は、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、核酸と、
    （ｃ）破壊されたβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子と
    を含むＴ細胞を含み、
    前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０７～約１×１０９個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で前記ヒト患者に投与される、方法。
  2. 前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ヒト患者に投与される前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、１用量あたり７×１０４個以下のＴＣＲ＋Ｔ細胞／ｋｇを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程（ｉ）の前記リンパ球除去治療は、前記ヒト患者に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００～７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって同時投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程（ｉ）の前記リンパ球除去治療は、前記ヒト患者に１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって又は１日当たり約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン及び約７５０ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを３日間にわたって同時投与することを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、約１×１０７、約３×１０７、約１×１０８、約３×１０８又は約１×１０９個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で前記ヒト患者に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程（ｉ）前に、前記ヒト患者は、以下の特徴：
    （ａ）臨床状態の著しい悪化、
    （ｂ）９１％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、
    （ｃ）コントロール不良な心不整脈、
    （ｄ）血管収縮薬のサポートを必要とする低血圧、
    （ｅ）活動性感染症、及び
    （ｆ）グレード≧２の急性神経毒性
    の１つ以上を示さない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の約２～７日前に実施される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 工程（ｉ）後及び工程（ｉｉ）前に、前記ヒト患者は、以下の特徴：
    （ａ）活動性のコントロール不良な感染症、
    （ｂ）工程（ｉ）前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び
    （ｃ）グレード≧２の急性神経毒性
    の１つ以上を示さない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）後の急性毒性の発症について前記ヒト患者を経過観察すること、及び（ｉｖ）発生する場合に前記急性毒性を管理することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程（ｉｉｉ）は、前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の投与後の少なくとも２８日間にわたって実施される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記急性毒性は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧症、腎不全又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記Ｂ細胞悪性病変は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ並びにＢＣＬ２及び／又はＢＣＬ６の再編成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）並びにグレード３ｂのＦＬからなる群から任意選択により選択される非ホジキンリンパ腫である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ＤＬＢＣＬは、ＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ヒト患者は、フルオロデオキシグルコース陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記Ｂ細胞悪性病変は、難治性及び／又は再発性である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ヒト患者は、１種類以上の先行抗癌療法を受けている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ヒト患者は、２種類以上の先行抗癌療法を受けている、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記先行抗癌療法は、抗ＣＤ２０抗体治療計画、アントラサイクリン含有治療計画又はこれらの組み合わせを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記ヒト患者は、難治性又は再発性の形質転換ＦＬを有し、且つＤＬＢＣＬへの形質転換後の疾患について少なくとも１種類の化学療法を受けている、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記Ｂ細胞悪性病変は、難治性であり、及び前記ヒト患者は、最後の治療で進行性疾患を有するか、又は最大で６ヵ月の安定疾患の期間で治療の少なくとも２つのサイクル後に安定疾患を有する、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ヒト患者は、以前の自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に失敗しているか、又は以前の自家ＨＳＣＴに不適格となっている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ヒト患者は、前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団での治療後に追加の抗癌療法を受ける、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ヒト患者は、以下の特徴：
    （ｍ）米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態０又は１を有すること、
    （ｎ）十分な腎臓、肝臓、心臓及び／又は肺機能、
    （ｏ）以前の遺伝子療法又は改変細胞療法がないこと、
    （ｐ）抗ＣＤ１９抗体を含む以前の治療がないこと、
    （ｑ）以前の同種ＨＳＣＴがないこと、
    （ｒ）脳脊髄液からの検出可能な悪性細胞がないこと、
    （ｓ）脳転移がないこと、
    （ｔ）以前の中枢神経系疾患がないこと、
    （ｕ）不安定狭心症、不整脈及び／又は心筋梗塞がないこと、
    （ｖ）コントロール不良な感染症がないこと、
    （ｗ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全疾患又は自己免疫疾患がないこと、及び
    （ｘ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスに感染していないこと
    の１つ以上を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ＣＤ１９に結合する前記ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする前記核酸は、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の欠失部位に挿入される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、同種である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、及び／又は前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも３０％は、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも９９．５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも８５％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、静脈内注入を介して前記ヒト患者に投与される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、凍結保存溶液中に懸濁される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. Ｂ細胞悪性病変を治療するのに使用される薬学的組成物であって、
    （ａ）配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を任意選択により含む、破壊されたＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子と、
    （ｂ）ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸であって、前記ＣＡＲは、配列番号５１に記載される重鎖可変領域と、配列番号５２に記載される軽鎖可変領域とを含む抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、前記核酸は、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、核酸と、
    （ｃ）破壊されたβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子と
    を含む遺伝子改変Ｔ細胞の集団を含み、約１×１０７～約１×１０９個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を含む薬学的組成物。
  41. 前記遺伝子改変Ｔ細胞の集団は、請求項１、２、２５～３７又は３９のいずれか一項に記載されている、請求項４０に記載の使用のための薬学的組成物。
  42. 請求項１～２４又は３８のいずれか一項に記載の方法で使用するためのものである、請求項４０又は４１に記載の使用のための薬学的組成物。
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