JP2023546178A - Ｃｄ１９を標的とする遺伝子操作されたｔ細胞を用いたｂ細胞悪性腫瘍の同種他家細胞療法 - Google Patents

Ｃｄ１９を標的とする遺伝子操作されたｔ細胞を用いたｂ細胞悪性腫瘍の同種他家細胞療法 Download PDF

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Abstract

ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、またはその両方を含み、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用するためのものである、遺伝子操作された免疫細胞（Ｔ細胞など）の集団。【選択図】図２４Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２０日に出願された米国仮出願第６３／０９４，２５２号、２０２１年１月２２日に出願された米国仮出願第６３／１４０，６６４号、２０２１年３月２３日に出願された米国仮出願第６３／１６４，６９０号、２０２１年６月２５日に出願された米国仮出願第６３／２１５，１９１号、及び２０２１年１０月１１日に出願された米国仮出願第６３／２５４，２２６号の出願日の利益を主張する。先の仮出願のそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ヒトの悪性腫瘍の治療に使用される養子Ｔ細胞療法である。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、再発／難治性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の持続的寛解など、臨床的に大きな成功を収めているが、承認されている製品は自家由来であり、患者固有の細胞収集及び製造が必要である。このため、一部の患者は、治療を待機している間に疾患の進行または死亡を経験する。したがって、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞療法の必要性が依然として存在する。
本開示は、少なくとも部分的に、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、破壊されているＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞、別名ＴＣ１細胞）を使用した形質転換ＦＬまたはＤＬＢＣＬなどのＢ細胞悪性腫瘍に対する同種他家細胞療法の開発に基づく。本明細書に開示される同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、本明細書に開示されるＢ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者において、特定の患者における完全な応答及び応答が長く持続するなどの治療効果を示した。さらに、本明細書に開示される同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ヒト患者において、ＣＡＲ－Ｔ細胞拡大の長期化及び注入後の持続性を含む、所望の薬物動態学的特徴を示した。
したがって、本開示のいくつかの態様は、ヒト患者におけるＢ細胞悪性腫瘍を治療するための方法を特徴とし、本方法は、（ｉ）Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者をリンパ球枯渇治療に供するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量をヒト患者に投与するステップと、を含み、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、（ａ）ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＴ細胞を含む。遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、約１．０×１０７～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与され得る。ヒト患者に投与される遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、１用量あたり７×１０４ＴＣＲ＋Ｔ細胞／ｋｇ以下を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）のリンパ球枯渇治療は、ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００～７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約３．５×１０８～約９×１０８である。例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約３．５×１０８～約６×１０８である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約３×１０７ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約１×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約４．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。特定の例において、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、約４．５×１０８、約６×１０８、または約７．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）のリンパ球枯渇治療は、ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００／ｍ２／日～７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む。場合によっては、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉ）の約２～７日前に実施してもよい。
ステップ（ｉ）の前に、ヒト患者は、次の特徴のうちの１つ以上を示さなくてもよい：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９１％を超える飽和レベルを維持するための酸素補給の必要性、（ｃ）制御されていない心不整脈、（ｄ）昇圧剤によるサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染、及び（ｆ）グレード２以上の急性神経毒性。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の後、ステップ（ｉｉ）の前に、ヒト患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を示さない：（ａ）制御されていない活動性感染、（ｂ）ステップ（ｉ）の前の臨床状態と比較して臨床状態が悪化している、及び（ｃ）グレード２以上の急性神経毒性。
本明細書に開示される方法のいずれも、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）後の急性毒性の出現についてヒト患者を監視するステップと、（ｉｖ）生じた場合に急性毒性を管理するステップと、をさらに含んでもよい。場合によっては、ステップ（ｉｉｉ）は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量の投与後、少なくとも２８日間実施することができる。例示的な急性毒性は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧、腎不全、ウイルス性脳炎、またはそれらの組み合わせを含む。
代替的または追加的に、本明細書に開示される方法は、任意にヒト患者が進行性疾患（ＰＤ）を示した後、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の１つ以上のその後の用量をヒト患者に投与することをさらに含んでもよく、ここで、ヒト患者は、これまでに応答を示していた。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団のその後の投与前の２～７日以内にリンパ球枯渇治療を受けてもよい。あるいは、ヒト患者が著しい血球減少を呈する場合、遺伝子操作されたＴ細胞の集団のその後の投与の前に、リンパ球枯渇治療をヒト患者に与えなくてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫であり得る。例としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、及びグレード３ｂ ＦＬが挙げられる。いくつかの例では、ＤＬＢＣＬは、ＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である。ヒト患者は、フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有し得る。
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、難治性及び／または再発性である。難治性及び／または再発性Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者は、これまでに１つ以上の治療ラインの抗がん療法を受けていてもよい。例えば、ヒト患者は、これまでに２つ以上の治療ラインの抗がん療法を受けている。いくつかの例では、これまでの抗がん療法は、抗ＣＤ２０抗体、アントラサイクリン含有レジメン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの例では、ヒト患者は、難治性または再発性の形質転換ＦＬを有し、ＤＬＢＣＬへの形質転換後の疾患に対して少なくとも１つの治療ラインの化学療法を受けている。いくつかの例では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、難治性であり、ヒト患者は、最終治療において進行性疾患を有するか、または少なくとも２サイクルの治療法後に安定疾患を有し、安定疾患の持続期間は、最大６ヶ月である。いくつかの例では、ヒト患者は、これまでの自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が奏効しなかったか、またはこれまでの自家ＨＳＣＴに不適格である。あるいは、またはそれに加えて、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団による治療後に追加の抗がん療法を受ける。
本明細書に開示される方法のいずれかにおいて、ヒト患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：（ａ）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス０または１を有する、（ｂ）腎臓、肝臓、心臓、及び／または肺機能が適切である、（ｃ）これまでに遺伝子療法または改変細胞療法を受けていない、（ｄ）これまでに抗ＣＤ１９抗体を含む治療を受けていない、（ｅ）これまでに同種他家ＨＳＣＴを受けていない、（ｆ）脳脊髄液からの検出可能な悪性腫瘍細胞がない、（ｇ）脳転移がない、（ｈ）これまでに中枢神経系障害がない、（ｉ）不安定狭心症、不整脈、及び／または心筋梗塞がない、（ｊ）制御されていない感染がない、（ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全障害または自己免疫疾患がない、（ｌ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに感染していない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ステップ（ｉ）にヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００／ｍ２／日を３日間同時投与することを含むリンパ球枯渇治療を伴ってもよい。あるいは、またはさらに、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、少なくとも３×１０７ＣＡＲ＋Ｔ細胞であり得る。場合によっては、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回投与の約４～８週間後に、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の投与が施されてもよい。ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回投与の少なくとも約４週間後に安定疾患（ＳＤ）、部分奏効（ＰＲ）、または完全奏効（ＣＲ）を達成し得る。いくつかの例では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の投与前の２～７日以内に２回目のリンパ球枯渇治療を受ける。あるいは、ヒト患者は、例えば、著しい血球減少を呈し、 を受けていないヒト患者の場合、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の投与の前に、リンパ球枯渇治療を受けていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書の開示されている方法は、ステップ（ｉ）に、ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約７５０／ｍ２／日を３日間同時投与することを含むリンパ球枯渇治療を伴ってもよい。場合によっては、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量は、少なくとも約３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回投与の約４～８週間後に、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の用量が投与されてもよい。こうしたヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回投与の少なくとも約４週間後に安定疾患（ＳＤ）、部分奏効（ＰＲ）、または完全奏効（ＣＲ）を達成し得る。場合によっては、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の投与前の２～７日以内に２回目のリンパ球枯渇治療を受ける。２回目のリンパ球枯渇治療は、３日間、ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００ｍｇ／ｍ２／日を同時投与することを含んでもよい。あるいは、ヒト患者は、例えば、著しい血球減少を呈し、 を受けていないヒト患者の場合、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の投与の前に、リンパ球枯渇治療を受けていなくてもよい。
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも１回の追加の投与を受けてもよい。場合によっては、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の追加投与の前の２～７日以内に３日間、約３０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２／日のシクロホスファミドをヒト患者に同時投与することを含むリンパ球枯渇治療を受ける。
本明細書に開示される方法のいずれかにおいて、遺伝子操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現し得る。いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号５１で表される重鎖可変領域におけるものと同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／または配列番号５２で表される軽鎖可変領域におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。場合によっては、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の例では、ＣＤ１９に結合するＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、（ｂ）破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、及び（ｃ）破壊されたベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、（ｂ）破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、及び（ｃ）破壊されたベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む。いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される。いくつかの特定の例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含み得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の欠失部位に挿入され得る。いくつかの例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む。
あるいは、またはさらに、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４で表されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、同種他家である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、及び／または遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも３０％は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。あるいは、またはさらに、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも９９．５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。あるいは、またはさらに、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも７０％（例えば、少なくとも８５％）は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。あるいは、またはさらに、遺伝子操作されたＴ細胞の集団中のＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも７０％）は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、静脈内注入によってヒト患者に投与される。遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、低温保存溶液に懸濁され得る。
また、本開示の範囲内には、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療（例えば、本明細書に開示される方法のいずれか）において使用するための医薬組成物であって、本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の集団のいずれか（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を含む医薬組成物、ならびに本明細書に開示されるＢ細胞悪性腫瘍の治療において使用するための医薬品を製造するための遺伝子操作されたＴ細胞の使用が含まれる。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明において述べられる。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明から、また添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
編集８日後のヒト初代Ｔ細胞、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）の一連のフローサイトメトリープロットである。グラフは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの表面発現の減少を示している。ＴＣＲ／ＭＨＣ Ｉダブルノックアウト細胞は、高レベルのＣＡＲ導入遺伝子を発現する（下のパネル）。精製ビーズによるＴＣ１細胞の負の選択は、ＴＣＲ陽性細胞の減少につながる（右パネル）。 ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）におけるＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座で達成された高い編集率を示すグラフである。遺伝子編集の機能的出力であるＴＣＲ及びＭＨＣＩの表面発現を測定し、ｙ軸を編集パーセンテージとしてプロットした。ＴＲＡＣ遺伝子座からのＣＡＲの高効率（例えば、５０％を超える）の部位特異的組み込み及び発現が検出された。これらのデータは、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生成効率が５０％を超えることを明示している。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＣ１）による処置後のＮＯＧ Ｒａｊｉマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３）（ｐ＝０．００７）の統計的に有意な減少を示すグラフである。 処置を受けていないＮＯＧ Ｒａｊｉマウスと比較して、ＴＣ１細胞により処置されたＮＯＧ Ｒａｊｉマウスの生存の増加を明示する生存曲線グラフである。 １日目に処置を受けなかった対照マウスと比較して、４日目にＴＣ１細胞により処置されたＮＯＧ Ｒａｊｉマウスの生存の増加を示す生存曲線グラフである。 Ａ及びＢは、マウスにおけるＴＣ１細胞の持続性及び抗腫瘍活性を示す図を含む。Ａは、ＴＣ１細胞がＮＯＧ Ｒａｊｉマウスにおいて持続することを明示する一連のフローサイトメトリープロットである。Ｂは、ＴＣ１細胞が、対照（無処置のＮＯＧ ＲａｊｉマウスまたはＮＯＧマウス）と比較して、ＴＣ１により処置されたＮＯＧ Ｒａｊｉマウスにおいて脾臓Ｒａｊｉ細胞を選択的に根絶することを明示するグラフである。効果は、対照と比較して、ＴＣ１により処置されたＮＯＧ Ｒａｊｉマウスの脾臓量の減少として示されている。 ＴＣ１処置を行った２匹の個々のＮＯＧ Ｒａｊｉマウスにおいて持続性脾臓ＴＣ１細胞が編集されることを明示する一連のフローサイトメトリープロットである。 １日目に処置を受けなかった対照マウスと比較して、４日目にＴＣ１細胞により処置されたＮＯＧ Ｎａｌｍ６マウスの生存率の増加を明示するカプラン・マイヤー生存プロットである。 処置を受けていない対照マウスと比較して、異なる濃度のＴＣ１により処置された後の、播種性Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）を有するマウスの生存の増加を明示するカプラン・マイヤー生存プロットである。 播種性Ｎａｌｍ６ Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）腫瘍モデルにおける、ＴＣ１細胞による処置後の腫瘍細胞拡大の統計的に有意な阻害を示すグラフである。 放射線照射後にＴＣ１細胞または種々の対照細胞（ＰＢＭＣまたはエレクトロポレーション（ＥＰ）Ｔ細胞）により処置された健康なマウス、または放射線のみを受けた（「ＲＴのみ」）マウスのカプラン・マイヤー生存プロットである。 図１８において処置したマウスの体重変化率を示すグラフである。 照射後に低用量（２×１０７）または高用量（４×１０７）のＴＣ１細胞により処置された、または未編集Ｔ細胞により処置された健康なマウス、または放射線のみを受けたマウス（「ビヒクル－ＲＴ」）のカプラン・マイヤー生存プロットである。 図２０により処置されたマウス、及び照射を受けておらず、細胞が投与されていないマウス（「ビヒクル－ＲＴなし」）の体重変化率を示すグラフである。 ６名の異なるドナー由来の末梢血細胞の未編集ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－細胞率を示す棒グラフである。 ＴＣＲαβ＋細胞の枯渇前及び後のＴＣ１細胞上でのＴＣＲαβ及びＢ２Ｍ発現のフローサイトメトリー結果を示す。 遺伝子編集後のＴＣＲ－及びＭＨＣ Ｉ－（Ｂ２Ｍ）のタンパク質損失率、ならびに個々のＴＣ１産生ロットからの編集ＴＣ１細胞中での抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞率のグラフである。 編集前及び後の６名の異なるドナー由来のＴ細胞集団におけるＰＤ１＋（左上）、ＬＡＧ３＋（右上）、ＴＩＭ３＋（左下）またはＣＤ５７＋（右下）の率を示すグラフを示す。 異なる比率でＴＣ１細胞または未編集Ｔ細胞と共培養したときのＣＤ１９陽性細胞株（Ｎａｌｍ６、Ｒａｊｉ、及びＫ５６２－ＣＤ１９）及びＣＤ１９陰性細胞（Ｋ５６２）の細胞溶解率を示すグラフである。 Ｔ細胞培地（血清＋ＩＬ２＋ＩＬ７、完全培地）の存在下、血清を含むがＩＬ２またはＩＬ７サイトカインを含まない培地（５％血清、サイトカインなし）または血清もしくはサイトカインなしの培地（血清なし、サイトカインなし）で培養した場合の生存ＴＣ１細胞の数を示すグラフである。遺伝子編集後の示された日に細胞を数えた。表示されている３つのロットの平均値±ＳＤ。 ＣＤ１９＋悪性腫瘍を有するヒト対象にリンパ球枯渇後に投与されたＣＴＸ１１０細胞（別名、ＴＣ１細胞）を評価するための臨床試験デザインを示す概略図である。コホートＡ及びＢは、ＮＨＬサブタイプ：ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、グレード３ｂ ＦＬ、または形質転換ＦＬで構成される。コホートＡでは、ＬＤ化学療法は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶ同時投与することを含む。コホートＢでは、ＬＤ化学療法は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶ同時投与することを含む。コホートＡでは、対象は、プロトコル指定基準を満たす場合、ＬＤ化学療法有りまたは無しで、２８日目（初回投与の４～８週間後）にＣＴＸ１１０の予定された２回目の投与を行うことができる。コホートＡ及びＢの両方の対象は、対象がこれまでに客観的奏効を示していた場合、疾患の進行時に再投与されてもよい。初回治療過程は、適用可能な場合、初回（１日目）及び２回目（３５日目）のＣＴＸ１１０注入及び関連するＬＤレジメンを含み得る。コホートＡ及びコホートＢの両方について、対象が初回注入後にこれまで臨床応答を示しており、追加の注入の基準を満たす場合、患者は疾患の進行時にＬＤ化学療法とともに単一のＣＴＸ１１０注入による２回目の治療過程を受けてもよい。Ｄ：日、ＤＬＢＣＬ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＤＬＴ：用量制限毒性、ＦＬ：濾胞性リンパ腫、ＩＶ：静脈内、ＬＤ：リンパ球枯渇、Ｍ：月、ＭＲＤ：微小残存病変、ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫、ＮＯＳ：非特異型。 ＣＴＸ１１０による腫瘍サイズの大幅な縮小（再投与を含む）を示す図である。ＳＤ＝安定疾患、ＣＲ＝完全奏効。１：値が軸の最上部を超える（２１５％）。 ＤＬ２からＤＬ４で治療された患者における末梢血ＣＡＲ－Ｔ細胞レベルを示す図である。値は、平均±ＳＥＭを表す。各時点でＮ＝１５～２１。 ＣＴＸ１１０の強化用量の強力な理論的根拠を示す図である。ＤＬ２～ＤＬ４の用量を受けた患者における完全奏効（ＣＲ）率及び全奏効（ＯＲＲ）率を示す。 ＣＴＸ１１０の強化用量の強力な理論的根拠を示す図である。示すような異なる応答を有する患者における細胞用量とベースライン腫瘍体積との比率を示す。ベースライン腫瘍体積は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（数百万）をベースラインＳＰＤ（ｍｍ２）で除算することによって計算される。
分化抗原群１９（ＣＤ１９）は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１１７８０９８において見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び非ホジキンリンパ腫など、ほとんどのＢ系列がん上に発現する。また、Ｂ細胞前駆細胞の初期マーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）を参照されたい。
本開示は、Ｂ細胞悪性腫瘍のための同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含み、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、それによってＴＲＡＣ遺伝子の発現が破壊される。同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、健康なドナーから得られた親Ｔ細胞を使用して調製される。そのため、自家ＣＡＲ－Ｔ療法では、患者自身のＴ細胞からＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するために必要な診断と治療との間に少なくとも３週間の間隔があるのとは対照的に、ＣＡＲ－Ｔ療法は、診断直後に、標的Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者に利用可能である。同種他家ＣＡＲ Ｔ療法は、診断直後の治療を容易にするために、医療施設で保管し在庫管理することができる。同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ療法が即座に利用できるようになったことで、患者自身の細胞から自家ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する場合に必要とされ得るブリッジング化学療法が不要になる。要するに、同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（例えば、本明細書に開示されるＣＴＸ１１０細胞の使用を含む）は、製造上失敗するリスクなく、即時治療が可能になり、患者の疾患が進行する可能性のある貴重な時間の節約となる。さらに、これにより、より一貫した製品、柔軟な投薬（例えば、必要に応じて再投薬が可能）、スケーラブルな製造及びより単純な輸送、及びより広範なアクセスがもたらされる。同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞の使用を含む）はまた、より有毒なリンパ球枯渇レジメンの必要性を回避できる。
本明細書に開示される同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、本明細書に開示されるＢ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者において、特定の患者における完全な応答及び応答の長い持続性などの治療効果を示した。さらに、本明細書に開示される同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ヒト患者において、ＣＡＲ－Ｔ細胞拡大の長期化及び注入後の持続性を含む、所望の薬物動態学的特徴を示した。
したがって、本明細書では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞などの遺伝子操作された免疫細胞の集団（例えば、配列番号４０、配列番号３９によってコードされるもの）を使用して、ヒト患者において、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための方法を提供する。そのような遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードし、任意によりプロモーター配列及び１つ以上の制御エレメントを含む核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子中の配列番号２６のセグメントを置換し得る。ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の投与前に、リンパ球枯渇治療を受ける。
Ｉ．抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において使用するための抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、またはそれらの組み合わせを有するヒトＴ細胞である。特定の例において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、破壊された内因性ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子を有する。
（ｉ）抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で開示されるＴ細胞などの遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、望ましくない細胞、例えばがん細胞などの疾患細胞によって発現される抗原を認識して結合するように操作された人工免疫細胞受容体を指す。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、非ＭＨＣ制限的な状態で、Ｔ細胞の特異性及び反応性を選択した標的に対して再度向ける能力を有する。非ＭＨＣ制限抗原認識により、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原プロセシングとは独立して抗原を認識する能力が得られ、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避する。さらに、Ｔ細胞上に発現した場合、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ鎖と二量体化しない。
ＣＡＲには様々な世代があり、そのそれぞれに異なる構成成分が含まれている。第１世代のＣＡＲは、抗体由来のｓｃＦｖを、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体のＣＤ３ｚｅｔａ（ζまたはｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第２世代のＣＡＲは、追加の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、またはＩＣＯＳを組み込み、共刺激シグナルを供給する。第３世代のＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０の組み合わせ、Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３、Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）を含む。様々な世代のＣＡＲ構築物のいずれも、本開示の範囲内である。
一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体または他の抗体フラグメントの一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ））を認識する細胞外ドメインと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメイン、ほとんどの場合、共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む融合ポリペプチドである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲ構築物は、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間のヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびに表面発現のためのＮ末端でのシグナルペプチドをさらに含み得る。シグナルペプチドの例には、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号３０）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３１）が含まれる。他のシグナルペプチドを使用することもできる。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的な抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、その後に細胞内共シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン）を含み得る。本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを構築する際に使用される例示的な構成成分は、以下に提供される配列表に見出すことができる。
（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインは、ＣＡＲが細胞表面上に発現する場合に細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域である。場合によっては、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドをＮ末端に位置させ得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を（いずれかの配向で）含むことができる）であり得る。場合によっては、ＶＨ及びＶＬフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、柔軟性のための一連のグリシン及びセリン、ならびに溶解性を高めるための一連のグルタミン酸塩及びリジンを有する親水性残基を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントが由来する親抗体の抗原結合特異性を保持する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶＨ及び／またはＶＬドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ及び／またはＶＬドメインは、完全ヒトである。
本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチド中の抗原結合細胞外ドメインは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に特異的である。いくつかの例では、抗原結合細胞外ドメインは、ＣＤ１９に結合できるｓｃＦｖ細胞外ドメインを含み得る。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号５１中のものと同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５２中のものと同じ軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含み得る。同じＶＨ及び／またはＶＬ ＣＤＲを有する２つの抗体は、同じアプローチ（例えば、当該分野において既知のＫａｂａｔアプローチ、Ｃｈｏｔｈｉａアプローチ、ＡｂＭアプローチ、接触アプローチ、またはＩＭＧＴアプローチ、例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照）によって決定される場合、それらのＣＤＲが同一であることを意味する。いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号５１のＶＨ及び／または配列番号５２のＶＬを含む。特定の例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み得る。
（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲポリペプチドは、膜貫通ドメインを含み得、これは、膜にまたがる疎水性アルファヘリックスであり得る。本明細書で使用されるとき、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜、好ましくは、真核生物細胞膜内で熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。膜貫通ドメインは、それを含むＣＡＲに安定性をもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書で提供されるように、他の膜貫通ドメインを使用してもよい。１つの特定の例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインである。
（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／または細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲまたはそのドメインに柔軟性を提供するか、またはＣＡＲまたはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、または５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のヒンジドメインがＣＡＲの他の領域に含まれていてもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであってもよい。他のヒンジドメインを使用してもよい。
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物のいずれも、受容体の機能末端である任意の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ、及び任意により１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。
ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζには、３つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が含まれており、これらが、Ｔ細胞が同族抗原と連結後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。多くの場合、ＣＤ３ζは、一次Ｔ細胞活性化シグナルを提供するが、共刺激シグナル伝達を必要とする完全なコンピテンス活性化シグナルは提供しない。いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物は、配列番号３８のアミノ酸配列を有し得るＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。例えば、ＣＤ２８及び／または４－１ＢＢの共刺激ドメインは、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共に、完全な増殖／生存シグナルを伝達するために使用され得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子、例えば、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子、例えば、配列番号３４のアミノ酸配列を有する４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
特定の例において、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３８）及びＣＤ２８共刺激ドメイン（例えば、配列番号３６）を含み得る。
本明細書に記載の方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、例えば、当技術分野で知られているか、または本明細書に開示されているものを産生するために使用できる２つ以上の好適なＣＡＲを包含することを理解することとする。例は、例えば、ＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２として公開された２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９、及び２０１９年５月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００に記載され、先行出願のそれぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の例では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３９のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号４０のアミノ酸配列を含み得る。以下に示す配列表を参照されたい。
本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞において、核酸は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのコード配列、及び任意により抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現のための調節配列（例えば、配列表に提供されるＥＦ１ａプロモーターなどのプロモーター）を含み、目的のゲノム遺伝子座に挿入され得る。いくつかの例では、核酸は、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、それによってＴＲＡＣ遺伝子の発現を妨げる。特定の例では、核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子中のフラグメント、例えば、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントを置換することができる。
（ｉｉ）ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト
本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、またはそれらの組み合わせをさらに有し得る。ＴＲＡＣ遺伝子座の破壊は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の喪失をもたらし、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低下させることを企図としている一方で、β２Ｍ遺伝子座の破壊は、主要組織適合複合体Ｉ型（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の欠如をもたらし、これは、宿主拒絶の可能性を低下させることにより、持続性を改善することを企図している。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを添加することで、改変されたＴ細胞をＣＤ１９発現腫瘍細胞に対して配向させる。場合によっては、ＣＡＲ発現構築物は、レンチウイルスまたはレトロウイルスを使用することなく、ＴＲＡＣ遺伝子座（本明細書の開示を参照）に正確に挿入され、これが、一貫性及び安全性の改善につながる。
本明細書で使用する場合、「破壊された遺伝子」という用語は、野生型の対応物と比較して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失、またはヌクレオチド置換など）を含み、これにより、コードされた遺伝子産物の活性を実質的に低下させるか、または完全に排除する遺伝子を指す。１つ以上の変異は、非コード領域、例えばプロモーター領域、転写または翻訳を調節する調節領域、またはイントロン領域内に位置し得る。あるいは、１つ以上の変異は、コード領域（例えば、エクソン）内に位置し得る。場合によっては、破壊された遺伝子は、コードされたタンパク質を発現しないか、または実質的に低下したレベルで発現する。他の例では、破壊された遺伝子は、コードされたタンパク質を変異形態で発現し、それは機能的でないか、実質的に低下した活性を有する。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、（例えば、抗体によって、例えばフローサイトメトリーによって）検出可能なレベルの、遺伝子によってコードされるタンパク質を（例えば、細胞表面に）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれることがある。例えば、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、β２Ｍタンパク質を細胞表面で検出できない場合、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍノックアウト細胞と見なし得る。
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型対応物と比較して、変異フラグメントを含むと記載され得る。変異フラグメントは、欠失、ヌクレオチド置換、付加、またはそれらの組み合わせを含み得る。他の実施形態では、破壊された遺伝子は、対応する野生型中に存在するフラグメントの欠失を有すると記載され得る。場合によっては、欠失フラグメントの５’末端は、本明細書に開示されるものなどの設計されたガイドＲＮＡ（オンターゲット配列として知られる）によって標的とされる遺伝子領域内に位置し、欠失フラグメントの３’末端は、標的とされる領域を超えている可能性がある。あるいは、欠失フラグメントの３’末端が標的領域内に位置し、欠失フラグメントの５’末端が標的とされる領域を越えてもよい。
場合によっては、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞中の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、欠失、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１中のフラグメントの欠失を含み得る。いくつかの例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＲＡＣガイドＲＮＡ ＴＡ－１の標的部位である配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む。以下の配列表を参照されたい。いくつかの例では、配列番号２６のフラグメントは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸によって置換され得る。そのような破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞中の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して生成され得る。いくつかの例では、以下の配列表に示されるＢ２Ｍ ｇＲＮＡを使用できる。破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。
（ｉｉｉ）同種他家治療のための抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団の例
本明細書に開示の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（これらは、本明細書に開示の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）のいずれかを発現する）ならびに本明細書に開示の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び／または破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞などのＴ細胞）の集団も本明細書に提供される。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を有するＣＤ１９指向性Ｔ細胞であるＣＴＸ１１０細胞である。抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号２６の部位において、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子中に挿入することができ、これは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸によって置換され、それによってＴＲＡＣ遺伝子の発現を破壊する。ＣＴＸ１１０細胞中の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列を含み得る。
ＣＴＸ１１０細胞は、標的とされる遺伝子（ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子）を破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９）技術を使用したｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子改変、及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を送達させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を介して産生できる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による遺伝子編集には、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１８）と、β２Ｍ遺伝子座を標的とするＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０）との２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が関与する。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれについても、改変を明示的に示さないものは、未改変配列及び任意の好適な改変を有する配列の両方を包含することを意味する。
ＣＴＸ１１０細胞の抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、抗ＣＤ１９一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ、配列番号４７のアミノ酸配列を含み得る）を含み、その後にＣＤ２８の細胞内共シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３６）に融合されるＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列を含む）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３８）を含む。特定の例では、ＣＴＸ１１０細胞中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも３０％が、検出可能なレベルの抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、検出可能なレベルの抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない場合がある。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、または９０％～１００％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
あるいは、またはさらに、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない場合がある。例えば、ＣＴＸ１１０細胞の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、または９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。特定の例では、ＣＴＸ１１０細胞の９０％超（例えば、９９．５％超）は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、相当のパーセンテージのＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団が、１つを超える遺伝子編集を含み得、これにより、特定のパーセンテージの細胞が１つを超える遺伝子及び／またはタンパク質を発現しないこととなる。
例えば、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの２つの表面タンパク質を発現しない、例えば、検出可能なレベルのβ２Ｍ及びＴＲＡＣタンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、または９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。別の例では、ＣＴＸ１１０細胞の集団の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載の編集であり得る、１つを超える遺伝子編集を（例えば、１つを超える遺伝子中に）含み得る。例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞の集団は、ＴＡ－１ ＴＲＡＣ ｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を介して破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み得る。いくつかの例では、ＣＴＸ１１０細胞は、未改変Ｔ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子中に欠失を含み得る。例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子中にフラグメントＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号２６）の欠失を含み得る。このフラグメントは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸（例えば、配列番号３９）によって置換することができる。あるいは、またはさらに、ＣＴＸ１１０細胞の集団は、Ｂ２Ｍ－１のｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み得る。そのようなＣＴＸ１１０細胞は、配列番号９～１４のヌクレオチド配列の１つ以上を含むβ２Ｍ遺伝子にＩｎｄｅｌを含み得る。特定の例では、ＣＴＸ１１０細胞は、３０％以上のＣＡＲ＋Ｔ細胞、５０％以下のＢ２Ｍ＋細胞、及び３０％以下のＴＣＲαβ＋細胞を含む。さらなる特定の例では、ＣＴＸ１１０細胞は、３０％以上のＣＡＲ＋Ｔ細胞、３０％以下のＢ２Ｍ＋細胞、及び０．５％以下のＴＣＲαβ＋細胞を含む。
ＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２及びＷＯ２０１９２１５５００も参照のこと。それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。
（ｉｖ）医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示の遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団のいずれか、例えば、ＣＴＸ１１０細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、ヒト患者におけるがん治療に使用することができ、これも本明細書に開示される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という語句は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、対象の組織、器官、及び／または体液と接触して使用するために好適である、適切な医学的判断の範囲内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合する、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを指す。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１－１９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される塩をさらに含む。薬学的に許容され得る塩の非限定的例としては、（無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）または有機酸（酢酸、酒石酸、マンデル酸など）を有するポリペプチドの遊離アミノ基から形成された）酸付加塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など）、及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）由来である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、低温保存溶液（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｃ５５）に懸濁させた遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の集団を含む。本開示で使用するための低温保存溶液はまた、アデノシン、デキストロース、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、１つ以上の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウムなど）、１つ以上の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、またはそれらの組み合わせを含み得る。低温保存溶液の成分は、滅菌水に溶解してもよい（注射品質）。低温保存溶液のいずれも、血清を実質的に含まなくてもよい（通常の方法では検出できなくてよい）。
場合によっては、（例えば、実質的に血清を含まない）低温保存溶液に懸濁したＣＴＸ１１０細胞などの遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物を保存バイアルに入れることができる。
本明細書に開示の遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の集団を含み、本明細書に開示の低温保存溶液中に任意により懸濁され得る本明細書に開示の任意の医薬組成物は、例えば、細胞及び組織の保存に一般的に適用される条件下で、Ｔ細胞の生存率及び生物活性に実質的に影響を及ぼさない環境で今後の使用のために保管され得る。いくつかの例では、医薬組成物は、液体窒素の気相中、－１３５℃以下で保管することができる。細胞をそのような条件下で一定期間保存した後、外観、細胞数、生存率、ＣＡＲ＋Ｔ細胞％、ＴＣＲ＋Ｔ細胞％、及びＢ２Ｍ＋Ｔ細胞％に関して、顕著な変化は観察されなかった。特定の例では、医薬組成物は、それぞれが約１．５×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０細胞など）の入ったバイアルに入れることができる。他の例では、医薬組成物は、それぞれが約３×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０細胞など）の入ったバイアルに入れることができる。
ＩＩ．遺伝子操作された免疫細胞の調製
当技術分野で知られている任意の好適な遺伝子編集方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復関連９）を使用するヌクレアーゼ依存性標的編集など、本明細書に開示の遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞などのＴ細胞）を創出するために使用することができる。特定の例では、ＣＴＸ１１０細胞などの遺伝子操作された免疫細胞は、ドナー鋳型としてアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を使用する相同組換えと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ技術によって産生される。
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介した遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集に使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡターゲティングプラットフォームとして転用された、原核生物内で自然に発生する防御メカニズムである。ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９、及び２つの非コードＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存して、ＤＮＡの切断を標的にする。ＣＲＩＳＰＲは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓの略語であり、細菌及び古細菌のゲノム中に見られるＤＮＡ配列のファミリーであり、これは、例えば、原核生物を感染させるまたは攻撃したウイルスなどによって以前に細胞にさらされた外来ＤＮＡと類似したＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含む。これらのＤＮＡのフラグメントは、例えば、その後の攻撃中の同様のウイルスからの再導入時に、類似の外来ＤＮＡを検出して破壊するために原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写により、スペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされ、この分子は、外来の外因ＤＮＡを認識して切断できるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、それを標的とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数の種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照）。
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ中の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識と特異性を駆動する。ｃｒＲＮＡの５’の２０ｎｔの配列を変更することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を特定の遺伝子座に標的化できる。標的配列の後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる（配列ＮＧＧを有する）特定の短いＤＮＡモチーフが続く場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔに一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、これがＣａｓ９エンドヌクレアーゼによって結合され、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を形成し、標的ＤＮＡを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位においてＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流のＤＮＡ鎖のうちの１つを切断し、これにより、ＤＮＡの両方の鎖が塩基対中で終結するところ（平滑末端）において、二重鎖切断（ＤＳＢ）が残存する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的ＤＳＢが形成された後、次の重要なステップは、ＤＳＢを修復することである。細胞は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）の２つの主要なＤＮＡ修復経路を使用してＤＳＢを修復する。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞など大部分の細胞型で非常に活性であるように見える堅牢な修復メカニズムである。ＮＨＥＪは、エラーが発生しやすく、多くの場合、ＤＳＢの部位で１～数百のヌクレオチドが除去されるかまたは付加される可能性があるが、そのような改変は、典型的には２０ｎｔ未満である。結果として生じる挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）は、遺伝子のコード領域または非コード領域を破壊させ得る。それに代わって、ＨＤＲは、内因または外因によりもたらされた長い一連の相同ドナーＤＮＡを使用して、ＤＳＢを高い忠実度で修復する。ＨＤＲは、分裂中の細胞中でのみ活性であり、ほとんどの細胞型において比較的低い頻度で発生する。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが修復オペラントとして利用される。
（ａ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書に開示のとおり遺伝子操作されたＴ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の酵素であり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用され得る。本明細書で提供されるとおり、野生型Ｃａｓ９が使用され得るか、またはＣａｓ９の改変型（例えば、Ｃａｓ９の進化型、またはＣａｓ９オルソログまたはバリアント）が使用され得ることが理解されるものとする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化配列（ＮＬＳ）を含むように操作されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組換えＥ．ｃｏｌｉの発酵によって産生され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、これは本明細書において配列番号５５として示す。
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡの使用を含む。本明細書で使用される場合、「ｇＲＮＡ」は、特定の標的配列での遺伝子編集のために、ＴＲＡＣ遺伝子またはβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列にＣａｓ９を向けることができるゲノム標的化核酸を指す。ガイドＲＮＡは、編集のために標的遺伝子内の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とを少なくとも含む。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする例示的なｇＲＮＡは、配列番号１８または２２で提供される。以下の配列表を参照されたい。ＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２も参照のこと。それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６－２２，５５２，１５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）を使用して設計することができる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域及びＣａｓ９を標的とするｇＲＮＡは、ＴＲＡＣゲノム領域内に破断を生じさせ、ＴＲＡＣ遺伝子内にＩｎｄｅｌをもたらし、これにより、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を破壊する。
β２Ｍ遺伝子を標的とする例示的なｇＲＮＡは、配列番号２０または２４に提供される。以下の配列表を参照されたい。ＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２も参照のこと。それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体に位置するβ２Ｍ遺伝子配列（ＧＲＣｈ３８座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）を使用して設計することができる。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的とするｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に破断を生じさせ、その結果、β２Ｍ遺伝子中のＩｎｄｅｌがｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を破壊する。
ＩＩ型システムにおいては、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ｇＲＮＡにおいては、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。Ｖ型ｇＲＮＡにおいては、ｃｒＲＮＡが二本鎖を形成する。両方のシステムにおいて、この二本鎖は、部位指向性ポリペプチドに結合し、それによってガイドＲＮＡ及び部位指向性ポリペプチドは、複合体を形成するようになる。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチドとの会合によって、複合体に標的特異性をもたらすことができる。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチドの活性を誘導することができる。
当業者が理解するように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に対して相補的なスペーサー配列を含めるように設計される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子の２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して相補的）である、３’のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。
ＩＩ型システム中の単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と称する）は、５’から３’の方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）をもたらすエレメントを含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を含む。
「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接する標的遺伝子内にあり、Ｃａｓ９によって改変される配列である。「標的配列」は、「標的核酸」中のいわゆるＰＡＭ鎖上にあり、これは、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含む二本鎖分子である。当業者であれば、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖中に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識する。したがって、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡにあたるものである。
例えば、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号２６）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１９）である。別の例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号２７）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ－３’（配列番号２１）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して、配列特異的な状態で目的の標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変動する。
本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、本システムで使用するＣａｓ９酵素によって認識され得るＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域とハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列に完全にマッチすることもあればミスマッチを有することもある。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ内で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸中に配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識する（式中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化された標的核酸配列の３’側、真横にある）
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０のヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０未満のヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０を超えるヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドの５’側、真横に２０塩基を有する。例えば、
を含む配列内では、標的核酸は、Ｎに対応する配列であることができ、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得、下線部のＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭである。例は、配列番号１５～１７として提供される。
本明細書に開示のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列を介して目的の任意の配列を標的とし得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子中の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的遺伝子中の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的遺伝子中の標的配列は、最大１０のミスマッチ、例えば、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、または最大１のミスマッチを含み得る。
本明細書で提供されるように使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、ＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２及びＷＯ２０１９／２１５５００に提供され、それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれについても、改変を明示的に示さないものは、未改変配列及び任意の好適な改変を有する配列の両方を包含することを意味する。
本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及び本明細書に開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成成分に依存し得る。例えば、異なる細菌種からの異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列の長さを有する。したがって、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチド長を有し得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得るｓｇＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド超のスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０ヌクレオチドの可変長スペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７、または８個のウラシル残基を含むことができる。
ｓｇＲＮＡのいずれかなど、本明細書に開示のｇＲＮＡのいずれかは、未修飾であってもよい。あるいは、それは、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／または修飾骨格を含んでもよい。例えば、ｓｇＲＮＡなどの修飾ｇＲＮＡは、５’末端もしくは３’末端のいずれか、またはその両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
ある実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内の活性または安定性など、同じまたは異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じベクターまたは異なるベクターでコードできる。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じかまたは異なる。
２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡが、本明細書に記載の方法、例えば、当技術分野で知られているか、または本明細書に開示されている方法で使用できることを理解することとする。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野で知られているＣａｓ９酵素及び／またはｇＲＮＡを含む。例は、例えばＷＯ２０１９／０９７３０５Ａ２及びＷＯ２０１９／２１５５００に見出すことができ、それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。
（ｉｉ）ＣＡＲ構築物をＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
本明細書に開示の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物をコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達することができる。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込まれる小さなウイルスであるため、ＣＡＲなどの導入遺伝子を送達できる。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／または目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製起点として機能する。また、ＡＡＶゲノム中にはｒｅｐ及びｃａｐタンパク質も存在し、転写されたときに、標的細胞への送達のためにＡＡＶゲノムをカプセル化するキャプシドを形成する。ＡＡＶ血清型を付与するこれらのキャプシド上の表面受容体は、キャプシドが主に結合する標的器官を決定し、したがってＡＡＶが最も効率的に感染する細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶ血清型は、１２種類ある。いくつかの実施形態では、ＣＡＲコード核酸の送達に使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由から、遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。まず、ＡＡＶは、ヒトなどの哺乳動物に投与したときに、免疫応答を誘発することはない。第二に、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮した場合、ＡＡＶは、標的細胞に効果的に送達される。最後に、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。これは、ゲノムが組み込まれることなく、宿主細胞中で生存することができるためである。この形質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞中の目的のゲノム部位に挿入するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー遺伝子座中にあり得る。
いくつかの実施形態では、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ばれ得るドナー鋳型を介して）抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を設計することができ、これにより、ＴＲＡＣ遺伝子内の任意の位置に挿入して、遺伝子操作されたＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊し、ＣＡＲポリペプチドを発現させることができるようになる。ＴＲＡＣが破壊されることにより、内因性ＴＣＲの機能の喪失がもたらされる。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子中での破壊は、本明細書に記載のものなどのエンドヌクレアーゼ、及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを用いて作出することができる。ＴＲＡＣ遺伝子及び標的領域に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば、本明細書に開示されるものをこの目的のために使用することができる。
いくつかの例では、ＴＲＡＣ遺伝子中のゲノム欠失及びＣＡＲコードセグメントによる置換は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用して）相同組換え修復すなわちＨＤＲによって作出され得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子中での破壊は、本明細書に開示されているようなエンドヌクレアーゼと、１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的とする１つ以上のｇＲＮＡとにより、ＴＲＡＣ遺伝子にＣＡＲコードセグメントを挿入することによって生じさせ得る。
本明細書に開示されるドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含み得る。いくつかの例では、ＣＡＲコード配列は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用したＴＲＡＣ遺伝子など、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲが可能になるように、２つの相同領域に隣接させ得る。この場合、標的遺伝子座におけるＤＮＡの両方の鎖を、標的遺伝子座に特異的なｇＲＮＡによってガイドされるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素によって切断できる。次にＨＤＲが発生して、二本鎖破断（ＤＳＢ）が修復され、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく生じるように、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子中のＤＳＢ部位を囲む配列に相補的な隣接残基（以下、「相同性アーム」）を使用して設計される。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復の鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的にエラーのないメカニズムにすることができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、変異と切断部位との距離に対応するため、重複する標的部位または近くにある標的部位を選択することが重要である。鋳型は相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、またはゲノム配列とは異なる配列を含有してもよく、このようにして配列編集が可能になる。
あるいは、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的位置と相同な領域を持たない可能性があり、標的部位での切断後にＮＨＥＪ依存性末端結合によって組み込まれ得る。
ドナー鋳型は、一本鎖及び／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状または環状形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖状分子の３’末端に付加され、及び／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一方の末端もしくは両方の末端にライゲートされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、これらに限定されないが、末端アミノ基（複数可）の付加、及び修飾ヌクレオチド間の連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられる。
ドナー鋳型は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの剤と複合された核酸として細胞に導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内因性プロモーターによって駆動され得るように、内因性プロモーターに近い部位（例えば、下流または上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、外因性プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するための構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用してもよい。
さらに、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチド及び／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。
遺伝子操作された免疫細胞（例えば、本明細書に開示のＴ細胞）を調製するために、好適な供給源からのＴ細胞などの免疫細胞、例えば、健康なドナーまたはＣＡＲ－Ｔ細胞療法を必要とする患者であり得るヒトドナーからの血液細胞を得ることができる。ＣＴＸ１１０細胞は、１名以上の健康なヒトドナーからの血液細胞を使用して作製できる。健康なドナー細胞から製造することで、意図せずに悪性リンパ腫／白血病細胞を形質導入するリスクが最小限に抑えられ、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能が改善され得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの構成成分（例えば、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ）、任意によりＡＡＶドナー鋳型は、従来のアプローチを介して宿主免疫細胞に送達され得る。いくつかの例では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、エレクトロポレーションによって宿主免疫細胞に送達することができる。必要に応じて、ＡＡＶドナー鋳型は、ＲＮＰ複合体と同時に免疫細胞に送達され得る。あるいは、ＲＮＰ及びＡＡＶドナー鋳型の送達は、順次行い得る。いくつかの例では、遺伝子編集成分の送達前にＴ細胞を活性化させてもよい。
遺伝子編集成分及び任意にドナー鋳型の送達後、細胞を回収し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させ得る。遺伝子編集効率は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのノックイン及び標的遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、または両方）のノックアウトを確認するための通常の方法を使用して評価することができる。いくつかの例では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞が除去されてもよい。ＣＴＸ１１０細胞などの本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞の調製に関するさらなる情報は、米国特許出願第６２／９３４，９９１号に見出すことができ、その関連開示は、本明細書に参照される目的及び主題のために参照により組み込まれる。
ＩＩＩ．Ｂ細胞悪性腫瘍の同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
いくつかの態様では、本明細書に開示のＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの集団を使用して、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者を治療するための方法が本明細書に提供される。同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、２段階の治療を含み得る：（ｉ）好適なヒト患者に１つ以上のリンパ球枯渇剤の１回以上の用量を与えることを含むコンディショニングレジメン（リンパ球枯渇治療）、及び（ｉｉ）本明細書に開示のＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団をヒト患者に投与することを含む治療レジメン（同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法）。場合によっては、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の１回または複数回の追加用量を、リンパ球枯渇治療を伴うか伴わずにヒト患者に投与してもよい。
（ｉ）患者集団
ヒト患者は、診断、治療、または治療法が望まれる任意のヒト対象であり得る。ヒト患者は、あらゆる年齢であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、成年（例えば、少なくとも１８歳の人）である。いくつかの例では、ヒト患者は、５０ｋｇ以上の体重を有し得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、小児であり得る。
本明細書に記載の方法によって治療されるヒト患者は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する、有する疑いがある、または有するリスクがあるヒト患者であり得る。Ｂ細胞悪性腫瘍の疑いのある対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍の１つ以上の症状、例えば、原因不明の体重減少、疲労、寝汗、息切れ、または腺腫脹を示し得る。Ｂ細胞悪性腫瘍のリスクのある対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍のリスク因子のうちの１つ以上、例えば、免疫系の弱体化、年齢、男性、または感染症（例えば、エプスタイン・バーウイルス感染症）を有する対象であり得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０ Ｔ細胞）治療を必要とするヒト患者は、通常の健康診断、例えば、身体診査、臨床検査、生検（例えば、骨髄生検及び／またはリンパ節生検）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、または超音波検査によって同定され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に由来する悪性腫瘍の異種群である非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、がんが発生した細胞型、組織学、変異プロファイリング、及び細胞表面上のタンパク質マーカーに基づいて、６０を超えるＮＨＬの異なるサブカテゴリーを定義しており、ＮＨＬは、世界で１０番目に多い悪性腫瘍である（Ｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｔｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＨＬは、報告されたすべての新たながん症例の４．３％を占め、米国におけるがんによる死因の第８位である。ＮＨＬの主要なサブタイプとしては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）が挙げられる（Ｔｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｔｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＣＤ１９の発現は、Ｂ細胞悪性腫瘍上に遍在しており、ＮＨＬの緩慢に進行するサブタイプと攻撃的なサブタイプ間で維持され（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒａｃｉｌａ，１９９５）、これらは、これらの適応症におけるＣＤ１９に向けた治療法の開発の増加に寄与している。
いくつかの例では、本明細書に記載の方法を使用して治療することができるＢ細胞悪性腫瘍としては、これらに限定されないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、グレード３ｂ ＦＬ、または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のリヒター形質転換が挙げられる。いくつかの例では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ＤＬＢＣＬ、例えば、高悪性度ＤＬＢＣＬまたはＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である。いくつかの例では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、形質転換ＦＬまたはグレード３ｂ ＦＬである。いくつかの例では、ヒト患者は、フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有する。いくつかの例では、ヒト患者は、バルキー病変の現れを伴う難治性ＮＨＬ疾患を有する場合がある（高リスク対象）。
ＤＬＢＣＬは、ＮＨＬの中で最も一般的な型であり、診断された症例の３０～４０％を占める（Ｓｅｈｎ ａｎｄ Ｇａｓｃｏｙｎｅ，２０１５）。約３０～５０％が、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾンからなる一次治療ラインの化学免疫療法で治癒を達成する（Ｒ－ＣＨＯＰ；Ｃｏｉｆｆｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかし、約２０％がＲ－ＣＨＯＰに難治性であり、３０％が完全奏効（ＣＲ、（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６））後に再発する。
ＦＬは、不均一な疾患であり、通常は緩慢な進行であり、報告されたＮＨＬの約２０％を占める。この経過は、治療法に対する初期の応答、及びその後の再発、時にはより攻撃性の高いリンパ腫の形態への形質転換を特徴とする。一般に、より進行した段階では不治であると考えられているが、早期疾患を有する対象の１０年生存率は７１％であり、濾胞性リンパ腫の国際予後指標スコアに基づくリスク因子は０～１である（Ｓｏｌａｌ－Ｃｅｌｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＦＬは、組織学的判定及び中心細胞と中心芽細胞の割合に基づいてグレード１～３に分類され、グレード３は、３ａ及び３ｂに細分される。ＦＬグレード３ｂは、現在、ｔ（１４；１８）及びＣＤ１０の発現が無いことがよくあり、ｐ５３及びＭＵＭ１／ＩＲＦ４の発現が増加しているため、生物学的に異なるエンティティと見なされている（Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。５００を超えるＦＬ症例の大規模な後ろ向き分析により、ＦＬグレード３ｂの臨床経過が、ＦＬグレード１～２に類似しているのに対し、ＦＬグレード３ｂは、ＤＬＢＣＬの臨床経過により類似した臨床経過を有することがさらに確認された（Ｋａｈｌ ａｎｄ Ｙａｎｇ，２０１６、Ｗａｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。このため、ＦＬグレード３ｂは、典型的には、ＤＬＢＣＬと同様に管理される（Ｋａｈｌ ａｎｄ Ｙａｎｇ，２０１６）。
いくつかの実施形態では、治療を受けるヒト患者は、ＤＬＢＣＬを有し、傍直腸腫瘤、後腹膜腫瘤、びまん性リンパ節（ＬＮ）、溶解性病変、扁桃病変、またはそれらの組み合わせを呈する。代替的または追加的に、ヒト患者は、骨髄拡散を有し得る。他の例では、ヒト患者は、骨髄拡散がない。
いくつかの実施形態では、治療を受けるヒト患者は、形質転換ＦＬを有する。このようなヒト患者は、びまん性ＬＮを呈し得る。場合によっては、ヒト患者は、骨髄拡散を有し得る。他の例では、ヒト患者は、骨髄拡散がない場合がある。
本明細書に記載の方法による治療を受けるヒト患者は、治療後に再発した、及び／または治療に対して抵抗性になった、及び／または治療に対して無応答であったヒト患者であり得る。本明細書で使用される場合、「再発した」または「再発する」とは、完全奏効期間後に戻る、本明細書で開示されるものなどのＢ細胞悪性腫瘍を指す。進行性疾患とは、最後の評価（例えば、安定疾患または部分奏効）後に疾患が悪化した場合を指す。いくつかの実施形態では、治療中に進行が生じる。いくつかの実施形態では、治療後に再発が起こる。応答の欠如は、通常の医療行為によって決定され得る。例えば、本明細書に記載の方法による治療を受けるヒト患者は、これまでに１つ以上の治療ラインの抗がん療法を受けたヒト患者であり得る。場合によっては、ヒト患者は、これまでに２つ以上の治療ラインの抗がん療法、例えば、化学療法、免疫療法、手術、またはそれらの組み合わせを受けていてもよい。いくつかの例では、これまでの抗がん療法は、抗ＣＤ２０抗体療法、アントラサイクリン含有療法、またはそれらの組み合わせを含み得る。
場合によっては、ヒト患者は、難治性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する。本明細書で使用される場合、「難治性」とは、治療に応答しない、または治療に耐性になる、本明細書に開示されるものなどのＢ細胞悪性腫瘍を指す。難治性Ｂ細胞性悪性腫瘍を有するヒト患者は、最後の治療で進行性疾患を有し得るか、または少なくとも２サイクルの治療後に安定疾患を有し、その安定疾患の期間が最大６ヶ月（例えば、最大５ヶ月、最大４ヶ月、または最大３ヶ月、または最大２ヶ月、または最大１ヶ月）である。いくつかの例では、ヒト患者は、以前に自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けており、そのようなものに対して応答を示さなかった（奏効しなかった）か、または若干の応答を達成後に進行したかまたは再発した可能性がある。他の例では、ヒト患者は、これまでの自家ＨＳＣＴに適格でない場合がある。
ヒト患者をスクリーニングして、患者が本明細書に開示されるコンディショニングレジメン（リンパ球枯渇治療）及び／または同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けるにあたって適格であるかを決定してもよい。例えば、リンパ球枯渇治療に適格なヒト患者は、次の特徴のうちの１つ以上を示さない、（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％を超える飽和レベルを維持するための酸素補給の必要性、（ｃ））制御されていない心不整脈、（ｄ）昇圧剤によるサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染、及び（ｆ）グレード２以上の急性神経毒性。別の例において、治療レジメンに適格なヒト患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を示さない：（ａ）制御されていない活動性感染、（ｂ）リンパ球枯渇治療前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード２以上の急性神経毒性。
そのようなスクリーニング結果に基づいて、ヒト患者をスクリーニングし、コンディショニングレジメン及び／または治療レジメンから除外してもよい。例えば、ヒト患者は、患者が以下の除外基準のうちの１つ以上を満たす場合、コンディショニングレジメン及び／または同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法から除外され得る：（ａ）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス０または１を有する、（ｂ）腎臓、肝臓、心臓、及び／または肺機能が適切である、（ｃ）これまでに遺伝子療法または改変細胞療法を受けていない、（ｄ）これまでに抗ＣＤ１９抗体を含む治療を受けていない、（ｅ）これまでに同種他家ＨＳＣＴを受けていない、（ｆ）脳脊髄液からの検出可能な悪性腫瘍細胞がない、（ｇ）脳転移がない、（ｈ）これまでに中枢神経系障害がない、（ｉ）不安定狭心症、不整脈、及び／または心筋梗塞がない、（ｊ）制御されていない感染がない、（ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全障害または自己免疫疾患がない、（ｌ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに感染していない。
いくつかの実施形態では、ヒト患者は、スクリーニング前の１４日以内または５半減期以内（いずれか長い方）まで、全身抗腫瘍療法または治験薬を受けていないＮＨＬ患者である。場合によっては、ヒト患者は事前に免疫療法（例えば、リツキシマブ、イノツズマブなど）を受けており、スクリーニング前の３０日以内（例えば、１４日以内）に中止してもよい。
（ｉｉ）コンディショニングレジメン（リンパ球枯渇療法）
本明細書に開示される治療方法に好適である任意のヒト患者は、対象の内因性リンパ球を減少させるかまたは枯渇させるために、リンパ球枯渇療法を受けてもよい。
リンパ球枯渇とは、内因性リンパ球及び／またはＴ細胞の破壊を指し、免疫移植及び免疫療法の前に一般的に使用される。リンパ球枯渇は、放射線照射及び／または化学療法によって達成できる。「リンパ球枯渇剤」は、対象に投与された場合に、内因性リンパ球及び／またはＴ細胞を減少、枯渇、または排除することができるあらゆる分子であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、本剤の投与前のリンパ球数と比較して、リンパ球数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、対象におけるリンパ球数が検出限界未満になるように、リンパ球の数を減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）のリンパ球枯渇剤を投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、リンパ球を特異的に死滅させる細胞傷害剤である。リンパ球枯渇剤の例としては、これらに限定されないが、フルダラビン、シクロホスファミド、ベンダムスチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ダカルバジン、メルファラン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、エトポシドリン酸塩、ミトキサントロン、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス、またはＤＡＢ－ＩＬ２が挙げられる。場合によっては、リンパ球枯渇剤は、低線量照射を伴ってもよい。コンディショニングレジメンのリンパ球枯渇効果は、日常的な実践によって監視可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、１つ以上のリンパ球枯渇剤、例えばフルダラビン及びシクロホスファミドを含むコンディショニングレジメンを含む。本明細書に記載の方法によって治療されるヒト患者は、コンディショニング段階において好適な期間（例えば、１～５日）、１つ以上のリンパ球枯渇剤の複数回投与を受けてもよい。患者は、リンパ球枯渇期間中、１日１回、リンパ球枯渇剤のうちの１つ以上を受け取ることができる。一例では、ヒト患者は、フルダラビン約２０～５０ｍｇ／ｍ２（例えば、３０ｍｇ／ｍ２）／日を２～４日間（例えば、３日間）、及びシクロホスファミド約５００～７５０ｍｇ／ｍ２（例えば、５００または７５０ｍｇ／ｍ２）／日を２～４日間（例えば、３日間）受ける。特定の例では、ヒト患者は、フルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２／日及びシクロホスファミド約５００ｍｇ／ｍ２／日を３日間受けてもよい。
他の例では、ヒト患者は、フルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２／日及びシクロホスファミド約７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間受けてもよい。ヒト患者がこの初回リンパ球枯渇治療レジメンを受ける場合、その後のリンパ球枯渇治療はいずれも、例えば、本明細書に開示のＣＴＸ１１０などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与に関連して、フルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２／日及びシクロホスファミド約５００ｍｇ／ｍ２／日を２～４日間、例えば３日間を含み得る。
次いで、ヒト患者は、本明細書に開示のリンパ球枯渇療法後の好適な期間内に、ＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを投与され得る。例えば、ヒト患者は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の投与前に、約２～７日間（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日）、１つ以上のリンパ球枯渇剤に供され得る。場合によっては、ヒト患者は、リンパ球枯渇療法後約４～５日以内に抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を投与される。
ＣＴＸ１１０細胞などの同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、事前に調製することができ、治療施設に保管され得るため、本明細書に開示のリンパ球枯渇療法は、ヒト患者が、本明細書に開示の同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に好適であると特定された後、短時間枠（例えば、２週間以内）でＢ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者に適用され得る。例えば、リンパ球枯渇療法の初回用量（例えば、フルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００ｍｇ／ｍ２または７５０ｍｇ／ｍ２）は、ヒト患者が、本明細書に開示の同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に好適であると特定された後、２週間以内（例えば、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、またはそれより少ない日数以内）にヒト患者に投与され得る。いくつかの例では、ヒト患者が治療に好適であると特定された後２４～７２時間以内（例えば、２４時間以内）に、リンパ球枯渇療法をヒト患者に実施してもよい。次に患者は、リンパ球枯渇治療後２～７日以内（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、または７日）にＣＡＲ－Ｔ細胞が投与され得る。これにより、本明細書に開示の同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えばＣＴＸ１１０細胞を用いたヒト患者のタイムリーな治療が、疾患診断及び／または患者の識別後に、遅延（例えば、治療用細胞の調製による遅延）なく可能になる。場合によっては、患者は、入院治療中にこの治療を受けてもよい。場合によっては、患者は、外来診療でこの治療を受けてもよい。
リンパ球枯渇ステップのいずれかの前に、ヒト患者は、患者がリンパ球枯渇治療に適格であるかを決定するために、１つ以上の特徴についてスクリーニングされ得る。例えば、リンパ球枯渇前に、リンパ球枯渇治療に適格なヒト患者は、次の特徴のうちの１つ以上を示さない、（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％を超える飽和レベルを維持するための酸素補給の必要性、（ｃ））制御されていない心不整脈、（ｄ）昇圧剤によるサポートを必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染、及び（ｆ）グレード２以上の急性神経毒性。
リンパ球枯渇後、ヒト患者は、患者がＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療に適格であるかを決定するために、１つ以上の特徴についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の前及びリンパ球枯渇治療の後に、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療に適格なヒト患者は、以下の特徴のうちの１つ以上を示さない：（ａ）制御されていない活動性感染、（ｂ）リンパ球枯渇治療前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード２以上の急性神経毒性。
（ｉｉｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与には、所望の効果（複数可）を得ることができるように、腫瘍部位などの所望の部位において、遺伝子操作されたＴ細胞集団の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を、これも本明細書に開示のヒト患者内に置く（例えば、移植）ことを含み得る。遺伝子操作されたＴ細胞集団は、移植された細胞または細胞の成分の少なくとも一部が依然として生存している対象内の所望の場所への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後における細胞の生存期間は、数時間という短期間であることもあれば、例えば、２４時間から数日、数週、数ヶ月、さらに数年という長期間であることもあれば、さらに対象の生涯にわたる、すなわち長期生着であることもある。特定の例では、患者は、入院治療中に遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を受けてもよい。特定の例において、患者は、外来治療中に遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）を受けてもよい。
例えば、本明細書に記載の一部の態様では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団は、全身の投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団は、全身投与され、これは、標的部位、組織、臓器に直接ではなく、細胞の集団を投与することを指し、代わって、これにより、細胞の集団は、対象の循環系に侵入し、このため、代謝及び他の類似プロセスに供される。好適な投与様式としては、注射、注入、点滴、または摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
有効量とは、病状（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）の少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な遺伝子操作されたＴ細胞集団の量を指し、所望の効果を提供するため、例えば病状を有する対象を治療するために遺伝子操作されたＴ細胞集団の十分な量に関する。また、有効量は、疾患の症状の出現の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を緩徐にすること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含む。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約１×１０７の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞～約１×１０９の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞、例えば、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現する、約１×１０７の細胞～約１×１０９の細胞（ＣＡＲ＋細胞、例えばＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効量は、約３×１０７～約１×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞、約３×１０７～約３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞、約３×１０７～約４．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞または約３×１０７～約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。他の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効量は、約１×１０８～約３×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞、約１×１０８～約４．５×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞、または約１×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。さらに他の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効量は、約３×１０８～約４．５×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞または約３×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効量は、約４．５×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、遺伝子操作されたＴ細胞集団の用量、例えば、約１×１０７のＣＴＸ１１０細胞～約１×１０９のＣＴＸ１１０細胞を含む用量を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は約３×１０７～約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、約３×１０７～約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、約３×１０７～約４．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、または約３×１０７～約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。他の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は、約１×１０８～約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、約１×１０８～約４．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、または約１×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。さらに他の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は、約３×１０８～約４．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞または約３×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は、約４．５×１０８～約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は、約６．０×１０８～約７．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の有効量は、約７．５×１０８～約９．０×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲であり得る。
いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約１×１０７のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約３×１０７のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約４．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約１×１０９のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞であり得る。
場合によっては、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現する約３．０×１０８（例えば、３．５×１０８）のＣＡＲ＋細胞～約９×１０８の細胞（ＣＡＲ＋細胞）を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、少なくとも３．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも４×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも４．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも５．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも６．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも７×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも７．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも８×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、少なくとも８．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞、または少なくとも９×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３．０×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞、例えば、約３．５×１０８～約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞または約３．５×１０８～約４．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約４．５×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約４．５×１０８～約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約６×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約７．５×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。
特定の例では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含み得る。例えば、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約４．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含み得る。他の例では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含み得る。いくつかの例では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約７．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含み得る。さらに他の例では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３×１０８～約７．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３×１０８～約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１１０細胞）の有効量は、約３×１０８～約４．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、遺伝子操作されたＴ細胞集団の用量、例えば、約３．５×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞～約９×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞を含む用量、例えば、本明細書に開示される任意の用量または用量範囲を含み得る。いくつかの例では、有効量は、４．５×１０６ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞である。いくつかの例では、有効量は、６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞である。いくつかの例では、有効量は、７．５×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞である。いくつかの例では、有効量は、９×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞である。
いくつかの例では、ＤＬＢＣＬ（例えば、再発及び／または難治性）を有する患者に、好適な用量のＣＴＸ１１０細胞、例えば、約３×１０７～約６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞を投与することができる。このようなＤＬＢＣＬ患者は、約３×１０７ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。あるいは、ＤＬＢＣＬ患者は、約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。別の例では、ＤＬＢＣＬ患者は、約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。別の例では、ＤＬＢＣＬ患者は、約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。
いくつかの例では、形質転換濾胞性リンパ腫（ｔＦＬ、再発及び／または難治性）を有する患者に、好適な用量のＣＴＸ１１０細胞、例えば、約３×１０７～約６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞を投与することができる。このようなｔＦＬ患者は、約３×１０７ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。あるいは、こうしたｔＦＬ患者は、約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。別の例では、ｔＦＬ患者は、約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。さらに別の例では、ｔＦＬ患者は、約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。
いくつかの例では、同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）で治療される患者は、Ｌｕｇａｎｏ ２０１４にしたがって決定することができるステージＩＩＩ疾患を有し得る。ステージＩＩＩの患者は、例えば、約３×１０７～約６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲の好適な用量のＣＴＸ１１０が投与され得る。このようなステージＩＩＩの患者は、約３×１０７ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。あるいは、こうしたステージＩＩＩの患者は、約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。別の例では、ステージＩＩＩの患者は、約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。さらに別の例では、ステージＩＩＩの患者は、約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。
いくつかの例では、同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）で治療される患者は、Ｌｕｇａｎｏ ２０１４にしたがって決定することができるステージＩＶ疾患を有し得る。ステージＩＶの患者は、例えば、約３×１０７～約６×１０８ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞の範囲の好適な用量のＣＴＸ１１０が投与され得る。このようなステージＩＶの患者は、約３×１０７ＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。あるいは、こうしたステージＩＶの患者は、約１×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。別の例では、ステージＩＶの患者は、約３×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。さらに別の例では、ステージＩＶの患者は、約６×１０８のＣＡＲ＋ＣＴＸ１１０細胞が投与され得る。
本明細書に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性は、熟練臨床医によって決定され得る。ほんの一例であるが、ＣＤ１９のレベルの徴候または症状のいずれか１つまたはすべてが有益な状態で変更された場合（例えば、少なくとも１０％減少）、またはＢ細胞悪性腫瘍の他の臨床的に承認された症状またはマーカーが改善または緩和された場合、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）は、有効と見なされる。また、有効性は、個体が入院により判定されるように悪化しないことまたは医療介入を必要としない（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の進行が停止している、または少なくとも緩徐になっている）ことによっても判定され得る。これらの指標の測定方法は当業者に公知であり、及び／または本明細書に記載されている。治療には、ヒト患者におけるＢ細胞悪性腫瘍の任意の治療が含まれ、以下を含む：（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を抑止もしくは緩徐化すること、または（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の後退をもたらすこと、及び（３）症状が出現する可能性を防止または低下させること。
必要に応じて、ＣＴＸ１１０細胞などの遺伝子操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかの２回目の投与（場合によっては、より多くの投与、例えば、合計で最大３回の投与）を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の１回の投与を受けた同じ患者に投与してもよい。再投与に適格な患者は、進行性疾患（ＰＤ）を示す可能性があり、これまでに応答を示していた。その後の用量または追加の用量は、初回用量と同じであってもよい。あるいは、２回目の用量または追加の用量は、初回用量とは異なり、より多くても少なくてもよい。いくつかの例では、２回目の用量は、約３．０×１０８～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞、例えば、約４．５×１０８～約６×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の範囲であり得る。特定の例では、２回目の用量は、約３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞であり得る。
いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）の２回目の投与は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の初回投与の約４週間後にヒト患者に施され得る。２回目の投与に適格なヒト患者は、初回投与後約４週間で安定疾患（ＳＤ）またはそれ以上を達成し得る（例えば、Ｌｕｇａｎｏ基準に基づく）。２回目の投与は、本明細書に開示のＬＤ化学療法を伴ってもよい（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の２回目の投与前２～７日以内）。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の初回用量に関連して高用量のＬＤ化学療法（例えば、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２＋シクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶ）を受けている患者の場合、その後のＬＤ化学療法は、低用量のもので、例えば、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２＋シクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶで同時投与し得る。あるいは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の２回目の投与（または追加投与）は、例えば、著しい血球減少を呈する患者の場合、ＬＤ化学療法を伴わなくてもよい。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与後、ヒト患者は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧、腎不全、またはそれらの組み合わせ、などの急性毒性について、監視することができる。
ヒト患者が急性毒性のうちの１つ以上の症状を示す場合、ヒト患者は、毒性管理を受ける場合がある。急性毒性のうちの１つ以上の症状を呈する患者の治療は、当技術分野で知られている。例えば、ＣＲＳの症状（例えば、心臓、呼吸器の異常、及び／または神経学的異常）を呈するヒト患者は、抗サイトカイン療法が施され得る。さらに、ＣＲＳの症状を呈さないヒト患者には、抗ＣＴＸ１１０ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進するために抗サイトカイン療法が施され得る。
代替的にまたは追加的に、ヒト患者が急性毒性のうちの１つ以上の症状を呈する場合、ヒト患者の治療を終了してもよい。患者が有害事象（ＡＥ）のうちの１つ以上の徴候を呈した場合、例えば、患者が異常な検査所見を有する、及び／または患者が疾患進行の徴候を示した場合、患者の治療を終了してもよい。
本明細書に記載の同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、ＣＴＸ１１０細胞を含む）は、組み合わせ療法においても使用され得る。例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するため、または遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効性を高めるため、及び／または遺伝子操作されたＴ細胞集団の副作用を軽減するために、他の治療剤と併用してもよい。
（ｉｖ）例示的治療レジメン
ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）を使用して、本明細書に開示の治療方法のいずれかによって治療することができる。例示的治療レジメンを図２１に示す。以下にいくつかの例を示す。
いくつかの実施形態では、ＮＨＬを有するヒト患者は、本明細書に開示の治療のために特定され得る。このようなヒト患者は、ＮＨＬサブタイプ、例えば、非特異型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（ＮＯＳ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、またはグレード３ｂ ＦＬを有し得る。ヒト患者は、以下の実施例７に提供する選択基準及び除外基準を満たし得る。ヒト患者は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２の同時投与を含むＬＤ化学療法を３日間毎日ＩＶで受けてもよい。場合によっては、これらの剤を両方とも同じ日に開始して連続３日間投与し、ＣＴＸ１１０注入の少なくとも４８時間前（ただし７日以内）に完了してもよい。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）は、静脈内注入により少なくとも３×１０７ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）の予定された２回目の投与は、初回投与の約４～８週間後にヒト患者に実施され得（例えば、２８日目に、初回用量（１日目）の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入する）、これはさらなるＬＤ化学療法と関連し得る。２回目の投与の期間は、２８日目から開始して２０日まで、例えば０～２０日の任意の期間、延長してもよい（１日目は、初回用量の注入日である）。場合によっては、ヒト患者は、２８日目のスキャンでＳＤまたはそれ以上（例えば、Ｌｕｇａｎｏ基準に基づく）を達成する。２回目の投与は、例えば対象が著しい血球減少を生じている場合、ＬＤ化学療法を行わずに実施してもよい。場合によっては、この治療過程（最初の治療過程）を受けたヒト患者は、対象がこれまでに応答していた場合には、ＰＤ後のＬＤ化学療法有りまたは無しで、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）の再投与（第２の治療過程）を受けてもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＨＬを有するヒト患者は、本明細書に開示の治療のために特定され得る。このようなヒト患者は、ＮＨＬサブタイプ、例えば、非特異型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（ＮＯＳ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、またはグレード３ｂ ＦＬを有し得る。ヒト患者は、以下の実施例７に提供する選択基準及び除外基準を満たし得る。ヒト患者は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２の同時投与を含むＬＤ化学療法を３日間毎日ＩＶで受けてもよい。場合によっては、これらの剤を両方とも同じ日に開始して連続３日間投与し、ＣＴＸ１１０注入の少なくとも４８時間前（ただし７日以内）に完了してもよい。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１１０）は、静脈内注入により少なくとも３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量でヒト患者に投与される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の初回投与後約４～８週間、例えば２８日目に予定されているＣＴＸ１１０の２回目の投与は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶ同時投与することを含むＬＤ化学療法と任意により組み合わせて、ヒト患者に投与してもよい。２回目の投与の期間は、２８日目から開始して２０日まで、例えば０～２０日の任意の期間、延長してもよい（１日目は、初回用量の注入である）。２回目の投与を受けた患者は、２８日目のスキャンでＳＤまたはそれ以上を達成し得る（例えば、Ｌｕｇａｎｏ基準に基づく）。場合によっては、例えば対象が著しい血球減少を生じている場合、ＬＤ化学療法なく、２回目の用量が投与される。上記の最初の治療過程を受けた後、患者は、これまでに応答していた場合には、ＰＤの後にＣＴＸ１１０などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を再投与する選択肢もある（第２の治療過程）。再投与は、フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を３日間毎日ＩＶ同時投与することを含むＬＤ化学療法を伴ってもよい。
ＣＴＸ１１０などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の２回の注入を含む、本明細書に記載の第１の治療過程は、本明細書に記載の強化投与とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、初回注入と２回目の注入は、４～８週間離れていてもよい（例えば、１日目の初回注入及び３５日目の２回目の注入（－７日／＋２１日））。適用可能な場合、初回注入及び２回目の注入は、本明細書に開示されるＬＤレジメンのうちのいずれかに関連し得る。第１の治療過程を受ける患者はいずれも、第２の治療過程をさらに受けてもよく、これは、ＣＴＸ１１０などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与を含んでもよく、適用可能なＬＤレジメンを伴う。第２の治療過程は、患者が初回注入後に以前に臨床応答（医師によって判定された）を有し、本明細書に記載されている追加の注入の基準を満たしていることを条件として、疾患の進行時に患者に適用することができる。
ＣＴＸ１１０などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を再投与する選択肢は、ＰＤ後に本明細書に開示の方法のうちのいずれかによる治療のためにヒト患者に利用可能であり、ヒト患者は、これまでに応答を示している。再投与は、ＮＨＬ患者の初回ＣＴＸ１１０注入から少なくとも２ヶ月後に、ＰＤ後に実施してもよい。
ＩＶ．Ｂ細胞悪性腫瘍の同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のためのキット
本開示はまた、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための方法において、本明細書に記載のＣＴＸ１１０細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を使用するためのキットを提供する。そのようなキットは、１つ以上のリンパ球枯渇剤を含む第１の医薬組成物、及び任意の核酸または遺伝子操作されたＴ細胞の集団（例えば、本明細書に記載のもの）を含む第２の医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を含む１つ以上の容器を含み得る。ＣＴＸ１１０細胞など、本明細書に開示の遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含むキットは、医療施設において保管及び在庫管理され、診断後のヒト患者の迅速な治療が可能になる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて使用するための説明書を含むことができる。含まれる使用説明書には、ヒト患者において意図された活性を達成するために対象に第１及び／または第２の医薬組成物を投与することの説明を含むことができる。キットは、ヒト患者が治療を必要としているかを識別することに基づいて、治療に好適であるヒト患者を選択する説明をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、説明書は、治療を必要とするヒト患者に第１及び第２の医薬組成物を投与する説明を含む。
本明細書に記載のＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞集団の使用に関する説明書には、一般に、意図する治療のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば複数用量パッケージ）またはサブユニット用量であり得る。本開示のキット中に提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に記載された説明書である。ラベルまたは添付文書は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、対象におけるＴ細胞またはＢ細胞の悪性腫瘍の治療、発症の遅延、及び／または緩和のために使用されることを示している。
本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージングとしては、これらに限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージングなどが挙げられる。吸入器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は、滅菌アクセスポートを有してもよい。医薬組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に開示のＣＴＸ１１０ Ｔ細胞などの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
キットは、任意により、緩衝液及び解釈情報などの追加の成分を提供し得る。通常、キットは、容器、及び容器上のまたは容器と関連したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。
一般的技術
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、以下の文献において完全に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
さらなる詳細を伴わずに、当業者は上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
実施例１：同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とするＣＤ１９の調製。
ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する同種他家Ｔ細胞は、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１８－０３２５９５５号に記載されているように、健康なドナーの末梢血単核細胞から調製した。簡潔に説明すると、初代ヒトＴ細胞を最初に、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号２６））及びＢ２Ｍ（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号２７））を標的とするＣａｓ９またはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーションした。ＴＲＡＣ遺伝子座でのＤＮＡ二本鎖破断は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）カセットに隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対する左右の相同性アームを含むＡＡＶ６送達ＤＮＡ鋳型（配列番号５６）を用いた相同組換え修復によって修復させた。ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なマウス抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８ヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ｚ及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインを含んでいた。ＣＡＲのアミノ酸配列、及びそれをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４０及び３９で表される。この実施例で使用されるｇＲＮＡは、以下のスペーサー配列を含む：ＴＲＡＣ ｇＲＮＡスペーサー（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ（配列番号１９））、及びＢ２Ｍ ｇＲＮＡスペーサー（ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ（配列番号２１））。ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含む細胞の集団は、本明細書では「ＴＣ１細胞」または「ＣＴＸ１１０細胞」と呼ばれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術により、ＴＣＲα遺伝子（ＴＲＡＣ）の定常領域のノックアウトを高頻度で達成し、これは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を著しく損わせることを目的として、健康なドナーからのヒト初代Ｔ細胞中でのＴＣＲ表面発現を約９８％減少させた。β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の高頻度ノックアウトも得ることができ、これは、患者中での持続性を高めることを目的とし、全体的な効力の増加につながり得る。ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍダブルノックアウト頻度は、その後の抗体ベースの精製または濃縮をいずれも行うことなく、約８０％のＴ細胞で得られている。破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座内からＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトと共に、ＡＡＶ６送達ドナー鋳型を使用した相同組換え修復によって産生され、一貫して高効率で産生されている。ＣＡＲのこの部位特異的組み込みは、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の潜在的な成長を防ぎ、ＧＶＨＤのリスクをさらに低下させ、またレトロウイルスまたはレンチウイルスの送達メカニズムに関連する挿入変異誘発のリスクも低下させる。これらの遺伝子操作された同種他家ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９依存性Ｔ細胞サイトカイン分泌及び強力なＣＤ１９特異的がん細胞溶解を示す。
同種他家抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ産物の産生（図１）は、効率的な編集を呈した（例えば、５０％を超えるＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞効率）（図２）。
実施例２：ＮＯＧマウスにおける皮下Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫腫瘍異種移植モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を決定するための用量漸増試験。
ＮＯＧマウスにおける皮下Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫腫瘍異種移植モデルに対するＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とするＣＤ１９の有効性は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によって採用された方法を使用して評価した。簡潔に言えば、１２匹の５～８週齢の雌ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験開始の５～７日前に病原体非含有条件下で維持した換気マイクロアイソレーターケージ内に個別に収容した。１日目に、マウスは、５×１０６Ｒａｊｉ細胞／マウスの皮下接種を受けた。表１に示すとおり、マウスをさらに３つの処置群に細分した。８日目（Ｒａｊｉ細胞接種７日後）に、処置群２及び群３は、表１に従って、２００μｌのＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の単回静脈内投与を受けた。
腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍体積が５００ｍｍ３以上になったときに、個々のマウスを安楽死させた。
１８日目までに、データは、未処置マウスと比較して、ＴＣ１細胞に応答して腫瘍体積が統計的に有意に低下していることを示している（図３）。腫瘍体積への効果は、用量依存的であり（表２）、より高用量のＴＣ１細胞を受けたマウスは、より低用量のＴＣ１細胞を受けたかまたは未処置マウスと比較して、腫瘍体積が大幅に減少していることが示された。生存率の上昇も処置群で観察された（表２）。
実施例３：ＮＯＧマウスにおける静脈内播種モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とするＣＤ１９有効性の判定。
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）の有効性をさらに判定するために、播種マウスモデルを利用した。
静脈内播種性Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫腫瘍異種移植モデル
ＴＣ１の有効性をさらに実証するために、ＮＯＧマウスにおけるＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫腫瘍細胞株を用いた静脈内播種モデル（播種モデル）を使用した。Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によって採用され、本明細書に記載されている方法を使用して、播種モデルにおいて、ＴＣ１の有効性を評価した。簡潔に言えば、２４匹の５～８週齢の雌ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験開始の５～７日前に病原体非含有条件下で維持した換気マイクロアイソレーターケージ内に個別に収容した。試験開始時に、表３に示すとおり、マウスを５つの処置群に細分した。１日目に、群２～５のマウスは、０．５×１０６Ｒａｊｉ細胞／マウスの静脈内注射を受けた。播種性疾患をモデル化するために、マウスに静脈内接種した。８日目（Ｒａｊｉ細胞注射の７日後）に、処置群３～５は、ＴＣ１細胞の２００μｌの単回静脈内投与を受けた（表３）。
試験過程中、マウスは、毎日監視し、体重は、週に２回測定した。重要評価項目は、罹患近く（ｐｅｒｉ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）までの時間であり、Ｔ細胞生着の効果も判定した。動物の死亡率及び死亡までの時間は、本試験のすべての群について記録した。瀕死状態に達する前に、マウスを安楽死させた。以下の基準のうちの１つ以上を満たす場合、マウスは、瀕死と定義し、屠殺した：
２０％以上の体重減少が１週間を超えて持続する、
腫瘍により、飲食、運動、ならびに排尿及び排便の能力など、正常な生理機能が阻害されている、
過度の体重減少（＞２０％）につながる長期の過度の下痢、または
喘鳴及び呼吸窮迫が持続する。
動物はまた、衰弱、円背姿勢、麻痺／不全麻痺、腹部膨満、潰瘍、膿瘍、発作及び／または出血など、臨床観察によって定義される、長期または過度の痛みまたは苦痛がある場合には、瀕死と見なした。
皮下異種移植モデル（実施例２）と同様に、播種モデルでは、図４に示すとおり、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）により処置されたマウスにおいて、統計的に有意な生存の利点が明らかになった。ｐ＜０．０００１。播種モデルにおける生存に対するＴＣ１治療の効果も、用量依存的であった（表４）。
第２の実験は、上記の静脈内播種モデルを使用して実施した。
１日目に、群２～４のマウスは、０．５×１０６Ｒａｊｉ細胞／マウスの静脈内注射を受けた。播種性疾患をモデル化するために、マウスに静脈内接種した。４日目（Ｒａｊｉ細胞注射の３日後）に、処置群２～４は、表５に従って、ＴＣ１細胞の２００μｌの単回静脈内投与を受けた。
ここでも、播種モデルでは、図５に示すとおり、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）により処置されたマウスにおいて、統計的に有意な生存の利点が明らかになった。ｐ＝０．００１６。播種モデルにおける生存に対するＴＣ１治療の効果も、用量依存的であった（表６）。
ＴＣ１治療に対する脾臓の応答の評価
Ｒａｊｉ注射の２～３週間後にマウスから脾臓を採取し、脾臓におけるＴＣ１細胞の持続性及びＲａｊｉ細胞の根絶についてフローサイトメトリーにより組織を評価した。
脾臓をＣチューブ内の３ｍＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦに移し、ＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して解離させた。サンプルを１００ミクロンのスクリーンを通して１５ｍＬのコニカルチューブに移し、遠心分離（１７００ｒｐｍ、５分間、ＡＲＴブレーキ付き）し、１ｍＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦに再懸濁して、Ｇｕａｖａ ＰＣＡを使用してカウントした。骨髄を遠心分離し、１ｍＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦに再懸濁して、Ｇｕａｖａ ＰＣＡを使用してカウントした。フローサイトメトリー染色するために、細胞を１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦ中、１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。
試験片（５０μＬ）を１ｍＬの１Ｘ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅに加え、室温（ＲＴ）で１０～１２分間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦで１回洗浄した。サンプルを５０μＬの１Ｘ ＤＰＢＳに再懸濁し、ヒト及びマウスのＴｒｕＳｔａｉｎと共に室温で１０～１５分間インキュベートした。サンプルを１ｍＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦで１回洗浄し、染色のために５０μＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦで再懸濁した。表面抗体を添加し、細胞を室温の暗所で１５～２０分間インキュベートし、次いで１ｍＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦで洗浄した。その後、フローサイトメーターで取得するために、サンプルを１２５μＬの１Ｘ ＤＰＢＳ ＣＭＦに再懸濁した。細胞は、次の表面抗体パネルで染色した。
細胞集団は、前方散乱対側方散乱に基づいて、電子ゲーティング（Ｐｌ＝総白血球）によって決定した。あるチャネルから別のチャネルへのスピルオーバーに対処するための補正は、装置の初期セットアップ時に、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＵｌｔｒａ Ｃｏｍｐ Ｂｅａｄｓを使用して実施した。フローサイトメーターは、各チューブ中に１０，０００個のＣＤ４５＋事象を収集するように設定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏｌｌ（商標）フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーによるデータ取得を行った。ＢＯ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（バージョン６．１．３または８．０．１）を使用してデータを取得した。フローサイトメトリーのデータ分析は、フローサイトグラムの形式で行った。これは、各細胞型の相対パーセンテージを測定するために生成されたグラフ表示である。
この実施例は、ＴＣ１細胞処置後、治療的に有益なＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞が脾臓に残存し、組織からＲａｊｉ細胞を選択的に根絶することを実証する（図６Ａ）。さらに、ＴＣ１細胞による治療は、細胞量のＲａｊｉ誘導増加を呈さない（図６Ａ）。さらに、図７は、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞により処置されたマウスの脾臓中の残存ヒト細胞が、ＣＤ８＋であることを示す。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３陰性でもあり、これは、このモデルでの持続性Ｔ細胞が、依然としてＴＣＲ／ＣＤ３陰性であり、したがって、編集を受けていることを示す。
静脈内播種性Ｎａｌｍ－６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍異種移植モデル
ＴＣ１の有効性をさらに実証するために、ＮＯＧマウスにおけるＮａｌｍ－６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍細胞株を使用した静脈内播種モデル（播種モデル）を使用した。Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によって採用され、本明細書に記載されている方法を使用して、播種モデルにおいて、ＴＣ１の有効性を評価した。簡潔に言えば、２４匹の５～８週齢の雌ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験開始の５～７日前に病原体非含有条件下で維持した換気マイクロアイソレーターケージ内に個別に収容した。試験開始時に、表８に示すとおり、マウスを５つの処置群に細分した。１日目に、群２～４のマウスは、０．５×１０６Ｎａｌｍ６細胞／マウスの静脈内注射を受けた。播種性疾患をモデル化するために、マウスに静脈内接種した。４日目（Ｎａｌｍ６細胞注射の３日後）に、処置群２～４は、表８に従って、ＴＣ１細胞の２００μｌの単回静脈内投与を受けた。
上記のとおり、試験過程中、マウスは、毎日監視し、体重は、週に２回測定した。
Ｒａｊｉ静脈内播種モデル（上記）と同様に、Ｎａｌｍ６モデルもまた、図８に示すとおり、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞（ＴＣ１）で治療したマウスにおいて、統計的に有意な生存の利点を示した。ｐ＝０．０００４。Ｎａｌｍ６播種モデルにおける生存に対するＴＣ１治療の効果も、用量依存的であった（表９）。
実施例４：ＮＯＧマウスにおける静脈内播種モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とするＣＤ１９有効性のさらなる判定。
本試験の目的は、ＮＯＧマウスでのＮａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ急性リンパ芽球性白血病腫瘍細胞株に対する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の複数用量レベルでの抗腫瘍活性を評価することであった。播種性疾患をモデル化するために、マウスに静脈内接種した。重要評価項目は、罹患近くまでの時間であった。生物発光イメージングは、播種性疾患の進行を監視するために実施した。
簡潔に言えば、６週齢の雌ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験開始の５～７日前に病原体非含有条件下で維持した換気マイクロアイソレーターケージ内に収容した。１日目に、マウスあたり５×１０４のＮａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ（Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ－－Ｐｕｒｏ；Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ））細胞の静脈内接種を行った。Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ細胞の接種から３日後、マウスを処置群に分け、表１０に示すとおり、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を投与した。目的領域（ＲＯＩ）の値が取得され、報告された。体重は、１日２回測定し、生物発光は、４日目（Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ細胞の接種後３日）から開始して６７日目まで週２回、７４日目から開始して試験終了まで週１回測定した。生物発光を測定するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン２００μｌを腹腔内注射した。試験開始時に、動態画像を撮影し、残り必要に応じて、マウスを画像化するためのＤ－ルシフェリン後最適用量（ｏｐｔｉｍａｌ ｐｏｓｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ｄｏｓｅ）及び曝露時間を決定した。ソフトウェアバージョン１．２．０（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．；Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を備えたＡＭＩ １０００イメージングユニットを使用して、発光シグナル（オープンエミッション）を捕捉することにより、マウスを画像化した。
個々のマウスは、罹患近く（高い腫瘍負荷を示唆する臨床徴候（例えば、運動性の欠如、円背、活動低下）または１週間を超える期間持続する２０％以上の体重減少）において安楽死させた。瀕死状態に達する前に、マウスを安楽死させた。この試験は、長期生存動物として最後のマウスを安楽死させた９９日目に終了した。
図９は、未治療マウスと比較して、異なる用量のＴＣ１細胞を受けたマウスの生存が延長したことを示す。図１０は、最高用量のＴＣ１細胞（１２×１０６細胞／マウス）を投与され、図９に示す最も長く生存したマウスにおける低いレベルから検出不可能なレベルまでの生物発光を示す。７４日目に、４匹のマウスすべてにおいて、生物発光が検出され、これは、処置群における腫瘍細胞の拡大を示す
全体として、これらの結果は、ＴＣ１細胞の単回注射により、致死用量のＮａｌｍ６ Ｂ－ＡＬＬ細胞を投与されたマウスの生存が延長され得ることを示している。この生存の延長は、用量依存的であり、ＴＣ１細胞の低用量、中用量、及び高用量の間で段階的な生存応答が観察される。
実施例５：ＣＡＲ Ｔ細胞を標的とする同種他家ＣＤ１９を投与されたマウスにおける移植片対宿主病の分析。
未編集ヒトＴ細胞及びＴＣ１細胞の両方が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性を評価するために、マウスでの試験を実施した。２００ｃＧｙを全身照射後、ＮＯＧ雌マウスに未編集のヒトＴ細胞またはＴＣ１細胞を単回静脈内スローボーラス注射で投与した。動物は、放射線のみ（群１）または放射線及びＰＢＭＣの単回投与（群２）、電気穿孔Ｔ細胞（群３）またはＴＣ１細胞（群４）の後、最大１１９日間追跡した。細胞は、１日目の放射線照射の約６時間後に投与した。表１１に、群及び試験デザインをまとめた。
本試験の評価項目は、生存率、ＧｖＨＤ症状の出現の動態、及び体重測定であった。
群１（動物１２匹中３匹）、群２（動物６匹中６匹）及び群３（動物６匹中２匹）において、処置後最初の３０日間に死亡が観察された（図１１）。群４（ＴＣ１細胞）のすべての動物は、スケジュールされた針剖検まで生存した（図１１）。群１、２、及び３の瀕死の動物は、ＧｖＨＤの出現と一致する体重減少及び／または臨床観察（触ると軽微から重度の冷たさ、軽微から中等度の憔悴、軽微から顕著な円背姿勢、重度の体重減少、軽度から重度の脱毛症、重度の活動低下、中等度の努力呼吸、及び顕著な頻呼吸）を経験した。群１及び４の動物、及び群３の非瀕死動物は、放射線照射後に軽度の体重減少を経験し、試験の過程で改善した（図１２）。顕著な臨床観察は記録されなかった。
本試験では、未編集ヒトＰＢＭＣが、すべての動物（群２）の照射ＮＯＧマウスにおいて致死的ＧｖＨＤを誘導し、細胞投与後２～３週間で発症することが実証された。対照的に、ＴＣ１細胞を投与されたマウス（群４）はいずれも、これらの動物に投与された細胞数が多いにもかかわらず（マウス１匹あたり６×１０６のＰＢＭＣと比較して、マウス１匹あたり３×１０７ＴＣ１細胞）、本試験中（１１９日）にＧｖＨＤを発症しなかった。照射処置は、すべての群において一時的な体重減少を誘導し、未編集ＰＢＭＣを受けなかったすべての群において回復した。
未編集のヒトＴ細胞及びＴＣ１細胞の両方がＧｖＨＤを引き起こす可能性をさらに評価するために、第２の試験を行った。具体的には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）雌マウスに、全身照射（総照射線量２００ｃＧｙ、１６０ｃＧｙ／分、標的ＬＤＲ０／１４０Ｒ）後、未編集ヒトＴ細胞またはＴＣ１細胞の単回静脈内スローボーラス注射を施した。本試験の評価項目は、生存率、ＧｖＨＤの症状の出現の動態、及び体重測定であった。組織病理学も、採取されたすべての組織で実施した。曝露は、必要に応じて、フローサイトメトリー及び免疫組織化学（ＩＨＣ）によってマウスの血液及び組織で判定した。
細胞は、表１２に記載のとおり、静脈内スローボーラスを介して単回投与として投与した。
動物は、検証済みの前臨床ソフトウェアシステム（Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ）を使用して、体重によって無作為に処置群に分けた。本試験は、大規模であるため、投与及び針剖検は、９日間にわたって進めた。偏りを最小限に抑えるために、対照群及びＴＣ１群（群４及び５）の動物に投与し、同日に剖検した。すべての群について、試験８５日目に針剖検を行った。
未編集ヒトＴ細胞を与えられたすべての動物（群３）について死亡が観察され、１４日目に発症した（図１３）。未編集ヒトＴ細胞を投与されたすべてのマウス（群３）は、２９日目までに死亡しているか、またはスケジュール外の安楽死に送られた。これらの動物の臨床徴候は、ＧｖＨＤの出現と一致しており、被毛の鈍化、軽微から重度の活動の低下、円背姿勢、軽微から中等度の痩せ、呼吸数の増加が含まれる。未編集のヒトＴ細胞（群３）を投与されたマウスでは、安楽死時に、赤血球、ヘモグロビン、血小板、白血球、及び網状赤血球数の減少など、血液学パラメータの顕著な変化が観察された。群３の動物の肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び胸腺において、最小から中等度の炎症が観察された。多くの場合、これらの組織の炎症には壊死が伴っていた。これらの試験結果は、ＧｖＨＤの出現と一致していた。さらに、大腿骨及び胸骨の骨髄における軽度から重度の低細胞性も群３の動物の大部分中に存在し、これはおそらく全身照射の影響に起因するものであった。これは、他のすべての群の１２週間と比較して、早期の針剖検日（放射線照射後２～４週間）のために、おそらくこの群でのみ観察された。ＧｖＨＤの存在と一致して、群３の動物の免疫組織化学分析により、調べたすべての組織（腎臓、肝臓、脾臓、肺、皮膚、及び消化管）中にヒトＣＤ４５Ｐ＋Ｐ細胞が存在することが明らかになった。他の群のすべての動物は、スケジュールされた針剖検まで生存した。
さらに、群１、２、４、または５では顕著な体重減少は観察されなかった（図１４）。ＧｖＨＤを示す可能性が高いと考えられる少なくとも２つの症状の観察結果を特徴とする、ＧｖＨＤと一致する顕著な臨床観察は、これらの群では記録されなかった。群４及び５の数匹の動物は、試験全体を通して、被毛の鈍化、活動の軽微から中程度の低下、及び／または軽微な痩せなどの症状を示した。これらの症状は、多くの場合、ＧｖＨＤに関連しているが、低頻度で観察され、一過性で持続時間が短いため、ＴＣ１に関連しているとは考えられず、一部の照射された対照動物でも見られた（群２）。
全体として、これら２つの試験による結果から、ＴＣ１細胞は、移植片対宿主病を誘導しないことが確認された。
実施例６：ＣＡＲ Ｔ細胞を標的とする同種他家ＣＤ１９の出現ロットの調製及び特徴付け。
臨床試験の目的のためのＴＣ１細胞は、標準的白血球除去法によって得られた健康なドナーの末梢血単核細胞から調製した。単核細胞は、Ｔ細胞を濃縮し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティングビーズで活性化し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションし、ＣＡＲ遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより形質導入した。改変Ｔ細胞は、細胞培養で拡大し、精製し、懸濁液で製剤化し、低温保存した。
細胞を改変する前に、６名の異なる健康なドナーからのＴ細胞を、様々な細胞表面マーカーの発現について評価した。ＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法で治療した場合、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）における完全奏効と相関することが以前に示されている（Ｆｒａｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．２４（５）：５６３－５７１，２０１８）。したがって、６名の異なるドナーのＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５Ｏ－Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーにより評価した。簡潔に言えば、１×１０６の細胞を陰性対照としてのＦａｂ－ビオチンまたはＩｇＧ－ビオチン抗体と共にインキュベートした。細胞を染色緩衝液で洗浄し、マウス抗ＩｇＧと共にインキュベートして、過剰な一次抗体を捕捉した。細胞を再度洗浄し、二次抗体の全パネル（ＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号３００９２４、ＣＤ４５ＲＯ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号３０４２３０、ＣＤ２７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：カタログ番号５６０６１２）及び生存率色素と共にインキュベートした。細胞を染色緩衝液で最後に洗浄し、フローサイトメーター上で実施して、様々な染色集団を捕捉した。図１５は、ＣＤ８＋サブセット内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞のレベルを示す。同種他家ＣＡＲ－Ｔの製造により、目的のドナーのＣＤ８＋画分に含まれるＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－細胞が多いなど、好ましい特性を有するドナー供給材料を選択することが可能になる。
より具体的には、１８歳から４０歳の男性ドナーのｌｅｕｋｏｐａｋを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の単離、濃縮及び活性化の後、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（配列番号２６）またはＢ２Ｍ ｓｇＲＮＡ（配列番号２７）を含むリボ核タンパク質複合体で細胞をエレクトロポレーションした。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍリボ核タンパク質複合体は、エレクトロポレーション前に組み合わせた。エレクトロポレーション後、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号４０）をコードするドナー鋳型（配列番号５４）を含む新たに解凍したｒＡＡＶを細胞に添加し、この細胞をインキュベートした。次いで、細胞を培養で拡大させ、３～４日ごとにｒｈＩＬ－２及びｒｈＩＬ－７を補充した。監視用に設定した細胞は、ＴＣＲパネル（ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ４５）を使用して、Ｔ細胞の同一性及び遺伝子編集について試験した。Ｔ細胞の同一性を確認したときに、細胞をビオチンコンジュゲート抗ＴＣＲαβ抗体及び抗ビオチンビーズとインキュベートすることにより、ＴＣＲαβ枯渇を実施した。枯渇した細胞を回収し、投与するために製剤化した。得られた細胞集団は、ＴＣＲαβ＋細胞が０．５％未満であった。図１６は、精製前及び精製後のＴＣＲαβ＋細胞の分析結果を示す。
ＴＣ１細胞の８つの出現ロットでは、Ｔ細胞の同一性について試験した。試験を行った８つのロットの平均結果は、Ｂ２Ｍの８４．５８％がノックアウト（すなわち、１５．４２％がＢ２Ｍ＋細胞）及び９９．９８％の細胞がＴＣＲ－（すなわち、０．２％がＴＣＲ＋）であり、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの約５０％がノックインを示した（図１７）。
さらに、Ｔ細胞編集前後のドナー中の疲弊及び老化マーカーを評価した。具体的には、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＴＩＭ３＋、及びＣＤ５７＋細胞の割合（パーセンテージ）を、全Ｔ細胞集団から決定した。マーカーの発現は、次の二次抗体を使用して、上記のとおり、フローサイトメトリーによって判定した：マウス抗－ＰＤ１ ＰｅＣｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８、マウス抗－ＴＩＭ３ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５００８、マウス抗－ＣＤ５７ ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５９６２２、及びマウス抗－ＬＡＧ３ ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６９３０６。図１８は、疲弊または老化マーカーが、ゲノム編集後に、総Ｔ細胞集団の１５％を超えて増加することは決してなかったことを示している。
さらに、ＴＣ１細胞の３つの異なるロットによる選択的死滅を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。具体的には、ＴＣ１細胞をＣＤ１９陽性細胞株（Ｋ５６２－ＣＤ１９、Ｒａｊｉ、及びＮａｌｍ６）、またはＣＤ１９陰性細胞株（Ｋ５６２）とインキュベートした。死滅は、フローサイトメトリーベースの細胞毒性アッセイを使用して、約２４時間後に測定した。具体的には、標的細胞を５μＭ ｅｆｌｕｏｒ６７０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で標識し、洗浄して、様々な比率（Ｔ細胞対標的細胞０．１：１～４：１）でＴＣ１または対照Ｔ細胞との共培養で一晩インキュベートした（５０，０００標的細胞／ウェル、９６ウェルＵ底プレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ］））。翌日、ウェルを洗浄し、培地を１：５００希釈の５ｍｇ／ｍＬ ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含む２００μＬの新鮮培地と交換し、死滅した／死滅しているところの細胞を数えた。最後に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに加え、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用したフローサイトメトリーにより細胞を分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ｖ１０，Ｆｌｏｗｊｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、フローサイトメトリーデータファイル（ｆｃｓファイル）を分析した。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞（未編集細胞）を対照として使用した。ＴＣ１細胞は、未編集Ｔ細胞よりも高い率でＣＤ１９陽性細胞を効率的に死滅させ、ＣＤ１９陰性細胞は、未編集Ｔ細胞と共培養したときよりも少ない、ＴＣ１細胞の存在下で低レベルの細胞溶解を示した（図１９）。
３名のユニークなドナーから産生したＴＣ１細胞も、サイトカイン及び／または血清の不在下での成長を判定するために使用した。具体的には、ＴＣ１細胞を完全なＴ細胞培地で１４日間増殖させた。０日目に、培養からの細胞を完全Ｔ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）含有）、５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）、ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＩＬ－７（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，Ｆｒｉｅｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））（完全培地）、血清を含むがＩＬ－２またはＩＬ－７サイトカインを含まない培地（５％血清、サイトカインなし）、または血清またはサイトカインを含まない培地（血清なし、サイトカインなし）のいずれかで成長させた。サイトカイン及び／または血清の除去後３５日まで、細胞を上記のとおり数えた。サイトカイン及び／または血清の不存在下では、ＴＣ１細胞の成長は観察されなかった（図２０）。
投与用に、ＴＣ１細胞は低温保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－５）に再懸濁させ、６ｍＬ注入バイアルに入れる。総用量は、１つ以上のバイアルに入っている。各バイアルの注入は、解凍後２０分以内に行う。
実施例７：再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象における同種他家ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０）の安全性及び有効性の第Ｉ相、非盲検、多施設、用量漸増及びコホート拡大試験。
ＣＴＸ１１０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集成分（単一ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された同種他家Ｔ細胞で構成されるＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法である。改変には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定数（ＴＲＡＣ）及びベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座の標的とされた破壊、及びアデノ随伴ウイルス発現カセットを介した抗ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子座への挿入を含む。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号４０）は、配列番号４７を含む抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメント、配列番号３２のＣＤ８膜貫通ドメイン、配列番号３６のＣＤ２８共刺激ドメイン、及び配列番号３８のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
ＣＴＸ１１０細胞は、標準的白血球除去法によって得られた健康なドナーの末梢血単核細胞から調製する。単核細胞は、Ｔ細胞を濃縮し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティングビーズで活性化し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションし、ＣＡＲ遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより形質導入する。改変Ｔ細胞は、細胞培養で拡大し、精製し、懸濁液で製剤化し、低温保存させる。ＣＴＸ１１０は、施設で保管し、投与直前に解凍することができる。
ＣＴＸ１１０同種他家ＣＡＲ－Ｔ療法では、簡素化された試験デザイン：スクリーニング時間枠が短い、アフェレーシスなし、ブリッジング化学療法なし、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物の施設での入手可能性が可能になる。患者の登録からリンパ球枯渇の開始までの時間の中央値は、２日になり得る。
この試験では、適格ヒト患者が、リンパ球枯渇（ＬＤ）化学療法の後にＣＴＸ１１０の静脈内（ＩＶ）注入を受けた。本明細書に開示される基準を満たす患者は、ＣＴＸ１１０の追加の投与（例えば、合計３回投与まで）を受けてもよい。この試験の現在の結果は、ＣＴＸ１１０がＣＤ１９＋がん細胞に対して用量依存的抗腫瘍活性を達成したことを示している。この結果はまた、標準的ＬＤレジメンを使用した場合、ＣＴＸ１１０細胞がｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも６ヶ月間拡大し、持続する、持続的応答が見られたことを示した（他の細胞ベースの治療法に関連して使用されるより毒性の高いＬＤレジメンとは対照的であった）。
１． 概要
１．１ 試験対象集団
用量漸増及びコホート拡大には、Ｂ細胞悪性腫瘍の成人対象を含む。対象は、疾患の組織学に基づいて、独立した用量漸増群に割り当てる。登録された成人対象には、例えば、非特異型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（ＮＯＳ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、グレード３ｂ ＦＬ、またはＣＬＬのリヒター形質転換など、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の選択されたサブタイプを有する対象が含まれる。さらに、登録された対象には、再発または難治性のＢ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の成人が含まれる。
１．２ 試験の目的及び根拠
第１相用量漸増試験の目的は、再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象における抗ＣＤ１９同種他家ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作Ｔ細胞（ＣＴＸ１１０細胞）の安全性及び有効性を評価することである。
再発／難治性のＢ細胞悪性腫瘍患者の転帰は、歴史的に見て不良である。しかし、この状況での自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法の使用は、これまでの治療選択肢が緩和的であった場合に、完全かつ持続的な応答が生じた（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９，１３６１－１３６５；Ｍａｕｓ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２２，１８７５－１８８４；Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２５３１－２５４４；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３８０，４５－５６；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２５４５－２５５４）。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法には、患者特異的細胞を収集すること及び製造することが必要である。残念なことに、一部の患者は、白血球除去を受ける候補でないか、または治療を待機している間に疾患の進行または死亡を経験する。ＣＴＸ１１０などの既製の同種他家ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、即時利用可能である、製造のばらつきを減少させる、個々の対象の製造上の不具合を防ぐことが可能となるという利点を提供し得る。
さらに、複数ラウンドの化学療法により治療された患者は、疲弊または老化した表現型を有するＴ細胞を有し得る。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法で治療された慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者において応答率が低いのは、Ｔ細胞の表現型の疲弊が一部原因である（Ｆｒａｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，５６３－５７１；Ｒｉｃｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，１６１２－１６２１）。健康なドナーからの化学療法未経験のＴ細胞から開始することにより、同種他家アプローチは、自家産物と比較して、ＣＡＲ Ｔ療法の一貫性及び有効性を向上させ得る。
同種他家ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に対する主な障壁は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクである。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、信頼性の高いマルチプレックス細胞編集が可能になる。ＣＴＸ１１０の製造プロセスでは、相同組換えによるＣＡＲ構築物の導入及びＴＲＡＣ遺伝子座の破壊が組み合わされている。ＡＡＶ送達ＤＮＡドナー鋳型及びＨＤＲを使用したＴＲＡＣゲノム遺伝子座でのＣＡＲの送達及び正確な挿入は、レンチウイルス及びレトロウイルスの形質導入法を使用した遺伝物質のランダムな挿入とは対照的である。ＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲ遺伝子を挿入することにより、ＣＡＲを発現するほぼすべての細胞中でＴＣＲが除去され、ＧｖＨＤのリスクが最小限に抑えられる。さらに、健康なドナー細胞から製造することにより、意図せずに悪性Ｂ細胞に形質導入するリスクがなくなる（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，１４９９－１５０３）。再発／難治性Ｂ細胞悪性腫瘍の対象におけるこの最初のヒト試験は、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変同種他家ＣＡＲ Ｔ細胞アプローチによるＣＴＸ１１０の安全性及び有効性を評価することを目的としている。
ＣＴＸ１１０は、ＣＤ１９指向性遺伝子改変同種他家Ｔ細胞免疫療法であり、健康なドナーの細胞から製造される。したがって、結果として製造された細胞は、信頼できる品質の一貫した最終産物を各対象に提供することを意図している。さらに、ＣＴＸ１１０の製造では、ＡＡＶ及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、ＴＲＡＣ部位にＣＡＲを正確に送達し、挿入することにより、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターのランダムな挿入に関連するリスクが提示されない。
２． 試験目的
主目的、パートＡ（用量漸増）：再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象において、様々なリンパ球枯渇剤との組み合わせにおいて、ＣＴＸ１１０の用量の漸増の安全性を判定し、パートＢの推奨用量を決定する。
主目的、パートＢ（コホート拡大）：再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象において、ＣＴＸ１１０の有効性を、客観的奏効率（ＯＲＲ）によって測定して判定する。
副次的目的（用量漸増及びコホート拡大）：ＣＴＸ１１０の有効性、安全性、及び薬物動態の特徴をさらに明らかにすること。
ＣＴＸ１１０に関連する患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時変化を評価すること。
探索的目的（用量漸増及びコホート拡大）：ＣＴＸ１１０に関連するゲノム、代謝、及び／またはプロテオミクスのバイオマーカーを特定すること。これらは、臨床応答、耐性、安全性、または薬力学的活性を示し得るまたは予測し得る。
３． 試験適格性
３．１ 選択基準
本試験への参加に適格であると見なされるには、対象は、特に指定されていない限り、すべてのコホートに適用される以下に記載のすべての選択基準を満たす必要がある。
１．年齢１８歳以上
２．プロトコルによって必要とされる試験手順を理解し、遵守し、書面によるインフォームドコンセント文書に自発的に署名できる
３．以下のＢ細胞悪性腫瘍のうちの１つと診断されている：
組織学的に確認されたＢ細胞ＮＨＬ：ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換ＦＬ、またはグレード３ｂ ＦＬ
・現地の病理学検査室による腫瘍組織学の確認（最後の再発／進行からの保存組織［登録から３ヶ月以内］またはスクリーニング中の生検）
・Ｌｕｇａｎｏ基準で定義された、フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）陽性である測定可能な病変が少なくとも１つある（Ｌｕｇａｎｏ基準５点スケールでのＤｅａｕｖｉｌｌｅスコア４または５。表１４）。
注記：前回照射を受けた病変は、放射線療法の完了後に進行が記録されている場合にのみ測定可能と見なされる。
４．以下のコホート固有基準によって明らかである難治性または再発性疾患：
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体及びアントラサイクリンを含むレジメンなど、これまでの２つ以上の治療ラインの治療法で、これまでの自家ＨＳＣＴが奏効しなかったか、またはこれまでの自家ＨＳＣＴに不適格であったかもしくは拒否された。自家ＨＳＣＴを受けた対象は、ＨＳＣＴ関連毒性から回復している必要がある。
・難治性疾患では、対象は、最後の治療においてＰＤを有するか、少なくとも２サイクルの治療後に安定疾患を有している必要があり（ＭａｃＭｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＳＤの期間は最大６ヶ月である。
・形質転換ＦＬを有する対象では、対象は、ＤＬＢＣＬへの形質転換後に疾患に対して少なくとも１つの治療ラインの化学療法を受けている必要がある。
５．Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス０または１を有する（表２８）
６．ＬＤ化学療法及びＣＡＲ Ｔ細胞注入を受ける基準を満たしている
７．適切な臓器機能：
・腎臓：推定糸球体濾過率＞５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
・肝臓：アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）またはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）＜３×正常上限（ＵＬＮ）、総ビリルビン＜１．５×ＵＬＮ（ギルバート症候群対象の場合、総ビリルビン＜２ｍｇ／ｄＬ）
・心臓：血行力学的に安定、超音波心臓検査図による左心室駆出率≧４５％
・肺：室内空気での酸素飽和レベル＞９１％／パルスオキシメトリー
８．出産の可能性のある女性対象（初経後、無傷の子宮及び少なくとも１つの卵巣を有し、閉経後１年未満）は、登録からＣＴＸ１１０注入後少なくとも１２ヶ月まで、許容される避妊方法（複数可）を使用することに同意する必要がある。
９．男性対象は、登録からＣＴＸ１１０注入後少なくとも１２ヶ月まで、効果的な許容される避妊方法（複数可）を使用することに同意する必要がある。
１０．ＮＨＬコホートの拡大（パートＢ）には、最大２０名のバルキー病変の現れを伴う難治性ＮＨＬ疾患の対象（高リスク対象）を含む。バルキー病変の現れを伴う難治性ＮＨＬ疾患とは、次のように定義する：
・現地検査室及び／または中央検査室の分析によって判定したとき、最大直径≧７．５ｃｍ及び／または二方向積和（ＳＰＤ）≧５０００ｍｍ２（ＬＤ化学療法前）の単一病変
及び／または
・あらゆる化学療法レジメンに対する応答（ＰＲまたはそれ以上）歴がない、及び／または登録から６ヶ月以内の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の診断
Ｌｕｇａｎｏ分類は、リンパ腫患者の画像を判定するための標準化方法である。これは、診断用ＣＴでの腫瘍量の放射線学的判定、及びＦＤＧ－ａｖｉｄ組織型に対するＦ１８ＦＤＧ－ＰＥＴでの代謝判定を含む（表１３及び１４を参照）。
３．２ 除外基準
本試験への参加が適格となるには、対象は、特に指定されていない限り、すべてのコホートに適用される以下に示す除外基準のいずれも満たしてはならない。
１．自家ＨＳＣＴに適格であり、それに同意している
２．以下に示す以下の治療法による治療を受けている：
・これまでにいずれかの遺伝子療法またはＣＡＲ Ｔ細胞などの遺伝子改変細胞療法による治療
・直近のＣＤ１９指向性治療後の進行または再発後に（免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより）ＣＤ１９の発現が確認されていない限り、ＣＤ１９指向抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または抗体－薬物複合体によるこれまでの治療
３．これまでに同種他家ＨＳＣＴを受けている。
４．バーキットリンパ腫／白血病と診断されている
５．シクロホスファミド、フルダラビン、またはＣＴＸ１１０製品の賦形剤のいずれかに対する既知の禁忌を有する
６．脳脊髄液（ＣＳＦ）からの検出可能な悪性腫瘍細胞または脳転移を示すスクリーニング中の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、または悪性腫瘍による中枢神経系（ＣＮＳ）浸潤歴（ＣＳＦまたは画像法）を有する。
７．発作障害、大脳血管虚血／出血、認知症、小脳疾患、またはＣＮＳ浸潤を伴う任意の自己免疫疾患の病歴を有する
８．登録から６ヶ月以内に不安定狭心症、臨床的に顕著な不整脈、または心筋梗塞、または登録時のグレード３以上の心膜液を有する
９．医療監視者とのコンサルテーションにおいて、制御されていない活動的な細菌、ウイルス、または真菌感染症が存在する
１０．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型もしくは２型、または活動性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の存在について陽性である。検出不可能なウイルス負荷が（定量的ＰＣＲまたは核酸検査により）記録されているＨＢＶまたはＨＢＣ感染の既往歴のある対象は許可されている。対象の適格性のために、登録から４５日以内に行われた感染症検査（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＣＶ抗体及びＰＣＲ、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶ表面抗体、ＨＢＶコア抗体）を考慮する場合がある
１１．基底細胞または扁平上皮皮膚癌を除く、以前のまたは同時の悪性腫瘍、適切に切除された子宮頸部の上皮内がん、または完全に切除され、登録の５年以上の間に寛解したが、以前に悪性腫瘍を有していた。
１２．登録する１４日以内に放射線療法を受けた
１３．登録する１４日以内または５半減期以内（いずれか長い方）に全身抗腫瘍療法または治験薬を使用した。例外：１）登録から３半減期以内に禁止されている事前の阻害性／刺激性免疫チェックポイント分子療法、２）登録前３０日以内のリツキシマブの使用は禁止されている（ただし、最後のリツキシマブ投与から少なくとも２週間後にＰＥＴ／ＣＴを行う必要がある）。例外：１）免疫療法剤（すなわち、リツキシマブ、イノツズマブ）は、登録１４日以内に中止する必要がある、２）長時間作用型化学療法剤（例えば、ｐｅｇ化アスペリゲナーゼ（ａｓｐｅｒｉｇｅｎａｓｅ）、メトトレキサート＞２５ｍｇ／ｍ２）は、登録後１４日以内に中止する必要がある、３）登録前に５半減期経過後、治験薬を中止する必要がある。対象は、登録前のこれまでのすべての治療法の急性毒性（血液学的を除く）から有害事象の共通用語基準（ＣＴＣＡＥ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、バージョン５．０）グレード１まで回復している必要がある。ステロイドは、維持のため、または末梢血芽球の制御を可能にするために、ＬＤ化学療法を開始する２日前まで許可されている。
１４．ステロイド及び／または他の免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全障害または活動性自己免疫疾患を有する。
１５．重大な精神障害または本試験に参加する対象の能力を妨げる可能性のある他の病状と診断されている
１６．妊娠中または授乳中の女性
１７．平均余命が６週未満である
１８．コホートＢのみ、グレード４の好中球減少症、グレード４の血小板減少症、またはグレード４の貧血（ＣＴＣＡＥ）の対象は除外する
４． 試験デザイン
４．１ 治験の計画
これは、再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象において、ＣＴＸ１１０の安全性及び有効性を評価する非盲検多施設第１相試験である。本試験は、用量漸増（パートＡ）、その後にコホート拡大（パートＢ）の２つの部分に分かれている。
用量漸増（パートＡ）は、各コホートに対して個別に実施し、以下に概説する基準に従って実施する。パートＡでは、次のＮＨＬサブタイプのうちの１つを有する成人対象のコホートＡにおいて用量漸増が進行中である：ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、グレード３ｂ ＦＬ、または形質転換ＦＬ（表１５）。コホートＡと同様のＮＨＬ集団を有する１つの追加のコホートが含まれており、本試験の用量漸増部分（コホートＢ））における異なる治療及びリンパ球枯渇レジメンを調査した（表１５）。
コホートＢの対象は、ＣＴＸ１１０注入後のＣＡＲ Ｔ細胞拡大に対するリンパ球のより長い抑制の効果を調査するために、コホートＡ（５００ｍｇ／ｍ２）と比較して、用量を増加してシクロホスファミド（７５０ｍｇ／ｍ２）により治療される。
まとめると、ＮＨＬの対象を登録するすべてのコホートについて、ＬＤ化学療法を伴うＣＴＸ１１０の追加用量を、２８日目のスキャンでＳＤ以上を達成した対象へのＣＴＸ１１０の初回注入後２８日目に投与してもよい（表１５）。すべてのコホートについて、本明細書に記載のとおり、対象が有意な血球減少を生じている場合、２８日目のＣＴＸ１１０の投与は、ＬＤ化学療法を行わずに施され得る。ブリナツモマブなどのＣＤ１９指向性治療法を以前に受けたことのある対象は、限定され得る。
用量漸増のためのコホート（パートＡ）を以下の表１５に要約する：
１．一次集団（Ｎ１）：以下の基準の両方を満たす対象を含む：
・現地検査室及び／または中央検査室分析によって判定したとき、標的病変（ＬＤ化学療法前）の二方向積和（ＳＰＤ）＜５０ｃｍ２
・登録の７ヶ月より前に、ＮＨＬの対象に対して一次治療ラインの抗がん療法を開始している
２．バルキー難治性集団（Ｎ２）：次の基準のいずれかを満たす対象を含む：
・現地検査室及び／または中央検査室分析によって判定したとき、標的病変（ＬＤ化学療法前）のＳＰＤ≧５０ｃｍ２
・登録前の７ヶ月以内にＮＨＬの対象に対して一次治療ラインの抗がん療法を開始している。
４．１．１ 試験デザイン
パートＡ及びパートＢの両方において、試験は、スクリーニング、治療、フォローアップの３つの主要段階からなる。本試験の用量漸増部分には、対象の２つのコホート：コホートＡ及びＢを含む。コホートＡ及びＢは、ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換ＦＬ、ならびにグレード３ｂＦＬなどのＮＨＬを有する対象を含む。
本試験の３つの主要段階は、次のとおりである：
ステージ１－治療の適格性を判断するためのスクリーニング（１～２週間）
ステージ２－治療（ステージ２Ａ＋ステージ２Ｂ）。各コホートの治療については、上記の表１５を参照のこと（１～２週間）
ステージ３－すべてのコホートのフォローアップ（ＣＴＸ１１０の最終注入後５年）。注記：ＬＤ化学療法の開始（すべてのコホート）とＣＴＸ１１０の注入（すべてのコホート）の両方の前に、基準に従って対象の臨床的適格性を再確認することとする。
再投与に関する追加基準については、以下を参照のこと。
用量漸増及びコホート拡大の両方について、対象は、各ＣＴＸ１１０注入後２８日間、調査施設の近く（すなわち、移動時間１時間）に滞在する必要がある。この急性毒性監視期間中、対象は、ＣＲＳ、神経毒性、及びＧｖＨＤなどのＡＥについて定期的に判定する。毒性管理ガイドラインを以下に示す。用量漸増中、すべての対象は、各ＣＴＸ１１０注入後の最初の７日間、または現地の規制もしくは施設の慣習により必要な場合にはそれ以上長く入院する。
急性毒性監視期間後、続いて対象は、ＣＴＸ１１０の最終注入後最長５年間、身体診査、定期的な検査及び画像判定、及びＡＥ評価によるフォローアップを受ける。
４．２ ＣＴＸ１１０の用量漸増
パートＡでは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数に基づいて、以下の用量のＣＴＸ１１０を本試験で評価することができる（表１６）。
用量漸増は、標準３＋３デザインを使用して行う。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の総数に基づいて、上記の表１６に示すＣＴＸ１１０の用量は、コホートＡのＤＬ１から開始して、本試験で評価され得る。コホートＡについては、ＤＬ３のデータを評価して、ＤＬ４で用量漸増を継続するかを判断する。
その後のコホートＢへの登録は、コホートＡでの判定及び安全性の確認後にのみ、より高い用量レベルで用量漸増を開始することができる。すべての用量レベルについて、７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの用量制限があり、これにより、投与の最小重量が決定される。
ＤＬＴ評価期間は、ＣＴＸ１１０の初回注入から開始し、２８日間継続する。
４．２．１ 用量制限毒性（ＤＬＴ）の定義
毒性は、ＣＲＳ及び神経毒性（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、及びＧｖＨＤ（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）について以下に示す場合を除き、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＣＴＣＡＥ バージョン５に従ってグレードに分け、記録される。
ＤＬＴは、ＤＬＴ評価期間中に発生し、（発症時間に対して）指定された期間を超えて持続する次の事象のうちのいずれかとして定義される：
・ステロイド抵抗性であるグレード２以上のＧｖＨＤ（例えば、ステロイド治療［例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日］３日後のＰＤ、７日後のＳＤ、または治療１４日後のＰＲ）
・ＤＬＴ期間中の死亡（疾患進行によるものを除く）
・ＣＴＸ１１０に関連する可能性のある、またはＣＴＸ１１０に関連する、あらゆる期間のグレード４の神経毒性
・あらゆるＣＴＸ１１０関連のグレード３または４の毒性であり、臨床的に顕著であり、７２時間以内に改善しない
・以下は、ＤＬＴとは見なされない：
－７２時間以内にグレード２以下まで改善しているグレード３または４のＣＲＳ
－１４日以内にグレード２以下まで改善しているグレード３の神経毒性（例えば、脳症、錯乱）
－グレード３または４の発熱
－血小板減少症（血小板数＜５０×１０９／Ｌ）の状況での出血、好中球減少症（好中球絶対数［ＡＮＣ］＜１０００／ｍｍ３）の状況での細菌感染または発熱の記録
－低ガンマグロブリン血症
－７日以内にグレード２以下に解消するグレード３または４の肺毒性。支持療法による体液過負荷のために挿管された対象の場合には、これは１４日に延長させ得る。
－１４日以内にグレード２以下まで改善しているグレード３または４の肝機能試験
－２１日以内にグレード２以下まで改善しているグレード３または４の腎不全
－グレード３または４の血小板減少症または好中球減少症は、後ろ向きに判定する。少なくとも６名の対象が注入後、対象の５０％以上が長期にわたる（すなわち、注入後２８日以上継続する）血球減少を生じる場合、用量漸増を中断してもよい。
対象は、ＣＴＸ１１０を受けて、ＤＬＴの評価を受ける必要がある。プロトコルの定義により、改善または解消のための時間が許容される可能性のあるＤＬＴを対象が有する場合、ＤＬＴ評価期間は、ＤＬＴが宣言される前にそれに応じて延長される。ＣＴＸ１１０に関連すると判定されたＤＬＴ評価期間外に発生したＡＥは、用量漸増の決定を行う際に考慮される。ＣＴＸ１１０との妥当な因果関係を有しないＡＥは、ＤＬＴとは見なされない。
４．３ ＣＴＸ１１０の再投与（パートＡ＋パートＢ）
ＣＴＸ１１０を投与された対象は、末梢血中で多対数のＣＡＲ Ｔ細胞の拡大なく客観的奏効を達成した。これは、自家ＣＡＲ Ｔ細胞とは異なる生物学及び細胞挙動を示唆するものである。同種他家ＣＡＲ Ｔ細胞は、リンパ球の回復時に自家ＣＡＲ Ｔ細胞よりも迅速にクリアランスされる可能性があるため、残りのあらゆるがん性細胞を浄化するために複数回投与を行う必要があり得る。より大きな応答及び長期持続性を達成するために、初回注入後に顕著な毒性を経験していない対象に再投与が提案される。
再投与は、５つの異なる用量レベル（ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ３．５、及びＤＬ４）で治療された１６名の対象を含む、これまでにＣＴＸ１１０により実証されている安全性プロファイルに基づいて提案される。ＣＴＸ１１０は、ＮＨＬにおける自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞療法において観察されたものと同じであるかまたはそれ以下の重症度及び頻度で、毒性を引き起こしている。注入反応またはＧｖＨＤはない。
４．３．１ ＣＴＸ１１０の予定用量
本試験では、ＣＴＸ１１０を３回まで投与できる。
再投与は、次の２つのシナリオで行い得る：
１．ＬＤ化学療法有りまたは無しで、時期または疾患応答基準に基づいて予定されている再投与。以下の表１７。
２．対象がＣＴＸ１１０の初回注入後に初期応答を有していた場合、ＰＤ後にＬＤ化学療法と共にＣＴＸ１１０を再投与する（すべてのコホート）。以下の表１７。
ＣＴＸ１１０の再投与には、対象は再投与基準を満たし、ここで指定されたスクリーニング判定のいくつかを繰り返し受ける必要がある。
４．３．２． コホートＡ及びＢでの予定された再投与
コホートＡ及びＢにおいて予定されている２回目の投与では、対象は、次の基準を満たす必要がある：
・これまで、用量漸増中にＤＬＴがない（該当する場合）
・これまでのＣＲＳグレードが３以上でなく、ＣＴＸ１１０注入後７２時間以内にグレード２以下まで解消していない
・ＣＴＸ１１０の初回注入後に、これまでのＧｖＨＤがない
・ＣＴＸ１１０注入後、解消しなかったこれまでのグレード２以上のＩＣＡＮＳがない
コホートＡの対象について、ＬＤ化学療法時及び２回目のＣＴＸ１１０注入前の追加の再投与基準は、以下のとおりである：
・ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０または１である
・飽和レベル＞９１％を維持するための酸素補給が不要である
・制御されていない心不整脈が新たに発生していない
・昇圧剤によるサポートまたは輸液ボーラスを必要とする低血圧がない
・制御されていない活動性感染症（治療に応答しない細菌、真菌、またはウイルスの血液培養陽性）がない
・腎臓：推定糸球体濾過率＞５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
・肝臓：ＡＳＴまたはＡＬＴ＜３×ＵＬＮ、総ビリルビン＜１．５×ＵＬＮ（ギルバート症候群の対象の場合、総ビリルビン＜２ｍｇ／ｄＬ）
・前回のＣＴＸ１１０注入と比較して、対象の毒性のリスクを上昇させる臨床状態の悪化がない。
・ＣＮＳ疾患の病変を示唆する新たな神経学的症状がない。ＬＰまたは脳ＭＲＩで正常な所見が得られ、神経学的症状が解消された場合は、再投与が考慮され得る。
・妊娠中または授乳中の女性は再投与に適性でない。
再投与を受ける対象を、次の点を考慮して初回投与と一致するように、判定スケジュール（以下の表２６～２７）に従い、観察することとする：
・超音波心臓検査図（新しい心臓の徴候または症状がない限り）、脳ＭＲＩ及び腰椎穿刺（進行に関連する新しい神経学的症状がない限り）は必要ない。
・ＣＤ１９の発現を実証するために、可能な限り組織生検を行う必要がある。しかし、２回目の予定用量の前に実施することが不可能である場合、ＣＴＸ１１０の２回目の予定用量に対する応答が観察されない場合、腫瘍の生検を実施することとする。
・ＰＥＴ／ＣＴは、２回目の予定投与から４週間以内に実施する必要がある。
最初の骨髄浸潤を有する対象では、２回目の予定投与から４週間以内に骨髄生検及び穿刺を繰り返し行う必要がある。
２８日目にＳＤ以上を達成したコホートＡ及びＢの対象は、ＣＴＸ１１０の初回注入の４～８週間後に２回目の予定されたＣＴＸ１１０注入（２８日目に投与）を受けてもよい。血球減少症（ＡＮＣ＜１０００／ｍｍ３及び／または血小板＜２５，０００×１０９／Ｌ）の対象では、ＬＤ化学療法を行わずに再投与することを選択してもよい。ＬＤ化学療法を再投与された対象は、長期血球減少症について継続的に評価を受ける。
コホート拡大においてＬＤ化学療法を行わずに２回目の予定投与を受けた対象において、８名の対象が投与を受け、全員が進行性疾患を有するか、または最終投与の２８日後の画像に基づいて応答の改善が観察されない場合、ＬＤ化学療法を行わずに再投与する選択肢はなくなり得、その後の対象が、ＬＤ化学療法なくＣＴＸ１１０の追加投与を受けることはない。
４．３．３． すべてのコホートでの進行性疾患後の再投与
すべてのコホートについて、対象が初回注入後にこれまでに臨床応答を有していた場合、ＰＤ後に対象にＣＴＸ１１０を再投与してもよい。再投与を検討するには、最初または最後のＣＴＸ１１０注入から１２ヶ月以内に、同時にまたはその後に進行するか、再発したＮＨＬ対象では、対象は、ＣＴＸ１１０注入後のＰＥＴ／ＣＴスキャンで、腫瘍サイズ及び／またはＦＤＧ結合活性の減少によって明示されるような臨床的利益のエビデンスを達成している必要がある。
再投与は、疾患の程度がＣＴＸ１１０の初回注入よりも小さい場合にのみ行い、医療監視者とのコンサルテーション後に進める。ＰＤ後に対象が再投与を受けることができる最も早い時期は、ＮＨＬコホートでは、ＣＴＸ１１０の初回注入から２ヶ月以上後である。ＣＴＸ１１０の最終注入後２ヶ月を超えており、グレード３または４の好中球減少症または血小板減少症を有する対象への再投与は、血球減少症が明確に、進行性疾患または他の可逆的原因によるものとすることができない限り、許可されない。
ＣＴＸ１１０を再投与するには、対象は、次の基準を満たしている必要がある：
・腫瘍（ＮＨＬ）が、再発時にＣＤ１９＋のままである（フローサイトメトリーまたは免疫組織化学による）ことの確認。
・これまで、用量漸増中にＤＬＴがない（該当する場合）
・これまでのＣＲＳグレードが３以上でなく、ＣＴＸ１１０注入後７２時間以内にグレード２以下まで解消していない
・ＣＴＸ１１０の注入後に、これまでのＧｖＨＤがない
・ＣＴＸ１１０注入後にこれまでのグレード２以上のＩＣＡＮＳがない
・上記のとおり、初回の本試験の選択基準（１番、２番、５番～１０番）及び除外基準（２番［ＣＴＸ１１０によるこれまでの治療を除く］～１５番）を満たしている
・本明細書に記載のＬＤ化学療法及びＣＴＸ１１０注入の基準を満たしている。
・ＰＤ後に再投与された対象を、初回投与と一致して、表２６（判定スケジュール［Ｍ２４へのスクリーニング］）に従い観察することとする。
次の追加の考慮事項を含め、すべてのステージ１スクリーニング判定を繰り返す必要がある：
・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ［ＩＰＩ］基準（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ，２０１６）に基づいて、ＣＮＳ再発のリスクが高い場合、または再投与時にＣＮＳ浸潤の徴候がある場合には、脳ＭＲＩ及び腰椎穿刺を繰り返し行う。
・超音波心臓検査図：ＣＴＸ１１０の投与後３ヶ月以内に再投与が行われ、新たな心臓症状が発生していない場合には省略してもよい。
・ＮＨＬコホートの場合：疾患の再発または進行を示すＰＥＴ／ＣＴスキャンは、腫瘍応答評価の新しいベースラインとして機能し得る。再投与は、そのスキャンから２８日以内に行う必要がある。骨髄穿刺及び生検は、再発／進行時に行わなかった場合には、繰り返し行う必要がある。
ＰＤ後に再投与を受ける対象は、以前に受けたものと同一のリンパ球枯渇レジメン及びＣＴＸ１１０投与を受けてもよい。コホートＡと同様のリンパ球枯渇を受ける可能性があるコホートＢの対象には例外が設けられる。
疾患の進行前に再投与を受ける対象では、スクリーニング中に実施されるベースラインＰＥＴ／ＣＴ及び骨髄生検を使用して、疾患応答の判定を継続して行う。ＰＤ後に再投与された対象については、疾患応答は、再投与前の最新のＰＥＴ／ＣＴスキャン及び骨髄と比較して判定する。
５． 試験治療
５．１ リンパ球枯渇化学療法
すべてのコホートのすべての対象は、本明細書内で指定されているように、ＣＴＸ１１０の初回投与の注入前及び再投与前にＬＤ化学療法を受ける。
コホートＡでは、ＬＤ化学療法は、以下からなり得る：
・フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２を１日３回ＩＶ投与、
・シクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２を１日３回ＩＶ投与。
コホートＢでは、ＬＤ化学療法は、以下からなり得る：
・フルダラビン３０ｍｇ／ｍ２を１日３回ＩＶ投与、
・シクロホスファミド７５０ｍｇ／ｍ２を１日３回ＩＶ投与。
両方の剤を同日に開始し、３日間連続して投与する。対象は、試験登録から７日以内にＬＤ化学療法を開始することとする。中等度の腎機能障害（クレアチニンクリアランス３０～７０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を有する成人対象は、該当する処方情報に従って減量させたフルダラビンを受けるものとする。
ＬＤ化学療法に関連する保管、調製、投与、支持療法の指示、及び毒性管理に関するガイダンスについては、フルダラビン及びシクロホスファミドに関する現在の完全な処方情報を参照のこと。
すべてのコホートの対象について、次の徴候または症状のいずれかが存在する場合、ＬＤ化学療法を遅らせてもよい。
・ＬＤ化学療法に関連するＡＥの潜在的リスクを高める臨床状態の顕著な悪化
・飽和レベル＞９１％を維持するための酸素補給を必要とする
・制御されていない心不整脈が新たに発生している
・昇圧剤のサポートを必要とする低血圧
・活動性感染：治療に応答しない細菌、真菌、またはウイルスの血液培養が陽性である
・グレード２以上の急性神経毒性
再投与前のコホートＡのＬＤ化学療法で満たされるべき追加の基準は、本明細書に明記している。毒性（複数可）が基礎疾患によって引き起こされ、抗がん療法を必要とする対象の場合、ＬＤ化学療法を再開する前に、疾患選択基準、治療の休薬、及び最終臓器機能基準を、その後満たす必要がある。さらに、登録後に抗がん療法を受けた対象（コホートＡ及びＢのＬＤ化学療法以外）はいずれも、ＬＤ化学療法を開始する前に疾患評価（ＰＥＴ／ＣＴスキャンを含む）を実施する必要がある。
５．２． ＣＴＸ１１０の投与
ＣＴＸ１１０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で改変された同種他家Ｔ細胞からなり、低温保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－５）に再懸濁させ、６ｍＬ注入バイアルに入れる。ＣＴＸ１１０の均一用量（ＣＡＲ＋Ｔ細胞に基づく）を１回のＩＶ注入として投与する。すべての用量レベルにおいて、用量制限７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇとする。総用量は、１つのバイアルに含まれても、複数のバイアルに含まれてもよい。注入は、好ましくは中心静脈カテーテルを通して行われるものとする。白血球フィルターは使用しないこと。
ＣＴＸ１１０の注入を開始する前に、施設の調剤部は、治療を受ける特定の各対象に対して、２回分のトシリズマブ及び緊急用器具が利用可能であることを確認する必要がある。対象は、ＣＴＸ１１０注入の約３０～６０分前に、標準施設の慣行に従って、アセトアミノフェンＰＯ（すなわち、施設の処方集に従って、パラセタモールまたはその同等物）及びジフェンヒドラミン塩酸塩ＩＶまたはＰＯ（または施設の処方集に従って、別のＨ１抗ヒスタミン）の事前投薬を受けることとする。予防的全身性コルチコステロイドは、ＣＴＸ１１０の活性を干渉し得るため、投与しないものとする。
ＣＴＸ１１０注入前に中止しなければならない医薬品のリストは、以下を参照のこと。
すべてのコホートについて、次の徴候または症状のいずれかが存在する場合、各ＣＴＸ１１０注入を遅らせてもよい：
・制御されていない新しい活動性感染
・ＬＤ化学療法の開始前と比較して臨床状態が悪化し、対象の毒性リスクが高くなる
・グレード２以上の急性神経毒性
コホートＡの各ＣＴＸ１１０注入は、ＬＤ化学療法の完了の少なくとも４８時間後（ただし７日以内）に投与される。ＣＴＸ１１０の注入が１０日超遅れる場合は、ＬＤ化学療法を繰り返す必要がある。再投与については、本明細書の開示を参照のこと。
５．２．１ ＣＴＸ１１０注入後の監視
ＣＴＸ１１０の注入後、注入後２時間、または潜在的なあらゆる臨床症状が解消されるまで、対象のバイタルを３０分ごとに監視することとする。パートＡの対象は、ＣＴＸ１１０注入後最低７日間、または現地の規制または施設の慣行により必要な場合はそれ以上入院する場合がある。パートＡ及びＢでは、対象は、ＣＴＸ１１０注入後少なくとも２８日間、調査施設の近く（すなわち、移動時間１時間）に滞在する必要がある。
対象は、判定スケジュールに従って、ＣＲＳ、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、神経毒性、ＧｖＨＤ、及び他のＡＥの徴候について監視を受ける（表２６及び表２７）。ＣＡＲ Ｔ細胞関連毒性の管理に関するガイドラインは、本明細書に記載されている。ＣＴＸ１１０関連の非血液毒性（例えば、発熱、低血圧、低酸素症、進行中の神経毒性）がグレード１に戻るまで、対象は入院を継続することとする。必要性を考慮して、対象は、より長期間入院を継続してもよい。
５．２．１．２ ＣＴＸ１１０のその後の注入スケジュール
本試験では、コホートＡ及びＢにおいて、最大３回のＣＴＸ１１０の注入が可能である。１日目の後の追加のＣＴＸ１１０注入は、次の２つのシナリオで生じ得る：
１．最初の治療過程では、次の時期または疾患応答基準に基づいて、追加の注入を行う：２８日目のスキャンで（Ｌｕｇａｎｏ基準に基づいて）ＳＤ以上を達成した対象に、３５日目（－７日目／＋２１日目）にＣＴＸ１１０の２回目の注入をＬＤ化学療法と共に施す。注記：コホートＢのＬＤ化学療法では、シクロホスファミドの用量は、ＣＴＸ１１０初回注入前に７５０ｍｇ／ｍ２であり、その後のＣＴＸ１１０注入前に５００ｍｇ／ｍ２である。
２．すべてのコホートについて、ＣＴＸ１１０の初回注入後に対象が臨床的利益を示した場合、ＰＤ後にＬＤ化学療法及び単一のＣＴＸ１１０注入からなる第２の治療過程を施すことができる。ＰＤ後の追加注入は、ＣＴＸ１１０の初回注入から１８ヶ月以内で、前回のＣＴＸ１１０注入から４週間以上である必要がある。
１日目以降に追加のＣＴＸ１１０注入を受けるためには、対象は、基準を満たし、この実施例において指定しているスクリーニング判定のうちのいくつかを繰り返し行う必要がある。
５．２．１．３ 初回治療過程中の８日目及び３５日目のＣＴＸ１１０注入の基準
コホートＡ及びＢ（３５日目）におけるＣＴＸ１１０の２回目の注入については、対象は次の基準を満たす必要がある：
・これまで、用量漸増中にＤＬＴがない（該当する場合）
・これまでのＣＲＳグレードが３以上でなく、ＣＴＣ１１０注入後７２時間以内にグレード２以下まで解消していない
・ＣＴＸ１１０の初回注入後に、これまでのＧｖＨＤがない
・ＣＴＸ１１０注入後、解消しなかったこれまでのグレード２以上のＩＣＡＮＳがない
さらに、ＬＤ化学療法時及び追加注入（コホートＡ及びＢの対象に対する２回目のＣＴＸ１１０注入［３５日目］）前に、対象は、以下の基準を満たす必要がある：
・ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０または１である
・飽和レベル＞９１％を維持するための酸素補給が不要である
・制御されていない心不整脈が新たに発生していない
・昇圧剤によるサポートまたは輸液ボーラスを必要とする低血圧がない
・制御されていない活動性感染症（治療に応答しない細菌、真菌、またはウイルスの血液培養陽性）がない
・腎臓：推定糸球体濾過率＞５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
・肝臓：ＡＳＴまたはＡＬＴ＜３×ＵＬＮ、総ビリルビン＜１．５×ＵＬＮ（ギルバート症候群の対象の場合、総ビリルビン＜２ｍｇ／ｄＬ）
・治験責任医師の意見では、前回のＣＴＸ１１０注入と比較して、対象の毒性のリスクを上昇させる臨床状態の悪化がない。
・ＣＮＳ疾患の病変を示唆する新たな神経学的症状がない。腰椎穿刺または脳ＭＲＩで正常所見であり、その後神経学的症状が解消した場合は、追加のＣＴＸ１１０注入を考慮することができる。
・妊娠中または授乳中の女性は追加のＣＴＸ１１０注入に適性でない。
予定されているリンパ球枯渇の開始から１４日以内に実施される現地の臨床検査は、その後のＣＴＸ１１０注入の適格性を確認するために使用できる。初回治療過程では、コホートＡ及びＢの対象に対する２回目のＣＴＸ１１０注入前に、血小板数が２５，０００細胞／μＬ未満またはＡＮＣが５００／ｍｍ３未満の対象については、（血球減少症の別の病因がもたらされない限り）ＬＤ化学療法が省略されてもよい。
追加の注入を受ける対象を、以下の点を考慮して、初回注入と一致して、表２６及び表２７の判定スケジュールに従い観察することとする：
・超音波心臓検査図（新しい心臓の徴候または症状がない限り）、脳ＭＲＩ及び腰椎穿刺（進行に関連する新しい神経学的症状がない限り）は必要ない。
・ＣＤ１９発現を実証するために、可能な限り組織生検（ＮＨＬ）または骨髄サンプル（Ｂ細胞ＡＬＬ）を取得するものとする。
・しかし、これが、コホートＡ及びＢの２回目の注入前に不可能である場合、この後のＣＴＸ１１０の注入に対する応答が観察されない場合は、次の疾患判定の時点で、腫瘍または骨髄のサンプルを収集するものとする。
・追加注入後４週間以内にＰＥＴ／ＣＴを実施する必要がある。
・最初の骨髄浸潤を有するＮＨＬ及びＢ細胞ＡＬＬの対象においては、骨髄生検及び穿刺は、追加の注入の２８日以内に繰り返し行う必要がある。
５．２．１．３．１ 血球減少症及びＬＤ化学療法
最初の治療過程で、著しい血球減少（ＡＮＣ＜５００／ｍｍ３及び／または血小板＜２５，０００細胞／μＬ）を生じる対象では、治験責任医師は、２回目のＣＴＸ１１０注入前のＬＤ化学療法を省略してもよい（コホートＡ及びＢ）。
５．３ これまでの医薬品及び併用医薬品
５．３．１ 許可されている医薬品
以下に記載の禁止医薬品を除いて、感染症、成長因子、血液成分などを治療するためのＩＶ抗生物質など、最適な医療ケアのために必要な支援措置が、本試験全体において与えられる。
処方薬及び非処方薬を含むすべての同時療法は、ＣＴＸ１１０注入後３ヶ月まで記録する必要がある。ＣＴＸ１１０注入の３ヶ月後から開始して、次の選択された併用医薬品のみを収集する必要がある：ＩＶ免疫グロブリン、ワクチン接種、抗がん治療（化学療法、放射線、免疫療法など）、免疫抑制剤（ステロイドなど）、及び任意の治験薬。
５．３．２ 禁止医薬品
以下の医薬品は、以下に指定のとおり、本試験の特定の期間中は禁止される：
・ＣＴＸ１１０の投与後は、薬理学的用量（５ｍｇ／日以上のプレドニゾンまたは等価用量の他のコルチコステロイド）でのコルチコステロイド療法及び他の免疫抑制薬を避けることとする。ただし、本明細書に記載のとおり、新たな毒性を治療するために医学的に適応である、またはＣＴＸ１１０に関連するＣＲＳもしくは神経毒性の管理の一部として適応である場合を除く。
・ＣＲＳの症状を悪化させる可能性があるため、ＣＴＸ１１０注入後の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）
・顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）は、ＣＴＸ１１０注入の２１日以降に投与されてもよい。
・髄腔内ＣＮＳ予防は、ＣＴＸ１１０注入の少なくとも１週間前に中止する必要がある。
・疾患の進行前のあらゆる抗がん療法（例えば、化学療法、免疫療法、標的療法、放射線または他の治験薬）またはＬＤ化学療法（すべてのコホート）
６． 毒性管理
６．１ 一般的なガイダンス
対象は、ＣＴＸ１１０注入後少なくとも２８日間は注意深く監視する必要がある。自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法、プロアクティブ監視及び治療で重大な毒性が報告されており、すべての有害事象は、プロトコルガイダンスに従って必要とされる。
これは初のヒト試験であり、ＣＴＸ１１０の臨床安全性プロファイルは報告されていないが、ＣＤ１９指向性自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法のこれまでの経験に基づいて、以下の一般的な推奨事項が示されている。
・発熱は、ＣＲＳの最も一般的な初期症候であるが、対象は、初期の症状の現れとして、虚弱、低血圧、または錯乱も経験する可能性がある。
・ＣＲＳの診断は、検査値ではなく、臨床症状に基づいて行うものとする。
・ＣＲＳ固有の管理に応答しない対象においては、敗血症及び耐性感染症を常に考慮する。対象は、耐性または緊急の細菌感染、ならびに真菌またはウイルス感染について継続的に評価するものとする。
・ＣＲＳ、ＨＬＨ、及びＴＬＳは、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後に同時に生じ得る。対象は、すべての状態の徴候及び症状を一貫して監視し、適切に管理するものとする。血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）で観察される徴候及び症状は、ＣＲＳの症候であるため、個別にグレード分けすることはない。
・神経毒性は、ＣＲＳ時、ＣＲＳ解消中、またはＣＲＳ解消後に発生し得る。神経毒性のグレード分け及び管理は、ＣＲＳとは別に行う。
・トシリズマブは、指示が出されてから２時間以内に投与する必要がある。
６．２ 毒性に特化したガイダンス
６．２．１ 注入反応
一過性の発熱、悪寒、及び／または悪心などの注入反応が、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞試験で報告されている。アセトアミノフェン（パラセタモール）及びジフェンヒドラミン塩酸塩（または別のＨ１抗ヒスタミン）は、注入反応が発生した場合に、必要に応じて、ＣＴＸ１１０の注入後６時間ごとに、繰り返すことができる。
アセトアミノフェンにより緩和されない発熱が対象で継続している場合には、必要に応じて非ステロイド性抗炎症医薬品を処方することができる。全身ステロイド投与の介入はＣＡＲ Ｔ細胞に対して有害な影響を有し得るため、生命を脅かす緊急事態の場合を除いて、全身ステロイドを投与しないものとする。
６．２．２ 熱性反応及び感染予防
感染予防は、施設の標準ケアに従って行うこととする。
熱性反応の事象では、感染に関する評価を開始し、医学的に適応であり、治療する医師によって決定されるとおり、対象を抗生物質、輸液、及び他の支持療法により適切に管理することとする。発熱が継続する場合には、対象の医学的管理を通じてウイルス及び真菌感染を考慮するものとする。対象がＣＴＸ１１０注入後に敗血症または全身性菌血症を呈した場合、適切な培養及び医療管理を開始するものとする。さらに、ＣＴＸ１１０の注入後、注入後３０日以内に発熱が生じた場合には、いずれの場合においても、ＣＲＳを考慮するものとする。
ＬＤ化学療法と共にＣＴＸ注入を複数回受けている対象については、ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ予防が推奨される。
６．２．３ 腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象は、ＴＬＳのリスクが上昇する。対象は、ＬＤ化学療法の開始以降ＣＴＸ１１０注入の２８日後まで、検査室での判定及び症状を介して、ＴＬＳについて綿密に監視するものとする。すべての対象は、スクリーニング中及びＬＤ化学療法の開始前に、予防的アロプリノール（またはフェブキソスタットなどの非アロプリノール代替品）を受け、経口／静脈内水分補給を増加させるものとする。予防は、ＣＴＸ１１０注入から２８日後、またはＴＬＳのリスクが過ぎた時点で中止できる。
施設は、施設の標準ケアに従って、または公開されているガイドラインに従って、ＴＬＳを監視し、治療することとする（Ｃａｉｒｏ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，（２００４）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，１２７，３－１１）。ラスブリカーゼの投与など、ＴＬＳの管理は、臨床的に適応とされる場合は、迅速に開始するものとする。
６．２．４ サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）
ＣＲＳは、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞療法で報告されている主要な毒性である。ＣＲＳは、標的抗原のＣＡＲの連結に応答して免疫系が過剰に活性化され、その結果Ｔ細胞の急速な刺激及び増殖による複数のサイトカインの上昇が原因である（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，２２９６；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ，２０，１１９－１２２）。サイトカインが放出されたときに、心臓、消化管（ＧＩ）、神経、呼吸（呼吸困難、低酸素症）、皮膚、心血管（低血圧、頻脈）、及び体質（発熱、寒け、発汗、食欲不振、頭痛、不定愁訴、疲労、関節痛、悪心、及び嘔吐）症状、及び検査室（凝固、腎臓、及び肝臓）異常など、ＣＲＳに関連する様々な臨床徴候及び症状が発生し得る。
ＣＲＳ管理の目標は、ＣＴＸ１１０の抗腫瘍効果の可能性を保持しながら、生命を脅かす後遺症を防ぐことである。症状は通常、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法の１～１４日後に生じるが、同種他家ＣＡＲ Ｔ細胞に関する症状の発症時期は、完全には定義されていない。
ＣＲＳは、検査室でのサイトカイン測定ではなく、臨床症状の現れに基づいて特定し、治療するものとする。ＣＲＳが疑われる場合は、公開されているガイドライン（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，１８８－１９５）から適用した表１８～２０の推奨事項に従って、グレード分け及び管理を行うことする。最初のＬｅｅ ＣＲＳグレーディング基準の開発以来、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を使用する医師は、ＣＲＳの症状の現れ及び時間経過に関する理解をさらに深めている。最近の米国血液骨髄移植協会（ＡＳＢＭＴ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のコンセンサス基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）では、低血圧及び／または低酸素症を伴う発熱の存在に基づいてグレード分けを行うこと、及び他の末端臓器毒性は、支持療法により個別に管理することを推奨している。したがって、このプロトコルでは、神経毒性は、異なるスケールを使用してグレード分けし、管理する（タイトル「免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）」のセクションを参照のこと）。ＣＲＳの管理の文脈における末端臓器毒性は、肝臓系及び腎臓系のみを指す（Ｐｅｎｎ Ｇｒａｄｉｎｇ基準のとおり；（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１１，３５）。
ＣＲＳの全期間中、解熱剤、静脈内輸液、及び酸素からなる支持療法を対象に提供することとする。グレード２以上のＣＲＳ（例えば、低血圧、輸液に応答しない、または酸素補給を必要とする低酸素症）を経験している対象は、継続的心臓テレメトリー及びパルスオキシメトリーで監視することとする。グレード３のＣＲＳを経験している対象については、心機能を判定するために超音波心臓検査を実施することを検討する。グレード３または４のＣＲＳについては、集中治療支持療法を考慮する。低酸素症によるものではなく、神経毒性（発作など）による気道保護のための挿管は、グレード４のＣＲＳとして捉えるものではない。同様に、ＣＲＳの他の徴候（例えば、低酸素症）を伴わない神経毒性による長期挿管は、グレード４のＣＲＳとは見なさない。症状の現れ（発熱、低血圧、低酸素症）が類似しているため、重度ＣＲＳの場合は、基礎となる感染症を考慮する必要がある。ＣＲＳの解消は、発熱（体温≧３８℃）、低酸素症、及び低血圧の解消として定義される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
６．２．５ 神経毒性
グレード３以上の神経毒性の場合はいずれも腰椎穿刺を必要とし、臨床的に実施可能な場合には、グレード１及びグレード２の事象に強く推奨される。腰椎穿刺は、臨床的に実施不可能でない限り、症状の発症から４８時間以内に実施する必要がある。
ＣＴＸ１１０を受けた後に神経認知症状を経験した対象の鑑別診断では、ウイルス性脳炎（例えば、ＨＨＶ－６脳炎、以下を参照）を考慮する必要がある。腰椎穿刺が実施される場合は常に、施設で実施される標準パネル（少なくとも細胞数、グラム染色、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを含むこととする）に加えて、次のウイルスパネルを実施する必要がある：ＨＳＶ－１及び－２、エンテロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びＨＨＶ－６のＣＳＦ ＰＣＲ分析。対象を適切に管理するために、感染症パネルの結果は、腰椎穿刺から５営業日以内に入手できる必要がある。施設がパネルテストを実施できない場合は、医療管理者と話し合う必要がある。
神経毒性は、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞療法で観察されている。毒性は、ＣＲＳの発生時、ＣＲＳの解消時、またはＣＲＳの解消後に発生する可能性があり、その病態生理学は不明である。ＡＳＴＣＴコンセンサスは、ＣＲＳに関連する神経毒性をＩＣＡＮＳとしてさらに定義し、ＩＣＡＮＳは、内因性または注入されたＴ細胞及び／または他の免疫エフェクター細胞の活性化または連結をもたらす任意の免疫療法後のＣＮＳに関与する病理学的プロセスを特徴とする障害である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
徴候及び症状は、進行性である可能性があり、失語症、意識レベルの変化、認知能力の障害、運動麻痺、発作、及び脳浮腫が含まれ得る。ＩＣＡＮＳグレード（表２１）は、これまでに自家ＣＡＲ Ｔ細胞試験で使用されたＣＡＲ Ｔ細胞療法関連毒性（ＣＡＲＴＯＸ）ワーキンググループ（ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＯＸｉｃｉｔｙ（ＣＡＲＴＯＸ）ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）の基準に基づいて開発された（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＩＣＡＮＳには、意識レベル、発作の有無、運動所見、脳浮腫の有無の判定、及びＩＣＥ（免疫エフェクター細胞関連脳症）判定ツールと呼ばれる修正版判定ツールを使用した神経学的ドメインの全体的な判定を組み込む（表２２）。
新たに発症したいずれの神経毒性の評価にも、神経学的検査（ＩＣＥ判定ツール、表２２を含む）、脳ＭＲＩ、及び臨床的に適応とされるＣＳＦの検査（腰椎穿刺による）を含めることとする。脳ＭＲＩが不可能な場合は、脳内出血を除外するために、すべての対象に非造影ＣＴを施行することとする。脳波図も臨床的に適応と見なすこととする。重症例では、気道保護のために気管内挿管が必要になり得る。
ＣＴＸ１１０の注入後少なくとも２１日間、または神経学的症状の解消時、鎮静作用のない抗発作薬（レベチラセタムなど）による予防をすべての対象において考慮することとする（抗発作医薬品が有害な症状の一因であると考えられる場合を除く）。２以上のＩＣＡＮＳグレードを経験している対象は、継続的心臓テレメトリー及びパルスオキシメトリーで監視することとする。重度または生命を脅かす神経毒性については、集中治療支持療法を提供するものとする。神経科コンサルテーションは、常に検討されるものとする。血小板及び凝固障害の徴候を監視し、脳内出血のリスクを軽減するために血液製剤を適切に輸注する。表２１には、神経毒性のグレードを示し、表２３には、管理ガイダンスを提供し、表２２には、ＩＣＥ判定を使用して行われる神経認知判定を示す（以下参照）。表２３に示す治療ガイドラインに加えて、ＣＲＩＳＰＲ医療監視者との話し合い後、ＩＣＡＮＳ管理のために非ステロイド系剤（例えば、アナキンラなど）を考慮してもよい（Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
積極的なステロイド管理を３日より長く受けている対象については、ステロイドの長期使用による重度の感染症のリスクを軽減するために、抗真菌薬及び抗ウイルス薬による予防が推奨される。抗微生物薬による予防も考慮することとする。
ＩＣＥ判定は、スクリーニング時、１日目のＣＴＸ１１０の投与前、及び２日目、３日目、５日目、８日目、及び２８日目に実施する。対象がＣＮＳ症状を経験した場合、症状が解消するまで約２日ごとにＩＣＥ判定を継続することとする。ばらつきを最小限に抑えるために、可能な限り、ＩＣＥ判定の管理に精通しているか、または訓練を受けた同じ研究スタッフメンバーによって判定するものとする。
発熱時または化学療法後に生じ得る頭痛は、非特異型症状である。頭痛のみが必ずしもＩＣＡＮＳの症候であるとは限らず、さらに評価を行うこととする。デコンディショニング及び筋肉低下によって生じる虚弱または平衡の問題は、ＩＣＡＮＳの定義から除外する。同様に、浮腫を伴うまたは伴わない頭蓋内出血は、これらの対象の凝固障害により発生する可能性があり、これもＩＣＡＮＳの定義から除外する。これら及び他の神経毒性は、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って捉えることとする。
６．２．５．１ ヒトヘルペスウイルス６脳炎
ほとんどのヒトは、小児期にＨＨＶ－６にさらされており、成人での血清学的有病率は、１００％に近づき得る。ＨＨＶ－６は、一次感染後、ほとんどの個体において臨床的に潜伏したままであり、再活性化することにより重度の免疫抑制を有するヒトにおいて疾患を引き起こすと考えられている（Ａｇｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。２種類のＨＨＶ－６（Ａ及びＢ）が特定されている。ＨＨＶ－６Ａ感染症と明確に関連する疾患はないが、ＨＨＶ－６Ｂは、小児疾患の突発性発疹の原因である。このウイルスはまた、神経向性を呈し、潜伏形態で脳組織中に残る。ＨＨＶ－６脳炎は、主に同種他家ＨＳＣＴ後の免疫低下患者で報告されており、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている免疫低下患者においても報告されている（Ｂｈａｎｕｓｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｚｅｒｒ，２０１４）。同種他家ＨＳＣＴのデータに基づくと、ステロイドの治療を受けている免疫低下患者では、ＨＨＶ－６脳炎が出現するリスクが高くなる。
ＨＨＶ－６脳炎の診断は、ＣＴＸ１１０注入後に神経学的症状（例えば、錯乱、記憶喪失、発作）を伴うあらゆる免疫低下対象において考慮されることとする。診断検査には、脳ＭＲＩに加えて、次のサンプルが必要である：ＨＨＶ－６ ＤＮＡ ＰＣＲの場合は、腰椎穿刺（臨床的に実施可能であれば、症状から４８時間以内に実施することとする）、及びＨＨＶ－６ ＤＮＡ ＰＣＲの場合は、血液（血漿が望ましい）。ＨＨＶ－６脳炎の診断は、ＰＣＲによって検出されたＣＳＦ ＨＨＶ－６ ＤＮＡの上昇、ＰＣＲによって検出された血液（血漿が好ましい）ＨＨＶ－６ ＤＮＡの上昇、及び急性の精神状態の所見（脳症）、または短期記憶喪失、または発作を有する対象において考慮することとする（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｚｅｒｒ，２０１４）。関連する脳ＭＲＩ異常（排他的ではないが、典型的には、内側側頭葉、特に海馬及び扁桃体の非増強性高強度病変）は、最初は見られない場合がある（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。脳ＭＲＩ所見は、最初は存在しない可能性があるため、ＨＨＶ－６脳炎の治療を、神経学的所見及びＨＨＶ－６ＣＳＦウイルスが高負荷である状況で検討することとする。軽度のタンパク質上昇及び軽度の髄液細胞増多が存在し得るが、ＣＳＦタンパク質及び細胞数は、多くの場合、顕著ではない可能性がある。対象は、発熱及び／または発疹を経験し得る（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＨＨＶ－６脳炎の疑いのある対象はいずれも、ＣＲＩＳＰＲ医療管理者に連絡する必要がある。
ＨＨＶ－６脳炎と診断された対象では、ガンシクロビルまたはホスカルネットによる治療を開始することとする。薬物の選択は、薬物の副作用、対象の併存疾患、及び施設の臨床診療によって指示されることとする。推奨される治療期間は、３週間、または施設の臨床診療によるものである（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｚｅｒｒ，２０１４；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
治療が開始されると、末梢血中のＨＨＶ－６ウイルス量を毎週ＰＣＲで確認するものとする。血中ウイルス量の減少が、治療開始後１～２週間以内に見られることとする。１～２週間の治療後にウイルス量が減少しない場合は、別の抗ウイルス剤（ガンシクロビルまたはホスカルネット）への切り替えを検討することとする。抗ウイルス療法は、少なくとも３週間、ＰＣＲ検査で血中のＨＨＶ－６ＤＮＡのクリアランスが示されるまで継続することとする。本治療法の最後に、ＣＳＦ中のＨＨＶ－６ＤＮＡのクリアランスを確認するために腰椎穿刺を行うこととする。可能であれば、ＨＨＶ－６脳炎の治療中は免疫抑制薬（ステロイドなど）を減少させることとする。ただし、特にＩＣＡＮＳも疑われる場合には、対象のステロイドの必要性とバランスを取る必要がある。
ＨＨＶ－６脳炎が疑われる対象については、可能であれば、ＣＴＸ１１０注入前に採取した血液サンプルから、ＰＣＲによるＨＨＶ－６ ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＨＨＶ－６ ＤＮＡの後ろ向き判定を実施することとする。
ＨＨＶ－６ＤＮＡウイルス量が一貫して上昇している対象（例えば＞１０，０００コピー／ｍＬ）、特に抗ウイルス療法の開始後にウイルス量が減少しない場合は、ＨＨＶ－６の再活性化及び染色体に組み込まれたＨＨＶ－６（ＣＩＨＨＶ－６）を区別する試みがなされることとする。各施設がそれに対応する能力を有する場合、ＣＩＨＨＶ－６は、ウイルスＤＮＡ／細胞ゲノムの１コピー、または毛包／爪中のウイルスＤＮＡのエビデンスによって、またはＨＨＶ－６がヒト染色体に組み込まれたことを示す蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって確認できる。
末端臓器疾患が疑われる場合に、生検が行われた場合、罹患臓器からの組織は、培養、免疫化学、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはｍＲＮＡの逆転写ＰＣＲによってＨＨＶ－６感染について検査することとする（各施設がこれらを実施できる場合）。
６．２．６ Ｂ細胞形成不全
Ｂ細胞形成不全が発生する可能性があり、免疫グロブリンＧの血中レベルを追跡することにより監視できる。ＩＶガンマグロブリンは、臨床的に顕著な低ガンマグロブリン血症（全身性感染症）に対して、施設の標準ケアに従って投与することができる。
６．２．７ 血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）
自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞による治療後にＨＬＨが報告されている（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ，２６，４３－４９；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７１，１５０７－１５１７；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｌｏｏｄ，１２５，４０１７－４０２３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，７，３０３ｒａ１３９；Ｔｅａｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，５１５４－５１５７。ＨＬＨは、活性化されたＴ細胞からのサイトカイン産生が過剰なマクロファージの活性化につながる、ＣＡＲ Ｔ細胞の注入後の炎症反応の結果である臨床症候群である。ＨＬＨの徴候及び症状としては、発熱、血球減少症、肝脾腫大、高ビリルビン血症を伴う肝機能障害、フィブリノーゲンの有意な減少を伴う凝固障害、フェリチンとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の顕著な上昇が挙げられ得る。神経学的所見も観察されている（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ，１１８，４０４１－４０５２；ＬａＲｏｓｅｅ，（２０１５）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ，１９０－１９６。
ＣＲＳ及びＨＬＨは、重複する臨床的特徴及び病態生理を伴う同様の臨床症候群を保有し得る。ＨＬＨは、ＣＲＳの発生時またはＣＲＳの解消時に発生する可能性がある。他のＣＲＳを示すエビデンスの有無を問わず、原因不明の肝機能検査値の上昇または血球減少がある場合には、ＨＬＨを考慮することとする。ＣＲＰ及びフェリチンを監視することは、診断の補助となり、臨床経過を定義することができる。
ＨＬＨが疑われる場合：
・フィブリノーゲンなどの凝固パラメータを頻回に監視する。これらの検査は、判定スケジュールに示されているよりも頻回に実施されてもよく、検査所見に基づいて頻度を決定することとする。
・フィブリノーゲンは、出血のリスクを低下させるために１００ｍｇ／ｄＬ以上に維持することとする。
凝固障害は、血液製剤で補正することとする。
ＣＲＳとの重複を考慮して、表１８～２０のＣＲＳ治療ガイダンスに従って対象も管理することとする。ＩＬ－１阻害剤、アナキンラ、または他の抗サイトカイン療法（エマパルマブ－ｌｚｓｇなど）も、医療監視者との検討後に考慮し得る。
６．２．８ 血球減少症
グレード３の好中球減少症及び血小板減少症は、時には注入後２８日以上持続し、自家ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞製品による治療を受けた対象において報告されている（Ｋｙｍｒｉａｈ ＵＳＰＩ，２０１７；Ｙｅｓｃａｒｔａ ＵＳＰＩ，２０１７）。したがって、ＣＴＸ１１０を投与された対象は、そのような毒性について監視され、適切にサポートされることとする。長期にわたる好中球減少症を有するあらゆる対象において、抗微生物薬及び抗真菌薬による予防を考慮することとする。
ＣＴＸ１１０注入後２８日以内に解消しなかったグレード３以上の好中球減少症、血小板減少症、または貧血を経験している対象については、グレード２以下まで解消するまでまたは新しい全身性抗がん療法を投与するまで週１回、ＣＴＸ１１０の各投与後３ヶ月まで週１回、その後、施設の慣行に従うまで最低月１回、全血球分画計算を実施することとする。
Ｇ－ＣＳＦは、ＣＴＸ１１０注入の２１日後にグレード４の好中球減少症の症例において、ＣＲＳのリスクが過ぎたときに考慮され得る。Ｇ－ＣＳＦの投与は、早期に考慮し得るが、最初に医療監視者と検討する必要がある。長期の好中球減少症、または高用量のステロイドの患者はいずれも、抗微生物薬及び抗真菌薬による予防を検討することとする。
６．２．９ 移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
ＧｖＨＤは、同種他家ＨＳＣＴの状況で見られ、これは、免疫適格ドナーＴ細胞（グラフト移植片）がレシピエント（宿主）を異物として認識した結果である。その後の免疫応答は、ドナーのＴ細胞を活性化してレシピエントを攻撃し、外来の抗原担持細胞を排除する。ＧｖＨＤは、同種他家ＨＳＣＴからの時間及び臨床的症候の両方に基づいて、急性症候群、慢性症候群、及び重複する症候群に細分される。急性ＧｖＨＤの徴候としては、黄斑丘疹の発疹；小胆管の損傷による黄疸を伴う高ビリルビン血症（胆汁うっ滞を引き起こす）；悪心、嘔吐、及び食欲不振；水様または血様の下痢及び痙攣性腹痛が挙げられ得る（Ｚｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂｌａｚａｒ，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２１６７－２１７９。
提案された臨床試験を裏付けるために、非臨床試験実施基準（ＧＬＰ）に準拠するＧｖＨＤ及び忍容性試験が、提案されたすべての臨床用量レベルの少なくとも１０倍超える２つの用量で免疫低下マウスにおいて実施した。さらに、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＡＲ挿入の特異性により、Ｔ細胞がＣＡＲ＋及びＴＣＲ＋の両方である可能性は非常に低い。残りのＴＣＲ＋細胞は、イムノアフィニティクロマトグラフィーにより、抗ＴＣＲ抗体カラムで、製造プロセス中に除去され、最終産物中ＴＣＲ＋細胞０．１５％未満を達成する。すべての用量レベルにおいて、用量制限７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇとし得る。この制限は、１×１０５ＴＣＲ＋細胞／ｋｇの制限よりも低く、これは、ハプロ同一ドナーのＳＣＴ中に重度のＧｖＨＤを引き起こすことができる同種他家細胞の数に関する公開レポートに基づく（Ｂｅｒｔａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，８２２－８２６。この特定の編集、精製、及び厳格な製品リリース基準により、ＣＴＸ１１０後のＧｖＨＤのリスクは低いはずである。ただし、実際の発生率は不明である。対象は、ＣＴＸ１１０の注入後に急性ＧｖＨＤの徴候がないか注意深く監視することとする。潜在的症状の時期は、不明である。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大は抗原によって引き起こされ、ＴＣＲ－細胞中でのみ発生する可能性が高いことを考慮すると、ＴＣＲ＋細胞の数が注入された数を大幅に上回る可能性は低い。
ＧｖＨＤの診断及びグレード分けは、表２４に概説するとおり、公開されている基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２２，４－１０）に基づくこととする。
全体的なＧｖＨＤグレードは、最重度の標的臓器の病変に基づいて決定できる。
・グレード０：いずれの臓器もステージ１～４でない。
・グレード１：ステージ１～２の皮膚で、肝臓、上部消化管、または下部消化管の病変はない。
・グレード２：ステージ３の発疹及び／またはステージ１の肝臓及び／またはステージ１の上部消化管及び／またはステージ１の下部消化管。
・グレード３：ステージ２～３の肝臓及び／またはステージ２～３の下部消化管、ステージ０～３の皮膚及び／またはステージ０～１の上部消化管。
・グレード４：ステージ４の皮膚、肝臓、または下部消化管の病変、ステージ０～１の上部消化管。
感染症及び医薬品への反応など、ＧｖＨＤを模倣し得る潜在的な交絡因子は除外することとする。皮膚及び／または消化管生検は、治療開始前または開始直後に確認のために行うこととする。肝臓病変の場合には、臨床的に実施可能であれば、肝生検を試みることとする。
急性ＧｖＨＤの管理に関する推奨事項を表２５に示す。治験の最後に対象間の比較ができるように、これらの推奨事項に従う必要があるが、これらに従うことにより対象がリスクにさらされ得る特定の臨床シナリオは除く。
二次治療ラインの療法の開始の決定は、より重度のＧｖＨＤを有する対象に対してより早期に行うこととする。例えば、二次療法は、ＧｖＨＤの症候が進行する３日後、グレード３のＧｖＨＤが持続して１週間後、またはグレード２のＧｖＨＤが持続して２週間後に適応とされ得る。高用量グルココルチコイド治療に耐えることができない対象においては、二次治療ラインの全身療法が早期に適応とされる場合がある（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１８，１１５０－１１６３）。二次治療の選択及び開始する時については、従来の慣行に基づき得る。
難治性急性ＧｖＨＤまたは慢性ＧｖＨＤの管理は、施設内ガイドラインに従って行うことができる。免疫抑制剤（ステロイドなど）により対象を治療する場合は、現地のガイドラインに従って抗感染予防措置を講じることとする。
６．２．１０ 低血圧及び腎不全
低血圧及び腎不全は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法において報告されており、施設内慣行ガイドラインに従って、生理食塩水ボーラスのＩＶ投与により治療を行うものとする。適宜、透析を検討することとする。
６．２．１１． ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中の特別考慮事項
本試験に登録された対象は、ＬＤ化学療法を受けており、免疫低下しており、感染リスクが高い。したがって、臨床試験プロトコルでは、スクリーニング中、ＬＤ化学療法前、ＣＴＸ１１０注入前に進行中の活動性感染症を有する場合、または注入が遅延する場合は、いずれも、対象を除外する必要がある（セクション４．２を参照）。
この措置には、ＣＯＶＩＤ １９（コロナウイルス病２０１９）の原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）の活動性感染を有する対象を含む。エビデンスは急速に変化し、かつ地域的な違いもあるため、現在の状況で特定の時点において個々の対象の試験を安全に実施できる場合は、現地の規制及び施設内ガイドラインに従うべきである。
７． 試験手順
本試験の用量漸増部分及び拡大部分は両方とも、３つの異なる段階で構成される：
（１）スクリーニング及び適格性の確認、（２）コホートの割り当てに応じてＬＤ化学療法及びＣＴＸ１１０注入からなる治療、及び（３）フォローアップ。スクリーニング段階では、対象は、上記の適格基準に従って判定する。
登録後、コホートＡ及びＢの対象は、ＬＤ化学療法を受け、その後ＣＴＸ１１０が注入される。フォローアップ中、対象は、腫瘍応答、疾患の進行、及び生存について判定される。すべての試験ステージを通じて、対象は、定期的に安全性を監視する。
全判定スケジュールを表２６及び表２７（すべてのコホート）に示す。必要なすべての試験手順の説明は、本セクションに記載する。プロトコルで義務付けられた判定に加えて、対象を、施設のガイドラインに従い観察する必要があり、臨床的に適応である場合は、スケジュール外の判定を行う必要がある。
評価しなかった場合は、再スケジュールして、可能な限り元のスケジュール日に近い日付で行うこととする。スケジュールされている次回評価に近すぎるため、再スケジュールが医学的に不必要であるかまたは安全でない場合は、例外が設けられる。その場合、実施できなかった評価は、中止とする。
このプロトコルの目的上、０日目はない。すべての来院日及び枠は、ＣＴＸ１１０の初回注入の日付として１日目を使用して計算する。
７．１ 対象のスクリーニング、登録、及び中止
７．１．１ 対象のスクリーニング
スクリーニング期間は、対象がインフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）を提出した日から開始し、適格性の確認及び本試験への登録まで継続する。インフォームドコンセントが得られたら、判定スケジュールに記載のとおり、対象をスクリーニングして試験適格性を確認する（表２６～２７）。スクリーニングの判定は、対象がインフォームドコンセントに署名してから１４日以内に完了する。
対象は、１回のみの再スクリーニングが許可される。これは、最初の同意から３ヶ月以内に行われ得る。
７．１．２． 治療コホートへの対象の割り当て
コホートＡ及びＢは、ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換ＦＬ、ならびにグレード３ｂ ＦＬを含むＮＨＬを有する対象を含む。ＣＴＸ１１０注入は、コホートＢにおいてＤＬ３で開始され得る。投与は、本明細書に記載のとおりに時間差で行われる。
パートＢ（ＮＨＬコホートの拡大）では、バルキー病変の現れを伴う難治性ＮＨＬ疾患（バルキー難治性集団Ｎ２）を有する対象の登録は、２０名の対象に制限されている。次のいずれかに該当する場合、バルキー病変の現れを伴う難治性ＮＨＬ疾患は、現地の結果を前向きに、及び／または中央検査室の分析を用いて後ろ向きに、高リスクと定義される（一致しない場合は、中央検査室の分析を優先する）：
・現地及び／または中央検査室分析によって判定したとき、ＳＰＤ≧５０ｃｍ２（ＬＤ化学療法前）［ＳＰＤ＝二方向積和］、及び／または
・いずれの化学療法レジメンに対しても応答（ＰＲまたはそれ以上）歴がない、及び／または登録から６ヶ月以内のＤＬＢＣＬの診断
・登録前７ヶ月以内のＮＨＬの対象に対して一次治療ラインの抗がん療法を開始している。
７．２ 試験判定
必要な処置の時期については、判定スケジュール（表２６及び表２７）を参照のこと。
７．２．１ 病歴
人口統計データを収集する。対象の疾患の全病歴、これまでのがん治療、及び診断日以降の治療に対する応答などの病歴を得る。心臓、神経、及び手術歴を得る。治験に参加するには、すべての対象が本明細書に記載のすべての選択基準を満たしている必要があり、本明細書に記載の除外基準をいずれも有しない。
７．２．２ 身体診査
全身の外観、皮膚、首、頭、目、耳、鼻、喉、心臓、肺、腹部、リンパ節、四肢、及び神経系を含む主要な身体系の検査を含む身体診査は、すべての治験来院時に行い、結果を記録する。スクリーニング時に実施された検査から指摘された変化は、ＡＥとして記録する。
７．２．３． 身長及び体重を含むバイタルサイン
バイタルサインは、治験来院ごとに記録し、座位血圧、心拍数、呼吸数、パルスオキシメトリー、体温、及び身長を含む。体重は、表２６～２７のスケジュールに従って取得し、身長は、スクリーニング時にのみ測る。
７．２．４ ＥＣＯＧパフォーマンスステータス
パフォーマンスステータスは、スクリーニング時、ＣＴＸ１１０注入時（１日目）、２８日目、及び３ヶ月目の来院時に、ＥＣＯＧスケールを使用して判定し、対象の全身健康状態及び日常生活の活動を行う能力を判断する。ＥＣＯＧパフォーマンスステータススケールは、以下の表２８に示す。
７．２．５ 超音波心臓検査図
適格性を確認するために、スクリーニング時に、訓練を受けた医療関係者が経胸壁超音波心臓検査（左心室駆出率の判定）を実施し、読み取る。低血圧のために２回以上の輸液ボーラスを必要とする、血行動態管理のために集中治療室に移送された、または低血圧のために任意の用量の昇圧剤を必要とするすべての対象に対しては、グレード３または４のＣＲＳの間に追加の心臓判定を行うことが推奨される（Ｂｒｕｄｎｏ ａｎｄ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，２０１６）。
７．２．６ 心電図
１２誘導心電図（ＥＣＧ）は、スクリーニング中、治療初日のＬＤ化学療法前（コホートＡ及びＢ）、１日目のＣＴＸ１１０投与前、及び２８日目に取得する。ＱＴｃ及びＱＲＳ間隔は、ＥＣＧから決定する。
７．２．７ ＮＨＬ腫瘍病理学
ＮＨＬサブタイプの組織病理学的診断は、現地検査室の判定に基づく。好ましくは、スクリーニング中に対象が腫瘍生検を受ける。しかし、再発／難治性疾患の生検が、最後の一連の療法の完了後、かつ登録前の３ヶ月以内に実施された場合は、保存されている組織を使用することができる。骨生検及び他の脱灰組織は、下流のアッセイと干渉するため許容されない。
組織生検の一部は、分析のために中央検査室に提出される。組織の調製及び発送に関する要件は、検査マニュアルに記載されている。保存組織の量または品質が不十分で、中央検査室の要件を満たすことができない場合は、スクリーニング中に生検を実施する必要がある。保存腫瘍組織サンプルは、侵襲性ＮＨＬのマーカー（例えば、ＭＹＣ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６）、及び腫瘍及び周囲の微小環境における免疫マーカー（例えば、プログラム細胞死タンパク質１、プログラム細胞死リガンド１）について分析することができる。
７．２．８ 脳ＭＲＩ
ＣＮＳ転移を除外するために、スクリーニング中に脳ＭＲＩを実施する。このＭＲＩの取得、処理、及び転送の要件は、イメージングマニュアルに記載されている。
７．２．９ 腰椎穿刺
腰椎穿刺は、ＣＮＳ浸潤のリスクが高い対象に実施される。これらには、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫の対象、精巣への浸潤を伴ったリンパ腫の対象、または、ＣＮＳ ＩＰＩ（Ｒ－ＣＨＯＰによる治療を受けたＤＬＢＣＬ患者のＣＮＳ再発／進行のリスクを推定するために使用されるツール）でリスクの高いスコアを有する対象を含む（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。臨床的に実施可能な場合、神経毒性中に腰椎穿刺を行う場合、探索的バイオマーカー及びＣＴＸ１１０の存在（ＰＣＲによる）について、ＣＳＦサンプルを中央検査室に送ることとする。神経毒性評価の状況で腰椎穿刺を行う場合は必ず、その施設で行われる標準パネル（少なくとも細胞数、グラム染色、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを含むこととする）に加えて、次のウイルスパネルを実施することとする：
・ＨＳＶ－１及び－２、エンテロウイルス、ＶＺＶ、ＣＭＶ、及びＨＨＶ－６のＣＳＦ ＰＣＲ分析
ウイルスパネルの結果は、対象の適切な管理をサポートするために、採取から５営業日以内に入手できることとする。
７．２．１０ 免疫エフェクター細胞関連脳症（ＩＣＥ）の判定
神経認知判定は、ＩＣＥ判定を使用して実施する。ＩＣＥ判定は、ＣＡＲＴＯＸ－１０スクリーニングツールをわずかに修正したバージョンであり、現在は、受容性失語症検査を含む。ＩＣＥ判定（表２２）では、認識機能の様々な領域を調べる：見当識、呼称、指示に従う、筆記、及び注意。
ＩＣＥ判定は、スクリーニング時、１日目のＣＴＸ１１０の投与前、及び２日目、３日目、５日目、８日目、及び２８日目に実施する。対象がＣＮＳ症状を経験した場合、症状が解消するまで約２日ごとにＩＣＥ判定を継続することとする。ばらつきを最小限に抑えるために、可能な限り、ＩＣＥ判定の管理に精通しているか、または訓練を受けた同じ研究スタッフメンバーによって判定するものとする。
７．２．１１ ＮＨＬのＰＥＴ／ＣＴ及び放射線疾患応答判定
すべての疾患部位（頸部、胸部、腹部、及び骨盤など）のＰＥＴ／ＣＴ（ＣＴにはＩＶ造影剤を含める必要がある）スキャンを必要とする。ＰＥＴ／ＣＴのＣＴ部分は、診断に適したものであるか、ＩＶ造影剤を使用した単独のＣＴを実施することとする。ＣＴが臨床的に禁忌である場合、または現地の規制で必要な場合は、造影剤を使用したＭＲＩを使用してもよい。ベースラインのＰＥＴ／ＣＴ（ＩＶ造影剤を使用）は、ＣＴＸ１１０の投与前２８日以内に実施する必要があり、注入後のスキャンは、表２６～２７の判定スケジュールに従って実施する。対象が、疾患の進行の可能性と一致する症状を有する場合は、スケジュール外のＰＥＴ／ＣＴ（ＩＶ造影剤を使用）を実施することとする。
３５日目（－７日／＋２１日）に２回目のＣＴＸ１１０注入を受けるすべての対象について、有効性を判定するために、その注入の２８日後にＰＥＴ／ＣＴスキャンを行う必要がある。２回目のＣＴＸ１１０注入によるＰＥＴ／ＣＴスキャンが最初の３ヶ月目のスキャンから１４日以内（枠を含む）に行われた場合、そのスキャンを３ヶ月目のイメージングと置き換えることができる。
スキャンの取得、処理、及び転送の要件は、イメージングマニュアルに記載されている。可能であれば、ＰＥＴ／ＣＴを取得するために使用されるイメージングモダリティ、マシン、及びスキャンパラメータは、試験中一貫性を維持することとする。腫瘍負荷は、Ｌｕｇａｎｏ基準（本明細書に開示）に従ってベースライン時に定量化する。腫瘍負荷の判定には、最大６つの標的病変について、各標的（結節または節外）病変の寸法を集計し、病変の２つの最長の直交直径を乗算することによって計算された直交直径の和（ＳＰＤ）を含む。標的病変は、複数の部位及び／臓器にわたる全体的な腫瘍負荷を表す、再現可能に測定できる最大サイズのものから選択することとする。
７．２．１２ ＮＨＬの骨髄生検及び穿刺
スクリーニング時及び２８日目に骨髄生検及び穿刺を行い、疾患の程度を評価する。ＰＥＴ／ＣＴスキャンで決定され、ＣＲを達成している骨髄浸潤歴を有する対象は、応答の判定を確認するために骨髄生検を受ける。対象が再発の徴候を示す場合は、生検片採取を繰り返すこととする。ＣＴＸ１１０の存在（ＰＣＲによって検出）に関する穿刺サンプルは、骨髄分析が実施される任意の時点で、中央検査室評価のために送ることとする。骨髄生検のための標準的施設内ガイドラインに準拠することとする。処理及び発送に関する詳細な指示は、検査室マニュアルに記載されている。余分なサンプル（利用可能な場合）は、探索的研究のために保管する。
７．２．１３ ＮＨＬの任意の腫瘍生検
腫瘍組織へのＣＴＸ１１０のトラフィッキング及びＣＴＸ１１０の機能に対する腫瘍環境の影響についてさらに理解するために、任意の腫瘍生検片は、生検に適応する腫瘍を有し、この処置に個別の同意を示す対象から取得する。任意の腫瘍生検は、２８日目に行う。腫瘍生検のための標準的施設内ガイドラインに準拠することとする。
７．２．１４ 検査室検査
検査室サンプルは、判定スケジュール（表２６及び表２７）に従って収集し、分析する。いくつかの詳細を以下の表２９に示す。
７．３． バイオマーカー
ＣＴＸ１１０の臨床応答、耐性、安全性、薬力学的活性、または作用機序を示す可能性のあるゲノム、代謝、及び／またはプロテオームのバイオマーカーを特定するために、血液、骨髄、腫瘍、及びＣＳＦサンプル（ＩＣＡＮＳを有する対象のみ）を収集する。
以下の検査項目は、中央検査室での分析用に採取する。処理のために中央検査室に送られる検査の採血及びサンプルの取り扱いに関する情報については、検査マニュアルを参照のこと。余分なサンプル（利用可能な場合）は、探索的研究のために保管する。
７．３．１ ＣＴＸ１１０薬物動態解析
ＣＴＸ１１０細胞のＰＫ解析は、表２６及び表２７に記載のスケジュールに従って収集された血液サンプルに対して行う。ＣＲＳ、神経毒性、及びＨＬＨの徴候または症状を経験している対象では、追加の血液サンプルを検査室のマニュアルに記載されている間隔で採取することとする。血中のＣＴＸ１１０の動態の時間経過（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）は、ＤＮＡ１μｇあたりのＣＡＲ構築物のコピーを測定するＰＣＲアッセイを使用して説明する。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面上のＣＡＲタンパク質の存在を確認する補足分析も実施できる。ＣＳＦ、骨髄、または腫瘍組織におけるＣＴＸ１１０のトラフィッキングは、プロトコル固有のサンプリングに従って収集されたこれらのサンプルのいずれか中で評価できる。
７．３．２． サイトカイン
ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７ａ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、及びＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインは、中央検査室で分析する。最近の総説で要約されているように、これまでの複数のＣＡＲ Ｔ細胞臨床試験で実施された相関分析により、これらのサイトカイン及び他のサイトカインが、重度のＣＲＳ及び／または神経毒性の潜在的な予測マーカーとして特定された（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈａｎ，２０１８）。サイトカイン用の血液は、表２６及び２７に記載されている特定の時間に収集する。ＣＲＳ、神経毒性、及びＨＬＨの徴候または症状を経験している対象では、追加のサンプルを採取することとする（検査マニュアルに記載されているスケジュールに従う）。
７．３．３ 抗ＣＴＸ１１０抗体
ＣＡＲ構築物は、マウスｓｃＦｖで構成されている。血液は、表２６～２７に従って、潜在的な免疫原性を判定するために、試験全体において採取する。
７．３．４ 探索的研究用バイオマーカー
探索的研究は、臨床応答、耐性、安全性、薬力学的活性、及び／または治療の作用機序の指標または予測となり得る分子（ゲノム、代謝、及び／またはプロテオミクス）バイオマーカー及び免疫表現型を特定するために実施される場合がある。
８． 安全性、有害事象、試験監督
各対象は、試験全体において定期的にＡＥの臨床的及び実験的エビデンスについて監視される。質問への回答で得られたＡＥ、各施設の人員によって観測されたＡＥ、または対象によって自発的に報告されたＡＥが記録される。すべてのＡＥは、十分な結論に達するまで追跡される。
８．１． 有害事象
ＡＥとは、医薬品を投与された患者または臨床調査の対象者におけるあらゆる不都合な医学的出現であり、必ずしもこの治療と因果関係を有するものではない。したがって、ＡＥは、その事象が医薬品（治験薬）に関連していると考えられるか否かにかかわらず、医薬品（治験薬）の使用と一時的に関連した任意の好ましくないまたは意図しない徴候（例えば、検査所見異常など）、症状、または疾患であり得る。［（ＧＣＰ）Ｅ６（Ｒ２）］臨床試験では、ＡＥには、試験治療が行われていなくても、ベースラインまたは休薬期間を含め、いかなる時でも発生する望ましくない病状が含まれる場合がある。ＡＥを定義する追加の基準を以下に記載する。
以下は、有害事象と見なす：
・既存の疾患または永続的な障害の悪化（既存の状態の性質、重症度、頻度、または期間における臨床的に顕著なあらゆる悪化）
・プロトコルで義務付けられた処置によって生じる事象（侵襲的処置による合併症など）
以下は、有害事象と見なさない：
・手術、内視鏡検査、抜歯、輸血などの選択的または事前に予定されていた医学的または外科的処置。
注記：事前にスケジュールされた選択的処置または定期的にスケジュールされている治療中に発生した好ましくない医療事象は、ＡＥまたはＳＡＥとして記録することとする
・治験医薬品の投与中または投与後に悪化していない既存の疾患または状態
・治験薬の注入または観察のために予定されていた入院
・試験中の悪性腫瘍、または疾患に関連する徴候及び症状、ならびに根底にある悪性腫瘍の進行または再発
臨床的に顕著であると考えられる検査結果の異常のみをＡＥとして報告することとする（例えば、臨床症状に関連する検査所見の異常、長期にわたる検査所見の異常、または追加の監視及び／または医学的介入を必要とする検査所見の異常）。可能な限り、これらは異常なパラメータ自体ではなく、臨床診断として報告することとする（すなわち、好中球減少症対好中球数の減少）。臨床的に有意でない検査結果の異常は、ＡＥとして記録されないものとする。
有害事象は、治療前、治療中、または治療後に発生する可能性があり、治療による（すなわち、ＣＴＸ１１０注入後に発生）または治療によらないのいずれかであり得る。治療によらないＡＥとは、対象がＣＴＸ１１０を投与される前に、書面によるインフォームドコンセントが得られた後に発生する、任意の新たな徴候または症状、疾患、または他の好ましくない医学的事象である。
８．２． 重篤な有害事象
以下の基準のいずれかを満たす場合、あらゆる好ましくない医学的結果のＡＥは、ＳＡＥとして分類する必要がある。
・死に至るもの
・生命を脅かす（すなわち、対象を死の差し迫ったリスクにさらすＡＥ）
・患者の入院を必要とする、または既存の入院を延長する（スケジュールされた医学的または外科的処置のための入院、またはスケジュールされた治療を行うための入院は、これらの基準を満たさない）
・永続的または重大な障害または無能力となる
・新生児の先天性奇形または先天的欠損症を引き起こす
・他の重要な／顕著な医学的事象。死亡、生命を脅かす、または入院を必要とする結果となり得ない重要な医療事象は、適切な医学的判断に基づいて、患者または対象を危険にさらす可能性があり、この定義に記載されている転帰のうちの１つを防ぐために、医学的または外科的介入が必要とされ得る場合には、重篤と見なされ得る
試験的注入のための入院、またはＣＴＸ１１０注入後の予定された入院は、ＳＡＥとは見なさない。さらに、観察のための入院または観察のための入院の延長は、他のＳＡＥ基準を満たす医学的に顕著な事象に関連しない限り、ＳＡＥとして報告されないものとする。
８．３． 特に注目すべき有害事象
特に明記されていない限り、ＣＴＸ１１０注入後、新しい抗がん療法の開始前に発生した場合は、すべてのＡＥＳＩを報告することとする。ＣＴＸ１１０注入後のＡＥＳＩは、報告する必要があり、以下を含む：
・ＣＴＸ１１０注入の反応
・グレード３以上の感染症
・腫瘍崩壊症候群
・サイトカイン放出症候群（ＨＬＨの重複症候を伴う症例を含む）
・ＩＣＡＮＳ
・Ｂ細胞形成不全
・低ガンマグロブリン血症
・移植片対宿主病
・二次悪性腫瘍
・制御不能なＴ細胞増殖
・治験責任医師が判定した新しい血液学的または自己免疫疾患はいずれも、ＣＴＸ１１０に関連している可能性があるか、ＣＴＸ１１０に関連している
必要なＡＥＳＩレポート収集期間に関する追加情報は、以下の表３０及び３１に詳述する。
７．４． 有害事象の重症度
ＡＥは、ＣＴＣＡＥバージョン５．０に従ってグレード分けされるが、ＣＲＳ、神経毒性、及びＧｖＨＤは例外であり、これらは、本明細書に開示の基準に従ってグレード分けする。
ＣＴＣＡＥグレードまたはプロトコルで指定された基準が利用できない場合、表３０の毒性グレードを使用できる。
８．５ 有害事象の因果関係
各ＡＥとＣＴＸ１１０、ＬＤ化学療法、ダラツムマブの投与、及びプロトコルで義務付けられているあらゆる試験処置（すべて個別に判定）との関係を判定する。関係の判定は、次の定義に基づいて行う：
・関連あり：試験治療または処置とＡＥとの間に明確な因果関係がある。
・関連する可能性あり：試験治療または処置とＡＥとの因果関係を示唆するエビデンスがいくつかあり、別の潜在的原因も存在する。
・関連なし：試験治療または処置とＡＥとの因果関係を示唆するエビデンスはない。
因果関係の判定を行う際には、事象の時期と治療または処置の実施、妥当な生物学的メカニズム、及び事象の他の潜在的な原因（例えば、併用療法、基礎疾患）との間の時間的関連性を考慮する必要がある。
ＳＡＥがあらゆる試験介入に関連していないと判定された場合、ＣＲＦに別の病因を示す必要がある。ＳＡＥと治験製品との関係が「可能性がある」と判断された場合、判定の根拠を提供する必要がある。
８．６ 転帰
ＡＥまたはＳＡＥの転帰は、次のように分類及び報告される：
・致命的
・未回復／未解消
・回復／解消
・後遺症を残して回復／解消
・回復中／解消中
・不明
対象が最後のＣＴＸ１１０注入から３ヶ月以内に新しい抗がん治療を受けた場合、すべてのＳＡＥ及びＡＥＳＩを３ヶ月目まで報告することとする。対象が３ヶ月目の試験来院後に新しい抗がん療法を開始した場合、ＣＴＸ１１０関連ＳＡＥ、ＣＴＸ１１０関連ＡＥＳＩ、及び新しい悪性腫瘍のみを報告する。対象が登録後にＣＴＸ１１０療法を受けていない場合、ＡＥ報告期間は、最後の試験関連処置（例えば、生検、画像検査、ＬＤ化学療法）の３０日後に終了する。
８．７ 疾患の進行
疾患の進行及び疾患の進行の徴候及び症状は、次の例外を除いてＡＥとして報告されないものとする：
試験中の悪性腫瘍の非定型または加速的な進行であって、その性質、症状の現れ、または重症度が疾患の通常の過程とは異なり、症状が重篤な基準を満たすもの。この場合、基礎状態の悪化をＳＡＥとして報告することとする。
ＣＴＸ１１０との関係にかかわらず、試験投与から３０日以内の死亡転帰を伴う疾患の進行は、ＳＡＥとして記録し、セクションごとに報告することとする。
８．８． 終了
以下の事象のうちの１つ以上が発生した場合、治療は、延期、一時停止、または終了することがある。
・管理不能で、予想外で、ＬＤ化学療法とは無関係である、ＣＴＸ１１０に起因する生命を脅かす（グレード４）毒性
・注入後３０日以内のＣＴＸ１１０に関連する死亡
・ＨＳＣＴなどのあらゆる新しい抗がん療法の開始前に７×１０４ＴＣＲ＋細胞／ｋｇ超を受けた対象のグレード２を超えるＧｖＨＤ
・少なくとも１２名の対象がコホート拡大に登録され、次のうち少なくとも１つが発生した後：
－ ３５％を超えるグレード３または４の神経毒性が２週間以内にグレード２以下まで解消しない
－ ２０％を超えるグレード２以上のＧｖＨＤでステロイド難治性である。
－ ３０％を超えるグレード４のＣＲＳ
・新しい悪性腫瘍（これまでに治療された悪性腫瘍の再発／進行とは異なる）
・有効性の欠如は、コホート拡大の１５名の対象がＣＴＸ１１０後判定を３ヶ月行った後、客観的奏効が２つ以下（中央検査室の分析による）として定義される。
・試験関連治療またはフォローアップを継続している間に対象をリスクにさらす可能性のあるあらゆる病状
９． 統計的方法
９．１ 試験の目的及び仮説
パートＡの主目的は、再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象におけるＣＴＸ１１０の漸増用量の安全性を判定して、パートＢの推奨用量を決定することである。
パートＢの主目的は、再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象において、ＣＴＸ１１０の有効性を、客観的奏効率によって測定して判定することである。
９．２． 試験評価項目
９．２．１ 主要評価項目
すべてのコホートの用量漸増：コホートそれぞれの用量制限毒性として定義される有害事象の発生率
コホートの拡大：独立した中央検査室による分析により決定される、Ｌｕｇａｎｏ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｃｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）に従った客観的奏効率（ＣＲ＋ＰＲ）。
９．２．２ 用量漸増及びコホート拡大副次的有効性評価項目
応答／寛解の期間は、客観的奏効事象を有している対象についてのみ報告される。これは、最初の客観的奏効と、最初の客観的奏効後の最初の疾患の進行または何らかの原因による死亡との間の時間を使用して判定される。最初の客観的奏効から進行せず、データカットオフ日の時点において試験中の対象は、最後の判定日に打ち切ることにする。
臨床的利益の持続期間（ＤＯＣＢ）は、最初の客観的奏効から最後の疾患進行または死亡までの時間として計算する。進行しておらず、データカットオフ日に試験中の対象は、最後の判定日に打ち切ることにする。
治療成功生存期間（ＴＦＦＳ）は、最初のＣＴＸ１１０注入から最後の疾患進行または何らかの原因による死亡までの時間として計算する。進行しておらず、データカットオフ日に試験中の対象は、最後の判定日に打ち切る。
全生存期間は、ＣＴＸ１１０の初回投与日から何らかの原因による死亡までの時間として計算する。データのカットオフ日に生存している対象は、生存が確認された最後の日付に打ち切る。
９．２．３． 副次的安全性評価項目
ＣＲＳ（Ｌｅｅ及びＡＳＴＣＴ基準）、神経毒性（ＩＣＡＮＳ及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０）、及びＧｖＨＤ（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ａｃｕｔｅ ＧＶＨＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ［ＭＡＧＩＣ］基準）を除き、ＣＴＣＡＥ バージョン５．０に従って、ＡＥの頻度及び重症度、ならびに臨床的に顕著な検査異常が要約され、報告される。
９．２．４． 薬物動態
薬物動態データには、ＣＡＲ構築物のコピーを測定するＰＣＲアッセイによって判定される経時的血中ＣＴＸ１１０レベルを含む。血中のＣＴＸ１１０の分析は、細胞表面のＣＡＲタンパク質を検出するフローサイトメトリーを使用して行うこともできる。このような分析は、血液中でのＣＴＸ１１０の存在を確認し、他の細胞免疫表現型の特徴をさらに明らかにするために使用してもよい。
９．２．５． 二次患者報告アウトカム評価項目
ＣＴＸ１１０に関連するＰＲＯの経時変化は、様々なコホート中の対象に実施されるＰＲＯ調査について、本明細書に開示されるように評価し、分析される。
９．２．６ 用量漸増及びコホート拡大探索的評価項目
・組織中のＣＴＸ１１０のレベル（骨髄、ＣＳＦ、及び／または腫瘍組織中のＣＴＸ１１０のトラフィッキングは、プロトコル固有のサンプリングごとに収集した任意のサンプル中で評価され得る）
・血液及び他の組織中のサイトカインのレベル
・抗ＣＴＸ１１０抗体の発生率
・経時的なＢ細胞及び免疫グロブリンのレベル
・ＣＴＸ１１０の増殖、ＣＲＳ、及び応答に対する抗サイトカイン療法の影響
・ＣＴＸ１１０療法後の自家または同種他家ＨＳＣＴの発生率
・その後の抗がん療法の発生率及び種類
・完全奏効／寛解までの時間。ＣＴＸ１１０初回注入日から完全奏効が最初に記録されるまでの時間として定義される
・ＣＴＸ１１０の初回注入日から最初のその後の治療の初回または何らかの原因による死亡日までの時間として定義される、その後の最初の無治療生存期間
・他のゲノム、プロテオミクス、代謝、または薬力学的評価項目
９．３ 分析セット
次の分析セットを評価し、データの提示に使用する。
パートＡ（用量漸増）
ＤＬＴ評価セット（ＤＥＳ）：ＣＴＸ１１０の投与を受け、ＤＬＴ評価期間を完了したか、ＤＬＴを経験した後早期に中止したすべての対象。ＤＬＴ評価期間は、ＣＴＸ１１０の初回注入から開始し、２８日間継続する。ＤＥＳは、パートＢの推奨投与量を決定するために使用する。
パートＡ＋パートＢ（用量漸増＋コホート拡大）
登録セット：本試験に登録されたすべての対象。登録セットは、割り当てられたＣＴＸ１１０の用量レベルに従って分類される。
治療セット：試験中何らかの試験治療を受けたすべての対象。治療セットの対象は、受けた試験治療に従って分類される。
修正ｉｎｔｅｎｔ ｔｏ ｔｒｅａｔセット（ｍＩＴＴ）：ＣＴＸ１１０注入を受けたすべての対象。ｍＩＴＴの対象は、割り当てられたＣＴＸ１１０の用量レベルに従って分類される。ｍＩＴＴは、臨床活動判定の主要な分析セットとなる。
安全性解析セット（ＳＡＳ）：ＣＴＸ１１０注入を受けたすべての対象。ＳＡＳの対象は、ＣＴＸ１１０の投与された用量レベルに従って分類される。ＳＡＳは、ＣＴＸ１１０の安全性プロファイルの特徴を明らかにするための主要な分析セットとなる。
９．４ 中間解析
９．４．１． 有効性中間解析
早期有効性及び無益性に関する中間解析は、独立した統計学者によって行われ、ＤＳＭＢによってレビューされる。中間解析は、ＮＨＬの拡大コホートの強化されたサブセット中の計画された７７名の対象のうち３８名（５０％）がパートＢに登録され、評価可能な腫瘍応答データを３ヶ月間有する場合、または早期に中止された場合に行う。
Ｌａｎ－Ｄｅｍｅｔｓ（Ｌａｎ ａｎｄ Ｄｅｍｅｔｓ，１９８３）によるアルファ消費関数を使用して、中間解析でＯ’Ｂｒｉｅｎ－Ｆｌｅｍｉｎｇ型の有効性境界を構築する。このアルファ消費関数の選択に基づいて、中間解析が３８名の対象（７７名の５０％）で実施される場合、統計的有意性を宣言するには、ＯＲＲの両側９９．２６％の正確な信頼区間の下限は、２６％より高い必要がある。その結果、中間解析で早期有効性を主張するには、少なくとも１９／３８＝５０％のＯＲＲを必要とする。早期有効性の実証は、規制当局とのやり取り及び出版物を裏付けるために使用され得る。強化されたサブセット中７６名の対象が治療を受け、少なくとも３ヶ月間追跡した場合の一次解析では、それに対応して両側９５．１４％の正確な信頼区間が使用され、奏効を主張するには少なくとも２９／７６＝３８％のＯＲＲを必要とする。
無益性については、中間解析の時点で、これらの３８名の対象のうち最大１０名の対象が客観的奏効を達成した場合、ＮＨＬ対象の登録は停止する。奏効に関する無情報事前確率に基づき、３９名の対象のうち１０名以下が中間解析の時点で客観的奏効を達成する場合、最終解析の時点で７６名の対象のうち少なくとも２９名の応答者を有するベイジアン予測確率は５％未満である。３９人目の対象者が登録された時点で少なくとも１１名の応答者がいる場合（中央検査室の画像分析に基づく）、登録を継続するための最小基準が満たされているため、スクリーニング及び登録は停止されない。ＣＴＸ１１０に対する真の奏効率が標準ケアと変わらない場合、この解析の時点で無益な治療を中止する可能性は６０．１％である。
９．５． 計画されている解析方法
有効性の一次解析は、試験のパートＢのＦＡＳのすべての対象が、ＣＴＸ１１０注入の３ヶ月後に応答を判定する機会を有した後に行われる。最終解析は、すべての対象が本試験を完了するかまたは中止したときに行われる。
適切な動態、人口統計、ベースライン、有効性、及び安全性のパラメータについて表にまとめる。特に指定のない限り、すべてのデータについて対象ごとのリストを示す。
９．５．１ 有効性解析
すべての解析（中間及び一次）のＯＲＲの主要評価項目は、ＦＡＳにおける疾患判定の独立した中央検査室の分析に基づく。最初に拡大コホートの強化されたサブセットで検査された帰無仮説を使用して階層テストを行い、その後、最初のステップで帰無仮説が棄却された場合、拡大コホート全体で検査を行う。
ＯＲＲの感度解析を実施できる。ＮＨＬの場合、Ｌｕｇａｎｏ応答基準（Ｃｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１４）が使用され、ＯＲＲは、ＣＲ率＋ＰＲ率を指す（表１３及び１４）。
客観的奏効率は、正確な９５％信頼区間の割合としてまとめる。ＤＯＲ、ＤＯＣＢ、ＴＦＦＳ、全生存期間などの事象発生までの時間変数については、カプラン・マイヤー法を使用して９５％信頼区間の中央値を計算する。
９．５．２ 安全性解析
ＣＴＸ１１０、ＬＤ化学療法、及び／またはダラツムマブを受けるすべての対象は、安全性解析セットに含まれる。臨床ＡＥは、ＣＴＣＡＥバージョン５に従ってグレード分けされるが、ＣＲＳは、Ｌｅｅ基準に従ってグレード分け（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）され、神経毒性は、ＩＣＡＮＳに従ってグレード分けされる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＣＴＣＡＥ、及びＧｖＨＤは、ＭＡＧＩＣ基準に従ってグレード分けされる（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＡＥ、ＳＡＥ、及びＡＥＳＩは、試験期間ごとのＡＥ収集が記載されている表３１の間隔に従ってまとめられ、報告される。
治療による有害事象は、ＣＴＸ１１０の初回注入時または注入後に開始するかまたは悪化するＡＥとして定義される。バイタルサインは、記述統計を使用してまとめる。少なくとも１つのＡＥを経験した対象の頻度は、ＭｅｄＤＲＡ用語に従って、身体系及び優先用語によって報告される。各ＡＥについて収集された詳細な情報には、事象の説明、期間、ＡＥが重症であったか、強度、治験薬との関係、取られた処置、臨床転帰、及びＤＬＴであったかを含む。解析では、用量制限として分類されるＡＥに重点が置かれている。
９．５．３． 薬物動態学的及び薬力学的解析
抗ＣＴＸ１１０抗体の発生率、血液中のＣＴＸ１１０ＣＡＲ＋Ｔ細胞のレベル、及び血清中のサイトカインのレベルをまとめる。
９．５．４． バイオマーカー分析
追加のバイオマーカーの調査には、血液細胞、腫瘍細胞、及び他の対象由来の組織の判定を含み得る。これらの判定では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及びそれらの組織に由来する他の生体分子を評価できる。このような評価は、ＣＴＸ１１０に対する対象の応答及び治験薬の作用機序に関連する要因の理解に役立つ。
結果
患者は、本試験に登録されており、全員がＣＴＸ１１０を受けている。用量漸増は、３，０００万個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞（用量レベル１またはＤＬ１）で開始し、用量レベル４（用量レベル４）である最高用量６億個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞まで、約２倍または３倍ずつ漸増させた。用量レベルについては、上記の表１６を参照のこと。
以下に提供するのは、２８日以上のフォローアップ期間における２６名の患者から得た追加の有効性及び安全性の結果である。その中で、３名の患者がＤＬ１投与を受け、３名がＤＬ２投与を受け、６名がＤＬ３投与を受け、６名がＤＬ３．５投与を受け、８名がＤＬ４投与を受けた。これらの患者はすべて、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ ＮＯＳ、高悪性度リンパ腫（トリプルヒットなど）、または形質転換濾胞性リンパ腫など）を有し、ベースラインの腫瘍体積が大きく、疾患負荷が高い。これらの患者はすべて再発及び難治性患者であり、これには、抗がん療法のいずれにもこれまで応答がなかった原発性難治性患者を含む。患者は、急速に進行する疾患の病歴を有し、２つ以上の治療ラインの治療法で進行し、最初のリンパ腫治療から９ヶ月以内にＣＴＸ１１０を受けた患者の３１％を含む。
２６名の患者のベースライン患者特性を以下の表３２に示す：
本試験に参加したすべての患者は、１４日以内にステージ１（適格性スクリーニング）を完了し、少なくとも１名の対象が２日以内にステージ１を完了した。適格基準を満たした少なくとも１名の対象が、ステージ１の完了から２４時間以内にリンパ球枯渇療法を開始した。
適格なすべての対象がスクリーニング期間（ステージ１）を完了し、１５日未満でＬＤ化学療法を受け、少なくとも１名の患者は、スクリーニングを完了し、７２時間以内にＬＤ化学療法の投与を開始した。すべての患者は、登録の中央値２日以内にＬＤ化学療法を開始した。
ＬＤ化学療法を受けているすべての対象は、ＬＤ化学療法の完了後２～７日以内にＣＴＸ１１０の投与に進んだ。これらの患者から得られたこれまでの結果を以下にまとめる。
有効性
治療に対する完全奏効を達成した患者のパーセンテージは、用量の増加と共に増加している。以下の表３３を参照のこと。ＣＴＸ１１０により治療された患者の腫瘍減少レベルについては、図２２も参照のこと。
ＤＬ２以上の用量を投与された患者では、約６０％が全奏効（ＯＲＲ）を示し、約４０％が完全奏効（ＣＲ）を示した。ＣＴＸ１１０以外のいかなる追加の全身がん療法を受けることなく、６ヶ月の時点で完全奏効したすべての患者は現在まで生存しており、Ｘ線写真による疾患のエビデンスを有しない。
一例では、ＤＬＢＣＬを有し、自家ＳＣＴを含むこれまでの２つの治療ラインの治療法の後に再発した女性患者は、ＤＬ３でＣＴＸ１１０により治療され、単回投与後２８日目に腫瘍が見えずに、完全奏効を示した。完全奏効は、１２ヶ月以上継続している。この患者は、ＣＴＸ１１０注入後に発熱、ＣＲＳ、またはＩＣＡＮＳを示さなかった。
安全性プロファイル
また、ＣＴＸ１１０は、すべての用量レベルにおいて忍容性が高いことも判明した。以下の表３４を参照のこと。
ＣＴＸ１１０注入後の重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、治療を受けた患者の疾患の進行とは関係ない：ＩＣＡＮＳ（Ｎ＝１）、ＣＲＳ（Ｎ＝１）、眼窩周囲蜂窩織炎（Ｎ＝１）、発熱性好中球減少症（Ｎ＝１）。
安全性の結果の概要を以下に示す（再投与した患者を含む）
・ＧｖＨＤなし
・グレード２を超えるＣＲＳはなく、グレード２を超えるＩＣＡＮＳは１例のみ
・低い感染率
・ＨＨＶ６感染によるウイルス性脳炎と４日間で解消したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌による敗血症を示した患者は２名のみであった
ＣＴＸ１１０の薬物動態プロファイルを調査した。ＤＬ２以上を投与された患者では、すべての患者において、ＣＡＲ－Ｔ細胞が複数の時点で検出された。注入の約８日後、末梢血において一貫したピーク拡大が観察された。再投与された患者でも同様の拡大が観察された。多くの患者では、末梢血群のＣＴＸ１１０レベルは、３～４週間でｄｄＰＣＲによる検出下限を下回る。図２３を参照。
ＣＴＸ１１０の薬物動態プロファイルでは、約１ヶ月でのＣＴＸ１１０の強化用量が裏付けられる（例えば、上記のコホートＡまたはコホートＢを参照）。例えば、ＣＴＸ１１０は、明確な用量応答を示し、より高いエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比でより良い応答が達成される。図２４Ａ及び図２４Ｂ。そのため、強化は、良好なＥ：Ｔ比で２ラウンド目の腫瘍死滅を生じさせ、深く持続的な応答を増加させる可能性を有する。
再投与
少なくとも３名の対象が、ＤＬ３のＣＴＸ１１０の２回目の投与により再投与を受けた。１名の対象はＤＬＢＣＬを有し、最初はＤＬ２で治療を受け、ＣＲを達成した。対象は、ＣＴＸ１１０の初回注入から約６ヶ月後に進行性疾患を経験し、ＤＬ３で再投与を受けた。対象は、２回目の投与の前に、標準的なリンパ球枯渇化学療法（例えば、フルダラビン及びシクロホスファミド）を受けた。対象は、２回目の投与後にＰＥＴ／ＣＴによりＰＲを達成した。２人目の対象も２８日目にＰＲを達成した。１回目または２回目の投与のいずれでも、発熱、ＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ、またはＧｖＨＤは観察されなかった。これらの結果は、ＣＴＸ１１０の追加用量が安全に投与され得、臨床応答を生み出すことができることを示している。
ステージＩＶのＤＬＢＣＬ（ＮＯＳ）を有し、これまでの治療ラインの治療法（Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＧＤＰ）の両方に対して難治性の１名の男性患者は、ＤＬ２でＣＴＸ１１０の初回注入を受け、２８日目にＣＲを達成したが、約７ヶ月で進行した。この患者は、ＤＬ３でＣＴＸ１１０の２回目の注入を受け、２８日目にＣＲを達成した。この患者は、現在まで完全奏効している。ＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ、またはいずれの注入にも特に注目すべき他の有害事象は観察されなかった。
結論
まとめると、ＣＴＸ１１０を含むこの臨床試験の結果は、用量反応の初期のエビデンスを示す。
ＤＬＢＣＬを有する２４名の患者のデータは、以下を示した：（ａ）承認された自家ＣＡＲ－Ｔ療法（ＹＥＳＣＡＲＴＡ（登録商標）、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）、及びＫＹＭＲＩＡＨ（登録商標）を含む）よりも優れている、または類似しているＩＴＴ（ｉｎｔｅｎｔ－ｔｏ－ｔｒｅａｔ）有効性（例えばＯＲＲ、ＣＲ、及び６ヶ月のＣＲ）、及び（ｂ）承認された自家ＣＡＲ－Ｔ療法と比較して、グレード３＋及び全体的にＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ、及び感染の発生率がはるかに低い差別化された安全性プロファイル。
免疫回避のために操作されたＣＴＸ１１０と一致して、より毒性の高いリンパ球枯渇剤を使用することなく、これらの応答が達成された。登録されたすべての患者は、迅速に治療された。ブリッジング化学療法を追加する必要なく、かつ製造失敗のリスクがない。応答は、異なるドナーから製造された複数の製品ロットで見られた。これらの結果は、本明細書に開示されているＣＲＩＳＰＲ編集同種他家ＣＡＲ－Ｔアプローチの妥当性を検証するものである。
他の実施形態
本明細書に開示される特徴はすべて、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
上述の説明から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途及び状況に適合するように、本発明に種々の変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
均等物
本明細書ではいくつかの発明の実施形態を説明し、図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行し、及び／または結果及び／または利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／または構造を容易に想起するであろう。そのような変形及び／または修正のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内にあることが意図される。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されたすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途（複数可）に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に説明され、特許請求された以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾していない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明範囲内に含まれる。
本明細書で定義され、使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書の定義、及び／または定義された用語の通常の意味を制御するものと理解されるべきである。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、及び特許出願は、場合によっては文書全体を包含し得る、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれる。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲において、本明細書で使用される「及び／または」という句は、そのように結合されている要素（すなわち、ある場合には結合して存在し、他の場合には分離して存在する要素）の「いずれかまたは両方」を意味することを理解するものとする。「及び／または」で列挙された複数の要素は、同じように解釈されるものとする。すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」である。「及び／または」句によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別される要素に関連するか否かにかかわらず、任意により存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意により、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意により、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意により、他の要素を含む）、などを指すことができる。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「または」は、上記で定義した「及び／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は包括的であると解釈されるものとし、すなわち、複数の要素または要素のリストのうちの少なくとも１つ（１つより多いことを含む）、及び任意により、追加の列挙されていない項目を含むものと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」など、反対に明確に示される用語のみが、複数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」などの排他的用語が前に付いている場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であり、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これらは、値を測定する、または決定する方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例により、許容可能な標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、さらにより好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の、好ましくは２倍以内の桁内を意味することが可能である。出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗示的であり、この文脈では、特定の値の許容誤差範囲内であること意味する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関して、「少なくとも１つの」という句は、要素のリスト内の要素のうちの任意の１つ以上から選択された少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されている要素を少なくともそれぞれ１つ必ずしも含むものではなく、要素のリスト内の要素のいずれかの組み合わせを除外するものでもないことを理解するべきである。この定義により、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するか否かに関係なく、任意に存在し得ることが可能になる。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、以下を指すことができる。一実施形態では、少なくとも１つ、任意により２つ以上などのＡであり、Ｂ（及び任意によりＢ以外の要素など）は存在せず、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意により２つ以上などのＢであり、Ａ（及び任意によりＡ以外の要素など）は存在せず、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意により２つ以上などのＡ、及び少なくとも１つの、任意により２つ以上などのＢ（及び任意により他の要素など）、など。
また、明確に反対のことが示されない限り、２つ以上のステップまたは行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

Claims (62)

  1. ヒト患者におけるＢ細胞悪性腫瘍を治療するための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者をリンパ球枯渇治療に供するステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の初回用量を前記ヒト患者に投与するステップと、を含み、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、（ａ）ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＴ細胞を含み、
    前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、約１．０×１０７～約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で前記ヒト患者に投与される、前記方法。
  2. 前記ＣＡＲが、配列番号５１で表される重鎖可変領域におけるものと同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号５２で表される軽鎖可変領域におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、（ｂ）破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、及び／または（ｃ）破壊されたベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、（ｂ）破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、及び（ｃ）破壊されたベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
  5. ステップ（ｉ）の前記リンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００～７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量が、約３×１０７、約１×１０８、約３×１０８、約４．５×１０８、約６×１０８、または約９×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量が、約３．５×１０８～約９×１０８、任意により約３．５×１０８～約６×１０８の用量で前記ヒト患者に投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量が、約４．５×１０８、約６×１０８、または約７．５×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で前記ヒト患者に投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. ステップ（ｉ）の前記リンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００／ｍ２／日～約７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ステップ（ｉ）の前に、前記ヒト患者が以下の特徴のうちの１つ以上を示さない、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）臨床状態の著しい悪化、
    （ｂ）９１％を超える飽和レベルを維持するための酸素補給の必要性、
    （ｃ）制御されていない心不整脈、
    （ｄ）昇圧剤によるサポートを必要とする低血圧、
    （ｅ）活動性感染、及び
    （ｆ）グレード２以上の急性神経毒性。
  11. ステップ（ｉ）が、ステップ（ｉｉ）の約２～７日前に実施される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ステップ（ｉ）の後、及びステップ（ｉｉ）の前に、前記ヒト患者が以下の特徴のうちの１つ以上を示さない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）制御されていない活動性感染、
    （ｂ）ステップ（ｉ）の前の臨床状態と比較して臨床状態が悪化している、及び
    （ｃ）グレード２以上の急性神経毒性。
  13. （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）後の急性毒性の発生について前記ヒト患者を監視するステップと、（ｉｖ）出現した場合に前記急性毒性を管理するステップと、をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ステップ（ｉｉｉ）が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量の投与後、少なくとも２８日間実施される、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記急性毒性が、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、Ｂ細胞形成不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、血球減少症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、高血圧、腎不全、ウイルス性脳炎、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
  16. 任意に前記ヒト患者が進行性疾患（ＰＤ）を示した後、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の１つ以上のその後の用量を前記ヒト患者に投与することをさらに含み、前記ヒト患者は、これまでに応答を示していた、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団のその後の投与前の２～７日以内にリンパ球枯渇治療を受ける、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ヒト患者が著しい血球減少を呈し、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団のその後の投与の前に、リンパ球枯渇治療を受けない、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫であり、任意により、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／またはＢＣＬ６の再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、及びグレード３ｂ ＦＬからなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ＤＬＢＣＬは、ＤＬＢＣＬ非特異型（ＮＯＳ）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ヒト患者が、フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）陽性である少なくとも１つの測定可能な病変を有する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、難治性及び／または再発性である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ヒト患者が、これまでに１つ以上の治療ラインの抗がん療法を受けている、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ヒト患者が、これまでに２つ以上の治療ラインの抗がん療法を受けている、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記これまでの抗がん療法が、抗ＣＤ２０抗体、アントラサイクリン含有レジメン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ヒト患者が、難治性または再発性の形質転換ＦＬを有し、ＤＬＢＣＬへの形質転換後の疾患に対して少なくとも１つの治療ラインの化学療法を受けている、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、難治性であり、前記ヒト患者は、最終治療において進行性疾患を有するか、または少なくとも２サイクルの治療法後に安定疾患を有し、安定疾患の持続期間は、最大６ヶ月である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ヒト患者は、これまでの自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が奏効しなかったか、またはこれまでの自家ＨＳＣＴに不適格である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団による治療後に追加の抗がん療法を受ける、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ヒト患者が、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス０または１を有する、
    （ｂ）腎臓、肝臓、心臓、及び／または肺機能が適切である、
    （ｃ）これまでに遺伝子療法または改変細胞療法を受けていない、
    （ｄ）これまでに抗ＣＤ１９抗体を含む治療を受けていない、
    （ｅ）これまでに同種他家ＨＳＣＴを受けていない、
    （ｆ）脳脊髄液からの検出可能な悪性腫瘍細胞がない、
    （ｇ）脳転移がない、
    （ｈ）これまでに中枢神経系障害がない、
    （ｉ）不安定狭心症、不整脈、及び／または心筋梗塞がない、
    （ｊ）制御されていない感染がない、
    （ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全障害または自己免疫疾患がない、
    （ｌ）ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに感染していない。
  31. ステップ（ｉ）の前記リンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約５００／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量が、少なくとも約３×１０７ＣＡＲ＋Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量の約４～８週間後に、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の用量が投与される、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量の少なくとも約４週間後に安定疾患（ＳＤ）、部分奏効（ＰＲ）、または完全奏効（ＣＲ）を達成する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記２回目の投与前の２～７日以内に２回目のリンパ球枯渇治療を受ける、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ヒト患者が著しい血球減少を呈し、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記２回目の投与の前に、リンパ球枯渇治療を受けない、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
  37. ステップ（ｉ）の前記リンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２及びシクロホスファミド約７５０ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量が、少なくとも約３×１０８ＣＡＲ＋Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
  39. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量の約４～８週間後に、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の２回目の用量が投与される、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記初回用量の少なくとも約４週間後に安定疾患（ＳＤ）、部分奏効（ＰＲ）、または完全奏効（ＣＲ）を達成する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記２回目の投与前の２～７日以内に２回目のリンパ球枯渇治療を受け、前記２回目のリンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者へフルダラビン約３０ｍｇ／ｍ２／日、及びシクロホスファミド約５００ｍｇ／ｍ２／日を３日間同時投与することを含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ヒト患者が著しい血球減少を呈し、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記２回目の投与の前に、リンパ球枯渇治療を受けない、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
  43. 前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも１回の追加投与を受け、任意により、前記ヒト患者が、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団の前記追加投与の前の２～７日以内に３日間、約３０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビン及び約５００ｍｇ／ｍ２／日のシクロホスファミドを前記ヒト患者に同時投与することを含むリンパ球枯渇治療を受ける、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記ヒト患者に投与される前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、１用量あたり７×１０４ＴＣＲ＋Ｔ細胞／ｋｇ以下を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. ＣＤ１９に結合する前記ＣＡＲが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、請求項３～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号２６のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む、請求項３～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の前記欠失部位に挿入される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９～１４で表されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項３～４９のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、同種他家である、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも９０％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、及び／または前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも３０％が、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも９９．５％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％が、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも８５％が、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団中の前記Ｔ細胞の少なくとも７０％が、検出可能なレベルの前記ＣＡＲを発現する、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、静脈内注入によって前記ヒト患者に投与される、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団が低温保存溶液中に懸濁される、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
  62. Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、ＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含み、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法で使用するためのものである、前記医薬組成物。
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