ES2608475T3 - Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2608475T3
ES2608475T3 ES11730118.4T ES11730118T ES2608475T3 ES 2608475 T3 ES2608475 T3 ES 2608475T3 ES 11730118 T ES11730118 T ES 11730118T ES 2608475 T3 ES2608475 T3 ES 2608475T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
cancer
antibodies
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11730118.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Tibor Keler
Henry C. Marsh
Lizhen He
Laura A. Vitale
Lawrence J. Thomas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celldex Therapeutics Inc
Original Assignee
Celldex Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44534592&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2608475(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celldex Therapeutics Inc filed Critical Celldex Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2608475T3 publication Critical patent/ES2608475T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a CD27 humana e induce o mejora una respuesta inmunitaria de linfocitos T, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 38, una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 39, una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 40, una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 44, una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 46.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Anticuerpos que se unen a CD27 humana y usos de los mismos Antecedentes de la invencion
Las interacciones entre linfocitos T y celulas presentadoras de antfgenos implican una variedad de moleculas accesorias que facilitan la generacion de una respuesta inmunitaria. Una de esas moleculas es CD27, que se une a CD70 y pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R) (Ranheim EA et al.. Blood. 1995 June 15;85(12):3556-65). La CD27 normalmente existe como una protefna transmembranaria de tipo I glucosilada frecuentemente en forma de homodfmeros con un puente disulfuro que une los dos monomeros. El puente disulfuro esta en el dominio extracelular cerca de la membrana (Camerini et al., J Immunol. 147:3165-69 (1991). La CD27 tambien puede expresarse en una forma soluble (vease, por ejemplo, van Oers MH, et al., Blood. 1993 Dec 1;82(11):3430-6 y Loenen WA, et al., Eur. J. Immunol. 22:447, 1992). La reticulacion del antfgeno CD27 sobre linfocitos T proporciona una senal coestimuladora que, de comun acuerdo con la reticulacion del receptor de linfocitos T, puede inducir la proliferacion de linfocitos T y la activacion inmune celular.
La CD27 se expresa en timocitos maduros, en la mayorfa de las linfocitos T de sangre periferica de CD4+ y CD8+, linfocitos citolfticos espontaneos y linfocitos B (Kobata T, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Nov 21;92(24):11249-53). La CD27 tambien esta altamente expresada en linfomas no Hodgkin de linfocitos B y leucemias linfocftica cronicas de linfocitos B (Ranheim EA, et al., Blood. 1995 Jun 15;85(12):3556-65). Ademas, se han identificado niveles elevados de protefna CD27 soluble en suero o sitios de actividad de enfermedad en infeccion parasitica, infeccion por citomegalovirus (CMV), sarcoidosis, esclerosis multiple y leucemia linfocftica cronica de linfocitos B (Loenen Wa, et al., Eur. J. Immunol. 22:447, 1992).
SAKANISHI et al: "Anti-tumor effects of depleting and non-depleting anti-CD27 monoclonal antibodies in immune- competent mice" (BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 393, no. 4, 19 de marzo de 2010, paginas 829-835) informa de la generacion de novedosos anticuerpos monoclonales supresores y no supresores contra de raton, y caracterizacion de su actividad co-estimuladora in vitro y efectos antitumorales en ratones inmunocompetentes portadores de linfoma singenico de linfocitos T (EG7) que expresa o carece de CD27.
RAMAKRISHNA et al: "In vitro characterization of novel anti-CD27 humana mAbs" (JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 184, 1 de abril de 2010, pagina 87.23) informa de la caracterizacion in vitro de diversos anticuerpos anti-CD27 humana, que incluyen su union a diversos tipos de celulas y que bloquean la union a CD70 soluble.
Se ha demostrado recientemente que los anticuerpos monoclonales agonistas contra CD27 promueven respuestas de linfocitos T y prometen como terapeuticos contra el cancer (vease, por ejemplo, T, et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 2010 Feb 18 y el documento WO 2008/051424). Sin embargo, mientras que los resultados obtenidos hasta la fecha establecen que la CD27 es una diana util para inmunoterapia, no se sabe que caracterfsticas particulares de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 son especialmente ventajosas para fines terapeuticos. Como tal, existe una necesidad en la tecnica de una mayor percepcion sobre las propiedades funcionales especfficas que hacen que los anticuerpos anti-CD27 sean terapeuticamente eficaces, ademas de anticuerpos terapeuticos mejorados contra CD27 que sean mas eficaces para tratar y/o prevenir enfermedades.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona, entre otras cosas, anticuerpos anti-CD27 aislados que tienen propiedades funcionales particulares que pueden unirse a efectos terapeuticos ventajosos y deseables. En particular, la presente invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a cD27 humana e induce o mejora una respuesta inmunitaria de linfocitos T, en la que el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 38, una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 39, una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 40, una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende sEq ID NO: 44, una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 45 y una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 46. Especfficamente, se han generado y caracterizado mediante la presente invencion anticuerpos monoclonales anti-CD27 capaces de regular por incremento las respuestas inmunitarias de linfocitos T (por ejemplo, como se demuestra por la induccion o mejora de respuestas de linfocitos T especfficas de antfgeno) que son particularmente adecuadas para la combinacion con terapias de vacuna. En una realizacion, los anticuerpos anti-CD27 agonistas pueden mejorar la respuesta inmunitaria contra canceres o enfermedades infecciosas mediante combinacion con vacunacion activa o mediante la mejora de las respuestas inmunitarias endogenas. Tales anticuerpos tambien pueden inducir, directa o indirectamente, la expresion de citocinas. Ademas, se han generado y caracterizado anticuerpos anti-CD27 que regulan por disminucion las respuestas inmunitarias de linfocitos T, que son particularmente adecuadas para tratar trastornos inmunitarios, tales como rechazo de injerto, alergia y enfermedades autoinmunitarias. Aun mas, se han generado y caracterizado anticuerpos anti-CD27 que inhiben el crecimiento de celulas que expresan CD27 mediante mecanismos directos de destruccion celular (por ejemplo, citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC)), que son particularmente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
eficaces en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades que implican la proliferacion celular (por ejemplo, canceres).
En una realizacion, los anticuerpos anti-CD27 de la presente invencion presentan una o mas de las siguientes propiedades:
(a) bloquean la union de sCD70 a CD27 al menos aproximadamente el 70 % a una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml;
(b) se unen a CD27 humana con una constante de disociacion en equilibrio Kd de 10-9 M o menos o, alternativamente, una constante de asociacion en equilibrio Ka de 10+9 M-1 o mayor;
(c) inducen citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) especffica de celulas que expresan CD27 al menos el 10 % a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml y aproximadamente el 6 % de complemento de suero de conejo;
(d) inducen lisis especffica de citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC) de celulas que expresan CD27 al menos el 10 % a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml y relacion de celulas efectoras:diana de 75:1;
(e) mejoran la mediana de la supervivencia al menos el 20 % en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) despues de la inoculacion con celulas tumorales in vivo (5 x 105 celulas Raji o 1 x 106 celulas Daudi) cuando se administran a 0,3 mg (i.p.) al menos dos veces a la semana durante 3 semanas en comparacion con los ratones a los que no se les administra anticuerpo;
(f) inducen o mejoran respuestas inmunitarias especfficas de antfgeno en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
(g) inducen o mejoran respuestas inmunitarias TH1 especfficas de antfgeno en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
(h) inducen o mejoran la proliferacion o activacion de linfocitos T especfficos de antfgeno en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
(i) reducen o inhiben la proliferacion o activacion de linfocitos T;
(j) inducen o mejoran la actividad de linfocitos T cuando se combina con activacion simultanea, separada o consecutiva de TCR;
(k) bloquean la union de sCD70 a CD27 al menos aproximadamente el 70 % a una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml y reducen o inhiben la actividad de linfocitos T cuando no son capaces de unirse a receptores Fc o que tienen union reducida a los mismos;
(l) producen menos del 50 % de reduccion de linfocitos T CD3+ (distintos de NK) en macacos cuando se administran a 3 mg/kg (i.v.) durante el perfodo de 29 dfas inmediatamente tras la administracion o
(m) producen menos del 50 % de reduccion de linfocitos B de memoria en macacos cuando se administran a 3 mg/kg (i.v.) durante el perfodo de 29 dfas inmediatamente tras la administracion.
En una realizacion particular, los anticuerpos de la invencion presentan combinaciones de estas propiedades funcionales.
Por consiguiente, en un aspecto, los anticuerpos anti-CD27 de esa invencion inducen y/o mejoran una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria de linfocitos T). En una realizacion adicional, los anticuerpos inhiben la union de CD70 a CD27 en las celulas. Anticuerpos particulares que tienen estas combinaciones de propiedades incluyen mAb 1F5 que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 37 y/o 43, respectivamente). Alternativamente, los anticuerpos descritos en el presente documento no inhiben la union de CD70 a CD27 en las celulas. Anticuerpos particulares que tienen estas combinaciones de propiedades incluyen mAb 3H8 que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 7 y/o 13, respectivamente o 7 y/o 19, respectivamente). Tales anticuerpos anti-CD27 tambien pueden unirse a una segunda molecula (por ejemplo, como una molecula biespecffica) que tiene una especificidad de union que es diferente de la del anticuerpo, tal como un receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD3, CD25, CD137, CD154) o un receptor Fc (por ejemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIBI (CD32), FcyRIIB2 (CD32), FcyRIIIA (CD16a), FcyRIIIB (CD16b), FceRI, FceRII (CD23), FcaRI (CD89), Fca/pR y FcRn) o un receptor de NK (por ejemplo, CD56) o un receptor de linfocitos B (por ejemplo, CD19, CD20).
Anticuerpos previstos para ser usado para la induccion o mejoramiento de respuestas inmunitarias segun la presente invencion pueden tener un dominio funcional Fc que permite la union a receptores Fc, y pueden incluir un dominio Fc mutado que tiene niveles elevados de union a los receptores Fc.
En otro aspecto, los anticuerpos anti-CD27 de la invencion regulan por disminucion las respuestas inmunitarias de linfocitos T inhibiendo la union de CD27 a CD70 en celulas que expresan estas protefnas. En una realizacion particular, los anticuerpos inhiben la union de CD70 soluble (sCD70) a CD27 que expresan celulas al menos aproximadamente el 70 %. Anticuerpos particulares que se encuentran dentro de esta clase incluyen, por ejemplo, mAb que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs:37 y/o 43 (mAb 1F5). Otros anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, mAb que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 49 y/o 55 (mAb 1H8), o SEQ ID NOs: 103 y/o 109 (mAb 3H12).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otro aspecto mas, los anticuerpos anti-CD27 de la invencion inducen o mejoran la funcion de celula efectora (por ejemplo, destruccion celular mediante tanto ADCC y/o CDC). En una realizacion, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 30 % de lisis especffica de celulas que expresan CD27 mediante ADCC a una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml y/o induce al menos aproximadamente el 30 % de CDC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml. Anticuerpos particulares que se encuentran en esta clase que presentan funcion efectora de ADCC incluyen, por ejemplo, mAb que comprende secuencias de la region variable de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs:37 y/o 43 (mAb 1F5). Otros anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, mAb que comprenden secuencias de region variable de cadena pesada y/o ligera que comprenden las SEQ ID NOs: 61 y/o 67 (mAb 1G5), SEQ ID NOs: 85 y/o 91, 85 y/o 97 (mAb 3A10), SEQ ID NOs: 7 y/o 13, 7 y/o 19 (mAb 3H8), SEQ ID NOs: 49 y/o 55 (mAb 1H8), o SEQ ID NOs: 103 y/o 109 (mAb 3H12). En una realizacion adicional, el anticuerpo tambien inhibe la union de CD70 a CD27 en las celulas. Anticuerpos particulares que tienen estas combinaciones de funciones incluyen, por ejemplo, mAb que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las sEq ID NOs: 37 y/o 43 (mAb 1F5). Otros anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, mAb que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 49 y/o 55 (mAb 1h8), SEQ ID NOs: 103 y/o 109 (mAb 3H12). Alternativamente, el anticuerpo descrito en el presente documento induce ADCC y/o CDC como se ha descrito anteriormente, pero no inhibe la union de CD70 a CD27 en las celulas. Anticuerpos particulares descritos que tienen estas caracterfsticas incluyen, por ejemplo, mAb que comprende secuencias de la region variable de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 61 y/o 67 (mAb 1G5), SEQ ID NOs: 85 y/o 91, 85 y/o 97 (mAb 3A10), SEQ ID NOs: 7 y/o 13, 7 y/o 19 (mAb 3H8).
Tambien pueden construir anticuerpos anti-CD27 capaces de inducir o mejorar la funcion de celula efectora (por ejemplo, ADCC y/o CDC) para incluir una region Fc que contribuye adecuadamente a la especificidad de union por un receptor Fc especifico (por ejemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIB (CD32), FcyRIIB2 (CD32), FcyRIIIA (CD16a), FcyRIIIB (CD16b), FcsRI, FcsRII (CD23), FcaRI (CD89), Fca/pR y FcRn).
La presente invencion tambien proporciona el anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento de un cancer seleccionado de leucemia, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, eritroleucemia monocftica mielomonocftica promielocftica de mieloblastos, leucemia cronica, leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, linfoma policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores solidos, sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de colon, carcinoma colorrectal, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vfas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cancer de cuello uterino, cancer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de pulmon no de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofarfngeo, carcinoma esofagico, carcinoma de celulas basales, cancer de las vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos, cancer de cerebro y sistema nervioso central (SNC), cancer de cuello uterino, coriocarcinoma, canceres colorrectales, cancer de tejido conjuntivo, cancer del aparato digestivo, cancer endometrial, cancer de esofago, cancer de ojo, cancer de cabeza y cuello, cancer gastrico, neoplasia intraepitelial, cancer de rinon, cancer de laringe, cancer de hfgado, cancer de pulmon (de celulas pequenas, de celulas grandes), melanoma, neuroblastoma; cancer de cavidad bucal (por ejemplo, labios, lengua, boca y faringe), cancer de ovarios, cancer pancreatico, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer rectal; cancer del aparato respiratorio, sarcoma, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer uterino y cancer del aparato urinario. Se describe en el presente documento un metodo para mejorar una respuesta inmunitaria contra un antfgeno en un sujeto en necesidad del mismo administrando al sujeto: i) un anticuerpo anti- CD27 y ii) un antfgeno, en el que el anticuerpo anti-CD27 se administra por separado de y antes de administrar el antfgeno.
Normalmente, en un metodo tal, el anticuerpo anti-CD27 puede administrarse entre al menos 2 y 96 horas antes del antfgeno. Por ejemplo, en un metodo tal, el anticuerpo anti-CD27 puede administrarse al menos 2 horas antes del antfgeno, por ejemplo, al menos 12 horas antes del antfgeno, adecuadamente al menos 24 horas antes del antfgeno, al menos 48 horas antes del antfgeno o al menos 72 horas antes del antfgeno, en el que el agonista de TLR es un agonista de TLR3.
Tambien se describe un metodo de mejoramiento de una respuesta inmunitaria contra un antfgeno en un sujeto en necesidad del mismo administrando simultaneamente, por separado o secuencialmente al sujeto: i) un anticuerpo anti-CD27; ii) un agonista de TLR; y iii) opcionalmente, el antfgeno.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En un caso preferido de un metodo tal, el agonista de TLR es un agonista de TLR3, por ejemplo, pero no se limita a, Poly IC:LC.
Las celulas que expresan CD27 incluyen todas y cada una de las celulas que expresan CD27, que incluyen, pero no se limitan a, linfocitos B, linfocitos NK y linfocitos T. En un caso particular, las celulas que expresan cD27 incluyen lfneas celulares de cancer tales como celulas Jurkat, celulas Raji, celulas Ramos y celulas Daudi. En otro caso, las celulas que expresan CD27 son celulas tumorales o celulas cancerosas. En otro caso, las celulas que expresan CD27 incluyen linfocitos B, linfocitos NK y linfocitos T que incluyen linfocitos T que se encuentran infiltrando tumores, tambien denominados linfocitos infiltrantes de tumores.
Anticuerpos particulares descritos en el presente documento comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera que utilizan lfneas germinales humanas particulares, es decir, estan codificados por los genes de lfneas germinales, pero incluyen reordenaciones y mutaciones geneticas, por ejemplo, mutaciones somaticas, que se producen durante la maduracion de anticuerpos. En un caso, la region variable de cadena pesada de los anticuerpos deriva de un gen 3-7 o 3-33 de la lfnea germinal humana. En otros casos, la region variable de cadena ligera del anticuerpo deriva de un gen 3- 20, 3-11, 24, 1D-16 o 1-13 de la lfnea germinal humana. En una realizacion particular, la region variable de cadena pesada del anticuerpo deriva de un gen Vh 3-7 o Vh 3-33 de la lfnea germinal humana y la region variable de cadena ligera del anticuerpo deriva de un gen Vk 3-20, Vk 3-11, Vk 1D-16 o Vk 1-13 de la lfnea germinal humana.
Una secuencia de lfnea germinal Vh 3-33 se proporciona (N.° de acceso de Genbank AAP44382) de la siguiente manera:
1 vqlvesgggv vqpgrslrls caasgftfst ygmhwvrqap gkglewvaii wfdgsntyya 61 dsvrgrftis rdssrktlyl emkslrvedt avyycak (SEQ ID NO: 3)
Una secuencia de lfnea germinal Vh 3-7 se proporciona (N.° de acceso de Genbank AAP44389) de la siguiente manera:
1 vqlvesgggl vqpggslrls caasgftfsn symtwvrqap gkglewvani kpdgsdknyi 61 nsvrgrftis rdnaekssyl qmnslraedt aiyycvt (SEQ ID NO:4)
En otro caso, la secuencia de region variable de cadena pesada CDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10, 28, 40, 52, 64, 76, 88, 106 y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoacidos). Los anticuerpos pueden incluir ademas una secuencia de region variable de cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 16, 22, 34, 46, 58, 70, 82, 94, 100, 112 y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas. En otro caso, las secuencias de cadena pesada CDR2 y CDR1 se seleccionan de SEQ ID NOs: 9, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 105 y SEQ ID NOs: 8, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 104, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas. Las secuencias de cadena ligera CDR2 y CDR1 se seleccionan de SEQ ID NOs: 15, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 99, 111 y SEQ ID NOs: 14, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 98, 110, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas.
En otra realizacion adicional, la invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une a CD27 e incluye
una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 38; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 39; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 40; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 44; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 45; y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 46.
Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo aislado que se une CD27 e incluye secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 variables de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 50; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 51; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 52; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 56; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 57;
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 58; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma;
(ii) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 104; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 105; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 106;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 110; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 111;
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 112; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma;
(iii) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 86; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 87; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 88; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 92 o 98; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 93 o 99; una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 94 o 100; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma;
(iv) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 26; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 27; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 28; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 32;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 33;
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 34; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma;
(v) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 74; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 75; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 76; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 80; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 81;
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 82; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma;
(vi) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 8; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 9; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 10; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 14 o 20; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 15 o 21; una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 16 o 22; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma; y
(vii) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 62; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 63; una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 64; una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 68;
una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 69;
una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 70; o modificaciones de secuencia conservativas de la misma.
En otro caso, la secuencia de region variable de cadena pesada CDR3 comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: R (G,E,D) (S,L,G,- ) (G,L,T,W, - ) (N,A,T,H,- ) (V,T,-) (M,P,-) (G,V,- ) (R, -) (G,M, -) (D,H,L,T,W) (A,G,N,W) (D,F,V,Y) (F,L) (D,E) (H,I,L,Y) (SEQ ID NO: 113), en las que "-" indica la opcion de que no este presente resto de aminoacido en esa posicion consenso. Los anticuerpos pueden incluir ademas una secuencia de region variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: Q (F,R,Y) (N,S) (N,T,S) (Y,W) P (F,L,P,R) T (SEQ ID NO: 114), en las que "-" indica la opcion de que no este presente resto de aminoacido en esa posicion consenso. En otro caso, la secuencia de region variable de cadena pesada CDR2 comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: I (K,W) (Y,N,Q) D G S (E,N) (K,Q) (SEQ ID NO: 115), en las que "-" indica la opcion de que no este presente resto de aminoacido en esa posicion consenso, y la secuencia de region variable de cadena ligera CDR2 comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: (A,D) A S (SEQ ID NO: 116). En otro caso, la secuencia de region variable de cadena pesada CDR1 comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: G F (T,S) (F,L) (S,N) (I,S,H) (Y,h) (SEQ ID NO: 117); y la secuencia de region variable de cadena ligera CDR1 comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de la secuencia consenso: Q (D,G,S) (I,V) (D,S) (R,S) (A,W,Y) (SEQ ID NO: 118).
En otro caso, anticuerpos aislados descritos en el presente documento se unen a CD27 humana e incluyen una region variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 6, 7, 24, 25, 36, 37, 48, 49, 60, 61, 72, 73, 84, 85, 102, 103, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas. El anticuerpo puede incluir ademas una region variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 12, 13, 18, 19, 30, 31, 42, 43,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
54, 55, 66, 67, 78, 79, 90, 91, 96, 97, 108, 109, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas.
Una realizacion todavfa adicional, anticuerpos aislados de la invencion se unen a CD27 humana e incluyen una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera que incluye las secuencias de aminoacidos; SEQ ID NOs: 37 y/o 43, respectivamente.
Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo aislado que se une a CD27 humana e incluyen una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera que incluyen las secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NOs: 49 y/o 55, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
(b) SEQ ID NOs: 103 y/o 109, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
(c) SEQ ID NOs: 85 y/o 91 y/o 97, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
(d) SEQ ID NOs: 25 y/o 31, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
(e) SEQ ID NOs: 73 y/o 79, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
(f) SEQ ID NOs: 7 y/o 13 y/o 19, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas; y
(g) SEQ ID NOs: 61 y/o 67, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas;
Anticuerpos aislados que incluyen regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 %, o mas identidad de secuencia con SEQ ID NOs: 37 y 43 o SEQ ID NOs: 35 y 41 tambien estan incluidos en la presente invencion. Intervalos intermedios a los valores anteriormente citados, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos el 90-95 % o el 95-100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NOs: 37 y 43 o SEQ iD NOs: 35 y 41 tambien pretenden estar englobados por la presente invencion.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos aislados que compiten para unirse a CD27 con los anticuerpos de la invencion. Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo que compite para unirse a CD27 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43, SEQ ID NOs: 49 y 55, SEQ ID NOs: 103 y 109, SEQ ID NOs: 85 y 91, SEQ ID NOs: 85 y 97, SEQ ID NOs: 25 y 31, SEQ ID NOs: 73 y 79, SEQ ID NOs: 7 y 13, SEQ ID NOs: 7 y 19, SEQ ID NOs: 61 y 67, respectivamente, o secuencias de aminoacidos al menos el 80 % identicas a las mismas. En otro caso, el anticuerpo compite para unirse a CD27 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43 (1F5), SEQ ID NOs: 49 y 55 (1H8) o SEQ ID NOs: 103 y 109 (3H12). En otro caso, el anticuerpo compite para unirse a CD27 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 25 y 31 (2C2), SEQ ID NOs: 7 y 13 (3H8), SEQ ID NOs: 7 y 19 (3H8), SEQ ID NOs: 61 y 67 (1G5) o SEQ ID NOs: 73 y 79 (2 g9). En otro caso mas, el anticuerpo compite para unirse a CD27 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 85 y 91 (3A10) o SEQ ID NOs: 85 y 97 (3A10).
Otros anticuerpos descritos en el presente documento se unen a un epitope sobre CD27 reconocido por los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro caso particular, el anticuerpo se une a un epitope sobre CD27 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43, SEQ ID NOs: 49 y 55, SEQ ID NOs: 103 y 109, SEQ ID NOs: 85 y 91, SEQ ID NOs: 85 y 97, SEQ ID NOs: 25 y 31, SEQ ID NOs: 73 y 79, SEQ ID NOs: 7 y 13, SEQ ID NOs: 7 y 19, SEQ ID NOs: 61 y 67, respectivamente, o secuencias de aminoacidos al menos el 80 % identicas a las mismas. En otro caso, el anticuerpo se une a un epitope sobre CD27 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43 (1F5), SEQ ID NOs: 49 y 55 (1H8) o SEQ ID NOs: 103 y 109 (3H12). En otro caso, el anticuerpo se une a un epitope sobre CD27 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 25 y 31 (2C2), SEQ ID NOs: 7 y 13 (3H8), SEQ ID NOs: 7 y 19 (3H8), SEQ ID NOs: 61 y 67 (1G5) o SEQ ID NOs: 73 y 79 (2 g9). En otro caso mas, el anticuerpo se une a un epitope sobre CD27 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 85 y 91 (3A10) o SEQ ID NOs: 85 y 97 (3A10).
Los anticuerpos de la invencion pueden ser de longitud completa, por ejemplo, cualquiera de los siguientes isotipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos tales como una porcion de union al antfgeno o un anticuerpo monocatenario (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv, un fragmento Fv de cadena unica, una region determinante de complementariedad (CDR) aislada o una combinacion de dos o mas CDR aisladas). Los anticuerpos pueden ser cualquier tipo de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanos, humanizados y quimericos.
Los antfgenos de tumor empleados por la presente invencion (por ejemplo, en una vacuna, usada en combinacion con un anticuerpo anti-CD27 de la invencion) incluyen cualquier antfgeno o determinante antigenico que esta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
presente en (o asociado a) una celula tumoral y no normalmente en celulas normales, o un antfgeno o determinante antigenico que esta presente en o asociado a celulas tumorales en cantidades mayores que en las celulas normales (no tumorales), o un antfgeno o determinante antigenico que esta presente en celulas tumorales en una forma diferente que la que se encuentra en celulas normales (no tumorales). Tales antfgenos incluyen antfgenos especfficos de tumor, que incluyen antfgenos de membrana especfficos de tumor, antfgenos asociados a tumor, que incluyen antfgenos de membrana asociados a tumor, antfgenos embrionarios en tumores, receptores del factor de crecimiento, ligandos del factor de crecimiento, y cualquier otro tipio de antfgeno que este asociado al cancer. Un antfgeno de tumor puede ser, por ejemplo, un antfgeno de cancer epitelial (por ejemplo, mama, gastrointestinal, pulmon), un antfgeno prostatico especffico (PSA) de cancer o antfgeno prostatico especffico de membrana (PSMA), un antfgeno de cancer de vejiga, un antfgeno de cancer de pulmon (por ejemplo, pulmon de celulas pequenas), un antfgeno de cancer de colon, un antfgeno de cancer de ovario, un antfgeno de cancer de cerebro, un antfgeno de cancer gastrico, un antfgeno de carcinoma de celulares renales, un antfgeno de cancer pancreatico, un antfgeno de cancer de hfgado, un antfgeno de cancer esofagico, un antfgeno de cancer de cabeza y cuello o un antfgeno de cancer colorrectal. Por ejemplo, el antfgeno puede incluir un antfgeno de tumor, tal como phCG, gp100 o Pmel17, CEA, gp100, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, tirosinasa, telomerasa, SSX2, MUC-1, MAGE-A3 y antfgeno de alto peso molecular asociado al melanoma (HMW-MAA) MART1, melan-A, EGFRvIII, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, WT1, Her2 o mesotelina. Otros antfgenos empleados por la presente invencion (por ejemplo, en una vacuna, usada en combinacion con un anticuerpo anti-CD27 de la invencion) incluyen antfgenos de patogenos de enfermedad infecciosa tales como virus, bacterias, parasitos y hongos, ejemplos de los cuales se desvelan en el presente documento.
La invencion tambien proporciona una molecula biespecffica que comprende el anticuerpo de la invencion unido a una segunda molecula que tiene especificidad de union que diferente de la del anticuerpo, en la que opcionalmente la segunda molecula se une a un receptor Fc, un receptor NK o un receptor de linfocitos T seleccionado de CD3, CD40 y CD25. Por ejemplo, en una realizacion, la segunda molecula puede unirse a CD3 o CD40.
Tambien se proporcionan composiciones que incluyen un anticuerpo o una molecula biespecffica de la invencion, formulada con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En particular, la presente invencion proporciona una composicion que comprende el anticuerpo de la invencion o la molecula biespecffica de la invencion y un vehfculo. Las composiciones pueden incluir ademas un adyuvante, agente inmunoestimulante (por ejemplo, ligando CD40, ligando FLT 3, citocinas, factores estimulantes de colonias, un anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD1, anticuerpo anti-41BB, anticuerpo anti-OX-40, LPS (endotoxina), ARNms, ARNbc, Bacille Calmette-Guerin (BCG), clorhidrato de levamisol, inmunoglobulinas intravenosas y agonista del receptor tipo Toll (TLR) (por ejemplo, agonista de TLR3 tal como Poly IC, un agonista de TLR4, un agonista de TLR5, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 y un agonista de TLR9)), agente inmunosupresor, otro anticuerpo o un antfgeno. Antfgenos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un componente de un patogeno, un antfgeno de tumor (por ejemplo, phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MART 1, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY- CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, MAGE-3, MaGe-A3, tirosinasa, telomerasa, antfgenos SSX2, antfgenos MUC-1 y antfgenos de tumor derivados de celulas germinales), un antfgeno de enfermedad infecciosa (por ejemplo, antfgenos virales, antfgenos bacterianos y parasfticos), un alergeno, o un autoantfgeno. Cualquiera de los antfgenos desvelados en el presente documento puede incluirse en una composicion de la invencion.
Moleculas de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invencion tambien estan englobadas por la invencion, ademas de vectores de expresion que comprenden tales acidos nucleicos y celulas huesped que comprenden tales vectores de expresion. En particular, la presente invencion proporciona un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la region variable de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo de la invencion y una celula transformada con el vector de expresion de la invencion. Por ejemplo, Se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal aislado que se une a CD27 humana, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera codificadas por secuencias de acidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 5 y 11, respectivamente; (b) SEQ ID NOs: 5 y 17, respectivamente; (c) SEQ ID NOs: 23 y 29, respectivamente; (d) SeQ ID Nos: 35 y 41, respectivamente; (e) SEQ ID NOs: 47 y 53, respectivamente; (f) SEQ ID NOs: 59 y 65, respectivamente; (g) SEQ ID NOs: 71 y 77, respectivamente; (h) SEQ ID NOs: 83 y 89, (i) SEQ ID NOs: 83 y 95; (j) SEQ ID NOs: 101 y 107, respectivamente, o secuencias de acidos nucleicos que tienen al menos el 90 % de identidad con las secuencias de acidos nucleicos de (a)-(h).
Tambien se describen en el presente documento metodos de induccion o mejoramiento de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria de linfocitos T, y/o una respuesta mediada por NK y/o una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos B) contra un antfgeno en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa), composicion o molecula biespecffica descrita en el presente documento. Tales metodos son particularmente adecuados para uso en terapias de vacuna.
Los anticuerpos y otras composiciones de la presente invencion tambien pueden usarse para inhibir el crecimiento de celulas que expresan cD27 poniendo en contacto las celulas con un anticuerpo o una composicion en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD27 (por ejemplo, en el tratamiento de canceres). Anticuerpos utiles para inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD27 incluyen anticuerpos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
longitud completa y fragmentos de los mismos, ademas de anticuerpos que contienen una segunda especificidad de union por un receptor Fc. En un caso, las celulas que expresan CD27 se ponen en contacto con un anticuerpo en presencia de celulas efectoras en condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de celulas diana (por ejemplo, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 40 % de lisis especffica de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml y comprende las SEQ ID NOs: 61, 67, 85, 91, 97, 37 y/o 43). En otro caso, las celulas se ponen en contacto con un anticuerpo en condiciones suficientes para inducir la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) de las celulas (por ejemplo, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 40 % de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml y comprende las SEQ ID NOs: 7, 13, 19, 49, 55, 103 y/o 109).
En otro caso, el anticuerpo empleado para inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD27 tambien puede poseer (o carecer de) caracterfsticas funcionales adicionales. Por ejemplo, el anticuerpo tambien puede inhibir la union de CD70 a CD27 en celulas que expresan estas protefnas (por ejemplo, un mAb que comprende secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las SEQ ID NOs: 37 y/o 43 (mAb 1F5), SEQ ID NOs: 49 y/o 55 (mAb 1H8) o SEQ ID NOs: 103 y/o 109 (mAb 3H12). Alternativamente, el anticuerpo puede no inhibir la union de CD70 a CD27 en tales celulas (por ejemplo, un mAb que comprende secuencias de regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprende las SeQ ID NOs: 61 y/o 67 (mAb 1G5), SEQ ID NOs: 85 y/o 91, 85 y/o 97 (mAb 3A10) o SEQ ID NOs:7 y/o 13, 7 y/o 19 (mAb 3H8).
Las celulas que expresan CD27 incluyen todas y cada una de las celulas que expresan CD27, que incluyen, pero no se limitan a, linfocitos NK, linfocitos B y linfocitos T. En un caso particular, las celulas que expresan cD27 incluyen lfneas celulares tales como celulas Jurkat, celulas Raji, celulas Ramos y celulas Daudi. En otro caso, las celulas que expresan CD27 son celulas tumorales o celulas cancerosas. En otro caso, las celulas que expresan CD27 incluyen linfocitos B, linfocitos NK, linfocitos T que se encuentran infiltrando tumores o celulas cancerosas, tambien denominados linfocitos infiltrantes de tumores.
Los metodos de inhibicion del crecimiento de celulas que expresan CD27 que se describen en el presente documento pueden usarse para tratar y prevenir una amplia variedad de enfermedades y trastornos. Por ejemplo, los metodos pueden usarse para tratar o prevenir un cancer (por ejemplo, un cancer seleccionado del grupo que consiste en leucemia, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, eritroleucemia monocftica mielomonocftica promielocftica de mieloblastos, leucemia cronica, leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, linfoma policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores solidos, sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de colon, carcinoma colorrectal, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vfas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cancer de cuello uterino, cancer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de pulmon no de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofarfngeo, carcinoma esofagico, carcinoma de celulas basales, cancer de las vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos, cancer de cerebro y sistema nervioso central (SNC), cancer de cuello uterino, coriocarcinoma, canceres colorrectales, cancer de tejido conjuntivo, cancer del aparato digestivo, cancer endometrial, cancer de esofago, cancer de ojo, cancer de cabeza y cuello, cancer gastrico, neoplasia intraepitelial, cancer de rinon, cancer de laringe, cancer de hfgado, cancer de pulmon (de celulas pequenas, de celulas grandes), melanoma, neuroblastoma; cancer de cavidad bucal (por ejemplo, labios, lengua, boca y faringe), cancer de ovarios, cancer pancreatico, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer rectal; cancer del aparato respiratorio, sarcoma, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer uterino y cancer del aparato urinario). Los canceres preferidos incluyen tumores que expresan CD27 seleccionados del grupo que consiste en leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt y linfoma de linfocitos B de la zona marginal. En otro caso, los metodos pueden usarse para tratar o prevenir una infeccion bacteriana, fungica, viral o parasitica.
Tambien se describen en el presente documento metodos de inhibicion de la union de CD70 a CD27 en celulas en un sujeto que tiene un trastorno administrando al sujeto anticuerpos o composiciones como se describen en el presente documento, ademas de metodos de regulacion por disminucion de una respuesta de linfocitos T en un individuo que tiene un trastorno administrando a un sujeto anticuerpos o composiciones descritas en el presente documento. Estos metodos son, de manera ideal, aptos para uso en el tratamiento de trastornos inmunitarios, tales como rechazo del injerto, enfermedades autoinmunitarias y alergia. Anticuerpos utiles en estos metodos incluyen fragmentos Fab, ademas de una region Fc mutada de forma tal que el anticuerpo no se una, o tenga una union significativamente reducida, a receptores Fc. En un caso particular, el anticuerpo comprende secuencias de regiones
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden SEQ ID NOs: 37 y/o 43 (mAb 1F5), SEQ ID NOs: 49 y/o 55 (mAb 1H8), o SEQ ID NOs: 103 y/o 109 (mAb 3H12).
Los metodos descritos en el presente documento para inhibir la union de CD70 a CD27 en celulas y para regular por disminucion una respuesta de linfocitos T pueden usarse para tratar una amplia variedad de enfermedades y trastornos, que incluyen, pero no se limitan a, rechazo del injerto, alergia y enfermedades autoinmunitarias. En un caso particular, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, esclerosis multiple, artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, psoriasis, enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias del intestino tales como colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistemico (SLE), encefalomielitis autoinmune, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, sfndrome de Goodpasture, penfigo, enfermedad de Graves, anemia hemolftica autoinmune, purpura trombocitopenica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anti-colageno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopatica, infertilidad asociada autoinmune, glomerulonefritis, glomerulonefritis crescentica, glomerulonefritis proliferativa, penfigoide bulloso, sfndrome de Sjogren, artritis psoriasica, resistencia a la insulina, diabetes mellitus autoinmune, hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, sfndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, sfndrome linfoproliferativo autoinmune, uveorretinitis autoinmune, sfndrome de Guillain-Barre, arteriosclerosis y enfermedad de Alzheimer).
La presente invencion proporciona ademas usos particulares de los anticuerpos, composiciones y moleculas biespecfficas descritas en el presente documento. Por ejemplo, Se describe en el presente documento el uso de un anticuerpo, composicion o molecula biespecffica en la fabricacion de un medicamento para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria contra un antfgeno en un sujeto. Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo o composicion en la fabricacion de un medicamento para inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD27, el uso de un anticuerpo o composicion en la fabricacion de un medicamento para inhibir la union de CD70 a CD27 en celulas en un sujeto que tiene un trastorno, y el uso de un anticuerpo o composicion en la fabricacion de un medicamento para regular por disminucion una respuesta de linfocitos T en un individuo que tiene un trastorno. Tambien se describe en el presente documento un anticuerpo, composicion o molecula biespecffica para su uso en inducir o mejorar una respuesta inmunitaria contra un antfgeno en un sujeto, un anticuerpo o una composicion para su uso en inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD27, un anticuerpo o composicion para su uso en inhibir la union de CD70 a CD27 en celulas en un sujeto que tiene un trastorno, y un anticuerpo o composicion para su uso en regular por disminucion una respuesta de linfocitos T en un individuo que tiene un trastorno.
La presente invencion tambien proporciona un metodo de deteccion de la presencia o ausencia de CD27 en una muestra biologica (1) poniendo en contacto una muestra biologica con un anticuerpo de la invencion en la que el anticuerpo se marca con una sustancia detectable; y (2) detectando el anticuerpo unido a CD27, para asf detectar la presencia o ausencia de CD27 en la muestra biologica.
Tambien se describen en el presente documento kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos y/o moleculas biespecfficas) de la invencion y, opcionalmente, instrucciones para su uso. El kit puede contener ademas al menos un reactivo adicional, tal como una citocina o complemento, o uno o mas anticuerpos adicionales de la invencion.
Otras caracterfsticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 describe la afinidad y parametros cineticos para los mAb 1G5, 1H8, 3H12, 3H8, 2G9, 1F5, 3A10, 2C2, ms 1A4, ms 9F4 y ms M-T271 como se ha determinado por el software Biacore™ BiaEvaluation (Biacore AB) con CD27 humana recombinante inmovilizada sobre el chip.
La Figura 2 es un grafico que muestra la union de anticuerpos humanos anti-CD27 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 y 3H12) a CD27 humana purificada recombinante usando ELISA.
La Figura 3 es un grafico que muestra la union mediante ELISA de 1F5 a CD27 humana o de mono (macaco) recombinante purificada.
La Figura 4 es un grafico que representa el efecto de anticuerpos humanos anti-CD27 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 y 3H12) y MsIgG (1A4, 9F4 y M-T271) sobre la union de CD70 soluble (sCD70) a protefna CD27 (mostrado como el % de bloqueo) mediante ELISA.
La Figura 5 es un analisis de citometrfa de flujo de la union de 1F5 a lfneas celulares linfoblastoides humanas y el bloqueo de la union de sCD70.
Las Figuras 6A-D son graficos que muestran la union de anticuerpos humanos anti-CD27 (2C2, 3H8 y 1F5) a CD27 en celulas Jurkat (Figura 4A), celulas Raji (Figura 4B), celulas Ramos (Figura 4C) y celulas Daudi (Figura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4D) como se evalua por citometrfa de flujo.
La Figura 7 es un grafico que muestra la union de anticuerpos humanos anti-CD27 (2C2, 3H8, 1F5, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 y 3H12) a CD27 en celulas Daudi se evalua por citometrfa de flujo.
La Figura 8 es un grafico de barras que muestra los resultados de un experimento de ELISA de bloqueo cruzado de anti-CD27, que demuestra que los anticuerpos 1F5, 1H8 y 3H12 son capaces de bloquearse de forma cruzada entre si y asf se unen al mismo epitope.
La Figura 9 es un grafico de barras que muestra los resultados de un experimento de ELISA de bloqueo cruzado de anti-CD27, que demuestra que los anticuerpos 2C2, 3H8, 1G5 y 2G9 son capaces de bloquearse de forma cruzada entre si y asf se unen al mismo epitope.
La Figura 10 es un grafico de barras que muestra los resultados de un experimento de ELISA de bloqueo cruzado de anti-CD27, que demuestra que la union del anticuerpo 3A10 a CD27 no esta completamente bloqueada de forma cruzada por cualquiera de los otros anticuerpos anti-CD27 probados, indicando asf que 3A10 se une a un unico epitope, pero la union de 3A10 esta parcialmente bloqueada de forma cruzada por los anticuerpos 1F5, 1H8 y 3H12, que indica que el epitope para 3A10 puede estar cerca del epitope unido por los anticuerpos 1F5, 1H8 y 3H12.
La Figura 11 es un grafico que representa los resultados de un ensayo de citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC) usando los mAb 1F5, 2C2, 3H8, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10 y 3H12.
La Figura 12 es un grafico que representa los resultados de otro ensayo de citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC) usando el mAb 1F5.
La Figura 13 es un grafico que representa los resultados de un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) usando los mAb 2C2, 1F5, 3H8, 1G5, 1H8, 2G9, 3A10, 3H12, Rituxan y HuIgG.
La Figura 14 es un grafico que describe los resultados de otro ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) usando el mAb 1F5.
La Figura 15 es un alineamiento de las secuencias VH de anticuerpos humanos anti-CD27 (1F5 (SEQ ID NO: 36), 1G5 (SEQ ID NO: 60), 1H8 (SEQ ID NO: 48), 2C2 (SEQ ID NO: 24), 2G9 (SEQ ID NO: 72), 3A10 (SEQ ID NO: 84), 3H12 (SEQ ID NO: 102) y 3H8 (SEQ ID NO: 6)).
La Figura 16 es un alineamiento de las secuencias VL de anticuerpos humanos anti-CD27 (1F5 (SEQ ID NO: 42), 1G5 (SEQ ID NO: 66), 1H8 (SEQ ID NO: 54), 2C2 (SEQ ID NO: 78), 2G9 (SEQ ID NO: 30), 3A10 (SEQ ID NO: 120), 3H12 (SEQ ID NO: 108) y 3H8 (SEQ ID NO: 12)).
Las Figuras 17 y 18 muestran los resultados de un estudio de primates no humanos in vivo usando el mAb 1F5. En particular, la Figura 17 muestra 1F5 en linfocitos circulantes despues de una dosis unica. La Figura 18 muestra que 1F5 no agota significativamente los linfocitos circulantes.
La Figura 19 representa los resultados de un ensayo de tincion de pentameros en esplenocitos y globulos sangufneos perifericos de raton.
La Figura 20 representa los resultados de un ensayo ELISPOT y el mejoramiento de la produccion de IFNy usando anticuerpos anti-CD27.
La Figura 21 muestra el mejoramiento por los mAb anti-CD27 de respuestas de linfocitos T a un antfgeno de vacuna en un modelo de raton transgenico por tincion de pentameros y ELISPOT de IFN.
Las Figuras 22A-C son el protocolo para y resultados de un experimento que muestra que anti-CD27 mejora las respuestas de linfocitos T a una vacuna dirigida a APC (a-DEC205-OVA). La Figura 22A muestra el protocolo para el experimento. La Figura 22B muestra los resultados de un experimento de tincion de tetrameros para medir linfocitos T especfficos de antfgeno. La Figura 22C muestra los resultados de un ensayo ELISPOT FN-gamma para medir linfocitos T especfficos de antfgeno.
Las Figuras 23A-D muestra los resultados de un experimento que muestra que anti-CD27 en combinacion con el agonista del TLR3 PolylC (a 25 pg, 50 pg o 100 pg) mejora las respuestas de linfocitos T a una vacuna dirigida a APC (a-DEC205-OVA). La Figura 23A es un grafico que muestra el % de celulas positivas IFN- gamma entre linfocitos T CD8+ para tanto ratones no mutantes tratados con poly IC y el mAb 1F5 anti-CD27, ratones transgenicos para huCD27 tratados con poly IC y un anticuerpo IgG1 humano de control como ratones transgenicos huCD27 tratados con poly IC y el mAb 1F5 anti-CD27.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las Figuras 24 y 25 muestran resultados de un estudio de la administracion del mAb anti-CD27 antes de la vacuna en presencia o ausencia de agonista T: LR y muestra la importancia del momento de administracion del anticuerpo con relacion a la vacuna.
Las Figuras 26 y 27 muestran los resultados de la administracion del mAb anti-CD27 en combinacion con activacion de tCr en linfocitos T de ratones transgenicos para CD27 humana, como se muestra por proliferacion y produccion de citocinas.
Las Figuras 28A-D son el protocolo para y los resultados de un experimento que muestra que anti-CD27 mejora la eficacia de una vacuna de a-DEC205-OVA en un modelo de exposicion a melanoma MO4 (B16- 0VA). La Figura 24A muestra el protocolo para el experimento. La Figura 24B es un grafico que representa el tamano del tumor (en mm2) frente al numero de dfas despues de la inoculacion del tumor en ratones sin tratar. La Figura 24C es un grafico que representa el tamano del tumor (en mm2) frente al numero de dfas despues de la inoculacion del tumor en ratones tratados con la vacuna sola. La Figura 24D es un grafico que representa el tamano del tumor (en mm2) frente al numero de dfas despues de la inoculacion del tumor en ratones tratados con la vacuna en combinacion con un anticuerpo anti-CD27.
Las Figuras 29A y B son graficos que demuestran la supervivencia prolongada de ratones transgenicos para CD27 humana (modelos de tumor) tras la exposicion a un linfoma singenico y la administracion de diversas dosis del mAb 1F5 anti-CD27.
Las Figuras 30 a 32 muestran los resultados de un experimento que prueba el efecto del tratamiento con anti- CD27 en un modelo de xenoinjerto de Raji en ratones SCID.
La Figura 30A representa el tamano del tumor (en mm3) frente al numero de dfas tras la inoculacion del tumor en ratones tanto sin tratar, tratados con un anticuerpo IgG1 humano de control como tratados con los anticuerpos 1F5 y 3H8 anti-CD27. Las flechas indican los dfas cuando se administro el tratamiento con anticuerpos por inyeccion i.p.
La Figura 30B muestra la supervivencia en un grafico de Kaplan-Meier.
La Figura 31A representa el tamano del tumor (en mm3) frente al numero de dfas tras la inoculacion del tumor en ratones tanto sin tratar, tratados con un anticuerpo IgG1 humano de control como tratados con el anticuerpo 1F5 anti-CD27. Las flechas indican los dfas cuando se administro el tratamiento con anticuerpos por inyeccion i.p. La Figura 31B muestra la supervivencia en un grafico de Kaplan-Meier.
La Figura 32 muestra los resultados de otro experimento que prueba el efecto del tratamiento con anti-CD27 en un modelo de xenoinjerto de Raji en ratones SCID en un grafico de Kaplan-Meier.
La Figura 33 muestra los resultados de un experimento que prueba el efecto del tratamiento con anti-CD27 en un modelo de xenoinjerto de Daudi en ratones SCID. La Figura 33A representa el tamano del tumor (en mm3) frente al numero de dfas tras la inoculacion del tumor en ratones tanto tratados con un anticuerpo IgG1 humano de control como tratados con el anticuerpo 1F5 anti-CD27 (0,1 mg o 0,3 mg). Las flechas indican los dfas cuando se administro el tratamiento con anticuerpos por inyeccion i.p. La Figura 33B muestra la supervivencia en un grafico de Kaplan-Meier.
La Figura 34 muestra los resultados de un ensayo ELISPOT y que el mejoramiento de la produccion de IFNg especffica de antfgeno usando anticuerpo anti-CD27 se anula cuando la porcion Fc de la IgG es incapaz de acoplar receptores Fc.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos anti-CD27 como se han definido anteriormente que presentan propiedades funcionales particulares que se correlacionan con beneficios terapeuticos significativos, que incluyen regulacion por incremento de la funcion inmune (por ejemplo, respuestas inmunitarias de linfocitos T como en terapias de vacuna, activacion de NK en terapias de cancer), inhibicion del crecimiento celular (por ejemplo, en terapia del cancer) y regulacion por disminucion de respuestas inmunitarias de linfocitos T (por ejemplo, en terapia autoinmune). Estas caracterfsticas funcionales incluyen, por ejemplo: (1) inhibicion de (por ejemplo, bloquea completa o parcialmente) la union de CD70 soluble a celulas que expresan CD27 al menos aproximadamente el 70 %, ademas, por ejemplo, al menos el 80 % o al menos el 90 % (2) union a CD27 humana con una Kd de 1 x 10-9 M o menos, (3) induccion de al menos aproximadamente el 40 % de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml, (4) induccion de al menos aproximadamente el 40 % de lisis especffica de celulas que expresan CD27 por ADCC a una concentracion de 10 pg/ml (ademas, por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % de lisis especffica) (5) induccion o mejoramiento de respuestas inmunitarias, especialmente respuestas TH1 y/o (6) induccion o mejoramiento de actividad de linfocitos T, especialmente numeros y/o actividad de linfocitos T
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CD8+ especfficos. Los anticuerpos incluyen regiones variables de cadena pesada y ligera particulares y/o secuencias de CDR como se ha definido anteriormente.
Con el fin de que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, primero se definen ciertos terminos. A lo largo de la descripcion detallada se exponen definiciones adicionales.
El termino "CD27" (tambien denominado "molecula de CD27", "receptor de CD27L", "S1521", "antfgeno CD27 de activacion de linfocitos T", "TNFRSF7", "MGC20393", "miembro 7 de la superfamilia del receptor de necrosis tumoral", "antfgeno S152 de activacion de linfocitos T", "Tp55", "miembro 7 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral", "antfgeno CD27" y "antfgeno CD27 de activacion de linfocitos T") se refiere a un receptor que es un miembro de la superfamilia del receptor del TNF, que se une al ligando CD70. CD27 es requerido para la generacion y el mantenimiento a largo plazo de la inmunidad de linfocitos T y desempena una funcion clave en la regulacion de la activacion de linfocitos B y la sfntesis de inmunoglobulinas. El termino "CD27" incluye cualquier variante o isoforma de CD27 que sea naturalmente expresada por celulas (por ejemplo, CD27 humana depositada en GENBANK® que tiene el N.° de acceso AAH12160.1). Por consiguiente, los anticuerpos de la invencion pueden reaccionar de forma cruzada con CD27 de especies distintas de la humana. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser especfficos para la CD27 humana y pueden no presentar reactividad cruzada con otras especies. cD27 o cualquier variante o isoforma de la misma pueden tanto aislarse de celulas o tejidos que las expresan naturalmente como ser producidas recombinantemente usando tecnicas muy conocidas en la tecnica y/o aquellas descritas en el presente documento. Preferentemente, los anticuerpos se dirigen a hCD27 que tiene un patron de glucosilacion normal.
Genbank® (N.° de acceso AAH12160.1) informa la secuencia de aminoacidos de CD27 humana como sigue (SEQ ID NO:1):
1 marphpwwlc vlgtlvglsa tpapkscper hywaqgklcc qmcepgtflv kdcdqhrkaa 61 qcdpcipgvs fspdhhtrph cescrhcnsg llvrnctita naecacrngw qcrdkectec 121 dplpnpslta rssqalsphp qpthlpyvse mleartaghm qtladfrqlp artlsthwpp 181 qrslcssdfi rilvifsgmf lvftlagalf lhqrrkyrsn kgespvepae pcryscpree 241 egstipiqed yrkpepacsp
El termino "CD70" (tambien denominado "molecula de CD70", "CD27L", "CD27LG", "TNFSF7", "miembro 7 de la superfamilia del factor (ligando) de necrosis tumoral", "ligando de CD27", "antfgeno CD70" "antfgeno de superficie cD70", "miembro 7 de la superfamilia del ligando del factor de necrosis tumoral", "antfgeno de Ki-24" y "CD27-L") se refiere al ligando para CD27 (vease, por ejemplo, Bowman MR et al., J. Immunol. 1994 Feb 15; 152(4): 1756-61). CD70 es una protefna transmembranaria tipo II que pertenece a la familia del ligando del factor de necrosis tumoral (TNF). Es un antfgeno de superficie en linfocitos T y B activados que induce la proliferacion de linfocitos T co- estimulados, mejora la generacion de linfocitos T citolfticos y contribuye a la activacion de linfocitos T. Tambien se ha sugerido que CD70 desempena una funcion en regular la activacion de linfocitos B, la funcion citotoxica de linfocitos citolfticos espontaneos y la sfntesis de inmunoglobulinas (Hintzen RQ et al., J. Immunol. 1994 Feb 15;152(4):1762-73).
Genbank® (N.° de acceso NP_001243) informa la secuencia de aminoacidos de CD70 humana como sigue (SEQ ID NO: 2):
1 mpeegsgcsv rrrpygcvlr aalvplvagl viclwciqr faqaqqqlpl eslgwdvael 61 qlnhtgpqqd prlywqggpa lgrsflhgpe ldkgqlrihr dgiymvhiqv tlaicsstta 121 srhhpttlav gicspasrsi sllrlsfhqg ctiasqrltp largdtlctn ltgtllpsrn 181 tdetffgvqw vrp
El termino "anticuerpo", como se hace referencia en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union al antfgeno (es decir, "porcion de union al antfgeno") o una cadena simple del mismo. Un "anticuerpo" se refiere, en una realizacion preferida, a una glucoprotefna que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion de union al antfgeno de la misma. Cada cadena pesada comprende una region variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada comprende tres dominios CH1, cH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una region variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada Vh y Vl esta compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de cadena pesada y ligera contienen un dominio de union que interacciona con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a los tejidos huesped o factores, que incluyen diversas celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El termino "porcion de union al antfgeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno (por ejemplo, CD27 humana). Tales "fragmentos" tienen, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1500 aminoacidos de longitud, adecuadamente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 745 aminoacidos de longitud, adecuadamente aproximadamente 8 a aproximadamente 300, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 200 aminoacidos, o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 o 100 aminoacidos de longitud. Se ha mostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de union englobados dentro del termino "fragmento de union al antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintetico. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, pueden unirse usando metodos recombinantes mediante un conector sintetico que les permite conformarse como una cadena de una unica protefna en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tambien se pretende que tales anticuerpos monocatenarios esten englobados dentro del termino "porcion de union al antfgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se criban para utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos. Las porciones de union al antfgeno pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante o mediante escision enzimatica o qufmica de inmunoglobulinas intactas.
Un "anticuerpo biespecffico" o "bifuncional" es un anticuerpo hfbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de union diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecfficos mediante una variedad de metodos, que incluyen la fusion de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
El termino "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad y afinidad de union unica por un epitope particular. Por consiguiente, el termino "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad de union unica y que tiene regiones variables y constantes opcionales derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de lfnea germinal humana. En una realizacion, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionados con una celula inmortalizada.
El termino "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o afslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de la inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo, (b) anticuerpos aislados de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica corte y empalme de secuencias de genes de la inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes que comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana particulares estan codificados por los genes de la lfnea germinal, pero incluyen reordenaciones y mutaciones posteriores que ocurren, por ejemplo, durante la maduracion del anticuerpo. Como se conoce en la tecnica (vease, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), la region variable contiene el dominio de union al antfgeno, que esta codificado por diversos genes que se reordenan para formar un anticuerpo especffico para un antfgeno extrano. Ademas de la reordenacion, la region variable puede modificarse adicionalmente por multiples cambios de un unico aminoacido (denominados mutacion somatica o hipermutacion) para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno extrano. La region constante cambiara en respuesta adicional a un antfgeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico reordenadas y somaticamente mutadas que codifican los polipeptidos de inmunoglobulina de cadena ligera y cadena pesada en respuesta a un antfgeno pueden no tener identidad de secuencia con las moleculas de acido nucleico originales, pero en su lugar seran sustancialmente identicas o similares (es decir, tienen al menos el 80 % de identidad).
El termino "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si estan presentes) de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especffica del sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo) (vease, Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859); Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:4 9-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol 13: 65-93 y Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546). Sin embargo, el termino "anticuerpo humano" no incluye
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamffero, tal como un raton, se injertaron sobre secuencias de la region estructural humana (es decir, anticuerpos humanizados).
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo heterologo" se define en relacion con el organismo no humano transgenico que produce un anticuerpo tal. Este termino se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos o una secuencia de acido nucleico codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no consiste en el animal no humano transgenico y generalmente de una especie distinta a la del animal no humano transgenico.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especfficamente a CD27 humana esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especfficamente a antfgenos distintos de CD27 humana). Un anticuerpo aislado que se une especfficamente a un epitope de puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras protefnas CD27 de especies diferentes. Sin embargo, el anticuerpo p refe rente me nte siempre se une a CD27 humana. Ademas, un anticuerpo aislado esta normalmente sustancialmente libre de otro material celular y/o productos qufmicos. En una realizacion de la invencion, una combinacion de anticuerpos "aislados" que tienen diferentes especificidades por CD27 se combina en una composicion bien definida.
El termino "epitope" o "determinante antigenico" se refiere a un sitio sobre un antfgeno al que se une especfficamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Los epitopes pueden estar formados tanto de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una protefna. Los epitopes formados de aminoacidos contiguos normalmente se retienen tras la exposicion a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epitopes formados por plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epitope normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos en una conformacion espacial unica. Son muy conocidos en la tecnica metodos de determinacion de que epitopes se unen por un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epitopes) e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitacion, en los que la superposicion de peptidos contiguos de CD27 se prueba para reactividad con el anticuerpo anti-CD27 dado. Metodos de determinacion de la conformacion espacial de epitopes incluyen tecnicas en la materia y aquellas descritas en el presente documento, por ejemplo, cristalograffa de rayos X y resonancia magnetica nuclear de 2 dimensiones (vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a un epitope sobre CD27 que comprende todo o una porcion de un epitope reconocido por los anticuerpos particulares descritos en el presente documento (por ejemplo, la misma region o una que se superpone o una region entre la region o que la comprende).
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos que se unen el mismo epitope y/o anticuerpos que compiten por unirse a CD27 humana con los anticuerpos descritos en el presente documento. Los anticuerpos que reconocen el mismo epitope o compiten por unirse pueden identificarse usando tecnicas rutinarias. Tales tecnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la union de otro anticuerpo a un antfgeno diana, es decir, un ensayo de union competitiva. La union competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina a prueba inhibe la union especffica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun, tal como CD27. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase solida (RIA), inmunoensayo enzimatico directo o indirecto de fase solida (EIA), ensayo de competicion sandwich (vease Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina directo de fase solida (vease Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo de marcado directo de fase solida, ensayo sandwich de marcado directo de fase solida (vease Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marca directa de fase solida usando marca de I-125 (vease Morel et al., Mol. Immunol. 25(1 ):7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo de fase solida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)) y RIA de marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Normalmente, un ensayo tal implica el uso de antfgeno purificado unido a una superficie solida o celulas que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de marca unida a la superficie solida o las celulas en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Normalmente, la inmunoglobulina de prueba esta presente en exceso. Normalmente, cuando un anticuerpo que compite esta presente en exceso, inhibira la union especffica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun al menos el 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 % 70-75 % o mas.
Otras tecnicas incluyen, por ejemplo, metodos de mapeo de epitopes, tales como, analisis de rayos X de cristales de complejos de antfgeno:anticuerpo que proporcionan resolucion atomica del epitope. Otros metodos monitorizan la union del anticuerpo a fragmentos de antfgeno o variaciones mutadas del antfgeno donde la perdida debido a una modificacion de un resto de aminoacido dentro de la secuencia de antfgeno se considera frecuentemente una indicacion de un componente de epitope. Ademas, tambien pueden usarse metodos combinatorios informaticos para el mapeo de epitopes. Estos metodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interes para aislar por afinidad peptidos cortos especfficos de bibliotecas de peptidos de presentacion en fagos combinatorias. Los peptidos se consideran como ejemplos para la definicion del epitope correspondiente al anticuerpo usado para cribar la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
biblioteca de peptidos. Para el mapeo de epitopes, tambien se han desarrollado algoritmos informaticos que se ha demostrado que mapean epitopes conformacionales discontinuos.
Como se usa en el presente documento, los terminos "union especffica", "union selectiva", "se une selectivamente" y "se une especfficamente" se refieren a la union de un anticuerpo a un epitope sobre un antfgeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una constante de disociacion en equilibrio (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menos cuando se determina por tecnologfa de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 2000 usando CD27 humana recombinante como analito y el anticuerpo como ligando y se une al antfgeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces superior a su afinidad para unirse a un antfgeno no especffico (por ejemplo, BSA, casefna) distinto al antfgeno predeterminado o un antfgeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antfgeno" y "un anticuerpo especffico para un antfgeno" se usan indistintamente en el presente documento con el termino "un anticuerpo que se une especfficamente a un antfgeno".
El termino "Kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociacion de una interaccion anticuerpo-antfgeno particular. Normalmente, los anticuerpos humanos de la invencion se unen a CD27 con una constante de equilibrio de disociacion (Kd) de aproximadamente 10-8 M o menos, tal como menos de 10-9 M o 10-10 M o incluso menor cuando se determina por tecnologfa de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 2000 usando CD27 humana recombinante como analito y el anticuerpo como ligando.
El termino "kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion para la disociacion de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antfgeno.
El termino "ka", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de asociacion para la asociacion de un anticuerpo con el antfgeno.
El termino "CE50", como se usa en el presente documento, se refiere a la concentracion de un anticuerpo o una porcion de union al antfgeno del mismo, que induce una respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, que es el 50 % de la respuesta maxima, es decir, intermedia entre la respuesta maxima y el punto de referencia.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que se codifica por genes de la region constante de cadena pesada. En una realizacion, un anticuerpo monoclonal humano de la invencion es del isotipo IgG1. En otra realizacion, un anticuerpo monoclonal humano de la invencion es del isotipo IgG2.
El termino "se une a CD27 inmovilizada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo humano de la invencion para unirse a CD27, por ejemplo, expresada en la superficie de una celula o que esta unida a un soporte solido.
El termino "reacciona de forma cruzada", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la invencion para unirse a CD27 de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invencion que se une a CD27 humana tambien puede unirse a otra especie de CD27. Como se usa en el presente documento, la reactividad cruzada se mide detectando una reactividad especffica con un antfgeno purificado en ensayos de union (por ejemplo, SPR, ELISA) o union a, o interaccionando funcionalmente de otro modo con, celulas que fisiologicamente expresan CD27. Metodos de determinacion de la reactividad cruzada incluyen ensayos de union estandar tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, por analisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) Biacore™ usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia) o tecnicas de citometrfa de flujo.
Como se usa en el presente documento, "cambio de isotipo" se refiere al fenomeno mediante el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
Como se usa en el presente documento, "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotfpica de cadena pesada que se produce cuando no ha tenido lugar cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no cambiado es normalmente el primer gen CH inmediatamente en la direccion 3' del gen VDJ funcionalmente reordenado. El cambio de isotipo se ha clasificado como cambio de isotipo clasico y no clasico. El cambio de isotipo clasico se produce mediante eventos de recombinacion que implican al menos una region de secuencia de cambio en el transgen. El cambio de isotipo no clasico puede producirse mediante, por ejemplo, recombinacion homologa entre aM humano y 1M humano (delecion asociada a 6). Pueden producirse mecanismos de cambio no clasicos alternativos, tales como la recombinacion intertransgenica y/o intercromosomica, entre otros, y producir el cambio de isotipo.
Como se usa en el presente documento, el termino "secuencia de cambio" se refiere a aquellas secuencias de ADN responsables de la recombinacion de cambio. Una secuencia "donante de cambio", tfpicamente una region de cambio p, se encontrara 5' (es decir, aguas arriba) de la region de construccion que va a delecionarse durante la recombinacion de cambio. La region "aceptora de cambio" estara entre la region de construccion que va a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
delecionarse y la region constante de sustitucion (por ejemplo, y, £, etc.). Debido a que no hay un sitio especffico donde siempre se produce la recombinacion, la secuencia genica final no sera normalmente predecible a partir de la construccion.
Como se usa en el presente documento, "patron de glucosilacion" se define como el patron de unidades de hidratos de carbono que estan covalentemente unidas a una protefna, mas especfficamente a una protefna inmunoglobulina. Un patron de glucosilacion de un anticuerpo heterologo puede caracterizarse por ser sustancialmente similar a patrones de glucosilacion que producen naturalmente en anticuerpos producidos por las especies del animal transgenico no humano, cuando un experto en la tecnica reconocerfa que el patron de glucosilacion del anticuerpo heterologo se parece mas a dicho patron de glucosilacion en la especie del animal transgenico no humano que en la especie de la que derivan los genes CH del transgen.
El termino "que existe de forma natural", como se usa en el presente documento como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, existe de forma natural una secuencia de polipeptidos o polinucleotidos que esta presente en un organismo (que incluyen los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el ser humano en el laboratorio.
El termino "reordenado", como se usa en el presente documento, se refiere a una configuracion de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera en el que un segmento V se posiciona inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformacion que codifica esencialmente un dominio Vh o Vl completo, respectivamente. Un locus del gen de inmunoglobulina reordenado puede identificarse por comparacion con aDn de la lfnea germinal; un locus reordenado tendra al menos un elemento de homologfa heptamero/nonamero recombinado.
El termino "no reordenado" o "configuracion de la lfnea germinal", como se usa en el presente documento en referencia a un segmento V, se refiere a la configuracion en la que el segmento V no recombina de manera que sea inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
El termino "molecula de acido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moleculas de ADN y moleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.
El termino "molecula de acido nucleico aislada", como se usa en el presente documento en referencia a acidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo, Vh, Vl, CDR3) que se unen a CD27, pretende referirse a una molecula de acido nucleico en la que las secuencias de nucleotidos que codifican el anticuerpo o porcion de anticuerpo estan libres de otras secuencias de nucleotidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen a antfgenos que no son CD27, que otras secuencias pueden flanquear naturalmente el acido nucleico en el ADN genomico humano. Por ejemplo, SEQ ID NOs: 35 y 41, 47 y 53, 101 y 107, 83 y 89, 83 y 95, 23 y 29, 71 y 77 se corresponden, respectivamente, con las secuencias de nucleotidos que comprenden las regiones variables de cadena pesada (Vh) y cadena ligera (Vl) de anticuerpos monoclonales del anticuerpo anti-CD27 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5.
Tambien se describen en el presente documento "modificaciones de secuencia conservativas" de las secuencias expuestas en SEQ ID NOs: 5-112, es decir, las modificaciones de secuencias de nucleotidos y aminoacidos que no anulan la union del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleotidos o que contienen la secuencia de aminoacidos, al antfgeno. Tales modificaciones de secuencia conservativas incluyen sustituciones conservativas de nucleotidos y aminoacidos, ademas de adiciones y deleciones de nucleotidos y aminoacidos. Por ejemplo, las modificaciones pueden introducirse en las SEQ ID NOs: 5-112 por tecnicas convencionales conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Sustituciones de aminoacidos conservativas incluyen aquellas en las que el resto de aminoacido se sustituye con un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. En la tecnica se han definido familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistefna, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta- ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Asf, un resto de aminoacido no esencial predicho en un anticuerpo anti-CD27 humano se sustituye preferentemente con otro resto de aminoacido de la misma familia de cadenas laterales. Los metodos de identificacion de sustituciones conservativas de nucleotidos y aminoacidos que no eliminan la union al antfgeno son muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
Alternativamente, en otra realizacion, pueden introducirse mutaciones de manera aleatoria a lo largo de toda o una parte de una secuencia codificante del anticuerpo anti-CD27, tal como mediante mutagenesis de saturacion, y los anticuerpos anti-CD27 modificados resultantes pueden cribarse para la actividad de union.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para los acidos nucleicos, el termino "homologfa sustancial" indica que dos acidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de manera optima, son identicas, con o deleciones de nucleotidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80 % de los nucleotidos, normalmente al menos aproximadamente el 90 % al 95 %, y mas preferentemente al menos aproximadamente el 98 % al 99,5 % de los nucleotidos. Alternativamente, existe homologfa sustancial cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridacion selectivas, con el complemento de la hebra.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, (es decir, el % de homologfa = N.° de posiciones identicas/N.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para el alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre las dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes mas adelante.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos puede tambien determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando tanto una matriz Blossum 62 como una matriz PAM250, y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una longitud por hueco de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de acido nucleico y de protefna de la presente invencion pueden usarse adicionalmente como una "secuencia de busqueda" para realizar una busqueda por comparacion con bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales busquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuacion= 100, longitud de palabra= 12, para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acido nucleico de la invencion. Las busquedas de protefnas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion= 50, longitud de palabra= 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de protefnas de la invencion. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Si se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas enteras, en un lisado de celulas o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico se "afsla" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protefnas celulares, mediante tecnicas convencionales, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandeo con CsCl, cromatograffa en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros muy conocidos en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Las composiciones de acido nucleico de la presente invencion, aunque frecuentemente estan en una secuencia nativa (excepto por sitios de restriccion modificados y similares), de tanto ADNc, genomico, como mezclas de los mismos, pueden mutarse, segun tecnicas convencionales para proporcionar secuencias genicas. Para secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoacidos segun se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homologas a o derivadas de V, D, J nativos, constantes, cambios y otras secuencias tales descritas en el presente documento (donde "derivadas" indica que una secuencia es identica o se modifico a partir de otra secuencia).
Un acido nucleico esta "operativamente unido" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o mejorador esta operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripcion de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripcion, operativamente unidas significa que las secuencias de ADN que se estan uniendo son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de protefnas, contiguas y en marco de lectura. Para secuencias de cambio, operativamente unidas indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinacion de cambio.
El termino "vector', como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro del cual puede unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que puede unirse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos son capaces de replicarse de manera autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomicos de mamffero). Otros vectores (por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ejemplo, vectores no episomicos de mamffero) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y asf se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente "vectores de expresion"). En general, vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan frecuentemente en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente usada. Sin embargo, la invencion pretende incluir tales otras formas de vectores de expresion, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) que cumplen funciones equivalentes.
El termino "celula huesped recombinante" (o simplemente "celula huesped"), como se usa en el presente documento, pretende referirse a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Debe entenderse que tales terminos pretenden referirse no solo a la celula objeto particular, sino a la progenie de una celula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a tanto mutacion como a influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula parental, pero igualmente estar incluida dentro del alcance del termino "celula huesped" como se usa en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el termino "antfgeno" se refiere a cualquier sustancia inmunogenica natural o sintetica, tal como una protefna, peptido o hapteno. Antfgenos adecuados para su uso en la presente invencion (por ejemplo, en una vacuna en combinacion con un anticuerpo anti-CD27 de la invencion) incluyen, por ejemplo, antfgenos de enfermedades infecciosas y antfgenos de tumor, contra los que se desean respuestas inmunitarias protectoras o terapeuticas, por ejemplo, antfgenos expresados por una celula tumoral o un organismo patogeno o antfgenos de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, antfgenos adecuados incluyen antfgenos asociados a tumor para la prevencion o el tratamiento de canceres. Ejemplos de antfgenos asociados a tumor incluyen, pero no se limitan a, secuencias que comprenden toda o parte de las secuencias de phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MARTI, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, tirosinasa, telomerasa, antfgenos SSX2 y MUC-1, y antfgenos de tumor derivados de celulas germinativas. Antfgenos asociados a tumor tambien incluyen los antfgenos de los grupos sangufneos, por ejemplo, los antfgenos Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2. Alternativamente, puede incluirse mas de un antfgeno dentro de las construcciones de antfgeno-anticuerpo de la invencion. Por ejemplo, puede combinarse un antfgeno MAGE con otros antfgenos tales como melanina A, tirosinasa y gp100 junto con adyuvantes tales como GM-CSF o IL-12, y unirse a un anticuerpo anti-APC.
Otros antfgenos adecuados incluyen antfgenos virales para la prevencion o el tratamiento de enfermedades virales. Ejemplos de antfgenos virales incluyen, pero no se limitan a, antfgenos gag de VIH-1, env de VIH-1, nef de VIH-1, VHB (antfgenos superficiales o de nucleo), VPH, FAS, VHS-1, VHS-2, p17, ORF2 y ORF3. Ejemplos de antfgenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, Toxoplasma gondii o Treponema pallidum. Los conjugados de anticuerpo- antfgeno bacteriano de la invencion pueden ser en el tratamiento o la prevencion de diversas enfermedades bacterianas tales como carbunco, botulismo, tetanos, clamidia, colera, difteria, enfermedad de Lyme, sffilis y tuberculosis. Otros antfgenos adecuados de patogenos de enfermedades infecciosas, tales como virus, bacterias, parasitos y hongos, se desvelan mas adelante.
Secuencias de los antfgenos anteriores son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se proporciona un ejemplo de una secuencia de ADNc de MAGE-3 en el documento US 6.235.525 (Ludwig Institute for Cancer Research); se proporcionan ejemplos de secuencias de acidos nucleicos y de protefnas de NY-ESO-1 en los documentos US 5.804.381 y US 6.069.233 (Ludwig Institute for Cancer Research); se proporcionan ejemplos de secuencias de acidos nucleicos y de protefnas de Melan-A en los documentos US 5.620.886 y US 5.854.203 (Ludwig Institute for Cancer Research); se proporcionan ejemplos de secuencias de acidos nucleicos y de protefnas de NY-BR-1 en los documentos US 6.774.226 y US 6.911.529 (Ludwig Institute for Cancer Research) y se proporcionan ejemplos de secuencias de acidos nucleicos y de protefnas de NY-CO-58 en el documento WO 02090986 (Ludwig Institute for Cancer Research); un ejemplo de una secuencia de aminoacidos para la protefna HER-2/neu esta disponible en el N.° de acceso de GENBANk® AAA58637; y una secuencia de nucleotidos (ARNm) para 1 similar a antfgeno carcinoembrionario (CEA-1) esta disponible en el N.° de acceso de GENBANK® Nm 020219.
Un antfgeno de VPH que puede usarse en las composiciones y los usos de la invencion puede incluir, por ejemplo, un antfgeno de VPH-16, un antfgeno de VPH-18, un antfgeno de VPH-31, un antfgeno de VPH-33 y/o un antfgeno de VPH-35; y es adecuadamente un antfgeno VPH-16 y/o un antfgeno VPH-18. Se describe un genoma de VPH-16 en Virology, 145:181- 185 (1985) y secuencias de ADN que codifican VPH-18 se describen en la patente de EE.UU. N.° 5.840.306. Los antfgenos de VPH-16 (por ejemplo, las regiones serorreactivas de las protefnas E1 y/o E2 de VPH-16) se describen en la patente de EE.UU. N.° 6.531.127, y los antfgenos de VPH-18 (por ejemplo, las regiones serorreactivas de las protefnas L1 y/o L2 de VPH-18) se describen en la patente de EE.UU. N.° 5.840.306. Similarmente, esta disponible un genoma completo para VHB en el N.° de acceso de GENBANK® NC_003977. El genoma del VHC se describe en la solicitud de patente europea N.° 318 216. El documento PCT/US90/01348 desvela informacion de secuencias de clones del genoma del vHc, secuencias de aminoacidos de protefnas virales del VHC y metodos de preparacion y uso de tales composiciones para vacunas del VHC que comprenden protefnas del VHC y peptidos derivados de ellas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Pueden identificarse peptidos antigenicos de protefnas (es decir, aquellos que contienen epitopes de linfocitos T) de una variedad de maneras muy conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los epitopes de linfocitos T pueden predecirse analizando la secuencia de la protefna usando algoritmos predictivos basado en la web (BIMAS y SYFPEITHI) para generar posibles peptidos de union a MHC clase I y II que coinciden con una base de datos interna de 10.000 peptidos de union a MHC bien caracterizados definidos previamente por CTL. Pueden clasificarse y seleccionarse peptidos de alta puntuacion como "interesantes" basandose en la alta afinidad con una molecula de MHC dada.
Otro metodo de identificacion de peptidos antigenicos que contienen epitopes de linfocitos T es dividiendo la protefna en peptidos no superpuestos de longitud deseada o peptidos superpuestos de longitudes deseadas que pueden producirse recombinantemente, sinteticamente, o en ciertas situaciones limitadas, mediante escision qufmica de la protefna y probarse para propiedades inmunogenicas, por ejemplo, provocando una respuesta de linfocitos T (es decir, proliferacion o secrecion de linfocinas).
Con el fin de determinar epitopes de linfocitos T precisos de la protefna mediante, por ejemplo, tecnicas de mapeo fino, un peptido que tiene actividad estimuladora de linfocitos T y asf que comprende al menos un epitope de linfocitos T, como se ha determinado por tecnicas de biologfa de linfocitos T, puede modificarse mediante la adicion o delecion de restos de aminoacidos en tanto el extremo amino como carboxi del peptido y probarse para determinar un cambio en la reactividad de linfocitos T con el peptido modificado. Si se encuentra que dos o mas peptidos que comparten un area de superposicion en la secuencia de protefna nativa tienen actividad estimuladora de linfocitos T humanos, como se ha determinado por tecnicas de biologfa de linfocitos T, pueden producirse peptidos adicionales que comprenden toda o una porcion de tales peptidos y estos peptidos adicionales pueden probarse mediante un procedimiento similar. Siguiendo esta tecnica, los peptidos se seleccionan y producen recombinantemente o sinteticamente. Los peptidos se seleccionan basandose en diversos factores, que incluyen la intensidad de la respuesta de linfocitos T al peptido (por ejemplo, fndice de estimulacion). Las propiedades ffsicas y qufmicas de estos peptidos seleccionados (por ejemplo, solubilidad, estabilidad) pueden entonces examinarse para determinar si los peptidos son adecuados para su uso en composiciones terapeuticas o si los peptidos requieren modificacion.
El termino "celula presentadora de antfgenos" o "APC" es una celula que presenta un antfgeno extrano complejado con MHC en su superficie. Los linfocitos T reconocen este complejo utilizando un receptor de linfocitos T (TCR). Ejemplos de APC incluyen, pero no se limitan a, celulas dendrfticas (DC), celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP), monocitos (tales como THP-1), celulas linfoblastoides B (tales como C1R.A2, 1518 B-LCL) y celulas dendrfticas derivadas de monocitos (DC). Algunas APC internalizan antfgenos tanto por fagocitosis como por endocitosis mediada por receptor. Ejemplos de receptores de APC incluyen, pero no se limitan a, lectinas tipo C, tales como el receptor humano 205 de celulas dendrfticas y epiteliales (CD27) y el receptor humano de manosa de macrofago.
El termino "presentacion de antfgenos" se refiere al proceso por el que las APC capturan antfgenos y permite su reconocimiento por linfocitos T, por ejemplo, como un componente de un conjugado de MHC-I y/o MHC-II.
Las "moleculas MHC" incluyen dos tipos de moleculas, MHC clase I y MHC clase II. Las moleculas MHC clase I presentan antfgenos a linfocitos T CD8+ especfficos y las moleculas mHc clase II presentan antfgenos a linfocitos T CD4+ especfficos. Los antfgenos administrados exogenamente a las APC se procesan principalmente para asociacion con MHC clase II. A diferencia, los antfgenos administrados endogenamente a las APC se procesan principalmente para asociacion a MHC clase I.
Como se usa en el presente documento, el termino "agente inmunoestimulante" incluye, pero no se limita a, compuestos capaces de estimular APCs, tales como DCs y macrofagos. Por ejemplo, agentes inmunoestimulantes adecuados para su uso en la presente invencion son capaces de estimular APCs, de manera que se acelera el proceso de maduracion de APCs, aumenta la proliferacion de APCs, y/o se regula por incremento la incorporacion o liberacion de moleculas coestimuladoras (por ejemplo, CD80, CD86, ICAM-1, moleculas MHC y CCR7) y citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1p, IL-6, IL-12, IL-15 e IFN-y). Los agentes inmunoestimulantes adecuados tambien son capaces de aumentar la proliferacion de linfocitos T. Tales agentes inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a, ligando CD40; ligando FLT3; citocinas, tales como IFN-a, IFN-p, IFN-y e IL-2; factores estimulantes de colonias, tales como G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos); un anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD1, anticuerpo anti-41 BB, o anticuerpo anti-OX-40; LPS (endotoxina); ARNmc; ARNbc; Bacille Calmette-Guerin (BCG); clorhidrato de levamisol; e inmunoglobulinas intravenosas. En una realizacion, un agente inmunoestimulante puede ser un agonista del receptor tipo Toll (TLR). Por ejemplo, el agente inmunoestimulante puede ser un agonista de TLR3 tal como un polinucleotido de inosina:citosina bicatenario (Poly I:C, por ejemplo, disponible como AmpligenTM de Hemispherx Bipharma, PA, EE.UU., o Poly IC:LC de Oncovir) o Poly A:U; un agonista de TLR4 tal como monofosforil lfpido A (MPL) o RC-529 (por ejemplo, disponible de GSK, RU); un agonista de TLR5 tal como flagelina; un agonista de TLR7 o TLR8 tal como una imidazoquinolina; agonista de TLR7 o TLR8, por ejemplo, imiquimod (por ejemplo, AldaraTM) o resiquimod y agentes de imidazoquinolina relacionados (por ejemplo, como los disponibles de 3M Corporation); o un agonista de TLR9 tal como un desoxinucleotido con motivos CpG no metilados (llamados "CpG", por ejemplo, como los disponibles de Coley Pharmaceutical). Un agente inmunoestimulante preferido es un agonista
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de TLR3, preferentemente Poly I:C. Tales agentes inmunoestimulantes pueden administrarse simultaneamente, por separado o secuencialmente con los anticuerpos y construcciones de la presente invencion y pueden tambien unirse ffsicamente a los anticuerpos y construcciones.
Como se usa en el presente documento, el termino "unido" se refiere a la asociacion de dos o mas moleculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace tambien puede ser genetico (es decir, fusionado recombinantemente). Tales enlaces pueden lograrse usando una amplia variedad de tecnicas reconocidos en la tecnica, tales como conjugacion qufmica y produccion de protefnas recombinantes.
Como se usa en el presente documento, el termino "presentacion cruzada" de antfgeno se refiere a la presentacion de antfgenos de protefnas exogenos a linfocitos T por medio de moleculas MHC clase I y clase II en APCs.
Como se usa en el presente documento, el termino "respuesta mediada por linfocitos T" se refiere a cualquier respuesta mediada por linfocitos T, que incluye linfocitos T efectores (por ejemplo, celulas CD8+) y linfocitos T cooperadores (por ejemplo, celulas CD4+). Las respuestas mediadas por linfocitos T incluyen, por ejemplo, citotoxicidad y proliferacion de linfocitos T.
Como se usa en el presente documento, el termino "respuesta de linfocitos T citotoxicos (CTL)" se refiere a una respuesta inmunitaria inducida por linfocitos T citotoxicos. Las respuestas de CTL estan mediadas principalmente por linfocitos T CD8+.
Como se usa en el presente documento, los terminos "inhibe" o "bloquea" (por ejemplo, con referencia a la inhibicion/bloqueo de la union de CD70 a CD27 en celulas) se usan indistintamente y engloban tanto inhibicion/bloqueo parcial como completo. La inhibicion/bloqueo de CD70 reduce o altera preferentemente el nivel normal o el tipo de actividad que se produce cuando la union CD70 se produce sin inhibicion o bloqueo. Se pretende que la inhibicion y bloqueo tambien incluyan cualquier disminucion medible en la afinidad de union de CD70 cuando entra en contacto con un anticuerpo anti-CD27 en comparacion con CD70 que no esta en contacto con un anticuerpo anti-CD27, por ejemplo, inhibe la union de CD70 al menos aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % , 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. En una realizacion preferida, el anticuerpo anti-CD27 inhibe la union de CD70 al menos aproximadamente el 70 %. En otra realizacion, el anticuerpo anti-CD27 inhibe la union de CD70 al menos el 80 %.
Como se usa en el presente documento, el termino "inhibe el crecimiento" (por ejemplo, con referencia a celulas) pretende incluir cualquier disminucion medible en el crecimiento de una celula, por ejemplo, la inhibicion del crecimiento de una celula al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o el 100 %.
Los terminos "inducir una respuesta inmunitaria" y "mejorar una respuesta inmunitaria" se usan indistintamente y se refieren a la estimulacion de una respuesta inmunitaria (es decir, tanto pasiva como adaptativa) a un antfgeno particular. El termino "induce", como se usa con respecto a inducir CDC o ADCC, se refiere a la estimulacion de mecanismos particulares de destruccion celular directa. Por ejemplo, en una realizacion, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o el 60 % de lisis por medio de CDC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml. En una realizacion preferida, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 40 % de lisis por medio de CDC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml. En otra realizacion, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o el 85 % de lisis por medio de ADCC (es decir, lisis especffica) de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml. En una realizacion preferida, el anticuerpo induce al menos aproximadamente el 40 % de lisis por medio de ADCC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml.
Los terminos "tratar", "tratando" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren a medidas terapeuticas o preventivas descritas en el presente documento. Los metodos de "tratamiento" emplean la administracion a un sujeto, en necesidad de tal tratamiento, de un anticuerpo humano de la presente invencion, por ejemplo, un sujeto en necesidad de una respuesta inmunitaria mejorada contra un antfgeno particular o un sujeto que finalmente pueda adquirir un trastorno tal, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de o mejorar uno o mas sfntomas del trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto mas alla de la esperada en ausencia de dicho tratamiento.
El termino "dosis eficaz" o "dosificacion eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. El termino "dosis terapeuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad del trastorno que este tratandose y del estado general del sistema inmunitario del paciente.
El termino "paciente" incluye seres humanos y otros sujetos animales que reciben tanto tratamiento profilactico como terapeutico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los anticuerpos y composiciones de la presente invencion pueden usarse para tratar un sujeto con un trastorno inmunitario. El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamfferos y no mamfferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
En las siguientes subsecciones se describen diversos aspectos de la invencion en mas detalle.
I. Produccion de anticuerpos para CD27
La presente invencion engloba anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos completamente humanos que se unen a CD27, por ejemplo, CD27 humana, como se ha definido anteriormente. Anticuerpos monoclonales que se unen a CD27 a modo de ejemplo incluyen 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando una variedad de tecnicas conocidas, tales como tecnica de hibridacion celular somatica estandar descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos de hibridacion celular somatica, en principio, tambien pueden emplearse otras tecnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformacion viral u oncogenica de linfocitos B, tecnica de presentacion en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.
Por consiguiente, en un caso, se usa un metodo de hibridoma para producir un anticuerpo que se une a CD27 humana. En este metodo, un raton u otro animal huesped apropiado puede inmunizarse con un antfgeno adecuado con el fin de provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especfficamente al antfgeno usado para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos pueden fusionarse luego con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma estan creciendo se ensaya para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno. Despues de identificar las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitante y cultivarse por metodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, lfquido ascftico o suero mediante procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, protefna A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.
En otro caso, los anticuerpos y porciones de anticuerpo que se unen a CD27 humana pueden aislarse de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando tecnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty et al., Nature, 348:552554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) y Hoet et al (2005) Nature Biotecnologfa 23, 344-348; las patentes de EE.UU. N.° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 a Ladner et al.; las patentes de EE.UU. N.° 5.427.908 y 5.580.717 a Dower et al.; las patentes de EE.UU. N.° 5.969.108 y 6.172.197 a McCafferty et al.; y las patentes de EE.UU. N.° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 a Griffiths et al. Adicionalmente, puede usarse la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), ademas de infeccion combinatoria y recombinacion in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)).
En un caso particular, el anticuerpo que se une a CD27 humana se produce usando la tecnica de presentacion en fagos descrita por Hoet et al., arriba. Esta tecnica implica la generacion de una biblioteca de Fab humanos que tiene una unica combinacion de secuencias de inmunoglobulinas aisladas de donantes humanos y que tienen diversidad sintetica en las CDRs de cadena pesada se genera. La biblioteca se criba entonces para Fabs que se unen a CD27 humana.
El sistema animal preferido para generar hibridomas que produce anticuerpos es el sistema murino. En la tecnica es muy conocida la produccion de hibridomas en el raton, que incluye protocolos de inmunizacion y tecnicas para aislar y fusionar esplenocitos inmunizados.
En un caso, los anticuerpos dirigidos contra CD27 se generan usando ratones transgenicos o transcromosomicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema del raton. En un caso, se emplean ratones transgenicos, denominados en el presente documento "ratones HuMAb" que contienen un minilocus de gen de la inmunoglobulina humano que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (p y y) y ligera k humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endogenos de la cadena p y y (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes introducidos de cadena pesada y ligera humanas experimentan cambio de clase y mutacion somatica para generar anticuerpos monoclonales IgGK de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), arriba; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, y Harding, F. and Lonberg, N. (1995)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546). La preparacion de ratones HuMAb se describe en detalle en la Seccion II mas adelante y en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:29122920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536- 546;Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Veanse tambien las patentes de EE.UU. N.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299 y 5.770.429, todas de Lonberg and Kay, y GenPharm International; la patente de EE.UU. N.° 5.545.807 de Surani et al.; publicacion internacional N.° WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645, publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992.
Inmunizaciones
Para generar anticuerpos completamente humanos para CD27, pueden inmunizarse ratones transgenicos o transcromosomicos que contienen genes de la inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones HCo12, HCo7 o KM) con una preparacion purificada o enriquecida del antfgeno CD27 y/o celulas que expresan CD27, como se describe, por ejemplo, en Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y el documento WO 98/24884. Como se describe en el presente documento, los ratones HuMAb se inmunizan tanto con protefnas CD27 recombinantes como lfneas celulares que expresan CD27 como inmunogenos. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con CD27 humana que codifica ADN. Preferentemente, los ratones tendran 6-16 semanas de edad tras la primera infusion. Por ejemplo, puede usarse una preparacion purificada o enriquecida (5-50 pg) del antfgeno CD27 recombinante para inmunizar los ratones HuMAb por via intraperitoneal. En el supuesto caso de que las inmunizaciones usando una preparacion purificada o enriquecida del antfgeno CD27 no produzcan anticuerpos, los ratones tambien pueden inmunizarse con celulas que expresan CD27, por ejemplo, una lfnea celular, para promover respuestas inmunitarias. Lfneas celulares a modo de ejemplo incluyen lfneas celulares CHO y Raji estables que expresan en exceso CD27.
La experiencia acumulada con diversos antfgenos ha demostrado que los ratones transgenicos HuMAb responden mejor cuando se inmunizan inicialmente por via intraperitoneal (IP) o por via subcutanea (SC) con el antfgeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP/SC cada dos semanas (hasta un total de 10) con antfgeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse durante el transcurso del protocolo de inmunizacion con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales. El plasma puede cribarse por ELISA (tal como se describe a continuacion), y pueden usarse ratones con tftulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-CD27 para las fusiones. Los ratones pueden reforzarse por via intravenosa con antfgeno 3 dfas antes del sacrificio y extraccion del bazo.
Generacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para CD27
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para CD27, pueden aislarse esplenocitos y celulas de los ganglios linfaticos de ratones inmunizados y fusionarse con una lfnea celular inmortalizada apropiada, tal como una lfnea celular de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes pueden entonces cribarse para la produccion de anticuerpos especfficos de antfgeno. Por ejemplo, pueden fusionarse suspensiones de celulas individuales de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados con celulas de mieloma de raton que no secretan SP2/0-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50 % de PEG (p/v). Las celulas pueden sembrarse a aproximadamente 1 x 105 en placas de microtitulacion de fondo plano, seguido de una incubacion de dos semanas en medio selectivo que contiene, ademas de los reactivos comunes, 10 % de suero de clon fetal, 5-10 % de factor de clonacion de hibridomas Origen (IGEN) y 1X HAT (Sigma). Despues de aproximadamente dos semanas, las celulas pueden cultivarse en medio en el que HAT se sustituye con HT. Los pocillos individuales pueden entonces cribarse mediante ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti-CD27 humanos o para unirse a la superficie de celulas que expresan CD27, por ejemplo, una lfnea celular CHO que expresa CD27, mediante FLISA (ensayo inmunoabsorbente unido a fluorescencia). Una vez se produce el extenso crecimiento de hibridomas, el medio puede observarse normalmente despues de 10-14 dfas. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden volver a sembrarse, volver a cribarse, y si siguen siendo positivos para IgG, anticuerpos monoclonales anti-CD27 pueden subclonarse al menos dos veces mediante dilucion limitante. Los subclones estables pueden entonces cultivarse in vitro para generar anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterizacion.
Generacion de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales para CD27
Tambien pueden producirse anticuerpos de la invencion en un transfectoma de celula huesped usando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfeccion de genes como es muy conocido en la tecnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Por ejemplo, en una realizacion, el (los) gen(es) de interes, por ejemplo, genes de anticuerpo humano, pueden unirse en un vector de expresion tal como un plasmido de expresion eucariota tal como se usa por el sistema de expresion de genes GS desvelado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841, u otros sistemas de expresion muy conocidos en la tecnica. El plasmido purificado con los genes de anticuerpo clonado puede introducirse en celulas huesped eucariotas tales como celulas CHO o celulas NSO o alternativamente otras celulas eucariotas como celulas derivadas de plantas, celulas de hongos o levadura. El metodo usado para introducir estos genes podrfan ser metodos los metodos descritos en la tecnica tales como electroporacion, lipofectina, lipofectamina u otros. Despues de introducir estos genes de anticuerpo en las celulas huesped, pueden identificarse y seleccionarse celulas que expresan el anticuerpo. Estas celulas representan los transfectomas que pueden luego amplificarse para su nivel de expresion y subir de nivel para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes y/o celulas de cultivo.
Alternativamente, estos genes de anticuerpo clonado pueden expresarse en otros sistemas de expresion tales como E. coli o en organismos completos o pueden expresarse sinteticamente.
Uso de secuencias de anticuerpo parciales para expresar anticuerpos intactos
Los anticuerpos interaccionan con antfgenos diana predominantemente mediante restos de aminoacidos que estan localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoacidos dentro de las CDRs son mas diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayorfa de las interacciones anticuerpo-antfgeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos especfficos que existen de forma natural construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo especffico que existe de forma natural injertadas en secuencias de la region estructural de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; y Queen, C. et al., 1989, Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1002910033). Tales secuencias de la region estructural pueden obtenerse de bases de datos de ADN publicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la lfnea germinal. Estas secuencias de la lfnea germinal se diferenciaran de secuencias de genes de anticuerpos maduros debido a que no incluiran genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la union de V(D)J durante la maduracion de linfocitos B. Las secuencias de genes de la lfnea germinal tambien se diferenciaran de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en individuos uniformemente a traves de la region variable. Por ejemplo, las mutaciones somaticas son relativamente poco frecuentes en la porcion del extremo amino de la region estructural. Por ejemplo, las mutaciones somaticas son relativamente poco frecuentes en la porcion del extremo amino de la region estructural 1 y en la porcion del extremo carboxi de la region estructural 4. Ademas, muchas mutaciones somaticas no alteran significativamente las propiedades de union del anticuerpo. Por este motivo, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular con el fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de union similares a las del anticuerpo original (vease el documento PCT/US99/05535 presentado el 12 de marzo de 1999). La secuencia de cadena pesada y ligera parcial que engloba las regiones CDR es normalmente suficiente a para este fin. Se usa la secuencia parcial para determinar que segmentos de genes variables y de union de la lfnea germinal contribuyeron a los genes variables de anticuerpo recombinado. La secuencia de la lfnea germinal se usa luego para llenar porciones ausentes de las regiones variables. Las secuencias conductoras de cadena pesada y ligera se escinden durante la maduracion de protefna y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para anadir secuencias ausentes, pueden combinarse secuencias de ADNc clonadas con oligonucleotidos sinteticos mediante ligacion o amplificacion por PCR. Alternativamente, la region variable completa puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleotidos cortos que se superponen y combinarse mediante amplificacion por PCR para crear un clon de region variable completamente sintetico. Este proceso tiene ciertas ventajas tales como eliminacion o inclusion o sitios de restriccion particulares u optimizacion de codones particulares.
Las secuencias de nucleotidos de transcritos de cadena pesada y ligera de un hibridoma se usan para disenar un conjunto que se superpone de oligonucleotidos sinteticos para crear secuencias V sinteticas con capacidades de codificacion de aminoacidos identicas a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sinteticas pueden diferenciarse de las secuencias naturales en tres formas: se interrumpen cadenas de bases de nucleotido repetidas para facilitar la sfntesis de oligonucleotidos y la amplificacion por PCR; se incorporan sitios de iniciacion de la traduccion optimos segun las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870) y se manipulan sitios Hindi!! en la direccion 5' de los sitios de iniciacion de la traduccion.
Tanto para las regiones variables de cadena pesada como ligera, las secuencias de cadena codificante optimizada y no codificante correspondiente se fragmentan en 30 - 50 nucleotidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleotido no codificante correspondiente. Asf, para cada cadena, los oligonucleotidos pueden ensamblarse en conjuntos bicatenarios superpuestos que abarcan segmentos de 150 - 400 nucleotidos. Los conjuntos se usan entonces como moldes para producir productos de amplificacion por PCR de 150 - 400 nucleotidos. Normalmente, un unico conjunto de oligonucleotidos de region variable se fragmentara en dos conjuntos que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR que se superponen. Estos productos que se superponen se combinan entonces mediante amplificacion por PCR para formar la region variable completa. Tambien puede desearse incluir
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
un fragmento que se superpone de la region constante de cadena pesada o ligera (que incluye el sitio Bbsl de la cadena ligera kappa o el sitio Agel si es la cadena pesada gamma) en la amplificacion por PCR para generar fragmentos que pueden clonarse facilmente en las construcciones de vector de expresion.
Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan entonces con el promotor clonado, secuencia conductora, iniciacion de la traduccion, secuencia conductora, secuencia de region constante, 3' no traducida, poliadenilacion y terminacion de la transcripcion para formar construcciones de vector de expresion. Las construcciones de expresion de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un unico vector, co-transfectarse, transfectarse en serie o transfectarse por separado en celulas huesped que luego se fusionan para formar una celula huesped que expresa ambas cadenas.
Se construyeron plasmidos para su uso en la construccion de vectores de expresion de forma tal que las secuencias de ADNc de cadena pesada V y ligera kappa amplificadas por PCR pudieran usarse para la reconstruccion de minigenes de cadena pesada y ligera completos. Estos plasmidos pueden usarse para expresar anticuerpos IgGi k o IgG4 k completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos y quimericos de la presente invencion tambien incluyen anticuerpos IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM e IgD. Pueden construirse plasmidos similares para la expresion de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresion de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.
Asf, las caracterfsticas estructurales de los anticuerpos anti-CD27 de la invencion puede usarse para crear anticuerpos anti-CD27 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invencion, tales como, por ejemplo,
(1) inhiben (por ejemplo, bloquean completa o parcialmente) la union de CD70 a celulas que expresan CD27 al menos aproximadamente el 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 % o al menos el 70 %, a una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml);
(2) se unen a CD27 humana con una constante de disociacion en equilibrio Kd de 10"9 M o menos o, alternativamente, una constante de asociacion en equilibrio Ka de 10+9 M"1 o mayor
(3) inducen al menos aproximadamente el 30 % de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml (o inducen al menos el 30 % o al menos aproximadamente el 40 % o al menos el 40 % de CDC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml);
(4) inducen al menos aproximadamente el 30 % de lisis mediada por ADCC especffica de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml (o inducen al menos el 30 % o al menos aproximadamente el 40 % o al menos el 40 % de lisis mediada por ADCC especffica de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml);
(5) previenen o inhiben el crecimiento de celulas tumorales que expresan CD27 en un modelo de xenoinjerto (por ejemplo, reducen el tamano del tumor en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) al menos aproximadamente el 50 % 20 dfas despues de la inoculacion de celulas tumorales in vivo a 0,5 mg ip en al menos 6 dfas);
(6) inducen o mejoran las respuestas inmunitarias especfficas del antfgeno cuando se combinan con una vacuna u otro antfgeno;
(7) inducen o mejoran las respuestas inmunitarias, en particular, pero no se limitan a, respuestas inmunitarias TH1;
(8) inducen o mejoran la actividad de linfocitos T, en particular, pero no se limitan a, numeros de linfocitos T CD8+ especfficos o actividad funcional o proliferacion o activacion de linfocitos T y/o
(9) reducen o inhiben la proliferacion o activacion de los linfocitos T. En una realizacion, las regiones CDR de los anticuerpos de la invencion pueden combinarse recombinantemente con regiones estructurales conocidas y CDRs para crear anticuerpos anti-CD27 adicionales modificados recombinantemente de la invencion. Las regiones estructurales variables de cadena pesada y ligera pueden derivar de las mismas secuencias de anticuerpos o secuencias diferentes. Las secuencias de anticuerpos pueden ser las secuencias de anticuerpos que existen de forma natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos. Vease Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) y Carter et al., documento WO 92/22653.
Tambien se describe en el presente documento un metodo de preparacion de un anticuerpo anti-CD27 que incluye: preparar un anticuerpo que incluye (1) regiones estructurales de cadena pesada y CDRs de cadena pesada, donde al menos una de las CDRs de cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada de las secuencias de aminoacidos de las CDRs mostradas en SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 50, 51, 52, 62, 63, 64, 74, 75, 76, 86, 87, 88, 104, 105, 106; y (2) regiones estructurales de cadena ligera y CDRs de cadena ligera, donde al menos una de las CDRs de cadena ligera incluye una secuencia de aminoacidos seleccionada de las secuencias de aminoacidos de las CDRs mostradas en SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 44, 45, 46, 56, 57, 58, 68, 69, 70, 80, 81, 82, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 110, 111, 112; donde el anticuerpo retiene la capacidad para unirse a CD27. La capacidad del anticuerpo para unirse a CD27 puede determinarse usando ensayos de union estandar, tales como aquellos expuestos en los ejemplos (por ejemplo, un ELISA o un FLISA).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Es muy conocido en la tecnica que los dominios de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempenan una funcion particularmente importante en la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo por un antfgeno (vease, Hall et al., J. Immunol., 149:1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152:5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193:400-419 (1995); Klimka et al., Brit. J. Cancer, 83:252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157:739-749 (1996)). Por consiguiente, los anticuerpos recombinantes de la invencion preparados como se expone anteriormente preferentemente comprenden las CDR3s de cadena pesada y/o ligera de anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5. Los anticuerpos pueden comprender ademas las CDR2s de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5. Los anticuerpos pueden comprender ademas las CDR1s de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5. Los anticuerpos pueden comprender ademas cualquier combinacion de las CDRs.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos anti-CD27 que comprenden: (1) regiones estructurales de la cadena pesada, una region CDR1 de la cadena pesada, una region CDR2 de la cadena pesada y una region CDR3 de la cadena pesada, en las que la region CDR3 de la cadena pesada se selecciona de las CDR3s de 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5 y (2) regiones estructurales de la cadena ligera, una region CDR1 de la cadena ligera, una region CDR2 de la cadena ligera y una region CDR3 de la cadena ligera, en las que la region CDR3 de cadena ligera se selecciona de las CDR3s de 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5, en las que el anticuerpo se une a CD27. El anticuerpo puede incluir ademas la CDR2 de la cadena pesada y/o la CDR2 de la cadena ligera de los anticuerpos 1F5, 1h8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5. El anticuerpo puede comprender ademas la CDR1 de la cadena pesada y/o la CDR1 de la cadena ligera de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5.
Generation de anticuerpos que tienen secuencias modificadas
En otra realizacion, las secuencias de la region variable, o porciones de la misma, de los anticuerpos anti-CD27 de la invencion se modifican para crear anticuerpos anti-CD27 estructuralmente relacionados que retienen la union (es decir, al mismo epitope que el anticuerpo no modificado) y, por lo tanto, son funcionalmente equivalentes. Metodos de identificacion de residuos que pueden alterarse sin eliminar la union al antfgeno son muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Marks et al. (Biotechnology (1992) 10(7):779-83 (diversificacion de anticuerpos monoclonales mediante barajado de regiones variables de la cadena ligera, luego regiones variables de la cadena pesada con cambios de secuencias de CDR3 fijos), Jespers et al. (1994) Biotechnology 12(9):899-903 (seleccion de anticuerpos humanos de repertorios de presentacion en fagos a un unico epitope de un antfgeno), Sharon et al. (1986) PNAS USA 83(8):2628-31 (mutagenesis dirigida al sitio de un resto de aminoacido invariable en la union de segmentos de diversidad variable de un anticuerpo); Casson et al. (1995) J. Immunol. 155(12):5647-54 (evolucion de perdida y cambio de especificidad resultante de mutagenesis al azar de una region variable de cadena pesada de anticuerpo).
Por consiguiente, las regiones CDR1, 2 y/o 3 de los anticuerpos manipulados descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) de aminoacidos exacta(s) como la(s) de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5 desveladas en el presente documento. Sin embargo, en otros casos, los anticuerpos comprenden derivados de las secuencias de CDR exactas de 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5, pero todavfa retienen la capacidad de unirse a CD27 eficazmente. Tales modificaciones de secuencias pueden incluir una o mas adiciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos, por ejemplo, modificaciones de secuencia conservativas como ha descrito anteriormente. Las modificaciones de secuencia tambien pueden basarse en las secuencias consenso descritas anteriormente para las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 particulares de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2C2, 2G9, 3H8 y 1G5.
Por consiguiente, el anticuerpo modificado puede estar compuesto de una o mas CDRs que son, por ejemplo, el 90 %, 95 %, 98 % o el 99,5 % identicas a una o mas CDRs de los anticuerpos 1F5, 1H8, 3H12, 3A10, 2c2, 2G9, 3H8 y 1G5. Tambien se pretende que esten englobados intervalos intermedios a los valores anteriormente citados, por ejemplo, CDRs que son el 90-95 %, 95-98 % o el 98-100 % de identidad identica a una o mas de las secuencias.
Puede alterarse uno o mas residuos de una CDR para modificar la union para lograr una constante de asociacion de union mas favorecida y una constante de disociacion de union mas favorecida, o ambas, de forma tal que se logre una constante de union idealizada. Usando esta estrategia puede lograrse un anticuerpo que tiene una afinidad de union ultra-alta de, por ejemplo, 1010 M-1 o mas. Pueden usarse tecnicas de maduracion de afinidad, muy conocidas en la tecnica y aquellas descritas en el presente documento, para alterar una o mas regiones CDR(s), seguido de cribado de las moleculas de union resultantes para el cambio deseado en la union. Por consiguiente, a medida que se alteran la(s) CRD(s), pueden monitorizarse los cambios en la afinidad de union, ademas de la inmunogenicidad, y puntuarse de forma que se logre un anticuerpo optimizado para la mejor union combinada y baja inmunogenicidad.
Ademas de o en lugar de las modificaciones dentro de las CDRs, tambien pueden hacerse modificaciones dentro de una o mas de las regiones estructurales FR1, FR2, FR3 y FR4, de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, siempre que estas modificaciones no eliminen la afinidad de union del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas restos de aminoacidos que no son de la lfnea germinal en las regiones estructurales de la region variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo de la invencion se sustituyen con un resto de aminoacidos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la linea germinal, es decir, el resto de aminoacidos correspondiente en la secuencia de la linea germinal humana para la region variable de cadena pesada o ligera, con el que el anticuerpo tiene identidad de secuencia significativa. Por ejemplo, puede alinearse una cadena de anticuerpo con una cadena de anticuerpo de la linea germinal con la que comparte identidad de secuencia significativa y los restos de aminoacidos que no se corresponden entre la secuencia de la region estructural del anticuerpo y la region estructural de la cadena de la linea germinal pueden sustituirse con restos correspondientes de la secuencia de la linea germinal. Cuando un aminoacido se diferencia entre una region estructural variable de un anticuerpo y una region estructural variable de la secuencia de la linea germinal humana equivalente, el aminoacido de la region estructural del anticuerpo debe normalmente sustituirse con el aminoacido de la secuencia de la linea germinal humana equivalente si se espera razonablemente que el aminoacido entre dentro de una de las siguientes categorfas:
(1) un resto de aminoacido que une no covalentemente el antfgeno directamente,
(2) un resto de aminoacido que es adyacente a una region CDR,
(3) un resto de aminoacido que interacciona de otro modo con una region CDR (por ejemplo, esta dentro de
aproximadamente 3-6 A de una region CDR como se ha determinado por modelado informatico) o
(4) un resto de aminoacido que participa en la interfase VL-VH.
Restos que "unen no covalentemente el antfgeno directamente" incluyen aminoacidos en las posiciones en regiones estructurales que tienen una buena probabilidad de interaccionar directamente con los aminoacidos en el antfgeno segun fuerzas qufmicas establecidas, por ejemplo, por enlace de hidrogeno, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofobas y similares. Por consiguiente, en una realizacion, un resto de aminoacido en la region estructural de un anticuerpo de la invencion esta sustituido con el resto de aminoacido de la linea germinal correspondiente que une no covalentemente el antfgeno directamente.
Restos que estan "adyacentes a una region CDR" incluyen restos de aminoacidos en posiciones inmediatamente adyacentes a una o mas de las CDRs en la secuencia primaria del anticuerpo, por ejemplo, en las posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR como se define por Kabat o una CDR como se define por Chothia (vease, por ejemplo, Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Por consiguiente, en una realizacion, un resto de aminoacido dentro de la region estructural de un anticuerpo de la invencion esta sustituido con un resto de aminoacido de la linea germinal correspondiente que es adyacente a una region CDR.
Restos que "interaccionan de otra manera con una region CDR" incluyen aquellos que se determina mediante analisis estructural secundario que estan en una orientacion espacial suficiente como para afectar una region CDR. Tales aminoacidos generalmente tendran un atomo de cadena lateral dentro de aproximadamente 3 unidades de angstrom (A) de algun atomo en las CDRs y deben contener un atomo que podrfa interaccionar con los atomos de CDR segun fuerzas qufmicas establecidas, tales como aquellas enumeradas anteriormente. Por consiguiente, en una realizacion, un restos de aminoacido dentro de la region estructural de un anticuerpo de la invencion esta sustituido con el resto de aminoacido de la linea germinal correspondiente que interacciona de otro modo con una region CDR.
Se sabe que los aminoacidos en varias posiciones en la region estructural son importantes para determinar la confirmacion de CDR (por ejemplo, capaces de interaccionar con las CDRs) en muchos anticuerpos (Chothia and Lesk, arriba, Chothia et al., arriba, y Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990)). Estos autores identificaron restos de la region estructural conservados importantes para la conformacion de CDR mediante el analisis de las estructuras de varios anticuerpos conocidos. Los anticuerpos analizados se encontraban en un numero limitado de clases estructurales o "canonicas" basandose en la conformacion de las CDRs. Los restos de la region estructural conservados dentro de los miembros de una clase canonica se denominan restos "canonicos". Los restos canonicos incluyen los restos 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 y 95 de la cadena ligera y los restos 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 y 94 de la cadena pesada. Pueden identificarse restos adicionales (por ejemplo, restos que determinan la estructura de CDR) segun la metodologfa de Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263:800. En particular, se sabe que los aminoacidos en las posiciones 2, 48, 64 y 71 de la cadena ligera y 26-30, 71 y 94 de la cadena pesada (enumeracion segun Kabat) son capaces de interaccionar con las CDRs en muchos anticuerpos. Tambien es probable que los aminoacidos en las posiciones 35 en la cadena ligera y 93 y 103 en la cadena pesada interaccionen con las CDRs. Pueden identificarse restos adicionales que pueden afectar la conformacion de las CDRs segun la metodologfa de Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487. Tales restos se denominan restos "vernier" y son aquellos restos en la region estructural que subyacen cerca de (es decir, forman una "plataforma" por debajo de) las cDr.
Los restos que "participan en la interfase VL-VH" o "restos de relleno" incluyen aquellos restos en la interfase entre VL y VH como se define, por ejemplo, en Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985) o Chothia et at., arriba.
Ocasionalmente, existe cierta ambiguedad acerca de si un aminoacido particular esta dentro de una o mas de las categorfas anteriormente mencionadas. En tales casos, se producen anticuerpos variantes alternativos, uno de los cuales tiene esa sustitucion particular, el otro no la tiene. Los anticuerpos variantes alternativos asf producidos pueden probarse en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento para la actividad deseada y el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
anticuerpo preferido seleccionado.
Candidatos adicionales para la sustitucion dentro de la region estructural son los aminoacidos que son poco usuales
0 "raros" para un anticuerpo en esa posicion. Estos aminoacidos pueden sustituirse con aminoacidos de la posicion equivalente de la secuencia de la lfnea germinal humana o de posiciones equivalentes de anticuerpos mas tfpicos. Por ejemplo, la sustitucion puede ser deseable cuando el aminoacido en una region estructural del anticuerpo es raro para esa posicion y el aminoacido correspondiente en la secuencia de la lfnea germinal es comun para esa posicion en las secuencias de inmunoglobulina; o cuando el aminoacido en el anticuerpo es raro para esa posicion y el aminoacido correspondiente en la secuencia de la lfnea germinal tambien es raro, con respecto a otras secuencias. Se contempla que sustituyendo un aminoacido poco usual con un aminoacido de la secuencia de la lfnea germinal que es tfpico para los anticuerpos, el anticuerpo puede hacerse menos inmunogenico.
El termino "raro", como se usa en el presente documento, indica un aminoacido que se produce en esa posicion en menos de aproximadamente el 20 %, preferentemente menos de aproximadamente el 10 %, mas preferentemente menos de aproximadamente el 5 %, incluso mas preferentemente menos de aproximadamente el 3 %, incluso mas preferentemente menos de aproximadamente el 2 % e incluso mas preferentemente menos de aproximadamente el
1 % de secuencias en una muestra de secuencias representativa y el termino "comun", como se usa en el presente documento, indica un aminoacido que se produce en mas de aproximadamente el 25 % pero normalmente mas de aproximadamente el 50 % de secuencias en una muestra representativa. Por ejemplo, todas las secuencias de region variable de cadena ligera y pesada se agrupan respectivamente en "subgrupos" de secuencias que son especialmente homologos unos con respecto a los otros y tienen los mismos aminoacidos en ciertas posiciones crfticas (Kabat et al., arriba). Cuando se decide si un aminoacido en una secuencia de anticuerpo es "raro" o "comun" entre las secuencias, frecuentemente sera preferible considerar solo aquellas secuencias en el mismo subgrupo que la secuencia de anticuerpo.
En general, las regiones estructurales de los anticuerpos son normalmente sustancialmente identicas, y mas sustancialmente, identicas a las regiones estructurales de las secuencias de lfnea germinal humana de la que derivaron. Por supuesto, muchos de los aminoacidos en la region estructural hacen una contribucion pequena, o no directa, a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Asf, muchas sustituciones conservativas individuales de los restos de la region estructural pueden ser toleradas sin un cambio apreciable de la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina resultante. Asf, en una realizacion, la region estructural variable del anticuerpo comparte al menos el 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de la region estructural variable de la lfnea germinal humana o consenso de tales secuencias. En otra realizacion, la region estructural variable del anticuerpo comparte al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de la region estructural variable de la lfnea germinal humana o consenso de tales secuencias.
Ademas de simplemente unirse a CD27, un anticuerpo puede seleccionarse por su retencion de otras propiedades funcionales de anticuerpos de la invencion, tales como, por ejemplo:
(1) inhibe (por ejemplo, bloquea completa o parcialmente) la union de CD70 a celulas que expresan CD27 al menos aproximadamente el 70 %;
(2) se une a CD27 humana con una constante de disociacion en equilibrio Kd de 10-9 M o menos o, alternativamente, una constante de asociacion en equilibrio Ka de 10+9 M-1 o mayor;
(3) induce al menos aproximadamente el 40 % de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml y/o
(4) induce al menos aproximadamente el 40 % de lisis especffica mediada por ADCC de celulas que expresan CD27 a una concentracion de 10 pg/ml.
Caracterizacion de anticuerpos monoclonales para CD27
Los anticuerpos monoclonales de la invencion pueden caracterizarse por unirse a CD27 usando una variedad de tecnicas conocidas. Generalmente, los anticuerpos se caracterizan inicialmente por ELISA. Brevemente, pueden recubrirse placas de microtitulacion con CD27 purificada en PBS, y luego bloquearse con protefnas irrelevantes tales como albumina en suero bovino (BSA) diluida en PBS. Se anaden diluciones de plasma de ratones inmunizados con CD27 a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween 20 y luego se incuban con reactivo policlonal especffico de Fc anti-IgG humana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 °C. Despues de lavar, las placas se desarrollan con sustrato ABTS y se analizan a DO de 405. Preferentemente, para las fusiones se usaran ratones que desarrollan los tftulos mas altos.
Puede usarse un ensayo ELISA como se ha descrito anteriormente para cribar anticuerpos y, asf, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunogen CD27. Los hibridomas que se unen, preferentemente con afinidad alta, a CD27 pueden entonces subclonarse y caracterizarse adicionalmente. Entonces puede elegirse un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las celulas originales (por ELISA), para preparar un banco de celulas y para la purificacion de anticuerpos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para purificar los anticuerpos anti-CD27, los hibridomas seleccionados pueden cultivarse en botellas de cultivo rotatorias, matraces de agitacion de dos litros u otros sistemas de cultivo. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatograffa de afinidad con protefna A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) para purificar la protefna. Despues del intercambio de tampon a PBS, la concentracion puede determinarse por DO280 usando el coeficiente de extincion 1,43 o preferentemente por analisis nefelometrico. La IgG puede comprobarse por electroforesis en gel y por el metodo especffico del antfgeno.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CD27 seleccionados se unen a epitopes unicos, cada anticuerpo puede biotinilarse usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). La union a mAb biotinilados puede detectarse con una sonda marcada con estreptavidina. Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, pueden realizarse ELISAs de isotipo usando tecnicas reconocidas en la tecnica. Por ejemplo, los pocillos de placas de microtitulacion pueden recubrirse con 10 pg/ml de anti-Ig durante la noche a 4 °C. Despues de bloquear con 5 % de BSA, las placas se hacen reaccionar con 10 pg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. Los pocillos pueden entonces hacerse reaccionar con IgG1 u otras sondas conjugadas especfficas de isotipo. Las placas se desarrollan y se analizan como se ha descrito anteriormente.
Para probar la union de anticuerpos monoclonales a celulas vivas que expresan CD27, puede usarse citometrfa de flujo. Brevemente, las lfneas celulares y/o CMSP humanas que expresan CD27 unida a la membrana (cultivadas en condiciones normales de crecimiento) se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene 0,1 % de BSA a 4 °C durante 1 hora. Despues de lavar, las celulas se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG marcado con fluorescefna en las mismas condiciones que la tincion del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse con el instrumento FACScan usando luz y propiedades de dispersion lateral para regular celulas individuales y se determina la union de los anticuerpos marcados. Puede usarse un ensayo alternativo usando microscopfa de fluorescencia (ademas del o en vez del) ensayo de citometrfa de flujo. Las celulas pueden tenirse exactamente se ha descrito anteriormente y examinarse mediante microscopfa de fluorescencia. Este metodo permite la visualizacion de celulas individuales, pero puede tener sensibilidad reducida dependiendo de la densidad del antfgeno.
Pueden probarse adicionalmente IgG anti-CD27 para reactividad con el antfgeno CD27 por transferencia Western. Brevemente, pueden prepararse extractos celulares de celulas que expresan CD27 y someterse a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Despues de la electroforesis, los antfgenos separados se transferiran a membranas de nitrocelulosa, se bloquearan con 20 % de suero de raton y se probaran con los anticuerpos monoclonales a probar. La union a IgG puede detectarse usando fosfatasa alcalina anti-IgG y desarrollarse con pastillas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Los metodos de analisis de la afinidad de union, reactividad cruzada y cinetica de union de diversos anticuerpos anti- CD27 incluyen ensayos estandar conocidos en la tecnica, por ejemplo, analisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) Biacore™ usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia), como se describe en el Ejemplo 2 en el presente documento.
II. Inmunotoxinas
En otra realizacion, los anticuerpos de la presente invencion estan unidos a un resto terapeutico, tal como una citotoxina, un farmaco o un radioisotopo. Cuando estan conjugados con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las celulas (por ejemplo, las mata). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procafna, tetracafna, lidocafna, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invencion puede conjugarse con un radioisotopo, por ejemplo, yodo radiactivo, para generar radiofarmaceuticos citotoxicos para tratar un trastorno relacionado con las dendritas, tal como una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, o enfermedad de injerto contra huesped.
Los conjugados de anticuerpo de la invencion pueden usarse para modificar una respuesta biologica dada, y el resto de farmaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapeuticos qufmicos clasicos. Por ejemplo, el resto de farmaco puede ser una protefna o polipeptido que posea una actividad biologica deseada. Tales protefnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina difterica; una protefna tal como factor de necrosis tumoral o interferon-Y; o modificadores de la respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las tecnicas para conjugar tales restos terapeuticos con anticuerpos son conocidos, vease, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Ill. Composiciones
En otra realizacion, la presente invencion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion que contiene uno o una combinacion de anticuerpos monoclonales de la presente invencion, formulados junto con un vehfculo (por ejemplo, un vehfculo farmaceuticamente aceptable). Tambien se proporcionan composiciones que contienen moleculas biespecfficas que comprenden un anticuerpo de la presente invencion. En una realizacion, las composiciones incluyen una combinacion de multiples (por ejemplo, dos o mas) anticuerpos aislados de la invencion. Preferentemente, cada uno de los anticuerpos de la composicion se une a un epitope preseleccionado distinto de CD27.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden administrarse en terapia de combinacion, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir una composicion de la presente invencion con al menos uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como agentes antiinflamatorios, DMARDs (farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad), agentes inmunosupresores y quimioterapeuticos. Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden administrarse conjuntamente con radioterapia. La coadministracion con otros anticuerpos tambien esta englobada por la invencion.
Como se usa en el presente documento, los terminos "vehfculo" y "vehfculo farmaceuticamente aceptable" incluyen todos y cada uno de disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, que son fisiologicamente compatibles. Preferentemente, el vehfculo es adecuado para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molecula biespecffica y multiespecffica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Ejemplos de adyuvantes que pueden usarse con los anticuerpos y construcciones de la presente invencion incluyen: Adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); sales de aluminio tales como gel de hidroxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspension insoluble de tirosina acilada; azucares acilados; polisacaridos cationica o anionicamente derivatizados; polifosfacenos; microesferas biodegradables; citocinas, tales como GM-CSF, interleucina-2, -7, -12, y otros factores similares; 3D-MPL; oligonucleotido CpG; y monofosforil lfpido A, por ejemplo, monofosforil lfpido A 3-de-O-acilado.
Los adyuvantes MPL estan disponibles en Corixa Corporation (Seattle, Wash; veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleotidos que contienen CpG (en los que el dinucleotido CpG no esta metilado) son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las patentes de EE.UU. N.° 6.008.200 y 5.856.462. Tambien se describen secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, Sato et al., Science 273:352, 1996.
Otros adyuvantes alternativos incluyen, por ejemplo, saponinas, tales como Quil A, o derivados de las mismas, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); escina; digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa; Montanide ISA 720 (Seppic, Francia); SAF (Chiron, California, Estados Unidos); IsCoMs (CSL), MF-59 (Chiron); la serie de adyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponible en SmithKline Beecham, Rixensart, Belgica); Detox (Enhanzyn™) (Corixa, Hamilton, Mont.); RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) y otros 4-fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGPs); adyuvantes de polioxietilen eter tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1; imidazoquinolinas sinteticas tales como imiquimod [S-26308, R-837] (Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001; y resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al., Cellular immunology 204: 64-74, 2000; las bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente sobre superficies de linfocitos T y celulas presentadoras de antfgenos, tales como tucaresol (Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995); citocina, quimiocina y moleculas coestimuladoras como cualquier protefna o peptido, que incluyen, por ejemplo, citocinas proinflamatorias tales como Interferon, GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa y TGF-beta, inductores de Th1 tales como interferon gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, inductores de Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y otros genes coestimuladores y de quimiocina tales como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L; agentes inmunoestimulantes que se dirigen a ligandos tales como CTLA- 4 y L-selectina, protemas y peptidos estimuladores de la apoptosis tales como Fas; adyuvantes basados en Ifpidos sinteticos, tales como vaxfectina (Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001) escualeno, alfa-tocoferol, polisorbato 80, DOPC y colesterol; endotoxina, [LPS], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); ligandos que activan receptores Toll para producir citocinas inductoras de Th1, tales como lipoprotemas micobacterianas sinteticas, protema micobacteriana p19, peptidoglicano, acido teicoico y Upido A; y CT (toxina del colera, subunidades A y B) y LT (enterotoxina labil al calor de E. coli, subunidades A y B), familia de protemas de choque termico (HSPs) y LLO (listeriolisina O; documento WO 01/72329). Estos y varios otros agonistas del receptor tipo Toll (TLR) se describen, por ejemplo, en Kanzler et al, Nature Medicine, Mayo de 2007, Vol. 13, No 5. Un agente inmunoestimulante preferido para su uso en combinacion con un anticuerpo anti-CD27 de la invencion es un agonista de TLR3, tal como Poly IC.
Una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confiere ningun efecto toxicologico no deseado (vease por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tales como clorhfdrico, mtrico, fosforico, sulfurico, bromhfdrico, yodtndrico, fosforoso y similares, asf como de acidos organicos no toxicos tales como acidos alifaticos mono- y dicarboxflicos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asf como de aminas organicas no toxicas tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocama, colina, dietanolamina, etilendiamina, procama y similares.
Una composicion de la presente invencion puede administrarse mediante una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Como sera apreciado por el experto, la via y/o el modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con vehmulos que protegeran al compuesto de la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada que incluye implantes, parches transdermicos y sistemas microencapsulados de liberacion. Pueden usarse polfmeros biocompatibles biodegradables tales como etileno-acetato de vinilo, poliantndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Para administrar un compuesto de la invencion por ciertas vfas de administracion, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivacion. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un vehmulo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Diluyentes aceptables incluyen solucion salina y soluciones de tampon acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, ademas de liposomas convencionales (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Los vehmulos incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones inyectables esteriles o dispersion. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Excepto en la medida de que algun medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Las composiciones terapeuticas normalmente deben ser esteriles y estables en condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentracion de farmaco. El vehmulo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partmula requerido en caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un componente o una combinacion de los componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de microfiltracion esteril. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son el secado a vacfo y el secado por congelacion (liofilizacion) que proporcionan un polvo del principio activo mas cualquier componente deseado adicional a partir de una solucion previamente esterilizada por filtracion de los mismos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las pautas de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrate un unico bolo, pueden administrate varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situacion terapeutica. Por ejemplo, los anticuerpos de la invencion pueden administrate una o dos veces por semana por inyeccion subcutanea o intramuscular o una o dos veces al mes por inyeccion subcutanea o intramuscular.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificacion para facilitar la administracion y uniformidad de dosificacion. Forma unitaria de dosificacion como se usa en el presente documento se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehfculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas unitarias de dosificacion para su uso en la invencion se dictan por y son directamente dependientes de (a) las caracterfsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que va a lograrse y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de combinar dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistefna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido cftrico, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.
Para las composiciones terapeuticas, las formulaciones de la presente invencion incluyen aquellas adecuadas para administracion oral, nasal, topica (que incluyen bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en formas de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehfculo para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del sujeto que esta tratandose y del modo particular de administracion. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehfculo para producir una forma de dosificacion unica generalmente sera aquella cantidad de la composicion que produce un efecto terapeutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad oscilara de aproximadamente el 0,001 por ciento a aproximadamente el noventa por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente el 0,005 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, lo mas preferentemente de aproximadamente el 0,01 por ciento a aproximadamente el 30 por ciento.
Las formulaciones de la presente invencion que son adecuadas para administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen tales vehfculos como se conocen en la tecnica por ser apropiados. Las formas de dosificacion para administracion topica o transdermica de composiciones de la presente invencion incluyen polvos, esprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un vehfculo farmaceuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampon o propulsor que pueda requerirse.
Las expresiones "administracion parenteral" y "administrado por via parenteral", como se usan en el presente documento, significan modos de administracion distintos de administracion enteral y topica, normalmente mediante inyeccion, e incluyen, sin limitacion, inyeccion intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardfaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, e infusion.
Ejemplos de vehfculos acuosos o no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos.
Estas composiciones pueden tambien contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevencion de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilizacion, anteriormente, como por la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. Tambien puede desearse incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede provocarse mediante la inclusion de agentes que retrasan la absorcion tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Cuando los compuestos de la presente invencion se administran como compuestos farmaceuticos a los seres humanos y animales, pueden administrarse solos o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, 0,001 al 90 % (mas preferentemente 0,005 al 70 %, tal como 0,01 al 30 %) de principio activo en combinacion con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Independientemente de la via de administracion seleccionada, los compuestos de la presente invencion, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se formulan en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante metodos convencionales conocidos para los expertos en la tecnica.
Pueden variarse los niveles de dosificacion reales de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion para obtener una cantidad de principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particulares, sin ser toxica para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleada, o el ester, la sal o la amida del mismo, la via de administracion, el momento de administracion, la velocidad de eliminacion del compuesto particular que se emplea, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afeccion, salud general e historia clfnica previa del paciente que esta tratandose, y factores similares muy conocidos en las tecnicas medicas. Un medico o veterinario con experiencia en la tecnica puede determinar facilmente y recetar la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica requerida. Por ejemplo, el medico o veterinario podrfa comenzar las dosis de los compuestos de la invencion empleados en la composicion farmaceutica a niveles mas bajos que los requeridos con el fin de lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composicion de la invencion sera esa cantidad del compuesto que es la menor dosis eficaz para producir un efecto terapeutico. Tal dosis eficaz dependera generalmente de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administracion sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea, preferentemente administrada proxima al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composicion terapeutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado en intervalos apropiados a lo largo del dfa, opcionalmente en formas de dosificacion unitaria. Aunque es posible que un compuesto de la presente invencion se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion).
Las composiciones terapeuticas pueden administrarse con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion preferida, una composicion terapeutica de la invencion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermico sin aguja, tal como los dispositivos desvelados en las patentes de EE.UU. N.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Ejemplos de implantes y modulos muy conocidos utiles en la presente invencion incluyen: patente de EE.UU. N.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusion implantable para administrar medicacion a una velocidad controlada; patente de EE.UU. N.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapeutico para administrar medicamentos a traves de la piel; patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusion de medicacion para administrar medicacion a una velocidad de infusion exacta; patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusion implantable de flujo variable para administracion continua de farmaco; patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que describe un sistema de administracion de farmaco osmotico que tiene compartimentos multicamara; y patente de EE.UU. N.° 4.475.196, que desvela un sistema de administracion de farmaco osmotico. Los expertos en la tecnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administracion y modulos.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invencion pueden formularse para garantizar la distribucion apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para garantizar que los compuestos terapeuticos de la invencion crucen la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para metodos de fabricacion de liposomas veanse, por ejemplo, las patentes de EE.Uu. 4.522.811; 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o mas restos que se transportan selectivamente a celulas u organos especfficos, mejorando asf la administracion del farmaco dirigido (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Restos de direccionamiento a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.416.016 a Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); tensioactivo receptor de la protefna A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies de las cuales pueden comprender las formulaciones de la invencion, ademas de componentes de las moleculas inventadas; p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vease tambien K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una realizacion de la invencion, los compuestos terapeuticos de la invencion se formulan en liposomas; en una realizacion mas preferida, los liposomas incluyen un resto de direccionamiento. En una realizacion mas preferida, los compuestos terapeuticos en los liposomas se administran por inyeccion en bolo a un sitio proximo al tumor o la infeccion. La composicion debe ser fluida hasta tal punto de que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
La capacidad de un compuesto para inhibir cancer puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composicion puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir, tal inhibicion in vitro mediante ensayos conocidos por el medico experto. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto terapeutico puede disminuir el tamano del tumor o mejorar de otra manera los sfntomas en un sujeto. Un experto habitual en la tecnica serfa capaz de determinar tales cantidades
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
basandose en factores tales como el tamano del sujeto, la gravedad de los sfntomas del sujeto y la composicion o via de administracion particulares seleccionadas.
La composicion debe ser esteril y fluida hasta tal punto que la composicion sea administrate por jeringa. Ademas de agua, el vehfculo puede ser una solucion salina tamponada isotonica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol y cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion a largo plazo de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Cuando el compuesto activo esta adecuadamente protegido, como se ha descrito anteriormente, el compuesto puede administrarse por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehfculo comestible asimilable.
IV. Usos y metodos de la invencion
En una realizacion, los anticuerpos, moleculas biespecfficas y composiciones de la presente invencion pueden usarse para tratar y/o prevenir (por ejemplo, inmunizar contra) una variedad de enfermedades y afecciones.
Una de las indicaciones de enfermedad primaria que puede tratarse es el cancer. En particular, un anticuerpo anti- CD27 que induce o mejora una respuesta inmunitaria puede usarse en el tratamiento del cancer. Tipos de canceres incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, eritroleucemia monocftica mielomonocftica promielocftica de mieloblastos, leucemia cronica, leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt y linfoma de linfocitos B de la zona marginal, linfoma policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores solidos, sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de colon, carcinoma colorrectal, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vfas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cancer de cuello uterino, cancer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de pulmon no de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofarfngeo, carcinoma esofagico, carcinoma de celulas basales, cancer de las vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos, cancer de cerebro y sistema nervioso central (SNC), cancer de cuello uterino, coriocarcinoma, canceres colorrectales, cancer de tejido conjuntivo, cancer del aparato digestivo, cancer endometrial, cancer de esofago, cancer de ojo, cancer de cabeza y cuello, cancer gastrico, neoplasia intraepitelial, cancer de rinon, cancer de laringe, cancer de hfgado, cancer de pulmon (de celulas pequenas, de celulas grandes), melanoma, neuroblastoma; cancer de cavidad bucal (por ejemplo, labios, lengua, boca y faringe), cancer de ovarios, cancer pancreatico, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer rectal; cancer del aparato respiratorio, sarcoma, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer uterino y cancer del aparato urinario. Los canceres preferidos incluyen tumores que expresan CD27 seleccionados del grupo que consiste en leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt y linfoma de linfocitos B de la zona marginal.
Otras indicaciones de enfermedad para el uso de un anticuerpo anti-CD27 que induce o mejora una respuesta inmunitaria incluye enfermedades infecciosas bacterianas, fungicas, virales y parasfticas. Otras indicaciones de enfermedad para el uso de un anticuerpo anti-CD27 que inhibe o reduce una respuesta inmunitaria incluye rechazo de injerto, alergia y enfermedades autoinmunitarias.
Enfermedades autoinmunitarias a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, esclerosis multiple, artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, psoriasis, enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias del intestino tales como colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistemico (SLE), encefalomielitis autoinmune, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, sfndrome de Goodpasture, penfigo, enfermedad de Graves, anemia hemolftica autoinmune, purpura trombocitopenica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anti-colageno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopatica, infertilidad asociada autoinmune, glomerulonefritis, glomerulonefritis crescentica, glomerulonefritis proliferativa, penfigoide bulloso, sfndrome de Sjogren, artritis psoriasica, resistencia a la insulina, diabetes mellitus autoinmune, hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, sfndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, sfndrome linfoproliferativo autoinmune, uveorretinitis autoinmune, sfndrome de Guillain-Bare, arteriosclerosis y enfermedad de Alzheimer. Trastornos alergicos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, conjuntivitis alergica, conjuntivitis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
primaveral, queratoconjuntivitis primaveral y conjuntivitis papilar gigante; trastornos alergicos nasales, que incluyen rinitis alergica y sinusitis; trastornos alergicos oticos, que incluyen picos de la trompa de Eustaquio; trastornos alergicos de las vfas respiratorias superiores e inferiores, que incluyen asma intrfnseco y extrfnseco; trastornos alergicos de la piel, que incluyen dermatitis, eccema y urticaria; y trastornos alergicos del tubo gastrointestinal.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invencion se administra en combinacion con una vacuna, para mejorar la respuesta inmunitaria al antfgeno de la vacuna, por ejemplo, un antfgeno de tumor (para asf mejorar la respuesta inmunitaria al tumor) o un antfgeno de un patogeno de enfermedad infecciosa (para asf mejorar la respuesta inmunitaria al patogeno de enfermedad infecciosa). Por consiguiente, en esta realizacion, un antfgeno de vacuna puede comprender, por ejemplo, un antfgeno o composicion antigenica capaz de provocar una respuesta inmunitaria a un tumor o a un patogeno de enfermedad infecciosa tal como un virus, una bacteria, un parasito o un hongo. El antfgeno o antfgenos pueden ser, por ejemplo, peptidos/protefnas, polisacaridos y/o lfpidos. El antfgeno o antfgenos derivan de tumores, tales como los diversos antfgenos de tumor previamente desvelados en el presente documento. Alternativamente, el antfgeno o antfgenos pueden derivar de patogenos tales como virus, bacterias, parasitos y/u hongos, tales como los diversos antfgenos de patogenos previamente desvelados en el presente documento. Ejemplos adicionales de antfgenos de patogenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:
Los antfgenos virales o determinantes antigenicos pueden derivar de, por ejemplo:
Citomegalovirus (especialmente humano, tal como gB o derivados del mismo); virus Epstein Barr (tal como gp350); flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapata, virus de la encefalitis japonesa); virus de la hepatitis tales como virus de la hepatitis B (por ejemplo, antfgeno de superficie de la hepatitis B tal como los antfgenos PreSI, PreS2 y S descritos en los documentos EP-A-414 374; EP-A- 0304 578, y EP-A-198474), virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E; VIH-1, (tal como tat, nef, gp120 o gp160); virus del herpes humano, tales como gD o derivados de los mismos o protefna temprana inmediata tal como ICP27 de VHS1 o VHS2;
virus del papiloma humano (por ejemplo, VPH6, 11, 16, 18); virus de la gripe (virus inactivado o vivo completo, virus dividido de la gripe, cultivado en huevos o celulas MDCK, o celulas Vero o virosomas enteros de la gripe (como se describe por Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920) o protefnas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como protefnas NP, NA, HA o M); virus del sarampion; virus de las paperas;
virus paragripal; virus de la rabia; virus respiratorio sincitial (tal como protefnas F y G); rotavirus (que incluye virus vivos atenuados); virus de la viruela; virus de la varicela zoster (tal como gpl, II e IE63); y los virus VPH responsables del cancer de cuello uterino (por ejemplo, las protefnas tempranas E6 o E7 en fusion con un vehfculo de protefna D para formar fusiones de protefna D-E6 o E7 de VPH 16, o combinaciones de los mismos; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (vease, por ejemplo, el documento WO 96/26277).
Los antfgenos bacterianos o determinantes antigenicos pueden derivar, por ejemplo, de: Bacillus spp., que incluye B. anthracis (por ejemplo, toxina botulfnica); Bordetella spp, que incluye B. pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbriae); Borrelia spp., que incluye B. burgdorferi (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Campylobacter spp, que incluye C. jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Chlamydia spp., que incluye C. trachomatis (por ejemplo, MOMP, protefnas de union a heparina), C. pneumonie (por ejemplo, MomP, protefnas de union a heparina), C. psittaci; Clostridium spp., que incluye C. tetani (tal como toxina del tetanos), C. botulinum (por ejemplo, toxina botulfnica), C. difficile (por ejemplo, toxinas de clostridio A o B); Corynebacterium spp., que incluye C. diphtheriae (por ejemplo, toxina de la difteria); Ehrlichia spp., que incluye E. equi y el agente de la ehrlichiosis granulocftica humana; Rickettsia spp, que incluye R. rickettsii; Enterococcus spp., que incluye E. faecalis, E. faecium; Escherichia spp, que incluye E. coli enterotoxica (por ejemplo, factores de colonizacion, toxina termolabil o derivados de la misma, o toxina termoestable), E. coli enterohemorragica, E. coli enteropatogena (por ejemplo, toxina tipo toxina shiga); Haemophilus spp., que incluye H. influenzae tipo B (por ejemplo, PRP), H. influenzae no tipificable, por ejemplo, OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, protefna D y lipoprotefna D, y fimbrina y peptidos derivados de fimbrina (vease, por ejemplo, el documento US 5.843.464); Helicobacter spp, que incluye H. pylori (por ejemplo, ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, que incluye P. aeruginosa; Legionella spp, que incluye L. pneumophila; Leptospira spp., que incluye L. interrogans; Listeria spp., que incluye L. monocytogenes; Moraxella spp, que incluye M. catarrhalis, tambien denominado Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Morexella Catarrhalis (que incluye vesfculas de membrana externa de la misma, y OMP106 (vease por ejemplo, el documento WO97/41731)); Mycobacterium spp., que incluye M. tuberculosis (por ejemplo, ESAT6, antfgeno 85A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Neisseria spp, que incluye N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo, polisacaridos capsulares y conjugados de los mismos, protefnas de union a transferrina, protefnas de union a lactoferrina, Pi1C, adhesinas); Neisseria meningitidis B (que incluye vesfculas de membrana externa de la misma, y NspA (vease, por ejemplo, el documento WO96/29412); Salmonella spp, que incluye S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Shigella spp, que incluye S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Staphylococcus spp., que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incluye S. aureus, S. epidermidis; Streptococcus spp, que incluye S. pneumonie (por ejemplo, polisacaridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, protefnas de union a colina) y el antfgeno de protefna Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989,67,1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342), y derivados purificados mutantes de los mismos (veanse, por ejemplo, los documentos WO 90/06951; WO 99/03884); Treponema spp., que incluye T. pallidum (por ejemplo, las protefnas de la membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; Vibrio spp, que incluye V. cholera (por ejemplo, toxina del colera); y Yersinia spp, que incluye Y. enterocolitica (por ejemplo, una protefna Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis.
Los antfgenos parasfticos/fungicos o determinantes antigenicos pueden derivar, por ejemplo, de: Babesia spp., que incluye B. microti; Candida spp., que incluye C. albicans; Cryptococcus spp., que incluye C. neoformans; Entamoeba spp., que incluye E. histolitica; Giardia spp., que incluye G. lamblia; Leshmania spp., que incluye L. major; Plasmodium, faciparum (MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus analogos en Plasmodium spp.); Pneumocystis spp., que incluye P. carinii; Schisostoma spp., que incluye S. mansoni; Trichomonas spp., que incluye T. vaginalis; Toxoplasma spp., que incluye T. gondii (por ejemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Trypanosoma spp., que incluye T. cruzi.
Se apreciara que segun este aspecto de la presente invencion, los antfgenos y determinantes antigenicos pueden usarse de muchas formas diferentes. Por ejemplo, los antfgenos o determinantes antigenicos pueden estar presentes como protefnas o peptidos aislados (por ejemplo, en las llamadas "vacunas de subunidad") o, por ejemplo, como antfgenos o determinantes antigenicos asociados a celulas o asociados a virus (por ejemplo, en tanto cepas de patogenos vivos como muertos). Los patogenos vivos se atenuaran preferentemente de manera conocida. Alternativamente, los antfgenos o determinantes antigenicos pueden generarse in situ en el sujeto usando un polinucleotido que codifica un antfgeno o determinante antigenico (como en la llamada "vacunacion de ADN"), aunque se apreciara que los polinucleotidos que pueden usarse con este enfoque no estan limitados al ADN, y pueden tambien incluir ARN y polinucleotidos modificados como se ha tratado anteriormente.
En una realizacion, un antfgeno de vacuna tambien puede dirigirse, por ejemplo, a tipos de celulas particulares o a tejidos particulares. Por ejemplo, el antfgeno de vacuna puede dirigirse a celulas presentadoras de antfgenos (APC), por ejemplo, usando agentes tales como anticuerpos dirigidos a receptores de la superficie de APC tales como DEC- 205, por ejemplo, como se trata en el documento WO 2009/061996 (Celldex Therapeutics, Inc), o el receptor de manosa (CD206), por ejemplo, como se trata en el documento WO 03040169 (Medarex, Inc.).
Para su uso en terapia, los anticuerpos de la invencion pueden administrarse a un sujeto directamente (es decir, in vivo), tanto solos como con otras terapias tales como un agente inmunoestimulante, una vacuna, quimioterapia o radioterapia. En todos los casos, los anticuerpos, biespecfficos, composiciones y agentes inmunoestimulantes y otras terapias se administran en una cantidad eficaz para ejercer su efecto terapeutico deseado. El termino "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biologico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz podrfa ser aquella cantidad necesaria para eliminar un tumor, cancer o infeccion bacteriana, viral o fungica. La cantidad eficaz para cualquier aplicacion particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afeccion que esta tratandose, el anticuerpo particular que se administra, el tamano del sujeto o la gravedad de la enfermedad o afeccion. Un experto habitual en la tecnica puede determinar empfricamente la cantidad eficaz de una molecula particular sin necesidad de excesiva experimentacion.
Vfas de administracion preferidas para vacunas incluyen, por ejemplo, inyeccion (por ejemplo, subcutanea, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intratecal). La inyeccion puede ser en un bolo o una infusion continua. Otras vfas de administracion incluyen administracion por via oral.
Los anticuerpos y moleculas biespecfficas de la invencion tambien pueden coadministrarse con adyuvantes y otros agentes terapeuticos. Se apreciara que el termino "coadministrado" como se usa en el presente documento incluye cualquiera o todas de administracion simultanea, separada o secuencial de los anticuerpos y conjugados de la presente invencion con adyuvantes y otros agentes que incluyen la administracion como parte de una pauta de dosificacion. Los anticuerpos normalmente se formulan en un vehfculo solo o en combinacion con tales agentes. Ejemplos de tales vehfculos incluyen soluciones, disolventes, medios de dispersion, agentes retardantes, emulsiones y similares. El uso de tales medios para sustancias farmaceuticamente activas es muy conocido en la tecnica. Cualquier otro vehfculo convencional adecuado para su uso con las moleculas entra dentro del alcance de la presente invencion.
Agentes adecuados para la co-administracion con los anticuerpos, conjugados, biespecfficos y composiciones incluyen otros anticuerpos, citotoxinas y/o farmacos, ademas de adyuvantes, agentes inmunoestimulantes y/o agentes inmunosupresores. En una realizacion, el agente es un agente quimioterapeutico. Los anticuerpos, biespecfficos y composiciones pueden administrarse en combinacion con radiacion.
Agentes quimioterapeuticos adecuados para la coadministracion con los anticuerpos y conjugados de la presente invencion en el tratamiento de tumores incluyen, por ejemplo: taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procafna, tetracafna, lidocafna, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de los mismos. Agentes adicionales incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) y temozolomida.
Agentes que eliminan o inhiben actividades inmunosupresoras, por ejemplo, por celulas inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T reguladores, linfocitos NKT, macrofagos, celulas supresoras derivadas de mieloides, celulas dendrfticas inmaduras o supresoras) o factores supresores producidos por el tumor o celulas huesped en el microambiente local del tumor (por ejemplo, TGFbeta, indolamina 2,3-dioxigenasa - IDO), tambien pueden administrarse con los anticuerpos y conjugados de la presente invencion. Tales agentes incluyen anticuerpos y farmacos de molecula pequena tales como inhibidores de IDO tales como 1-metiltriptofano o derivados.
Agentes adecuados para la coadministracion con los anticuerpos y biespecfficos de la presente invencion para el tratamiento de tales trastornos inmunitarios incluyen, por ejemplo, agentes inmunosupresores tales como rapamicina, ciclosporina y FK506; agentes anti-TNFa tales como etanercept, adalimumab e infliximab; y esteroides. Ejemplos de esteroides especfficos naturales y sinteticos incluyen, por ejemplo: aldosterona, beclometasona, betametasona, budesonida, cloprednol, cortisona, cortivazol, desoxicortona, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflucortolona, fluclorolona, flumetasona, flunisolida, fluocinolona, fluocinonida, fluocortin-butilo, fluorocortisona, fluorocortolona, fluorometolona, flurandrenolona, fluticasona, halcinonida, hidrocortisona, icometasona, meprednisona, metilprednisolona, parametasona, prednisolona, prednisona, tixocortol y triamcinolona.
Agentes adecuados para la coadministracion con los anticuerpos y biespecfficos de la presente invencion para la induccion o el mejoramiento de una respuesta inmunitaria incluyen, por ejemplo, adyuvantes y/o agentes inmunoestimulantes, ejemplos no limitantes de los cuales se han desvelado anteriormente en este documento. Un agente inmunoestimulante preferido es un agonista de TLR3, tal como Poly IC.
La presente invencion se ilustra ademas mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como adicionalmente restrictivos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generacion de anticuerpos monoclonales humanos especfficos para CD27
Se generaron anticuerpos monoclonales anti-CD27 humanos inmunizando la cepa HC2/KCo7 de ratones transgenicos HuMAb® ("HuMAb" es una marca registrada de Medarex, Inc., Princeton, Nueva Jersey) con un antfgeno CD27 humana soluble. Los ratones HC2/KCo7 HuMAb se generaron como se describe en las patentes de EE.UU. N.° 5.770,429 y 5.545.806.
Antfgeno e inmunizacion: El antfgeno era una protefna de fusion soluble que comprende un dominio extracelular de CD27 fusionado con un dominio Fc de anticuerpo (protefna quimerica CD27-Fc humana recombinante (R&D Systems). El antfgeno se mezclo con adyuvante completo de Freund (Sigma) para la primera inmunizacion. A partir de aquf, el antfgeno se mezclo con adyuvante incompleto de Freund (Sigma). Se inmunizaron ratones adicionales con la protefna CD27 soluble en RIBI MPL mas sistema adyuvante de TDM (Sigma). 5-25 microgramos de antfgeno CD27 soluble recombinante en PBS o 5 x 106 celulas cHo transfectadas para la expresion superficial de CD27 humana en PBS se mezclaron 1:1 con el adyuvante. Los ratones se inyectaron con 100 microlitros del antfgeno preparado en la cavidad peritoneal cada 14 dfas. A los animales que desarrollaron tftulos anti-CD27 se les administro una inyeccion iv de 10 microgramos de antfgeno CD27 soluble recombinante tres a cuatro dfas antes de la fusion. Se recogieron los bazos de raton y los esplenocitos aislados se usaron para la preparacion de hibridomas.
Preparacion de hibridomas: Se uso la lfnea celular de mieloma de murino P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) para las fusiones. Se uso RPMI 1640 (Invitrogen) que contenfa 10 % de FBS para cultivar las celulas de mieloma. Se anadieron complementos de medio adicionales al medio de crecimiento de hibridoma, que incluyeron: 3 % de factor de clonacion de hibridomas Origen (Igen), 10 % de FBS (Sigma), L-glutamina (Gibco), 0,1 % de gentamicina (Gibco), 2-mercaptoetanol (Gibco), medios HAT (Sigma; hipoxantina 10 x 104 M, aminopterina 4,0 x 10-7 M, timidina 1,6 x 10' 5 M), o HT (Sigma; hipoxantina 1,0 x 10-4 M, timidina 1,6 x 10-5 M).
Las celulas de bazo se mezclaron con celulas de mieloma P3x63Ag8.653 en una relacion 6:1 y se sedimentaron por centrifugacion. Se anadio gota a gota polietilenglicol mezclando cuidadosamente para facilitar la fusion. Se dejo que los hibridomas crecieran durante una a dos semanas hasta que se establecieron colonias visibles. Se recogio el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
sobrenadante y se uso para el cribado inicial para IgG humana mediante ELISA usando una captura especffica de cadena kappa humana y una deteccion especffica de Fc humano. Entonces, los sobrenadantes positivos para IgG se ensayaron para la especificidad de CD27 mediante citometrfa de flujo o usando un ELISA para detectar anti- 0027.
Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos especfficos (mAb humanos; IgG) se subclonaron y expandieron. Los mAb humanos producidos se purificaron luego por cromatograffa en columna de protefna A segun condiciones normales que condujeron al aislamiento de varios anticuerpos de interes particular, que se denominaron 4B7-1B3 (tambien denominado en el presente documento 4B7), 3H12-1C8 (tambien denominado en el presente documento 3H12), 1F5-1H5 (tambien denominado en el presente documento 1F5), 2C2-1A10 (tambien denominado en el presente documento 2C2), 2G9-1D11 (tambien denominado en el presente documento 2G9), 1H8-B4 (tambien denominado en la presente 1H8), 3H12-1E12 (tambien denominado en la presente 3H12), 3G1- 1A11 (tambien denominado en el presente documento 3G1) (1B10), 4A2-B11 (tambien denominado en el presente documento 4A2), 3A10-G10 (tambien denominado en el presente documento 3A10), 2G11-B5 (tambien denominado en el presente documento 2G11), 4H11-G11 (tambien denominado en el presente documento 4H11), 2H3-E8 (tambien denominado en el presente documento 2H3), 4A7-B3 (tambien denominado en la presente 4A7), 3H8-1B11 (tambien denominado en la presente 3H8) y 1G5-1B9 (tambien denominado en el presente documento 1G5).
Tambien se cribaron hibridomas para determinar la reactividad cruzada con CD27 de macaco rhesus y todos fueron positivos para union.
Ejemplo 2
Determinacion de afinidad y constantes de velocidad de mAb humanos por resonancia de plasmones superficiales (SPR)
Se examinaron la afinidad de union y la cinetica de union de diversos anticuerpos anti-CD27 humanos del Ejemplo 1 por analisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) Biacore™ usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia) segun las pautas del fabricante.
Se unio covalentemente la protefna quimerica CD27/TNFRSF7/Fc humana recombinante purificada (R&D Systems, catalogo N.° 382-CD) a un chip sensor Biacore™ CM5 (dextrano carboximetilado covalentemente unido a una superficie de oro; producto de Biacore N.° BR-1000-14) usando qufmica de acoplamiento de aminas estandar con un kit de acoplamiento de aminas proporcionado por Biacore segun las pautas del fabricante (producto de Biacore N.° BR-1000-50, que comprende reactivos de acoplamiento N-hidroxisuccinimida (NHS) y clorhidrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)). Se inmovilizaron niveles bajos de ligando para limitar cualquier efecto del transporte de masa de analito sobre los parametros cineticos, de forma que la Rmax observada estuviera en el orden de 100-400 UR.
La union se midio haciendo fluir los anticuerpos sobre el chip sensor en tampon HBS-EP (tampon HBS-EP, producto de Biacore N.° BR-1001-88: acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES) 0,01 M, cloruro sodico 0,15 M, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA) 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %), a concentraciones que oscilaban de 1,56 a 50 nM y a un caudal de 30 pl/minuto durante 180 segundos. Se siguio la cinetica de asociacion y disociacion antfgeno-anticuerpo durante 480 segundos o 1200 segundos para anticuerpos con velocidades de disociacion mas lentas.
Se realizaron controles correspondientes en cada caso usando una celda de flujo de blanco sin protefna inmovilizada para restar el "nivel de fondo". Se usaron inyecciones secuenciales de HCl 10 mM durante 10 segundos a 50 pl/min, seguidas de glicina 10 mM a pH 2.0 durante 30 segundos a 50 pl/min como las condiciones de regeneracion a lo largo del estudio.
Se uso el software BIAevaluation de Biacore version 3.2 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) en cada caso para derivar parametros cineticos de la serie de concentraciones de analito diluido en tampon de electroforesis HBS-EP. Las curvas de asociacion y disociacion se ajustaron a un modelo de union de Langmuir 1:1 usando el software BIAevaluation Biacore™ (Biacore AB) segun las pautas del fabricante.
Los parametros cineticos y de afinidad (con referencia restada) como se determinan se muestran en la Figura 1.
Para cada anticuerpo, las figuras mostradas son la media de dos series de experimentos separadas, usando celdas de flujo preparadas por separado en cada caso (donde ka = constante de velocidad de asociacion, kd = constante de velocidad de disociacion, Kd = constante de equilibrio de disociacion (medida de afinidad), Ka = constante de equilibrio de asociacion, Rmax = senal maxima de respuesta de SPR).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 3
Ensayo de ELISA para determinar caracterfsticas de union a mAb humano en CD27
Se recubrieron placas de microtitulacion con CD27 humana o de macaco soluble o recombinante en PBS, y luego se bloquearon con 5 % de albumina de suero bovino en PBS. Se anadieron mAb humanos purificados con protefna A y un control de isotipo a concentraciones de saturacion y se incubaron a 37 °C. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un reactivo policlonal especffico de Fc anti-IgG humana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina a 37 °C. Despues de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato pNPP (1 mg/ml), y se analizaron a DO 405-650 usando un lector de placas de microtitulacion. Curvas de union representativas se muestran en la Figura 2. Los resultados tambien se usaron para estimar la concentracion de saturacion al 50 % (valor C en la curva de ajuste de 4 parametros) como se muestra en la Tabla 1 a continuacion.
Para establecer que los macacos cinomolgos son un modelo importante para probar los mAb anti-CD27, se capturaron diversas concentraciones de CD27 de macaco o de CD27 humana purificadas en placas de ELISA con anticuerpo anti-Flag, seguido de incubacion con mAb anti-CD27 humana. Se usaron un anticuerpo Fc-HRP anti-IgG humana de cabra y sustrato Super Blue TMB para la deteccion. Los resultados se muestran en la Tabla 1, que indica union similar a cD27 de macaco y humano. Curvas de union representativas para el anticuerpo 1F5 tambien se muestran en la Figura 3.
Tabla 1
Caracterizacion de mAb anti-CD27 seleccionados
mAb
Union al 50 % a CD27 humana (M)** Union al 50 % a CD27 humana (pg/ml)** Union al 50 % a CD27 de mono (pg/ml)**
1G5
4,9E-10 0,074 0,065
1H8
4,3E-10 0,064 0,105
3H12
5,7E-10 0,085 0,123
3H8
4,6E-10 0,069 0,065
2G9
4,3E-10 0,064 0,069
1F5
3,9E-10 0,059 0,12
3A10
6,3E-10 0,094 Sin union
2C2
3,0E-10 0,045 0,034
** estimado uniendo a placas cubiertas con CD27 en un formato de ELISA
En otro experimento, para establecer una distribucion similar de la union de 1F5 a celulas de sangre periferica, se aislaron CMSP de sangre completa de 3 humanos y 3 macacos cinomolgos. Las celulas se tineron con mAb 1F5 junto con marcadores para delinear las principales poblaciones de linfocitos T y linfocitos B que expresaban CD27. La siguiente tabla (Tabla 2) resume la media ± error estandar de resultados para celulas humanas y de macaco con respecto al porcentaje de celulas que expresan CD27 y la intensidad de expresion (MFI). Estos datos establecen una distribucion similar de union de 1F5 a celulas de sangre periferica de ser humano y mono.
Tabla 2
Analisis
Linfocitos T CD4+ Linfocitos T CD8+ Linfocitos B (CD20+) Linfocitos NK
% de CD27+b MFIc
humano 84±5 1517± 123 mono 81±1 416± 14 humano 70 ± 12 1415± 153 mono 90 ± 1 519±11 humano 37±4 893± 101 mono 15±1 491± 113 humano 11±4 667± 28 mono 88 ± 6 1050± 42
Ejemplo 4
4A: Bloqueo de la union a sCD70 por ELISA
Se midio el efecto de los mAb humanos del Ejemplo 1 sobre la union de protefna CD70 soluble (sCD70) a CD27 por ELISA. Se recubrio una placa de microtitulacion con 1 pg/ml de quimera CD27/Fc recombinante humana soluble de R&D Systems a 1 pg/ml, luego se bloqueo con 5 % de PBA. Los anticuerpos anti-CD27 ([final] = 25 pg/ml) se mezclaron previamente con CD70 recombinante humano soluble-biotina de US Biologicals ([final] = 0,5 pg/ml) y se anadieron a la placa. Se detecto rCD70 capturado con CD27 con estreptavidina-HRP y sustrato Super Blue TMB. Los resultados (mostrados como % de bloqueo) se muestran en la Figura 4 con controles tal como se indica. Estos resultados muestran que varios de los anticuerpos (que incluyen 1F5, 1H8, 3H12 y 1A4) tuvieron la propiedad de bloquear o al menos inhibir significativamente la union de sCD70.
4B: mAb CD27 se une a CD27 en lfneas celulares linfoblastoides humanas y bloquea la union al ligando (CD70)
Se analizo la union del mAb anti-CD27 humana 1F5 a lfneas celulares linfoblastoides humanas, y el bloqueo de la union de sCD70, por citometrfa de flujo usando un citometro de flujo Becton Dickinson FACSCanto II. Los resultados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se muestran en la Figura 5, y muestran que 1F5 se une eficazmente a una variedad de lineas celulares e inhibe competitivamente la union de sCD70.
Ejemplo 5
Union de mAb humanos a celulas que expresan CD27 humana
Se investigo la capacidad de los mAb anti-CD27 humana para unirse a CD27 en celulas que expresan CD27 humana en su superficie se investigo por citometrfa de flujo del siguiente modo.
Se probaron anticuerpos para unirse a lineas celulares humanas que expresan D27 humano en su superficie. Se incubaron mAb humanos purificados con proteina A 2C2, 3H8 y lF5 con celulas Jurkat, Raji, Ramos y Daudi que expresan CD27 humana, ademas de celulas de control a 4 °C. Todos los anticuerpos se usaron a concentraciones de saturacion. Despues de 1 hora, las celulas se lavaron con PBS que contenia 0,1 % de BSA y 0,05 % de NaN3 (PBA) y los anticuerpos unidos se detectaron incubando las celulas con una sonda especifica de Fc anti-IgG humana de cabra marcada con PE, a 4 °C. La sonda en exceso se lavo de las celulas con PBA y la fluorescencia asociada a celulas se determino por analisis usando un instrumento LSR™ (BD Biosciences, NJ, EE.UU.) segun las pautas del fabricante.
Como se muestra en las Figuras 6 y 7, los mAb humanos demostraron union de alto nivel a celulas que expresan CD27 humana. Estos datos demostraron que estos anticuerpos se unen eficazmente y especificamente a CD27 humana expresada en celulas vivas en comparacion con las celulas de control.
Ejemplo 6
Bloqueo cruzado/competencia de mAb humanos determinado por ELISA
Se recubrio una placa de microtitulacion con una proteina de fusion quimerica CD27-Fc humana recombinante, luego se bloqueo con 5 % de BSA en PBS. Los mAb humanos sin conjugar (20 pg/ml) se mezclaron con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rabano picante (0,5 pg/ml), luego se anadieron a la placa y se incubaron a 37 °C. Las placas se lavaron con PBS/Tween y se desarrollaron con sustrato TMB y se analizaron a DO 450 usando un lector de placas de microtitulacion. Los resultados, mostrados en las Figuras 8 a 10, indican que un primer conjunto de los mAb humanos (que comprenden los mAb 1F5, 1H8 y 3H12) compiten de forma cruzada unos con los otros (vease la Figura 8), que un conjunto adicional de los mAb humanos (que comprenden los mAb 2C2, 3H8, 1G5 y 2G9) tambien compiten de forma cruzada unos con los otros (vease la Figura 9) y que el mAb humano 3A10 se une a un epitope unico pero puede unirse en un sitio distinto pero posiblemente cerca de los sitios de union de los mAb 1F5, 1H8 y 3H12 debido a que estos anticuerpos eran capaces de bloquear de forma cruzada parcialmente la union de 3A10 a CD27 (vease la Figura 10).
Ejemplo 7
Citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC o CDC)
Se cultivaron celulas diana (celulas Raji de linfoma) (en medio AIM-V) durante 1-2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 en presencia de anticuerpos anti-CD27 y complemento de conejo (dilucion final de 1:15) en un volumen final de 150 ul. Tambien se incluyeron controles apropiados con una senal de filtracion (solamente diana) y senal MAX (dianas con detergente Lysol™ al 12 % para una concentracion final de 4 %). Las celulas se ajustaron a 1 x 106/ml y se anadieron 50 ul a cada pocillo (para dar 50.000 celulas/pocillo). Los pocillos se resuspendieron luego y se transfirieron 100 ul de la suspension celular a una placa blanca opaca. A cada uno de estos pocillos se anadio 100 ul del reactivo Promega CellTiter Glo y la placa se mezclo durante 2 minutos a temperatura ambiente. La placa se dejo incubar durante 10 minutos para estabilizar la senal luminiscente. La luminiscencia se registro en un lector de placas Perkin Elmer Victor X4. La citotoxicidad se determino con la siguiente formula: (100-((muestra - MAX)/(filtracion - MAX))) x 100. Los resultados (mostrados como % de lisis) se muestran en la Figura 11 a partir de la cual puede verse que varios anticuerpos anti-CD27 presentaron actividad de CDCC significativa.
En un experimento adicional, se lavaron celulas diana (celulas Ramos) y se cargaron con Calcein AM (Molecular Probes). Las celulas cargadas se lavaron luego otra vez y se resuspendieron a 1x106/ml en medio de cultivo (RPMI + 10 % de FBS). Las celulas diana se cultivaron durante 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2, en presencia de anticuerpos anti-CD27 y complemento de conejo (dilucion final de 1:15) en un volumen final de 150 ul. Tambien se incluyeron controles apropiados con una senal de filtracion (solamente diana) y senal MAX (dianas con Triton X-100 al 20 % para una concentracion final de 2 %). Tras la incubacion, se transfirieron 75 ul de sobrenadante de los pocillos a una placa negra opaca. La fluorescencia (Ex 485; Em 535) se registro en un lector de placas Perkin Elmer Victor X4. La citotoxicidad especifica se determino con la siguiente formula: (lisis experimental - espontanea)/(lisis maxima - lisis espontanea) x 100. Los resultados, mostrados en la Figura 12, indican que el mAb anti-CD27 (1F5) mostro una actividad de CDC de al menos el 10 % en celulas Ramos a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ejemplo 8
Citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC)
Se lavaron celulas diana (celulas Raji de linfoma) y cargaron con reactivo BATDA (Perkin Elmer). Las celulas cargadas se lavaron luego otra vez y se resuspendieron a 2x105/ml en medio de cultivo (RPMI + 10 % de FBS). Se prepararon celulas efectoras y se ajustaron a concentraciones apropiadas en medio de cultivo dando las relaciones de efectoras:diana deseadas (100:1 - 50:1). En una placa de fondo redondo, se anadieron celulas diana, celulas efectoras y anticuerpo en un volumen final de 150 ul. Se usaron controles apropiados, que incluyen una senal de filtracion (solamente dianas), una senal de lisis espontanea (dianas + efectoras) y una senal de lisis maxima (dianas + detergente Lysol™ al 12 % para una concentracion final de 4 %). Las celulas se sedimentaron en la placa y se incubaron durante 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Tras la incubacion, se transfirieron 20 ul de sobrenadante de los pocillos a una placa blanca opaca. A cada uno de estos pocillos se anadio 200 ul de solucion de europio (Perkin Elmer) y la placa se mezclo durante 15 minutos. La fluorescencia resuelta en el tiempo se registro en un lector de placas Perkin Elmer Victor X4. La citotoxicidad especifica se determino usando la siguiente formula: (lisis experimental - espontanea)/(lisis maxima - lisis espontanea) x 100. Los resultados (mostrados como % de lisis) se muestran en la Figura 13 a partir de la cual puede verse que varios anticuerpos anti-CD27 presentaron actividad de ADCC significativa.
En un experimento adicional, se lavaron celulas diana (celulas Daudi y Ramos de linfoma) y se cargaron con Calcein AM (Molecular Probes). Las celulas cargadas se lavaron luego otra vez y se resuspendieron a 1x105/ml en medio de cultivo (RPMI + 10 % de FBS). Se prepararon celulas efectoras y se ajustaron a concentraciones apropiadas en medio de cultivo dando relaciones de efectoras:diana deseadas (75:1). En una placa de fondo redondo, se anadieron celulas diana, celulas efectoras y anticuerpo en un volumen final de 150 ul. Se usaron controles apropiados, que incluyen una senal de filtracion (solamente dianas), una senal de lisis espontanea (dianas + efectoras) y una senal de lisis maxima (dianas + Triton X-100 al 20 % para una concentracion final de 2 %). Las celulas se sedimentaron en la placa y se incubaron durante 4 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Tras la incubacion, se transfirieron 75 ul de sobrenadante de los pocillos a una placa negra opaca. La fluorescencia (Ex 485; Em 535) se registro en un lector de placas Perkin Elmer Victor X4. La citotoxicidad especifica se determino usando la siguiente formula: (lisis experimental - espontanea)/(lisis maxima - lisis espontanea) x 100. Los resultados, mostrados en la Figura 14, indican que el mAb anti-CD27 (1F5) mostro una actividad de ADCC de al menos el 10 % (medida como citotoxicidad especifica) en celulas Daudi y Ramos a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml y una relacion de celulas efectoras:diana de 75:1.
Ejemplo 9
Secuenciamiento de anticuerpos
Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, los mAb humanos de hibridomas que producen IgG de mAb humanos especfficos se purificaron por cromatograffa en columna de protefna A que condujo al aislamiento de un panel de anticuerpos (mAb humanos) de particular interes. Se identificaron las regiones codificantes Vh y Vl de los mAb humanos 4B7, 3H12, 1F5, 2C2, 2G9, 1H8, 3H12, 3G1 (1B10) 4A2, 3A10, 2G11, 4H11, 2H3, 4A7, 3H8 y 1G5 usando ARN de los hibridomas correspondientes. El ARN se transcribio de forma inversa a ADNc, las regiones codificantes V se amplificaron por PCR y se secuencio el producto de PCR. Lo siguiente son las secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los mAb humanos (en el caso de las secuencias de aminoacidos, las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) estan subrayadas).
3H8 VH (VH 3-7; D7-27; JH2)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 5)
atggagttggggctgagctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttg
gtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttattggatggcctgggtccgccaggctcca
gggaaagggctggagtggctgggcaatataaagcaagatggaagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatc
tccagagacaacgccaagaactcactgtatctacaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgagggaa
ctggggatggactggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 6) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
A/EZGFSRrFZE4/F£GFOCEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMAWVR
OAPGKGLEWLGNIKODGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVY
YCVRELGMDWYFDLWGRGTLVTVSS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMAWVROAPGKGLEWLGNIKODG
SEKYYVDSVKGRFTTSRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCVRELGMDWYFDLWG
RGTLVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 8): GFTFSSYW Vh CDR2 (SEQ ID NO: 9): IKQDGSEK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 10): VRELGMDWYFDL
3H8 VK #2 (VK 3-11; JK1)
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 11)
Atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccac
cctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttgacagctacttagcctggtaccaacagaaac
ctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctggga
cagacttcactctcaccatcagcaacctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctccgacgttcg
gccaagggaccaaggtggaaatcaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 12) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
Affi^R^QZ.ZFZZIZRXPJrfGEIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYOQ
KPGOAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCOORSNWPP
TFGQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 13) excluyendo el peptido senal:
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASOSVDSYLAWYOOKPGOAPRLL1YDASNRATGI
PARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCOORSNWPPTFGOGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 14): QSVDSY
Vl CDR2 (SEQ ID NO: 15): DAS
Vl CDR3 (SEQ ID NO: 16): QQRSNWPPT
3H8 VK #3 (VK 3-11; JK1)
Tambien se encontro que una cadena ligera adicional era activa del siguiente modo (aunque solo se uso la cadena ligera anterior (3H8-1B11 VK #2) en los ejemplos anteriores):
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 17)
Atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccac
cctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaac
ctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctggga
cagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagcgtagcaactggcctccgacgttcg
gccaagggaccaaggtggaaatcaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 18) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
A/£4P^GZZFZZZZJFZrorrGEIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSSYLAWYOOK
PGOAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOORSNWPPTF
GQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 19) excluyendo el peptido senal:
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSSYLAWYOQKPGOAPRLLIYDASSRATGIP
DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOORSNWPPTFGOGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 20): QSVSSY Vl CDR2 (SEQ ID NO: 21): DAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 22): QQRSNWPPT
5
10
15
20
25
30
35
40
2C2 VH (VH 3-33; D1-7; JH4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 23)
imagen1
gtccagcctgggaggtccctgcgactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatgacatacactgggtccgccaggctcc
aggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatc
tccagagacaattccacgaactcgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattattgtgtgggaggaac
tgctgaccttgaacactgggaccagggaaccctggtcaccgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 24) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
i1/£reZSrFFZFYZGRGFC>CQVQLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVR QAPGKGLE WVAVIWNDGSNKYYAD SVKGRFTISRDN STNSLFLQMN SLRAEDTAVY YCVGGTADLEHWDOGTLVTVSS
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 25) excluyendo el peptido senal:
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVROAPGKGLEWVAVIWNDGS
NKYYADSVKGRFTISRDNSTNSLFLOMNSLRAEDTAVYYCVGGTADLEHWDOGTL
VTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 26): GFTFSSYD Vh CDR2 (SEQ ID NO: 27): IWNDGSNK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 28): VGGTADLEHWDQ
2C2 VK (VK 1D-16; JK4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 29)
imagen2
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 30) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
MffFZ^QZZGZZZZCFPG/lflCPIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOO
KPEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPLT
FGGGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 31) excluyendo el peptido senal:
DIOMTOSPSSLSASVGDRVT1TCRASOGISSWLAWYOOKPEKAPK.SLIYAASSLOSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPLTFGGGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 32): QGISSW Vl CDR2 (SEQ ID NO: 33): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 34): QQYNSYPLT
1F5 VH (VH 3-33; D7-27; JH4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 35)
imagen3
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 36) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
AffiFGISBWZmi/iGrQCOVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWV
ROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTA
VYYCARGSGNWGFFDYWGOGTLVTVSS
5 Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 37) excluyendo el peptido senal:
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDG SNKYY ADS VKGRFTISRDN SKNTL YLOMNSLRAEDT AVY Y C ARGSGN WGFFD Y WG QGTLVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 38): GFTFSSYD 10 Vh CDR2 (SEQ ID NO: 39): IWYDGSNK
Vh CDR3 (SEQ ID NO: 40): ARGSGNWGFFDY
1F5 VK #2 (VK ID-16; JK1)
15 Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 41)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctc actgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcaggtggttagcctggtatcagcagaaac cagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatacttaccctcggacgttcggcc aaggga ccaaggtggaaatcaaa
20
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 42) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
Mj?EAjOZ£GZmCAPGAffCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISRWLAWYOO
KPEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNTYPRT
FGQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 43) excluyendo el peptido senal:
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISRWLAWYOOK.PEKAPKSLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNTYPRTFGOGTKVEIK
30
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 44): QGISRW Vl CDR2 (SEQ ID NO: 45): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 46): QQYNTYPRT
1H8 VH (VH 3-33; D7-27; JH4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 47)
35
imagen4
ggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcaatatctatgacatgcactgggtccgccaggctc
caggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaatcaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccat
ctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacattttgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggta
ctcactgggggtactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 48) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
MEFGISWVFI. VALI.RGrOCOV’OEVHSGGGVVOPGRSl.RESCAASGFTFNtYDMH WVR
OAPGKGLEWVAVIWYDGSNOYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNILRAEDTAV
YYCARGTHWGYFDYWGOGTLVTVSS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFNIYDMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDG
SNOYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNILRAEDTAVYYCARGTHWGYFDYWGO
GTLVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 50): GFTFNIYD Vh CDR2 (SEQ ID NO: 51): IWYDGSNQ Vh CDR3 (SEQ ID NO: 52): ARGTHWGYFDY
1H8 VK (VK ID-16; JK1)
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 53)
imagen5
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 54) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
it/RFZ^OZZGZZZZCFPG-FRCDIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOO
KPEKAPKSLIYAASNLOSGVPSRFSGSGSCTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPRT
FGQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 55) excluyendo el peptido senal:
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEKAPKSLIYAASNLOSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPRTFGOGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 56): QGISSW Vl CDR2 (SEQ ID NO: 57): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 58): QQYNSYPRT
1G5 VH (VH 3-33; D6-19; JH2)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 59)
gtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctcc
aggcaagggactggagtgggtggcacttctatggtatgatggtagccataaagactttgcagactccgtgaagggccgattcaccatct
ccagagacaattccaagaacacgctagatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagag
ggtttagcagtacctggtcactggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 60) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
M£FGZStFFFZKAZZi?GFOCOVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVR OAPGKGLEWVALLWYDGSHKDFADSVKGRFT1SRDNSKMTLDLOMNSLRAEDTAV YY CAREGLAVPGH WYFDL WGRGTLVTV S S
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 61) excluyendo el peptido senal:
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFSESSYGMHWVROAPGKGLEWVALLWYDG
SHKDFADSVKGRFTTSRDNSKNTLDLOMNSLRAEDTAVYYCAREGLAVPGHWYFDL
WGRGTLVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 62): GFSFSSYG Vh CDR2 (SEQ ID NO: 63): LWYDGSHK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 64): AREGLAVPGHWYFDL
1G5 VK (VK 1-13; JK1)
5
10
15
20
25
30
35
40
imagen6
cagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatacttaccctcggacgttcggcc aaggga ccaaggtggaaatcaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 66) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
il/RE/YtOLEGLI-ZXRZPG/IRCAIOLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSALAWYOOK
PGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOFNTYPRTF
GQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 67) excluyendo el peptido senal:
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPK.LLIYDASSLESGVP
SRFSGSGSGTDFTLTTSSLOPEDFATYYCOOFNTYPRTFGOGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 68): QGISSA Vl CDR2 (SEQ ID NO: 69): DAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 70): QQFNTYPRT
2G9 VH (VH 3-33; D1-7; JH4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 71)
imagen7
gtccagcctgggaggtccctgcgactctcctgtgcagcgtctggattcaccctcagtagccatgacatacactgggtccgccaggctc
caggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccat
ctccagagacaattccacgaactcgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattattgtgtgagaggaa
ctgctgaccttgaacactgggaccagggaaccctggtcaccgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 72) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVO LVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTLSSHDIHWVR QAPGKGLE WVAVIWNDGSNKYYAD SVKGRETISRDN STNSLFLQMN SLRAEDTAVY Y C VRGT ADLEHWDOGTLVTV S S
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 73) excluyendo el peptido senal:
OVQLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTLSSHDIHWVROAPGKGLEWVAVTWNDGS
NKYYADSVKGRETISRDNSTNSLFLOMNSLRAEDTAVYYCVRGTADLEHWDOGTL
VTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 74): GFTLSSHD Vh CDR2 (SEQ ID NO: 75): IWNDGSNK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 76): VRGTADLEHWDQ
2G9 VK (VK 1D-16; JK4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 77)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctc
actgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcagaaac
cagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac
agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctctcactttcggcg
gagggaccaaggtggagatcaaa
5
10
15
20
25
30
35
40
M/?KZJOZZGZZZZCFPG/)/?CDIOMTOSPSSLSASVGDRVT1TCRASOGISSWLAWYOO
KPEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQOYNSYPLT
FGGGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 79) excluyendo el peptido senal:
DIQMTOSPSSLSASVGDRVT1TCRASOGISSWLAWYOOKPEK.APK.SLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTTSSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 80): QGISSW Vl CDR2 (SEQ ID NO: 81): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 82): QQYNSYPLT
3A10 VH (VH 3-33; D3-10; JH3)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 83)
imagen8
imagen9
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 84) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
MZGyWELMLLffGF^CQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSHYGMHWV RO APGKGPE WV All WYDG SNKYY ADS VKGRFTISRDN SKNTLDLOMNSLRAEDT AV YYCARDGWTTMVRGLNVFDIWGOGTMVTYSS
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 85) excluyendo el peptido senal:
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSHYGMHWVRQAPGKGPEWVAIIWYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLDLOMNSLRAEDTAVYYCARDGWTTMVRGLNV
FDIWGOGTMVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 86): GFTFSHYG Vh CDR2 (SEQ ID NO: 87): IWYDGSNK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 88): ARDGWTTMVRGLNVFDI
3A10 VK #1 (VK 1D-16; JK5)
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 89)
imagen10
cagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac
agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctcccaccttcggcc
aagggacacgactggagattaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 90) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
Mi?FZAGZZGZZZZCZ’P(?/4i?C,DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQ
KPEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPPT
FGQGTRLEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 91) excluyendo el peptido senal:
DIQMTOSPSSLSASVGDRVT1TCRASODISSWLAWYOOKPEK.APK.SLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPPTFGOGTRLEIK
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 92): QDISSW Vl CDR2 (SEQ ID NO: 93): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 94): QQYNSYPPT
3A10 VK #4 (VK 1-13; JK5)
Tambien se encontro que una cadena ligera adicional era activa del siguiente modo (aunque solo se uso la cadena ligera anterior (3H8-1B11 VK #1) en los ejemplos anteriores):
Secuencia de acidos nucleicos de Vl (SEQ ID NO: 95)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgccatccagttgacccagtctccatcctc
cctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaac
cagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac
agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctcccaccttcggcc
aagggacacgactggagattaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 96) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
A/RrZAOFZGFZLZRYRGFKCAIOLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSALAWYOOK
PEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNSYPPTF
GQGTRLEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 97) excluyendo el peptido senal:
AIOLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSALAWYOOKPEKAPKSLIYAASSLOSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCOOYNSYPPTFGOGTRLEIK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 98): QGISSA Vl CDR2 (SEQ ID NO: 99): AAS Vl CDR3 (SEQ ID NO: 100): QQYNSYPPT
3H12 VH (VH 3-33; D7-27; JH4)
Secuencia de acidos nucleicos de Vh (SEQ ID NO: 101)
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtg
gtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcaacgtctggattcaccttcagtagctatgacatgcactgggtccgccaggctcc
aggcaaggggctggagtgggtggcagttatttggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatct
ccagagacaattccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgggagacgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggta
gtggtaactggggtttctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 102) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
MZGMR^Z^ZYM^CQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSSYDMHWVR
OAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLGDEDTAV
YYCARGSGNWGFFDYWGOGTLVTVSS
Secuencia de aminoacidos de Vh (SEQ ID NO: 103) excluyendo el peptido senal:
OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCATSGFTFSSYDMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLGDEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWG
QGTLVTVSS
Vh CDR1 (SEQ ID NO: 104): GFTFSSYD Vh CDR2 (SEQ ID NO: 105): IWYDGSNK Vh CDR3 (SEQ ID NO: 106): ARGSGNWGFFDY
3H12 VK #2 (VK ID-16; JK1)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
imagen11
cagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggac agatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatacttaccctcggacgttcggcc aaggga ccaaggtggaaatcaaa
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 108) (incluyendo el peptido senal en cursiva subrayado):
AfflKZJQZ.LGZ.LZXC/yG^CDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYOO
KPEKAPKSLIYAASSLOSGVPSRFSGSGSCTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNTYPRT
FGQGTKVEIK
Secuencia de aminoacidos de Vl (SEQ ID NO: 109) excluyendo el peptido senal:
DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQG1SRWLAWYQQK.PEKAPKSLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOYNTYPRTFGOGTKVETK
Vl CDR1 (SEQ ID NO: 110): QGISRW
Vl CDR2 (SEQ ID NO: 111): AAS
Vl CDR3 (SEQ ID NO: 112): QQYNTYPRT
LOS ALINEAMIENTOS SE MUESTRAN EN LAS FIGS 15 Y 16
Ejemplo 10
Estudio de primates no humanos in vivo
Para evaluar la tolerancia del mAb 1F5 anti-CD27 humana en primates no humanos, se trataron 3 monos cinomolgos con una dosis i.v. de 1, 3 o 10 mg/kg de 1F5. Los animales se siguieron durante 29 dfas. Los linfocitos totales (basandose en el tamano de dispersion lateral y frontal), linfocitos B de memoria (CD20+ y CD95 claro) y monocitos (basandose en el tamano de dispersion lateral y frontal) se tineron con anticuerpo anti-IgG humana (lfnea en negrita) y se compararon con controles no tenidos (histograma sombreado). Los resultados se muestran en la Figura 17. Estos resultados muestran que el mAb 1F5 se unio a la superficie de linfocitos circulantes que se sabe que expresan CD27 durante la duracion entera del estudio. Los monocitos, celulas que no expresan CD27, no tuvieron union a 1F5.
Ademas, para determinar el efecto de 1F5 sobre poblaciones de linfocitos circulantes, los linfocitos se tineron con marcadores de subconjunto y se represento el % de celulas positivas frente al tiempo en la Figura 17 para cada animal tratado a las diferentes dosis (puntos cuadrados = 1 mg/kg; puntos circulares = 3 mg/kg; puntos triangulares = 10 mg/kg). Los resultados se muestran en la Figura 18.
Conjuntamente, los resultados de estos estudios, mostrados en las Figuras 17 y 18, demostraron que 1F5 fue bien tolerado y no agoto significativamente los linfocitos circulantes (distinto de cierto agotamiento transitorio de linfocitos NK) despues de una unica dosis de 1 - 10 mg/kg. Ademas, no hubo elevacion en las temperaturas corporales y no hubo niveles detectables de TNF-a, IL-6 o IL-1p.
Ejemplo 11
Los mAb anti-CD27 mejoraron la proliferacion y activacion de linfocitos T CD8+ especfficos de antfgeno Tincion de pentameros en celulas de sangre periferica y esplenocitos de raton
Se inyectaron ratones transgenicos para CD27 humana (huCD27-Tg) por via intravenosa con 5 mg de ovoalbumina de pollo y el panel de anticuerpos completamente humanos que reconocen CD27 humana se genero como en el Ejemplo 1 (mAb humanos de CD27). Se incluyeron clon anti-CD27 de raton de rata AT 124 e IgG1 humana irrelevante como controles positivos y negativos, respectivamente. Cada anticuerpo (250 pg) se co-inyecto con ovoalbumina el dfa 0 y 250 pg adicionales de anticuerpo solo en el dfa 1. Se recogieron sangre periferica y celulas del bazo en el dfa 7. Se usaron esplenocitos (1x 106) o sangre completa (100 pl) para la tincion. Despues de bloquear el receptor Fc, las celulas se tineron con 10 pl de H-2Kb/SIINFEKL (SEQ ID NO: 119), un complejo tetramerico de MHC de raton complejado con el epitope de linfocitos T del peptido de ovoalbumina (Beckman Coulter) o un complejo pentamerico similar (Proimmune), mAb anti-CD8 (eBioscience) y anti-huCD27 o mAb anti- msCD27 (BD Biosciences) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las celulas se lisaron luego con RBC, se lavaron y se fijaron y se adquirieron al menos 100.000 eventos en Flow Cytometer LSR (BD Biosciences). Se determino la fraccion de celulas positivas para tetramero o pentamero en la poblacion regulada con CD8+ o CD27+. Los resultados se muestran en las Figuras 19 y 21 a partir de las cuales puede verse que los anticuerpos anti-CD27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mejoraron significativamente las respuestas inmunitarias.
Ejemplo 12 Ensayo ELISPOT
Se dispusieron esplenocitos (2,5 x 105 y 0,5 x 105) de la preparacion de tincion de pentamero del Ejemplo 8 anterior en una placa recubierta con anticuerpo monoclonal (mAb) anti-IFNy en pocillos por triplicado despues de la lisis con RBC. Se anadio el peptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 119) a una concentracion final de 2 pg/ml. Se establecio un control de referencia para cada muestra por triplicado en ausencia del peptido. La estimulacion se mantuvo a 37 °C en una estufa de incubacion de cultivo de tejido durante la noche. Se realizo deteccion ELISPOT usando un kit de ELISPOT (BD Biosciences) siguiendo el protocolo del fabricante. Se conto el numero de manchas de IFNy. Los resultados se muestran en las Figuras 20 y 21, a partir de las cuales puede verse que los mAb anti-CD27 mejoraron significativamente la actividad de los linfocitos T.
Ejemplo 13
El mAb anti-CD27 mejora las respuestas de linfocitos T a un antfgeno de vacuna
Se inmunizaron ratones transgenicos HuCD27 con 5 pg (s.c.) de la vacuna dirigida a APC que comprende un anticuerpo anti-IgG DEC-205 de raton fusionado con ovoalbumina (OVA) (denominado a-mDEC-205-OVA), en combinacion con el mAb anti-CD27 humana 1F5 (i.p.) a diversas dosis (25, 50, 100, 200 o 400 pg). Una semana despues, los esplenocitos se analizaron para la reactividad de linfocitos T CD8+ al peptido OVA SIINFEKL (SEQ ID NO: 119) (peptido OVA 257-264) por tincion de tetrameros (% de tetrameros positivos para todas las CD8+ mostradas) y ELISPOT de IFN-y por el procedimiento que se describe generalmente en los Ejemplos 8 y 9, respectivamente. Los resultados se muestran en las Figuras 22A-C, en las que la Figura 22A muestra el protocolo usado, la Figura 22B muestra los resultados del experimento de tincion de tetrameros y la Figura 22C muestra los resultados del experimento ELISPOT de IFN-y. Estos resultados indican que el mAb 1F5 humano coadministrado mejoro significativamente las respuestas de linfocitos T al componente de vacuna administrado.
Ejemplo 14
Efecto sinergico del mAb anti-CD27 (1F5) y agonista de TLR (Poly IC) sobre las respuestas de linfocitos T a la vacuna (anti-DEC205-OVA)
Se inyectaron por via intraperitoneal companeros de camada de ratones huCD27-Tg (transgenicos) y no mutantes (WT) con el mAb anti-CD27 1F5 (50 pg) el dfa -3 y luego por via subcutanea mediante la inyeccion de 4 patas con anti-mDec205-OVA (5 pg) mas Poly IC 0, 25, 50 o 100 pg el dfa 0. Los bazos se recogieron el dfa 7 y se evaluaron por tincion de tetrameros, ELISPOT de IFN-y e ICS de IFN-y. Se calcularon la media ± DE de ICS de IFN-y positivo entre linfocitos T CD8 regulados de 3 ratones por grupo y se recogio un panel de graficas de puntos representativas. Los resultados, mostrados en las Figuras 23A-D, indican que el mAb anti-CD27 humana actuo sinergicamente con el agonista de TLR3 Poly IC para mejorar las respuestas de linfocitos T al componente de vacuna administrado.
Ejemplo 15
Administracion de mAb anti-CD27 antes de la vacuna dirigida a Dec205 en ausencia o presencia de agonista de TLR
Se inyectaron ratones huCD27-Tg y companeros de camada no mutantes (WT) por via intraperitoneal con el mAb anti-CD27 (50 pg) en diversos dfas con respecto a la vacuna como se indica en la Figura 28 y por via subcutanea mediante la inyeccion en 4 patas con anti-mDec205-OVA (5 pg) mas o menos agonista de TLR Poly IC-LC (20 pg) en el dfa 0. Los bazos se recogieron en el dfa 7 y se evaluaron mediante tincion de tetrameros y ELISPOT de IFNy. En las Figuras 24 y 25 se muestra un panel representativo de tincion de tetrameros entre linfocitos T CD8 regulados. ELISPOT de IFNy mostro un patron similar.
Estos resultados muestran que, sorprendentemente, cuando el anticuerpo anti-CD27 se administra en combinacion con una vacuna en presencia o ausencia de agonista de TLR, la activacion de linfocitos T es mayor cuando el anticuerpo se administra antes de la vacuna, por ejemplo, un dfa o mas antes de que se administre la vacuna (antfgeno).
Ejemplo 16
El mAb anti-CD27 combinado con la activacion de TCR activa linfocitos T de ratones transgenicos para CD27 humana
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para evaluar la capacidad de activacion de linfocitos T del mAb 1F5, se purificaron linfocitos T del bazo de ratones hCD27-Tg por seleccion negativa con perlas. Las celulas se marcaron con CFSE y se incubaron con 0,2 pg/ml de mAb anti-CD27 humano 1F5 o control de isotipo durante 3 dfas. Se paso anti-IgG humana de reticulacion a traves de una columna de eliminacion de endotoxina antes de su uso. En las Figuras 26 y 27 se muestra la dilucion de ICS de IFNy y CSFE entre linfocitos T CD8 y CD4. ICS de TNFa mostro el mismo patron que IFNg. Como se muestra en la Figura 26 y 27, cuando se combina con activacion de TCR, el mAb 1F5 induce eficazmente la proliferacion y produccion de citocinas de linfocitos T in vitro. Los datos muestran que se requirieron tanto la reticulacion con anti- IgG humana como la activacion del receptor de linfocitos T con el mAb anti-CD3 para la proliferacion inducida por 1F5 y la produccion de citocina.
Ejemplo 17
El mAb anti-CD27 mejora la eficacia de vacuna en un modelo de exposicion a melanoma MO4
Para evaluar la actividad antitumoral in vivo, huCD27-Tg y control WT, 8 ratones por grupo, se inocularon por via subcutanea con 0,3 x 105 celulas MO4 en el dfa 0. En el dfa 5 y 12, estos ratones se inyectaron por via intraperitoneal con el mAb anti-CD27 1F5 (50 pg); en el dfa 8 y 15, dosis adicionales de CD27 HuMab (50 pg) y se vacunaron con anti-mDec205-OVA (5 pg). Se midio el crecimiento tumoral con compases calibradores 2 veces por semana. Los resultados se muestran en la Figura 24.
En un estudio adicional, huCD27-Tg y control WT, 5 ratones por grupo, se inocularon por via subcutanea con 1 x 105 celulas MO4 en el dfa 0. En el dfa 5 y 12, estos ratones se vacunaron con anti-mDec205-OVA (5 pg) mas el agonista de TLR Poly IC-LC (10 pg) por via intraperitoneal. En los dfas 6 y 13, los ratones se inyectaron con el mAb anti- CD27 1F5 (50 pg). El crecimiento tumoral se midio con compases calibradores 2 veces por semana segun se indica en el protocolo ilustrado en la Figura 285A. Los resultados, mostrados en las Figuras 28B, C y D, muestran el efecto del no tratamiento (Figura 28B), tratamiento con vacuna sola (Figura 28C) o tratamiento con vacuna en combinacion con tratamiento anti-CD27 (Figura 28D) sobre el tamano del tumor en los ratones en funcion del numero de dfas despues de la inoculacion del tumor. Los resultados demuestran que el tratamiento de combinacion con el mAb anti- CD27 (1F5) prolongo significativamente la supervivencia de los ratones expuestos al tumor.
Ejemplo 18
1F5 presenta potente actividad antitumoral en un modelo de exposicion a tumor de raton transgenico singenico del linfoma B de BCLi
Para evaluar la actividad antitumoral in vivo de 1F5, grupos de 9-10 ratones transgenicos hCD27 (referencia Balb/c) se expusieron a 107 celulas de linfoma B BCL1 administradas por via intravenosa en el dfa 0. Los animales se trataron luego con 5 dosis del mAb anti-CD27 humana 1F5 como se indico. Como se muestra en las Figuras 29A y 29B, se prolongo significativamente la supervivencia de ratones expuestos a tumor, en una forma dependiente de la dosis.
Ejemplo 19
Destruccion de tumores en modelo de raton SCID de xenoinjerto de Raji
Se mantuvieron ratones CB.17 SCID (comprados en Taconic) en una instalacion de ratones libre de patogenos. Se inyectaron celulas Raji de linfoma (1 x 105) por via subcutanea en ratones SCID, 4 ratones por grupo. En el dfa 6, estos ratones se trataron con los mAb humanos para CD27 mediante administracion intraperitoneal, 0,5 mg por dosis y se dosificaron dos veces por semana durante 3 semanas. Se midio el crecimiento tumoral con compases calibradores 3 veces por semana. Los resultados del crecimiento tumoral y los analisis de Kaplan-Meier se muestran en la Figura 30A y 30B, a partir de las cuales puede verse que los mAb anti-CD27 prolongaron significativamente la supervivencia de los ratones expuestos al tumor.
En un experimento adicional, se mantuvieron ratones CB.17 SCID (comprados en Taconic) en una instalacion de ratones libre de patogenos. Se inyectaron celulas Raji de linfoma humano (5 x 105) por via subcutanea en ratones SCID en el dfa 0, 6 ratones por grupo. En el dfa 5, estos ratones se trataron con el mAb anti-CD27 1F5 mediante administracion intraperitoneal, 0,033, 0,1 o 0,3 mg por dosis y se dosificaron dos veces por semana durante 3 semanas. Se midio el crecimiento tumoral con compases calibradores 2 veces por semana.
Los resultados, mostrados en la Figura 31 A, indican que el mAb anti-CD27 (1F5) inhibio significativamente el crecimiento tumoral y asf prolongo significativamente la supervivencia de los ratones expuestos al tumor. En la Figura 31B tambien se proporciona una grafica de supervivencia de Kaplan-Meier de los datos, que muestra que la mediana de la supervivencia aumento en al menos 10 dfas en los ratones del grupo tratado en comparacion con el grupo de control. Se realizo otro experimento de xenoinjerto con 1G5 y los resultados se muestran en la Figura 32.
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 20
Destruccion de tumores en modelo de raton SCID de xenoinjerto de Daudi
Se mantuvieron ratones CB.17 SCID (comprados en Taconic) en una instalacion de ratones libre de patogenos. Se inyectaron celulas Daudi de linfoma humano (1 x 106) por via subcutanea en ratones SCID en el dfa 0, 6 ratones por grupo. En el dfa 5, estos ratones se trataron con el mAb humano anti-CD27 1F5 mediante administracion intraperitoneal, 0,033, 0,1 o 0,3 mg por dosis y se dosificaron dos veces por semana durante 3 semanas. Se midio el crecimiento tumoral con compases calibradores 2 veces por semana.
Los resultados, mostrados en la Figura 33, indican que el mAb anti-CD27 (1F5) inhibio significativamente el crecimiento tumoral (Figura 33A) y asf prolongo significativamente la supervivencia de los ratones expuestos al tumor (grafica de Kaplan-Meier en la Figura 33B).
Ejemplo 21
El mAb anti-CD27 modificado para no unirse a receptores Fc no mejora las respuestas de linfocitos T a un antfgeno de vacuna
Se inmunizaron ratones HuCD27 transgenicos con 5 pg (s.c.) de vacuna dirigida a APC que comprende un anticuerpo anti-IgG DEC-205 de raton fusionado con ovoalbumina (OVA) (denominado a-mDEC-205-OVA), en combinacion con el mAb humano anti-CD27 1F5 (i.p.) o mutante de mAb 1F5 (porcion Fc mutada para prevenir la union al receptor Fc) o mAb de IgG de control. Una semana despues, los esplenocitos se analizaron para la reactividad de linfocitos T CD8+ con el peptido OVA SIINFEKL (SEQ ID NO: 119) (peptido OVA 257-264) por ELISPOT de IFN-y por el procedimiento como se describe generalmente.
Los resultados, mostrados en la Figura 34, demuestran que el mAb 1F5 humano alterado no mejora las respuestas de linfocitos T a la vacuna y asf serfa un agente eficaz para bloquear la via CD70/CD27.
RESUMEN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:
DESCRIPCION
1
CD27 humana (N.° de acceso de GenBank: AAH12160.1)
2
CD70 humana (N.° de acceso de GenBank: NP 001243)
3
Se proporciona la secuencia de la lfnea germinal 3-33 de Vh (N.° de acceso de GenBank AAP44382)
4
Se proporciona la secuencia de la lfnea germinal 3-7 de Vh (N.° de acceso de GenBank AAP44389)
5
3H8-1B11 VH acido nucleico
6
3H8-1B11 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
7
3H8-1B11 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
8
3H8-1B11 VH CDR1 aminoacido
9
3H8-1B11 VH CDR2 aminoacido
10
3H8-1B11 VH CDR3 aminoacido
11
3H8-1B11 VL #2 acido nucleico
12
3H8-1B11 VL #2 aminoacido incluyendo el peptido senal
13
3H8-1B11 VL #2 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
14
3H8-1B11 VL #2 CDR1 aminoacido
15
3H8-1B11 VL #2 CDR2 aminoacido
16
3H8-1B11 VL #2 CDR3 aminoacido
17
3H8-1B11 VL #3 acido nucleico
18
3H8-1B11 VL #3 aminoacido incluyendo el peptido senal
SEQ ID NO:
DESCRIPCION
19
3H8-1B11 VL #3 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
20
3H8-1B11 VL #3 CDR1 aminoacido
21
3H8-1B11 VL #3 CDR2 aminoacido
22
3H8-1B11 VL #3 CDR3 aminoacido
23
2C2-1A10 VH acido nucleico
24
2C2-1A10 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
25
2C2-1A10 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
26
2C2-1A10 VH CDR1 aminoacido
27
2C2-1A10 VH CDR2 aminoacido
28
2C2-1A10 VH CDR3 aminoacido
29
2C2-1A10 VL acido nucleico
30
2C2-1A10 VL aminoacido incluyendo el peptido senal
31
2C2-1A10 VL aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
32
2C2-1A10 VL CDR1 aminoacido
33
2C2-1A10 VL CDR2 aminoacido
34
2C2-1A10 VL CDR3 aminoacido
35
1F5-1H5 VH acido nucleico
36
1F5-1H5 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
37
1F5-1H5 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
38
1F5-1H5 VH CDR1 aminoacido
39
1F5-1H5 VH CDR2 aminoacido
40
1F5-1H5 VH CDR3 aminoacido
41
1F5-1H5 VL #2 acido nucleico
42
1F5-1H5 VL #2 aminoacido incluyendo el peptido senal
43
1F5-1H5 VL #2 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
44
1F5-1H5 VL #1 CDR1 aminoacido
45
1F5-1H5 VL #2 CDR2 aminoacido
46
1F5-1H5 VL #2 CDR3 aminoacido
47
1H8-B4 VH acido nucleico
48
1H8-B4 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
49
1H8-B4 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
SEQ ID NO:
DESCRIPCION
50
1H8-B4 VH CDR1 aminoacido
51
1H8-B4 VH CDR2 aminoacido
52
1H8-B4 VH CDR3 aminoacido
53
1H8-B4 VL acido nucleico
54
1H8-B4 VL aminoacido incluyendo el peptido senal
55
1H8-B4 VL aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
56
1H8-B4 VL CDR1 aminoacido
57
1H8-B4 VL CDR2 aminoacido
58
1H8-B4 VL CDR3 aminoacido
59
1G5-1B9 VH acido nucleico
60
1G5-1B9 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
61
1G5-1B9 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
62
1G5-1B9 VH CDR1 aminoacido
63
1G5-1B9 VH CDR2 aminoacido
64
1G5-1B9 VH CDR3 aminoacido
65
1G5-1B9 VL acido nucleico
66
1G5-1B9 VL aminoacido incluyendo el peptido senal
67
1G5-1B9 VL aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
68
1G5-1B9 VL CDR1 aminoacido
69
1G5-1B9 VL CDR2 aminoacido
70
1G5-1B9 VL CDR3 aminoacido
71
2G9-1D11 VH acido nucleico
72
2G9-1D11 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
73
2G9-1D11 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
74
2G9-1D11 VH CDR1 aminoacido
75
2G9-1D11 VH CDR2 aminoacido
76
2G9-1D11 VH CDR3 aminoacido
77
2G9-1D11 VL acido nucleico
78
2G9-1D11 VL aminoacido incluyendo el peptido senal
79
2G9-1D11 VL aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
80
2G9-1D11 VL CDR1 aminoacido
SEQ ID NO:
DESCRIPCION
81
2G9-1D11 VL CDR2 aminoacido
82
2G9-1D11 VL CDR3 aminoacido
83
3A10-1G10 VH acido nucleico
84
3A10-1G10 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
85
3A10-1G10 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
86
3A10-1G10 VH CDR1 aminoacido
87
3A10-1G10 VH CDR2 aminoacido
88
3A10-1G10 VH CDR3 aminoacido
89
3A10-1G10 VL #1 acido nucleico
90
3A10-1G10 VL #1 aminoacido incluyendo el peptido senal
91
3A10-1G10 VL #1 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
92
3A10-1G10 VL #1 CDR1 aminoacido
93
3A10-1G10 VL #1 CDR2 aminoacido
94
3A10-1G10 VL #1 CDR3 aminoacido
95
3A10-1G10 VL #4 acido nucleico
96
3A10-1G10 VL #4 aminoacido incluyendo el peptido senal
97
3A10-1G10 VL #4 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
98
3A10-1G10 VL #4 CDR1 aminoacido
99
3A10-1G10 VL #4 CDR2 aminoacido
100
3A10-1G10 VL #4 CDR3 aminoacido
101
3H12-1E12 VH acido nucleico
102
3H12-1E12 VH aminoacido incluyendo el peptido senal
103
3H12-1E12 VH aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
104
3H12-1E12 VH CDR1 aminoacido
105
3H12-1E12 VH CDR2 aminoacido
106
3H12-1E12 VH CDR3 aminoacido
107
3H12-1E12 VL #2 acido nucleico
108
3H12-1E12 VL #2 aminoacido incluyendo el peptido senal
109
3H12-1E12 VL #2 aminoacido "maduro" excluyendo el peptido senal
110
3H12-1E12 VL #2 CDR1 aminoacido
111
3H12-1E12 VL #2 CDR2 aminoacido
SEQ ID NO:
DESCRIPCION
112
3H12-1E12 VL #2 CDR3
aminoacido
113
VH CDR3 consenso
114
VL CDR3 consenso
115
VH CDR2 consenso
116
VL CDR2 consenso
117
VH CDR1 consenso
118
VL CDR1 consenso

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a CD27 humana e induce o mejora una respuesta inmunitaria de linfocitos T, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 38, una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 39, una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 40, una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEQ ID NO: 44, una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 45 y una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 46.
  2. 2. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende:
    (i) una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identica a las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43, respectivamente;
    (ii) una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoacidos al menos el 95 % identica a las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43, respectivamente; o
    (iii) una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera codificadas por secuencias de acidos nucleicos al menos el 90 % identicas a las secuencias de acidos nucleicos expuestas en SEQ ID NOs: 35 y 41, respectivamente.
  3. 3. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NOs: 37 y 43, respectivamente.
  4. 4. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera codificado por las secuencias de acidos nucleicos expuestas en SEQ ID NOs: 35 y 41, respectivamente.
  5. 5. El anticuerpo monoclonal aislado de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo presenta al menos una de las siguientes propiedades:
    (a) bloquea la union de sCD70 a CD27 al menos el 70 % a una concentracion de anticuerpo de 10 pg/ml;
    (b) se une a CD27 humana con una constante de disociacion en equilibrio Kd de 10"9 M o menos, o alternativamente, una constante de asociacion en equilibrio Ka de 10+9 M"1 o mayor;
    (c) induce citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) especffica de celulas que expresan CD27 al menos el 10 % a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml y aproximadamente el 6 % de complemento de suero de conejo;
    (d) induce lisis especffica de citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC) de celulas que expresan CD27 al menos el 10 % a una concentracion de anticuerpo de 3 pg/ml y relacion de celulas efectoras:diana de 75:1;
    (e) mejora la mediana de la supervivencia al menos el 20 % en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) despues de la inoculacion con celulas tumorales in vivo (5 x 105 celulas Raji o 1 x 106 celulas Daudi) cuando se administran a 0,3 mg (i.p.) al menos dos veces a la semana durante 3 semanas en comparacion con los ratones a los que no se les administra anticuerpo;
    (f) induce o mejora respuestas inmunitarias especfficas de antfgeno in vivo en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
    (g) induce o mejora respuestas inmunitarias TH1 especfficas de antfgeno in vivo en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
    (h) induce o mejora la proliferacion o activacion de linfocitos T especfficos de antfgeno in vivo en combinacion con una vacuna o antfgeno endogeno;
    (i) induce o mejora la actividad de linfocitos T cuando se combina con activacion simultanea, separada o consecutiva de TCR;
    (j) produce menos del 50 % de reduccion de linfocitos T CD3+ (distintos de linfocitos NK) en macacos cuando se administra a 3 mg/kg (i.v.) durante el periodo de 29 dfas inmediatamente tras la administracion; o
    (k) produce menos del 50 % de reduccion de linfocitos B de memoria en macacos cuando se administra a 3 mg/kg (i.v.) durante el periodo de 29 dfas inmediatamente tras la administracion.
  6. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo esta seleccionado de:
    (i) un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; y/o
    (ii) un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.
  7. 7. Una molecula biespecffica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, unida a una segunda molecula que tiene una especificidad de union que es diferente del anticuerpo, en la que opcionalmente la segunda molecula se une a un receptor Fc, un receptor NK, o un receptor de linfocitos T
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    seleccionado de CD3, CD40 y CD25.
  8. 8. Un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la region variable de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9. Una celula transformada con el vector de expresion de la reivindicacion 8.
  10. 10. Una composicion que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la molecula biespecffica de la reivindicacion 7 y un vehfculo.
  11. 11. La composicion de la reivindicacion 10, que comprende ademas:
    (i) un adyuvante y/o agente inmunoestimulante, opcionalmente
    en la que el agente inmunoestimulante esta seleccionado de ligando CD40, ligando FLT 3, citocinas, factores estimulantes de colonias, un anticuerpo anti-CTLA-4, LPS (endotoxina), ARNms, ARNbc, Bacille Calmette- Guerin (BCG), clorhidrato de levamisol, inmunoglobulinas intravenosas y un agonista del receptor tipo Toll (TLR), tal como un agonista de TLR3, un agonista de TLR4, un agonista de TLR5, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 y un agonista de TLR 9; o
    (ii) un agente inmunosupresor, otro anticuerpo y/o un antfgeno, opcionalmente en la que el antfgeno comprende un componente de un patogeno, un alergeno, un autoantfgeno o un antfgeno de tumor, tal como phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MARTI, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY- BR-1, nY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, tirosinasa, telomerasa, antfgenos SSX2, antfgenos MUC-1 y antfgenos de tumor derivados de celulas germinales.
  12. 12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un metodo de tratamiento de un cancer seleccionado de leucemia, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, eritroleucemia monocftica mielomonocftica promielocftica de mieloblastos, leucemia cronica, leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia linfocftica cronica, linfoma de celulas del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, linfoma policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores solidos, sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de colon, carcinoma colorrectal, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vfas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cancer de cuello uterino, cancer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de pulmon no de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofarfngeo, carcinoma esofagico, carcinoma de celulas basales, cancer de las vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de huesos, cancer de cerebro y sistema nervioso central (SNC), cancer de cuello uterino, coriocarcinoma, canceres colorrectales, cancer de tejido conjuntivo, cancer del aparato digestivo, cancer endometrial, cancer de esofago, cancer de ojo, cancer de cabeza y cuello, cancer gastrico, neoplasia intraepitelial, cancer de rinon, cancer de laringe, cancer de hfgado, cancer de pulmon (de celulas pequenas, de celulas grandes), melanoma, neuroblastoma; cancer de cavidad bucal (por ejemplo, labios, lengua, boca y faringe), cancer de ovarios, cancer pancreatico, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer rectal; cancer del aparato respiratorio, sarcoma, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer uterino y cancer del aparato urinario.
  13. 13. Un metodo de deteccion de la presencia o ausencia de CD27 en una muestra biologica, que comprende:
    (a) poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo se marca con una sustancia detectable; y
    (b) detectar el anticuerpo unido a CD27 para asf detectar la presencia o ausencia de CD27 en la muestra biologica.
ES11730118.4T 2010-04-13 2011-04-13 Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos Active ES2608475T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32372010P 2010-04-13 2010-04-13
US323720P 2010-04-13
US201161471459P 2011-04-04 2011-04-04
US471459P 2011-04-04
PCT/US2011/032355 WO2011130434A2 (en) 2010-04-13 2011-04-13 Antibodies that bind human cd27 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2608475T3 true ES2608475T3 (es) 2017-04-11

Family

ID=44534592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11730118.4T Active ES2608475T3 (es) 2010-04-13 2011-04-13 Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos

Country Status (15)

Country Link
US (3) US9169325B2 (es)
EP (2) EP3165540A1 (es)
JP (2) JP6002659B2 (es)
KR (1) KR101958753B1 (es)
CN (2) CN103154034B (es)
AU (1) AU2011239706B2 (es)
BR (1) BR112012026227A2 (es)
CA (1) CA2796571C (es)
EA (2) EA201690310A1 (es)
ES (1) ES2608475T3 (es)
IL (1) IL222329B (es)
MX (1) MX339621B (es)
NZ (2) NZ602892A (es)
SG (1) SG184310A1 (es)
WO (1) WO2011130434A2 (es)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG184310A1 (en) 2010-04-13 2012-10-30 Celldex Therapeutics Inc Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
JP6023706B2 (ja) * 2010-07-09 2016-11-09 アデュロ・バイオテック・ホールディングス・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップＡｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ， Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ． Ｃｄ２７に対するアゴニスト抗体
EP2655409A4 (en) 2010-12-22 2015-07-01 Univ Leland Stanford Junior SUPERAGONISTS AND ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-2
JO3787B1 (ar) 2012-03-15 2021-01-31 Janssen Biotech Inc أجسام مضادة بشرية ضد cd27 و طرق و استخداماتها
MX355041B (es) 2012-05-25 2018-03-28 Janssen Biotech Inc Dominios de union a albumina consenso no naturales.
WO2014140374A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Novo Nordisk A/S Monovalent cd27 antibodies
NZ712148A (en) 2013-03-29 2019-11-29 Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd Wt1 antigen peptide conjugate vaccine
US9725494B2 (en) 2013-05-17 2017-08-08 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Soluble CD27 (sCD27) and the use thereof
AU2014292926B2 (en) 2013-07-25 2020-03-05 Exicure Operating Company Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
RU2016107426A (ru) * 2013-08-02 2017-09-07 Адуро Байотек Холдингс, Юроуп Б.В. Комбинирование агонистов cd27 и ингибирование иммунных контрольных точек для стимуляции иммунитета
CN105722860A (zh) 2013-09-24 2016-06-29 梅迪塞纳医疗股份有限公司 白介素-2融合蛋白及其应用
CN114671954A (zh) 2014-01-10 2022-06-28 博笛生物科技有限公司 靶向her2阳性肿瘤的化合物和组合物
US10150802B2 (en) 2014-04-24 2018-12-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
WO2016002827A1 (ja) * 2014-07-01 2016-01-07 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤
CN107074958A (zh) 2014-07-09 2017-08-18 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗‑pd‑l1组合
MD4733C1 (ro) * 2014-08-19 2021-07-31 Merck Sharp & Dohme Corp Anticorpi anti-TIGIT
TN2017000129A1 (en) 2014-10-14 2018-10-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
PL3218406T3 (pl) * 2014-11-10 2021-10-04 Medimmune Limited Cząsteczki wiążące specyficzne dla CD73 i ich zastosowania
MA40737A (fr) * 2014-11-21 2017-07-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Déterminants de la réponse d'un cancer à une immunothérapie par blocage de pd-1
BR112017015136A2 (pt) * 2015-01-14 2018-01-30 Compass Therapeutics Llc polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, conjugado, composição farmacêutica, método para tratar um indivíduo com câncer, método para inibir ou reduzir o crescimento de câncer, composição, célula, método de fazer um polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, vetor ou conjunto de vetores e kit
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
SI3283107T1 (sl) 2015-04-17 2020-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Sestavki vsebujoči kombinacijo ipilimumaba in nivolumaba
US20180140691A1 (en) * 2015-05-20 2018-05-24 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Combination use of wt1 antigen peptide and immunomodulator
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
EP3364995B1 (en) * 2015-10-23 2021-08-04 Apogenix AG Single-chain cd27-receptor agonist proteins
US10392442B2 (en) 2015-12-17 2019-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Use of anti-PD-1 antibody in combination with anti-CD27 antibody in cancer treatment
CN115252792A (zh) 2016-01-07 2022-11-01 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-egfr组合
CN115554406A (zh) 2016-01-07 2023-01-03 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-cd20组合
BR112018067802A2 (pt) * 2016-03-04 2019-01-15 Univ Rockefeller anticorpos anti-cd40 com atividade agonista melhorada
JP7069032B2 (ja) 2016-03-24 2022-05-17 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド がん免疫治療における胃腸の免疫関連有害事象の治療方法
BR112018073781A2 (pt) 2016-05-20 2019-02-26 Biohaven Pharmaceutical Holding Company Ltd. uso de agentes de modulação de glutamato com imunoterapias para o tratamento de câncer
EP3471753A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
GB201613167D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Univ Southampton Cancer and b-cell related disease therapy
CN109843916B (zh) 2016-08-12 2023-10-31 詹森生物科技公司 具有增强的激动活性的Fc工程化抗TNFR超家族成员抗体及其使用方法
US10669344B2 (en) 2016-08-12 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other Fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
LT3347379T (lt) 2016-08-17 2020-05-11 Compugen Ltd. Anti-tigit antikūnai, anti-pvrig antikūnai ir jų kombinacijos
JOP20190055A1 (ar) * 2016-09-26 2019-03-24 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة ضد cd27
US20190225698A1 (en) * 2016-09-29 2019-07-25 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd27 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use of same
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
CN108239659B (zh) 2016-12-23 2020-03-03 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018113774A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd27
CA3049163A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists
KR20190133213A (ko) 2017-03-31 2019-12-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
CN108794467A (zh) 2017-04-27 2018-11-13 博笛生物科技有限公司 2-氨基-喹啉衍生物
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
BR112019023608A2 (pt) 2017-05-12 2020-05-26 Crispr Therapeutics Ag Materiais e métodos para células manipuladas e seus usos em imuno-oncologia
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
SG10202111336RA (en) 2017-06-01 2021-11-29 Compugen Ltd Triple combination antibody therapies
EP3641814A4 (en) 2017-06-19 2021-06-23 Medicenna Therapeutics Inc. USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS, AGONISTS, AND FUSIONS THEREOF
EP3641771A4 (en) 2017-06-23 2020-12-16 Birdie Biopharmaceuticals, Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
WO2019070991A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 Duke University IMPROVING THE EFFECTIVENESS OF VACCINES AGAINST CANCER
WO2019075468A1 (en) 2017-10-15 2019-04-18 Bristol-Myers Squibb Company TUMOR TREATMENT METHODS
JP2021512962A (ja) 2018-02-13 2021-05-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド アデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストによる腫瘍浸潤性リンパ球（ｔｉｌ）の拡大培養並びにｔｉｌ及びアデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストの治療的組み合わせ
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
CA3094005A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd27 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
WO2019191676A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
JP2021520201A (ja) * 2018-04-04 2021-08-19 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗ｃｄ２７抗体およびその使用
CN111971303B (zh) * 2018-04-13 2022-05-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd27抗体及其用途
CN112292185A (zh) 2018-04-17 2021-01-29 塞德斯医疗公司 抗cd27和抗pd-l1抗体及双特异性构建体
CA3099364A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer comprising engineered t cells comprising modified chimeric antigen receptors
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
JP7453219B2 (ja) 2018-10-11 2024-03-19 インヒブリックス， インコーポレイテッド Ｐｄ－１単一ドメイン抗体およびその治療用組成物
CN115227824A (zh) * 2018-11-12 2022-10-25 中南大学湘雅二医院 免疫检查点的抑制剂在制备治疗青光眼和其他眼部免疫损伤机制相关疾病药物中的应用
US20220016168A1 (en) 2018-12-11 2022-01-20 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
AU2020241686A1 (en) 2019-03-15 2021-11-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting HER2
BR112021019328A2 (pt) 2019-03-29 2021-11-30 Myst Therapeutics Llc Métodos ex vivo para produzir um produto terapêutico de célula t e composições e métodos relacionados
CA3138633A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
WO2020227159A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity
EP4065229A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Myst Therapeutics, LLC Method of producing tumor-reactive t cell composition using modulatory agents
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CN115427438A (zh) 2020-02-27 2022-12-02 迈斯特治疗公司 肿瘤反应性t细胞的离体富集和扩增的方法及其相关组合物
CN111690070A (zh) * 2020-05-13 2020-09-22 深圳市众循精准医学研究院 一种sPD-1-Fc-sTGFβRII融合蛋白及其应用
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
MX2023007734A (es) 2020-12-28 2023-08-21 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de las mismas.
JP2024501029A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１抗体の皮下投与
US20240117047A1 (en) * 2021-02-11 2024-04-11 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for human ror1
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US20230109496A1 (en) 2021-09-06 2023-04-06 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
WO2023064958A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Compugen Ltd. Combination therapy with anti-pvrig antibodies formulations, anti-tigit antibodies, and anti-pd-1 antibodies
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5182368A (en) 1986-06-13 1993-01-26 Ledbetter Jeffrey A Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CN1049686C (zh) 1987-11-18 2000-02-23 希龙股份有限公司 非ａ和非ｂ肝炎病毒的诊断及疫苗
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP3237842B2 (ja) 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
DE69031556T2 (de) 1989-07-25 1998-05-14 Smithkline Beecham Biolog Antigene sowie Verfahren zu deren Herstellung
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU658370B2 (en) 1990-07-13 1995-04-13 General Hospital Corporation, The CD53 cell surface antigen and use thereof
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
DE4123760C2 (de) 1991-07-18 2000-01-20 Dade Behring Marburg Gmbh Seroreaktive Bereiche auf den HPV 16 Proteinen E1 und E2
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5620886A (en) 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
DK0772619T4 (da) 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
CA2211995A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US5840306A (en) 1995-03-22 1998-11-24 Merck & Co., Inc. DNA encoding human papillomavirus type 18
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
US6069233A (en) 1996-10-03 2000-05-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US6010853A (en) 1997-05-29 2000-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Siva genes, novel genes involved in CD27-mediated apoptosis
KR100619350B1 (ko) 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU746163B2 (en) 1998-04-09 2002-04-18 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Adjuvant compositions
US20030035790A1 (en) 1999-01-15 2003-02-20 Shu-Hsia Chen Combination therapy for the prevention or treatment of cancer, inflammatory disorders or infectious diseases in a subject
AU3209300A (en) 1999-01-15 2000-08-01 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Combination therapy of cancer by the activation of co-stimulatory molecules expressed by immune cells and cytokines
US6774226B1 (en) 1999-11-30 2004-08-10 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
CA2404164A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for enhancing immunogenicity of antigens
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
IL157274A0 (en) * 2001-02-12 2004-02-19 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to fc alpha receptor (cd89)
US6794501B2 (en) 2001-05-04 2004-09-21 Ludwig Institute For Cancer Research Colon cancer antigen panel
AU2003210266A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Bioinvent International Ab Treatment, diagnosis and imaging of disease
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
WO2004023973A2 (en) 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
CA2516138A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic gpcr targets in cancer
US20040170982A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
CA2516128A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
US20080213267A1 (en) 2006-02-24 2008-09-04 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
JPWO2007102200A1 (ja) * 2006-03-07 2009-07-23 国立大学法人大阪大学 抗ｃｄ２０モノクローナル抗体
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
US7794718B2 (en) * 2007-11-01 2010-09-14 Perseid Therapeutics, LLC Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
EA026990B1 (ru) 2007-11-07 2017-06-30 Селлдекс Терапьютикс Инк. Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205
EP2090320A1 (en) 2008-02-15 2009-08-19 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Ligands of the Natural Killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof
CA2729567C (en) 2008-06-30 2018-04-24 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd27 antibody
SG184310A1 (en) 2010-04-13 2012-10-30 Celldex Therapeutics Inc Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
JP6023706B2 (ja) 2010-07-09 2016-11-09 アデュロ・バイオテック・ホールディングス・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップＡｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ， Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ． Ｃｄ２７に対するアゴニスト抗体
EP2723381A4 (en) 2011-06-21 2015-03-18 Univ Johns Hopkins FOCUSED RADIATION FOR THE REINFORCEMENT OF IMMUNE TREATMENTS AGAINST NEOPLASMS
JO3787B1 (ar) 2012-03-15 2021-01-31 Janssen Biotech Inc أجسام مضادة بشرية ضد cd27 و طرق و استخداماتها
JP6136343B2 (ja) 2012-06-12 2017-05-31 株式会社リコー 情報処理システム、情報処理方法、プログラム、及び記録媒体
RU2016107426A (ru) 2013-08-02 2017-09-07 Адуро Байотек Холдингс, Юроуп Б.В. Комбинирование агонистов cd27 и ингибирование иммунных контрольных точек для стимуляции иммунитета
CA2921639A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Cd70-binding peptides and method, process and use relating thereto
KR102264548B1 (ko) 2014-11-21 2021-06-16 삼성전자주식회사 반도체 패키지 및 그 제조 방법
GB201500319D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
WO2017079112A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
SG11201808821WA (en) 2016-04-18 2018-11-29 Celldex Therapeutics Inc Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
GB201613167D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Univ Southampton Cancer and b-cell related disease therapy
CN112292185A (zh) 2018-04-17 2021-01-29 塞德斯医疗公司 抗cd27和抗pd-l1抗体及双特异性构建体

Also Published As

Publication number Publication date
CN103154034A (zh) 2013-06-12
IL222329B (en) 2018-08-30
BR112012026227A2 (pt) 2020-08-04
IL222329A0 (en) 2012-12-31
EA024701B1 (ru) 2016-10-31
EP2558498B1 (en) 2016-10-12
CN105669865A (zh) 2016-06-15
US11180566B2 (en) 2021-11-23
JP2013531970A (ja) 2013-08-15
US20110274685A1 (en) 2011-11-10
JP6486300B2 (ja) 2019-03-20
AU2011239706A1 (en) 2012-11-01
WO2011130434A9 (en) 2012-07-19
JP2017046692A (ja) 2017-03-09
AU2011239706B2 (en) 2015-08-20
EA201690310A1 (ru) 2016-12-30
WO2011130434A2 (en) 2011-10-20
EA201291039A1 (ru) 2013-04-30
NZ602892A (en) 2014-08-29
KR101958753B1 (ko) 2019-03-15
US20150337047A1 (en) 2015-11-26
US20220227877A1 (en) 2022-07-21
SG184310A1 (en) 2012-10-30
CN103154034B (zh) 2016-06-08
NZ623807A (en) 2016-03-31
JP6002659B2 (ja) 2016-10-05
CA2796571A1 (en) 2011-10-20
EP2558498A2 (en) 2013-02-20
EP3165540A1 (en) 2017-05-10
US9169325B2 (en) 2015-10-27
CA2796571C (en) 2019-10-29
KR20130066605A (ko) 2013-06-20
MX339621B (es) 2016-06-02
MX2012011768A (es) 2013-05-09
WO2011130434A3 (en) 2012-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2608475T3 (es) Anticuerpos que se unen a cd27 humana y usos de los mismos
US10941201B2 (en) Methods of inducing or enhancing an immune response comprising administering agonistic anti-CD40 antibodies
US20120213771A1 (en) Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
JP7466459B2 (ja) 抗ｃｄ２７および抗ｐｄ－ｌ１抗体ならびに二重特異性構築物
AU2018201621A1 (en) Antibodies that bind human CD27 and uses thereof
AU2013203270B2 (en) Antibodies that bind human CD27 and uses thereof
DK2558498T3 (en) ANTIBODIES BINDING HUMANT CD27 AND APPLICATIONS THEREOF
EA042934B1 (ru) Агонистические антитела, которые связываются с cd40 человека, и варианты их применения