TW201813979A - 抗ｃｄ２７抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及抗CD27抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含該抗CD27抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CD27抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本發明涉及一種人抗CD27抗體及其在製備用於治療CD27介導的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

抗CD27抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
本發明涉及一種抗CD27抗體，CD27的抗原結合片段，包含該抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CD27抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。
腫瘤免疫療法是抗癌藥物領域的一個長期熱點。它充分利用和調動腫瘤患者體內的殺傷性T細胞，對腫瘤進行殺傷摧毀，可能是最有效且最安全的腫瘤治療途徑之一。人體內T細胞的活化是具備兩條信號通路的系統，除了需藉由抗原呈遞細胞遞呈MHC抗原肽給T細胞提供第一信號，同時需要一系列協同刺激分子提供第二信號，才能使T細胞產生正常的免疫應答。
T細胞和抗原呈遞細胞之間的相互作用包括有利於產生免疫應答的多種輔助分子，而CD27正是其中重要一種，它屬於腫瘤壞死因數受體(TNF-R)超家族並結合T細胞表面的CD70。CD27是糖基化的I型跨膜蛋白，通常是由二硫橋連結的同源二聚體。二硫橋處在胞外域的近細胞膜區 域(Camerini等，J Immunol.147：3165-69,1991)。在T細胞上，交聯的CD27抗原可提供協同刺激信號，而與T細胞受體一起交聯時可誘導T細胞增殖和細胞免疫活化。CD27在成熟胸腺細胞、大多數CD4+和CD8+外用血T細胞、自然殺傷細胞和B細胞上表達，也在B細胞非霍奇金淋巴瘤和B細胞慢性淋巴細胞白血病中高表達；而在寄生蟲、巨細胞病毒(CMV)等感染、多發性硬化、結節病和B細胞慢性淋巴細胞白血病中，血清或疾病活動性部位也觀測到可溶CD27蛋白水準升高(Kobata T等，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA.1995(24)：11249-53；Ranheim EA等，Blood.199585(12)：3556-65；Loenen WA等，Eur.J.Immunol.1992 22：447)。
近年的研究表明，抗CD27單株抗體激動劑可促進T細胞應答，並可作為潛在的抗癌治療劑(參見專利WO2008051424，WO2011130434)。雖然迄今獲得的研究結果已將CD27鑒定為免疫療法的有用靶標，但抗CD27單克株抗體哪些具體特徵對治療尤為有利則仍然有待探明。本領域仍然需要深入瞭解抗CD27抗體的哪些具體功能特性在治療學上有效，以至進一步獲得潛在的對防治疾病疾病更有效的改進型抗CD27抗體。
目前已有多家國際公司研發針對CD27靶點的腫瘤抗體藥物。美國Celldex的抗CD27抗體已處在II期臨床試驗階段，而默克、Aduro和Apogenix等公司的相關產品尚在臨床前開發之中。
本專利發明旨在提供具備高親和力、高選擇性和高生物活性的抗CD27抗體，具有可與期望的有利治療效果相關聯的特定功能特性。
本發明提供一種抗CD27抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：14所示的LCDR1。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：15所示的LCDR2。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的LCDR3區。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗 CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11所示的HCDR1。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：12所示的HCDR2。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：13所示的HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，該抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，該抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且其中該抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
特別佳的抗CD27抗體或其抗原結合片段可選自下述任一種：
(1)抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(2)抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中，該抗體輕鏈可變區 序列選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10；重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
特別佳的抗CD27抗體或其抗原結合片段可選自下述任一種：
(1)抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：2，重鏈可變區序列為SEQ ID NO：1。
(2)抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：10，重鏈可變區序列為SEQ ID NO：9。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為鼠源抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為嵌合抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27人源化抗體或其片段，其進一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的恆定區，較佳包含人源IgG1，IgG2或IgG4恆定區。因為IgG2或IgG4沒有ADCC毒性，或者 使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fv、sFv、F(ab’)2。
本發明進一步提供一種編碼如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段的DNA序列。
本發明進一步提供一種含有如上所述的DNA序列的表達載體。
本發明進一步提供一種用如上所述的表達載體轉化的宿主細胞。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母。
在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
本發明還提供了一種多特異性抗體，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。
本發明還提供了一種單鏈抗體，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。
本發明還提供了一種抗體-藥物偶聯物，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。該抗體-藥物偶聯物是本領域公知的，其由抗體-接頭-藥物(毒素)相互連接形成，已知的接頭包括裂解接頭、非裂解接頭，例如接頭包括但不限於SMCC、SPDP等等；毒素也是本領域公知的，例如DM1、DM4、MMAE、MMAF等。
本發明進一步提供一種如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段、或包含其的醫藥組成物，包括但不限於多特異性抗體、單鏈抗體、抗體-藥物偶聯物等形式，在製備用於治療CD27介導的疾病或病症的藥物中的用途；其中該疾病較佳為癌症和自身免疫疾病；更佳為表達CD27的癌症和自身免疫疾病；該癌症最佳為直腸癌、腦癌、腎癌、肺癌、肝癌、多發性骨髓瘤和黑色素瘤；該自身免疫疾病最佳為自身免疫性腦脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化和類風濕關節炎。
本發明進一步提供一種治療和預防CD27介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量的如上所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段、或包含其的的醫藥組成物，包括但不限於多特異性抗體、單鏈抗體、抗體-藥物偶聯物等形式；其中該疾病較佳為癌症和自身免疫疾病；更佳為表達CD27的癌症和自身免疫疾病；該癌症最佳為直腸癌、腦癌、腎癌、肺癌、肝癌、多發性骨髓瘤 和黑色素瘤；該自身免疫疾病最佳為自身免疫性腦脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化和類風濕關節炎。
第1圖為抗CD27抗體mAb076和mAb077與抗原的親和力和動力學參數圖，其藉由Data Acquisition 7.1軟體，按相應實施例中所描述的方法進行測定。
第2圖為使用流式細胞分析測定的人抗CD27抗體mAb076和mAb077與HEK293細胞表達的人或小鼠CD27抗原結合、而與其餘TNFR超家族受體均無結合的數據(有結合信號的細胞占細胞總數比例)圖。
第3圖為使用流式細胞分析測定的，抗CD27抗體mAb076與HEK293細胞表達的人或小鼠CD27抗原結合的梯度稀釋滴定曲線圖。
第4圖為使用流式細胞分析測定的人抗CD27抗體mAb076和mAb077與小鼠T細胞結合的數據(有結合信號的細胞占細胞總數比例)圖。
第5圖為使用流式細胞分析測定的抗體mAb076和mAb077有效阻斷細胞表達CD27與其配體CD70結合的數據(有CD70特異結合信號的細胞占細胞總數比例)圖。
第6圖為使用螢光素酶報告基因方法檢測的，抗體mAb076和mAb077啟動NF-kB信號通路的梯度稀釋滴定曲線圖。
第7圖為使用流式細胞分析測定的，抗體mAb076和mAb077啟動人外周血單核T細胞的圖：(A).1F5、mAb076 和mAb077對T細胞IFN-γ表達的促進作用。(B).mAb076抗體對T細胞增殖的活化。
第8圖為抗CD27抗體mAb076和mAb077與Fc γ RI受體結合的親和力和動力學參數圖，其藉由Data Acquisition 7.1軟體，按相應實施例中所描述的方法進行測定。
第9圖為在溶媒處理的小鼠中、用對照人IgG1抗體處理的小鼠中或用抗CD27 mAb076-IgG抗體處理的小鼠中，E.G7-OVA移植T淋巴瘤相對於腫瘤接種後的天數的腫瘤大小(以mm3表示)圖。(A)為腫瘤生長曲線；(B)為小鼠體重相對變化。誤差用標準誤差表示。
第10圖為在PBS處理的小鼠中、用對照人IgG1抗體處理的小鼠中或用抗CD27 mAb077-IgG抗體處理的小鼠中，人源Raji移植淋巴瘤相對於腫瘤接種後的天數的腫瘤大小(以mm3表示)圖。(A)為腫瘤生長曲線；(B)為小鼠體重相對變化。誤差用標準誤差表示。
一、術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其他技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈，δ鏈，γ鏈，α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1,2,3,4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2， FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合Kabat和Chothia編號規則(HCDR1)。
術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“CD27”是指為TNF受體超家族成員的細胞表面受體。CD27是產生和長期維持T細胞免疫所必需的分子，並在調節B細胞活化和免疫球蛋白合成中發揮關鍵作用。術語“CD27”包括由細胞天然表達的CD27(例如以登錄號AAH12160.1登記於GENBANK的人CD27)的任何變體或同種型。本發明的抗體可與得自非人物種的CD27交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人CD27特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。CD27或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳地，抗CD27抗體靶向具有正常糖基化模 式的人源CD27。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2 或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。
本發明中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及與人CD27結合的Fv片段sFv片段；包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：8中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位元點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語“與CD27結合”，指能與人CD27相互作用。本發明的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗 體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“抗體-藥物偶聯物”(ADC)指與一種或多種異源的化學合成分子，包括但不限於細胞毒劑偶聯的抗體或抗體片段。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本發明所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人CD27作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊 密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的CD27結合的能力。例如，結合人CD27的本發明的抗體也可以結合另一物種的CD27。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達CD27的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。CD70的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生CD70結合時出現活性的正常水準或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗CD27抗體接觸時，與未與抗CD27抗體接觸的CD70相比，任何可測量的CD70結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒 作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F235E,或L234A/E235A突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人CD27或其片段免疫，所得到的抗體能被復性，純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。 得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其他現有技術進行重組得到。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效 量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其他專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由……組成”或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且視需要包括與該元件類似或不同性質的其他元件，該其他元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。作為非限制性例子，基本上由所提及的胺基酸序列組成的結合化合物還可以包括一種或多種胺基酸，其不顯著影響結合化合物的性質。
本發明所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特 定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括親代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性 成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的《抗體技術實驗手冊》，《分子選殖手冊》；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1：人CD27抗原結合抗體片段(Fab)的篩選發現
針對人CD27抗原的人源抗體片段篩選使用了體外噬菌粒展示系統。所用抗原包括CD27-HisFc(Sino Biological #10039-H03H),CD27-Fc(Sino Biological #10039-H31H)和CD27-His(Sino Biological #10039-H08B1)。抗原被直接吸附固定在Maxisorp 96孔篩選板(Thermo Scientific 446469)，或經生物素化後吸附在Dynabeads微顆粒(M280,Streptavidin,Invitrogen #60210)上，並使用KingFisher(Thermo Scientific)自動篩選工作站經標準噬菌體展示篩選流程進行篩選。針對每種抗原進行了3-4輪以上篩選，在每輪中使用人源抗體Fc片段以消除背景。在最後一輪篩選之後，挑取單菌落純株孵育上清，藉由ELISA方法初步鑒定結合人CD27的抗體片段，初選標準為ELISA讀數至少是背景信號的2倍以上。
實施例2：生物膜層干涉(BLI)測定抗體片段與人CD27親和力
每個獨特序列的抗體Fab片段在其C端增加組胺酸標 記後使用大腸桿菌表達系統過表達，然後由Ni-NTA親和樹脂進行純化。Fab使用ForteBio Octet RED96系統由以下方法測定其與人CD27的親和力：首先使用BLI系統的AHC(人源IgG抗體Fc片段特異)感測器捕獲人CD27-HisFc融合蛋白，然後將其浸入含有5-10μg/ml每種純化Fab蛋白的測量緩衝液中。收集的數據由Data Acquisition 7.1軟體進行處理，並擬合為1：1結合的Langmuir模型曲線。抗體mAb076和mAb077為結合力最優的兩株抗體，被選取用於進一步的分析和開發試驗。其與CD27結合與動力學常數如第1圖所示。
人單抗mAb076的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
mAb076 VH SEQ ID NO：1
mAb076 VL SEQ ID NO：2 其含有下列CDR序列：
人單抗mAb077的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
mAb077 VH SEQ ID NO：9
mAb077 VL SEQ ID NO：10 其含有下列CDR序列：
實施例3：抗體Fab片段轉為IgG及其表達純化
將每個抗體片段分別選殖進表達IgG1亞型抗體輕鏈和重鏈的哺乳動物細胞表達載體。配對的載體以瞬轉方式按標準流程轉染入HEK293細胞中。表達後收集上清離心過濾，然後藉由protein A親和力層析色譜純化IgG。洗脫的蛋白經中和後離子交換轉入PB緩衝液(20mM磷酸鈉，150mM NaCl,pH 7.0)。蛋白濃度藉由紫外分光光度計測定，並在變性、還原或非還原條件下測定其純度和性質。
實施例4：表面等離子共振(SPR)測定抗體與不同物種CD27的結合
抗體與人CD27結合的親和力和動力學參數使用BiacoreTM T200測定。首先在Biacore系統的CM5晶片上固定抗人IgG(Fc)抗體，並以此捕獲mAb076、mAb077和參照抗體1F5的IgG1部分(流速10μL/min，12秒)。其後的動力學實驗中，不同濃度的人CD27抗原(3.13,6.25,12.5,25, 50,100Nm)以30μL/min，300秒，然後300秒解離時間進行分析。系統緩衝液為1×HBS-EP(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005% v/v P20表面活性劑,pH 7.4，25℃，以下實驗同)，每個實驗配備晶片未固定任何蛋白的空白對照。每次結束後以10mM甘胺酸(pH 1.5)，流速30μL/min，30秒再生晶片。實驗數據由BIAevaluation 3.2軟體進行處理，並擬合為1：1結合的Langmuir模型曲線。結果如第1圖所示。
抗體與人CD27結合的親和力同樣使用SPR測定。在本實驗中，鼠CD27-FcHis融合蛋白藉由胺基偶聯直接固定於CM5晶片上(600RU)。不同濃度(0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50,100nM)的抗體於30μL/min流速，30秒上樣，解離時間1800秒。結果顯示mAb076和077均對小鼠CD27有pM級別親和力，而參照抗體1F5則沒有。數據如第1圖所示。
抗體與猴CD27結合的親和力和動力學參數使用ForteBio Octet RED96測定。各IgG抗體經生物素化標記後，藉由EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation試劑盒(Thermo Fisher Scientific)方法固定於含鏈親和素(Streptavidin)的生物感測器上，再將感測器先後浸入含恆河猴CD27-Fc蛋白的緩衝液中300秒結合、空白緩衝液300秒解離。收集的數據由Data Acquisition 7.1軟體進行處理，並擬合為1：1結合的Langmuir模型曲線。如第1圖所示，mAb076和mAb077的親和力較1F5相比均更高。
實施例5：抗體與細胞表達人/鼠CD27特異結合的測定
抗體與細胞表面表達的人或鼠CD27結合藉由螢光啟動細胞分選(FACS)測定。相應抗原使用載體質粒瞬轉入HEK293細胞後進行表達，48小時後收集細胞並使用冷的FACS緩衝液(PBS，1%BSA)洗一次，然後分別與100nM相應抗體在冰上孵育結合1小時。緩衝液洗2次後，再與Alexa Fluor 647偶聯的鼠抗人Fc抗體在冰上結合30分鐘，洗1次後上樣Beckman® CytoFlex流式細胞儀檢測讀數，計算有結合信號的細胞百分比例。如第2圖所示，抗體mAb076和mAb077與細胞表面的人或鼠CD27均有明顯結合，而與包括人或鼠CD40,OX40,CD137,FAS,TNFRSF1A在內的其餘TNF受體超家族成員抗原蛋白均無結合。
mAb076抗體與細胞表面表達的人或鼠CD27結合的EC50由1：3逐級梯度稀釋曲線(100nM至0.05nM)測定。如第3圖所示，mAb076與參照抗體1F5和細胞表面人CD27均有較強結合，而1F5與鼠CD27結合信號很弱。
實施例6：抗體與小鼠T細胞結合的測定
該項抗體結合實驗使用活化的小鼠脾臟T細胞進行。BALB/c脾臟T細胞使用Stemcell Technologies的小鼠T細胞分離試劑盒進行純化，並使用50ng/ml PMA和1μg/ml離子黴素(Ionomycin)啟動2天，然後每個樣品收集105數量的細胞，使用50μl 100nM相應抗體在冰上孵育1小時。FACS緩衝液洗一次後，用100μl 1：500稀釋的鼠抗人Fc-APC(Biolegend)冰上孵育染色30分鐘。緩衝液再洗一次 後再懸浮，然後上樣至CytoFlex流式細胞儀檢測讀數，計算有結合信號的細胞百分比例。如第4圖所示，mAb076與mAb077均與活化的小鼠T細胞有很強結合力。
實施例7：抗體的CD27配體阻斷實驗
抗體阻斷CD27與其配體CD70結合的測試藉由免疫螢光染色和FACS檢測。使用載體質粒瞬轉CD27進入HEK293細胞後進行表達，48小時後收集細胞並使用冷的FACS緩衝液洗一次，然後分別與100nM相應抗體在冰上孵育結合1小時，再加入16nM生物素化標記的CD70。孵育30分鐘後，緩衝液洗2次並與Alexa Fluor 647偶聯的鏈親和素孵育結合30分鐘。緩衝液再洗一次後再懸浮，然後上樣至CytoFlex流式細胞儀檢測讀數，計算有CD70特異結合信號的細胞百分比例。如第5圖所示，mAb076、mAb077與參照抗體均可有效阻斷CD27與CD70的結合。
實施例8：抗CD27抗體對NF-kB細胞信號通路的啟動
細胞表面CD27分子的啟動會引發下游一系列信號通路的活化，包括NK-kB，可藉由螢光素酶報告基因方法檢測。在本例中，5×105 HEK293T細胞轉染入表達人CD27基因的質粒，以及NFkB-luc和renilla螢光素酶報告基因(Promega)。4小時後，分裝入96孔板，2×104細胞每孔。將梯度稀釋的相應抗體與F(ab')2羊抗人IgG Fc γ二抗預混合後，加入HEK293T細胞並在5% CO2的37℃培養箱中孵育18小時。裂解細胞，並使用Promega的Dual-luciferase試劑盒，在SpectraMax i3x讀板儀上測量螢光素酶強度。 相對螢光素酶單位(RLU)GraphPad Prism軟體分析並作圖。如第6圖所示，mAb076和mAb077對NF-kB報告基因均有顯著的啟動。
實施例9：抗CD27抗體的T細胞啟動實驗
在T細胞啟動功能實驗中，先使用100ul 0.5ug/ml抗CD3抗體加不同濃度的受測抗體(30,10,3,1,0ug/ml)預處理96孔細胞培養板，4℃過夜。人外周血單核細胞(PBMC)使用Sigma的Histopaque1077試劑盒分離，然後用Stemcell Technologies的純化試劑盒純化，並再懸浮在含10% FBS的RPMI1640培養基中，2.5×105/ml。在96孔板每孔中加入200ul(5×104)上述細胞，並同時使用5ug/ml抗CD28刺激抗體作為陽性對照。在5% CO2的37℃培養箱中孵育4天後，每孔取100ul轉移到新的樣品板(剩餘部分用於IFN-γ檢測)。加入80ul CellTiter-Glo®試劑孵育10分鐘穩定信號，然後用SpectraMax i3x讀板儀檢測冷發光強度。如第7圖所示，IgG1形式mAb076和mAb077對T細胞IFN-γ表達的促進作用均比參照抗體1F5更高；而在另一實驗中，mAb076抗體對T細胞的活化也比相應形式的1F5更高。
實施例10：SPR測定抗體與Fc γ R受體的結合
抗體與Fc γ R受體的結合藉由SPR方法在BiacoreTM T200上檢測。Protein L固定在CM5感測器晶片上，用於捕獲抗體(10μl/min，12秒上樣)。然後使用不同濃度的Fc γ RI受體(0.39,0.78,1.56,3.13,6.25nM，系統緩衝液中)10μl/min上樣300秒並解離600秒。對於Fc γ RIIa(CD32a) or Fc γ RIIb(CD32b)兩種受體，使用相同的方法，但濃度為25,50,100,200,400nM。收集的數據由Data Acquisition 7.1軟體進行處理，並擬合為1：1結合的Langmuir模型曲線。mAb076和mAb077僅結合Fc γ RI受體，而與Fc γ RIIa和Fc γ RIIb沒有結合。數據結果如第8圖所示。
實施例11：mAb076-IgG在鼠源腫瘤模型中的藥效
40只C57BL/6小鼠，雌性，5-6週，18-20g，分5組，每組8隻。體外培養E.G7-OVA細胞，無菌條件下，移植於C57BL/6小鼠皮下，每隻小鼠接種1×104個細胞。腫瘤接種當天為第0天。在接種第3天開始第一次給藥，之後按如下方案進行：G1：溶媒對照組；G2：IgG1 0.2mg/隻,i.p.,N=8,Q2D,3,5,7,9,11,13天；G3：mAb076-IgG 0.07mg/隻,i.p.,N=8,Q2D,3,5,7,9,11,13天；G4：mAb076-IgG 0.2mg/隻,i.p.,N=8,Q2D,3,5,7,9,11,13天；G5：mAb076-IgG 0.6mg/隻,i.p.,N=8,Q2D,3,5,7,9,11,13天；給藥後每天監測動物日常行為表現，共進行27天。用遊標卡尺測量腫瘤的長徑及短徑後，用長×寬2/2計算腫瘤體積。腫瘤抑制率採用公式TGI%=(1-T/C)×100%。T和C分別為給藥組和對照組在某一特定時間點的腫瘤體積(TV)。體重變化用公式RCBW%=(BWi-BW0)/BW0×100%， BWi是小鼠當前體重，BW0是分組當日的小鼠體重。所有實驗結果以平均瘤體積±標準誤差(SEM)表示。用T-Test檢驗方法比較治療組腫瘤體積和瘤重與對照組相比有無顯著性差異。所有的數據均用Graphpad進行分析，p<0.05為具有顯著性差異。如第9圖所示，在E.G7-OVA腫瘤模型中，mAb076-IgG表現出抗腫瘤作用，各組終末平均腫瘤體積分別為：1355.3mm3、1365.87mm3、0mm3、404.88mm3、0mm3；低、中、高劑量組抑瘤率(TGI)分別為100%、70.36%和100%。各給藥組均沒有出現明顯的C57BL/6小鼠體重下降情況，表明C57BL/6小鼠對該劑量下的mAb076-IgG耐受性良好。
實施例12：mAb077-IgG在異種移植瘤腫瘤模型中的藥效
45只CB17-SCID小鼠，雌性，5-6週，18-20g，購自北京維通利華，分5組，每組9隻。體外培養Raji在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養液中。收集指數生長期的Raji細胞，無菌條件下，移植於CB17-SCID小鼠皮下，每隻小鼠接種2×106個細胞。腫瘤接種當天為第0天。在接種第3天開始第一次給藥，之後按如下方案進行：第1組：PBS溶媒，i.p.,N=9,Q2D,3,5,7,9,11,13,15天；第2組：IgG1 30mg/kg,i.p.,N=9,Q2D,3,5,7,9,11,13,15天；第3組：mAb077-IgG 3mg/kg,i.p.,N=9,Q2D,3,5,7,9,11,13,15天； 第4組：mAb077-IgG 10mg/kg,i.p.,N=9,Q2D,3,5,7,9,11,13,15天；第5組：mAb077-IgG 30mg/kg,i.p.,N=9,Q2D,3,5,7,9,11,13,15天；給藥後每天監測動物日常行為表現，共進行18天。用遊標卡尺測量腫瘤的長徑及短徑後，用長×寬2/2計算腫瘤體積。腫瘤抑制率採用公式TGI%=(1-T/C)×100%。T和C分別為給藥組和對照組在某一特定時間點的腫瘤體積(TV)。體重變化用公式RCBW %=(BWi-BW0)/BW0×100%，BWi是小鼠當前體重，BW0是分組當日的小鼠體重。所有實驗結果以平均瘤體積±標準誤差(SEM)表示。用T-Test檢驗方法比較治療組腫瘤體積和瘤重與對照組相比有無顯著性差異。所有的數據均用Graphpad進行分析，p<0.05為具有顯著性差異。
如第10圖所示，在Raji移植腫瘤模型中，mAb077-IgG表現出明顯的抗腫瘤作用及劑量依賴，低、中、高劑量組抑瘤率(TGI)分別為41%、49%和70%。各給藥組均沒有出現明顯的小鼠體重下降情況，表明小鼠對該劑量下的mAb077-IgG耐受性良好。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
<120> 抗CD27抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 360245CG
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Claims (43)

  1. 一種抗CD27抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：14所示的LCDR1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：15所示的LCDR2。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的LCDR3。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11所示的HCDR1。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：4 或SEQ ID NO：12所示的HCDR2。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：13所示的HCDR3。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且其中該抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  15. 如申請專利範圍第12項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10；重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
  16. 如申請專利範圍第12項所述的抗CD27抗體或其抗原 結合片段，其中該抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：2，重鏈可變區序列為SEQ ID NO：1。
  17. 如申請專利範圍第12項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：10，重鏈可變區序列為SEQ ID NO：9。
  18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
  19. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段。
  20. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
  21. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人抗體或其片段。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區序列為：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或其變體。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該變體在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化。
  24. 如申請專利範圍第21項所述的抗CD27抗體或其抗原 結合片段，其中該抗體重鏈可變區序列為：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9或其變體。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，其中該變體在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化。
  26. 一種編碼如申請專利範圍第1至25項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段的DNA序列。
  27. 一種含有如申請專利範圍第26項所述的DNA序列的表達載體。
  28. 一種用如申請專利範圍第27項所述的表達載體轉化的宿主細胞。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為大腸桿菌。
  31. 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為酵母菌。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為畢赤酵母。
  33. 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
  35. 一種醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
  36. 一種多特異性抗體，含有如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
  37. 一種單鏈抗體，含有如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
  38. 一種抗體-藥物偶聯物，其中該抗體含有如申請專利範圍第1至17任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。
  39. 一種申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD27抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第35項所述的醫藥組成物，或如申請專利範圍第36項所述的多特異性抗體，或如申請專利範圍第37項所述的單鏈抗體，或如申請專利範圍第38項所述的抗體-藥物偶聯物的用途，其係製備用於治療或預防CD27介導的疾病或病症的藥物。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的用途，其中該疾病為癌症和自身免疫疾病。
  41. 如申請專利範圍第40項所述的用途，其中該疾病為表達CD27的癌症和自身免疫疾病。
  42. 如申請專利範圍第41項所述的用途，其中該癌症為直 腸癌、腦癌、腎癌、肺癌、肝癌、多發性骨髓瘤和黑色素瘤。
  43. 如申請專利範圍第41項所述的用途，其中該自身免疫疾病為自身免疫性腦脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化和類風濕關節炎。
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