MX2011000668A - Antigenos quimericos polipeptidicos del virus sincitial respiratorio. - Google Patents
Antigenos quimericos polipeptidicos del virus sincitial respiratorio.Info
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Abstract
Se proveen antígenos del polipéptido quimérico del Virus Siricitial Respiratorio (RSV); los polipéptidos descritos incluyen una primera secuencia de aminoácidos que comprende un dominio F2 unido de manera no escindible a un dominio F1 de un polipéptido de proteína de Fusión (F) de Virus Sincitial Respiratorio (RSV); y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende una porción de un polipéptido de la proteína de Unión (G) de RSV que comprende un epítope inmunológicamente dominante; la descripción también provee los ácidos nucleicos que codifican, y las composiciones farmacéuticas que contienen, los polipéptidos quiméricos de RSV, así como los métodos para su producción y uso.
Description
ANTÍGENOS QUIMÉRICOS POLIPEPTÍDICOS DEL VIRUS SINCITIAL
RESPIRATORIO
REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación anterior de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/081 ,888, presentada el 18 de Julio de 2008, cuya descripción se incorpora en la presente para referencia.
NOTIFICACIÓN DE DERECHOS DE AUTOR CONFORME A 37 C.F.R. S
1.71 (E)
Una porción de la descripción de este documento de patente contiene material que está sujeto a la protección del derecho de autor. El propietario del derecho de autor no tiene objeción a la reproducción facsimilar por cualquier persona del documento de patente o la descripción de patente, como aparece en el archivo de los registros de patente de la Oficina de Patentes y Marcas Registradas, pero de lo contrario se reservas todos los derechos de autor correspondientes.
CAMPO TÉCNICO
Esta descripción se relaciona con el campo de la inmunología. Más particularmente, esta descripción se refiere a composiciones y a métodos para provocar una respuesta inmune específica para el Virus Sincitial Respiratorio (RSV-por sus siglas en inglés).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El Virus Sincitial Respiratorio Humano (RSV) es la causa mundial más común de las infecciones del tracto respiratorio inferior (LRI-por sus siglas en inglés) en infantes menores de 6 meses de edad y bebés prematuros de menos que o igual a 35 semanas de gestación. El espectro de la enfermedad de RSV incluye un gran conjunto de síntomas respiratorios desde rinitis y otitis hasta neumonía y bronquiolitis, estas últimas dos enfermedades estando asociadas con una considerable morbilidad y mortalidad. Los seres humanos son el único recipiente conocido para el RSV. La propagación del virus a partir de secreciones nasales contaminadas ocurre vía grandes gotículas respiratorias, de manera que para la transmisión se requiere el contacto cercano con un individuo infectado o superficie contaminada. El RSV puede persistir por muchas horas en juguetes u otros objetos, lo que explica la alta velocidad de infecciones nosocomiales de RSV, particularmente en salas pediátricas.
Los montos anuales globales de la infección y de la mortalidad para el RSV se estimado siendo de 64 millones y 160,000 respectivamente. Solo en los E.U.A. se estima que el RSV es responsable de 18,000 a 75,000 hospitalizaciones y de 90 a 1900 muertes anualmente. En climas templados, está bien documentado que el RSV es una causa de las epidemias anuales invernales de LRI agudo, incluyendo bronquiolitis y neumonía. En los E.U.A., casi todos los niños de dos años de edad han sido infectados con RSV. La tasa de incidencia de LRI asociado son RSV en niños en contrario sanos fue calculada como 37 por 1000 niños-año en los primeros dos años de vida (45 por 1000 niños-año en niños menores de 6 meses) y el riesgo de hospitalización como 6 por 1000 niños-año (11 por 1000 niños-año en los primeros seis meses de vida). La incidencia es mayor en niños con enfermedad cardiopulmonar y en esos nacidos prematuramente, los cuales constituyen casi la mitad de admisiones en hospitales relacionadas con RSV en los E.U.A. Los niños que experimentan un LRI más grave causado por RSV tienen posteriormente una incidencia creciente de asma infantil. Los costes para cuidar de los niños con LRI grave y sus secuelas son sustanciales, y el RSV es también cada vez más reconocido como una causa importante de la morbilidad a partir de una enfermedad similar a la influenza en personas mayores, destacando la necesidad para una vacuna segura y eficaz capaz de proteger contra la enfermedad inducida por el RSV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta descripción se refiere a antígenos quiméricos del virus sincitial respiratorio (RSV). Los antigenos quiméricos de RSV incluyen, en una dirección de la N-terminal a la C-terminal: una primera secuencia de aminoácidos que comprende un dominio F2 no escindible unido a un dominio F1 de un polipéptido de la proteina de fusión (F) del Virus Sincitial Respiratorio (RSV); y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende una porción de un polipéptido de la proteína de unión (G) de un RSV que comprende un epítope inmunológicamente dominante. Los antígenos descritos provocan una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto, y pueden usarse para tratar y/o prevenir los síntomas de la infección por el RSV. También se describen ácidos nucleicos que codifican a los antígenos quiméricos, las composiciones inmunogénicas que contienen los antígenos quiméricos, y los métodos para producir y usar los antígenos quiméricos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es una representación esquemática de la modificación realizada con respecto al FG prototípico (FG Rix) para producir el FG V1-1 y el FG V2-1. Los números 1 y 2 indican la posición de un enlazador introducido y del fragmento de la proteína de G, respectivamente.
La FIG. 2 es una alineación de la secuencia que provee una comparación del FG-Rix y de dos quimeras de FG mejoradas novedosas de ejemplo designadas FG V1.-1 y FG V2-1.
Las FIGS. 3A y 3B son gráficos de barras que ilustran la inhibición de la neutralización de suero humano por el FG V1-14 y el FG V2-1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Introducción
El desarrollo de las vacunas que protegen contra los síntomas y secuelas causadas por la infección de RSV ha sido complicado por el hecho que las respuestas inmunes del huésped parecen jugar un papel en la patogénesis de la enfermedad. Estudios recientes en los años 1960 demostraron que los niños vacunados con una vacuna de RSV inactivada con formalina sufrieron una enfermedad más grave con la subsiguiente exposición al virus con respecto a sujetos de control sin vacunar. Estas primeras pruebas resultaron en la hospitalización del 80% de los vacunados, y en dos muertes. La potenciación de la gravedad de la enfermedad se ha reproducido en modelos animales y se piensa que resulta de niveles inadecuados de anticuerpos neutralizantes de suero, que carecen de inmunidad local, y de la inducción excesiva de una respuesta inmune similar a células T ayudantes del tipo 2 (Th2) con eosinofilia pulmonar, y de la producción creciente de citocinas IL-4 e IL-5. En cambio, una vacuna exitosa que protege contra la infección de
RSV induce una respuesta inmune del tipo Th1 , caracterizada por la producción de IL-2 y de interferón-? (IFN- ?).
Han sido intentados diferentes acercamientos, incluyendo el virus muerto o inactivado, el virus vivo atenuado y acercamientos de subunidad purificada, en esfuerzos para producir una vacuna segura y efectiva de RSV que produzca respuestas inmunes duraderas y protectoras en poblaciones sanas y en riesgo. No obstante, ninguno de los candidatos evaluados hasta la fecha han resultado en la comercialización de una vacuna con el fin de prevenir la infección de RSV y/o de reducir o de prevenir la enfermedad de RSV. Un acercamiento ha implicado la producción de antígenos quiméricos recombinantes que incluyen componentes tanto de las glicoproteinas de Fusión (F) como de unión (G) al RSV. Los antígenos quiméricos de ejemplo del RSV se divulgan en la Patente de E.U.A. No. 5,194,595. Estas construcciones quiméricas incluyeron los dominios extracelulares completos de las proteínas F y G de RSV (es decir, los residuos de aminoácidos 1-526 de F de RSV, y 69-298 de G de RSV). Aunque este antígeno quimérico provocó una respuesta inmune en los modelos animales (por ejemplo, ratones, ratas del algodón), no fue capaz de proceder a comercialización debido a las dificultades en la producción y de estabilidad.
La presente descripción se refiere a polipéptidos FG quiméricos novedosos con inmunogenicidad excelente y características de procesamiento superiores. Estos antígenos quiméricos de RSV novedosos superan muchos inconvenientes significativos encontrados en intentos previos de producir
antígenos quiméricos de RSV seguros y efectivos que son adecuados para la administración como vacunas profilácticas y terapéuticas.
En un aspecto, la descripción se refiere a un antígeno del virus sincitial respiratorio (RSV) que incluye un polipéptido quimérico que comprende en una dirección desde la N-terminal hasta la C-terminal (i) una primera secuencia de aminoácidos que incluye un dominio F2 unido de manera no escindible a un dominio F1 de un polipéptido de proteína de F; y (ii) una segunda secuencia de aminoácidos que incluye una porción de un polipéptido de proteína de G que contiene un epítope inmunológicamente dominante. Típicamente, el dominio F2 y el dominio F1 del polipéptido de la proteína F de RSV están unidos de manera o escindible vía un enlazador de aminoácido. Los dominios F2 y F1 pueden unirse en una manera no escindible eliminando la secuencia de reconocimiento de la escisión de la furina y/o eliminando los sitios que hacen a los dominios F2 y F1 separables y que resulta en la liberación del péptido pep27 durante la maduración y montaje de una proteína F nativa. Por ejemplo, el polipéptido quimérico de RSV puede incluir por lo menos una deleción o sustitución de un aminoácido que elimina un sitio de escisión de la furina, volviendo así no escindible al polipéptido quimérico. Por ejemplo, uno o más aminoácidos (por ejemplo, en las posiciones 106 y 133) pueden ser suprimidos o sustituido para producir una proteína F no escindible. En ciertas modalidades ilustrativas, dos aminoácidos (que incluyen por lo menos una arginina, por ejemplo, arginina y
alanina en las posiciones 106 y 107, y arginina y lisina en las posiciones 133 y 134) pueden ser suprimidos o sustituidos.
Opcionalmente, para facilitar la expresión y la recuperación, el polipéptido quimérico de RSV incluye un péptido de señal en el N-terminal. Un péptido de señal puede seleccionarse de entre numerosos péptidos de señal conocidos en la técnica, y se elige típicamente para facilitar (mejorar o maximizar) la producción y el procesamiento en un sistema seleccionado para la expresión recombinante del polipéptido quimérico. Los péptidos de señal generalmente están en el intervalo de 18-25 aminoácidos en longitud. En ciertas modalidades, el péptido de señal es de una proteína F de RSV, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1-23 de la SEQ ID NO: 2. El dominio F2 puede incluir los residuos de aminoácidos 24-105 de un polipéptido de la proteína F nativa. Será evidente que pueden variar los límites precisos del aminoácido entre el péptido de señal y el dominio F2 por uno o más aminoácidos (de hecho, en el caso de un péptido de señal seleccionado de una proteína F de RSV, tal límite es arbitrario). En modalidades de ejemplo, el dominio F1 incluye esencialmente toda la porción extracelular del dominio F1 , por ejemplo, del residuo 137 al residuo 528 de un polipéptido de la proteína F nativa. Como se indicó anteriormente, los dominios F2 y F1 pueden estar unidos de manera no escindible por una secuencia de enlazador de aminoácido. Numerosos enlazadores de aminoácido son conocidos por los expertos en la técnica y adecuados en el contexto de los polipéptidos quiméricos FG descritos en la presente. En modalidades de ejemplo, el
enlazador se selecciona de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
La secuencia polipeptídica de F se une en marco a una porción del polipéptido de la proteína G de RSV. Una porción de la proteína G se selecciona para mejorar características de producción (por ejemplo, en comparación a un polipéptido de la proteína G de longitud completa). La porción de la proteína G se selecciona para retener epítopes inmunológicamente dominantes, en particular, un epítope inmunológicamente dominante entre los residuos de aminoácidos 183 y 203. Por ejemplo, la porción de la proteína G de RSV incluye los aminoácidos 152-229. En ciertas modalidades de ejemplo, la porción de la proteína G de RSV incluye los residuos de aminoácidos 149-229 de la proteína G.
Las secuencias de los componentes de F y de G pueden seleccionarse de secuencias proteicas naturales de F y de G, y pueden seleccionarse para corresponder en secuencia a una sola cepa o a más de una cepa. Por ejemplo, las porciones de F y de G pueden ser formadas de la misma cepa, o cada una de las porciones de F y de G puede ser formada de una cepa diferente, o la porción de F o la porción de G o ambas pueden ser un híbrido correspondiente a los aminoácidos de más de una cepa. Opcionalmente, el polipéptido quimérico de RSV puede incluir una o más de una sustitución de aminoácidos con relación a un polipéptido natural de RSV. Por ejemplo, puede introducirse una sustitución de aminoácidos dentro de la porción de la proteína G, tal como una sustitución de aminoácidos que se
correlaciona con la reducción o la prevención de la enfermedad vírica potenciada por la vacuna en un sistema modelo, por ejemplo, el polipéptido quimérico puede incluir una sustitución de asparagina por alanina en el residuo 191 (N191A) de la proteína G.
Opcionalmente, los polipéptidos quiméricos de RSV como se describen en la presente pueden incluir una etiqueta del polihistidina, u otra de tales secuencias diseñadas para facilitar o mejorar la recuperación y/o la purificación de una proteína recombinantemente expresada.
En ciertas modalidades de ejemplo, el polipéptido quimérico de RSV tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 1 o 13, o una subsecuencia de las mismas, (por ejemplo, una subsecuencia que carece de la secuencia de señal de los aminoácidos 1-23, o teniendo una sustitución de una secuencia de señal diferente y/o que carece de la etiqueta de histidina en el C-terminal). De manera favorable, el polipéptido quimérico de RSV incluye por lo menos un epítope immunodominante tanto de la proteina F de RSV como de la proteína G de RSV.
Con la expresión (por ejemplo, y la purificación o el aislamiento), el polipéptido quimérico de RSV se monta en un multímero que posee una conformación que se asemeja inmunológicamente a la proteína de F nativa. Por ejemplo, el polipéptido quimérico de RSV se monta favorable en un trímero.
En esta descripción también se contemplan las composiciones inmunogénicas que incluyen cualquiera de los polipéptidos quiméricos de RSV
descritos anteriormente, formuladas con un portador o excipiente. Típicamente, el portador o excipiente es un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón. Opcionalmente, portador o excipiente puede incluir componentes adicionales que mejoran la estabilidad, solubilidad o tanto la estabilidad como la solubilidad del polipéptido quimérico de RSV. Opcionalmente, la composición inmunogénica comprende además un adyuvante adecuado para la administración en la población de sujetos a los cuales se pretende administrar la composición por ejemplo, para prevenir, reducir o potenciar la enfermedad o síntomas inducidos por el RSV. En consecuencia, el adyuvante puede seleccionarse para la administración a un recién nacido, a un infante o a un adulto, tal como un adulto de por lo menos 65 años de edad. De manera favorable, el adyuvante es un adyuvante derivador de Th1. En ciertas modalidades, el adyuvante es un ligando de TLR-4, tal como 3D-MPL, o cualquier otro derivado sintético del lípido A. Opcionalmente, la composición inmunogénica también puede incluir un portador particulado, tal como alumbre. En ciertas modalidades, el adyuvante puede incluir un liposoma o una emulsión, por ejemplo, una emulsión de aceite en agua.
La composición inmunogénica es favorablemente formulada para uso como un medicamento en seres humanos, por ejemplo, para la prevención o la reducción de la infección con RSV después de la administración a un sujeto humano, o para la prevención o la reducción de una respuesta patológica causada por la infección con RSV después de la
administración a un sujeto humano. Opcionalmente, la composición inmunogénica también incluye por lo menos un antígeno adicional de un organismo patógeno diferente de RSV. Por ejemplo, el organismo patógeno puede ser un virus diferente de RSV, tal como el virus de la Parainfluenza (PIV), el virus de la influenza, el virus de la hepatitis B, y/o el poliovirus. Alternativamente, el organismo patógeno puede ser una bacteria, tal como de difteria, tétanos, tosferina, Hemophilus influenza, y/o neumococo.
Otro aspecto de esta descripción se refiere a los ácidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos quiméricos provistos en la presente. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos incluyen una secuencia polinucleotídica que ha sido optimizada por un codón para la expresión en una célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, optimizada por codón para la expresión en una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula vegetal, etc.). En algunos casos, los ácidos nucleicos están contenido dentro de vectores, tales como un vector de expresión procariótico o eucariótico. Las células dentro de las cuales se introducen dichos ácidos nucleicos o vectores (es decir, las células hospedadoras) también son un aspecto de esta descripción. Las células hospedadoras pueden ser células bacterianas, pero más comúnmente serán células eucarióticas, tales como células de levadura (por ejemplo, picchia), células vegetales, células de insectos, o células de mamífero (por ejemplo, células de CHO).
Los polipéptidos quiméricos y los ácidos nucleicos son útiles en la preparación de medicamentos para tratar (por ejemplo, profilácticamente) una infección de RSV. En consecuencia, esta descripción también provee métodos para provocar una respuesta inmune contra RSV al administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene cualquiera de los polipéptidos quiméricos de RSV descritos en la presente. De manera favorable, cuando se administra a un sujeto humano (por ejemplo como un recién nacido, un infante o un niño o a un sujeto de edad avanzada) la composición provoca una respuesta inmune específica para RSV sin potenciar la enfermedad viral después del contacto con el RSV. De manera favorable, la composición provoca una respuesta inmune protectora que reduce o previene la infección con un RSV y/o reduce o previene una respuesta patológica después de la infección con un RSV. Típicamente, la respuesta inmune provoca una respuesta inmune caracterizada por la producción de citocinas del tipo de Th1 , por ejemplo, una respuesta inmune del tipo Th1.
Términos
A menos que estén explicados de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo comprendido comúnmente por uno de conocimientos ordinarios en la técnica a la cual pertenece esta descripción. Las definiciones de los términos comunes en la biología molecular pueden encontrarse en
Benjamín Lewin, Genes V, publicado por la Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995
(ISBN 1-56081-569- 8).
Los términos singulares "un," "uno," y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Deberá comprenderse además que todos los tamaños de las bases o los tamaños de los aminoácidos, y todos los pesos moleculares o valores de masas moleculares, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y son provistos para la descripción. Además, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o los niveles de una sustancia, tales como un antígeno, pretenden ser aproximados. Así, donde está indicada una concentración siendo por lo menos (por ejemplo) 200 pg, se pretende que la concentración sea comprendida como siendo por lo menos aproximadamente (o "cerca de" o "~") 200 pg.
Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a esos descritos en la presente en la práctica o prueba de esta descripción, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. El término "comprende" significa "incluye." Así, a menos que el contexto lo
requiera de otra manera, la palabra "comprende," y las variaciones por ejemplo "comprenden" y "que comprende" será comprendidas como implicando la inclusión de un compuesto o una composición establecidos (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o una etapa, o un grupo de compuestos o etapas, pero no a la exclusión de cualesquiera otros compuestos, composición, etapas, o grupos de los mismos. La abreviatura, "e.g." se deriva del Latín exempli gratia, y es utilizada en la presente para indicar un ejemplo no limitativo. Así, la abreviatura "e.g." es sinónima con el término "por ejemplo."
Para facilitar la revisión de las diferentes modalidades de esta descripción, se proveen las siguientes explicaciones de los términos. Términos y explicaciones adicionales se proveen en el contexto de esta descripción.
El virus sincitial respiratorio (RSV) es un virus patógeno de la familia Paramyxoviridae, subfamilia Pneumovirinae, género Pneumovirus. El genoma de RSV es una molécula de ARN de sentido negativo, de una sola hebra, de 15,222 nucleótidos de largo, que codifica 11 proteínas. La asociación hermética del genoma de RNA con la proteína N viral forma un nucleocápsido envuelto al interior de la envolvente viral. Dos grupos de cepas humanas de RSV han sido descritos, los grupos A y B, basados en diferencias en la antigenicidad de la glicoproteína G. Numerosas cepas de RSV se han aislado a la fecha. Cepas de ejemplo son indicadas por el número de acceso de GenBank y/o EMBL en las FIGS. 4 y 5. Cepas adicionales del RSV son
probables de ser aisladas, y están comprendidas dentro del género de RSV. De manera similar, el género de RSV abarca las variantes que surgen de manera natural (por ejemplo, las cepas previamente o posteriormente identificadas) por la desviación genética, o por síntesis y/o recombinación artificial.
El término "proteína F" o "proteína de fusión" o "polipéptido de proteína F" o "polipéptido de proteína de fusión" se refiere a un polipéptido o a una proteína que tiene toda o una parte de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la proteína de fusión de RSV. El término "proteína G" o "polipéptido de proteína G" se refiere a un polipéptido o a una proteína que tiene toda o una parte de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la proteina de Unión al RSV. Numerosas proteínas de Fusión y de Unión de RSV han sido descritas y son conocidas por los expertos en la técnica.
Para facilitar la comprensión de esta descripción, cuando se hade referencia a las posiciones de los residuos de aminoácidos de las proteínas F y/o G de RSV, todas las posiciones de los residuos de aminoácidos se dan con referencia a (es decir, la posición de los residuos de aminoácidos corresponde a) la posición del aminoácido de la proteína F de ejemplo de la SEQ ID NO: 2, y a las posiciones de los aminoácidos de la proteina G de ejemplo de la SEQ ID NO: 4. No obstante, pueden usarse aminoácidos comparables de cualquier cepa A o B de RSV. Las posiciones comparables de los aminoácidos de cualquier otra cepa de A o B de RSV pueden ser determinadas fácilmente por los que tienen conocimientos
ordinarios en la técnica, alineando las secuencias de aminoácidos de la cepa de RSV seleccionada con esa de la SEQ ID NO: 2 usando los algoritmos de alineación fácilmente disponibles y bien conocidos (tales como BLAST (por sus siglas en inglés), por ejemplo, usando los parámetros implícitos). Secuencias de proteínas F y G de ejemplo de numerosas cepas se proveen en la WO20081 14149, cualquiera de las cuales puede emplearse en el contexto de las proteínas FG quiméricas descritas en la presente. La WO20081 14149 se incorpora en la presente para referencia con el fin de divulgar las secuencias de las proteínas F y G de RSV adecuadas para el uso en las proteínas G quiméricas.
Un "polipéptido FG quimérico" o un "antígeno FG" o "antígeno del polipéptido FG" es un polipéptido quimérico que incorpora los componentes del polipéptido, típicamente incluyendo determinantes antigénicos o epítopes de ambas de una proteína F de RSV y de una proteína G de RSV. En el contexto de esta descripción, los polipéptidos FG quiméricos incluyen en una orientación de la N-terminal a la C-terminal: una primera secuencia de aminoácidos que incluye un dominio F2 no escindible unido a un dominio F1 y una segunda secuencia de aminoácidos que incluye una porción de la proteína G de RSV que contiene un epítope inmunológicamente dominante. El término subunidad y dominio son utilizado de manera intercambiable con referencia a los dominios estructurales de la proteína F y/o del polipéptido F0. El término quimérico en este contexto incluye los polipéptidos en los cuales los componentes de las proteínas F y G son ambos del mismo del mismo
serotipo o cepa, así como los polipéptidos en los cuales los componentes individuales de las proteínas F y G son de diferentes serotipos o cepas.
Una "variante" al referirse a un ácido nucleico o a una proteína (por ejemplo, una proteína o dominio de proteína F o G de RSV, o un polipéptido FG quimérico) es un ácido nucleico o un polipéptido que difiere de un ácido nucleico o de una proteína de referencia. Generalmente, la diferencia(s) entre la variante y el ácido nucleico o la proteína de referencia constituye proporcionalmente un pequeño número de diferencias en comparación con la referencia. Dichas diferencias pueden ser adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. Así, una variante difiere típicamente por no más de aproximadamente 1 %, o 2%, o 5%, o 10%, o 15%, o 20% del nucleótido o de los residuos de aminoácidos. Así, una variante en el contexto de una proteína F o G de RSV, o un polipéptido FG quimérico, típicamente comparte por lo menos 80%, u 85%, más comúnmente, por lo ; menos aproximadamente 90% o más, tal como 95%, o aún 98% o 99% de identidad de la secuencia con una proteína de referencia, por ejemplo, las secuencias de referencia ilustradas en las SEQ ID NO: 2 y 4, o cualquiera de los polipéptidos FG de ejemplo descritos en la presente. Variantes adicionales incluidas como un aspecto de esta descripción son los polipéptidos FG quiméricos que incorporan un F2 (por ejemplo, que comprende todo o una parte de los aminoácidos 24-105, designados numéricamente por la alineación con la SEQ ID NO: 2) y/o el componente F1 (por ejemplo, que comprende todo o una parte de los aminoácidos 137-528, designados numéricamente por
la alineación con la SEQ ID NO: 2) de cualquiera de las secuencias de ejemplo, por ejemplo, provistas en la WO20081 14149 (ya sea la misma o diferente cepa) y un componente de proteína G (por ejemplo, todo o una parte de los aminoácidos 149-229, designados numéricamente por la alineación a la SEQ ID NO: 4) seleccionados de cualquiera de las secuencias de ejemplo, por ejemplo, provistas en la WO20081 14149. Las variantes pueden surgir a través de desviación genética, o pueden ser producidas artificialmente usando mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria, o por la recombinación de dos o más variantes preexistentes. Por ejemplo, un polipéptido FG variante puede incluir 1 , o 2, o 5 o 10, o 15, o 50 diferencias de aminoácidos en comparación con las quimeras FG de ejemplo de las SEQ ID NO: 11 y 13, o hasta aproximadamente 100 diferencias de nucleótidos en comparación con los ácidos nucleicos FG quiméricos de ejemplo, por ejemplo, de las SEQ ID NO: 10 y 12.
Un "dominio" de un polipéptido o de una proteína es un elemento estructuralmente definido dentro del polipéptido o la proteína. En el contexto de esta descripción, "un dominio de escisión de furina" es un dominio definido por la escisión de un polipéptido precursor por una furina proteasa. Por ejemplo, la proteína F se sintetiza como un solo polipéptido, designado F0. El polipéptido F0 es subsiguientemente escindido en dos motivos de consenso de reconocimiento de la furina por una furina proteasa para producir dos unidades de polipéptido estructuralmente independientes designadas F2 y F1. La F2 se extiende desde el aminoácido 24 (que sigue al péptido de señal) al
primer (en una dirección de la N- a la C-terminal) sitio de reconocimiento de la escisión de la furina. La F1 se extiende desde el segundo sitio de escisión de la furina hasta el extremo C-terminal del polipéptido F0. En el contexto de esta descripción, el término F1 también se usa para referirse a una porción del polipéptido F0 que incluye la porción extracelular del dominio F1 (por ejemplo, los aminoácidos 137-528).
Los términos "nativos" y "naturales" se refieren a un elemento, tal como una proteína, un polipéptido o un ácido nucleico, que están presentes en el mismo estado que en la naturaleza. Es decir, el elemento no ha sido modificado artificialmente. Se comprenderá, que en el contexto de esta descripción, existen numerosas variantes nativas/naturales de las proteínas o los polipéptidos de RSV, por ejemplo, obtenidos de diferentes cepas o aislados naturales de RSV.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácidos que están unidos conjuntamente a través de enlaces amídicos. Los términos "polipéptido" o "proteína" como se usan en la presente pretenden abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluyen secuencias modificadas tales como glicoproteínas. El término "polipéptido" está específicamente destinado a cubrir las proteínas naturales, así como esas que son producidas recombinante o sintéticamente. El término "fragmento," en referencia a un polipéptido, se refiere a una porción (es decir, una subsecuencia) de un polipéptido. El término "fragmento inmunogénico" se refiere a todos los fragmentos de un polipéptido que retienen por lo menos un
epítope inmunogénico predominante de la proteína o del polipéptido de referencia de longitud completa. La orientación dentro de un polipéptido es generalmente escrita en una dirección de la N-terminal al C-terminal, definida por la orientación de las porciones amino y carboxi de aminoácidos individuales. Los polipéptidos son traducidos del extremo N o amino hacia el extremo C o carboxi.
Un "péptido de señal" es una secuencia corta de aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 18-25 aminoácidos en longitud) que dirige a las proteínas secretoras o de membrana recién sintetizadas hacia y a través de las membranas, por ejemplo, del retículo endoplásmico. Los péptidos de señal con frecuencia pero no universalmente situados en el N-terminal de un polipéptido, y son escindidos con frecuencia por peptidasas de señal después de que la proteína ha cruzado la membrana. Las secuencias de señal contienen típicamente tres características estructurales comunes: una región básica polar del N-terminal (región n), un núcleo hidrofóbico, y una región c hidrofílica).
Los términos "polinucleótido" y "secuencia de ácido nucleico" se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases en longitud. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye las formas simples y dobles del ADN. Por "polinucleótido aislado" se entiende un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificantes con las cuales es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5'
y una en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del cual se deriva. En una modalidad, un polinucleótido codifica un polipéptido. La dirección 5' y 3' de un ácido nucleico es definida con referencia a la conectividad de las unidades individuales de nucleótidos, y designadas de acuerdo con las posiciones del carbono del anillo de azúcar desoxiribosa (o ribosa). El contenido informativo (codificante) de una secuencia polinucleotidica es leído en una dirección de 5' a 3'.
Un ácido nucleico "recombinante" es uno que tiene una secuencia que no es natural o tiene una secuencia que está formada por una combinación artificial de dos segmentos en contrario separados, de la secuencia. Esta combinación artificial puede efectuarse por la síntesis química o, más comúnmente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética. Una proteína "recombinante" es una que es codificada por un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, recombinante), que ha sido introducido en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana o eucariótica. El ácido nucleico puede ser introducido, en un vector de expresión que tiene señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico puede ser integrado dentro del cromosoma de la célula hospedadora.
El término "purificación" (por ejemplo, con respecto a un patógeno o a una composición que contiene un patógeno) se refiere al procedimiento de remover componentes de una composición, cuya presencia no es deseada. La purificación es un término relativo, y no requiere que todas
las trazas del componente indeseable sean removidas de la composición. En el contexto de la producción de vacunas, la purificación incluye los procedimientos tales como centrifugación, diálisis, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de exclusión de tamaño, purificación de afinidad o precipitación. Así, el término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, pretende ser un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación purificada de ácido nucleico es una en la cual la proteína especificada está más enriquecida que el ácido nucleico en su entorno generativo, por ejemplo dentro de una célula o en cámaras de reacción bioquímicas. Una preparación de ácido nucleico o de proteína sustancialmente pura puede purificarse de manera que el ácido nucleico deseado represente por lo menos 50% del contenido de ácido nucleico total de la preparación. En ciertas modalidades, un ácido nucleico substancialmente puro representará por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% o más del ácido nucleico o del contenido en proteínas total de la preparación.
Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, una proteína o un organelo) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el cual el componente existe naturalmente, tal como, otro ADN o ARN, proteínas y organelos cromosómicos y extra-cromosómicos. Los ácidos nucleicos y las proteínas que han sido "aislados" incluyen los ácidos nucleicos y las proteínas purificados por métodos de purificación estándar. El término también abarca
los ácidos nucleicos y las proteínas preparados por la expresión recombinante en una célula hospedadora así como los ácidos nucleicos y las proteínas químicamente sintetizados.
Un "antigeno" es un compuesto, una composición, o una sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos y/o una respuesta de células T en un animal, incluyendo las composiciones que son inyectadas, absorbidas o introducidas de otra forma dentro de un animal. El término "antígeno" incluye todos los epítopes antigénicos relacionados. El término "epítope" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio o a un antígeno al cual responden las células B y/o T. Los epítopes "¡nmunológicamente dominantes" son esos epítopes a los cuales se hace una respuesta inmune funcionalmente significativa por el huésped, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos o una respuesta de células T. Así, con respecto a una respuesta inmune protectora contra un patógeno, los epítopes ¡nmunológicamente dominantes son esas porciones antigénicas que cuando son reconocidas por el sistema inmune del huésped resulta en una protección contra la enfermedad causada por el patógeno. El término "epítope de célula T" se refiere a un epítope que cuando es unido a una molécula apropiada de MHC es específicamente unido por una célula T (vía un receptor de células T). Un "epítope de células B" es un epítope que es específicamente unido por un anticuerpo (o molécula del receptor de células B).
Un "adyuvante" es un agente que mejora la producción de una respuesta inmune en una manera no específica. Los adyuvantes comunes
incluyen suspensiones de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre los cuales se adsorbe el antígeno; emulsiones, incluyendo agua en aceite, y aceite en agua (y variantes de las mismas, incluyendo emulsiones dobles y emulsiones reversibles), liposacáridos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos immunoestimulantes (tales como los oligonucleótidos CpG), liposomas, agonistas del receptor Toll (particularmente, los agonistas TLR2, TLR4, TLR7/8 y TLR9), y diferentes combinaciones de tales componentes.
Una "composición inmunogénica" es una composición de materia adecuada para la administración a un sujeto humano o animal que es capaz de provocar una respuesta inmune específica, por ejemplo, contra un patógeno, tal como RSV. Como tal, una composición inmunogénica incluye uno o más antígenos (por ejemplo, antígenos de polipéptido) o epítopes antigénicos. Una composición inmunogénica también puede incluir uno o más componentes adicionales capaces de provocar o de mejorar una respuesta inmune, tal como un excipiente, un portador, y/o un adyuvante. En ciertos casos, las composiciones inmunogénicas son administradas para provocar una respuesta inmune que protege el sujeto contra los síntomas o las condiciones inducidas por un patógeno. En algunos casos, los síntomas o la enfermedad causada por un patógeno se previene (o se reduce o mejora) al inhibir la replicación del patógeno (por ejemplo, RSV) que sigue a la exposición del sujeto al patógeno. En el contexto de esta descripción, el término composición inmunogénica será comprendido abarcando las composiciones que son ideadas para la administración a un sujeto o a una
población de sujetos con el fin de provocar una respuesta inmune protectora o paliativa contra el RSV (es decir, composiciones de vacuna o vacunas).
Una "respuesta inmune" es una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como una célula B, célula T, o monocito, a un estimulo. Una respuesta inmune puede ser una respuesta de célula B, que resulta en la producción de anticuerpos específicos, tales como anticuerpos neutralizantes específicos del antigeno. Una respuesta inmune también puede ser una respuesta de célula T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. En algunos casos, la respuesta es especifica para un antígeno particular (es decir, una "respuesta específica al antígeno"). Si el antígeno se deriva de un patógeno, la respuesta específica al antígeno es una "respuesta específica al patógeno." Una "respuesta inmune protectora" es una respuesta inmune que inhibe una función o una actividad perjudicial de un patógeno, reduce la infección por un patógeno, o disminuye los síntomas (incluyendo la muerte) que resulta de la infección por el patógeno. Una respuesta inmune protectora puede ser medida, por ejemplo, mediante la inhibición de la replicación vírica o la formación de placas en un ensayo de reducción de placa o ensayo de neutralización de ELISA, o al medir la resistencia al desafío del patógeno in vivo.
Una respuesta inmune del tipo "Th1 " está caracterizada por las células ayudantes T de CD4+ que producen IL-2 e IFN-?. En cambio, una respuesta inmune del tipo "Th2" está caracterizada por las células ayudantes de CD4+ que producen IL-4, IL-5, e IL-13.
Una "cantidad inmunológicamente efectiva" es una cantidad de una composición (típicamente, una composición inmunogénica) utilizada para provocar una respuesta inmune en un sujeto. Comúnmente, el resultado deseado es la producción de la respuesta inmune específica a un antígeno (por ejemplo, patógeno) que es capaz de, o que contribuye a proteger al sujeto contra el patógeno. No obstante, para obtener una respuesta inmune protectora contra un patógeno se pueden requerir administraciones múltiples de la composición inmunogénica. Así, en el contexto de esta descripción, el término cantidad inmunológicamente efectiva abarca una dosis fraccionada que contribuye conjuntamente con administraciones previas o subsiguientes a lograr una respuesta inmune protectora.
El adjetivo "farmacéuticamente aceptable" indica que el sujeto es adecuado para la administración a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano o animal). Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), describe composiciones y formulaciones (que incluyen diluyentes) adecuadas para el suministro farmacéutico de composiciones terapéuticas y/o profilácticas, incluyendo composiciones inmunogénicas.
El término "modular" en referencia a una respuesta, tal como una respuesta inmune, significa alterar o variar la activación, la magnitud, la duración o las características de la respuesta. Un agente que modula una respuesta inmune altera por lo menos una de la activación, de la magnitud, de la duración o de las características de una respuesta inmune después de su
administración, o que altera por lo menos uno de la activación, de la magnitud, de la duración o de la característica en comparación a un agente de referencia.
El término "reduce" es un término relativo, tal que un agente reduce una respuesta o una condición si la respuesta o la condición es cuantitativamente disminuida después de la administración del agente, o si disminuye después de la administración del agente, en comparación a un agente de referencia. De manera similar, el término "previene" no significa necesariamente que un agente elimina totalmente la respuesta o la condición, siempre y cuando se elimine por lo menos una característica de la respuesta o de la condición. Así, una composición inmunogénica que reduce o previene una infección o una respuesta, tal como una respuesta patológica, por ejemplo, una enfermedad vírica potenciada por la vacuna, pero que no necesariamente elimina totalmente tal infección o respuesta, siempre y cuando la infección o la respuesta sea disminuida de manera medible, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 50%, tal como por lo menos aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, o aún por aproximadamente 90% (es decir por 10% o menor que) la infección o la respuesta en la ausencia del agente, o en comparación a un agente de referencia.
Un "sujeto" es un organismo vertebrado multicelular vivo. En el contexto de esta descripción, el sujeto puede ser un sujeto experimental, tal
como un animal no humano, por ejemplo, un ratón, una rata del algodón, o un primate no humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un sujeto humano.
Antígenos Quiméricos FG de RSV
La envolvente viral del RSV incluye glicoproteínas F, G y SH viralmente codificadas. Las glicoproteínas F y G son los únicos dos componentes del virión de RSV que son conocidos para inducir anticuerpos neutralizantes específicos de RSV. Los polipéptidos FG quiméricos descritos en la presente se diseñan para incorporar características estructurales de la proteína F nativa mientras que simultáneamente exhiben epítopes immunodominantes importantes de la proteína G de RSV.
La proteína F nativa de RSV se traduce como un precursor de polipéptido simple, designado F0. El F0 se pliega y se somete a proteolisis y a otras modificaciones post-traduccionales. Primero, un péptido de señal (Sp) dirige la traducción del polipéptido naciente al retículo endoplásmico (ER) y es escindido posteriormente por una peptidasa de señal. El polipéptido naciente luego es glicosilado en N en el RE en 3 sitios, en las posiciones de aminoácidos 27, 70 y 500 de la secuencia del polipéptido F de ejemplo de la SEQ ID NO: 2. La F2 y F1 son generadas por la escisión de furina y plegadas conjuntamente como un trímero del heterodímero (3 veces F2-F1). La furina es una endoproteasa de serina dependiente de calcio que puede escindir eficientemente las proteínas precursoras en los sitios de procesamiento de aminoácidos básicos apareados. Típicamente, tales sitios de procesamiento
incluyen una secuencia diana de aminoácidos básicos (canónicamente, Arg-X-(Arg/lys) - Arg'). La proteína F de RSV incluye dos sitios de reconocimiento de la furina en las posiciones 106-109 y 133-136. La escisión proteolítica del polipéptido FO maduro natural por una furina proteasa en las dos secuencias de consenso de furina conservadas, RAR/KR109 (FCS-2) y KKRKRR136 (FCS-1 ), resulta en la generación de tres fragmentos proteolíticos. La subunidad F1 grande anclada a membrana con un péptido de fusión hidrofóbico en su extremo N (correspondiente a los aminoácidos 137-574) está enlazado a la subunidad pequeña F2 (correspondiente a los aminoácidos 24-105) vía un puente bisulfuro, y se libera un pequeño péptido compuesto de 27 aminoácidos (pep27) situados originalmente entre los dos sitios de escisión. Será reconocido por los expertos en la técnica que las abreviaturas F0, F1 y F2 se designan comúnmente F0, Fi y F2 en la literatura científica. Una descripción del procesamiento de la furina de la proteína F de RSV, junto con las definiciones de la terminología aceptada en la técnica se encuentra en 'Zimmer et al. , "Proteolytic activation of Respiratory Syncytial Virus fusión protein." J. Biol Chem. 276:31642-31650, 2001 , y Zimmer et al. , "Cleavage at the furin consensus sequence RAK/KR109 and presence of the intervening peptide of the Respiratory Syncytial Virus fusión protein are dispensable fpor virus replication in cell culture." J. Virol. 76:9218 - 9224, 2002. La proteína es anclada a la membrana usando su hélice de transmembrana mostrada por la tableta blanca (TM) en la región del C-termínal. Además, la proteína F de RSV
incorpora 15 residuos de Cisteínas, 4 epitopes neutralizantes caracterizados, 2 regiones de hélice enrolladas y un motivo de lipidación.
La proteina G nativa es una proteína de 298 aminoácidos que está anclada a la membrana del virión mediante su región hidrofóbica de la transmembrana (aminoácidos 41-63). Los aminoácidos 65-298 incluyen la porción de la proteína G que está expuesta a la superficie del RSV. En cada extremidad están presentes regiones altamente o-glicosiladas similares a mucina. En estas dos regiones también están presentes cinco motivos de N-glicosilación. La central no-glicosilada incluye numerosos motivos estructurales importantes, incluyendo: 1) un lazo corredizo de cisteína (aa173-190), que es la única porción del G para el cual están disponibles datos estructurales; 2) un epítope inmunodominante de clase II de MHC en aa183-203; y) motivos del receptor de químosina fractalquina (C3XCR) y de unión a glucosaminoglicano (GAG), que están implicados en el proceso de fijación viral en la superficie de la célula hospedadora.
Esta descripción se refiere a polipéptidos quiméricos de RSV que incluyen en una orientación del N-terminal al C-terminal: (i) una primera secuencia de aminoácidos que incluye un dominio F2 unido a un dominio F1 de la proteína F de RSV y (ii) una segunda secuencia de aminoácidos que incluye una porción de una proteína G de RSV. Para facilitar el plegamiento y montaje durante la producción, la secuencia de la proteína F nativa es modificada para eliminar los sitios internos de reconocimiento de la furina y para prevenir la escisión de la furina. Los sitios de escisión de la furina pueden
ser destruidos por la adición, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos en la región de residuos de aminoácidos 106-109 y/o 133-136. Por ejemplo, los sitios de reconocimiento de la furina pueden ser eliminados al suprimir uno o dos aminoácidos (por ejemplo arginina y alanina en las posiciones 106 y 107, y arginina y lisina en las posiciones 133 y 134), que destruyen los sitios de escisión de la furina. Asi, con la expresión y el montaje, las porciones F2 y F1 del polipéptido quimérico permanecen en una sola unidad del polipéptido no escindible.
En la selección de los dominios F2 y F1 de la proteína F, un experto en la técnica reconocerá que no es estrictamente necesario incluir el dominio completo de F2 y/o F1. Típicamente, son de importancia las consideraciones conformacionales al seleccionar una subsecuencia (o fragmento) del dominio F2. Así, el dominio F2 incluye típicamente una porción del dominio F2 que facilita el montaje y la estabilidad del polipéptido quimérico. En ciertas variantes de ejemplo, el dominio F2 incluye los aminoácidos 24-105. Opcionalmente, el dominio F2 puede incluir un péptido de señal del polipéptido F0 nativo (por ejemplo, los aminoácidos 1-23).
Típicamente, por lo menos una subsecuencia (o fragmento) del dominio F1 es seleccionado y diseñado para mantener una conformación estable que incluya los epítopes inmunodominantes de la proteína F. Por ejemplo, es generalmente deseable seleccionar una subsecuencia del dominio F1 del polipéptido que incluya los epítopes reconocidos por los anticuerpos neutralizantes en las regiones de aminoácidos 262-275 (neutralización del
palivizumab) y 423-436 (el ch101 F MAb de Centocor). Además, es deseable incluir epítopes de células T, por ejemplo, en la región de aminoácidos 328-355. Más comúnmente, como una sola porción contigua de la subunidad F1 (por ejemplo, ampliando a los aminoácidos 262-436) pero los epítopes pueden ser retenidos en una secuencia sintética que incluya estos epítopes inmunodominantes como elementos discontinuos montados en una conformación estable. Así, un polipéptido de dominio F1 comprende por lo menos aproximadamente los aminoácidos 262-436 de un polipéptido de proteína F de RSV. En un ejemplo no limitativo que se provee en la presente, el dominio F1 comprende los aminoácidos 137 a 528 de un polipéptido de proteína F nativa (aunque podrían emplearse fragmentos algo más pequeños, por ejemplo, un fragmento que inicia en el residuo de aminoácido 151 o el aminoácido 161 , o que termina en la posición 524). Un experto en la técnica reconocerá que pueden usarse subsecuencías más cortas a criterio del practicante.
Para facilitar el plegamiento y montaje, y para maximizar la retención de epítopes conformacionales, se introduce un aminoácido enlazador entre los dos dominios de la proteína F. Numerosos enlazadores de longitud variable y atributos estructurales son conocidos por los expertos en la técnica. En el contexto de los polipéptidos quiméricos de RSV descritos en la presente, puede emplearse cualquiera de un número de tales enlazadores. Por ejemplo, secuencias simples repetidas ricas en glicina son empleadas favorablemente como enlazadores, según lo ilustrado en las modalidades
designadas V1-1 y V 1-2. En FG V1-1 , se emplea una secuencia simple repetida de glicina y serina como enlazador. La variante de FG V1-2 incluye un enlazador de glicina/serina que está adaptado para incluir un sitio de glicosilación. Secuencias enlazadoras de glicin/serina especificas de ejemplo se proveen en las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente. Alternativamente, pueden emplearse enlazadores con atributos estructurales más complejos. En ciertas modalidades, un enlazador se selecciona de la proteína F nativa. Por ejemplo, en ciertas modalidades favorables, el enlazador corresponde en la secuencia a todo o una parte de la secuencia de pep27, según lo ilustrado por las modalidades designadas V2-1 y V2-2. Donde se emplea tal enlazador, puede variar en longitud, por ejemplo, para modificar las características estructurales o funcionales, tales como la glicosilación. Dos versiones de ejemplo de un enlazador a base de pep27 se proveen en las SEQ ID NO: 7 y 8.
El componente del polipéptido de la proteína G se selecciona para incluir una porción (o subsecuencia o fragmento) de la proteína G que retiene los epítopes inmunológicamente dominantes o de células T inmunodominantes, por ejemplo, en la región de los aminoácidos 183-197. Las variantes de ejemplo incluyen, por ejemplo subsecuencias o fragmentos de la proteína G que incluyen de los aminoácidos 152, 151 , 150, 149, 148, etc., a los aminoácidos 226, 227, 228, 229, 230, etc. Opcionalmente, puede sustituirse un fragmento más grande (tal como un fragmento que incluye los residuos de aminoácidos 128-229, o 130-230) de una proteina G nativa. Un
experto en la técnica apreciará fácilmente que también pueden usarse porciones más largas o más cortas de la proteína G, siempre y cuando la porción seleccionada no desestabilice conformacionalmente o interrumpa la expresión, el plegamiento o el procesamiento del polipéptido FG quimérico. Opcionalmente, el dominio de la proteína G incluye una sustitución de aminoácidos en la posición 191 , que ha sido correlacionada previamente con reducir y/o prevenir una enfermedad incrementada caracterizada por la eosinofilia asociada con las vacunas de RSV inactivadas con formalina. Una descripción perfecta de los atributos de las proteínas G naturales y sustituidas (N191A) se encuentra, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. con número de publicación 2005/0042230, la cual es incorporada en la presente para referencia para todos los fines.
Si así se desea, pueden identificarse epítopes de células T adicionales usando motivos de anclaje u otros métodos, tales como red neural o determinaciones polinomioales, conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, RANKPEP (disponible en el sitio en red mundial en: mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); ProPredl (disponible en el sitio en red mundial en: imtech. res. in/raghava/propredl/index. html); Bimas (disponible en el sitio en red mundial en: www.bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html); y SYFPEITH (disponible en el sitio en red mundial en: syfpeithi.bmiheidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm). Por ejemplo, los algoritmos son usados para determinar el "umbral de unión" de los
péptidos, y para seleccionar ésos con las puntuaciones que les dan una alta probabilidad de unión a MHC o a anticuerpos con una cierta afinidad. Los algoritmos están basados ya sea en los efectos en la unión a MHC de un aminoácido particular en una posición particular, los efectos en la unión del anticuerpo de un aminoácido particular en una posición particular, o los efectos en la unión de una sustitución particular en un péptido que contiene un motivo. Dentro del contexto de un péptido inmunogénico, "un residuo conservado" es uno que aparece con una frecuencia significativamente mayor de lo esperado por una distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. Los residuos de anclaje son residuos conservados que proveen un punto de contacto con la molécula de MHC. Los epítopes de células T identificados por tales métodos predictivos pueden ser confirmados al medir su unión a una proteína específica de MHC y por su capacidad de estimular a las células T cuando se presenta en el contexto de la proteína MHC.
Aunque se establecen modalidades de ejemplo en las SEQ ID
NO: 1 1 y 13, pueden producirse muchas otras modalidades sin experimentación indebida por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica. Será evidente para los expertos en la técnica que cualesquiera secuencias de proteínas F y/o G de RSV pueden emplearse en la construcción de los polipéptidos FG quiméricos recombinantes de RSV. La secuencia de la proteína F, que es responsable de la fusión de la envolvente del virus con la membrana de la célula diana, se conserva altamente entre los aislados de RSV. En cambio, ese de la proteína G, que es responsable de la
fijación del virus, es relativamente variable. Una alineación de las secuencias de proteina F y G de RSV, que ilustra la identidad y la variación entre las diferentes proteínas, se provee en la WO20081 14149. Las regiones conservadas y las variables son fácilmente evidentes a partir de estas alineaciones.
Por ejemplo, en una modalidad, el dominio F2 (por ejemplo, correspondiente a los aminoácidos 24 - 105 de la secuencia de la proteína F de referencia) unida de manera no escindible a un dominio F1 (por ejemplo, correspondiente a los aminoácidos 137-528 de la secuencia de la proteína F de referencia) por un enlazador seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, u 8, y unido en marco a un dominio de proteína G que incluye el epítope inmunodominante provisto por los aminoácidos 183-203 de la proteína G (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido correspondiente a la posición 149 a aproximadamente el aminoácido correspondiente a la posición 229 de la secuencia de la proteína F de referencia, por ejemplo, de la posición 148, 149, 150, 151 o 152 a la posición 226, 227, 228, 229 o 230). Los dominios F2 y F1 pueden seleccionarse del mismo polipéptido de proteína F, tal como un polipéptido de proteína F seleccionado de una proteína F natural tal como ese de la SEQ ID NO: 2, o cualquiera de los otros polipéptidos de proteína F de ejemplo (por ejemplo, ésos divulgados en la WO20081 4149). Alternativamente, los dominios F2 y F1 pueden seleccionarse de diferentes polipéptidos de proteína F naturales. Alternativamente, uno o ambos de los dominios F2 y F1 pueden modificarse como se indica más detalladamente en
la discusión en la presente con respecto a las variantes. De manera similar, el dominio de la proteína G puede seleccionarse de la SEQ ID NO: 4 o de cualquiera de las variantes divulgadas en la WO20081 14149.
Otras modalidades de ejemplo son las variantes que tienen una deleción de uno o más aminoácidos. Cuando se desean fragmentos más cortos, se selecciona sin embargo una porción que retiene las características estructural e inmunológicamente importantes de los componentes del polipéptido quimérico, como se describe en la presente. Alternativamente, las variantes pueden incluir aminoácidos adicionales. Por ejemplo, las variantes pueden incluir aminoácidos adicionales, que facilitan la purificación, (por ejemplo, las etiquetas de polihistidina).
Además, o alternativamente, pueden realizarse modificaciones a cualquiera de los polipéptidos FG quiméricos descritos para mejorar la expresión y la estabilidad de los polipéptidos quiméricos cuando se producen en un sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, las construcciones eucarióticas son típicamente diseñadas para incluir un péptido de señal correspondiente al sistema de expresión, por ejemplo, un péptido de señal de mamífero o viral, tal como la secuencia de señal nativa F0 de RSV se selecciona favorablemente al expresar el polipéptido quimérico en células de mamífero. Alternativamente, un péptido de señal (tal como un péptido de señal de baculovirus, o el péptido de señal de la melitina, puede sustituirse para la expresión, en células de insectos. Péptidos de señal vegetales adecuados son conocidos en la técnica, si se prefiere un sistema de expresión
vegetal. Péptidos de señal de ejemplo adecuados para uso en el contexto de
los polipéptidos FG quiméricos descritos en la presente incluyen los péptidos
de señal de: activador del plasminógeno tisular (tPA), proteína gD del Virus
del Herpes Simplex (HSV), endostatina humana, VIH gp120, CD33, proteína
gB del citomegalovirus, Her2Neu humano, virus de Epstein Barr (EBV) gp350,
y el SS de Tan et al., Protein Eng. 15:337 - 45. '
En ciertas modalidades, los polipéptidos FG quiméricos se
modifican para alterar el patrón o el estado de la glicosilación (por ejemplo,
aumentando o disminuyendo la proporción de moléculas glicosiladas en uno o
más de los sitios de glicosilación presentes en un polipéptido de proteína F nativa. Por ejemplo, se predice que el polipéptido de proteína F nativa de la
I
SEQ ID NO: 2 será glicosilado en las posiciones del aminoácido 27, 70 y 500.
En una modalidad, se introduce una modificación en la proximidad del sitio de
glicosilación en la posición del aminoácido 500. Por ejemplo, puede eliminarse
el sitio de glicosilación substituyendo un aminoácido, tal como glutamina (Q)
en lugar de la asparagina en la posición correspondiente a la posición 500 de
la secuencia de la proteína F de referencia (SEQ ID NO: 2). Favorablemente,
se introduce una modificación que aumenta la eficacia de glicosilación en este
sitio de glicosilación. Ejemplos de modificaciones adecuadas incluyen en las
posiciones 500-502, las siguientes secuencias de aminoácidos: NGS; NKS;
NGT; NKT. Las modificaciones de este sitio de glicosilación que resulta en
una glicosilación aumentada también puede resultar en una producción de proteína substancialmente aumentada.
Ácidos Nucleicos que Codifican Los Antigenos del Polipéptido FG Quimérico
Otro aspecto de ésta descripción se refiere a los ácidos nucleicos recombinantes que codifican los polipéptidos FG quiméricos descritos anteriormente. Los ácidos nucleicos recombinantes incluyen en la dirección de 5' a 3', (1) una secuencia polinucleotidica que codifica por lo menos una porción o fragmento de un dominio 2 de escisión de furina del polipéptido de proteína F de RSV (dominio F2)¡ (2) una secuencia polinucleotidica que codifica un enlazador de aminoácido; (3) una secuencia polinucleotidica que codifica por lo menos una porción o fragmento de un dominio 1 de escisión de la furina del polipéptido de proteína F de RSV (domino F1 )¡ y (4) una secuencia polinucleotidica que codifica por lo menos una porción o fragmento de un polipéptido de proteína G de RSV. Las secuencias polinucleotídicas componentes se unen de manera que los segmentos del polipéptido codificado son producidos en un solo polipéptido quimérico contiguo como se describió anteriormente.
En cierta modalidad, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido FG quimérico en el cual el dominio F2 (por ejemplo, correspondiente a los aminoácidos 24-105 de la secuencia de proteína F de referencia) está unida de manera no disociable a un dominio F1 (por ejemplo, correspondiente a los aminoácidos 137-528 de la secuencia de proteína F de referencia) por un enlazador seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, u 8, y unido en marco a un dominio de proteína G que incluye el epítope
inmunodominante provisto por los aminoácidos 183-203 de la proteina G (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido correspondiente a la posición 149 a aproximadamente el aminoácido correspondiente a la posición 229 de la secuencia de proteína F de referencia, por ejemplo, de la posición 148, 149, 150, 151 o 152 a la posición 226, 227, 228, 229 o 230). Los polinucleótidos que codifican los dominios F2 y F1 pueden seleccionarse del mismo polipéptido de proteína F, tal como un polipéptido de proteína F seleccionado de una proteína F natural tal como esa de la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1), o ésa que codifica cualquiera de los otros polipéptidos de proteína F de ejemplo (por ejemplo, ésos divulgados en la WO2008114149). Alternativamente, los dominios F2 y F1 pueden seleccionarse para codificar diferentes polipéptidos de proteína F natural. Alternativamente, los polinucleótidos que codifican uno o ambos de los dominios F2 y F1 pueden incluir una o más mutaciones (por ejemplo, adición, deleción o sustitución del nucleótido) para modificar el polipéptido como se indica (por ejemplo, para modificar un sitio de glicosilación en la posición 27, 70 y/o 500) más detalladamente en la discusión en la presente con respecto a las variantes. De manera similar, el polinucleótido que codifica el dominio de la proteína G se selecciona de la SEQ ID NO: 4 o de cualquiera de las variantes divulgadas en la WO2008114149.
En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos recombinantes son optimizados por codón para la expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica seleccionada, tal como una célula de mamífero,
vegetal o de insecto. Para facilitar la replicación y la expresión, los ácidos nucleicos pueden ser incorporados en un vector, tal como un vector de expresión procariótico o eucariótico. Aunque los ácidos nucleicos descritos en la presente pueden ser incluidos en cualquiera de una variedad de vectores (incluyendo, por ejemplo, plásmidos bacterianos; ADN del fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN del fago, ADN viral tal como una vacuna, adenovirus, el virus pox de las aves, las pseudorabias, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y muchos otros), más comúnmente el vector será un vector de expresión adecuado para generar los productos de expresión del polipéptido. En un vector de expresión, el ácido nucleico que codifica la quimera FG está dispuesto típicamente en proximidad y orientación a una secuencia de control de transcripción adecuada (promotor, y opcionalmente, uno o más potenciadores) para dirigir la síntesis del ARNm. Es decir, la secuencia polinucleotídica de interés está operativamente enlazada a una secuencia de control de transcripción adecuada. Ejemplos de tales promotores incluyen: el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de LTR o SV40, el promotor del poliedro del baculovirus, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor del fago 17 y lambda PL, y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión típicamente también contiene un sitio de unión de ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector incluye opcionalmente las secuencias apropiadas para amplificar la
expresión. Además, los vectores de expresión comprenden opcionalmente uno o más genes marcadores selecciónateles para proveer un rasgo fenotipico para la selección de las células hospedadoras transformadas, tales como la resistencia a la dihidrofolato reductasa o la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como la resistencia a la tetraciclina o a ampicilina en la E. coli.
El vector de expresión también puede incluir elementos adicionales de expresión, por ejemplo, para mejorar la eficiencia de la traducción. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, un codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes. En algunos casos, por ejemplo, un codón de iniciación de la traducción y los elementos de la secuencia asociados son insertados en el vector de expresión apropiado simultáneamente con la secuencia polinucleotídica de interés (por ejemplo, un codón de iniciación nativo). En tales casos, no se requieren las señales de control traduccional adicionales. No obstante, en casos en los que se inserta solo una secuencia codificante del polipéptido, o una porción de la misma, se proveen señales de control traduccional exógenas, incluyendo un codón de iniciación de ATG para la expresión de la secuencia FG quimérica. El codón de iniciación es colocado en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de la secuencia polinucleotídica de interés. Los elementos transcripcionales exógenos y los codones de iniciación pueden tener diferentes orígenes, tanto naturales como sintéticos.
Si se desea, la eficacia de la expresión puede aumentar además por la inclusión de potenciadores apropiados al sistema celular en uso (Scharf et al., (1994) Results Probl Cell Differ 20:125 - 62; Bitter et al. (1987) Methods in Enzvmol 153:516 - 544). En algunos casos, el ácido nucleico (tal como un vector) que codifica el polipéptido FG incluye uno o más elementos adicionales de la secuencia seleccionados para aumentar y/u optimizar la expresión del ácido nucleico que codifica a FG cuando se introduce en una célula hospedadora. Una clase de secuencias potenciadoras de la expresión incluye un elemento epigenético tal como una Región de Fijación de Matriz (o MAR), o un elemento epigenético similar, por ejemplo, elementos STAR (por sus siglas en inglés) (por ejemplo, tales como esos elementos STAR divulgados en Otte et al., Biotechnol. Prog. 23:801 - 807, 2007). Sin estar limitado por la teoría, se considera que las MAR median el anclaje de una secuencia de ADN diana a la matriz nuclear, generando dominios de bucle de cromatina que se extienden hacia fuera de los núcleos de la heterocromatina. Aunque las MAR no contienen ningún consenso obvio o secuencia reconocible, su característica más consistente parece ser un alto contenido global de A T, y las bases C predominantes en una hebra. Estas regiones parecen formar las estructuras secundarias dobladas que pueden ser propensas a la separación de la hebra, y pueden incluir un elemento de desenrollamiento de núcleo (CUE-por sus siglas en inglés) que puede servir como el punto de nucleación para la separación de la hebra. Numerosos motivos simples de secuencia ricos en AT han sido asociados con las
secuencias MAR: por ejemplo, la caja A (AATAAAYAAA), la caja T (TTWTWTTWTT), los motivos que desenrollan el ADN (AATATATT, AATATT), los sitios de unión de SATB1 (caja H, A/T/C25) y los sitios de consenso de la Topoisomerasa II para los vertebrados (RNYNNCNNGYNGKTNYNY) o Drosophila (GTNWAYATTNATNNR). Secuencias MAR de ejemplo se describen en la Solicitud de Patente Publicada de E.U.A. No. 20070178469, y en la solicitud de patente internacional no. WO02/074969 (que son incorporadas en la presente para referencia). Secuencias MAR adicionales que pueden usarse para potenciar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido FG incluyen la lisozima MAR del pollo, MARp1-42, MARp1-6, MARp1-68, y MARpx-29, descritas en Girad et al., Nature Methods, 4:747-753, 2007 (divulgado en los Números de acceso GenBank. EA423306, DI107030, DI106196, DI107561 , y DI106512, respectivamente). Un experto apreciará que la expresión puede ser además modulada al seleccionar una MAR que produzca un nivel intermedio de potenciación, como se reporta para MAR 1-9. Si se desea, pueden identificarse secuencias MAR alternativas para aumentar la expresión de un polipéptido FG buscando bases de datos de secuencias, por ejemplo, usando el software tal como MAR-Finder (disponible en la red en futuresoft.org/MarFinder), SMARTest (disponible en la red en genomatix.de), o SMARScan I (Levitsky et al., Bioinformatics 15:582 - 592, 1999). En ciertas modalidades, la MAR se introduce (por ejemplo, se transfecta) en la célula hospedadora en el mismo ácido nucleico (por ejemplo, vector) como la secuencia que codifica al polipéptido FG. En una modalidad
alternativa, la MAR se introduce en un ácido nucleico separado (por ejemplo, en trans) y puede opcionalmente co-integrarse con el ácido nucleico FG.
Los procedimientos de ejemplo suficientes para guiar a una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a través de la producción de ácidos nucleicos FG recombinantes pueden encontrarse en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001 ; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y suplementos al 2003); y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999.
Ácidos nucleicos de ejemplo que codifican los polipéptidos FG quiméricos están representados por las SEQ ID NO: 10 y 12. Pueden producirse variantes adicionales al montar secuencias análogas polipeptidicas de la proteína F2, F1 y G seleccionadas de cepas descubiertas conocidas (o por descubrir) del RSV, por ejemplo, como se muestra en las FIGS. 4 y 5. Los expertos en la técnica pueden producir variantes adicionales de la secuencia que comparten identidad de secuencia con las variantes de ejemplo. Típicamente, las variantes del ácido nucleico codificarán polipéptidos que difieran por no más que 1%, o 2%, o 5%, o 10%, o 15%, o 20% del nucleótido o de los residuos de aminoácidos. Es decir, los polipéptidos codificados comparten por lo menos 80%, u 85%, más comúnmente, por lo menos
aproximadamente 90% o más, tal como 95%, o aún 98% o 99% la identidad de la secuencia. Será comprendido inmediatamente por los expertos en la técnica, que las secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos FG, pueden por sí mismos compartir menos identidad de la secuencia debido a la redundancia del código genético.
Será comprendido por los expertos en la técnica, que la similitud entre el polipéptido FG quimérico y las secuencias polinucleotídicas, en cuanto a los polipéptidos y secuencias de nucleótidos en general, pueden expresarse en términos de similitud entre las secuencias, en contrario referida como identidad de la secuencia. La identidad de la secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud); cuanto más alto es el porcentaje, más similares son las estructuras primarias de las dos secuencias. Generalmente, cuanto más similares son las estructuras primarias de dos secuencias de aminoácidos (o polinucleótidos), más similares son las estructuras del orden superior resultantes de plegamiento y montaje. Las variantes de un polipéptido FG quimérico y de las secuencias polinucleotídicas pueden tener uno o una pequeña cantidad de deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos pero sin embargo compartirán un porcentaje muy alto de sus aminoácidos, y generalmente de su secuencia polinucleotídica.
Los métodos para determinar la identidad de la secuencia son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación están descritos en: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ;
Needleman and Wunsch, J Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151 , 1989; Corpet et al, Nucleic Acids Research 16:10881 , 1988, y Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci.. USA 85:2444, 1988. Altschul et al, Nature Genet. 6:119, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de la alineación de secuencias y cálculos de homología. La herramienta de búsqueda de alineación local básica de la NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) está disponible de muchas fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (centro nacional para la información de la biotecnología) (NCBI, Bethesda, MD) y en el Internet, para el uso con relación a los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de la secuencia usando este programa está disponible en el sitio en red del NCBI en el Internet.
Otro índice de similitud de la secuencia entre dos ácidos nucleicos es la capacidad de hibridar. Cuanto más similares son las secuencias de los dos ácidos nucleicos, más rigurosas las condiciones en las cuales podrán hibridar. La rigurosidad de las condiciones de hibridación son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Así, las condiciones de hibridación que resultan en grados particulares de rigurosidad variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación de elección y la composición y la longitud de las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan. Generalmente, la temperatura de la hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o
Mg++) del tampón de hibridación determinará la rigurosidad de la hibridación, aunque los tiempos de lavado también influencian la rigurosidad. Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas de aproximadamente 5°C a 20°C inferior al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm, es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana hibrida a una sonda perfectamente apareada. Las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de las rigurosidades se encuentran, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ; Tijssen, Hibridation with Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nuclei Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science LTd., NY, NY, 1993 y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.
Para propósitos de la presente descripción, "condiciones rigurosas" abarcan las condiciones bajo las cuales la hibridación ocurrirá solamente si hay menos de 25% de malapareamiento entre la molécula de la hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones rigurosas" pueden dividirse en niveles particulares de rigurosidad para una definición más precisa. Asi, como se utiliza en la presente, las condiciones de "rigurosidad moderada" son esas bajo las cuales las moléculas con más de 25% de malapareamiento en la secuencia no se hibridarán; las condiciones de "rigurosidad media" son ésas bajo las cuales las moléculas con más de 15% de malapareamiento no se
hibridarán, y las condiciones de "rigurosidad alta" son ésas bajo las cuales las secuencias con más de 10% de malapareamiento no se hibridarán. Las condiciones de "muy alta rigurosidad" son ésas bajo las cuales las secuencias con más de 6% de malapareamiento no se hibridarán. En cambio, los ácidos nucleicos que hibridan bajo "condiciones de baja rigurosidad" incluyen esos con identidad de la secuencia mucho menor sobre solo subsecuencias cortas del ácido nucleico. Por lo tanto, se comprenderá que las diferentes variantes de los ácidos nucleicos que están comprendidos por esta descripción son capaces de hibridar a por lo menos las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 67 o 69, sobre substancialmente su longitud completa.
Métodos para Producir Polipéptidos Antigénicos Quiméricos de
RSV
Los polipéptidos FG quiméricos descritos en la presente se producen usando procedimientos bien establecidos para la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Los procedimientos suficientes para guiar a un experto en la técnica pueden encontrarse en, por ejemplo, las referencias de Sambrook y Ausubel citadas anteriormente. Detalles adicionales y específicos se proveen a continuación.
Los ácidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de los antígenos quiméricos FG de RSV descritos anteriormente, tal como (pero no limitado a) los ácidos nucleicos de ejemplo representados por las SEQ ID NO: 10 y 12, son introducido dentro de células hospedadoras por cualquiera
de una variedad de procedimientos bien conocidos, tales como electroporación, transfección mediada por liposomas, precipitación de fosfato cálcico, infección, transfección y similares, dependiendo de la selección de vectores y de las células hospedadoras.
Por lo tanto, también es un aspecto de esta descripción las células hospedadoras que incluyen ácidos nucleicos que codifican al polipéptido FG quimérico recombinante. Las células hospedadoras favorables incluyen células hospedadoras procarióticas (es decir, bacterianas), tales como E. coli, así como numerosas células hospedadoras eucarióticas, incluyendo células de hongos (por ejemplo, levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae y Picchia pastoris), células de insectos, células vegetales, y células de mamífero (tales como células de CHO). Los ácidos nucleicos FG recombinantes son introducidos (por ejemplo, transducidos, transformados o transfectados) dentro de las células hospedadoras, por ejemplo, vía un vector, tal como un vector de expresión. Como se describió anteriormente, el vector es más típicamente un plásmido, pero tales vectores también pueden ser, por ejemplo, una partícula vírica, un fago, etc. Ejemplos de hospedadores de la expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Neuroespora crassa; células de insectos tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda, células de mamífero tales como 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 o melanoma de Bowes; células vegetales, incluyendo células de algas, etc.
Las células hospedadora pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar a promotores, seleccionar transformantes, o amplificar las secuencias polinucleotídicas insertadas. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son típicamente ésas previamente utilizadas con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y será sean evidentes para los expertos en la técnica y en las referencias citadas en la presente, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas aquí. Los productos de expresión correspondientes a los ácidos nucleicos de la invención también se pueden producir en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, los detalles con respecto al cultivo celular pueden encontrarse en Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Orqan Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbioloqical Media (1993) CRC, Boca Ratón, FL.
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse un número de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el producto expresado. Por ejemplo, cuando se requieren grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos de los mismos para la producción de anticuerpos, los vectores que dirigen altos niveles de expresión de las proteínas de fusión que
son purificadas fácilmente se emplean de manera favorable. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión y clonación multifuncionales de E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los cuales la secuencia codificante de interés, por ejemplo, un polinucleótido de la invención como se describió anteriormente, puede ser ligada dentro del vector en el marco con las secuencias para la traducción del amino-terminal que inicia en la Metionina y los 7 residuos subsiguientes de la beta-galactosidasa produciendo una proteina de fusión beta-galactosidasa catalíticamente activa; los vectores pIN (Van Keeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503 - 5509; los vectores pET (Novagen, Madison Wl), en los cuales la metionina del amino-terminal se liga en el marco con una etiqueta de histidina; y similares.
De manera similar, en levaduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, un número de vectores que contiene promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH pueden usarse para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, véase Berger, Ausubel, y, por ejemplo, a Grant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516 - 544). En células hospedadoras de mamífero, puede usarse un número de sistemas de expresión, incluyendo tanto sistemas basados en plásmis como virales.
Una célula hospedadora opcionalmente se elige por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de procesar las secuencias insertadas en la manera deseada. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, (así
como, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, lipidación y acilación). El procesamiento post-traduccional por ejemplo, que escinde una forma del precursor en una forma madura de la proteína (por ejemplo, por una furina proteasa) se realiza opcionalmente en el contexto de la célula hospedadora. Diferentes células huésped tales como 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc, tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traduccionales y pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña, introducida.
Para la producción de alto rendimiento, de largo plazo del polipéptido FG quimérico recombinante codificado por los ácidos nucleicos descritos en la presente, típicamente se usan los sistemas de expresión estables. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polipéptido FG quimérico se introducen en la célula hospedadora que usa vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos endógenos de expresión y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, las células se dejan crecer por 1-2 días en un medio enriquecido antes de sean cambiadas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Por ejemplo, los grupos o las colonias resistentes de células transformadas de manera estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas al tipo celular. Las
células hospedadoras transformadas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido FG quimérico son opcionalmente cultivadas quiméricas bajo condicines adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína codificada del cultivo celular.
Después de la transducción de una linea celular hospedadora adecuada y el crecimiento de las células hospedadoras a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células son cultivadas por un período adicional. El producto polipeptídico secretado entonces es entonces recuperado del medio de cultivo. Alternativamente, las células pueden ser recolectadas por centrifugación, romperse por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante retenido para purificación posterior. Las células eucarióticas o microbianas empleadas en la expresión de proteínas puede romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, rompimiento mecánico, o el uso de agentes de lisis celular, u otros métodos, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los polipéptidos FG quiméricos expresados pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes mediante cualquiera de un número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio o de etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando
cualquiera de los sistemas de marcado indicados en la presente), cromatografía de hidroxilapatita, y cromatografía de lectina. Pueden usarse etapas de replegado de la proteína, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las etapas finales de la purificación. Además de las referencias indicadas anteriormente, una variedad de métodos de purificación son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ésos establecidos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley- VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.
En ciertos ejemplos, los ácidos nucleicos son introducidos en vectores adecuados para la introducción y la expresión en células procariotas, por ejemplo, células de E. coli. Por ejemplo, un ácido nucleico que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica un antígeno FG quimérico de RSV puede introducirse en cualquiera de una variedad de vectores disponibles en el comercio o vectores propios, tales como la serie pET de vectores de expresión (por ejemplo, pET19b y pET21d). La expresión de la secuencia
codificante es inducible por IPTG (por sus siglas en inglés), dando por resultado altos niveles de expresión de la proteína. La secuencia polinucleotídica que codifica el antígeno quimérico de RSV es transcrita bajo el promotor del fago T7. También son adecuados los vectores alternativos, tales como pURV22 que incluyen un promotor pL lambda inducible por calor.
El vector de expresión es introducido (por ejemplo, por electroporación) en una bacteria hospedera adecuada. Numerosas cepas adecuadas de E. coli están disponibles y pueden ser seleccionadas por un experto en la técnica (por ejemplo, las cepas Rosetta y BL21 (DE3) han resultado ser favorables para la expresión de los vectores recombinantes que contienen secuencias polinucleotídicas que codifican los antígenos FG quiméricos de RSV.
En otro ejemplo, los polinculeótidos que codifican los polipéptidos FG quiméricos son clonados en un vector adecuado para la introducción en células de mamífero (por ejemplo, células de CHO). En esta modalidad de ejemplo, la secuencia polinucleotídica que codifica el antígeno quimérico de RSV se introduce en el vector pEE14 desarrollado por la firma Lonza Biologicals. El polipéptido quimérico se expresa bajo un promotor constitutivo, el promotor temprano inmediato de CMV (CitoMegalo Virus). La selección de las células transfectadas de manera estable que expresan la quimera se realiza con base en la capacidad de las células transfectadas de crecer en la ausencia de una fuente de glutamina. Las células que han integrado con éxito el pEE14 son capaces de crecer en la ausencia de
glutamina exógena, porque el vector pEE14 expresa la enzima GS (glutamina sintetasa). Las células seleccionadas pueden expandirse por clonación y caracterizarse para la expresión del polipéptido quimérico.
En otro ejemplo, la secuencia polinucleotídica que codifica el antígeno quimérico FG de RSV se introduce en células de insectos usando un Sistema de Vector de Expresión de Baculovirus (BEVS). El baculovirus recombinante capaz de infectar las células de insectos puede generarse usando vectores, kits y/o sistemas disponibles en el comercio, tales como el sistema de BD BaculoGoId de BD BioScience. Brevemente, la secuencia polinucleotídica que codifica un antígeno quimérico FG de RSV es insertada en el vector de transferencia pAcSG2. Entonces, las células hospedadoras SF9 {Spodoptera frugiperda) son co-transfectadas por el plásmido pAcSG2-quimera y BD BaculoGoId, que contiene el ADN genómico linealizado del baculovirus virus de polihedrosis nuclear de Autographa califórnica (AcNPV). Después de la transfección, la recombinación homologa curre entre el plásmido pACSG2 y el genoma del Baculovirus para generar el virus recombinante. En un ejemplo, el antígeno quimérico de RSV se expresa bajo control regulador del promotor de la polihedrina (pH). Pueden producirse vectores de transferencia similares usando otros promotores, tales como los promotores básico (Ba) y p10. De manera similar, pueden emplearse células de insectos alternativas, tales como SF21 que está cercanamente relacionada al Sf9, y la línea celular Cinco Alta (Hi5) derivada de una oruga de la col, Trichoplusia ni.
Después de la transfección y la inducción de la expresión (de acuerdo al promotor y/o potenciadores seleccionados u otros elementos reguladores), los polipéptidos quiméricos expresados se recuperan (por ejemplo, se purifican o enriquecen) y se renaturalizan para asegurar el plegamiento en una conformación antigénicamente activa. Típicamente, la conformación antigénicamente activa es un multímero de polipéptidos FG quiméricos. De manera favorable, el mutlímero es un trímero.
Composiciones y Métodos Inmunoqénicos
También se proveen composiciones inmunogénicas que incluyen polipéptidos FG quiméricos y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Numerosos diluyentes y portadores famracéuticamente aceptables y/o excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975).
En general, la naturaleza del diluyente, portador y/o excipiente dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales incluyen generalmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones de sal equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como portador. En ciertas formulaciones (por ejemplo, composiciones sólidas, tales como formas de polvo), no se emplea un
diluyente líquido. En tales formulaciones, pueden usarse portadores sólidos no tóxico, incluyendo por ejemplo, los grados farmacéuticos de la trehalosa, manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio.
En consecuencia, los excipientes y los portadores adecuados pueden ser seleccionados por los expertos en la técnica para producir una formulación adecuada para el suministro a un sujeto por una vía de administración seleccionada.
Ejemplos particulares se dan antes en la Cuadro 1. Los excipientes adicionales incluyen, sin limitación: glicerol, polietilenglicol (PEG), vidrio que forma Polioles (tal como, sorbitol, trehalosa) N-lauroilsarcosina (por ejemplo, sal sódica), L-prolina, sulfobetaina no detergente, clorurohidrato de guanidina, urea, óxido de trimetilamina, KCI, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ (y otras sales relacionadas al catión divalente), ditiotreitol (DTT), dithioeritrol, ß-mercaptoetanol, detergentes (que incluyen, por ejemplo, Tween80, Tween20, Tritón X-100, NP-40, Empigen BB, Octilglucósido, lauroil maltósido, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12, Zwittergent 3-14, Zwittergent 3-16, CHAPS, desoxicolato de sodio, dodecil sulfato de sodio, y bromuro de cetiltrimetilamonio.
En ciertos ejemplos favorables, la composición inmunogénica también incluye un adyuvante. Los adyuvantes adecuados para uso en las composiciones inmunogénicas que contienen los polipéptidos FG quiméricos son adyuvantes que encombinación con los antigenos FG descritos en la
presente son seguros y mínimamente reactogénicos cuando se administran a un sujeto.
Un adyuvante adecuado para uso en combinación con los antígenos FG quiméricos es un derivado de lipopolisacárido bacteriano no tóxico. Un ejemplo de un derivado no tóxico adecuado del lipido A, es el lipido A del monofosforilado o más particularmente un lipido A (3D-MPL) monofosforilado 3-Desacilado. El 3D-MPL es vendido bajo el nombre de MPL por GlaxoSmithKIine Biologicals N.A., y se refiere a través del documento como el MPL o 3D-MPL. Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,436,727; 4,877,611 ; 4,866,034 y 4,912,094. El 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de las células T de CD4+ con un fenotipo de IFN-? (Th1 ). El 3D-MPL puede producirse de acuerdo con los métodos divulgados en la GB222021 1 A. Químicamente es una mezcla de lipido A monofosforilado 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invención pueden usarse 3D-MPL de partículas pequeñas. El 3D-MPL de partículas pequeñas tiene un tamaño de partícula tal que puede ser esterilizado por filtración a través de un filtro de 0.22 µ??. Tales preparaciones se describen en la W094/21292.
Dicho lipopolisacárido, tal como 3D-MPL, puede ser usado en cantidades entre 1 y 50 µg, por dosis humana de la composición inmunogénica. Dicho 3D-MPL puede usarse a un nivel de aproximadamente 25 gl por ejemplo entre 20-30 µg, convenientemente entre 21-29 µg o entre
22 y 28 µ? o entre 23 y 27 µg o entre 24 y 26 µ?, o 25 g. En otra modalidad, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 µg, por ejemplo entre 5 y 15 µg, convenientemente entre 6 y 14 µg, por ejemplo entre 7 y 13 µ? o entre 8 y 12 µ? o entre 9 y 1 1 µg> o 10 µg. En otra modalidad, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 5 µg, por ejemplo entre 1 y 9 µ9, o entre 2 y 8 µ9 o convenientemente entre 3 y 7 µg o 4 µg, o 5 µ9.
En otras modalidades, el lipopolisacárido puede ser un disacárido ß(1 -6) de glucosamina, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,005,099 y la Patente EP No. 0 729 473 B1. Un experto en la técnica sería fácilmente capaz de producir diversos lipopolisacáridos, tal como 3D-MPL, con base en las enseñanzas de estas referencias. Sin embargo, cada una de estas referencias es incorporada en la presente para referencia. Además de los inmunoestimulantes antes mencionados (que son similares en estructura a esa del LPS o MPL o 3D-MPL), los derivados del monosacárido y del disacárido acilado que son una sub-porción de la estructura anterior del MPL son también adyuvantes adecuados. En otras modalidades, el adyuvante es un derivado sintético del lípido A, algunos de los cuales se describen como agonistas de TLR-4, e incluyen, pero no se limitan a:
OM 174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fósfono-p-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-
h¡droxitetradecano¡lamino]-a-D-glucopiranos¡ldihidrogenfosfato), (WO 95/14026).
OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecano¡lam¡no]-4-oxo-5-aza-9-(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1 ,10-diol,1 ,10-bis (dihidrógenofosfato) (WO 99/64301 y WO 00/0462).
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidrox¡tetradecanoilam¡no]decan-1 , 10-diol, 1 -dihidrógenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (WO 01/46127).
Otros ligandos TLR4 que pueden ser utilizados son alquil
Glucosaminida fosfatos (AGP) tales como ésos divulgados en la WO 98/50399 o la Patente de E.U.A. No. 6,303,347 (también se divulgan los procedimientos para la preparación de los AGP), convenientemente RC527 o RC529 o sales farmacéuticamente aceptables de los AGP según lo divulgado en la Patente de E.U.A. No. 6,764,840. Algunos AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas del TLR4. Se piensa que ambos son útiles como adyuvantes.
Otros ligandos adecuados de TLR-4, capaces de causar una respuesta de señalización a través de TLR-4 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5) son, por ejemplo, lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas y sus derivados, o fragmentos de las mismas, en particular un derivado no tóxico de LPS (tal como 3D-MPL). Otros agonistas de TLR adecuados son: las proteínas de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 o 90; proteína A del surfactante, oligosacáridos de hialuronan, fragmentos de sulfato de heparan,
fragmentos de fibronectina, péptidos del fibrinógeno y b-defensin-2, y dipéptido de muramilo (MDP). En una modalidad el agonista de TLR es HSP 60, 70 o 90. Otros ligandos adecuados de TLR-4 son como se describen en la WO 2003/01 1223 y en la WO 2003/099195, tal como el compuesto I, el compuesto II y el compuesto III divulgados en las páginas 4-5 de la WO2003/011223 o en las páginas 3-4 de la WO2003/099195 y en particular esos compuestos divulgados en la WO2003/011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, y ER804764. Por ejemplo, un ligando adecuado de TLR-4 es ER804057.
Los agonistas adicionales de TLR también son útiles como adyuvantes. El término "agonista de TLR" se refiere a un agente que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de una trayectoria de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo o indirectamente a través de la generación de un ligando endógeno o exógeno. Tales agonistas de TLR naturales o sintéticos pueden ser utilizados como adyuvantes alternativos o adicionales. Una breve revisión del papel de los TLR como receptores de adyuvantes se provee en Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002. Estos adyuvantes potenciales incluyen, pero no se limitan a los agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9. En consecuencia, en una modalidad, el adyuvante y la composición inmunogénica comprenden además un adyuvante que se selecciona del grupo que consiste de: un agonista de TLR-1 , un agonista de TLR-2, un agonista de
TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinación de los mismos.
En una modalidad de la presente invención, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-1. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona de: lipopéptidos Tri-acilados (LP); modulina soluble en fenol; LP de la Micobacteria tuberculosis S-(2,3-bis (palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, LP triclorhidrato (Pam3Cys) que imita el extremo amino acetilado de una lipoproteína bacteriana y de OspA LP de Borrelia burgdorfei.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-2. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es una o más de una lipoproteína, un péptidoglicano, un lipopéptido bacteriano de M tuberculosis, B burgdorferi o T pallidum; péptidoglicanos de las especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manuronicos, Neisseria poríns, fimbriae bacteriana, factores de la virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina del sarampión, y zymosan de la levadura.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-3. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de
señalización a través de TLR-3 es un ARN de doble cadena (dsARN), o ácido polyinosinic-policitidílico (Poli IC), un patrón molecular del ácido nucleico asociado con la infección viral.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-5. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es flagellin bacteriano.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-6. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es una lipoproteína micobacteriana, LP di-acilada, y modulina soluble en fenol. Agonistas de TLR6 adicionales se describen en WO 2003/043572.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-7. Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es un ARN de una sola cadena (ssARN), loxoribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina, o derivado del mismo. En una modalidad, el agonista de TLR es imiquimod. Agonistas de TLR7 adicionales se describen en WO 2002/085905.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-8.
Convenientemente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es un ARN de una cadena (ssARN), una molécula de imidazoquinolina con actividad antiviral, por ejemplo resiquimod (R848); el resiquimod es también capaz del reconocimiento por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que pueden ser usados incluyen ésos descritos en la WO 2004/071459.
En una modalidad alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-9. En una modalidad, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-9 es HSP90. Alternativamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-9 es ADN bacteriano o viral, ADN que contiene nucleótidos de CpG no metilados, en particular contextos de secuencia conocidos como motivos de CpG. Los oligonucleótidos que contienen CpG inducen predominantemente una respuesta de Th1. Tales oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en la WO 96/02555, WO 99/33488 y la Patente de E.U.A. No. 6,008,200 y 5,856,462. Convenientemente, los oligonucleótidos de CpG son oligonucleótidos de CpG. Oligonucleótidos adecuados para uso en las composiciones inmunogénicas de la presente invención son oligonucleótidos que contienen CpG, opcionalmente que contienen dos o más motivos de cpG de dinucleótidos separados por lo menos por tres, convenientemente por lo menos por seis o más nucleótidos. Un motivo de CpG es un nucleótido de Citosina seguido por un nucleótido de Guanina. Los oligonucleótidos de CpG
de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad específica el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o convenientemente un enlace de fosforotioato, aunque dentro del alcance de la presente invención se encuentras los enlaces fosfodiéster y otros internucleótidos. También se incluye dentro del alcance de la invención a los oligonucleótidos con enlaces internucleótidos mezclados. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o de fosforoditioato se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,666,153, 5,278,302 y en la WO 95/26204.
Otros adyuvantes que pueden ser utilizados en las composiciones inmunogénicas con un polipéptido FG quimérico, por ejemplo, solos o en combinación con 3D-MPL, u otro adyuvante descrito en la presente, son las saponinas, tales como QS21.
Las saponinas son enseñadas en: Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Las saponinas son glicósidos de esferoide o de triterpeno ampliamente distribuidas en los reinos vegetales y de los animales marinos. Las saponinas son notables por la formación de soluciones coloidales en agua que hacen espuma al sacudirlas, y por precipitar el colesterol. Cuando las saponinas están cerca de las membranas celulares crean estructuras similares a poros en la membrana, lo que causa que la membrana se rompa. La hemolisis de eritrocitos es un ejemplo de este fenómeno, que es una propiedad de ciertas, pero no de todas, las saponinas.
Las saponinas son conocidas como adyuvantes en las vacunas para la administración sistémica. La actividad adyuvante y hemolítica de las saponinas individuales ha sido extensivamente estudiada en la técnica (Lacaille-Dubois y Wagner, supra). Por ejemplo, Quil A (derivada de la corteza del árbol de América del sur Quillaja Saponaria Molina), y las fracciones del mismo, se describen en la US 5,057,540 y "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; y EP 0 362 279 B1. Las estructuras particuladas, los denominados Complejos Estimulantes Inmunes (ISCOMS), que comprenden fracciones del Quil A son hemolíticos y han sido utilizados en la fabricación de vacunas (Morein, B., EP 0 109 942 B1 ; WO 96/11711 ; WO 96/33739). Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (las fracciones purificadas por HPLC del Quil A) han sido descritas como adyuvantes sistémicos potentes, y el método para su producción se divulga en la Patente de E.U.A. No. 5,057,540 y EP 0 362 279 B1 , que se incorporan en la presente para referencia. Otras saponinas que han sido utilizadas en los estudios de vacunación sistémica incluyen ésas derivadas de otras especies de plantas tales como Gypsophila y Saponaria (Bomford et al, Vaccine, 10(9):572-577, 1992). El QS21 es una fracción no tóxica purificada por Hplc derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Un método para producir el QS21 se divulga en la Patente de E.U.A. No. 5,057,540. Formulaciones adyuvantes no reactogénicas que contienen el QS21 se describen en la WO 96/33739. Las referencias antes mencionadas son incorporadas para referencia en la presente. Dicha saponina
inmunológicamente activa, tal como QS21 , puede ser usada en cantidades de entre 1 y 50 µ?, por dosis humana de la composición inmunogénica. Ventajosamente, el QS21 es ventajoso se usa a un nivel de aproximadamente 25 g, por ejemplo entre 20-30 µg, convenientemente entre 21-29 µg o entre 22 -28 µg o entre 23 -27 µg o entre 24 - 26 µg, o 25 µg. En otra modalidad, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende el QS21 a un nivel de aproximadamente 10 µg, por ejemplo entre 5 y 15 µg, convenientemente entre 6 - 14 µg, por ejemplo entre 7 -13 µg o entre 8 -12 µg o entre 9 -11 µg, o 10 µg. En otra modalidad, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende el QS21 a un nivel de aproximadamente 5 µ?, por ejemplo entre 1-9 µg, o entre 2 -8 µg o convenientemente entre 3-7 µg o 4 - 6 µg1 o 5 µg. Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes estimulantes de Th1 exitosos cuando están formulados junto con un antígeno. Asi, por ejemplo, los polipéptidos FG quiméricos pueden emplearse de manera favorable en composiciones inmunogénicas con un adyuvante que comprende una combinación de QS21 y colesterol.
Opcionalmente, el adyuvante también puede incluir sales minerales tales como sales de aluminio o calcio, en particular hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio. Por ejemplo, un adyuvante que contiene 3D-MPL en combinación con una sal de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio o 'alumbre") es adecuado para la formulación en una
composición inmunogénica que contiene un polipéptido FG quimérico para la administración a un sujeto humano.
Otra clase de adyuvantes derivadores de Th1 adecuados para uso en formulaciones con los polipéptidos FG quiméricos incluyen composiciones inmunoestimulantes basadas en OMP. Las composiciones inmunoestimulantes basadas en OMP son particularmente adecuadas como adyuvantes mucosales, por ejemplo, para la administración intranasal. Las composiciones inmunoestimulantes basadas en OMP son un género de preparaciones de proteínas de la membrana externa (OMP, incluyendo algunos porins) de bacterias Gram-negativas, tales como, pero no limitadas a, las especies de Neisseria (véase, por ejemplo, Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, en "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong-Kong, página 193, 1997; Patente de E.U.A. No. 5,726,292; Patente de E.U.A. No. 4,707,543), que son útiles como portador o en las composiciones para los inmunógenos, tales como antígenos bacterianos o virales. Algunas composiciones inmunoestimulantes basadas en OMP pueden ser referidas como "Proteosomas," que son hidrofóbicas y seguras para uso humano. Los proteosomas tienen la capacidad de auto-montarse en vesículas o aglomerados de OMP similares a vesículas de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 800 nm, y de incorporar no covalentemente, coordinar, asociar (por ejemplo, electrostáticamente o hidrofóbicamente), o en contrario cooperar con los antígenos proteicos (Ag),
particularmente los antigenos que tienen una porción hidrofóbica. Cualquier método de preparación que resulte en el componente proteico de la membrana externa en forma vesicular o similar a vesículas, incluyendo estructuras membranosas multimoleculares o composiciones de OMP similares a glóbulos fundidos de uno o más OMP, están incluidos dentro de la definición de Proteosoma. Los Proteosomas pueden prepararse, por ejemplo, como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,726,292 o la Patente de E.U.A. No. 5,985,284). Los Proteosomas también pueden contener un lipopolisacárido o un lipooligosacárido endógeno (LPS o LOS, respectivamente) originados de las bacterias utilizadas para producir los porins de OMP (por ejemplo, especies de Neisseria), que en general serán menores de 2% de la preparación total de OMP.
Los Proteosomas están compuestos principalmente de proteínas químicamente extraídas de la membrana externa (OMP) de Neisseria menigitidis (en su mayoría porins A y B así como OMP de clase 4), mantenidos en solución por un detergente (Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines, In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Los Proteosomas pueden formularse con una variedad de antígenos tales como proteínas recombinantes o purificadas derivadas de fuentes virales, incluyendo los polipéptidos FG quiméricos descritos en la presente, por ejemplo, por diafiltración o procedimientos tradicionales de diálisis. La eliminación gradual del detergente permite la
formación de complejos hidrofóbicos particulados de aproximadamente 100-200nm de diámetro (LoweII GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines, In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206).
"Proteosoma: LPS o Protollin" como se usa en la presente se refiere a preparaciones de proteosomas mezclados, por ejemplo, por la adición exógena, con por lo menos un tipo de lipopolisacárido para proveer una composición de OMP-LPS (que puede funcionar como una composición inmunoestimulante). Así, la composición de OMP-LPS puede estar comprendida de dos de los componentes básicos de Protollin, que incluyen (1 ) una preparación de la proteína de la membrana externa de Proteosomas (por ejemplo, Proyuvante) preparada de bacterias Gram-negativas, tales como de Neisseria meningitídis, y (2) una preparación de uno o más liposacáridos. Un lipooligosacárido puede ser endógeno (por ejemplo, contenido naturalmente con la preparación de Proteosoma OMP), puede mezclarse o combinarse con una preparación de OMP de un lipooligosacárido exógeno preparado (por ejemplo, preparado de un cultivo diferente o microorganismo que la preparación de OMP), o puede ser una combinación de los mismos. Tales LPS añadidos exógenamente pueden ser de la misma bacteria Gram-negativa de la cual se realizó la preparación del OMP, o de una bacteria Gram-negativa diferente. Debe también comprenderse que la protollin incluye opcionalmente lípidos, glicolípidos, glicoproteínas, moléculas pequeñas, o similares, y combinaciones de los mismos. La Protollin puede prepararse, por ejemplo,
como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0044425.
También pueden usarse combinaciones de diferentes adyuvantes, tales como esos mencionado anteriormente, en las composiciones con los polipéptidos FG quiméricos. Por ejemplo, como ya se indicó, el QS21 puede formularse junto con el 3D-MPL. La relación de QS21 : 3D-MPL estará típicamente en el orden de 1 :10 a 10:1 ; tal como 1 :5 a 5:1 , y a menudo substancialmente 1 :1. Típicamente, la relación está en el intervalo de 2.5:1 a 1 :1 3D-MPL:QS21. Otra combinación de formulación de adyuvantes incluye 3D-MPL y una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. Cuando se formulado en combinación, esta combinación puede mejorar una respuesta inmune de Th1 específica de antígeno.
En algunos casos, la formulación de adyuvantes incluye liposomas, una emulsión de aceite en agua, o una sal mineral tal como una sal de calcio o de aluminio, por ejemplo fosfato de calcio, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Un ejemplo de una emulsión aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, un tocol tal como alfa-tocoferol, y un surfactante, tal como polysorbate 80 o Tween 80, en un portador acuoso, y no contiene ningunos inmunoestimulante adicional, en particular no contiene un derivado de lípido A no tóxico (tal como 3D-MPL) o una saponina (tal como QS21). El portador acuoso puede ser, por ejemplo, una solución salina
tamponada con fosfato. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
En otra modalidad de la invención se provee una composición de vacuna que comprende un antígeno o una composición de antígeno y una composición adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua y opcionalmente uno o más de otros inmunoestimulantes, en donde dicha emulsión de aceite en agua comprende 0.5-10 mg de aceite metabolizable . (convenientemente escualeno), 0.5-11 mg de tocol (convenientemente alfa- > tocoferol) y 0.4-4 mg de agente emulsionante.
En una modalidad específica, la formulación adyuvante incluye
3D-MPL preparado en la forma de emulsión, tal como una emulsión de aceite en agua. En algunos casos, la emulsión tiene un tamaño de partícula pequeño menor que 0.2 µ?? de diámetro, como se divulga en la WO 94/21292. Por ejemplo, las partículas de 3D-MPL pueden ser suficientemente pequeñas ser esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0.22 mieras (como se describe en la Patente Europea número 0 689 454). Alternativamente, el 3D-MPL puede prepararse en una formulación liposomal. Opcionalmente, el adyuvante que contiene el 3D-MPL (o un derivado del mismo) también incluye un componente inmunoestimulante adicional.
Por ejemplo, cuando una composición inmunogénica con un antígeno del polipéptido FG quimérico se formula para la administración a un infante, la dosificación del adyuvante se determina para ser efectiva y relativamente no reactogénica en un sujeto infantil. Generalmente, la
dosificación de adyuvante en una formulación infantil es menor que la usada en formulaciones diseñadas para la administración a un adulto (por ejemplo, adultos de 65 años o mayores). Por ejemplo, la cantidad de 3D-MPL está típicamente en el intervalo de 1 µ9-200 µ9, tal como 10-100 µ9, o 10 µ9-50 µ9 por dosis. Una dosis infantil está típicamente en el extremo inferior de este intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 1 µ9 a aproximadamente 50 µ9, por ejemplo de aproximadamente 2 µ9, o aproximadamente 5 9, o aproximadamente 10 µ9, a aproximadamente 25 µ9, o a aproximadamente 50 µ9. Típicamente, donde se usa QS21 en la formulación, los intervalos son comparables (y de acuerdo con las relaciones indicadas anteriormente). Para poblaciones adultas y de ancianos, las formulaciones incluyen típicamente más de un componente adyuvante de lo que se encuentra típicamente en una formulación infantil. En particular las formulaciones que usan una emulsión de aceite en agua, tal emulsión puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, tal como colesterol, escualeno, alfa tocoferol, y/o un detergente, tal como tween 80 o span85. En formulaciones de ejemplo, tales componentes pueden estar presentes en las siguientes cantidades: de aproximadamente 1 -50mg de colesterol, de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol y de 0.3 a 3% de tween 80. Típicamente, la relación de escualeno:alfa tocoferol es igual o menor que 1 y esto provee una emulsión más estable. En algunos casos, la formulación también puede contener un estabilizador. Donde está presente el alumbre, por ejemplo, en combinación con 3D-MPL, la cantidad
está típicamente entre aproximadamente 100 µ9 y 1 mg, tal como de aproximadamente 100 µ?, o aproximadamente 200 µ9 a aproximadamente 750 tal como aproximadamente 500 µg por dosis.
Una composición inmunogénica contiene típicamente una cantidad inmunoprotectora (o una dosis fraccionada de la misma) del antígeno y puede prepararse por técnicas convencionales. La preparación de composiciones inmunogénicas, incluyendo ésas para la administración a los sujetos humanos, se describe en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol61 Vaccine Design-the subunit and adyuvant approach, editado por Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de E.U.A. No. 4,235,877. La conjugación de proteínas a macromoléculas es divulgada, por ejemplo, por Likhite, Patente de E.U.A. 4,372,945 y por Armor ef al., Patente de E.U.A. No. 4,474,757.
Típicamente, la cantidad de proteína en cada dosis de la composición inmunogénica se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en el sujeto típico. Inmunoprotector en este contexto no significa necesariamente totalmente protector contra la infección; significa la protección contra síntomas o la enfermedad, especialmente la enfermedad grave asociada con el virus. La cantidad de antígeno puede variar dependiendo de cuál inmunógeno específico se emplea. Generalmente, se espera que cada dosis humana
comprenda 1 1000 µ9 de proteína, tal como de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 100 µg, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 µ9, tal como de aproximadamente 1 µ9, a aproximadamente 2 µ9, aproximadamente 5 µ9, aproximadamente 10 µ9, aproximadamente 15 µ9, aproximadamente 20 µ9, aproximadamente 25 µ9, aproximadamente 30 µ9, aproximadamente 40 µ9, o aproximadamente 50 µ9. La cantidad utilizada en una composición inmunogénica se selecciona con base en la población objetivo (por ejemplo, niños o ancianos). Una cantidad óptima para una composición particular puede ser determinada mediante estudios estándar que implican la observación de valoraciones de anticuerpos y de otras respuestas en los sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Antíqenos del polipéptido quimérico de RSV de Ejemplo
Polipéptidos FG eucarióticos de ejemplo
Los FG quiméricos eucarióticos de ejemplo V1-1 y V2-1 fueron producidos de acuerdo con esta descripción. La secuencia de tales quimeras FG de ejemplo se proveen en la SEQ ID NO: 10 y 1 1 . Los polipéptidos FG
quiméricos incluyeron la secuencia de señal nativa de FO. La incorporación de una secuencia de señal potencia las modificaciones post-traduccionales, tales como glicosilación. En estas modalidades de ejemplo, se eliminaron ambos motivos de reconocimiento de furina, y se insertó un enlazador entre los dominios F2 y F1. La secuencia de los enlazadores presentes en FG V1 -1 y de FG V2-1 se proveen en las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente.
Esta proteína recombinante de ejemplo se diseñó para ser expresada en células mamíferas de Ovario de Hámster Chino (CHO) usando un sistema de expresión GS. Las células de CHO que crecen en un medio libre de glutamina requieren glutamina exógena para un crecimiento óptimo. Después de la transfección de las células de CHO con un vector pEE14 incluyendo una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido FG quimérico, este sistema posibilita la selección de dones estables vía la privación metabólica, debido a la expresión de la glutamina sintasa por el vector pEE14. Aunque las construcciones descrita aquí fueron producidas para la expresión en células de CHO, éstas construcciones pueden producirse de igual manera para la expresión usando un Sistema de Vector de Expresión de Baculovirus (BEVS).
EJEMPLO 2
Inhibición de la Neutralización en Suero Humano por el polipéptido quimérico de RSV
Suero humano obtenido de voluntarios fue seleccionado para la reactividad contra RSV A mediante ELISA y se usó en el ensayo de inhibición de la neutralización (NI) a la dilución relevante con base en una valoración potencial de neutralización anterior de RSV. El suero fue mezclado con proteínas inhibidoras a las concentraciones de 25 µ?/??? y se incubaron 1.5 a 2 horas a 37°C. En una placa de 96 pozos de fondo redondo, se mezcló el suero y las proteínas con una concentración fija de RSV A y se incubó por 20min a 33°C. Las mezclas de suero-inhibidor-virus fueron entonces colocadas en placas de 96 pozos de fondo plano previamente sembradas con células Vero, y se incubado además por 5-6 días a 33°C con C02 al 5% hasta el ensayo de inmunofluorescencia para la detección del valorador NI.
Las valoraciones fueron calculadas usando el método de Reed-Muench y los porcentajes de NI fueron calculados como sigue: [(valorador NI de 25 µ9/?t?? de inhibidor - valorador NI de 0 µ9 /mi de inhibidor)/valorador NI de 0 µ?/??? de inhibidor] X 100.
Listado de secuencias
SEQ ID NO:1
Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de referencia de RSV
Cepa A2 No. de Acceso de Genebank U50362
SEQ ID NO:2
Secuencia de aminoácidos del precursor FO de la proteína F de referencia de RSV
Cepa A2 No. de Acceso de Genebank AAB86664
SEQ ID NO:3
Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína G de referencia de RSV
Cepa larga
SEQ ID NO:4
Secuencia de aminoácidos de la proteína G de referencia de
RSV
SEQ ID N0:5
Enlazador sintético 1
SEQ ID NO:6
Enlazador sintético 2
SEQ ID NO:7
Enlazador sintético 3
SEQ ID NO:8
Enlazador sintético 4
SEQ ID NO:9
FG-Rixensart orig
SEQ ID NO:10
FG V1-1 (CHO)
SEQ ID N0:11
FG V1-1
SEQ ID N0:12
FG V2-1
SEQ ID N0:13
FG V2-1
Claims (55)
1.- Un polipéptido quimérico de RSV que comprende en una dirección del N terminal al C terminal: (i) una primera secuencia de aminoácidos que comprende un dominio F2 unido de manera no escindible a un dominio F1 de un polipéptido de proteína de Fusión (F) de Virus Sincitial Respiratorio (RSV); y (ii) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende una porción de un polipéptido de proteína de Unión (G) de RSV que comprende un epítope inmunológicamente dominante.
2. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el dominio F2 y el dominio F1 del polipéptido de proteína F de RSV están unidos de manera no escindible vía un enlazador de aminoácido.
3. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el enlazador de aminoácido se selecciona del grupo de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
4.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque la primera secuencia de aminoácidos comprende por lo menos una deleción o sustitución de aminoácido que elimina un sitio de escisión de la furina.
5.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la primera secuencia de aminoácidos comprende deleciones de aminoácidos en las posiciones 106 y 133 del polipéptido de proteína F de RSV.
6.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque comprende adicionalmente un péptido de señal.
7. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado además porque el dominio F2 comprende una secuencia de aminoácidos del residuo 24 al residuo 105 de un polipéptido de proteína F nativa.
8. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque el dominio F1 comprende una secuencia de aminoácidos del residuo 137 al residuo 528 de un polipéptido de proteína F nativa.
9. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado además porque la porción del polipéptido de proteína G de RSV comprende del residuo de aminoácido 183 al residuo 203 de un polipéptido de proteína G nativa.
10.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque la porción del polipéptido de proteína G de RSV comprende del residuo de aminoácido 152 al residuo 229 de un polipéptido de proteína G nativa.
11. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado además porque la porción del polipéptido de proteína G de RSV comprende del residuo de aminoácido 149 al residuo 229 de un polipéptido de proteína G nativa.
12. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido quimérico comprende por lo menos una sustitución de aminoácido relativa a un polipéptido natural de RSV, en donde la sustitución del aminoácido se correlaciona con la reducción o la prevención de la enfermedad vírica potenciada por la vacuna.
13. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el polipéptido quimérico comprende una sustitución de asparagina por alanina en el residuo 191 (N191 A) de la proteína G.
14. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque por lo menos una porción del polipéptido de proteína F y el polipéptido de proteína G corresponde en secuencia a la cepa larga de RSV A o a la cepa de RSV A2.
15. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido quimérico comprende adicionalmente una etiqueta de polihistidina.
16.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 11 y 13 o una subsecuencia de las mismas.
17.- El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la subsecuencia omite los residuos de aminoácidos 1-23 de la secuencia seleccionada.
18. - El polipéptido quimérico de RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido quimérico de RSV comprende por lo menos un epítope inmunodominante tanto de una proteína F de RSV como de una proteína G de RSV.
19. - Un antígeno recombinante de RSV que comprende un multímero de los polipéptidos quiméricos de RSV de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
20. - El antígeno recombinante de RSV de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el antígeno de RSV comprende un trímero de polipéptidos quiméricos.
21. - Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido quimérico de RSV de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y un portador o excipiente.
22. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el portador o excipiente es un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
23. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizada además porque el portador o excipiente comprende un tampón.
24. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizada además porque el portador o excipiente comprende por lo menos un componente que estabiliza la solubilidad, la estabilidad o ambas de la solubilidad y la estabilidad.
25. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante.
26. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el adyuvante es adecuado para ser administrable a un recién nacido.
27. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el adyuvante es capaz de potenciar una respuesta inmune en un humano de por lo menos 65 años de edad.
28. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-27, caracterizada además porque el adyuvante es un adyuvante derivador de Th1.
29. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el adyuvante es un ligando de TLR-4.
30. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho derivado del lípido A se elige de: 3D-MPL y cualquier derivado sintético del lípido A.
31. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-30, caracterizada además porque comprende adicionalmente un portador particulado.
32.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicho portador es alumbre.
33.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25-30, caracterizada además porque el adyuvante comprende una emulsión de aceite en agua.
34.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-33, para uso en medicina.
35.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-33, para su uso en la prevención o la reducción de la infección de RSV.
36.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 21-33, para el uso en la prevención o la reducción de una respuesta patológica causada por la infección de RSV.
37.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-33, caracterizada además porque comprende adicionalmente por lo menos un antígeno adicional de un organismo patógeno diferente de RSV.
38.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el organismo patógeno es un virus diferente de RSV.
39. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque el virus inmunogénico es el virus de la Parainfluenza (PIV).
40. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque el organismo patógeno se selecciona de: hepatitis B, influenza, difteria, tétanos, tosferina, Hemophilus influenza, poliovirus, y neumococo.
41.- Un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
42. - El ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido quimérico comprende por lo menos un codón que es optimizado para la expresión en una célula hospedadora seleccionada.
43. - Un vector que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 41 o de la reivindicación 42.
44. - El vector de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el vector comprende un vector de expresión procariótico o eucariótico.
45. - Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 41 o 42, o el vector de expresión de la reivindicación 44.
46. - La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque la célula hospedadora se selecciona del grupo de: células bacterianas, células de levadura, células de insectos, células vegetales y células de mamífero.
47.- El uso del polipéptido quimérico de RSV de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 41-44 en la preparación de un medicamento para tratar una infección de RSV.
48. - El uso del polipéptido quimérico de RSV o del ácido nucleico de la reivindicación 47, en donde el medicamento tiene el fin de tratar profilácticamente una infección de RSV.
49. - El uso de una composición que comprende el polipéptido quimérico de RSV de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la preparación de un medicamento para provocar una respuesta inmune contra el Virus Sincitial Respiratorio (RSV) en un sujeto.
50. - El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde el medicamento provoca una respuesta inmune específica para RSV sin potenciar la enfermedad vírica después del contacto con RSV.
51. - El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la respuesta inmune comprende una respuesta inmune del tipo Th1.
52. - El uso como se reclama en la reivindicación 50 o 51 , en donde la respuesta inmune comprende una respuesta inmune protectora que reduce o previene la infección con un RSV y/o reduce o previene una respuesta patológica después de la infección con un RSV.
53. - El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde el sujeto es un sujeto humano.
54. - El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por una vía intranasal.
55. - El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por una vía intramuscular.
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