JP2011528222A - キメラ呼吸器合胞体ウイルスポリペプチド抗原 - Google Patents

Abstract

キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ポリペプチド抗原が提供される。開示されるポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドのＦ１ドメインと切断されないように連結されたＦ２ドメインを含んでなる第一のアミノ酸配列と、免疫学的に優性なエピトープを含んでなるＲＳＶ付着（Ｇ）タンパク質ポリペプチドの一部を含んでなる第二のアミノ酸配列とを含む。本開示はまた、該キメラＲＳＶポリペプチドをコードする核酸、該キメラＲＳＶポリペプチドを含む医薬組成物、ならびにそれらの製造および使用のための方法も提供する。

Description

発明の背景

先行出願の相互参照
本願は、２００８年７月１８日出願の米国仮出願第６１／０８１，８８８号の先の出願日の利益を主張し、その開示は引用することにより本明細書の一部とされる。

３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（Ｅ）に従う著作権の通知
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発明の分野
本開示は免疫学の分野に関する。より詳しくは、本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に特異的な免疫応答を惹起するための組成物および方法に関する。

背景技術
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、月齢６か月未満の乳児および妊娠３５週以前の未熟児における下気道感染（ＬＲＩ）の、世界で最も多い原因である。ＲＳＶ疾患のスペクトルには、鼻炎および耳炎から肺炎および細気管支炎までの幅広い一連の呼吸器徴候が含まれ、後者の２つに疾患は相当な罹患率および死亡率を伴う。ヒトはＲＳＶの唯一の既知の保有者である。汚染された鼻腔分泌物からのウイルスの拡散は大きな呼吸器飛沫を介して起こり、伝染には感染個体または汚染された表面との密な接触が必要である。ＲＳＶは玩具またはその他の物品上で数時間存続でき、これにより、院内、特に小児科病棟でのＲＳＶ感染率が高いことが説明される。

ＲＳＶの世界の年間感染数および死亡数はそれぞれ６千４百万および１６万と推計される。米国では、ＲＳＶだけで、年間、１８，０００〜７５，０００人の入院、そして９０〜１９００人の死亡の原因となっていると見積もられる。温帯気候では、ＲＳＶが、毎年の冬に流行する、細気管支炎および肺炎を含む急性ＬＲＩの原因であることがよく述べられている。米国では、ほぼ全ての小児が、２歳までにＲＳＶに感染している。それ以外の点では健康な小児におけるＲＳＶ関連ＬＲＩの罹患率は、２歳までで年間小児１０００人当たり３７人（６か月未満の乳児では年間小児１０００人当たり４５人）および入院リスクは年間小児１０００人当たり６人（６か月未満の乳児では年間小児１０００人当たり１１人）として計算された。罹患率は心臓肺疾患を有する小児および未熟児で高く、米国のＲＳＶ関連入院のほぼ半数を占めている。ＲＳＶにより引き起こされるより重篤なＬＲＩを受けた小児はその後、小児喘息の発症率が高まる。重篤なＬＲＩおよびそれらの後遺症を持つ小児の医療費は大きく、ＲＳＶは、高齢者のインフルエンザ様疾患からの罹患の重要な原因としてますます認識されるようになっており、ＲＳＶにより引き起こされる疾患から保護することができる安全かつ有効なワクチンの必要性が強調されている。

本発明はキメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。キメラＲＳＶ抗原は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドのＦ１ドメインと切断されないように連結されたＦ２ドメインを含んでなる第一のアミノ酸配列と、免疫学的に優性なエピトープを含んでなるＲＳＶ付着（Ｇ）タンパク質ポリペプチドの一部を含んでなる第二のアミノ酸配列とを含む。この抗原は、対象に投与すると免疫応答を惹起し、ＲＳＶ感染の徴候を治療および／または予防するために使用することができる。また、該キメラ抗原をコードする核酸、該キメラ抗原を含む免疫原性組成物、および該キメラ抗原を製造および使用する方法に関する。

発明の具体的説明

導入
ＲＳＶ感染により引き起こされる徴候および後遺症から保護するワクチンの開発は、宿主の免疫応答がその疾病の病因に役割を果たしているようであるという事実により複雑化している。１９６０年代の初期の研究では、ホルマリンで不活性化されたＲＳＶワクチンを接種した小児が非接種対照被験者に比べて、次にウイルスに曝された際により重篤な疾患を患うことが示されている。これらの初期の治験は、ワクチン接種を受けた人の８０％の入院と２人の死者を出した。疾患の高い重篤度は動物モデルでも再現され、血清中和抗体の不十分なレベル、局部的免疫性の欠如、ならびに肺の好酸球増加とＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの産生の増大を伴う２型ヘルパーＴ細胞様（Ｔｈ２）免疫応答の過度な誘導から起こると思われる。これに対し、ＲＳＶ感染から保護する首尾よいワクチンは、ＩＬ−２およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の産生を特徴とするＴｈ１型の免疫応答を誘導する。

健康集団およびリスク集団で持続的かつ防御免疫応答を生じる安全かつ有効なＲＳＶワクチンを生産するために、死滅もしくは不活性化ウイルス、弱毒した生ウイルスおよび精製サブユニットアプローチを含む種々のアプローチが試みられてきた。しかしながら、これまでに評価された候補に、ＲＳＶ感染を予防する、および／またはＲＳＶ疾患を軽減もしくは予防する目的でワクチンの市販に至ったものは無い。１つのアプローチは、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質および付着（Ｇ）糖タンパク質の双方の成分を含む組換えキメラ抗原の生産に関する。キメラＲＳＶ抗原の例は米国特許第５，１９４，５９５号に開示されている。これらのキメラ構築物は、ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質の全細胞外ドメイン（すなわち、ＲＳＶ Ｆのアミノ酸残基１〜５２６、そしてＲＳＶ Ｇの６９〜２９８）を含んでいた。このキメラ抗原は動物モデル（例えば、マウス、コットンラット）において免疫応答を惹起したが、生産および安定性の難しさから市販用に加工することはできなかった。

本発明は、優れた免疫原性と優れた加工特性を有する新規なキメラＦＧポリペプチドに関する。これらの新規なキメラＲＳＶ抗原は、予防用ワクチンおよび治療用ワクチンとしての投与に好適な安全かつ有効なキメラＲＳＶ抗原を生産するために、これまでの試みで直面したいくつかの重大な欠点を克服する。

一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ１ドメインと切断されないように連結されたＦ２ドメインを含んでなる第一のアミノ酸配列と、（ｉｉ）免疫学的に優性なエピトープを含んでなるＧタンパク質ポリペプチドの一部を含む第二のアミノ酸配列とを含んでなるキメラポリペプチドを含む呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。典型的には、ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインとＦ１ドメインはアミノ酸リンカーによって切断されないように連結されている。Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインを分離可能とし、天然Ｆタンパク質の成熟およびアセンブリの際にｐｅｐ２７ペプチドの放出をもたらすフリン切断認識配列および／または部位を削除することにより切断できない様式で連結することができる。例えば、該キメラＲＳＶポリペプチドは、フリン切断部位を除去し、それによりキメラポリペプチドを切断できないようにする少なくとも１つのアミノ酸欠失または置換を含むことができる。例えば、１以上のアミノ酸（例えば、１０６番と１３３番の位置で）欠失させるか、または置換して切断不能のＦタンパク質を作出することができる。ある特定の例示的実施形態では、２つのアミノ酸（少なくとも１つのアルギニン、例えば、１０６番と１０７番の位置のアルギニンとアラニン、また、１３３番と１３４番の位置のアルギニンとリシンを含む）を欠失させるか、または置換することができる。

所望により、発現および回収を助けるために、キメラＲＳＶポリペプチドはＮ末端にシグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドは、当技術分野で公知の多数のシグナルペプチドの中から選択することができ、一般には、キメラポリペプチドの組換え発現向けに選択された系における生産およびプロセシングを助長（増強または最大化）するように選択される。シグナルペプチドは通常、アミノ酸１８〜２５個の範囲の長さである。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドはＲＳＶ Ｆタンパク質に由来し、例えば、配列番号２のアミノ酸残基１〜２３である。Ｆ２ドメインは天然Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基２４〜１０５を含み得る。シグナルペプチドとＦ２ドメインとの間の厳密なアミノ酸限界は１以上のアミノ酸で異なり得る（実際には、ＲＳＶ Ｆタンパク質から選択されたシグナルペプチドの場合には、このような限界は任意である）。例示的実施形態では、Ｆ１ドメインは、Ｆ１ドメインの細胞外部分の本質的に全て、例えば、天然Ｆタンパク質ポリペプチドの残基１３７〜残基５２８を含む。上記で示したように、Ｆ２およびＦ１ドメインは、アミノ酸リンカー配列によって、切断されないように連結させることができる。本明細書に開示されているキメラＦＧポリペプチドに関して好適な多くのアミノ酸リンカーが当業者に知られている。例示的実施形態では、該リンカーは配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列から選択される。

Ｆポリペプチド配列は、ＲＳＶ Ｇタンパク質ポリペプチドの一部とフレーム内で連結される。Ｇタンパク質の一部は、生産特性を改良するように選択される（例えば、全長Ｇタンパク質ポリペプチドと比べて）。このＧタンパク質の一部は、免疫学的に優性なエピトープ、特に、アミノ酸残基１８３〜２０３の間の免疫学的に優性なエピトープを保持するように選択される。例えば、ＲＳＶ Ｇタンパク質の一部はアミノ酸１５２〜２２９を含む。ある特定の例示的実施形態では、ＲＳＶ Ｇタンパク質の一部は、Ｇタンパク質のアミノ酸残基１４９〜２２９を含む。

Ｆ成分およびＧ成分の配列は、天然に存在するＦタンパク質配列およびＧタンパク質配列から選択することができ、単一の株または１を超える株に配列が相当するように選択することができる。例えば、Ｆ部分とＧ部分は同じ株に由来してもよいし、あるいはＦ部分とＧ部分はそれぞれ異なる株に由来してもよいし、あるいはＦ部分またはＧ部分またはその双方は、１を超える株に由来するアミノ酸に相当するハイブリッドであり得る。所望により、キメラＲＳＶポリペプチドは天然に存在するＲＳＶポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、モデル系においてワクチンにより増強されるウイルス性疾患の軽減または予防に関連しているアミノ酸置換などのアミノ酸置換をＧタンパク質部分に導入することができ、例えば、キメラポリペプチドはＧタンパク質の残基１９１のアラニン（Ｎ１９１Ａ）によるアスパラギンの置換を含み得る。

所望により、本明細書に開示されているキメラＲＳＶポリペプチドは、ポリヒスチジンタグ、あるいは組換え発現タンパク質の回収および／または精製を助長または促進するように設計された別のこのような配列を含み得る。

ある特定の例示的実施形態では、キメラＲＳＶポリペプチドは、配列番号１１もしくは１３またはその部分配列（例えば、アミノ酸１〜２３のシグナル配列を欠く、または違うシグナル配列の置換を有する、かつ／またはＣ末端ヒスチジンタグを欠く部分配列）から選択されるアミノ酸配列を有する。有利には、該キメラＲＳＶポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質双方の免疫優性エピトープを少なくとも１つ含む。

発現（例えば、および精製または単離）時、キメラＲＳＶポリペプチドは、天然Ｆタンパク質と免疫学的に類似するコンフォメーションを有する多量体へと組み立てられる。例えば、キメラＲＳＶポリペプチドは有利には三量体へと組み立てられる。

また、この開示には、担体または賦形剤とともに処方されたキメラＲＳＶポリペプチドのいずれかを含む免疫原性組成物が包含される。一般に、担体または賦形剤は、バッファーなどの薬学上許容される担体または賦形剤である。所望により、担体または賦形剤は、キメラＲＳＶポリペプチドの安定性、溶解度または安定性と溶解度の双方を高める付加的成分を含み得る。所望により、免疫原性組成物は、例えばＲＳＶにより誘発される疾患または徴候を予防、軽減または改善するためにその組成物の投与が意図される対象集団に投与するのに好適なアジュバントをさらに含んでなる。よって、アジュバントは、新生児、幼児または成人、例えば、少なくとも６５歳の成人に投与するように選択することができる。有利には、アジュバントは、Ｔｈ１偏向アジュバント(Th1-biasing adjuvant)である。ある特定の実施形態では、アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬなどのＴＬＲ−４リガンド、または脂質Ａの他の任意の合成誘導体である。所望により、免疫原性組成物はまた、ミョウバンなどの特定の担体を含んでもよい。ある特定の実施形態では、アジュバントはリポソームまたはエマルション、例えば、水中油型エマルションを含み得る。

免疫原性組成物は有利には、ヒトにおいて薬剤として用いるために、例えば、ヒト対象への投与後にＲＳＶによる感染を予防もしくは軽減するため、またはヒト対象への投与後にＲＳＶによる感染により引き起こされる病的応答を予防または軽減するために処方される。所望により、免疫原性組成物はまた、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの付加的抗原も含む。例えば、病原性生物は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび／またはポリオウイルスなどのＲＳＶ以外のウイルスであり得る。あるいは、病原性生物はジフテリア、破傷風、百日咳、好血性インフルエンザ(Hemophilus influenza）および／または肺炎球菌などの細菌であり得る。

本発明の別の態様は、本明細書で提供されるキメラポリペプチドのいずれかをコードする組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、該核酸は、選択された宿主細胞における発現のために至適化されたコドン（例えば、哺乳類細胞、酵母細胞、植物細胞などにおける発現のために至適化されたコドン）を持ったポリヌクレオチド配列を含む。場合によっては、該核酸は原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクター中に含まれる。このような核酸またはベクターが導入された細胞（すなわち、宿主細胞）も、本発明の１つの特徴である。該宿主細胞は細菌細胞であり得るが、より一般には、酵母細胞（例えば、ピッチア(picchia)）、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）などの真核細胞であろう。

キメラポリペプチドおよび核酸は、ＲＳＶ感染を処置する（例えば、予防的に）ための薬剤の製造において有用である。よって、本発明はまた、本明細書に開示されているキメラＲＳＶポリペプチドのいずれかを含有する、免疫学的に有効な量の組成物を投与することにより、ＲＳＶに対して免疫応答を惹起する方法も提供する。有利には、ヒト対象（新生児、幼児または小児または高齢者など）に投与した際に、該組成物はＲＳＶとの接触後にウイルス性疾患を増強することなく、ＲＳＶに特異的な免疫応答を惹起する。有利には、該組成物は、ＲＳＶによる感染を軽減もしくは予防する、かつ／またはＲＳＶによる感染後に病的応答を軽減もしくは予防する防御免疫応答を惹起する。一般に、該免疫応答はＴｈ１型サイトカインの産生を特徴とする免疫応答、例えば、Ｔｈ１型免疫応答を惹起する。

用語
反対の説明がない限り、本明細書で用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者によって一般に理解されているものと同じ意味を持つ。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press発行, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.発刊, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.発行, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出せる。

単数の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が反対のことを明確に示さない限り、複数の対象も含む。同様に、「または(or)」という用語は、文脈が反対のことを明確に示さない限り、「および(and)」を含むものとする。「複数」とは、２以上を表す。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される総ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに総ての分子量または分子質量値は概数であり、説明のために示される。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して示される数値限界も概数であるものとする。よって、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇであることが示される場合には、その濃度は少なくともおよそ（または「約」または「〜」）２００ｐｇであると理解されるものとする。

本明細書に記載されているものと類似または等価な方法および材料は本開示の実施または試験に使用可能であるが、以下に好適な方法および材料を記載する。「含んでなる」とは、「含む」を意味する。よって、文脈上そうでないという必要がない限り、「含んでなる(comprises)」ならびに「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprising)」という用語は、示された化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくは工程、または化合物群もしくは工程群を包含するが、他のいずれの化合物、組成物、工程またはそれらの群を排除しないことを意味する。省略形の「e.g.」は、「Latin exempli gratia」に由来し、本明細書では限定されない例を示して用いる。よって、省略形の「e.g.」は、「for example」という用語と同義である。

本開示の種々の実施形態の検証を助けるため、以下、用語を説明する。その他の用語および説明は本開示の文脈で示す。

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクスウイルス科肺炎ウイルス亜科肺炎ウイルス属の病原性ウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１１のタンパク質をコードする、１５，２２２ヌクレオチド長の一本鎖、ネガティブセンスＲＮＡ分子である。ＲＮＡゲノムとウイルスＮタンパク質との強固な会合は、ウイルスエンベロープ内部に包まれたヌクレオキャプシドを形成する。Ｇ糖タンパク質の抗原性の違いに基づき、Ａ群およびＢ群の２群のヒトＲＳＶ株が記載されている。これまでに多数のＲＳＶ株が単離されている。図４および５に、例示的な株がＧｅｎＢａｎｋおよび／またはＥＭＢＬ受託番号により示されている。さらなるＲＳＶ株も単離されると思われ、ＲＳＶ属に包含される。同様に、ＲＳＶ属には、遺伝的浮動または人工合成および／もしくは組換えにより天然から生じる変異体（例えば、これまでに同定された、または今後同定される株）も包含される。

「Ｆタンパク質」または「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質ポリペプチド」または「融合タンパク質ポリペプチド」とは、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「Ｇタンパク質」または「Ｇタンパク質ポリペプチド」とは、ＲＳＶ付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。多くのＲＳＶ融合タンパク質および付着タンパク質が記載されており、当業者に知られている。

本開示の理解を助けるために、ＲＳＶ Ｆおよび／またはＧタンパク質のアミノ酸残基位置に関して、総てのアミノ酸残基位置は、配列番号２の例示的Ｆタンパク質のアミノ酸位置および配列番号４の例示的Ｇタンパク質のアミノ酸位置を参照して示される（すなわち、アミノ酸残基位置は配列番号２の例示的Ｆタンパク質のアミノ酸位置および配列番号４の例示的Ｇタンパク質のアミノ酸位置に相当する）。しかしながら、いずれのＲＳＶ Ａ株またはＢ株からの匹敵するアミノ酸を使用してもよい。他のいずれのＲＳＶ Ａ株またはＢ株の匹敵するアミノ酸位置も、容易に入手できる周知のアライメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ、例えば、デフォルトパラメーターを使用）を用いて、選択されたＲＳＶ株と配列番号２のアミノ酸配列をアラインすることにより、当業者によって容易に決定することができる。多くの株からの例示的ＦおよびＧタンパク質配列がＷＯ２００８１１４１４９に示されており、そのいずれを本明細書に開示されているキメラＦＧタンパク質に関して用いてもよい。ＷＯ２００８１１４１４９は、キメラＧタンパク質において用いるのに好適なＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質の配列を開示する目的で、引用することにより本明細書の一部とされる。

「キメラＦＧポリペプチド」または「ＦＧ抗原」または「ＦＧポリペプチド抗原」は、一般にＲＳＶ Ｆタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質の双方の抗原決定基またはエピトープを含むポリペプチド成分を組み込んだキメラポリペプチドである。本開示に関して、キメラＦＧポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｆ１ドメインと切断されないように連結されたＦ２ドメインを含む第一のアミノ酸配列と、免疫学的に優性なエピトープを含むＲＳＶ Ｇタンパク質の一部を含む第二のアミノ酸配列とを含む。サブユニットおよびドメインという用語は、Ｆタンパク質および／またはＦ０ポリペプチドの構造ドメインに関して互換的に用いられる。本明細書においてキメラとは、Ｆタンパク質成分とＧタンパク質成分が双方とも同じ血清型または株に由来するポリペプチド、ならびにＦタンパク質成分およびＧタンパク質成分が異なる血清型または株に由来するポリペプチドを含む。

核酸またはタンパク質（例えば、ＲＳＶ ＦもしくはＧタンパク質もしくはタンパク質ドメイン、またはＦＧキメラポリペプチド）に関して「変異体」は、参照核酸またはタンパク質とは異なる核酸またはポリペプチドである。通常、変異体と参照核酸またはタンパク質の間の違いは、参照と比べた場合に比較的少数の違いからなる。このような違いはアミノ酸付加、欠失または置換であり得る。よって、変異体は一般に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のせいぜい約１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけが異なる。よって、ＲＳＶ ＦもしくはＧタンパク質、またはキメラＦＧポリペプチドに関して変異体は、一般に、参照タンパク質、例えば、配列番号２および４に示されている参照配列、または本明細書に開示されているいずれかの例示的ＦＧポリペプチドと少なくとも８０％、または８５％、より一般には少なくとも約９０％以上、例えば、９５％またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。本開示の特徴として含まれるさらなる変異体は、例えばＷＯ２００８１１４１４９に示されている例示的配列のいずれかに由来する（同じ株でも異なる株でもよい）Ｆ２成分（例えば、配列番号２とのアライメントにより数値的に示されるアミノ酸２４〜１０５の全部または一部を含んでなる）および／またはＦ１成分（例えば、配列番号２とのアライメントにより数値的に示されるアミノ酸１３７〜５２８の全部または一部を含んでなる）と、例えばＷＯ２００８１１４１４９に示されている例示的配列のいずれかから選択されるＧタンパク質成分（例えば、配列番号４とのアライメントにより数値的に示されるアミノ酸１４９〜２２９の全部または一部）を組み込んだキメラＦＧポリペプチドである。変異体は遺伝的浮動により生じる場合もあるし、あるいは部位指定もしくはランダム突然変異誘発を用いて、または２つ以上の既存の変異体の組換えによって人工的に作出することもできる。例えば、変異体ＦＧポリペプチドは、配列番号１１および１３の例示的ＦＧキメラと比べて１または２または５または１０または１５または５０個のアミノ酸の違いか、あるいは例えば配列番号１０および１２などの例示的ＦＧキメラ核酸と比べて約１００個までのヌクレオチドの違いを含み得る。

ポリペプチドまたはタンパク質の「ドメイン」は、そのポリペプチドまたはタンパク質内の構造的に定義された要素である。本開示に関して「フリン切断ドメイン」とは、フリンプロテアーゼによる前駆体ポリペプチドの切断により定義されるドメインである。例えば、Ｆタンパク質は、Ｆ０と呼ばれる単一のポリペプチドとして合成される。このＦ０ポリペプチドは次に、フリンプロテアーゼにより、コンセンサスフリン認識モチーフにおいて切断され、Ｆ２およびＦ１と呼ばれる２つの構造的に独立したポリペプチド単位を生じる。Ｆ２は、アミノ酸２４（シグナルペプチドの後）から第一の（Ｎ末端からＣ末端の方向に）フリン切断認識部位にわたる。Ｆ１は、第二のフリン切断部位からＦ０ポリペプチドのＣ末端にわたる。本開示に関してＦ１とはまた、Ｆ１ドメインの細胞外部分（例えば、アミノ酸１３７〜５２８）を含むＦ０ポリペプチドの一部を指しても用いられる。

「天然」および「天然に存在する」とは、それが天然にあるのに同じ状態で存在するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸などの要素を意味する。すなわち、この要素は人工的に改変されたものではない。本開示に関して、例えば、種々の天然に存在する株またはＲＳＶの単離物から得られたＲＳＶタンパク質またはポリペプチドの多くの天然／天然に存在する変異体が存在すると理解される。

「ポリペプチド」とは、単量体がアミド結合によって連結されているアミノ酸残基である。本明細書において「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、任意のアミノ酸配列を包含するものとし、糖タンパク質などの修飾配列を含む。「ポリペプチド」とは、特に、天然に存在するタンパク質ならびに組換えまたは合成生産されたものを包含する。ポリペプチドに関して「断片」とは、ポリペプチドの一部（すなわち、部分配列）を意味する。「免疫原性断片」とは、全長参照タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの優性免疫エピトープを保持するポリペプチドのあらゆる断片を意味する。ポリペプチド内での配向は一般に、Ｎ末端からＣ末端の方向に示され、個々のアミノ酸のアミノ部分およびカルボキシ部分の配向により定義される。ポリペプチドはＮ末端またはアミノ末端からＣ末端またはカルボキシ末端に向かって翻訳される。

「シグナルペプチド」は、新たに合成される分泌型タンパク質または膜タンパク質の、例えば小胞体の膜からの出入りを命令する短いアミノ酸配列（例えば、およそ１８〜２５アミノ酸長）である。シグナルペプチドは、普遍的ではないが多くの場合、ポリペプチドのＮ末端に位置し、多くの場合、タンパク質が膜を通過した後にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナル配列は一般に、Ｎ末端極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水核および親水性領域（ｃ−領域）の、３つの共通する構造的特徴を含む。

「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」とは、少なくとも１０塩基長の、重合形態のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチドの修飾形態であり得る。この用語は一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡを含む。「単離されたポリヌクレオチド」とは、由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてそれが直接連続する両方のコード配列（１つは５’末端、１つは３’末端）とは直接連続しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態において、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’および３’配向は、個々のヌクレオチド単位の接続性に関して定義され、デオキシリボース（またはリボース）糖環の炭素の位置によって示される。ポリヌクレオチド配列の情報（コード）内容は５’から３’方向に読み取られる。

「組換え」核酸とは、天然には存在しない配列を有するか、またはそうでなければ別個の２つの配列セグメントの人工的組合せにより作出される配列を有するものである。この人工的組合せは、化学合成よって、あるいはより一般には、例えば遺伝子工学技術などの単離された核酸セグメントの操作によって行うことができる。「組換え」タンパク質は、細菌または真核細胞などの宿主細胞に導入された異種（例えば、組換え）核酸によりコードされているものである。この核酸は、導入された核酸によりコードされているタンパク質を発現することができるシグナルを有する発現ベクターに導入することもできるし、あるいはこの核酸は宿主細胞染色体に組み込むこともできる。

「精製」（例えば、病原体または病原体を含む組成物に関して）とは、組成物からその存在が望まれない成分を除去するプロセスを意味する。精製は相対的な言葉であり、必ずしも、望まれない成分の総ての痕跡を組成物から除去する必要はない。ワクチン生産に関しては、精製は、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製または沈殿などのプロセスを含む。よって、「精製された」とは、絶対的な純粋を必要とするのではなく、相対的な言葉として意図される。よって、例えば、精製された核酸調製物は、特定のタンパク質が、その核酸がその生成環境、例えば、細胞内または生化学反応チャンバー内にある場合よりも富化されているものである。実質的に純粋な核酸またはタンパク質の調製物は、所望の核酸がその調製物の全核酸含量の少なくとも５０％を示すように精製することができる。ある特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、その調製物の全核酸またはタンパク質含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％またはそれ以上を占める。

「単離された」生体成分（核酸分子、タンパク質またはオルガネラなど）は、その成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生体成分、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびにオルガネラから実質的に分離または精製されたものである。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語にはまた、宿主細胞での組換え発現により製造された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含される。

「抗原」は、動物において抗体の産生および／またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質であり、動物に注射、吸収またはそうでなければ導入された組成物を含む。「抗原」とは、総ての関連する抗原エピトープを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。「免疫学的に優性な」エピトープとは、機能的に重要な宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答が生じるエピトープである。よって、病原体に対する防御免疫応答に関して、免疫学的に優性なエピトープは、宿主の免疫系により認識される場合に、その病原体により引き起こされる疾患からの防御をもたらす抗原部分である。「Ｔ細胞エピトープ」とは、適当なＭＨＣ分子と結合した際に、Ｔ細胞により（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープを意味する。「Ｂ細胞エピトープ」とは、抗体（またはＢ細胞受容体分子）により特異的に結合されるエピトープである。

「アジュバント」とは、非特異的に免疫応答の生成を増強する薬剤である。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液、油中水および水中油型エマルション（二重エマルションおよび可逆的エマルションを含むその変種）を含むエマルション、リポ糖類、リポ多糖類、免疫刺激性核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）、リポソーム、Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、およびこのような成分の種々の組合せが挙げられる。

「免疫原性組成物」とは、例えばＲＳＶなどの病原体に対して特異的免疫応答を惹起することができる、ヒトまたは動物対象への投与に好適なものの組成物である。免疫原性組成物はそれ自体、１以上の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）または抗原エピトープを含む。免疫原性組成物はまた、賦形剤、担体および／またはアジュバントなどの免疫応答を惹起または増強し得る１以上の付加的成分を含むことができる。ある特定の場合では、免疫原性組成物は、病原体により引き起こされる徴候または症状から対象を保護する免疫応答を惹起するために投与される。場合によっては、病原体により引き起こされる徴候または症状は、対象の病原体曝露の後に病原体（例えばＲＳＶ）の複製を阻害することにより予防（または軽減または改善）される。本開示に関して、免疫原性組成物は、ＲＳＶに対して防御的または待期的免疫応答を惹起する目的で対象または対象集団へ投与することが意図される組成物（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）を包含するものと理解される。

「免疫応答」とは、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系細胞の応答である。免疫応答は、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の産生をもたらすＢ細胞応答であり得る。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であり得る。場合によっては、この応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的」応答）。抗原が病原体に由来する場合には、この抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」とは、病原体の有害な機能または活性を阻害する免疫応答であり、病原体による感染を軽減するか、または病原体による感染から生じる徴候（死を含む）を低減する。防御免疫応答は例えば、プラーク減少アッセイ(plaque reduction assay)もしくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製またはプラーク形成の阻害により、またはin vivoにおいて病原体投与に対する耐性を測定することにより測定することができる。

「Ｔｈ１」型免疫応答は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞を特徴的とする。これに対し、「Ｔｈ２」型の免疫応答、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞を特徴とする。

「免疫学的に有効な量」は、対象において免疫応答を惹起するために用いられる組成物（一般に、免疫原性組成物）の量である。一般に、求められる結果は、病原体から対象を保護することができる、または保護することに寄与する抗原（例えば病原体）特異的免疫応答の生成である。しかしながら、病原体に対して防御免疫応答を得るには、免疫原性組成物を何回も投与する必要のある場合がある。よって、本開示において、免疫学的に有効な量には、防御免疫応答を獲得するための、それまでの投与またはその後の投与と組み合わさって寄与する分割用量を包含する。

形容句の「薬学上許容される」とは、その対象物が対象（例えば、ヒトまたは動物対象）への投与に好適であることを示す。Remington’s Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第15版 (1975)には、免疫原性組成物を含む治療用および／または予防用組成物の医薬送達に好適な組成物および処方物（希釈剤を含む）が記載されている。

免疫応答などの応答に関して「調整する」とは、その応答の開始、大きさ、持続期間または特徴を変化または変動させることを意味する。免疫応答を調整する薬剤は、その投与後の免疫応答の開始、大きさ、持続期間または特徴の少なくとも１つを変化させるか、あるいは参照薬剤と比べてその開始、大きさ、持続期間または特徴の少なくとも１つを変化させる。

「軽減する」とは相対的な言葉であり、従って、薬剤の投与後に応答または症状が量的に少なくなるか、または薬剤の投与後に参照薬剤に比べてそれが少なくなれば、薬剤はその応答または症状を軽減するといえる。同様に、「予防する」という用語も、その応答または症状の少なくとも１つの特徴が少なくなる限り、薬剤がその応答または症状を必ずしも完全に消失させることを意味するのではない。よって、病的応答、例えば、ワクチンにより増強されるウイルス性疾患などの感染または応答を軽減または予防する免疫原性組成物は、そのような感染または応答を完全に消失させる場合もあるが、その感染または応答が、測定可能に、例えば、薬剤の不在下での、または参照薬剤と比較しての感染または応答の、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％または約８０％またはさらには約９０％少なくなる（すなわち、１０％以下）限り、必ずしも完全に消失させなくてもよい。

「対象」は、生きている多細胞脊椎動物である。本開示において、対象は、例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、コットンラット、または非ヒト霊長類などの実験対象であり得る。あるいは、対象はヒト対象であり得る。

ＦＧキメラＲＳＶ抗原
ＲＳＶのウイルスエンベロープは、ウイルスにコードされているＦ、ＧおよびＳＨ糖タンパク質を含む。ＦおよびＧ糖タンパク質は、ＲＳＶ特異的中和抗体を誘導することが知られているＲＳＶビリオンのただ２つの成分である。本明細書に開示されているキメラＦＧポリペプチドは、天然Ｆタンパク質の構造的特徴を組み込むと同時に、ＲＳＶ Ｇタンパク質の重要な免疫優性エピトープを示すように設計される。

ＲＳＶの天然Ｆタンパク質は、Ｆ０と呼ばれる単一のポリペプチド前駆体として翻訳される。Ｆ０は折りたたまれ、タンパク質分解およびその他の翻訳後修飾を受ける。まず、シグナルペプチド（Ｓｐ）は未完成ポリペプチドの翻訳を小胞体（ＥＲ）に向け、その後、シグナルペプチダーゼにより切断される。次に、未完成ポリペプチドは、配列番号２の例示的Ｆポリペプチド配列のアミノ酸２７番、７０番および５００番の３つの部位でＲＥがＮグリコシル化される。フリン切断によりＦ２およびＦ１が生じ、ヘテロ二量体の三量体（Ｆ２−Ｆ１×３）として一緒に折りたたまれる。フリンは、前駆体タンパク質を対合した塩基性アミノ酸プロセシング部位において効率的に切断することができるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。一般に、このようなプロセシング部位は塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）を含む。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１０６〜１０９と１３３〜１３６の位置に２つのフリン認識部位を含む。ＲＡＲ／ＫＲ^１０９（ＦＣＳ−２）とＫＫＲＫＲＲ^１３６（ＦＣＳ−１）の２つの保存されたフリンコンセンサス配列におけるフリンプロテアーゼによる、天然に存在する成熟Ｆ０ポリペプチドのタンパク質分解性切断の結果、３つのタンパク質分解断片が生じる。Ｎ末端に疎水性の融合ペプチドを含む大きな膜固定サブユニットＦ１（アミノ酸１３７〜５７４に相当）が、小サブユニットＦ２（アミノ酸２４〜１０５に相当）にジスルフィド橋を介して結合されており、もともとこの２つの切断部位にあった２７個のアミノ酸からなる小ペプチド（ｐｅｐ２７）が遊離する。当業者ならば、略号Ｆ０、Ｆ１およびＦ２は科学文献では一般にＦ_０、Ｆ_１およびＦ_２と記載されることが分かるであろう。ＲＳＶ Ｆタンパク質のフリンプロセシングの説明は、当技術分野で認められている用語の定義とともに、Zimmer et al. "Proteolytic activation of Respiratory Syncytial Virus fusion protein." J Biol. Chem. 276:31642-31650, 2001、およびZimmer et al, "Cleavage at the furin consensus sequence RAR/KR109 and presence of the intervening peptide of the Respiratory Syncytial Virus fusion protein are dispensable for virus replication in cell culture." J Virol. 76:9218-9224, 2002に見出せる。このタンパク質は、Ｃ末端領域において白い菱形（ＴＭ）で示されるそのトランスメンブランヘリックスを用いて膜に固定される。さらに、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１５個のシステイン残基、４つの同定されている中和エピトープ、２つのコイルドコイル領域および脂質化モチーフを特徴とする。

天然Ｇタンパク質は、そのトランスメンブラン疎水性領域（アミノ酸４１〜６３）によってビリオン膜に固定されている２９８アミノ酸のタンパク質である。アミノ酸６５〜２９８は、ＲＳＶの表面に露出しているＧタンパク質の一部を含む。各末端には、高Ｏ−グリコシル化ムチン様領域が存在する。これらの２つの領域には、５つのＮ−グリコシル化モチーフも存在する。グリコシル化されていない中央部は、１）構造データが入手可能な、Ｇの唯一の部分であるシステインヌース(cysteine noose)（ａａ１７３〜１９０）、２）ａａ１８３〜２０３の免疫優性ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、および３）宿主細胞表面へのウイルス付着のプロセスに関連づけられているケモカインフラクタルカイン受容体（Ｃ３ＸＣＲ）およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合モチーフを含む、数個の重要な構造モチーフを含む。

本発明は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）ＲＳＶ Ｆタンパク質のＦ１ドメインと連結されたＦ２ドメインを含む第一のアミノ酸配列と、（ｉｉ）ＲＳＶ Ｇタンパクの一部を含む第二のアミノ酸配列を含むキメラＲＳＶポリペプチドに関する。生成中の折りたたみと組み立てを助けるために、天然Ｆタンパク質配列は、内部フリン認識部位を削除し、フリン切断が妨げられるように改変される。フリン切断部位は、アミノ酸残基１０６〜１０９および／または１３３〜１３６の領域における１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換により破壊することができる。例えば、フリン認識部位は、フリン切断部位を破壊する、１または２個のアミノ酸（例えば、１０６番と１０７番の位置のアルギニンとアラニン、および１３３番と１３４番の位置のアルギニンとライシン）の欠失により削除することができる。従って、発現および組み立ての際に、キメラポリペプチドのＦ２およびＦ１部分は、単一の、切断可能のポリペプチドのまま残る。

Ｆタンパク質のＦ２およびＦ１ドメインの選択においては、当業者ならば、必ずしも完全なＦ２および／またはＦ１ドメインを含む必要はないことが分かるであろう。一般に、Ｆ２ドメインの部分配列（または断片）を選択する場合には、コンフォメーション的観点が重要である。従って、Ｆ２ドメインは一般に、キメラポリペプチドの組み立ておよび安定性を助けるＦ２ドメイン部分を含む。ある特定の例示的変型では、Ｆ２ドメインは、アミノ酸２４〜１０５を含む。所望により、Ｆ２ドメインは、天然Ｆ０ポリペプチドのシグナルペプチド（例えば、アミノ酸１〜２３）を含むことができる。

一般に、Ｆ１ドメインの少なくとも部分配列（または断片）は、Ｆタンパク質の免疫優性エピトープを含む安定なコンフォメーションを維持するように選択および設計される。例えば、一般に、アミノ酸２６２〜２７５（パリビズマブ(palivizumab)中和）および４２３〜４３６（Ｃｅｎｔｏｃｏｒのｃｈ１０１Ｆ ＭＡｂ）の領域に中和抗体により認識されるエピトープを含むＦ１ポリペプチドドメインの部分配列を選択することが望ましい。さらに、例えばアミノ酸３２８〜３５５の領域にＴ細胞エピトープを含むのが望ましい。しかし、より一般には、エピトープは、Ｆ１サブユニットの１つの連続する部分（例えば、アミノ酸２６２〜４３６にわたる）として、これらの免疫優性エピトープを安定なコンフォメーションに組み立てられた不連続の要素として含む合成配列中に保持させることもできる。よって、Ｆ１ドメインポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくともほぼアミノ酸２６２〜４３６を含んでなる。本明細書に示される１つの限定されない例では、Ｆ１ドメインは、天然Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１３７〜５２８を含んでなる（しかしながら、例えば、アミノ酸残基１５１またはアミノ酸１６１で始まるか、または５２４番で終わる断片など、やや小さい断片を使用することもできる）。当業者ならば、従事者の判断でさらなる短い部分配列を使用することができることが分かる。

折りたたみおよび組み立てを助け、コンフォメーショナルエピトープの保持を最大限とするために、これら２つのＦタンパク質ドメインの間にアミノ酸リンカーを導入する。長さおよび構造の特性が異なる多くのリンカーが当業者に知られている。本明細書に開示されているキメラＲＳＶポリペプチドに関しては、このようなリンカーの多くが使用可能である。例えば、実施形態に示されているようにＶ１−１およびＶ１−２と呼ばれる、単純なグリシンリッチリピート配列がリンカーとして遊離に用いられる。ＦＧ Ｖ１−１では、単純なグリシンおよびセリンリピート配列がリンカーとして用いられる。ＦＧ Ｖ １−２の変種としては、グリコシル化部位を含むように適合されたグリシン／セリンリンカーが含まれる。特定の例示的グリシン／セリンリンカー配列は、それぞれ配列番号５および６に示されている。あるいは、より複雑な構造特性を有するリンカーも使用可能である。ある特定の実施形態では、リンカーは、天然Ｆタンパク質から選択される。例えば、ある特定の好都合な実施形態では、リンカーは、実施例により示されているようにＶ２−１およびＶ２−２と呼ばれる、ｐｅｐ２７配列の全部または一部に配列が相当する。このようなリンカーを用いる場合、例えば、グリコシル化などの構造的または機能的特徴を改変するための長さが異なる場合がある。ｐｅｐ２７に基づくリンカーの２つの例示的変種が配列番号７および８に示されている。

Ｇタンパク質ポリペプチド成分は、免疫学的に優性なまたは免疫優性Ｔ細胞エピトープを、例えば、アミノ酸１８３〜１９７の領域に保持するＧタンパク質の部分（または部分配列もしくは断片）を含むように選択される。例示的変異体は、例えば、アミノ酸１５２、１５１、１５０、１４９、１４８などからアミノ酸２２６、２２７、２２８、２２９、２３０などまでを含むＧタンパク質の部分配列または断片を含む。所望により、天然Ｇタンパク質のより大きな断片（例えば、アミノ酸残基１２８〜２２９または１３０〜２３０を含む断片）も置換可能である。当業者ならば、Ｇタンパク質のより大きなまたはより小さな部分も、その選択された部分がキメラＦＧポリペプチドの発現、折りたたみまたはプロセシングをコンフォメーション的に不安定化または混乱させない限り、使用可能であることが容易に分かる。所望により、Ｇタンパク質ドメインは、これまでにホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンに関連する好酸球増加を特徴とする疾患の増強の軽減および／または予防と関連づけられている１９１番の位置にアミノ酸置換を含む。天然および置換（Ｎ１９１Ａ）Ｇタンパク質の特性に関する詳しい説明は、例えば、目的を問わず、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許公報第２００５／００４２２３０号に見出せる。

所望であれば、アンカーモチーフまたはニューラルネットもしくは多項式解法などの当技術分野で公知の他の方法（例えば、RANKPEP (the world wide webにてmif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.htmlで入手可能); ProPredI (the world wide webにてimtech.res.in/raghava/propredI/index.htmlで入手可能); Bimas (the world wide webにてwww-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.htmlで入手可能);およびSYFPEITH (the world wide webにてsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htmで入手可能)を用いて、さらなるＴ細胞エピトープを特定することもできる。例えば、ペプチドの「結合閾値」を決定するため、また、ある特定の親和性においてそれら高い確率のＭＨＣまたは抗体結合を与えるスコアを有するものを選択するためのアルゴリズムが使用される。これらのアルゴリズムは、特定の位置における特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する影響、特定の位置における特定のアミノ酸の抗体結合に対する影響、またはモチーフを含むペプチドにおける特定の置換の結合に対する影響のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの範囲内で、「保存残基」とは、ペプチドの特定の位置におけるランダム分布により推定されるものよりも有意に高い頻度で見られるものである。アンカー残基は、ＭＨＣ分子との接触点を提供する、保存残基である。このような推定法により同定されたＴ細胞エピトープは、それらの、特定のＭＨＣタンパク質との結合を測定することにより、また、ＭＨＣタンパク質に関して示される場合には、それらのＴ細胞刺激能により確認することができる。

例示的実施形態が配列番号１１および１３に示されているが、当業者ならば、余分な実験を行わずとも、他の多くの実施形態を作出することができる。当業者には、いずれのＲＳＶ Ｆおよび／またはＧタンパク質配列でも組換えキメラＲＳＶ ＦＧポリペプチドの構築に使用可能であることが自明である。ウイルスエンベロープと標的細胞膜の融合を担うＦタンパク質の配列は、ＲＳＶ単離物の中でも保存性が高い。これに対し、ウイルス付着を担うＧタンパク質の配列は、比較的変動がある。異なるタンパク質間の属性とバリエーションを示すＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質配列のアライメントがＷＯ２００８１１４１４９に示されている。保存領域と可変領域はこれらのアライメントから容易に明らかになる。

例えば、一実施形態において、Ｆ２ドメイン（例えば、参照Ｆタンパク質配列のアミノ酸２４〜１０５に相当）は、配列番号５、６、７または８から選択されるリンカーにより、Ｆ１ドメイン（例えば、参照Ｆタンパク質配列のアミノ酸１３７〜５２８に相当）と切断されないように連結され、Ｇタンパク質のアミノ酸１８３〜２０３（例えば、参照Ｆタンパク質配列のほぼ１４９番に相当するアミノ酸からほぼ２２９番に相当するアミノ酸まで、例えば、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２番の位置から２２６、２２７、２２８、２２９または２３０番の位置まで）により示される免疫優性エピトープを含むＧタンパク質ドメインとフレーム内で連結される。Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは同じＦタンパク質ポリペプチド、例えば、配列番号２などの天然Ｆタンパク質から選択されるＦタンパク質ポリペプチド、または他のいずれかの例示的Ｆタンパク質ポリペプチド（例えば、ＷＯ２００８１１４１４９に開示されているもの）から選択することができる。あるいは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは異なる天然Ｆタンパク質ポリペプチドから選択することもできる。あるいは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの一方または双方を、本明細書において変異体に関しての考察でより詳しく示されているように改変することもできる。同様に、Ｇタンパク質ドメインは、配列番号４から、またはＷＯ２００８１１４１４９に開示されている変異体のいずれかから選択することができる。

他の例示的実施形態として、１以上のアミノ酸の欠失を有する変異体がある。より短い断片が望まれる場合にも、やはり、本明細書に記載されるように、キメラポリペプチドの成分の構造的および免疫学的に重要な特徴を保持する部分が選択される。あるいは、変異体は付加的なアミノ酸を含むこともできる。例えば、変異体は精製を助ける付加的アミノ酸（例えば、ポリヒスチジンタグ）を含むことができる。

それに加えて、またはその代わりに、開示されているキメラＦＧ ポリペプチドのいずれかに対して、選択された発現系で産生される場合、キメラポリペプチドの発現および安定性を改良するための改変を行うこともできる。例えば、真核生物構築物は一般に、発現系に対応するシグナルペプチドを含むように設計され、例えば、哺乳類細胞でキメラポリペプチドを発現させる場合には、有利にはＲＳＶ Ｆ０天然シグナル配列などの哺乳類またはウイルスシグナルペプチドが選択される。あるいは、昆虫細胞での発現のためには、シグナルペプチド（バキュロウイルスシグナルペプチドまたはメリチンシグナルペプチドを置換することができる。植物発現系が好ましい場合には、好適な植物シグナルペプチドが当技術分野で公知である。本明細書に開示されているキメラＦＧポリペプチドに関して用いるのに好適な例示的シグナルペプチドとしては、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＤタンパク質、ヒトエンドスタチン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＣＤ３３、サイトメガロウイルスｇＢタンパク質、ヒトＨｅｒ２Ｎｅｕ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３５０およびTan et al. , Protein Eng. 15:337-45のシグナルペプチドが挙げられる。

ある特定の実施形態では、キメラＦＧポリペプチドは、グリコシル化のパターンまたは状態を変化させるように改変される（例えば、天然Ｆタンパク質ポリペプチド中に存在する１以上のグリコシル化部位においてグリコシル化された分子の産生を増加または低下させることによる）。例えば、配列番号２の天然Ｆタンパク質ポリペプチドは、アミノ酸２７番、７０番および５００番の位置でグリコシル化されていると推定される。一実施形態では、改変はアミノ酸５００番のグリコシル化部位の付近に導入される。例えば、グリコシル化部位は、参照Ｆタンパク質配列（配列番号２）の５００番に相当する位置におけるアスパラギンの代わりにグルタミン（Ｑ）など、アミノ酸を置換することによって除去することができる。有利には、このグリコシル化部位におけるグリコシル化効率を増大させる改変が導入される。好適な改変の例には、５００〜５０２番の位置における以下のアミノ酸配列ＮＧＳ、ＮＫＳ、ＮＧＴ、ＮＫＴが含まれる。グリコシル化の増大をもたらすこのグリコシル化部位の改変はまた、実質的に高いタンパク質産生ももたらし得る。

キメラＦＧポリペプチド抗原をコードする核酸
本発明の別の態様は、上記のキメラＦＧポリペプチドをコードする組換え核酸に関する。この組換え核酸は、５’から３’の方向に、（１）ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチドフリン切断ドメイン２（Ｆ２ドメイン）の少なくとも一部または断片をコードするポリヌクレオチド配列；（２）アミノ酸リンカーをコードするポリヌクレオチド配列；（３）ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチドフリン切断ドメイン１（Ｆ１ドメイン）の少なくとも一部または断片をコードするポリヌクレオチド配列；および（４）ＲＳＶ Ｇタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部または断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。成分ポリヌクレオチド配列は、上記で開示されたように、コードされているポリペプチドセグメントが単一の連続したキメラポリペプチドとして産生されるように連結される。

ある特定の実施形態では、この組換え核酸は、Ｆ２ドメイン（例えば、参照Ｆタンパク質配列のアミノ酸２４〜１０５に相当）が、配列番号５、６、７または８のいずれかから選択されるリンカーにより、Ｆ１ドメイン（例えば、参照Ｆタンパク質配列のアミノ酸１３７〜５２８に相当）と切断されないように連結され、Ｇタンパク質のアミノ酸１８３〜２０３（例えば、参照Ｆタンパク質配列のほぼ１４９番に相当するアミノ酸からほぼ２２９番に相当するアミノ酸まで、例えば、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２番の位置から２２６、２２７、２２８、２２９または２３０番の位置まで）により示される免疫優性エピトープを含むＧタンパク質ドメインとフレーム内で連結されているキメラＦＧポリペプチドをコードする。Ｆ２ドメインおよびＦ１ドメインをコードするポリヌクレオチドは同じＦタンパク質ポリペプチド、例えば、配列番号２のものなどの天然に存在するＦタンパク質から選択されるＦタンパク質ポリペプチド（例えば、配列番号１）、または他のいずれかの例示的Ｆタンパク質ポリペプチド（例えば、ＷＯ２００８１１４１４９に開示されているもの）をコードするものから選択することができる。あるいは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインは異なる天然Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするように選択することもできる。あるいは、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの一方または双方をコードするポリヌクレオチドは、本明細書において変異体に関しての考察でより詳しく示されているようにポリペプチドを改変するため（例えば、２７番、７０番および／または５００番の位置のグリコシル化部位を改変するため）に、１以上の突然変異（例えば、ヌクレオチドの付加、欠失または置換）を含むこともできる。同様に、Ｇタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４から、またはＷＯ２００８１１４１４９に開示されている変異体のいずれかから選択することができる。

ある特定の実施形態では、この組換え核酸は、選択された原核生物または真核生物宿主細胞、例えば、哺乳類、植物または昆虫細胞での発現のために至適化されたコドンである。複製および発現を助けるために、これらの核酸を原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。本明細書に開示されている核酸は、多様なベクター（例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他多くのものとの組合せに由来するベクター）のいずれのものにも組み込むことができるが、最も一般的には、ベクターはポリペプチド発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、ＦＧキメラをコードする核酸は一般に、ｍＲＮＡ合成を指令するために適当な転写制御配列（プロモーター、および所望により、１以上のエンハンサー）に近接し、かつ、配向して配置される。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は適当な転写制御配列と機能的に連結される。このようなプロモーターの例としては、ＣＭＶの前初期プロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、バキュロウイルスのポリへドロンプロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰ_Ｌプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞において遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターまたはそれらのウイルスが挙げられる。発現ベクターはまた一般に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。該ベクターは所望により、発現を増幅するのに適当な配列を含む。さらに、該発現ベクターは所望により、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性など、または大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を手今日するための１以上の選択マーカー遺伝子を含んでなる。

発現ベクターはまた、例えば、翻訳の効率を向上させるための付加的な発現エレメントを含むこともできる。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る。場合によっては、例えば、翻訳開始コドンおよび関連配列エレメントは、目的のポリヌクレオチド配列（例えば、天然開始コドン）と同時に適当な発現ベクターに挿入される。場合によっては、付加的翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、ポリペプチドコード配列またはその一部だけを挿入する場合には、キメラＦＧ配列の発現のためにＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供される。開始コドンは、目的のポリヌクレオチド配列の翻訳を確保するのに適正なリーディングフレームに置かれる。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成双方の種々の起源のものであり得る。

所望であれば、発現の効率は、使用において細胞系に適当なエンハンサーを含めることによってさらに増強することができる(Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter et al (1987) Methods in Enzvmol 153:516-544)。場合によっては、ＦＧポリペプチドをコードする核酸（ベクターなど）は、宿主細胞に導入された際に、ＦＧをコードする核酸の発現を増強および／または至適化するように選択された１以上の付加的配列エレメントを含む。１つの発現増強配列種は、マトリックス付着領域（またはＭＡＲ）などの後成的エレメント、または類似の後成的エレメント、例えばＳＴＡＲエレメント（例えば、Otte et al, Biotechnol. Prog. 23:801-807, 2007などのＳＴＡＲエレメント）を含む。特定の理論に縛られるものではないが、ＭＡＲは、標的ＤＮＡ配列の核マトリックスへの固定を媒介すると考えられており、異質染色質核から外へ延びるクロマチンループドメインを形成する。ＭＡＲは明らかなコンセンサス配列または認識可能な配列を含まないが、それらの最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含量と一方の鎖に優勢なＣ塩基であると思われる。これらの領域は、鎖が分離しやすい屈曲した二次構造を形成すると思われ、鎖の分離のための核形成点として働き得る核巻き戻しエレメント(core- unwinding element)（ＣＵＥ）を含み得る。いくつかの単純なＡＴリッチ配列モチーフがＭＡＲ配列、例えば、Ａ−ボックス（ＡＡＴＡＡＡＹＡＡＡ）、Ｔ−ボックス（ＴＴＷＴＷＴＴＷＴＴ）、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ（ＡＡＴＡＴＡＴＴ、ＡＡＴＡＴＴ）、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ−ボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）および脊椎動物（ＲＮＹＮＮＣＮＮＧＹＮＧＫＴＮＹＮＹ）またはショウジョウバエ（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）のコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位と組み合わされている。例示的ＭＡＲ配列は公開米国特許出願第２００７０１７８４６９号および国際特許出願第ＷＯ０２／０７４９６９（これらは引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。ＦＧポリペプチドをコードする核酸の発現を増強するために使用可能なさらなるＭＡＲ配列としては、Girod et al, Nature Methods, 4:747-753, 2007に記載されているニワトリリゾチームＭＡＲ、ＭＡＲｐ１−４２、ＭＡＲｐ１−６、ＭＡＲｐ１−６８およびＭＡＲｐｘ−２９（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡ４２３３０６、ＤＩ１０７０３０、ＤＩ１０６１９６、ＤＩ１０７５６１およびＤＩ１０６５１２で開示されている）。当業者ならば、ＭＡＲ１−９に関して報告されているように、発現は中間レベルの増強をもたらすＭＡＲを選択することによってさらに調整することができると分かるであろう。所望であれば、例えば、ＦＧポリペプチドの発現を増強するための別のＭＡＲ配列を、例えば、ＭＡＲ−ファインダー（ウェブのfuturesoft.org/MarFinderで入手可能）、ＳＭＡＲＴｅｓｔ（ウェブのgenomatix.deで入手可能）、またはＳＭＡＲＳｃａｎ Ｉ(Levitsky et al, Bioinformatics 15:582-592, 1999)などのソフトウエアを用い、配列データベースを検索することにより同定することができる。ある特定の実施形態では、ＭＡＲは、ＦＧポリペプチドをコードする配列と同じ核酸（例えば、ベクター）で宿主細胞に導入（例えば、トランスフェクト）される。別の実施形態では、ＭＡＲは、別個の核酸で（例えば、トランスで）導入され、それを所望によりＦＧ核酸とともに組み込むことができる。

組換えＦＧ核酸の生産の際に当業者に指針を与えるに十分な例示的手順は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (および2003までの増補);およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 第４版, Wiley & Sons, 1999に見出せる。

キメラＦＧポリペプチドをコードする例示的核酸は、配列番号１０および１２に示されている。さらなる変異体は、例えば図４および５に示されているような、既知または（今後）発見されるＲＳＶ株のいずれかから選択される類似体Ｆ２、Ｆ１およびＧタンパク質ポリペプチド配列を組み立てることによって作製することができる。例示的変異体と配列同一性を持つさらなる配列変異体も当業者により作製することができる。一般に、核酸変異体はせいぜい１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基だけで異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされているポリペプチドは少なくとも８０％または８５％、より一般的には少なくとも約９０％以上、例えば９５％、またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。当業者ならば、ＦＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は遺伝コードの縮重のためにそれら自体、配列同一性は低い場合があることがすぐに理解できるであろう。

当業者ならば、ポリペプチドおよびヌクレオチド配列についてのキメラＦＧポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列の間の類似性は一般に、そうでなければ配列同一性と呼ばれる配列間の類似性として表すことができることが理解できるであろう。配列同一性は多くの場合、同一性（または類似性）パーセンテージとして評価され、パーセンテージが高いほど、その２つの配列の一次構造の類似性が高い。一般に、２つのアミノ酸（またはポリヌクレオチド）の一次構造の類似性が高いほど、折りたたみおよび組み立てからもたらされるより高次の構造の類似性が高い。キメラＦＧポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の変異体は１つまたは少数のアミノ酸欠失、付加または置換を持ち得るが、やはり、それらのアミノ酸、一般にはそれらのポリヌクレオチド配列の極めて高いパーセンテージを共有する。

配列同一性を決定する方法は当技術分野でよく知られている。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al, Nucleic Acids Research 16:10881, 1988;およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アラインメント法および相同性算出の詳細な検討を提供している。配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに用いるためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD)を含むいくつかのソースから、またインターネットで入手できる。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定すればよいかという説明は、インターネットにてＮＣＢＩのウェブサイトで入手できる。

２つの核酸間の配列類似性のもう１つの指標がハイブリダイズ能である。２つの核酸配列の類似性が高いほど、それらがハイブリダイズする条件のストリンジェンシーが高い。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列に依存し、環境パラメーターが違えば異なる。従って、特にストリンジェンシーの程度を左右するハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって異なる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ^＋および／またはＭｇ^＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄回数もストリンジェンシーに影響を及ぼす。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔ_ｎは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である（所定のイオン強度およびｐＨ下）。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの算出は、例えば、Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993およびAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 第４版, John Wiley & Sons, Inc., 1999に見出せる。

本開示の目的では、「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間の不一致が２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「ストリンジェント条件」は、より厳密な定義の特定のストリンジェンシーレベルに分解することができる。よって、本明細書において、「中程度(moderate)ストリンジェンシー」条件とは、２５％を超える配列不一致を有する分子はハイブリダイズしない条件であり、「中(medium)ストリンジェンシー」条件とは、１５％を超える不一致を有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件とは、１０％を超える不一致を有する配列がハイブリダイズしない条件である。「極めて高いストリンジェンシー」条件とは、６％を超える不一致を有する分子がハイブリダイズしない条件である。これに対し、「低ストリンジェンシー」条件下でハイブリダイズする核酸は、はるかに低い配列同一性を有するもの、または核酸の短い部分配列にのみ配列同一性を有するものが含まれる。従って、この開示により包含される核酸の種々の変異体は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、６７または６９の少なくとも１つと、実質的にそれらの全長にわたってハイブリダイズすることができる。

キメラＲＳＶ抗原ポリペプチドの生産方法
本明細書に開示されているキメラＦＧポリペプチドは、組換えタンパク質の発現および精製に関して十分に確立された手順を用いて生産される。当業者に指針を与えるに十分な手順は、例えば、先に引用したSambrook and the Ausubelの参照文献に見出せる。さらなる、また、具体的な詳細を以下に示す。

上記のキメラＦＧ ＲＳＶ抗原のいずれかをコードする組換え核酸、例えば（限定されるものではないが）、配列番号１０および１２で示される例示的核酸は、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、感染、トランスフェクションなどの様々な周知の手順のいずれかによって、宿主細胞に導入される。

よって、組換えキメラＦＧポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞もまた本開示の特徴である。好ましい宿主細胞としては、例えば大腸菌などの原核生物（すなわち細菌）宿主細胞、ならびに真菌（例えば酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピッチア・パストリス(Picchia pastoris)）細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）を含む多くの真核生物宿主細胞が挙げられる。組換えＦＧ核酸は、例えば、発現ベクターなどのベクターを介して宿主細胞に導入（例えば、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される。上記のように、ベクターは最も一般的にはプラスミドであるが、このようなベクターは例えばウイルス粒子、ファージなどであってもよい。適当な発現宿主の例としては、大腸菌(E. coli)、放線菌(streptomyces)およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびアカパンカビ(Neurospora crassa)などの真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)およびヨトウガ(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３またはＢｏｗｅｓメラノーマなどの哺乳類細胞；藻類細胞を含む植物細胞などが挙げられる。

これらの宿主細胞は、適当であれば、プロモーターを活性化する、形質転換体を選択する、または挿入されたポリヌクレオチド配列を増幅するよう改変された慣例の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は一般に、発現のために選択された宿主細胞で事前に用いられたものであり、当業者には、本明細書に引用されている参照文献、例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 第３版, Wiley-Liss, New Yorkおよびそこに引用されている参照文献を参照すれば明らかになる。本発明の核酸に相当する発現産物はまた、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞で産生させることもできる。Sambrook, Berger and Ausubelの他、細胞培養に関する詳細はPayne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (編) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)およびAtlas and Parks (編) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに見出せる。

細菌系において、発現産物に意図される使用に応じていくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体生産のために多量のポリペプチドまたはその断片が必要な場合は、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターを用いるのが有利である。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ(Stratagene)（この場合、目的のコード配列、例えば、上記のような本発明のポリヌクレオチドを、ベクター中の、触媒的に活性なβガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生するβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端翻訳開始メチオニンとそれに続く７残基の配列とフレーム内で連結することができる）；ｐＩＮベクター(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509)；ｐＥＴベクター(Novagen, Madison WI)（この場合、アミノ末端メチオニンをヒスチジンタグとフレーム内で連結する）などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。

同様に、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含む多くのベクターが、所望の発現産物の生産のために使用可能である。総説としては、Berger, Ausubelおよび例えばGrant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544)を参照。哺乳類宿主細胞では、プラスミド系およびウイルス系の双方を含むいくつかの発現系が使用可能である。

宿主細胞は、所望により、挿入配列の発現を調整する、または発現タンパク質を所望の様式でプロセシングする、その能力に関して選択される。タンパク質のこのような修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化（ならびに、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が挙げられる。例えば前駆形態をそのタンパク質の成熟形態へと切断する翻訳後プロセシング（例えば、フリンプロテアーゼによる）が所望により宿主細胞に関して行われる。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの種々の宿主細胞がこのような翻訳後活性に特異的な細胞機構および特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確保するために選択することができる。

本明細書に開示されている核酸によりコードされている組換えキメラＦＧポリペプチドの長期、高収率生産のためには、一般に安定な発現系が用いられる。例えば、キメラＦＧポリペプチドを安定発現する細胞系統は、ウイルス起源の複製または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞に導入される。ベクターの導入後、細胞を富化培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖と回収が可能となる。例えば、耐性群、すなわち安定して形質転換された細胞のコロニーを、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。キメラＦＧポリペプチドをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は所望により、コードされているタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養する。

好適な宿主細胞系統の形質導入を行い、それらの宿主細胞を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。その後、分泌されたポリペプチド産物を培養培地から回収する。あるいは、細胞を遠心分離により採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いた真核生物または微生物細胞は、冷凍−解凍サイクル、音波処理、機械的破砕または細胞溶解剤の使用、または当業者によく知られた他の方法を含む、通常のいずれかの方法によって破砕することができる。

発現したキメラＦＧポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本発明で示されているタグ系を使用）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野でよく知られたいくつかの方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。成熟タンパク質の立体配置を完成させる上で、所望であれば、タンパク質再折りたたみ工程を使用することができる。最後に、最終精製工程で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。上記の参照文献に加え、例えば、Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.;およびBollag et al. (1996) Protein Methods. 第２版 Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 第３版Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley- VCH, NY;およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJに示されているものなどを含む精製方法が当技術分野でよく知られている。

ある特定の例では、該核酸は原核細胞、例えば大腸菌細胞における導入および発現に好適なベクターに導入される。例えば、ＦＧキメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、ｐＥＴ系の発現ベクター（例えば、ｐＥＴ１９ｂおよびｐＥＴ２１ｄ）などの種々の市販または専売ベクターのいずれかに導入することができる。コード配列の発現はＩＰＴＧにより誘導可能であり、高レベルのタンパク質発現が生じる。キメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモーター下で転写される。また、熱誘導型λｐＬプロモーターを含むｐＵＲＶ２２などの別のベクターも好適である。

該発現ベクターを好適な細菌宿主に導入する（例えば、エレクトロポレーションによる）。多くの好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者ならば選択することができる（例えば、ＲｏｓｅｔｔａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ＦＧキメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターの発現に有利であることが分かっている）。

別の例では、キメラＦＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入するのに好適なベクターにクローニングする。この例示的実施形態では、キメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を、Lonza Biologicals firmにより開発されたｐＥＥ１４ベクターに導入する。キメラポリペプチドを構成プロモーターである前初期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター下で発現させる。キメラを発現する安定トランスフェクト細胞の選択は、トランスフェクト細胞がグルタミン源の不在下で増殖する能力に基づいて行う。ｐＥＥ１４が上手く組み込まれた細胞は、ｐＥＥ１４ベクターがＧＳ（グルタミンシンセターゼ）酵素を発現するので、外因性のグルタミンの不在下で増殖することができる。選択された細胞をクローン増殖させ、キメラポリペプチドの発現を同定する。

別の例では、ＦＧキメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞に導入する。昆虫細胞を感染させることができる組換えバキュロウイルスを、市販のベクター、キットおよび／または系、例えば、BD BioScienceからのＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系を用いて作製することができる。要するに、ＦＧキメラＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｃＳＧ２トランスファーベクターに挿入する。次に、宿主細胞ＳＦ９（ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)）を、ｐＡｃＳＧ２キメラ(pAcSG2-chimer)プラスミドと、バキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の線状化ゲノムＤＮＡを含むＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄとで同時トランスフェクトする。トランスフェクション後、ｐＡＣＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスを生じる。一例では、キメラＲＳＶ抗原はポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）の調節制御下で発現される。基本（Ｂａ）プロモーターおよびｐ１０プロモーターなどの他のプロモーターを用い、同様のトランスファーベクターを作製することができる。同様に、Ｓｆ９と近縁のＳＦ２１およびキャベツシャクトリムシ(cabbage looper) Trichoplusia niに由来するＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞系統などの別の昆虫細胞も使用可能である。

トランスフェクションおよび発現誘導（選択されたプロモーターおよび／またはエンハンサーまたはその他の調節エレメントによる）の後、発現されたキメラポリペプチドを回収し（例えば、精製または富化し）、抗原的に有効なコンフォメーションへと確実に折りたたまれるように変性させる。一般に、抗原的に活性なコンフォメーションはキメラＦＧポリペプチドの多量体である。有利には、多量体は三量体である。

免疫原性組成物および方法
また、キメラＦＧポリペプチドおよび薬学上許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む免疫原性組成物も提供される。多くの薬学上許容される希釈剤および担体および／または薬学上許容される賦形剤は当技術分野で公知であり、Remington 's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第１５版(1975)に記載されている。

一般に、希釈剤、担体および／または賦形剤の性質は、用いる特定の投与様式によって異なる。例えば、非経口処方物は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロースまたはグリセロールなどの薬学上および生理学上許容される流体を含む注射可能な流体を含む。ある特定の処方物（例えば、粉末形態などの固体組成物）では、液体希釈剤は用いられない。このような処方物では、例えば、製薬級のトレハロース、マンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含む無毒な固体担体を使用することができる。

よって、好適な賦形剤および担体は、選択された投与経路により対象に送達するのに好適な処方物を形成するように当業者により選択可能である。

特定の例を表１に示す。さらなる賦形剤としては、限定されるものではないが、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガラス形成ポリオール（ソルビトール、トレハロースなど）、Ｎ−ラウロイルサルコシン（例えば、ナトリウム塩）、Ｌ−プロリン、非洗剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、酸化トリメチルアミン、ＫＣｌ、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｚｎ^２＋（およびその他の二価陽イオン関連塩）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトロール、β−メルカプトエタノール、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、および臭化セチルトリメチルアンモニウムが挙げられる。

ある特定の有利な例では、疫原性組成物はまたアジュバントも含む。キメラＦＧポリペプチドを含有する免疫原性組成物に用いるのに好適なアジュバントは、本明細書に開示されているＦＧ抗原と組み合わせて、対象に投与した際に安全かつ最小の反応原性であるアジュバントである。

ＦＧキメラ抗原と組み合わせて用いるのに好適な１つのアジュバントは、無毒な細菌リポ多糖誘導体である。脂質Ａの好適な無毒な誘導体の一例が、モノホスホリル脂質Ａまたはより詳しくは３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によりＭＰＬの名称で販売されており、文献にはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬとして示されている。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号参照。３Ｄ−ＭＰＬは主としてＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導し、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）の表現型を伴う。３Ｄ−ＭＰＬはＧＢ２２２０２１１ Ａに開示されている方法に従って生産することができる。これは化学的には、３、４、５または６つのアシル化鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用することができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターで濾過除菌できるような粒径を有する。このような調製物はＷＯ９４／２１２９２に記載されている。

３Ｄ−ＭＰＬなどの該リポ多糖は、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの間の量で使用することができる。このような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇのレベル、例えば２０〜３０μｇの間、好適には２１〜２９μｇの間または２２〜２８μｇの間または２３〜２７μｇの間または２４〜２６μｇの間、または２５μｇで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、３Ｄ−ＭＰＬを約１０μｇのレベル、例えば５〜１５μｇの間、好適には６〜１４μｇの間、例えば７〜１３μｇの間または８〜１２μｇの間または９〜１１μｇの間、または１０μｇで含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、３Ｄ−ＭＰＬを約５μｇのレベル、例えば１〜９μｇの間、または２〜８μｇの間または好適には３〜７μｇの間または４〜 μｇの間、または５μｇで含んでなる。

他の実施形態では、リポ多糖類は、米国特許第６，００５，０９９号および欧州特許第０７２９４７３ Ｂ１号に記載されているようなβ（１−６）グルコサミン二糖であり得る。当業者ならば、これらの参照文献の教示に基づき、３Ｄ−ＭＰＬなどの種々のリポ多糖類を生産することができる。これらの各参照文献もやはり、引用することにより本明細書の一部とされる。上述の免疫刺激剤（ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと構造が類似する）の他、ＭＰＬの上記構造の一部であるアシル化単糖および二糖誘導体も好適なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは脂質Ａの合成誘導体であり、そのあるものはＴＬＲ−４アゴニストとして記載されており、限定されるものではないが、

ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル二水素ホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）、
ＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（ＷＯ９９／６４３０１およびＷＯ００／０４６２）、
ＯＭ１９７ＭＰ−Ａｃ ＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（ＷＯ０１／４６１２７）
が挙げられる。

使用可能な他のＴＬＲ４リガンドは、ＷＯ９８／５０３９９または米国特許第６，３０３，３４７号（ＡＧＰの製造方法も開示されている）に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、好適には、ＲＣ５２７またはＲＣ５２９または米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているようなＡＧＰの薬学上許容される塩である。いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、またいくつかはＴＬＲ４アンタゴニストである。双方ともアジュバントとして有用であると思われる。

ＴＬＲ−４を介してシグナル伝達応答を生じ得る(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)他の好適なＴＬＲ−４リガンドは、例えば、グラム陰性菌由来のリポ多糖およびその誘導体、またはその断片、特に、ＬＰＳ（３Ｄ−ＭＰＬなど）の無毒な誘導体である。他の好適なＴＬＲアゴニストとしては、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０；界面活性剤タンパク質Ａ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２、およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）がある。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストはＨＳＰ ６０、７０または９０である。他の好適なＴＬＲ−４リガンドはＷＯ２００３／０１１２２３およびＷＯ２００３／０９９１９５に記載されている通りであり、例えば、ＷＯ２００３／０１１２２３の第４〜５頁またはＷＯ２００３／０９９１９５の第３〜４頁に開示されている化合物Ｉ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ、特に、ＷＯ２００３／０１１２２３にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０およびＥＲ８０４７６４に開示されている化合物である。例えば、１つの好適なＴＬＲ−４リガンドはＥＲ８０４０５７である。

さらなるＴＬＲアゴニストもアジュバントとして有用である。「ＴＬＲアゴニスト」とは、直接的リガンドとして、または内因性もしくは外因性リガンドの生成によって間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介してシグナル伝達応答を生じ得る薬剤を意味する。このような天然または合成ＴＬＲアゴニストは、代替または付加的アジュバントとして使用可能である。アジュバント受容体としてのＴＬＲの役割の簡単な総説が、Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589: 1-13, 2002に示されている。これらの可能性のあるアジュバントとしては、限定されるものではないが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のアゴニストが挙げられる。よって、一実施形態において、アジュバントおよび免疫原性組成物は、ＴＬＲ−１アゴニスト、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−３アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−６アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、ＴＬＲ−８アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニストまたはその組合せからなる群から選択されるアジュバントをさらに含んでなる。

本発明の一実施形態では、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、トリアシル化リポペプチド（ＬＰ）；フェノール溶解性モジュリン；結核菌(Mycobacterium tuberculosis)ＬＰ；細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模倣するＳ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ三塩酸塩（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰおよびライム病ボレリア(Borrelia burgdorfei)由来のＯｓｐＡ ＬＰから選択される。

別の実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、結核菌(M tuberculosis)、ライム病ボレリア(B burgdorferi)または梅毒トレポネーマ(T pallidum)由来の１以上のリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌リポペプチド；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む種に由来するペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリア属のポーリン類、細菌線毛、エルシニア属(Yersina)病原因子、ＣＭＶビリオン、麻疹ヘマグルチニンおよび酵母由来のザイモサンである。

別の実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはウイルス感染に関連する分子核酸パターンであるポリイノシンポリシチジル酸（ポリＩＣ）である。

別の実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは細菌フラジェリンである。

別の実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化ＬＰおよびフェノール溶解性モジュリンである。さらなるＴＬＲ６アゴニストがＷＯ２００３／０４３５７２に記載されている。

別の実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、Ｎ７およびＣ８位のグアノシン類似体、またはイミダゾキノリン化合物、またはその誘導体である。一実施形態において、ＴＬＲアゴニストはイミキモドである。さらなるＴＬＲ７アゴニストがＷＯ２００２／０８５９０５に記載されている。

別の実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。好適には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）であり、レシキモドはまたＴＬＲ−７によっても認識され得る。使用可能な他のＴＬＲ−８アゴニストとしては、ＷＯ２００４／０７１４５９に記載されているものが挙げられる。

別の実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストが用いられる。一実施形態において、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストはＨＳＰ９０である。あるいは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を生じ得るＴＬＲアゴニストは、細菌またはウイルスＤＮＡ、ＣｐＧヌクレオチド、特に、ＣｐＧモチーフとして知られる配列構成を含むＤＮＡである。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドは主としてＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。好適には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物に用いるのに好適なオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧを含む、所望により、少なくとも３つ、好適には少なくとも６以上のヌクレオチドにより分離された２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧモチーフはシトシンヌクレオチドとそれに続くグアニンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般に、デオキシヌクレオチドである。特定の実施形態では、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間はスホロジチオエート、または好適にはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合および他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、本発明の範囲には、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを作出する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、同第５，２７８，３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。

キメラＦＧポリペプチドを伴う免疫原性組成物に、例えばそれら単独でまたは３Ｄ−ＭＰＬもしくは本明細書に記載の別のアジュバントと組み合わせて使用可能な他のアジュバントとしては、ＱＳ２１などのサポニンがある。

サポニンは、Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)に教示されている。サポニンは植物界および海洋動物界に広く分布しているステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンは、浸透すると発泡するコロイド水溶液を形成すること、コレステロールを沈殿させることが示されている。サポニンが細胞膜付近にあると、膜に穿孔様構造を作り、膜をバーストさせる。赤血球の溶血はこの現象の一例であり、総てではないがある種のサポニンの特性である。

サポニンは全身投与用のワクチンのアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血活性は当技術分野で鋭意研究されている(Lacaille-Dubois and Wagner, 前掲)。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの樹木キラジャ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する）およびその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号および"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55;およびＥＰ０３６２２７９ Ｂ１に記載されている。Ｑｕｉｌ Ａの画分を含んでなる免疫刺激複合体(Immune Stimulating Complexes)（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる特定の構造は溶血性があり、ワクチンの製造に用いられている（Morein, B., ０１０９９４２ Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１；ＷＯ９６／３３７３９）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は効力のある全身アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９ Ｂ１に開示されている。全身ワクチン接種研究に用いられている他のサポニンとしては、Gypsophila and Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992)などの他の植物種に由来するものが挙げられる。ＱＳ２１は、キラジャ・サポナリア・モリナ樹皮由来の、Ｈｐｌｃ精製された無毒な画分である。ＱＳ２１の生産方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。ＱＳ２１を含有する非反応原性アジュバント処方物はＷＯ９６／３３７３９に記載されている。上述の参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。ＱＳ２１などの免疫学的に活性なサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量で使用することができる。有利には、ＱＳ２１は、約２５μｇのレベル、例えば、２０〜３０μｇの間、好適には２１〜２９μｇの間または２２〜２８μｇの間または２３〜２７μｇの間または２４〜２６μｇの間または２５μｇで用いられる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、ＱＳ２１を、約１０μｇのレベル、例えば５〜１５μｇの間、好適には６〜１４μｇの間、例えば７〜１３μｇの間または８〜１２μｇの間または９〜１１μｇの間、または１０μｇで含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、ＱＳ２１を、約５μｇのレベル、例えば１〜９μｇの間、または２〜８μｇの間、または好適には３〜７μｇの間、または４〜６μｇの間、または５μｇで含んでなる。ＱＳ２１とコレステロールを含んでなるこのような処方物は、抗原とともに処方した場合に良好なＴｈ１刺激アジュバントとなることが示されている。よって、例えば、キメラＦＧポリペプチドは有利には、免疫原性組成物でＱＳ２１とコレステロールの組合せを含んでなるアジュバントとともに使用することができる。
所望により、アジュバントはまた、アルミニウムまたはカルシウム塩、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなどの無機塩を含むことができる。例えば、３Ｄ−ＭＰＬをアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムまたは「ミョウバン」）と組み合わせて含むアジュバントは、ヒト対象に投与するためのキメラＦＧポリペプチド含有免疫原性組成物の処方物に好適である。

キメラＦＧポリペプチドを含む処方物に用いるのに好適な、別種のＴｈ１偏向アジュバントとしては、ＯＭＰに基づく免疫刺激組成物が挙げられる。ＯＭＰに基づく免疫刺激組成物は、例えば鼻腔内投与のための粘膜アジュバントとして特に好適である。ＯＭＰに基づく免疫刺激組成物は、限定されるものではないが、ナイセリア種（例えば、Lowell et al, J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al, Science 240:800, 1988; Lynch et al, Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, "New Generation Vaccines" 第２版, Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, 193頁, 1997;米国特許第５，７２６，２９２号;米国特許第４，７０７，５４３号参照）などのグラム陰性菌に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ、数種のポーリンを含む）の一種の調製物であり、細菌またはウイルス抗原などの免疫原の担体または組成物として有用である。いくつかのＯＭＰに基づく免疫刺激組成物は「プロテオソーム」とも呼ぶことができ、疎水性であり、ヒト使用にとって安全である。プロテオソームは約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターへと自己組み立てする能力およびタンパク質抗原（Ａｇ）、特に、疎水性部分を有する抗原を非共有結合的に組み込む、配位する、結合する（例えば、静電気的にもしくは疎水的に）またはそうでなければ協働する能力を有する。多分子膜構造または１以上のＯＭＰの融解球状ＯＭＰ組成物を含む小胞または小胞様形態の外膜タンパク質成分をもたらすいずれの製造方法もプロテオソームの定義に含まれる。プロテオソームは、例えば当技術分野で記載されているように製造することができる（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号または同第５，９８５，２８４号参照）。プロテオソームはまた、ＯＭＰポーリンの生産に用いられる細菌（例えば、ナイセリア種）起源の内因性リポ多糖またはリポオリゴ糖（それぞれＬＰＳまたはＬＯＳ）を含み得る（一般に、全ＯＭＰ調製物の２％未満である）。

プロテオソームは主として、洗剤により溶液中で維持された髄膜炎菌(Neisseria menigitidis)から化学的に抽出された外膜タンパク質（ＯＭＰ）（ほとんどポーリンＡおよびＢならびにクラス４ ＯＭＰ）からなる(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS編, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。プロテオソームは、本明細書に開示されているキメラＦＧポリペプチドを含む、ウイルス源由来の精製（例えば、ダイアフィルトレーションまたは従来の透析法による）または組換えタンパク質などの種々の抗原とともに処方することができる。洗剤を段階的に除去することで、およそ１００〜２００ｎｍ径の粒状疎水性複合体が形成される(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS編, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。

本明細書において「プロテオソーム：ＬＰＳまたはプロトリン」とは、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫刺激組成物として働き得る）を提供するために少なくとも１種のリポ多糖と、例えば外から加えることにより混合したプロテオソームの調製物を意味する。よって、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、（１）髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)などのグラム陰性菌から調製されたプロテオソームの外膜タンパク質調製物（例えば、プロジュバント(Projuvant)）と、（２）１以上のリポ糖の調製物を含む、プロトリンの２つの基本成分からなり得る。リポオリゴ糖は内因性であってもよいし（例えば、ＯＭＰプロテオソーム調製物とともに天然に含まれる）、外因的に調製された（例えば、ＯＭＰ調製物とは異なる培養物または微生物から調製された）リポオリゴ糖由来のＯＭＰ調製物と混合または組み合わせてもよいし、あるいはその組合せであってもよい。このような外から加えられるＬＰＳは、そのＯＭＰ調製物が作られたものと同じグラム陰性細菌に由来してもよいし、あるいは異なるグラム陰性細菌に由来してもよい。プロトリンはまた、所望により、脂質、糖脂質、糖タンパク質または小分子など、およびその組合せを含んでもよいと理解すべきである。プロトリンは、例えば米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されているように製造することができる。

上述のもののような異なるアジュバントの組合せもまた、キメラＦＧポリペプチドを伴う組成物に使用することができる。例えば、すでに示したように、ＱＳ２１は３Ｄ−ＭＰＬとともに処方することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は一般に１：１０〜１０：１程度、例えば１：５〜５：１、多くの場合は実質的に１：１である。一般に、この比率は２．５：１〜１：１ ３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲である。別の組合せアジュバント処方物としては、３Ｄ−ＭＰＬとアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムを含む。組み合わせて処方する場合、この組合せは抗原特異的Ｔｈ１免疫応答を増強することができる。

場合によっては、アジュバント処方物は、リポソーム、水中油型エマルション、またはカルシウム塩もしくはアルミニウム塩などの無機塩、例えば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。
水中油型エマルションの一例は、水性担体中にスクアランなどの代謝可能な油、α−トコフェロールなどのトコール、およびポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０などの界面活性剤を含んでなり、付加的な免疫刺激剤を含まず、特に、それは無毒な脂質Ａ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）またはサポニン（ＱＳ２１など）を含まない。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。さらに、水中油型エマルションはスパン８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含み得る。

本発明の別の実施形態では、抗原または抗原組成物を含んでなるワクチン組成物と、水中油型エマルションおよび所望により１以上のさらなる免疫刺激剤を含んでなるアジュバント組成物を提供し、該水中油型エマルションは０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（好適には、スクアラン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（好適には、α−トコフェロール）および０．４〜４ｍｇの乳化剤を含んでなる。

１つの特定の実施形態では、アジュバント処方物は水中油型エマルションなどのエマルションの形態で製造された３Ｄ−ＭＰＬを含む。場合によっては、このエマルションは、ＷＯ９４／２１２９２に開示されているように０．２μｍ径未満の小粒径である。例えば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、０．２２ミクロンの膜で濾過除菌されるに十分小さいものであり得る（欧州特許第０６８９４５４号に記載の通り）。あるいは、３Ｄ−ＭＰＬはリポソーム処方物として製造することもできる。所望により、３Ｄ−ＭＰＬ（またはその誘導体）を含有するアジュバントはまた、付加的な免疫刺激成分も含む。

例えば、キメラＦＧポリペプチド抗原を伴う免疫原性組成物が幼児への投与のために処方される場合には、アジュバントの用量は幼児対象において有効で、かつ、比較的反応原性の無いように決定される。一般に、幼児処方物におけるアジュバントの用量は、成人（例えば、６５歳以上の成人）への投与のために設計された処方物で用いられるものよりも少ない。例えば、３Ｄ−ＭＰＬの量は一般に、用量当たり１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、または１０μｇ〜５０μｇの範囲である。幼児用量は一般にこの範囲の下端であり、例えば約１μｇ〜約５０μｇ、例えば約２μｇ、または約５μｇ、または約１０μｇ、約２５μｇまで、または約５０μｇまでである。一般に、ＱＳ２１が処方物に用いられる場合、それらの範囲は匹敵するものである（上記で示した比率に従う）。成人および高齢者では、処方物は一般に、幼児処方物に一般に見られるものよりも多いアジュバント成分を含む。特に、水中油型エマルションを用いる処方物では、このようなエマルションは、例えば、コレステロール、スクアラン、αトコフェロール、および／またはｔｗｅｅｎ ８０またはスパン８５などの洗剤のような付加的成分を含み得る。例示的処方物では、このような成分は、以下の量：約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアラン、２〜１０％のαトコフェロールおよび０．３〜３％のｔｗｅｅｎ ８０で存在し得る。一般に、スクアラン：αトコフェロールの比率は、これがより安定なエマルションを提供することから、１または１未満である。場合によっては、処方物は安定剤を含んでもよい。ミョウバンが例えば３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせて存在する場合、その量は一般に用量当たり約１００μｇ〜１ｍｇ、例えば約１００μｇ、または約２００μｇ〜約７５０μｇ、例えば約５００μｇである。

免疫原性組成物は一般に、免疫防御的量（またはその分割用量）の抗原を含み、慣例の技術によって製造することができる。ヒト対象への投与のためのものを含む免疫原性組成物の製造は一般に、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell and Newman編, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al.編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム内へのカプセル封入は、例えば、Fullertonにより米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。タンパク質の高分子へのコンジュゲーションは、例えば、Likhiteにより米国特許第４，３７２，９４５号およびArmor et al.により米国特許第４，４７４，７５７号に記載されている。

一般に、免疫原性組成物の各用量中のタンパク質の量は、典型的な対象において重大な有害副作用無く、免疫防御応答を誘導する量として選択される。これに関して免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味するのではなく、徴候または疾患、特にウイルスに関連する重篤な疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特定の免疫原を用いるかによって異なり得る。一般に、各ヒト用量は１ １０００μｇ、例えば約１μｇ〜約１００μｇ、例えば約１μｇ〜約５０μｇ、例えば約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇのタンパク質を含んでなると考えられる。免疫原性組成物に用いる量は、対象集団（例えば、幼児または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物に対する最適量は、抗体力価の所見および対象における他の応答を含む標準的な試験によって確認することができる。初回ワクチン接種の後、対象に約４週間以内に追加免疫を施すことができる。

実施例１：例示的キメラＲＳＶポリペプチド抗原
例示的真核生物ＦＧポリペプチド
例示的真核生物キメラＦＧ Ｖ１−１およびＦＧ Ｖ２−１を本開示に従って作製した。このような例示的ＦＧキメラの配列を配列番号１０および１１に示す。キメラＦＧポリペプチドはＦ０天然シグナル配列を含んでいた。シグナル配列を組み込むと、グリコシル化などの翻訳後修飾が増強される。これらの例示的実施形態では、双方のフリン認識モチーフを除去し、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインの間にリンカーを挿入した。ＦＧ Ｖ１−１およびＦＧ Ｖ２−１に存在するリンカーの配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。

この例示的組換えタンパク質を、ＧＳ発現系を用い、哺乳類チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現されるように設計した。グルタミン不含培地で増殖させたＣＨＯ細胞は最適な増殖に外因性のグルタミンを必要とする。ＣＨＯ細胞を、キメラＦＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むｐＥＥ１４ベクターでトランスフェクトした後、この系は、ｐＥＥ１４ベクターによるグルタミンシンターゼの発現のために、代謝欠乏を介した安定クローンの選択を可能とする。ここに記載される構築物はＣＨＯ細胞での発現のために作製されたものであるが、これらの構築物は同様に、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いた発現のためにも作製可能である。

実施例２：キメラＲＳＶポリペプチドによるヒト血清における中和阻害
ボランティアから得たヒト血清をＥＬＩＳＡによりＲＳＶ Ａに対する反応性に関してスクリーニングし、事前のＲＳＶ中和能滴定に基づき、適切な希釈で中和阻害（ＮＩ）アッセイに用いた。血清を２５μｇ／ｍｌ濃度の阻害タンパク質と混合し、３７℃で１．５〜２時間インキュベートした。丸底９６ウェルプレートにて、血清およびタンパク質を固定濃度のＲＳＶ Ａと混合し、３３℃で２０分間インキュベートした。その後、血清−阻害剤−ウイルスの混合物を、予めＶｅｒｏ細胞を播種した平底９６ウェルプレートに入れ、ＮＩ力価検出のための免疫蛍光アッセイまで、５％ＣＯ２下、３３℃でさらに５〜６日間インキュベートした。

Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて力価を計算し、ＮＩのパーセンテージを次のように計算した：［（２５μｇ／ｍｌ阻害剤のＮＩ力価−０μｇ／ｍｌ阻害剤のＮＩ力価）／０μｇ／ｍｌ阻害剤のＮＩ力価］×１００。

ＦＧ Ｖ１−１およびＦＧ Ｖ２−１を製造するために原型ＦＧ（ＦＧ Ｒｉｘ）に対して行った改変の模式図である。数字の１と２は、それぞれ、導入されたリンカーとＧタンパク質断片の位置を示す。 ＦＧ−Ｒｉｘと２例の新規改変型ＦＧキメラ（ＦＧ Ｖ１−１およびＦＧ Ｖ２−１と呼ばれる）の比較を示す配列アラインメントである。 図３ＡおよびＢは ＦＧ Ｖ１−１およびＦＧ Ｖ２−１によるヒト血漿の中和阻害を示す棒グラフである。

Claims (57)

1. Ｎ末端からＣ末端の方向に、
   （ｉ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質ポリペプチドのＦ１ドメインと切断されないように連結されたＦ２ドメインを含んでなる第一のアミノ酸配列と、
   （ｉｉ）免疫学的に優性なエピトープを含んでなるＲＳＶ付着（Ｇ）タンパク質ポリペプチドの一部を含んでなる第二のアミノ酸配列と
   を含んでなる、キメラＲＳＶポリペプチド。
2. ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ２ドメインとＦ１ドメインとがアミノ酸リンカーによって切断されないように連結されている、請求項１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
3. アミノ酸リンカーが、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の群から選択される、請求項２に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
4. 第一のアミノ酸配列が、フリン切断部位を除去する少なくとも１つのアミノ酸欠失または置換を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
5. 第一のアミノ酸配列が、ＲＳＶ Ｆタンパク質ポリペプチド１０６番と１３３番の位置にアミノ酸欠失を含んでなる、請求項４に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
6. シグナルペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
7. Ｆ２ドメインが、天然Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の残基２４〜１０５を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
8. Ｆ１ドメインが、天然Ｆタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の残基１３７〜５２８を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
9. ＲＳＶ Ｇタンパク質ポリペプチドの一部が、天然Ｇタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１８３〜２０３を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
10. ＲＳＶ Ｇタンパク質ポリペプチドの一部が、天然Ｇタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１５２〜２２９を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
11. ＲＳＶ Ｇタンパク質ポリペプチドの一部が、天然Ｇタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１４９〜２２９を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
12. キメラポリペプチドが、天然に存在するＲＳＶポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなり、そのアミノ酸置換がワクチンにより増強されるウイルス性疾患の軽減または予防に関連している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
13. キメラポリペプチドが、Ｇタンパク質の残基１９１におけるアラニンによるアスパラギンの置換（Ｎ１９１Ａ）を含んでなる、請求項１２に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
14. Ｆタンパク質ポリペプチドおよびＧタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部が、配列においてＲＳＶ Ａ Ｌｏｎｇ株またはＲＳＶ Ａ２株に相当する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
15. キメラポリペプチドが、ポリヒスチジンタグをさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
16. キメラポリペプチドが、配列番号１１および１３から選択されるアミノ酸配列またはその部分配列を含んでなる、請求項１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
17. 部分配列から選択配列のアミノ酸残基１〜２３が除かれた、請求項１６に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
18. ＲＳＶ Ｆタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質双方の免疫優性エピトープを少なくとも１つ含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチドの多量体を含んでなる、組換えＲＳＶ抗原。
20. ＲＳＶ抗原が、キメラポリペプチドの三量体を含んでなる、請求項１９に記載の組換えＲＳＶ抗原。
21. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチドと担体または賦形剤とを含んでなる、免疫原性組成物。
22. 担体または賦形剤が、薬学上許容される担体または賦形剤である、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
23. 担体または賦形剤がバッファーを含んでなる、請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物。
24. 担体または賦形剤が、溶解度、安定性または溶解度と安定性の双方を安定化させる少なくとも１つの成分を含んでなる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
25. アジュバントをさらに含んでなる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
26. アジュバントが、新生児への投与に好適である、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
27. アジュバントが、少なくとも６５歳のヒトにおいて免疫応答を増強し得る、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
28. アジュバントが、Ｔｈ１偏向アジュバントである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
29. アジュバントが、ＴＬＲ−４リガンドである、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
30. 脂質Ａ誘導体が、３Ｄ−ＭＰＬおよび脂質Ａの任意の合成誘導体から選択される、請求項２９に記載の免疫原性組成物。
31. 特定の担体をさらに含んでなる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
32. 前記担体がミョウバンである、請求項３１に記載の免疫原性組成物。
33. アジュバントが、水中油型エマルションを含んでなる、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
34. 薬剤として用いるための、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
35. ヒト対象への投与後のＲＳＶによる感染の予防または軽減に用いるための、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
36. ヒト対象への投与後にＲＳＶによる感染により引き起こされる病的応答の予防または軽減に用いるための、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
37. ヒト対象への投与後にＲＳＶによる感染を軽減または予防する、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
38. ヒト対象への投与後にＲＳＶによる感染により引き起こされる病的応答を軽減または予防する、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
39. ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つの付加的抗原をさらに含んでなる、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
40. 病原性生物が、ＲＳＶ以外のウイルスである、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
41. 免疫原性ウイルスが、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）である、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
42. 病原性生物が、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、好血性インフルエンザ、ポリオウイルスおよび肺炎球菌から選択される、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
43. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、組換え核酸。
44. キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、選択された宿主細胞における発現のために至適化された少なくとも１つのコドンを含んでなる、請求項４３に記載の組換え核酸。
45. 請求項４３または４４に記載の組換え核酸を含んでなる、ベクター。
46. 原核生物または真核生物発現ベクターを含んでなる、請求項４５に記載のベクター。
47. 請求項４３もしくは４４に記載の核酸、または請求項４６に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
48. 細菌細胞、 酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞から選択される、請求項４７に記載の宿主細胞。
49. ＲＳＶ感染を処置するための薬剤の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチドまたは請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の核酸の使用。
50. 薬剤が、ＲＳＶ感染を予防的に処置する目的で投与される、請求項４９に記載のキメラＲＳＶポリペプチドまたは核酸の使用。
51. 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対して免疫応答を惹起するための方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラＲＳＶポリペプチドを含んでなる、免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与する工程を含んでなる、方法。
52. キメラＲＳＶポリペプチドを含んでなる組成物の投与が、ＲＳＶとの接触後にウイルス性疾患を増強することなくＲＳＶに特異的な免疫応答を惹起する、請求項５１に記載の方法。
53. 免疫応答が、Ｔｈ１型免疫応答を含んでなる、請求項５２に記載の方法。
54. 免疫応答が、ＲＳＶによる感染を軽減もしくは予防する、および／またはＲＳＶによる感染後に病的応答を軽減もしくは予防する防御免疫応答を含んでなる、請求項５２または５３に記載の方法。
55. 対象がヒト対象である、請求項５１に記載の方法。
56. キメラＲＳＶポリペプチドを含んでなる組成物の投与が、鼻腔内経路による投与を含んでなる、請求項５１に記載の方法。
57. キメラＲＳＶポリペプチドを含んでなる組成物の投与が、筋肉内経路による投与を含んでなる、請求項５１に記載の方法。

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