KR20110045008A - 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩티드 항원 - Google Patents

키메라 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩티드 항원 Download PDF

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노르먼드 블라이스
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아이디 바이오메디컬 코포레이션 오브 퀘벡
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Abstract

키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 폴리펩티드 항원이 제공된다. 개시된 폴리펩티드는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 (F) 단백질 폴리펩티드의 F1 도메인에 절단불가능하게 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열; 및 면역학적으로 우세한 에피토프를 포함하는 RSV 부착 (G) 단백질 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서는 키메라 RSV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 키메라 RSV 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물, 뿐만 아니라 이들의 제조 및 사용 방법을 또한 제공한다.

Description

키메라 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩티드 항원{CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS POLYPEPTIDE ANTIGENS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008년 7월 18일에 출원된 US 가출원 번호 61/081,888을 우선권으로 청구하고, 이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
37 C.F.R. § 1.71(E)에 따른 저작권 통지
본 특허 문헌의 명세서의 일부분은 저작권의 보호를 받는 자료를 함유한다. 저작권자는, 특허 문헌 또는 특허 명세서가 특허청의 특허 파일 또는 기록에 나와 있는 바와 같이, 누군가가 특허 문헌 또는 특허 명세서를 원본 그대로 복사하는 것을 반대하지 않지만, 그렇지 않은 경우에는 어떠한 것이든 모든 저작권을 보유한다.
기술 분야
본 명세서는 면역학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 명세서는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 대해 특이적인 면역 응답을 유발하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
배경기술
인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 6개월 미만의 영아 및 임신 35주 이하의 미숙아에서 하부 기도 감염 (LRI)의 전세계적으로 가장 통상적인 원인이다. RSV 질환 스펙트럼에는 비염 및 이염에서부터 폐렴 및 기관지염까지의 광범위한 호흡기 증상들이 포함되는데, 후자의 2가지 질환은 상당한 이환율 및 사망률과 관련된다. 인간은 RSV에 대한 유일하게 공지된 병원소이다. 오염된 코 분비물로부터의 바이러스의 확산은 대형 호흡기 비말을 통해 일어나고, 따라서 감염된 개체 또는 오염된 표면과의 근접한 접촉이 전파에 요구된다. RSV는 장남감 또는 기타 물품 상에서 수 시간 동안 지속될 수 있고, 이는, 특히 소아과 병동에서의, 병원내 RSV 감염의 높은 비율을 설명한다.
RSV에 대한 세계적인 연간 감염 및 사망률 수치는 각각 6천4백만명 및 160,000명인 것으로 추정된다. 미국에서만, RSV는 매년 18,000명 내지 75,000명의 입원 및 90명 내지 1900명의 사망을 초래하는 것으로 추정된다. 온대성 기후에서, RSV가 기관지염 및 폐렴이 포함되는 매년 겨울 유행하는 급성 LRI의 원인으로서 잘 보도되어 있다. 미국에서, 2세까지 거의 모든 아동이 RSV에 감염된 적이 있다. 다른 면에서는 건강한 아동에서의 RSV-관련 LRI의 발생률은 생후 2년까지의 아동 1000명 당 37명 (6개월령 미만의 영아에서는 1000명 당 45명)으로, 입원 위험은 아동 1000명 당 6명 (생후 6개월 이내의 아동 1000명 당 11명)으로 계산되었다. 발생률은 심폐 질환이 있는 아동, 및 미숙아에서 더 높고, 이들은 미국에서 RSV-관련 입원의 거의 절반을 구성한다. 나중에 RSV에 의해 야기되는 더욱 중증의 LRI를 겪는 아동은 아동 천식의 발생률이 증가되었다. 중증 LRI에 걸린 아동 및 이들의 후유증을 관리하는 비용이 상당하고, 또한 점점 RSV가 노인에서의 인플루엔자-유사 질병으로부터의 이환율의 중요한 원인으로서 인식되어, RSV-유도 질환에 대해 보호할 수 있는 안전하고 효과적인 백신에 대한 요구를 강조하고 있다.
발명의 개요
본 명세서는 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항원에 관한 것이다. 이러한 키메라 RSV 항원은, N-말단에서 C-말단 방향으로, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 (F) 단백질 폴리펩티드의 F1 도메인에 절단불가능하게 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열; 및 면역학적으로 우세한 에피토프를 포함하는 RSV 부착 (G) 단백질 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함한다. 개시된 항원은 대상에게 투여되는 경우 면역 응답을 유발하고, RSV 감염 증상을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 키메라 항원을 코딩하는 핵산, 이러한 키메라 항원을 함유하는 면역원성 조성물, 및 이러한 키메라 항원을 제조 및 사용하는 방법이 또한 개시된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 FG V1-1 및 FG V2-1이 생산되도록 원형 FG (FG Rix)와 관련하여 이루어진 변형의 개략도이다. 숫자 1 및 2는 도입된 링커(linker)의 위치 및 G 단백질 단편을 각각 가리킨다.
도 2는 FG-Rix, 및 FG V1-1 및 FG V2-1로 명시된 2개의 예시적인 개선된 신규 FG 키메라의 비교를 제공하는 서열 정렬이다.
도 3A 및 B는 FG V1-1 및 FG V2-1에 의한 인간 혈청의 중화 억제를 도해하는 막대 그래프이다.
상세한 설명
서론
RSV 감염에 의해 야기되는 증상 및 후유증에 대해 보호하는 백신의 개발은 숙주 면역 응답이 질환의 발병기전에서 역할을 하는 것으로 보인다는 사실로 인해 복잡해졌다. 1960년대의 초기 연구는 포르말린-불활성화 RSV 백신이 예방 접종된 아동이 예방 접종되지 않은 대조군 대상과 비교하여 바이러스에의 후속 노출 시 더욱 중증의 질환을 앓았음을 나타냈다. 이러한 초기의 시도는 예방 접종자의 80％의 입원 및 2명의 사망을 초래하였다. 강화된 질환 중증도가 동물 모델에서 재현되었고, 이는 부적절한 수준의 혈청-중화 항체, 국소 면역의 결여, 및 제2형 헬퍼 T-세포-유사 (Th2) 면역 응답의 과도한 유도 + 폐 호산구증가증 및 IL-4 및 IL-5 사이토카인의 증가된 생산으로부터 초래되는 것으로 생각된다. 대조적으로, RSV 감염에 대해 보호하는 성공적인 백신은 IL-2 및 γ-인터페론 (IFN-γ)의 생산을 특징으로 하는 Th1-유형 면역 응답을 유도한다.
건강 집단 및 위험 집단에서 내구성이 있고 보호적인 면역 응답을 일으키는 안전하고 효과적인 RSV 백신을 생산하려는 노력으로 사멸 또는 불활성화 바이러스, 약독화 생 바이러스 및 정제된 서브유닛 접근법이 포함되는 다양한 접근법이 시도되었다. 그러나, 현재까지 평가된 후보들 중 어느 것에서도 RSV 감염의 예방 및/또는 RSV 질환의 감소 또는 예방을 목적으로 하는 백신의 마케팅이 초래되지 않았다. 한 접근법은 RSV 융합 (F) 및 부착 (G) 당단백질 양쪽 모두의 성분을 포함하는 재조합 키메라 항원의 생산을 수반하였다. 예시적인 키메라 RSV 항원들이 미국 특허 번호 5,194,595에 개시되어 있다. 이러한 키메라 구축물들은 RSV F 및 G 단백질의 전체 세포외 도메인 (즉, RSV F의 아미노산 잔기 1-526, 및 RSV G의 아미노산 잔기 69-298)을 포함하였다. 이러한 키메라 항원은 동물 모델 (예를 들어, 마우스, 코튼 래트(cotton rat))에서 면역 응답을 유발하였지만, 생산 및 안정성 난점으로 인해 판매용으로 진행될 수 없었다.
본 발명의 명세서는 우수한 면역원성 및 탁월한 공정 특성이 있는 신규 키메라 FG 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 신규 키메라 RSV 항원은 기존의 시도에서 마주치는 여러 유의한 단점들을 극복하여, 예방적 및 치료적 백신으로서의 투여에 적절한 안전하고 효과적인 키메라 RSV 항원이 생산된다.
한 양상에서, 본 명세서는 N 말단에서 C 말단 방향으로 (i) F 단백질 폴리펩티드의 F1 도메인에 절단불가능하게 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열; 및 (ii) 면역학적으로 우세한 에피토프를 함유하는 G 단백질 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항원에 관한 것이다. 전형적으로, RSV F 단백질 폴리펩티드의 F2 도메인 및 F1 도메인은 아미노산 링커를 통해 절단불가능하게 연결된다. 천연 F 단백질의 성숙 및 조립 동안 F2 및 F1 도메인이 분리될 수 있게 하고 pep27 펩티드의 방출을 초래하는 퓨린(furin) 절단 인식 서열 및/또는 부위를 제거함으로써 F2 및 F1 도메인이 절단불가능한 방식으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 키메라 RSV 폴리펩티드는 퓨린 절단 부위를 제거함으로써 키메라 폴리펩티드를 절단불가능하게 하는 하나 이상의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 위치 106 및 133의 아미노산)이 결실 또는 치환되어 절단불가능한 F 단백질이 생산될 수 있다. 예시적인 특정 실시양태에서, 2개의 아미노산 (1개 이상의 아르기닌을 포함하고, 예를 들어, 위치 106 및 107의 아르기닌 및 알라닌, 및 위치 133 및 134의 아르기닌 및 라이신)이 결실 또는 치환될 수 있다.
임의적으로, 발현 및 회수를 용이하게 하기 위해, 키메라 RSV 폴리펩티드는 신호 펩티드를 N-말단에 포함한다. 신호 펩티드는 당업계에 공지된 수많은 신호 펩티드 중에서 선택될 수 있고, 전형적으로, 키메라 폴리펩티드의 재조합 발현에 선택된 시스템에서의 생산 및 프로세싱을 용이하게 하도록 (강화 또는 최대화하도록) 선택된다. 신호 펩티드는 일반적으로 아미노산 18-25개 범위의 길이이다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 RSV F 단백질로부터의 신호 펩티드, 예를 들어, 서열 2의 아미노산 잔기 1-23이다. F2 도메인은 천연 F 단백질 폴리펩티드의 아미노산 잔기 24-105를 포함할 수 있다. 신호 펩티드와 F2 도메인 사이의 정확한 아미노산 한계는 하나 이상의 아미노산만큼 변할 수 있음이 명백할 것이다 (실제로, RSV F 단백질로부터 선택된 신호 펩티드의 경우에, 이같은 한계는 임의적이다). 예시적인 실시양태에서, F1 도메인은 F1 도메인의 본질적으로 모든 세포외 부분, 예를 들어, 천연 F 단백질 폴리펩티드의 잔기 137부터 잔기 528까지를 포함한다. 상기 지시된 바와 같이, F2 및 F1 도메인은 아미노산 링커 서열에 의해 절단불가능하게 연결될 수 있다. 당업자에게 공지된 수많은 아미노산 링커가 본원에 개시된 키메라 FG 폴리펩티드의 정황에서 적절하다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8로부터 선택된다.
F 폴리펩티드 서열은 RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분에 인-프레임(in frame)으로 연결된다. G 단백질의 일부분은 생산 특성을 개선하도록 선택된다 (예를 들어, 전장 G 단백질 폴리펩티드와 비교하여). G 단백질의 일부분은 면역학적으로 우세한 에피토프, 특히 아미노산 잔기 183과 203 사이의 면역학적으로 우세한 에피토프를 유지하도록 선택된다. 예를 들어, RSV G 단백질의 일부분은 아미노산 152-229를 포함한다. 예시적인 특정 실시양태에서, RSV G 단백질의 일부분은 G 단백질의 아미노산 잔기 149-229를 포함한다.
F 및 G 성분의 서열은 천연 발생 F 및 G 단백질 서열로부터 선택될 수 있고, 서열에서 단일 균주 또는 1가지를 초과하는 균주에 상응하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, F 및 G 부분이 동일한 균주에서 유래될 수 있거나, 또는 F 및 G 부분이 각각 상이한 균주로부터 유래될 수 있거나, 또는 F 부분 또는 G 부분 또는 양쪽 모두가 1가지를 초과하는 균주로부터의 아미노산에 상응하는 하이브리드일 수 있다. 임의적으로, 키메라 RSV 폴리펩티드는 천연 발생 RSV 폴리펩티드에 비해 1개 또는 1개를 초과하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모델 시스템에서 백신에 의해 강화되는 바이러스 질환의 감소 또는 예방과 상관되는 아미노산 치환과 같은 아미노산 치환이 G 단백질 부분 내로 도입될 수 있고, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드는 G 단백질의 잔기 191에서의 아스파라긴 → 알라닌 치환 (N191A)을 포함할 수 있다.
임의적으로, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 RSV 폴리펩티드는 폴리히스티딘 태그(tag), 또는 재조합적으로 발현된 단백질의 회수 및/또는 정제를 용이하게 하거나 강화하도록 디자인된 또다른 이같은 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 특정 실시양태에서, 키메라 RSV 폴리펩티드는 서열 11 또는 13, 또는 이의 하위서열(subsequence) (예를 들어, 아미노산 1-23의 신호 서열이 없거나, 또는 상이한 신호 서열의 치환이 있고/있거나 C 말단 히스티딘 태그가 없는 하위서열)로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌다. 유리하게는, 키메라 RSV 폴리펩티드는 RSV F 단백질 및 RSV G 단백질 양쪽 모두의 1개 이상의 면역우세 에피토프를 포함한다.
발현 (예를 들어, 및 정제 또는 단리) 시, 키메라 RSV 폴리펩티드는 천연 F 단백질과 면역학적으로 유사한 형상을 보유하는 다량체로 조립된다. 예를 들어, 키메라 RSV 폴리펩티드는 유리하게는 3량체로 조립될 수 있다.
담체 또는 부형제와 함께 제형된, 임의의 상기 기술된 키메라 RSV 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 본 명세서에 또한 포함된다. 전형적으로, 담체 또는 부형제는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제, 예컨대 완충제이다. 임의적으로, 담체 또는 부형제는 키메라 RSV 폴리펩티드의 안정성, 용해도 또는 안정성과 용해도 양쪽 모두를 강화하는 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 임의적으로, 면역원성 조성물은, 예를 들어, RSV-유도 질환 또는 증상을 예방하거나 감소시키거나 또는 완화시키기 위해, 조성물이 투여되도록 의도되는 대상들의 집단 내로의 투여에 적절한 애주번트(adjuvant)를 더 포함한다. 따라서, 신생아, 영아 또는 성인, 예컨대 65세 이상의 성인에게의 투여를 위해 애주번트가 선택될 수 있다. 유리하게는, 애주번트는 Th1 편향 애주번트이다. 특정 실시양태에서, 애주번트는 TLR-4 리간드, 예컨대 3D-MPL, 또는 지질 A의 임의의 또다른 합성 유도체이다. 임의적으로, 면역원성 조성물은 미립자 담체, 예컨대 백반을 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 애주번트는 리포솜 또는 에멀션, 예를 들어, 수중유 에멀션을 포함할 수 있다.
유리하게는, 면역원성 조성물은 인간에서의 의약으로서 사용하기 위해, 예를 들어, 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염의 예방 또는 감소를 위해, 또는 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염에 의해 야기되는 병리학적 응답의 예방 또는 감소를 위해 제형된다. 임의적으로, 면역원성 조성물은 RSV 이외의 병원성 생물의 1개 이상의 추가적인 항원을 또한 포함한다. 예를 들어, 병원성 생물은 RSV 이외의 바이러스, 예컨대 파라인플루엔자(Parainfluenza) 바이러스 (PIV), 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 및/또는 폴리오바이러스일 수 있다. 별법적으로, 병원성 생물은 박테리아, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza), 및/또는 폐렴구균(Pneumococcus)일 수 있다.
본 명세서의 또다른 양상은 임의의 본원에서 제공된 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산은 선택된 숙주 세포에서의 발현에 대해 코돈이 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다 (예를 들어, 포유류 세포, 효모 세포, 식물 세포 등에서의 발현에 대해 코돈이 최적화됨). 일부 경우에, 핵산은 벡터, 예컨대 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터 내에 함유된다. 이같은 핵산 또는 벡터가 도입되는 세포 (즉, 숙주 세포) 또한 본 명세서의 양상이다. 숙주 세포는 박테리아 세포일 수 있지만, 더욱 통상적으로는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 (예를 들어, 피치아(picchia)), 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포)일 것이다.
이러한 키메라 폴리펩티드 및 핵산은 RSV 감염을 (예를 들어, 예방적으로) 치료하기 위한 의약의 제조에서 유용하다. 따라서, 본 명세서는 임의의 본원에 키메라 RSV 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 면역학적 유효량으로 투여함으로써 RSV에 대한 면역 응답을 유발하는 방법을 또한 제공한다. 유리하게는, 인간 대상 (예컨대 신생아, 영아 또는 아동 또는 노인 대상)에게 투여되는 경우, 조성물은 RSV와의 접촉 후 바이러스 질환을 강화하지 않으면서 RSV에 대해 특이적인 면역 응답을 유발한다. 유리하게는, 조성물은 RSV 감염을 감소시키거나 예방하고/하거나, RSV 감염 후의 병리학적 응답을 감소시키거나 또는 예방하는 보호적 면역 응답을 유발한다. 전형적으로, 면역 응답은 Th1 유형 사이토카인의 생산을 특징으로 하는 면역 응답, 예를 들어, Th1-유형 면역 응답을 유발한다.
용어
달리 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 명세서가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 지닌다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를 [Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994] (ISBN 0-19-854287-9); [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994] (ISBN 0-632-02182-9); 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995] (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.
단수형 관사 ("a", "an", 및 "the")는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 용어 "복수"는 2개 이상을 지칭한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 추가적으로, 물질, 예컨대 항원의 농도 또는 수준과 관련하여 제공된 수치 한정은 대략적이도록 의도된다. 따라서, 농도가 (예를 들어) 200 pg 이상인 것으로 지시되는 경우, 농도가 대략 (또는 "약" 또는 "~") 200 pg 이상인 것으로 이해되도록 의도된다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 명세서의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 용어 "포함하다(comprise)"는 "포함된다(include)"를 의미한다. 따라서, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어, 및 변형물 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"는 언급된 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 항원) 또는 단계, 또는 화합물들 또는 단계들의 군의 포함(inclusion)을 의미하지만, 임의의 또다른 화합물, 조성물, 단계 또는 이들의 군의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 <exempli gratia>로부터 유래되고, 비-제한적인 예를 지시하도록 본원에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.
본 명세서의 다양한 실시양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 하기의 용어 설명이 제공된다. 추가적인 용어 및 설명이 본 명세서의 맥락에서 제공될 수 있다.
호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 파라믹소바이러스 과(Paramyxoviridae), 뉴모바이러스 아과(Pneumovirinae), 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속의 병원성 바이러스이다. RSV의 게놈은 뉴클레오티드 15,222개 길이의 단일 가닥, 음성-센스(sense) RNA 분자이고, 이는 11개의 단백질을 코딩한다. RNA 게놈과 바이러스 N 단백질의 단단한 회합은 바이러스 외피 내부에 감싸진 뉴클레오캡시드를 형성한다. G 당단백질의 항원성에서의 차이를 기초로 인간 RSV 균주의 A 군 및 B 군의 2가지 군이 기술되어 있다. 현재까지 수많은 RSV 균주들이 단리되었다. 도 4 및 5의 진뱅크(GenBank) 및/또는 EMBL 접속 번호들이 예시적인 균주들을 나타낸다. 추가적인 RSV 균주들이 단리될 것이고, RSV의 속 내에 포함된다. 유사하게, RSV 속은 유전적 부동(genetic drift), 또는 인공적인 합성 및/또는 재조합에 의해 천연 발생 바이러스 (예를 들어, 기존에 또는 추후에 확인된 균주)로부터 생성되는 변이체를 포함한다.
용어 "F 단백질" 또는 "융합 단백질" 또는 "F 단백질 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질 폴리펩티드"는 RSV 융합 단백질 폴리펩티드의 아미노산 서열 전부 또는 이의 일부를 지니는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "G 단백질" 또는 "G 단백질 폴리펩티드"는 RSV 부착 단백질 폴리펩티드의 아미노산 서열 전부 또는 이의 일부를 지니는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 수많은 RSV 융합 및 부착 단백질이 기술되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서의 이해를 용이하게 하기 위해, RSV F 및/또는 G 단백질의 아미노산 잔기 위치를 지칭할 때, 모든 아미노산 잔기 위치는 서열 2의 예시적인 F 단백질의 아미노산 위치 및 서열 4의 예시적인 G 단백질의 아미노산 위치를 기준으로 제공된다 (즉, 아미노산 잔기 위치는 서열 2의 예시적인 F 단백질의 아미노산 위치 및 서열 4의 예시적인 G 단백질의 아미노산 위치에 상응한다). 그러나, 임의의 RSV A 또는 B 균주로부터의 필적하는 아미노산이 사용될 수 있다. 임의의 RSV A 또는 B 균주의 필적하는 아미노산 위치는 선택된 RSV 균주의 아미노산 서열을 용이하게 입수가능하고 주지된 정렬 알고리즘 (예컨대 디폴트 파라메터를 예를 들어 사용하는 BLAST)을 사용하여 서열 2와 정렬함으로써 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 수많은 균주로부터의 예시적인 F 및 G 단백질 서열이 WO2008114149에서 제공되고, 이들 중 임의의 것이 본원에 개시된 키메라 FG 단백질의 맥락에서 사용될 수 있다. WO2008114149는 키메라 G 단백질에서 사용하기에 적절한 RSV F 및 G 단백질의 서열을 개시하기 위한 목적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
"키메라 FG 폴리펩티드" 또는 "FG 항원" 또는 "FG 폴리펩티드 항원"은 RSV F 단백질 및 RSV G 단백질 양쪽 모두의 항원 결정기 또는 에피토프를 전형적으로 포함하는, 폴리펩티드 성분들이 혼입된 키메라 폴리펩티드이다. 본 명세서의 맥락에서, 키메라 FG 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 배향으로 F1 도메인에 절단불가능하게 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열 및 면역학적으로 우세한 에피토프를 함유하는 RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함한다. 용어 서브유닛 및 도메인은 F 단백질 및/또는 F0 폴리펩티드의 구조적 도메인과 관련하여 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 맥락에서의 용어 키메라는 F 및 G 단백질 성분이 양쪽 모두 동일한 혈청형 또는 균주로부터의 것인 폴리펩티드, 뿐만 아니라 개별적인 F 및 G 단백질 성분이 상이한 혈청형 또는 균주로부터의 것인 폴리펩티드를 포함한다.
핵산 또는 단백질 (예를 들어, RSV F 또는 G 단백질 또는 단백질 도메인, 또는 FG 키메라 폴리펩티드)을 지칭할 때의 "변이체"는 기준 핵산 또는 단백질과 상이한 핵산 또는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 변이체 핵산 또는 단백질과 기준 핵산 또는 단백질 간의 차이(들)는 기준물에 비해 비례적으로 작은 개수의 차이를 구성한다. 이같은 차이는 아미노산 부가, 결실 또는 치환일 수 있다. 따라서, 전형적으로 변이체는 약 1％, 또는 2％, 또는 5％, 또는 10％, 또는 15％, 또는 20％ 이하의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기만큼 상이하다. 따라서, RSV F 또는 G 단백질, 또는 키메라 FG 폴리펩티드의 정황에서의 변이체는 기준 단백질, 예를 들어, 서열 2 및 4에 설명된 기준 서열, 또는 임의의 본원에 개시된 예시적인 FG 폴리펩티드와 적어도 80％, 또는 85％, 더욱 통상적으로는 적어도 약 90％ 이상, 예컨대 95％, 또는 심지어 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 전형적으로 공유한다. 본 명세서의 특색으로서 포함되는 추가적인 변이체는 WO2008114149에서 예를 들어 제공되는 임의의 예시적인 서열로부터의 F2 (예를 들어, 서열 2와의 정렬에 의해 숫자가 지정되는 아미노산 24-105 전부 또는 이의 일부분을 포함함) 및/또는 F1 성분 (예를 들어, 서열 2와의 정렬에 의해 숫자가 지정되는 아미노산 137-528 전부 또는 이의 일부분을 포함함) (동일한 균주 또는 상이한 균주), 및 WO2008114149에서 예를 들어 제공되는 임의의 예시적인 서열로부터 선택된 G 단백질 성분 (예를 들어, 서열 4에 대한 정렬에 의해 숫자가 지정되는 아미노산 149-229 전부 또는 이의 일부분)이 혼입된 키메라 FG 폴리펩티드이다. 변이체는 유전적 부동으로부터 생길 수 있거나, 또는 인공적으로 부위 지정 또는 무작위 돌연변이를 사용하여 또는 2개 이상의 기존의 변이체의 재조합에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 변이체 FG 폴리펩티드는 서열 11 및 13의 예시적인 FG 키메라와 비교하여 1개, 또는 2개, 또는 5개 또는 10개, 또는 15개, 또는 50개의 아미노산 차이, 또는 예시적인 FG 키메라 핵산, 예를 들어, 서열 10 및 12의 핵산과 비교하여 약 100개까지의 뉴클레오티드 차이를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "도메인"은 폴리펩티드 또는 단백질 내의 구조적으로 한정되는 요소이다. 본 명세서의 맥락에서, "퓨린 절단 도메인"은 퓨린 프로티에이스(protease)에 의한 전구체 폴리펩티드의 절단에 의해 한정되는 도메인이다. 예를 들어, F 단백질은 F0으로 명시되는 단일 폴리펩티드로서 합성된다. 이어서 F0 폴리펩티드가 퓨린 프로티에이스에 의해 2개의 컨센서스 퓨린 인식 모티프에서 절단되어, F2 및 F1로 명시되는 2개의 구조적으로 독립적인 폴리펩티드 유닛이 생산된다. F2는 아미노산 24 (신호 펩티드 다음)에서 첫번째 (N- → C- 말단 방향에서 첫번째) 퓨린 절단 인식 부위까지에 이른다. F1은 두번째 퓨린 절단 부위에서 F0 폴리펩티드의 C-말단 끝부분까지에 이른다. 본 명세서의 맥락에서, 용어 F1은 F1 도메인의 세포외 부분 (예를 들어, 아미노산 137-528)을 포함하는 F0 폴리펩티드의 일부분을 지칭하도록 또한 사용된다.
용어 "천연" 및 "천연 발생"은 자연에서와 동일한 상태로 존재하는 요소, 예컨대 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 즉, 이러한 요소가 인공적으로 변형되지 않았다. 본 명세서의 맥락에서, RSV의 여러 천연 발생 균주 또는 단리물로부터 예를 들어 수득된 RSV 단백질 또는 폴리펩티드의 수많은 천연/천연 발생 변이체가 있음이 이해될 것이다.
용어 "폴리펩티드"는 단량체들이 아미드 결합을 통해 함께 연결되는 아미노산 잔기인 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 아미노산 서열을 포함하도록 의도되고, 당단백질과 같은 변형 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 천연 발생 단백질, 뿐만 아니라 재조합적으로 또는 합성적으로 생산된 것들을 포함하도록 명확하게 의도된다. 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "단편"은 폴리펩티드의 일부분 (즉, 하위서열)을 지칭한다. 용어 "면역원성 단편"은 전장 기준 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 우세한 면역원성 에피토프를 보유하는 모든 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 일반적으로 폴리펩티드 내의 배향은 개별적인 아미노산들의 아미노 및 카르복시 모이어티(moiety)의 배향에 의해 정의되는 N-말단 → C-말단 방향으로 열거된다. 폴리펩티드는 N 또는 아미노-말단으로부터 C 또는 카르복시-말단을 향해 번역된다.
"신호 펩티드"는 새롭게 합성된 분비 또는 막 단백질을 막 (예를 들어, 세포질 세망의 막)으로 또는 막을 통과하도록 지시하는 짧은 아미노산 서열 (예를 들어, 아미노산 약 18-25개 길이)이다. 신호 펩티드는 보편적이지는 않지만 자주 폴리펩티드의 N-말단에 위치하고, 단백질이 막을 가로지른 후 신호 펩티데이스(peptidase)에 의해 자주 절단된다. 신호 서열은 전형적으로 3개의 공통적인 구조 특색을 함유한다: N-말단 극성 염기성 영역 (n-영역), 소수성 코어(core), 및 친수성 c-영역.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 서열"은 염기 10개 이상 길이의 중합체성 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한쪽 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 이러한 용어는 단일 및 이중 형태의 DNA를 포함한다. "단리된 폴리뉴클레오티드"는 자신이 유래된 생물의 천연 발생 게놈 내에서 자신과 바로 인접한 코딩 서열 양쪽 모두 (5' 끝부분 상의 하나 및 3' 끝부분 상의 하나)에 바로 인접하지 않는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩한다. 핵산의 5' 및 3' 방향은 개별적인 뉴클레오티드 유닛들의 연결도와 관련하여 정의되고, 데옥시리보스 (또는 리보스) 당 고리의 탄소 위치에 따라 지정된다. 폴리뉴클레오티드 서열의 정보성 (코딩) 내용은 5' → 3' 방향으로 판독된다.
"재조합" 핵산은 천연 발생이 아닌 서열을 지니거나 또는 인공적인 조합이 아니면 분리되어 있는 2개의 서열 절편의 인공적인 조합에 의해 제조된 서열을 지니는 핵산이다. 이러한 인공적인 조합은 화학적 합성에 의해, 또는, 더욱 통상적으로는, 단리된 핵산 절편의 인공적인 조작 (예를 들어, 유전자 조작 기술에 의한 조작)에 의해 달성될 수 있다. "재조합" 단백질은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진핵생물 세포 내로 도입된 이종 (예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 코딩되는 단백질이다. 핵산은 도입된 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 발현할 수 있는 신호가 있는 발현 벡터 상에서 도입될 수 있거나, 또는 핵산이 숙주 세포 염색체 내로 통합될 수 있다.
용어 "정제" (예를 들어, 병원체 또는 병원체를 함유하는 조성물과 관련된 정제)는 존재를 원치 않는 성분을 조성물로부터 제거하는 공정을 지칭한다. 정제는 상대적인 용어이고, 바람직하지 않는 성분의 모든 흔적이 조성물로부터 제거되는 것을 요구하지 않는다. 백신 생산의 정황에서, 정제는 원심분리, 투석, 이온-교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피, 친화성-정제 또는 침전과 같은 공정을 포함한다. 따라서, 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고, 오히려, 이는 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 핵산 제제는 특정 단백질이 이러한 핵산이 이의 생성 환경, 예를 들어 세포 또는 생화학적 반응 챔버에 있는 것보다 더 강화된 제제이다. 실질적으로 순수한 핵산 또는 단백질 제제는 원하는 핵산이 제제의 전체 핵산 함량의 50％ 이상을 나타내도록 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 핵산은 제제의 전체 핵산 또는 단백질 함량의 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상 또는 이를 초과하는 값을 나타낼 것이다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 분자, 단백질 또는 소기관)은 이러한 성분이 천연적으로 발생하는 생물의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 예컨대 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 소기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다. "단리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 이러한 용어는 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 및 단백질을 또한 포함한다.
"항원"은 동물 내로 주사되거나, 흡수되거나 또는 또다른 방식으로 도입되는 조성물이 포함되는, 동물에서 항체 생산 및/또는 T 세포 응답을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질이다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 B 및/또는 T 세포가 응답하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "면역학적으로 우세한" 에피토프는 이에 대해 기능적으로 유의한 숙주 면역 응답, 예를 들어, 항체 응답 또는 T 세포 응답이 이루어지는 에피토프이다. 따라서, 병원체에 대한 보호적 면역 응답과 관련하여, 면역학적으로 우세한 에피토프는 숙주 면역계에 의해 인식되는 경우 병원체에 의해 야기되는 질환으로부터의 보호를 초래하는 항원 모이어티이다. 용어 "T 세포 에피토프"는 적합한 MHC 분자에 결합되는 경우 T 세포에 의해 특이적으로 결합 (T 세포 수용체를 통해)되는 에피토프를 지칭한다. "B 세포 에피토프"는 항체 (또는 B 세포 수용체 분자)에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프이다.
"애주번트"는 비-특이적 방식으로 면역 응답의 생산을 강화하는 작용제이다. 통상적인 애주번트에는 항체가 상부에 흡착되는 무기질 (백반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄)의 현탁액; 유중수 및 수중유 (및 이중 에멀션 및 가역성 에멀션이 포함되는 이의 변이체)가 포함되는 에멀션, 지질당류, 지질다당류, 면역자극성 핵산 (예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드), 리포솜, 톨(Toll) 수용체 작동제 (특히, TLR2, TLR4, TLR7/8 및 TLR9 작동제), 및 이같은 성분들의 다양한 조합물이 포함된다.
"면역원성 조성물"은 특이적 면역 응답, 예를 들어, RSV와 같은 병원체에 대한 면역 응답을 유발할 수 있는, 인간 또는 동물 대상에게의 투여에 적절한 물질의 조성물이다. 따라서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 항원) 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물은 면역 응답을 유발 또는 강화할 수 있는 하나 이상의 추가적인 성분, 예컨대 부형제, 담체, 및/또는 애주번트를 또한 포함할 수 있다. 특정 예에서, 면역원성 조성물은 병원체에 의해 유도되는 증상 또는 용태에 대해 대상을 보호하는 면역 응답을 유발하도록 투여된다. 일부 경우에, 대상이 병원체 (예를 들어, RSV)에 노출된 후 병원체의 복제를 억제하는 것에 의해 병원체에 의해 야기되는 증상 또는 질환이 예방 (또는 감소 또는 완화)된다. 본 명세서의 맥락에서, 용어 면역원성 조성물은 RSV에 대한 보호적 또는 경감적 면역 응답을 유발하려는 목적으로 대상 또는 대상들의 집단에게 투여되도록 의도되는 조성물 (즉, 백신 조성물 또는 백신)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"면역 응답"은 자극에 대한 면역계 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 또는 단핵구의 응답이다. 면역 응답은 특이적 항체, 예컨대 항원 특이적 중화 항체의 생산을 초래하는 B 세포 응답일 수 있다. 또한 면역 응답은 T 세포 응답, 예컨대 CD4+ 응답 또는 CD8+ 응답일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 응답은 특정 항원에 대해 특이적이다 (즉, "항원-특이적 응답"). 항원이 병원체로부터 유래되는 경우, 항원-특이적 응답은 "병원체-특이적 응답"이다. "보호적 면역 응답"은 병원체의 해로운 기능 또는 활성을 억제하거나, 병원체에 의한 감염을 감소시키거나, 또는 병원체에 의한 감염으로부터 초래되는 증상 (사망 포함)을 감소시키는 면역 응답이다. 예를 들어, 플라크 감소 분석법 또는 ELISA-중화 분석법에서의 바이러스 복제 또는 플라크 형성의 억제에 의해, 또는 생체 내에서의 병원체 챌린지(challenge)에 대한 저항성을 측정함으로써, 보호적 면역 응답을 측정할 수 있다.
"Th1" 유형 면역 응답은 IL-2 및 IFN-γ를 생산하는 CD4+ T 헬퍼 세포를 특징으로 한다. 반면에, "Th2" 유형 면역 응답은 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 생산하는 CD4+ 헬퍼 세포를 특징으로 한다.
"면역학적 유효량"은 대상에서 면역 응답을 유발하는데 사용되는 조성물 (전형적으로, 면역원성 조성물)의 양이다. 통상적으로, 원하는 결과는 병원체에 대해 대상을 보호할 수 있거나 보호하는데 기여하는 항원 (예를 들어, 병원체)-특이적 면역 응답의 생산이다. 그러나, 병원체에 대한 보호적 면역 응답을 수득하는 것은 면역원성 조성물의 다중 투여를 요구할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 맥락에서, 용어 면역학적 유효량은 기존의 투여 또는 추후의 투여와 조합되어 보호적 면역 응답을 달성하는 것에 기여하는 분할 용량을 포함한다.
형용사 "제약상 허용되는"은 지시대상이 대상 (예를 들어, 인간 또는 동물 대상)에게 투여하는데 적절하다는 것을 가리킨다. [Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에 면역원성 조성물이 포함되는 치료 및/또는 예방 조성물의 제약 전달에 적절한 조성물 및 제형 (희석제 포함)이 기술되어 있다.
응답, 예컨대 면역 응답과 관련하여 용어 "조정하다"는 응답의 개시, 규모, 기간 또는 특성을 변경 또는 변화시키는 것을 의미한다. 면역 응답을 조정하는 작용제는 이의 투여 후의 면역 응답의 개시, 규모, 기간 또는 특성 중 하나 이상을 변경시키거나, 또는 기준 작용제와 비교하여 개시, 규모, 기간 또는 특성 중 하나 이상을 변경시킨다.
작용제의 투여 후 응답 또는 용태가 정량적으로 줄어드는 경우 또는 기준 작용제와 비교하여 작용제의 투여 후 응답 또는 용태가 줄어드는 경우 작용제가 응답 또는 용태를 감소시키는 것이도록, 용어 "감소시킨다"는 상대적인 용어이다. 유사하게, 용어 "예방한다"는 응답 또는 용태의 하나 이상의 특성이 제거되는 한, 작용제가 응답 또는 용태를 완전히 제거하는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 따라서, 감염 또는 응답, 예컨대 병리학적 응답, 예를 들어, 백신에 의해 강화되는 바이러스 질환을 감소시키거나 예방하는 면역원성 조성물은, 감염 또는 응답이 측정가능하게, 예를 들어, 작용제의 부재 하의 또는 기준 작용제와 비교했을 때의 감염 또는 응답의 약 50％ 이상, 예컨대 약 70％, 또는 약 80％, 또는 심지어 약 90％ 이상만큼 (즉, 10％ 이하로) 줄어드는 한, 이같은 감염 또는 응답을 제거할 수 있지만, 반드시 완전히 제거하지는 않는다.
"대상"은 살아 있는 다세포 척추동물 생물이다. 본 명세서의 맥락에서, 대상은 실험용 대상, 예컨대 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스, 코튼 래트, 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 별법적으로, 대상은 인간 대상일 수 있다.
FG 키메라 RSV 항원
RSV의 바이러스 외피는 바이러스에 의해 코딩되는 F, G 및 SH 당단백질을 코딩한다. F 및 G 당단백질은 RSV-특이적 중화 항체를 유도하는 것으로 공지된 RSV 비리온의 단지 2개뿐인 성분이다. 본원에 개시된 키메라 FG 폴리펩티드는 천연 F 단백질의 구조적인 특색이 혼입되면서 동시에 RSV G 단백질의 중요한 면역우세 에피토프를 나타내도록 디자인된다.
RSV의 천연 F 단백질은 F0로 명시되는 단일 폴리펩티드 전구체로서 번역된다. F0는 폴딩(folding)되고, 단백질분해 및 기타 번역후 변형에 적용된다. 먼저, 신호 펩티드 (Sp)가 신생 폴리펩티드의 번역을 세포질 세망 (ER)으로 표적화하고, 나중에 신호 펩티데이스에 의해 절단된다. 그후, RE에서 신생 폴리펩티드가 예시적인 F 폴리펩티드 서열인 서열 2의 아미노산 위치 27, 70 및 500의 3개의 부위에서 N-글리코실화된다. F2 및 F1이 퓨린-절단에 의해 생성되고, 이종이량체의 삼량체 (3회의 F2-F1)로서 함께 폴딩된다. 퓨린은 쌍을 이룬 염기성 아미노산 프로세싱 부위에서 전구체 단백질을 효율적으로 절단할 수 있는 칼슘-의존적 세린 엔도프로티에이스(endoprotease)이다. 전형적으로, 이같은 프로세싱 부위는 염기성 아미노산 표적 서열 (정규적으로, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')을 포함한다. RSV F 단백질은 위치 106-109 및 133-136에서 2개의 퓨린 인식 부위를 포함한다. 2개의 보존된 퓨린 컨센서스 부위인 RAR/KR109 (FCS-2) 및 KKRKRR136 (FCS-1)에서의 퓨린 프로티에이스에 의한 성숙된 천연 발생 F0 폴리펩티드의 단백질분해성 절단은 3개의 단백질분해성 단편의 생성을 초래한다. N 말단에 소수성 융합 펩티드가 있는, 막에 고정된 대형 서브유닛 F1 (아미노산 137-574에 상응)이 소형 서브유닛 F2 (아미노산 24-105에 상응)에 디설파이드 다리를 통해 연결되고, 원래 2개의 절단 부위 사이에 위치하는 아미노산 27개로 구성된 소형 펩티드 (pep27)가 방출된다. 약어 F0, F1 및 F2는 과학 문헌에서의 F0, F1 및 F2를 통상적으로 명시하는 것으로 당업자에게 인식될 것이다. RSV F 단백질의 퓨린 프로세싱의 설명이, 당업계에서 인정되는 용어법의 정의와 함께, [Zimmer et al. "Proteolytic activation of Respiratory Syncytial Virus fusion protein." J. Biol. Chem. 276:31642-31650, 2001], 및 [Zimmer et al., "Cleavage at the furin consensus sequence RAR/KR109 and presence of the intervening peptide of the Respiratory Syncytial Virus fusion protein are dispensable for virus replication in cell culture." J. Virol. 76:9218-9224, 2002]에서 확인된다. 단백질은 C-말단 영역 내의 백색 마름모 (TM)로 표시되는 이의 막횡단 나선을 사용하여 막에 고정된다. 또한, RSV F 단백질은 15개의 시스테인 잔기, 4개의 특징적인 중화 에피토프, 2개의 코일드-코일(coiled-coil) 영역, 및 지질화(lipidation) 모티프를 특색으로 한다.
천연 G 단백질은 자신의 막횡단 소수성 영역 (아미노산 41-63)에 의해 비리온 막에 고정되는 아미노산 298개의 단백질이다. 아미노산 65-298은 RSV의 표면에서 노출되는 G 단백질의 부분을 포함한다. 고도로 O-글리코실화된 뮤신(mucin)-유사 영역이 각각의 말단에 존재한다. 5개의 N-글리코실화 모티프가 이러한 2개의 영역 내에 또한 존재한다. 글리코실화되지 않은 중심부는 1) G에서 유일하게 구조적 데이터가 입수가능한 부분인 시스테인 올가미 (aa173-190); 2) aa183-203의 면역우세 MHC 클래스 II 에피토프; 및 3) 숙주 세포 표면 상에서의 바이러스 부착 프로세스에서 관련되는, 케모카인 프랙탈카인(fractalkine) 수용체 (C3XCR) 및 글리코사미노글리칸 (GAG) 결합 모티프가 포함되는 여러 중요한 구조적 모티프를 포함한다.
본 명세서는 N-말단 → C-말단 배향으로 (i) RSV F 단백질의 F1 도메인에 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열 및 (ii) RSV G 단백질의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드에 관한 것이다. 생산 동안의 폴딩 및 조립을 용이하게 하기 위해, 내부 퓨린 인식 부위를 제거하고 퓨린 절단을 방지하도록 천연 F 단백질 서열이 변형된다. 아미노산 잔기 106-109 및/또는 133-136의 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 퓨린 절단 부위가 파괴될 수 있다. 예를 들어, 1개 또는 2개의 아미노산 (예를 들어, 위치 106 및 107의 아르기닌 및 알라닌, 및 위치 133 및 134의 아르기닌 및 라이신)을 결실시킴으로써 퓨린 인식 부위가 제거될 수 있고, 이는 퓨린 절단 부위를 파괴한다. 따라서, 발현 및 조립 시, 키메라 폴리펩티드의 F2 및 F1 부분이 절단불가능한 단일 폴리펩티드 유닛으로 남는다.
F 단백질의 F2 및 F1 도메인을 선택하는데 있어서, 당업자는 전체 F2 및/또는 F1 도메인을 포함하는 것이 엄격하게 필요하지 않다는 것을 인지할 것이다. 전형적으로, F2 도메인의 하위서열 (또는 단편)을 선택할 때 입체형상적인 고려가 중요하다. 따라서, F2 도메인은 키메라 폴리펩티드의 조립 및 안정성을 용이하게 하는 F2 도메인의 일부분을 전형적으로 포함한다. 예시적인 특정 변이체에서, F2 도메인은 아미노산 24-105를 포함한다. 임의적으로, F2 도메인은 천연 F0 폴리펩티드의 신호 펩티드 (예를 들어, 아미노산 1-23)를 포함할 수 있다.
전형적으로, 적어도 F1 도메인의 하위서열 (또는 단편)은 F 단백질의 면역우세 에피토프를 포함하는 안정적인 입체형상을 유지하도록 선택되고 디자인된다. 예를 들어, 아미노산 262-275 (팔리비주맵 중화) 및 423-436 (센토코르(Centocor)의 ch101F MAb)의 영역에서 중화 항체가 인식하는 에피토프를 포함하는 F1 폴리펩티드 도메인의 하위서열을 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다. 추가적으로, T 세포 에피토프, 예를 들어, 아미노산 328-355 내의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 가장 통상적으로는, F1 서브유닛의 단일한 연속 부분 (예를 들어, 아미노산 262-436에 걸쳐짐)으로서이지만, 에피토프들이 안정적인 입체형상으로 조립된 비연속 요소들로서 이러한 면역우세 에피토프들을 포함하는 합성 서열 내에 유지될 수 있다. 따라서, F1 도메인 폴리펩티드는 적어도 RSV F 단백질 폴리펩티드의 대략적인 아미노산 262-436을 포함한다. 본원에서 제공된 한 비제한적인 예에서, (다소 더 작은 단편, 예를 들어, 아미노산 잔기 151 또는 아미노산 161에서 시작하거나, 또는 위치 524에서 종결되는 단편이 사용될 수 있기는 하지만) F1 도메인은 천연 F 단백질 폴리펩티드의 아미노산 137 내지 528을 포함한다. 당업자는 추가적인 더 짧은 하위서열들이 실행자의 재량에 따라 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
폴딩 및 조립을 용이하게 하고, 입체형상적인 에피토프의 유지를 최대화하기 위해, 아미노산 링커가 2개의 F 단백질 도메인 사이에 도입된다. 다양한 길이 및 구조적 속성의 수많은 링커가 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 개시된 키메라 RSV 폴리펩티드의 정황에서, 다수의 이같은 링커들 중 임의의 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어, V1-1 및 V1-2로 명시된 실시양태에서 설명되는 바와 같이, 단순한 글리신-풍부 반복 서열이 링커로서 유리하게 사용된다. FG V1-1에서, 단순한 글리신 및 세린 반복 서열이 링커로서 사용된다. FG V1-2의 변이체는 글리코실화 부위를 포함하도록 개조된 글리신/세린 링커를 포함한다. 구체적인 예시적인 글리신/세린 링커 서열이 각각 서열 5 및 6에서 제시된다. 별법적으로, 더욱 복잡한 구조 속성을 지니는 링커가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 천연 F 단백질로부터 링커가 선택된다. 예를 들어, 특정한 바람직한 실시양태에서, 서열에서 링커는 V2-1 및 V2-2로 명시된 실시양태에 의해 설명되는 바와 같이 pep27 서열 전체 또는 이의 일부분에 상응한다. 이같은 링커가 사용되는 경우, 예를 들어, 구조적 또는 기능적 특성, 예컨대 글리코실화가 변형되도록, 이는 길이 면에서 다양할 수 있다. pep27-기반 링커의 2개의 예시적인 버젼이 서열 7 및 8에서 제공된다.
면역학적으로 우세한 또는 면역우세 T 세포 에피토프(들), 예를 들어, 아미노산 183-197의 영역 내의 에피토프를 유지하는 G 단백질의 일부분 (또는 하위서열 또는 단편)을 포함하도록 G 단백질 폴리펩티드 성분이 선택된다. 예시적인 변이체는, 예를 들어, 아미노산 152, 151, 150, 149, 148 등에서부터 아미노산 226, 227, 228, 229, 230 등까지를 포함하는 G 단백질의 하위서열 또는 단편을 포함한다. 임의적으로, 천연 G 단백질의 더 큰 단편 (예컨대 아미노산 잔기 128-229, 또는 130-230을 포함하는 단편)이 치환될 수 있다. 당업자는, 선택된 부분이 키메라 FG 폴리펩티드의 발현, 폴딩 또는 프로세싱을 입체형상적으로 불안정하게 하거나 파괴하지 않는 한, G 단백질의 더 길거나 더 짧은 부분이 또한 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 임의적으로, G 단백질 도메인은 위치 191에서의 아미노산 치환을 포함하는데, 이는, 기존에, 포르말린으로 불활성화된 RSV 백신과 관련된 호산구증가증을 특징으로 하는 강화된 질환을 감소시키고/시키거나 예방하는 것과 상관되었다. 천연 발생 G 단백질 및 치환된 (N191A) G 단백질의 속성의 면밀한 설명을, 예를 들어, 모든 면에서 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 공개 번호 2005/0042230에서 확인할 수 있다.
원한다면, 고정 모티프 또는 당업계에 공지된 기타 방법, 예컨대 신경망 또는 다항식 결정을 사용하여 추가적인 T 세포 에피토프를 확인할 수 있고, 예를 들어, RANKPEP (mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html의 월드 와이드 웹에서 입수가능); ProPredI (imtech.res.in/raghava/propredI/index.html의 월드 와이드 웹에서 입수가능); Bimas (www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html의 월드 와이드 웹에서 입수가능); 및 SYFPEITH (syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm의 월드 와이드 웹에서 입수가능)를 참조한다. 예를 들어, 알고리즘을 사용하여, 펩티드의 "결합 역치"를 결정하고, 특정 친화력의 MHC 또는 항체 결합의 높은 가능성을 제공하는 점수의 펩티드를 선택한다. 이러한 알고리즘은 특정 위치에서의 특정 아미노산의 MHC 결합에 대한 효과, 특정 위치에서의 특정 아미노산의 항체 결합에 대한 효과, 또는 모티프-함유 펩티드에서의 특정 치환의 결합에 대한 효과를 기초로 한다. 면역원성 펩티드의 정황에서, "보존 잔기"는 펩티드 내의 특정 위치에서 무작위 분포에 의해 예상되는 것보다 유의하게 더 높은 빈도로 나타나는 것이다. 고정 잔기는 MHC 분자와의 접촉점을 제공하는 보존 잔기이다. 이같은 예측 방법에 의해 확인된 T 세포 에피토프는 특이적 MHC 단백질에 대한 이의 결합을 측정함으로써, 그리고 MHC 단백질의 정황에서 제시되는 경우에 T 세포를 자극하는 이의 능력에 의해 확증될 수 있다.
예시적인 실시양태가 서열 11 및 13에 기재되지만, 수많은 또다른 실시양태들이 과도한 실험 없이 당업자에 의해 생산될 수 있다. 임의의 RSV F 및/또는 G 단백질 서열이 재조합 키메라 RSV FG 폴리펩티드의 구축에서 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 바이러스 외피와 표적 세포막의 융합을 담당하는 F 단백질의 서열은 RSV 단리물들 간에 고도로 보존된다. 대조적으로, 바이러스 부착을 담당하는 G 단백질의 서열은 비교적 가변적이다. 여러 단백질들 간의 동일성 및 변동을 나타내는 RSV F 및 G 단백질 서열들의 정렬이 WO2008114149에서 제공된다. 보존 영역 및 가변 영역이 이러한 정렬로부터 명백하다.
예를 들어, 한 실시양태에서, F2 도메인 (예를 들어, 기준 F 단백질 서열의 아미노산 24-105에 상응함)이 서열 5, 6, 7, 또는 8 중 임의의 것으로부터 선택된 링커에 의해 F1 도메인 (예를 들어, 기준 F 단백질 서열의 아미노산 137-528에 상응함)에 절단불가능하게 연결되고, G 단백질의 아미노산 183-203에 의해 제공되는 면역우세 에피토프를 포함하는 G 단백질 도메인 (예를 들어, 대략적으로 기준 F 단백질 서열의 위치 149에 상응하는 아미노산에서 대략적으로 위치 229에 상응하는 아미노산까지, 예를 들어, 위치 148, 149, 150, 151 또는 152에서 위치 226, 227, 228, 229 또는 230까지)에 인-프레임으로 연결된다. F2 및 F1 도메인은 동일한 F 단백질 폴리펩티드, 예컨대 서열 2의 단백질과 같은 천연 발생 F 단백질, 또는 임의의 또다른 예시적인 F 단백질 폴리펩티드 (예를 들어, WO2008114149에 개시된 것들)로부터 선택된 F 단백질 폴리펩티드로부터 선택될 수 있다. 별법적으로, F2 및 F1 도메인이 상이한 천연 발생 F 단백질 폴리펩티드들로부터 선택될 수 있다. 별법적으로, F2 및 F1 도메인 중 하나 또는 양쪽 모두가 변이체에 관한 본원에서의 논의에서 더욱 상세하게 지시된 바와 같이 변형될 수 있다. 유사하게, G 단백질 도메인이 서열 4로부터 또는 WO2008114149에 개시된 변이체들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
또다른 예시적인 실시양태는 하나 이상의 아미노산의 결실이 있는 변이체이다. 더 짧은 단편을 원하는 경우, 그럼에도 불구하고, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 폴리펩티드의 성분들의 구조적으로 및 면역학적으로 중요한 특색을 유지하는 부분이 선택된다. 별법적으로, 변이체가 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체가 정제를 용이하게 하는 추가적인 아미노산 (예를 들어, 폴리히스티딘 태그)을 포함할 수 있다.
추가적으로, 또는 별법적으로, 선택된 발현 시스템에서 생산되는 경우 키메라 폴리펩티드의 발현 및 안정성을 강화하도록 임의의 개시된 키메라 FG 폴리펩티드에 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 진핵생물 구축물은 발현 시스템에 상응하는 신호 펩티드, 예를 들어, 포유류 또는 바이러스 신호 펩티드를 포함하도록 디자인되고, 예컨대 RSV F0 천연 신호 서열이 포유류 세포에서 키메라 폴리펩티드를 발현시키는 경우에 유리하게 선택된다. 별법적으로, 신호 펩티드 (예컨대 배큘로바이러스 신호 펩티드, 또는 멜리틴(melittin) 신호 펩티드)가 곤충 세포에서의 발현을 위해 치환될 수 있다. 식물 발현 시스템이 선호되는 경우, 적절한 식물 신호 펩티드가 당업계에 공지되어 있다. 본원에 개시된 키메라 FG 폴리펩티드의 정황에서 사용하기에 적절한 예시적인 신호 펩티드에는 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) gD 단백질, 인간 엔도스타틴, HIV gp120, CD33, 사이토메갈로바이러스 gB 단백질, 인간 Her2Neu, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) gp350, 및 [Tan et al., Protein Eng. 15:337-45]의 SS의 신호 펩티드가 포함된다.
특정 실시양태에서, 글리코실화 패턴 또는 상태가 변경되도록 키메라 FG 폴리펩티드가 변형된다 (예를 들어, 천연 F 단백질 폴리펩티드 내에 존재하는 글리코실화 부위들 중 하나 이상에서 글리코실화되는 분자들의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써). 예를 들어, 서열 2의 천연 F 단백질 폴리펩티드는 아미노산 위치 27, 70 및 500에서 글리코실화되는 것으로 예측된다. 한 실시양태에서, 아미노산 위치 500의 글리코실화 부위의 부근에서 변형이 도입된다. 예를 들어, 기준 F 단백질 서열 (서열 2)의 위치 500에 상응하는 위치의 아스파라긴 대신에 글루타민 (Q)과 같은 아미노산을 치환함으로써 글리코실화 부위가 제거될 수 있다. 유리하게는, 이러한 글리코실화 부위에서의 글리코실화 효율을 증가시키는 변형이 도입된다. 적절한 변형의 예로는 위치 500-502에서의 하기의 아미노산 서열이 포함된다: NGS; NKS; NGT; NKT. 증가된 글리코실화를 초래하는 이러한 글리코실화 부위에서의 변형은 실질적으로 증가된 단백질 생산을 또한 초래할 수 있다.
키메라 FG 폴리펩티드 항원을 코딩하는 핵산
본 명세서의 또다른 양상은 상기 기술된 키메라 FG 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 이러한 재조합 핵산은 5' → 3' 방향으로 (1) RSV F 단백질 폴리펩티드 퓨린 절단 도메인 2 (F2 도메인)의 적어도 일부분 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; (2) 아미노산 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; (3) RSV F 단백질 폴리펩티드 퓨린 절단 도메인 1 (F1 도메인)의 적어도 일부분 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (4) RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 코딩된 폴리펩티드 절편들이 상기 개시된 바와 같은 연속된 단일 키메라 폴리펩티드로 생산되도록 성분 폴리뉴클레오티드 서열들이 연결된다.
특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 F2 도메인 (예를 들어, 기준 F 단백질 서열의 아미노산 24-105에 상응함)이 서열 5, 6, 7, 또는 8 중 임의의 것으로부터 선택된 링커에 의해 F1 도메인 (예를 들어, 기준 F 단백질 서열의 아미노산 137-528에 상응함)에 절단불가능하게 연결되고, G 단백질의 아미노산 183-203에 의해 제공되는 면역우세 에피토프를 포함하는 G 단백질 도메인 (예를 들어, 대략적으로 기준 F 단백질 서열의 위치 149에 상응하는 아미노산에서 대략적으로 위치 229에 상응하는 아미노산까지, 예를 들어, 위치 148, 149, 150, 151 또는 152에서 위치 226, 227, 228, 229 또는 230까지)에 인-프레임으로 연결된 키메라 FG 폴리펩티드를 코딩한다. F2 및 F1 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 F 단백질 폴리펩티드, 예컨대 서열 2의 단백질과 같은 천연 발생 F 단백질 (예를 들어, 서열 1), 또는 임의의 또다른 예시적인 F 단백질 폴리펩티드 (예를 들어, WO2008114149에 개시된 것들)를 코딩하는 것으로부터 선택된 F 단백질 폴리펩티드로부터 선택될 수 있다. 별법적으로, F2 및 F1 도메인은 상이한 천연 발생 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하도록 선택될 수 있다. 별법적으로, 변이체에 관한 본원에서의 논의에서 더욱 상세하게 지시된 바와 같이 폴리펩티드가 변형되도록 (예를 들어, 위치 27, 70 및/또는 500에서의 글리코실화 부위가 변형되도록), F2 및 F1 도메인 중 하나 또는 양쪽 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 뉴클레오티드 부가, 결실 또는 치환)를 포함할 수 있다. 유사하게, G 단백질 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 4로부터 또는 WO2008114149에 개시된 변이체들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 선택된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 포유류, 식물 또는 곤충 세포에서의 발현에 대해 코돈이 최적화된다. 복제 및 발현을 용이하게 하기 위해, 핵산이 벡터, 예컨대 원핵생물 또는 진핵생물 벡터 내로 도입될 수 있다. 본원에 개시된 핵산이 다양한 벡터들 (예를 들어, 박테리아성 플라스미드; 파지 DNA; 배큘로바이러스; 효모 플라스미드; 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 거짓광견병, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 기타 다수와 같은 바이러스 DNA, 파지 DNA와 플라스미드의 조합물로부터 유래된 벡터가 포함됨) 중 임의의 벡터 내에 포함될 수 있지만, 가장 통상적으로, 벡터는 폴리펩티드 발현 생성물을 생성시키는데 적절한 발현 벡터일 것이다. 발현 벡터에서, FG 키메라를 코딩하는 핵산은 mRNA 합성을 지시하도록 적합한 전사 제어 서열 (프로모터, 및 임의적인 하나 이상의 인핸서)에 가깝게, 그리고 mRNA 합성을 지시하는 배향으로 전형적으로 배열된다. 즉, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 적합한 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 이같은 프로모터의 예로는 CMV의 극초기 프로모터, LTR 또는 SV40 프로모터, 배큘로바이러스의 폴리히드론 프로모터, 대장균 lac 또는 trp 프로모터, 파지 T7 및 람다 PL 프로모터, 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 이들의 바이러스에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결자를 또한 전형적으로 함유한다. 벡터는 발현을 증폭시키기 위한 적합한 서열을 임의적으로 포함한다. 또한, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 소질, 예컨대 진핵생물 세포 배양에 대한 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성, 또는 대장균에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 저항성을 제공하는 하나 이상의 선별성 마커 유전자를 임의적으로 포함한다.
발현 벡터는, 예를 들어, 번역 효율을 개선하기 위해, 추가적인 발현 요소를 또한 포함할 수 있다. 이러한 신호에는, 예를 들어, ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 번역 개시 코돈 및 관련 서열 요소가 관심 폴리뉴클레오티드 서열과 동시에 적합한 발현 벡터 내로 삽입된다 (예를 들어, 천연 출발 코돈). 이같은 경우에, 추가적인 번역 제어 신호가 요구되지 않는다. 그러나, 폴리펩티드 코딩 서열 또는 이의 일부분만 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈이 포함되는 외인성 번역 제어 신호가 키메라 FG 서열의 발현을 위해 제공된다. 개시 코돈은 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 번역을 확실히 하도록 정확한 판독 프레임 내에 놓인다. 외인성 전사 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 양쪽 모두의 다양한 기원으로부터의 것일 수 있다.
원한다면, 사용 중인 세포 세스템에 적합한 인핸서를 포함함으로써 발현 효율이 추가로 증가될 수 있다 ([Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62]; [Bitter et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544]). 일부 예에서, FG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예컨대 벡터)은 숙주 세포 내로 도입되는 경우 FG 코딩 핵산의 발현을 증가시키고/시키거나 최적화하도록 선택되는 하나 이상의 추가적인 서열 요소를 포함한다. 발현-강화 서열의 한 클래스에는 후생 요소 예컨대 기질 부착 영역 (또는 MAR), 또는 유사한 후생 요소, 예를 들어, STAR 요소 (예를 들어, [Otte et al., Biotechnol. Prog. 23:801-807, 2007]에 개시된 STAR 요소)가 포함된다. 이론에 제한되지 않으면서, MAR은 표적 DNA 서열이 핵 기질에 고정되는 것을 매개하여, 이질염색질(heterochromatin) 코어로부터 바깥쪽으로 확장되는 염색질 루프 도메인을 생성시키는 것으로 여겨진다. MAR은 어떠한 명백한 컨센서스 서열 또는 인식가능한 서열도 함유하지 않지만, 이의 가장 일관된 특색은 전체적으로 높은 A/T 함량, 및 한쪽 가닥에서 우세한 C 염기인 것으로 보인다. 이러한 영역은 가닥이 분리되기 쉬울 수 있는 구부러진 2차 구조를 형성하는 것으로 보이고, 가닥 분리를 위한 핵형성 지점으로 작용할 수 있는 코어-풀기(unwinding) 요소 (CUE)를 포함할 수 있다. 몇몇 단순한 AT-풍부 서열 모티프들이 MAR 서열과 관련되었다: 예를 들어, A-박스 (AATAAAYAAA), T-박스 (TTWTWTTWTT), DNA 풀기 모티프 (AATATATT, AATATT), SATB1 결합 부위 (H-box, A/T/C25), 및 척추동물 (RNYNNCNNGYNGKTNYNY) 또는 초파리(Drosophila) (GTNWAYATTNATNNR)에 대한 컨센서스 토포아이소머레이스(Topoisomerase) II 부위. 예시적인 MAR 서열들이 공개된 미국 특허 출원 번호 20070178469, 및 국제 특허 출원 번호 WO02/074969 (거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. FG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 강화하는데 사용될 수 있는 추가적인 MAR 서열에는 [Girod et al., Nature Methods, 4:747-753, 2007]에 기술된 닭 라이소자임 MAR, MARp1-42, MARp1-6, MARp1-68, 및 MARpx-29 (각각 진뱅크 접속 번호 EA423306, DI107030, DI106196, DI107561, 및 DI106512에 개시됨)가 포함된다. 당업자는 MAR 1-9에 대해 보고된 바와 같이, 중간 수준의 강화를 일으키는 MAR을 선택함으로써 발현이 추가로 조정될 수 있음을 이해할 것이다. 원한다면, 예를 들어, MAR-Finder (futuresoft.org/MarFinder의 웹에서 입수가능), SMARTest (genomatix.de의 웹에서 입수가능), 또는 SMARScan I ([Levitsky et al., Bioinformatics 15:582-592, 1999])과 같은 소프트웨어를 사용하여, 서열 데이터베이스를 검색함으로써 FG 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위한 별법적인 MAR 서열을 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, MAR는 FG 폴리펩티드-코딩 서열과 동일한 핵산 (예를 들어, 벡터) 상에서 숙주 세포 내로 도입된다 (예를 들어, 형질감염된다). 별법적인 실시양태에서, MAR는 별도의 핵산 상에서 도입되고 (예를 들어, 트랜스(trans)), 이는 임의적으로 FG 핵산과 공동-통합될 수 있다.
재조합 FG 핵산의 생산 전반에 걸쳐 당업자를 안내하는데 충분한 예시적인 절차들을 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992] (및 2003년까지의 증보); 및 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999]에서 확인할 수 있다.
키메라 FG 폴리펩티드를 코딩하는 예시적인 핵산이 서열 10 및 12에서 제시된다. 예를 들어, 도 4 및 5에 제시된 바와 같은, RSV의 공지된 (또는 추후에) 발견된 균주들 중 임의의 것으로부터 선택된 유사한 F2, F1 및 G 단백질 폴리펩티드 서열들을 조립함으로써 추가적인 변이체가 생산될 수 있다. 예시적인 변이체들과 서열 동일성을 공유하는 추가적인 서열 변이체들이 당업자에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 핵산 변이체는 1％, 또는 2％, 또는 5％, 또는 10％, 또는 15％, 또는 20％ 이하의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기만큼 상이한 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 즉, 코딩된 폴리펩티드는 80％, 또는 85％ 이상, 더욱 통상적으로는 약 90％ 이상, 예컨대 95％, 또는 심지어 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 공유한다. 당업자는 FG 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들 자체가 유전자 코드의 중복성으로 인해 서열 동일성을 덜 공유할 수 있다는 것을 바로 이해할 것이다.
당업자는 키메라 FG 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열들 간의 유사성이, 일반적인 폴리펩티드 및 뉴클레오티드 서열들에 대한 것과 같이, 서열들 간의 유사성 (다르게는 서열 동일성으로 지칭됨)의 관점에서 표현될 수 있음을 이해할 것이다. 서열 동일성은 동일성 (또는 유사성) 백분율의 관점에서 종종 측정된다; 백분율이 높을수록, 2개의 서열 간의 1차 구조가 더욱 유사하다. 일반적으로, 2개의 아미노산 (또는 폴리뉴클레오티드) 서열의 1차 구조가 더욱 유사할수록, 폴딩 및 조립으로부터 초래되는 더 높은 차원의 구조가 더욱 유사하다. 키메라 FG 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체는 1개 또는 소수의 아미노산 결실, 부가 또는 치환이 있을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 매우 높은 백분율의 아미노산 및 일반적으로는 폴리뉴클레오티드 서열을 공유할 것이다.
서열 동일성을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989]; [Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988]; 및 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]에 기술되어 있다. [Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994]에 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항이 제시된다. 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해, <National Center for Biotechnology Information> (NCBI, Bethesda, MD)이 포함되는 여러 공급원으로부터, 그리고 인터넷 상에서 <NCBI Basic Local Alignment Search Tool> (BLAST) ([Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990])이 입수가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명이 인터넷 상의 NCBI 웹사이트에서 입수가능하다.
2개의 핵산 간의 서열 유사성의 또다른 지표는 혼성화 능력이다. 2개의 핵산의 서열이 유사할수록, 이들이 혼성화할 조건이 더 엄격하다. 혼성화 조건의 엄격도는 서열 의존적이고, 상이한 환경 파라메터 하에 상이하다. 따라서, 특정한 정도의 엄격도를 초래할 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화될 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정할 것이지만, 세정 시간 또한 엄격도에 영향을 미친다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 내지 20℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 (규정된 이온 강도 및 pH 하에) 표적 서열의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도이다. 핵산 혼성화 조건 및 엄격도의 계산을, 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]; [Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993] 및 [Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999]에서 확인할 수 있다.
본 명세서의 목적을 위해, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 표적 서열 간에 25％ 미만의 미스매치가 있는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 더욱 정확한 정의를 위해 특정 수준의 엄격도로 분류될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 "적당한 엄격도" 조건은 25％를 초과하는 서열 미스매치가 있는 분자들이 혼성화하지 않을 조건이고, "중등도의 엄격도" 조건은 15％를 초과하는 미스매치가 있는 분자들이 혼성화하지 않을 조건이며, "고도의 엄격도" 조건은 10％를 초과하는 미스매치가 있는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이다. "매우 고도의 엄격도" 조건은 6％를 초과하는 미스매치가 있는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이다. 반면에, "낮은 엄격도 조건" 하에 혼성화하는 핵산은 서열 동일성이 훨씬 더 낮은 것들 또는 핵산의 짧은 하위서열들에 걸쳐서만 서열 동일성이 있는 것들이 포함된다. 따라서, 본 명세서에 포함되는 핵산의 다양한 변이체들은 실질적으로 자신의 전체 길이에 걸쳐 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 67 또는 69 중 하나 이상과 혼성화할 수 있음이 이해될 것이다.
키메라 RSV 항원성 폴리펩티드의 생산 방법
재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 잘 확립되어 있는 절차를 사용하여 본원에 개시된 키메라 FG 폴리펩티드가 생산된다. 당업자를 안내하기에 충분한 절차들을, 예를 들어, [Sambrook, 상기 문헌], 및 [Ausubel, 상기 문헌]에서 확인할 수 있다. 추가적이고 구체적인 상세사항들이 하기에서 제공된다.
임의의 상기 기술된 키메라 FG RSV 항원을 코딩하는 재조합 핵산, 예컨대 (그러나 이에 한정되지 않음) 서열 10 및 12로 표시되는 예시적인 핵산이 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 전기천공, 리포솜 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 감염, 형질감염 등과 같은 다양한 주지된 절차들 중 임의의 절차에 의해 숙주 세포 내로 도입된다.
따라서, 재조합 키메라 FG 폴리펩티드-코딩 핵산을 포함하는 숙주 세포 또한 본 명세서의 특색이다. 유리한 숙주 세포에는 원핵생물 (즉, 박테리아) 숙주 세포, 예컨대 대장균, 뿐만 아니라 진균류 (예를 들어, 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Picchia pastoris)) 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유류 세포 (예컨대 CHO 세포)가 포함되는 다수의 진핵생물 숙주 세포가 포함된다. 예를 들어, 벡터, 예컨대 발현 벡터를 통해, 재조합 FG 핵산이 숙주 세포 내로 도입 (예를 들어, 형질도입, 형질전환 또는 형질감염)된다. 상기 기술된 바와 같이, 벡터는 가장 전형적으로는 플라스미드이지만, 이같은 벡터는 예를 들어 바이러스 입자, 파지 등일 수도 있다. 적합한 발현 숙주의 예로는 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium); 진균류 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에, 피치아 파스토리스, 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 곤충 세포 예컨대 초파리(Drosophila) 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 포유류 세포 예컨대 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 또는 보웨스(Bowes) 흑색종; 조류 세포가 포함되는 식물 세포가 포함된다.
프로모터 활성화, 형질전환체 선별 또는 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 위해 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 숙주 세포를 배양할 수 있다. 전헝적으로 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 조건이고, 당업자에게, 그리고 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York] 및 이에 인용된 참조문헌이 예를 들어 포함되는 본원에 인용된 참조문헌에서 명백할 것이다. 본 발명의 핵산에 상응하는 발현 생성물이 비-동물 세포 예컨대 식물, 효모, 진균, 박테리아 등에서 또한 생산될 수 있다. [Sambrook, 상기 문헌], [Berger, 상기 문헌] 및 [Ausubel, 상기 문헌]에 더하여, 세포 배양에 관한 상세사항을 [Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; [Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 [Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]에서 확인할 수 있다.
박테리아 시스템에서, 발현 생성물에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 폴리펩티드 또는 이의 단편이 항체의 생산에 필요한 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 유리하게 사용된다. 이같은 벡터에는 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 관심 코딩 서열, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 베타-갈락토시데이스의 아미노-말단 번역 개시 메티오닌 및 이어지는 7개의 잔기에 대한 서열과 인-프레임으로 벡터 내로 결찰되어, 촉매적으로 활성인 베타 갈락토시데이스 융합 단백질이 생산될 수 있는 BLUESCRIPT (Stratagene); pIN 벡터 ([Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509]); 아미노-말단 메티오닌이 히스티딘 태그와 인-프레임으로 결찰된 pET 벡터 (Novagen, Madison WI) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
유사하게, 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에에서, 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터가 원하는 발현 생성물의 생산에 사용될 수 있다. 리뷰를 위해, [Berger, 상기 문헌] [Ausubel, 상기 문헌], 및, 예를 들어, [Grant et al. 1987; Methods in Enzymology 153:516-544]을 참조한다. 포유류 숙주 세포에서, 플라스미드 및 바이러스-기반 시스템 양쪽 모두가 포함되는 다수의 발현 시스템이 이용될 수 있다.
삽입된 서열의 발현을 조정하거나 발현된 단백질을 원하는 방식으로 프로세싱하는 능력에 대해 숙주 세포가 임의적으로 선택된다. 단백질의 이같은 변형에는 글리코실화 (뿐만 아니라, 예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 지질화 및 아실화)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 번역후 프로세싱, 예를 들어, 전구체 형태를 성숙된 형태의 단백질로 (예를 들어, 퓨린 프로티에이스에 의해) 절단하는 프로세싱이 숙주 세포의 정황에서 임의적으로 수행된다. 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 등과 같은 여러 숙주 세포들이 이같은 번역후 활성에 대한 특이적인 세포 기구 및 특징적인 메커니즘을 지니고, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 확실히 하도록 선택될 수 있다.
본원에 개시된 핵산에 의해 코딩되는 재조합 키메라 FG 폴리펩티드의 장기간의 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현 시스템이 전형적으로 사용된다. 예를 들어, 키메라 FG 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주를 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택성 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포 내로 도입한다. 벡터의 도입 후, 세포를 강화 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 후, 선별 배지로 전환시킨다. 선별성 마커의 목적은 선별에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 예를 들어, 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 군 또는 콜로니가 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 임의적으로, 키메라 FG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 코딩된 단백질의 세포 배양물로부터의 발현 및 회수에 적절한 조건 하에 배양한다.
적절한 숙주 세포주의 형질도입 및 적합한 세포 밀도로의 숙주 세포의 성장 후, 선택된 프로모터를 적합한 수단 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)로 유도하고, 세포를 추가적인 기간 동안 배양한다. 그후, 분비된 폴리펩티드 생성물을 배양 배지로부터 회수한다. 별법적으로, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성된 미정제 추출물을 추가적인 정제를 위해 유지시킬 수 있다. 단백질의 발현에 사용된 진핵생물 또는 미생물 세포를 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용이 포함되는 임의의 편리한 방법, 또는 당업자에게 주지되어 있는 기타 방법에 의해 파괴시킬 수 있다.
발현된 키메라 FG 폴리펩티드를 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 임의의 본원에서 언급된 태그부착 시스템을 사용함), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피가 포함되는, 당업계에 주지된 다수의 방법들 중 임의의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 성숙된 단백질의 입체형상을 완성시키는 것에서, 원한다면, 단백질 리폴딩(refolding) 단계를 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 최종 정제 단계에서 사용할 수 있다. 상기 언급된 참고문헌들에 더하여, 예를 들어, [Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.]; 및 [Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY]; [Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ], [Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.]; [Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY]; [Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY]; 및 [Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ]에 기재된 것들이 포함되는 다양한 정제 방법이 당업계에 주지되어 있다.
특정 예에서, 원핵생물 세포, 예를 들어, 대장균 세포에서의 도입 및 발현에 적절한 벡터 내로 핵산이 도입된다. 예를 들어, FG 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 다양한 시판되거나 독점적인 벡터들 중 임의의 것, 예컨대 pET 시리즈의 발현 벡터 (예를 들어, pET19b 및 pET21d) 내로 도입될 수 있다. IPTG에 의해 코딩 서열의 발현이 유도될 수 있어, 높은 수준의 단백질 발현이 초래된다. 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 파지 T7 프로모터 하에 전사된다. 별법적인 벡터, 예컨대 열-유도성 람다 pL 프로모터를 포함하는 pURV22가 또한 적절하다.
적절한 박테리아 숙주 내로 (예를 들어, 전기천공에 의해) 발현 벡터가 도입된다. 수많은 적절한 대장균 균주가 이용가능하고, 당업자에 의해 선택될 수 있다 (예를 들어, 로제타(Rosetta) 및 BL21 (DE3) 균주가 FG 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 벡터의 발현에 유리한 것으로 입증되었다).
또다른 예에서, 키메라 FG 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포) 내로의 도입에 적절한 벡터 내로 클로닝된다. 이러한 예시적인 실시양태에서, 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 론자 바이오로지칼스(Lonza Biologicals) 사에서 개발된 pEE14 벡터 내로 도입한다. 키메라 폴리펩티드가 구성적 프로모터인 극초기 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터 하에 발현된다. 키메라를 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포의 선별은 형질전환된 세포가 글루타민 공급원의 부재 하에 성장하는 능력을 기초로 이루어진다. pEE14 벡터가 GS (글루타민 신쎄테이스(Glutamine Synthetase)) 효소를 발현하기 때문에, pEE14가 성공적으로 통합된 세포는 외인성 글루타민의 부재 하에 성장할 수 있다. 선택된 세포를 클로닝에 의해 확장시키고, 키메라 폴리펩티드의 발현에 대해 특성화할 수 있다.
또다른 예에서, FG 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)을 사용하여 곤충 세포 내로 도입된다. 시판되는 벡터, 키트 및/또는 시스템, 예컨대 BD 바이오사이언스(BD BioScience)로부터의 BD 배큘로골드(BD BaculoGold) 시스템을 사용하여, 곤충 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 생성시킬 수 있다. 간략하게, FG 키메라 RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 pAcSG2 전달 벡터 내로 삽입한다. 그후, 숙주 세포 SF9 (스포돕테라 프루기데르다)를 배큘로바이러스인 오토그라파 칼리포르니카 핵 다면체형성 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)의 선형화된 게놈 DNA를 함유하는 BD 배큘로골드 및 pAcSG2-키메라 플라스미드로 공동-형질감염시킨다. 형질감염 후, pACSG2 플라스미드와 배큘로바이러스 게놈 사이에 상동 재조합이 발생하여 재조합 바이러스가 생성된다. 한 예에서, 키메라 RSV 항원이 폴리헤드린 프로모터 (pH)의 조절 제어 하에 발현된다. 염기성 (Ba) 및 p10 프로모터와 같은 또다른 프로모터를 사용하여 유사한 전달 벡터를 생산할 수 있다. 유사하게, 별법적인 곤충 세포, 예컨대 Sf9에 밀접하게 관련된 SF21, 및 양배추 자벌레인 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터 유래된 하이 파이브(High Five) (Hi5) 세포주를 사용할 수 있다.
형질감염 및 발현 유도 (선택된 프로모터 및/또는 인핸서 또는 기타 조절 요소에 따른 유도) 후, 발현된 키메라 폴리펩티드를 회수하고 (예를 들어, 정제 또는 강화하고), 항원 면에서 활성인 입체형상으로 폴딩되는 것을 확실히 하도록 재생시킨다. 전형적으로, 항원 면에서 활성인 입체형상은 키메라 FG 폴리펩티드의 다량체이다. 유리하게는, 다량체는 3량체이다.
면역원성 조성물 및 방법
키메라 FG 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공된다. 수많은 제약상 허용되는 희석제 및 담체 및/또는 제약상 허용되는 부형제가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에 기술되어 있다.
일반적으로, 희석제, 담체 및/또는 부형제의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 좌우될 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 제약상 및 생리학적으로 허용되는 유체 예컨대 물, 생리식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 비히클로서 포함하는 주사용 유체를 일반적으로 포함한다. 특정 제형 (예를 들어, 파우더 형태와 같은 고체 조성물)에서는, 액체 희석제가 사용되지 않는다. 이같은 제형에서, 제약 등급의 트레할로스, 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산마그네슘이 예를 들어 포함되는 비-독성 고체 담체가 사용될 수 있다.
따라서, 선택된 투여 경로에 의해 대상에게 전달하기에 적절한 제형이 생산되도록 당업자가 적절한 부형제 및 담체를 선택할 수 있다.
특정 예들이 상기 표 1에서 제공된다. 추가적인 부형제에는, 비제한적으로, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 유리 형성 폴리올 (예컨대, 소르비톨, 트레할로스), N-라우로일사크로신 (예를 들어, 나트륨 염), L-프롤린, 비-세제성 설포베타인, 구아니딘 하이드로클로라이드, 요소, 트리메틸아민 옥시드, KCl, Ca2 +, Mg2 +, Mn2+, Zn2 + (및 기타 2가 양이온 관련 염), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트롤, β-메르캅토에탄올, 세제 (트윈(Tween)80, 트윈20, 트리톤(Triton) X-100, NP-40, 엠피젠 BB(Empigen BB), 옥틸글루코시드(Octylglucoside), 라우로일 말토시드(Lauroyl maltoside), 쯔비터젠트(Zwittergent) 3-08, 쯔비터젠트 3-10, 쯔비터젠트 3-12, 쯔비터젠트 3-14, 쯔비터젠트 3-16, CHAPS, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 세틸트리메틸암모늄 브로마이드가 예를 들어 포함됨)가 포함된다.
특정한 바람직한 예에서, 면역원성 조성물은 애주번트를 또한 포함한다. 키메라 FG 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 적절한 애주번트는, 본원에 개시된 FG 항원과 조합되어, 대상에게 투여되는 경우 안전하고 최소한도로 반응발생성(reactogenic)인 애주번트이다.
FG 키메라 항원과 조합하여 사용하기 위한 한 적절한 애주번트는 비-독성 박테리아 지질다당류 유도체이다. 지질 A의 적절한 비-독성 유도체의 예는 모노포스포릴 지질 A, 더욱 특히 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)이다. 3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이올로지칼스 엔.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals N.A.)에서 MPL이라는 명칭으로 판매되고, 본 문서 전반에 걸쳐 MPL 또는 3D-MPL로 지칭된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094 참조. 3D-MPL은 IFN-γ (Th1) 표현형의 CD4+ T 세포 응답을 주로 촉진한다. GB2220211 A에 개시된 방법에 따라 3D-MPL을 생산할 수 있다. 화학적으로, 이는 3, 4, 5 또는 6개의 아실화 사슬이 있는 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서, 소형 입자 3D-MPL이 사용될 수 있다. 소형 입자 3D-MPL은 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 지닌다. 이같은 제제가 WO94/21292에 기술되어 있다.
상기 지질다당류, 예컨대 3D-MPL은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 1 내지 50 ㎍ 사이의 양으로 사용될 수 있다. 이같은 3D-MPL은 약 25 ㎍의 수준, 예를 들어 20-30 ㎍ 사이, 적절하게는 21-29 ㎍ 사이 또는 22 내지 28 ㎍ 사이 또는 23 내지 27 ㎍ 사이 또는 24 내지 26 ㎍ 사이, 또는 25 ㎍으로 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 인간 용량의 면역원성 조성물은 약 10 ㎍의 수준, 예를 들어 5 내지 15 ㎍ 사이, 적절하게는 6 내지 14 ㎍ 사이, 예를 들어 7 내지 13 ㎍ 사이 또는 8 내지 12 ㎍ 사이 또는 9 내지 11 ㎍ 사이, 또는 10 ㎍으로 3D-MPL을 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 인간 용량의 면역원성 조성물은 약 5 ㎍의 수준, 예를 들어 1 내지 9 ㎍ 사이, 또는 2 내지 8 ㎍ 사이 또는 적절하게는 3 내지 7 ㎍ 사이 또는 4 내지 ㎍ 사이, 또는 5 ㎍으로 3D-MPL을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 지질다당류는 미국 특허 번호 6,005,099 및 EP 특허 번호 0 729 473 B1에 기술된 바와 같은 β(1-6) 글루코사민 이당류일 수 있다. 당업자는 이러한 참조문헌의 교시를 기초로 다양한 지질다당류, 예컨대 3D-MPL을 쉽게 생산할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 각각의 이러한 참조문헌은 거명에 의해 본원에 포함된다. 상기 언급된 면역자극제 (구조 면에서 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL과 유사함)에 더하여, 상기 MPL 구조에 대해 하위-일부분(sub-portion)인 아실화 단당류 및 이당류 유도체가 또한 적절한 애주번트이다. 또다른 실시양태에서, 애주번트는 지질 A의 합성 유도체이고, 이의 일부는 TLR-4 작동제로 기술되고, 하기의 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다:
OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디하이드로겐포스페이트), (WO 95/14026)
OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디하이드로게노포스페이트) (WO 99/64301 및 WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-하이드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디하이드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트) (WO 01/46127)
사용될 수 있는 또다른 TLR4 리간드는 알킬 글루코사미니드 포스페이트 (AGP) 예컨대 WO 98/50399 또는 미국 특허 번호 6,303,347 (AGP의 제조 공정이 또한 개시되어 있음)에 개시된 것들, 적절하게는 RC527 또는 RC529 또는 미국 특허 번호 6,764,840에 개시된 바와 같은 AGP의 제약상 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 작동제이고, 일부는 TLR4 길항제이다. 양쪽 모두 애주번트로서 유용한 것으로 생각된다.
TLR-4 ([Sabroe et al., JI 2003 p1630-5])를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 또다른 적절한 TLR-4 리간드는, 예를 들어, 감마-음성 박테리아로부터의 지질다당류 및 이의 유도체, 또는 이들의 단편, 특히 LPS (예컨대 3D-MPL)의 비-독성 유도체이다. 또다른 적절한 TLR 작동제는 열 충격(heat shock) 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고당류, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 및 무라밀 디펩티드 (MDP)이다. 한 실시양태에서, TLR 작동제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 또다른 적절한 TLR-4 리간드는 WO 2003/011223 및 WO 2003/099195에 개시된 바와 같고, 예컨대 WO2003/011223의 4-5면 또는 WO2003/099195의 3-4면에 개시된 화합물 I, 화합물 II 및 화합물 III, 특히 WO2003/011223에 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, 및 ER804764로 개시된 화합물이다. 예를 들어, 한 적절한 TLR-4 리간드는 ER804057이다.
추가적인 TLR 작동제들이 애주번트로서 또한 유용하다. 용어 "TLR 작동제"는 직접적인 리간드로서 또는 간접적으로 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해 TLR 신호전달 경로를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 작용제를 지칭한다. 이같은 천연 또는 합성 TLR 작동제들이 별법적인 또는 추가적인 애주번트로서 사용될 수 있다. 애주번트 수용체로서의 TLR의 역할의 간략한 리뷰가 [Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002]에서 제공된다. 이러한 잠재적인 애주번트들에는 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9에 대한 작동제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 애주번트 및 면역원성 조성물은 TLR-1 작동제, TLR-2 작동제, TLR-3 작동제, TLR-4 작동제, TLR-5 작동제, TLR-6 작동제, TLR-7 작동제, TLR-8 작동제, TLR-9 작동제, 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 애주번트를 더 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, TLR-1을 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-1을 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 트리-아실화 리포펩티드 (LP); 페놀-가용성 모둘린(modulin); 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) LP; 박테리아 지질단백질의 아세틸화 아미노 말단을 모방하는 S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 트리하이드로클로라이드 (Pam3Cys) LP 및 보렐리아 부르도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터의 OspA LP로부터 선택된다.
별법적인 실시양태에서, TLR-2를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-2를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 보렐리아 부르도르페이 또는 트레포네마 팔리둠(T pallidum)으로부터의 지질단백질, 펩티도글리칸, 박테리아 리포펩티드; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)가 포함되는 종으로부터의 펩티도글리칸; 리포테이코산, 만누론산, 네이세리아(Neisseria) 포린, 박테리아 핌브리아에(fimbriae), 예르시나(Yersina) 독력 인자, CMV 비리온, 홍역 혈구응집소, 및 효모로부터의 자이모산 중 하나 이상이다.
별법적인 실시양태에서, TLR-3을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-3을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 바이러스 감염과 관련된 분자성 핵산 패턴인 폴리이노신산-폴리사이티딜산 (폴리 IC(Poly IC))이다.
별법적인 실시양태에서, TLR-5를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-5를 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 박테리아 플라젤린(flagellin)이다.
별법적인 실시양태에서, TLR-6을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-6을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 마이코박테리아 지질단백질, 디-아실화 LP, 및 페놀-가용성 모둘린이다. 추가적인 TLR6 작동제들이 WO 2003/043572에 기술되어 있다.
별법적인 실시양태에서, TLR-7을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-7을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 록소리빈, 위치 N7 및 C8에서의 구아노신 유사체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물, 또는 이들의 유도체이다. 한 실시양태에서, 이러한 TLR 작동제는 이미퀴모드(imiquimod)이다. 추가적인 TLR7 작동제들이 WO 2002/085905에 기술되어 있다.
별법적인 실시양태에서, TLR-8을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 적절하게는, TLR-8을 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 항-바이러스 활성이 있는 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들어 레시퀴모드(resiquimod) (R848)이고, 레시퀴모드는 TLR-7에 의한 인식이 또한 가능하다. 사용될 수 있는 또다른 TLR-8 작동제에는 WO 2004/071459에 기술된 것들이 포함된다.
별법적인 실시양태에서, TLR-9를 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제가 사용된다. 한 실시양태에서, TLR-9를 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 HSP90이다. 별법적으로, TLR-9를 통한 통한 신호전달 응답을 야기할 수 있는 TLR 작동제는 박테리아 또는 바이러스 DNA, 메틸화되지 않은 CpG 뉴클레오티드, 특히 CpG 모티프로 공지된 서열 환경을 함유하는 DNA이다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 주로 Th1 응답을 유도한다. 이같은 올리고뉴클레오티드들이 주지되어 있고, 예를 들어, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 번호 6,008,200 및 5,856,462에 기술되어 있다. 적절하게는, CpG 뉴클레오티드는 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 적절한 올리고뉴클레오티드는 3개 이상, 적절하게는 6개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 임의적으로 함유하는, CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 사이토신 뉴클레오티드에 이어진 구아닌 뉴클레오티드이다. 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드간(internucleotide) 부분은 포스포로디티오에이트, 또는 적절하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스테르 및 기타 뉴클레오티드간 결합이 본 발명의 범주 내에 속한다. 혼합된 뉴클레오티드간 결합이 있는 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트의 제조 방법이 미국 특허 번호 5,666,153, 5,278,302 및 WO 95/26204에 기술되어 있다.
예를 들어, 자체적으로 또는 3D-MPL 또는 본원에 기술된 다른 애주번트와 조합되어, 키메라 FG 폴리펩티드와 함께 면역원성 조성물에서 사용될 수 있는 또다른 애주번트는 사포닌, 예컨대 QS21이다.
사포닌은 [Lacaille-Dubois, M and Wagner H., 1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386]에 교시되어 있다. 사포닌은 식물 및 해양 동물 계에 광범위하게 분포되어 있는 스테로이드 또는 트리테르펜 글리코시드이다. 진탕 시 발포되는 수중 콜로이드 용액을 형성하고, 콜레스테롤을 침전시키는 것에 대해 사포닌이 주목된다. 사포닌이 세포막 주변에 있을 때, 이는 막이 파열되도록 하는 공극-유사 구조를 막 내에 생성시킨다. 적혈구 용혈이 이러한 현상의 예이고, 이는 전체는 아니지만 특정 사포닌의 성질이다.
사포닌은 전신 투여용 백신에서 애주번트로 공지되어 있다. 개별적인 사포닌의 애주번트 및 용혈 활성이 당업계에서 광범위하게 연구되었다 ([Lacaille-Dubois and Wagner, 상기 문헌]). 예를 들어, 퀼 A(Quil A) (남아메리카산 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래됨), 및 이의 분획이 US 5,057,540 및 ["Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55]; 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. 면역 자극 복합체 (ISCOMS: Immune Stimulating Complex)로 명명된, 퀼 A의 분획을 포함하는 미립자 구조물이 용혈성이고, 백신 제작에 사용되었다 (Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (퀼 A의 HPLC 정제 분획)이 강력한 전신 애주번트로서 기술되었고, 이들의 제조 방법이 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 5,057,540 및 EP 0 362 279 B1에 개시되어 있다. 전신 예방 접종 연구에서 사용된 또다른 사포닌에는 집소필라(Gypsophila) 및 사포나리아(Saponaria)와 같은 또다른 식물 종으로부터 유래된 것들이 포함된다 ([Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992]). QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된, HPLC로 정제된 비-독성 분획이다. QS21의 제조 방법이 미국 특허 번호 5,057,540에 기술되어 있다. QS21을 함유하는 비-반응발생성 애주번트 제형이 WO 96/33739에 기술되어 있다. 상기 언급된 참고문헌들은 거명에 의해 본원에 포함된다. 상기의 면역학적으로 활성인 사포닌, 예컨대 QS21은 면역원성 조성물의 인간 용량 당 1 내지 50 ㎍ 사이의 양으로 사용될 수 있다. 유리하게는, QS21은 약 25 ㎍의 수준, 예를 들어 20-30 ㎍ 사이, 적절하게는 21-29 ㎍ 사이 또는 22-28 ㎍ 사이 또는 23-27 ㎍ 사이 또는 24-26 ㎍ 사이, 또는 25 ㎍으로 사용된다. 또다른 실시양태에서, 인간 용량의 면역원성 조성물은 QS21을 약 10 ㎍의 수준, 예를 들어 5 내지 15 ㎍ 사이, 적절하게는 6-14 ㎍ 사이, 예를 들어 7-13 ㎍ 사이 또는 8-12 ㎍ 사이 또는 9-11 ㎍ 사이, 또는 10 ㎍으로 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 인간 용량의 면역원성 조성물은 QS21을 약 5 ㎍의 수준, 예를 들어 1-9 ㎍ 사이, 또는 2-8 ㎍ 사이 또는 적절하게는 3-7 ㎍ 사이 또는 4-6 ㎍ 사이, 또는 5 ㎍으로 포함한다. QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 이같은 제형은 항원과 함께 제형되는 경우 성공적인 Th1 자극 애주번트인 것으로 나타났다. 따라서, 예를 들어, 키메라 FG 폴리펩티드가 QS21 및 콜레스테롤의 조합물을 포함하는 애주번트와 함께 면역원성 조성물에서 유리하게 사용될 수 있다.
임의적으로, 애주번트는 무기 염 예컨대 알루미늄 또는 칼슘 염, 특히 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄 또는 "백반")과 조합된 3D-MPL을 함유하는 애주번트가 인간 대상에게 투여하기 위한 키메라 FG 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물에서의 제형에 적절하다.
키메라 FG 폴리펩티드와 함께 제형에서 사용하기 위한 적절한 Th1 편향 애주번트의 또다른 클래스에는 OMP-기반 면역자극 조성물이 포함된다. OMP-기반 면역자극 조성물은, 예를 들어, 비내 투여를 위해, 점막 애주번트로서 특히 적절하다. OMP-기반 면역자극 조성물은 네이세리아 종과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 그람(Gram)-음성 박테리아로부터의 외막 단백질 (OMP, 약간의 포린(porin) 포함)의 제제 부류이고 (예를 들어, [Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988]; [Lowell et al., Science 240:800, 1988]; [Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984]; [Lowell, "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997]; 미국 특허 번호 5,726,292; 미국 특허 번호 4,707,543 참조), 이는 박테리아 또는 바이러스 항원과 같은 면역원에 대한 담체로서 또는 이에 대한 조성물에서 유용하다. 일부 OMP-기반 면역자극 조성물은 "프로테오솜(Proteosome)"으로 지칭될 수 있고, 이는 소수성이고 인간에서의 사용에 대해 안전하다. 프로테오솜은 약 20 nm 내지 약 800 nm의 소포 또는 소포-유사 OMP 클러스터로 자가-조립되는, 그리고 단백질 항원 (Ag), 특히 소수성 모이어티가 있는 항원을 비공유결합적으로 혼입하거나, 이와 배위 결합되거나, 회합 (예를 들어, 정전기적으로 또는 소수성으로)되거나, 다른 방식으로 조합되는 능력을 지닌다. 하나 이상의 OMP의 다중 분자 막 구조 또는 용융 구체-유사 OMP 조성물이 포함되는 소포 형태 또는 소포-유사 형태 내의 외막 단백질 성분을 초래하는 임의의 제조 방법이 프로테오솜의 정의에 포함된다. 프로테오솜은, 예를 들어, 당업계에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,726,292 또는 미국 특허 번호 5,985,284 참조). 프로테오솜은 OMP 포린을 생산하는데 사용된 박테리아 (예를 들어, 네이세리아 종)로부터 기원하는 내인성 지질다당류 또는 지질올리고당류 (각각 LPS 또는 LOS)을 또한 함유할 수 있고, 이는 일반적으로 전체 OMP 제제의 2％ 미만일 것이다.
프로테오솜은 세제에 의해 용액 내에서 유지되는, 수막염균(Neisseria meningitidis)으로부터의 화학적으로 추출된 외막 단백질 (OMP) (대부분 포린 A 및 B, 뿐만 아니라 클래스 4 OMP)로 주로 구성된다 ([Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206]). 프로테오솜은 예를 들어 투석여과 또는 전통적인 투석 공정에 의해 바이러스 공급원으로부터 유래된 정제된 단백질 또는 재조합 단백질과 같은 다양한 항원 (본원에 개시된 키메라 FG 폴리펩티드 포함)과 함께 제형될 수 있다. 세제를 점진적으로 제거하면 직경이 약 100-200 nm인 소수성 미립자 복합체가 형성되게 된다 ([Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206]).
본원에서 사용된 "프로테오솜:LPS 또는 프로톨린(Protollin)"은, 예를 들어, 외인성 첨가에 의해, OMP-LPS 조성물 (이는 면역자극 조성물로 기능할 수 있다)을 제공하도록 하나 이상의 종류의 지질다당류와 함께 혼합된 프로테오솜의 제제를 지칭한다. 따라서, OMP-LPS 조성물은 (1) 그람-음성 박테리아, 예컨대 수막염균으로부터 제조된 프로테오솜의 외막 단백질 제제 (예를 들어, 프로주반트(Projuvant)), 및 (2) 하나 이상의 지질당류의 제제를 포함하는 프로톨린의 기본 성분들 중 2개로 구성될 수 있다. 지질올리고당류는 내인성일 수 있거나 (예를 들어, OMP 프로테오솜 제제와 함께 천연적으로 함유됨), 외인성으로 제조된 지질올리고당류 (예를 들어, OMP 제제 이외의 상이한 미생물 또는 배양물로부터 제조됨)로부터 OMP 제제와 혼합 또는 조합될 수 있거나, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 이같은 외인성으로 첨가된 LPS는 OMP 제제가 제조된 것과 동일한 그람-음성 박테리아로부터의 것이거나 또는 상이한 그람-음성 박테리아로부터의 것일 수 있다. 프로톨린은 지질, 당지질, 당단백질, 소형 분자 등, 및 이들의 조합물을 임의적으로 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0044425에 기술된 바와 같이, 프로톨린을 제조할 수 있다.
여러 애주번트들, 예컨대 상기에서 언급된 것들의 조합물이 키메라 FG 폴리펩티드와 함께 조성물에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 앞서 언급된 바와 같이, QS21이 3D-MPL과 함께 제형될 수 있다. 전형적으로 QS21:3D-MPL의 비율은 대략 1:10 내지 10:1, 예컨대 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 전형적으로, 이러한 비율은 2.5:1 내지 1:1 3D-MPL:QS21의 범위이다. 또다른 조합 애주번트 제형은 3D-MPL 및 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄을 포함한다. 조합되어 제형되는 경우, 이러한 조합물은 항원-특이적 Th1 면역 응답을 강화시킬 수 있다.
일부 예에서, 애주번트 제형은 리포솜, 수중유 에멀션, 또는 무기질 염 예컨대 칼슘 또는 알루미늄 염, 예를 들어, 인산칼슘, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 포함한다.
수중유 에멀션의 한 예는 수성 담체 내에 대사가능한 오일, 예컨대 스쿠알렌, 토콜 예컨대 알파-토코페롤, 및 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80을 포함하고, 어떠한 추가적인 면역자극제(들)도 함유하지 않으며, 특히 비-독성 지질 A 유도체 (예컨대 3D-MPL) 또는 사포닌 (예컨대 QS21)을 함유하지 않는다. 수성 담체는, 예를 들어, 포스페이트 완충 염수일 수 있다. 추가적으로, 수중유 에멀션은 스팬(span) 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 항원 또는 항원 조성물과, 수중유 에멀션을 포함하고 임의적으로 하나 이상의 추가적인 면역자극제를 포함하는 애주번트 조성물을 포함하고, 이때 상기 수중유 에멀션이 0.5-10 ㎎의 대사가능한 오일 (적절하게는 스쿠알렌), 0.5-11 ㎎의 토콜 (적절하게는 알파-토코페롤) 및 0.4-4 ㎎의 유화제를 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
한 구체적인 실시양태에서, 애주번트 제형은 에멀션, 예컨대 수중유 에멀션의 형태로 제조된 3D-MPL을 포함한다. 일부 경우에, 에멀션은 WO 94/21292에 개시된 바와 같이 직경 0.2 ㎛ 미만의 작은 입자 크기를 지닌다. 예를 들어, 3D-MPL의 입자는 0.22 ㎛ 막을 통해 멸균 여과되기에 충분히 작을 수 있다 (유럽 특허 번호 0 689 454에 기술된 바와 같음). 별법적으로, 3D-MPL은 리포솜 제형으로 제조될 수 있다. 임의적으로, 3D-MPL (또는 이의 유도체)을 함유하는 애주번트는 추가적인 면역자극 성분을 또한 포함한다.
예를 들어, 키메라 FG 폴리펩티드 항원이 있는 면역원성 조성물이 영아에게 투여하기 위해 제형되는 경우, 애주번트의 투여량은 영아 대상에서 효과적이고 비교적 비-반응발생성이도록 결정된다. 일반적으로, 영아 제형에서의 애주번트의 투여량은 성인 (예를 들어, 65세 이상의 성인)에게 투여하기 위해 디자인된 제형에서 사용되는 것보다 더 낮다. 예를 들어, 3D-MPL의 양은 전형적으로 용량 당 1 ㎍ 내지 200 ㎍, 예컨대 10 내지 100 ㎍, 또는 10 ㎍ 내지 50 ㎍ 범위이다. 전형적으로 영아 용량은 이러한 범위에서 한계가 더 낮고, 예를 들어, 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예컨대 약 2 ㎍, 또는 약 5 ㎍, 또는 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 또는 내지 약 50 ㎍이다. 전형적으로, QS21이 제형에서 사용되는 경우, 범위가 유사하다 (그리고, 상기 지시된 비율에 따름). 성인 및 노인 집단에 대해, 제형은 영아 제형에서 전형적으로 발견되는 것보다 많은 애주번트 성분을 전형적으로 포함한다. 수중유 에멀션을 사용하는 특정 제형에서, 이같은 에멀션은 추가적인 성분, 예를 들어, 콜레스테롤, 스쿠알렌, 알파 토코페롤, 및/또는 세제, 예컨대 트윈 80 또는 스팬85를 포함할 수 있다. 예시적인 제형에서, 이같은 성분은 하기의 양으로 존재할 수 있다: 약 1-50 mg 콜레스테롤, 2 내지 10％ 스쿠알렌, 2 내지 10％ 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3％ 트윈 80. 전형적으로, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비율은 1 이하인데, 이러한 비율이 더욱 안정적인 에멀션을 제공하기 때문이다. 일부 경우에, 제형은 안정화제를 또한 함유할 수 있다. 백반이 존재하는 경우 (예를 들어, 3D-MPL와 조합되어), 이의 양은 전형적으로 용량 당 약 100 ㎍ 내지 1 mg 사이, 예컨대 약 100 ㎍, 또는 약 200 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 예컨대 약 500 ㎍이다.
면역원성 조성물은 전형적으로 면역보호적인 양 (또는 이의 분할 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 면역원성 조성물 (인간 대상에게 투여하기 위한 것 포함)의 제조가 [Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell and Newman Eds., Plenurn Press, 1995], [New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. Eds., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 일반적으로 기술되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화가, 예를 들어, 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 4,235,877에 기술되어 있다. 거대분자에 단백질을 접합시키는 것이, 예를 들어, 리카이트(Likhite)의 미국 특허 4,372,945 및 아모르(Armor) 등의 미국 특허 4,474,757에 개시되어 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물의 각각의 용량 내의 단백질의 양은 전형적인 대상에서 유의한 불리한 부작용 없이 면역보호적 응답을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 정황에서의 면역보호적은 반드시 감염에 대해 완전하게 보호적인 것을 의미할 필요는 없다; 이는 증상 또는 질환, 특히 바이러스와 관련된 중증 질환에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 어떠한 특이적 면역원이 사용되는지에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 각각의 인간 용량이 1-1000 ㎍의 단백질, 예컨대 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 예를 들어, 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예컨대 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 5 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 또는 약 50 ㎍을 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에서 사용되는 양은 대상 집단 (예를 들어, 영아 또는 노인)을 기초로 선택된다. 대상에서의 항체 역가 및 기타 응답의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 특정 조성물에 대한 최적의 양을 확인할 수 있다. 최초의 예방 접종 후, 약 4주 내에 대상에게 추가접종을 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1: 예시적인 키메라 RSV 폴리펩티드 항원
예시적인 진핵생물 FG 폴리펩티드
예시적인 진핵생물 키메라 FG V1-1 및 FG V2-1을 본 명세서에 따라 생산하였다. 이같은 예시적인 FG 키메라의 서열이 서열 10 및 11에서 제공된다. 키메라 FG 폴리펩티드는 F0 천연 신호 서열을 포함하였다. 신호 서열의 혼입은 번역후 변형, 예컨대 글리코실화를 강화한다. 이러한 예시적인 실시양태에서, 퓨린 인식 모티프 양쪽 모두가 제거되었고, 링커가 F2 도메인과 F1 도메인 사이에 삽입되었다. FG V1-1 및 FG V2-1 내에 존재하는 링커의 서열이 각각 서열 5 및 6에서 제공된다.
GS 발현 시스템을 사용하여 포유류 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되도록 이러한 예시적인 재조합 단백질이 디자인되었다. 글루타민이 없는 배지에서 성장된 CHO 세포는 최적의 성장을 위해 외인성 글루타민을 필요로 한다. 키메라 FG 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pEE14 벡터로 CHO 세포가 형질감염되면, 이러한 시스템은 pEE14 벡터에 의한 글루타민 신쎄이스(synthase)의 발현으로 인해 대사 결핍을 통해 안정적인 클론을 선별할 수 있게 한다. 여기에 기술된 구축물은 CHO 세포에서의 발현을 위해 생산되었지만, 이러한 구축물은 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)을 사용하는 발현을 위해 동등하게 생산될 수 있다.
실시예 2: 키메라 RSV 폴리펩티드에 의한 인간 혈청에서의 중화 억제
지원자로부터 수득된 인간 혈청을 ELISA에 의해 RSV A에 대한 반응성에 대해 스크리닝하였고, 기존의 RSV 중화 잠재력 역가측정을 기초로 하는 관련된 희석도로 중화 억제 (NI) 분석법에서 사용하였다. 혈청을 25 ㎍/㎖ 농도의 억제제 단백질과 혼합하고, 1.5 내지 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 둥근 바닥 96웰 플레이트에서, 혈청 및 단백질을 고정된 농도의 RSV A와 혼합하고, 20분 동안 33℃에서 인큐베이션하였다. 그후, 혈청-억제제-바이러스 혼합물을 베로(Vero) 세포가 앞서 파종된 편평 바닥 96웰 플레이트 내에 놓고, 추가로 5-6일 동안 33℃에서 5％ CO2와 함께 인큐베이션한 후, 면역형광 분석법으로 NI 역가를 검출하였다.
역가를 리드-뮌히(Reed-Muench) 방법을 사용하여 계산하였고, NI의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: [(25 ㎍/㎖ 억제제의 NI 역가 - 0 ㎍/㎖ 억제제의 NI 역가) / 0 ㎍/㎖ 억제제의 NI 역가] × 100.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Blais, Normand Rheault, Patrick <120> CHIMERIC ANTIGENS <130> VU63077 <150> 61/081,888 <151> 2008-07-18 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1697 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 1 atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 gttttgcttc tggtcaaaac atcactgaag aattttatca atcaacatgc agtgcagtag 120 caaaggctat cttagtgctc tgagaactgg ttggtatacc agtgttataa ctatagatta 180 agtaatatca aggaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaacaag 240 aattagataa atataaaaat gctgtaacag aattgcagtt gctcatgcaa agcacccagc 300 aacaaacaat cgagccagaa gagaactacc aaggtttatg aattatacac tcaaaatgcc 360 aaaaaaacca atgtaacatt aagcaagaaa aggaaaagaa gatttcttgg tttttgttag 420 gtgttggatc tgcaatcgcc agtggcgttg ctgtatctaa ggtcctgcac ctgaagggga 480 agtgaacaag atcaaaagtg ctctactatc cacaaacaag gctgtagtca gttatcaaat 540 ggagttagtg tcttaaccag caaagtgtta gacctcaaaa actatataga aaacaattgt 600 tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agcaactgta tagagttcca 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Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Ile Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 3 <211> 897 <212> DNA <213> PRT <400> 3 atgtccaaaa acaaggacca acgcaccgct aagacactag aaaagacctg ggacactctc 60 aatcatttat tattcatatc atcgggctta tataagttaa atcttaaatc tatagcacaa 120 atcacattat ccattctggc aatgataatc tcaacttcac ttataattac agccatcata 180 ttcatagcct cggcaaacca caaagtcaca ctaacaactg caatcataca agatgcaaca 240 agccagatca agaacacaac cccaacatac ctcactcagg atcctcagct tggaatcagc 300 ttctccaatc tgtctgaaat tacatcacaa accaccacca tactagcttc aacaacacca 360 ggagtcaagt caaacctgca acccacaaca gtcaagacta aaaacacaac aacaacccaa 420 acacaaccca gcaagcccac tacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaaa caaacccaat 480 aatgattttc acttcgaagt gtttaacttt gtaccctgca gcatatgcag caacaatcca 540 acctgctggg ctatctgcaa aagaatacca aacaaaaaac caggaaagaa aaccaccacc 600 aagcctacaa aaaaaccaac cttcaagaca accaaaaaag atctcaaacc tcaaaccact 660 aaaccaaagg aagtacccac caccaagccc acagaagagc caaccatcaa caccaccaaa 720 acaaacatca caactacact gctcaccaac aacaccacag gaaatccaaa actcacaagt 780 caaatggaaa ccttccactc aacctcctcc gaaggcaatc taagcccttc tcaagtctcc 840 acaacatccg agcacccatc acaaccctca tctccaccca acacaacacg ccagtag 897 <210> 4 <211> 298 <212> PRT <213> PRT <400> 4 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Gly Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Thr Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asp Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Ile Thr Ser Gln Thr Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Asn Leu Gln Pro 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Thr Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Lys Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Leu Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu His Pro Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Thr Arg Gln 290 295 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 5 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 6 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Asn Val Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 7 Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Thr 1 5 10 15 Asn Val Thr Leu Ser 20 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 8 Gln Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Thr Asn Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 2268 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant chimeric FG polypeptide <400> 9 atggagttgc caatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcgctgc agtcacattt 60 tgctttgctt ctagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgatgaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccagcagcaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aataccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcattgctg tatctaaggt cctgcactta 480 gaaggagaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc cgtagtcagc 540 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600 aaacaattgt tacctattgt gaataagcaa agctgcagaa tatcaaatat agaaactgtg 660 atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta 780 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta 900 gtacaattac cactatatgg tgtgatagat acaccttgtt ggaaattaca cacatcccct 960 ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtca aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020 tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080 caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat 1140 ctctgcaatg ttgacatatt caatcccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgtgat 1320 tatgtatcaa ataaaggggt ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gcaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac 1500 cagagtttag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560 tcaaccacaa atatcctggt cacactaaca actgcaatca tacaagatgc aacaagccag 1620 atcaagaaca caaccccaac atacctcacc cagaatcccc agcttggaat cagcttctcc 1680 aatctgtctg aaactacatc acaaaccacc accatactag cttcaacaac accaagtgtc 1740 aagtcaaccc tgcaatccac aacagtcaag accaaaaaca caacaacaac caaaatacaa 1800 cccagcaagc ccaccacaaa acaacgccaa aacaaaccac caaacaaacc caataatgat 1860 tttcactttg aagtgttcaa ctttgtacct tgcagcatat gcagcaacaa tccaacctgc 1920 tgggctatct gtaaaagaat accaaacaaa aaacctggaa agaaaaccac caccaagccc 1980 acaaaaaaac caaccatcaa gacaaccaaa aaagatctca aacctcaaac cacaaaacca 2040 aaggaagtac ctaccaccaa gcccacagaa aagccaacca tcaacaccac caaaacaaac 2100 atcagaacta cactgctcac caacaatacc acaggaaatc cagaacacac aagtcaaaag 2160 ggaaccctcc actcaacctc ctccgatggc aatccaagcc cttcacaagt ctatacaaca 2220 tccgagtacc tatcacaacc tccatctcca tccaacacaa caaaccag 2268 <210> 10 <211> 1828 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a recombinant chimeric FG polypeptide <400> 10 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctg aaaaccaacg ccatcaccgc catcctggcc 60 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aagagtttta ccagtccacc 120 tgctccgccg tgtccaaggg ctacctgtcc gccctgcgga ccggctggta cacctccgtg 180 atcaccatcg agctgtccaa catcaaagaa aacaagtgca acggcaccga cgccaaggtc 240 aagctgatca agcaggaact ggacaagtac aagagcgccg tgacagaact ccagctcctg 300 atgcagtcca cccctgccac caacaacaag aagtccggcg gcagcggcgg ctctggcggc 360 tccggcggat ctggcaagaa gttcctgggc ttcctgctgg gcgctggctc cgccatcgcc 420 tccggcaccg ccgtgagcaa ggtgctgcac ctggagggcg aggtgaacaa gatcaagagc 480 gccctgctgt ccaccaacaa ggccgtggtg tccctgtcca acggcgtgtc cgtgctgacc 540 tccaaggtgc tggatctgaa gaactacatc gacaagcagc tgctgcctat cgtgaacaag 600 cagtcctgct ccatctccaa catcgagacc gtgatcgagt tccagcagaa gaacaaccgg 660 ctgctggaga tcacccgcga gttctccgtg aacgccggcg tgaccacccc tgtgtccacc 720 tacatgctga ccaactccga gctgctgtcc ctgatcaacg acatgcctat caccaacgac 780 caaaaaaagc tgatgtccaa caacgtgcag atcgtgcggc agcagtccta cagcatcatg 840 agcatcatca aggaagaagt cctggcctac gtcgtgcagc tgcctctgta cggcgtgatc 900 gacacccctt gctggaagct gcacacctcc cccctgtgca ccaccaacac caaggaaggc 960 tccaacatct gcctgacccg gaccgaccgg ggctggtact gcgacaacgc cggctccgtg 1020 tccttcttcc ctctggccga gacctgcaag gtgcagtcca accgggtgtt ctgcgacacc 1080 atgaactccc tgaccctgcc ttccgaggtg aacctgtgca acatcgacat cttcaacccc 1140 aagtacgact gcaagatcat gaccagcaag accgacgtgt cctccagcgt gatcacctcc 1200 ctgggcgcca tcgtgtcctg ctacggcaag accaagtgca ccgcctccaa caagaaccgg 1260 ggaatcatca agaccttctc caacggctgc gactacgtgt ccaataaggg cgtggacacc 1320 gtgtccgtgg gcaacacact gtactacgtg aataagcagg aaggcaagag cctgtacgtg 1380 aagggcgagc ctatcatcaa cttctacgac cctctggtgt tcccttccga cgagttcgac 1440 gcctccatca gccaggtcaa cgagaagatc aaccagtccc tggccttcat ccggaagtcc 1500 gacgagctgc tgcacaacgt gaacgctggc aagtctacca ccaacatcat ggtgaccaag 1560 cagcggcaga acaagcctcc taacaagccc aacaacgact tccacttcga ggtgttcaac 1620 ttcgtgcctt gctccatctg ctccaacaac cctacctgct gggccatctg caagagaatc 1680 cccaacaaga agccaggcaa gaaaaccacc accaagccta ccaagaagcc taccttcaag 1740 accaccaaga aggaccacaa gcctcagacc acaaagccta aggaagtgcc aaccaccaag 1800 caccaccacc atcaccactg ataatcta 1828 <210> 11 <211> 602 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant chimeric FG polypeptide <400> 11 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Lys Lys Phe Leu Gly Phe Leu 115 120 125 Leu Gly Ala Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Thr Ala Val Ser Lys Val 130 135 140 Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser 145 150 155 160 Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr 165 170 175 Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro 180 185 190 Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile 195 200 205 Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe 210 215 220 Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr 225 230 235 240 Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp 245 250 255 Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser 260 265 270 Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val 275 280 285 Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His 290 295 300 Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys 305 310 315 320 Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val 325 330 335 Ser Phe Phe Pro Leu Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val 340 345 350 Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu 355 360 365 Cys Asn Ile Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr 370 375 380 Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile 385 390 395 400 Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg 405 410 415 Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys 420 425 430 Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys 435 440 445 Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe 450 455 460 Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser 465 470 475 480 Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser 485 490 495 Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile 500 505 510 Met Val Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn 515 520 525 Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser 530 535 540 Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys 545 550 555 560 Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys 565 570 575 Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val 580 585 590 Pro Thr Thr Lys His His His His His His 595 600 <210> 12 <211> 1849 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a recombinant chimeric FG polypeptide <400> 12 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctc aagaccaacg ccatcaccgc catcctggcc 60 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aagagttcta ccagtccacc 120 tgctccgccg tgtccaaggg ctacctgtcc gccctgcgga ccggctggta cacctccgtg 180 atcaccatcg agctgtccaa catcaaagaa aacaagtgca acggcaccga cgccaaggtc 240 aagctgatca agcaggaact ggacaagtac aagagcgccg tgaccgaact ccagctgctg 300 atgcagtcca cccctgccac caacaacaag aaagaactgc ctcggttcat gaactacacc 360 ctgaacaaca ccaagaacac caacgtgacc ctgagcaaga agttcctggg cttcctgctg 420 ggcgctggct ccgccatcgc ctccggcacc gccgtgagca aggtgctgca cctggagggc 480 gaggtgaaca agatcaagag cgccctgctg tccaccaaca aggccgtggt gtccctgtcc 540 aacggcgtgt ccgtgctgac ctccaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag 600 ctgctgccta tcgtgaacaa gcagtcctgc tccatctcca acatcgagac cgtgatcgag 660 ttccagcaga agaacaaccg gctgctggag atcacccgcg agttctccgt gaacgccggc 720 gtgaccaccc ctgtgtccac ctacatgctg acaaactccg agctgctctc cctgatcaac 780 gacatgccta tcaccaacga ccaaaaaaag ctgatgtcca acaacgtgca gatcgtgcgg 840 cagcagtcct acagcatcat gagcatcatc aaggaagagg tcctggccta cgtggtgcag 900 ctgcctctgt acggcgtgat cgacacccct tgctggaagc tgcacacctc ccccctgtgc 960 accaccaaca ccaaggaagg ctccaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac 1020 tgcgacaacg ccggctccgt gtccttcttc cctctggccg agacctgcaa ggtgcagtcc 1080 aaccgggtgt tctgcgacac catgaactcc ctgaccctgc cttccgaggt gaacctgtgc 1140 aacatcgaca tcttcaaccc caagtacgac tgcaagatca tgaccagcaa gaccgacgtg 1200 tcctccagcg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc 1260 accgcctcca acaagaaccg gggaatcatc aagaccttct ccaacggctg cgactacgtg 1320 tccaataagg gcgtggacac cgtgtccgtg ggcaacacac tgtactacgt gaataagcag 1380 gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cctatcatca acttctacga ccctctggtg 1440 ttcccttccg acgagttcga cgcctccatc agccaggtca acgagaagat caaccagtcc 1500 ctggccttca tccggaagtc cgacgagctg ctgcacaacg tgaacgctgg caagtctacc 1560 accaacatca tggtgaccaa gcagcggcag aacaagcctc ctaacaagcc caacaacgac 1620 ttccacttcg aggtgttcaa cttcgtgcct tgctccatct gctccaacaa ccctacctgc 1680 tgggccatct gcaagagaat ccccaacaag aagcctggca agaaaaccac caccaagcct 1740 accaagaagc ctaccttcaa gaccaccaag aaggaccaca agcctcagac cacaaagcct 1800 aaggaagtgc caaccaccaa gcaccaccac catcaccact gataatcta 1849 <210> 13 <211> 609 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant chimeric FG polypeptide <400> 13 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Lys Lys Glu Leu Pro Arg Phe 100 105 110 Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Thr Asn Val Thr Leu Ser 115 120 125 Lys Lys Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Ala Gly Ser Ala Ile Ala Ser 130 135 140 Gly Thr Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys 145 150 155 160 Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser 165 170 175 Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr 180 185 190 Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile 195 200 205 Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu 210 215 220 Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro 225 230 235 240 Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn 245 250 255 Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val 260 265 270 Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu 275 280 285 Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp 290 295 300 Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr 305 310 315 320 Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr 325 330 335 Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Leu Ala Glu Thr Cys 340 345 350 Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr 355 360 365 Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile Asp Ile Phe Asn Pro Lys 370 375 380 Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val 385 390 395 400 Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys 405 410 415 Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly 420 425 430 Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn 435 440 445 Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys 450 455 460 Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp 465 470 475 480 Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser 485 490 495 Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala 500 505 510 Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Val Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys 515 520 525 Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe 530 535 540 Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys 545 550 555 560 Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro 565 570 575 Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln 580 585 590 Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys His His His His His 595 600 605 His

Claims (57)

  1. N 말단에서 C 말단 방향으로,
    (i) 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 (F) 단백질 폴리펩티드의 F1 도메인에 절단불가능하게 연결된 F2 도메인을 포함하는 제1 아미노산 서열; 및
    (ii) 면역학적으로 우세한 에피토프를 포함하는 RSV 부착 (G) 단백질 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 제2 아미노산 서열
    을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, RSV F 단백질 폴리펩티드의 F2 도메인 및 F1 도메인이 아미노산 링커(linker)를 통해 절단불가능하게 연결되는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 링커가 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8의 군으로부터 선택되는 것인 키메라 RSV 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 아미노산 서열이 퓨린(furin) 절단 부위를 제거하는 하나 이상의 아미노산 결실 또는 치환을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 제1 아미노산 서열이 RSV F 단백질 폴리펩티드의 위치 106 및 133에서의 아미노산 결실을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 더 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, F2 도메인이 천연 F 단백질 폴리펩티드의 잔기 24부터 잔기 105까지의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, F1 도메인이 천연 F 단백질 폴리펩티드의 잔기 137부터 잔기 528까지의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분이 천연 G 단백질 폴리펩티드의 아미노산 잔기 183부터 잔기 203까지를 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분이 천연 G 단백질 폴리펩티드의 아미노산 잔기 152부터 잔기 229까지를 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RSV G 단백질 폴리펩티드의 일부분이 천연 G 단백질 폴리펩티드의 아미노산 잔기 149부터 잔기 229까지를 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 발생 RSV 폴리펩티드에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 아미노산 치환은 백신에 의해 강화되는 바이러스 질환의 감소 또는 예방과 상관되는 것인 키메라 RSV 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, G 단백질의 잔기 191에서의 아스파라긴 → 알라닌 치환 (N191A)을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, F 단백질 폴리펩티드 및 G 단백질 폴리펩티드의 적어도 일부분이 서열에서 RSV A 장형(Long) 균주 또는 RSV A2 균주에 상응하는 것인 키메라 RSV 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리히스티딘 태그(tag)를 더 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 서열 11 및 13 또는 이들의 하위서열(subsequence)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 하위서열이, 선택된 서열의 아미노산 잔기 1-23이 생략된 것인 키메라 RSV 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RSV F 단백질 및 RSV G 단백질 양쪽 모두의 1개 이상의 면역우세 에피토프를 포함하는 키메라 RSV 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 RSV 폴리펩티드의 다량체를 포함하는 재조합 RSV 항원.
  20. 제19항에 있어서, 키메라 폴리펩티드의 3량체를 포함하는 재조합 RSV 항원.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 RSV 폴리펩티드, 및 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 담체 또는 부형제가 제약상 허용되는 담체 또는 부형제인 면역원성 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 담체 또는 부형제가 완충제를 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 또는 부형제가 용해도, 안정성, 또는 용해도와 안정성 양쪽 모두를 안정시키는 하나 이상의 성분을 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트(adjuvant)를 더 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 애주번트가 신생아에게의 투여에 적절한 것인 면역원성 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 애주번트가 65세 이상의 인간에서 면역 응답을 강화할 수 있는 것인 면역원성 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트가 Th1 편향 애주번트인 면역원성 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 애주번트가 TLR-4 리간드인 면역원성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 지질 A 유도체가 3D-MPL 및 지질 A의 임의의 합성 유도체로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 미립자 담체를 더 포함하는 면역원성 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 담체가 백반인 면역원성 조성물.
  33. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트가 수중유 에멀션을 포함하는 면역원성 조성물.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품에서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  35. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염의 예방 또는 감소에서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  36. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염에 의해 야기되는 병리학적 응답의 예방 또는 감소에서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  37. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염을 감소시키거나 예방하는 면역원성 조성물.
  38. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상에게 투여한 후 RSV 감염에 의해 야기되는 병리학적 응답을 감소시키거나 예방하는 면역원성 조성물.
  39. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 이외의 병원성 생물의 1개 이상의 추가적인 항원을 더 포함하는 면역원성 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 병원성 생물이 RSV 이외의 바이러스인 면역원성 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 면역원성 바이러스가 파라인플루엔자(Parainfluenza) 바이러스 (PIV)인 면역원성 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 병원성 생물이 B형 간염, 인플루엔자, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza), 폴리오바이러스, 및 폐렴구균(Pneumococcus)으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  43. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산.
  44. 제43항에 있어서, 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 선택된 숙주 세포에서의 발현에 대해 최적화된 1개 이상의 코돈을 포함하는 재조합 핵산.
  45. 제43항 또는 제44항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터를 포함하는 벡터.
  47. 제43항 또는 제44항의 핵산 또는 제46항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유류 세포의 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  49. RSV 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 RSV 폴리펩티드 또는 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항의 핵산의 용도.
  50. 제49항에 있어서, 의약이 RSV 감염을 예방적으로 치료하기 위한 목적으로 투여되는 키메라 RSV 폴리펩티드 또는 핵산의 용도.
  51. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 키메라 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 면역원성 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV에 대한 면역 응답을 유발하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 키메라 RSV 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것이 RSV와의 접촉 후 바이러스 질환을 강화하지 않으면서 RSV에 대해 특이적인 면역 응답을 유발하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 면역 응답이 Th1 유형 면역 응답을 포함하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 면역 응답이 RSV 감염을 감소시키거나 예방하고/하거나, RSV 감염 후의 병리학적 응답을 감소시키거나 예방하는 보호적 면역 응답을 포함하는 방법.
  55. 제51항에 있어서, 대상이 인간 대상인 방법.
  56. 제51항에 있어서, 키메라 RSV 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것이 비내 경로에 의해 투여하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제51항에 있어서, 키메라 RSV 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것이 근육내 경로에 의해 투여하는 것을 포함하는 방법.
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