FR2873378A1 - Complexes immunogenes, leur procede de preparation et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé permettant d'améliorer l'immunogénicité d'un immunogène, antigène ou haptène, par couplage avec un peptide support de petite taille. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un complexe immunogène ainsi que les complexes susceptibles d'être obtenus par un tel procédé, et l'utilisation de tels complexes à titre de médicament pour augmenter l'immunogénicité d'un immunogène. L'invention comprend notamment un peptide support couplé avec un peptide issu de la protéine G du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) et son utilisation à titre vaccinal pour le traitement des infections respiratoires liées au VRS.
Description
La présente invention concerne un procédé permettant d'améliorer
l'immunogénicité d'un immunogène, antigène ou haptène, par couplage avec un peptide support de petite taille. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un complexe immunogène ainsi que les complexes susceptibles d'être
obtenus par un tel procédé, et l'utilisation de tels complexes à titre de médicament pour augmenter l'immunogénicité d'un immunogène. L'invention comprend notamment un peptide support couplé avec un peptide issu de la protéine G du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) et son utilisation à titre vaccinal pour le traitement des infections respiratoires liées au VRS.
1 o Le système immunitaire est un réseau de composants de nature humorale et cellulaire qui interagissent pour permettre à l'hôte de différencier le soi du non-soi afin de l'éliminer, ainsi que les agents jugés pathogènes. Pour ce faire, le système immunitaire a développé deux mécanismes qui agissent de concert: immunité innée et immunité acquise.
Sous le terme d'immunité innée sont regroupés les barrières physiques (peau, muqueuse, ...), les cellules (monocytes/macrophages, polynucléaires, cellules NK, ...) et les facteurs solubles (complément, cytokines, protéines de la phase aiguë, ...) mis en jeu ou produits en réponse à une agression. Les réponses de l'immunité innée sont rapides mais ne sont ni spécifiques ni mémorisées.
Les médiateurs cellulaires de l'immunité acquise sont les lymphocytes T et B. Leur interaction permet notamment la production d'immunoglobulines par ces derniers. A l'inverse des réponses de l'immunité innée, celles de l'immunité acquise sont spécifiques, adaptables et mémorisables. En effet, la pénétration d'un antigène dans un organisme neuf instaure une réponse immunitaire dite réponse primaire, au cours de laquelle se multiplieront des lymphocytes (T et B) à vie longue, appelés lymphocytes à mémoire. Grâce à ces cellules, lors d'une deuxième pénétration du même antigène, la réaction immunitaire, dite secondaire, sera plus rapide et plus intense. Pour qu'une réponse primaire ait lieu, il faut tout d'abord que l'antigène soit capté et apprêté par les cellules présentant l'antigène, pour être présenté aux lymphocytes T. Les vaccins ont pour but de protéger l'hôte en empêchant ou limitant l'invasion d'agents pathogènes. A l'heure actuelle, tous les vaccins commercialisés remplissent ce rôle en suscitant la production d'anticorps.
Lorsque l'antigène vaccinant n'est pas à même de déclencher une réponse immunitaire ou que celle-ci est trop faible, son association physique à une protéine, dite protéine porteuse, possédant des épitopes T capables d'interagir avec les lymphocytes T permet d'y suppléer. Les protéines porteuses vaccinales les plus connues sont les anatoxines diphtériques et tétaniques.
Parmi ces protéines porteuses, on peut également citer la protéine dénommée BB , fragment de la protéine G des Streptocoques, capable de lier l'albumine, fragment correspondant aux résidus 24 à 242 de la séquence SEQ ID N 1. Cette protéine permet de déclencher une réponse anticorps primaire plus précoce et plus intense vis-à-vis de l'antigène vaccinant qui lui est associé (Libon et al., Vaccine, 17(5): 406-41,1999). A ce titre, on pourra également se référer à la demande internationale de brevet publiée sous le numéro WO 96/14416.
La présente invention a pour but de fournir une alternative aux protéines porteuses qui permettrait, comme il ressortira de la description ci-après, de remédier à l'ensemble des inconvénients liés à l'utilisation d'une telle protéine porteuse. Plus particulièrement, la présente invention permet de limiter les effets secondaires liés à la présence d'une protéine porteuse de relativement grande taille tout en permettant l'obtention de rendements de productions élevés.
Dans un souci de clarté, les avantages de la présente invention seront mis en évidence en comparaison avec une protéine porteuse de l'état de la technique, à savoir la protéine porteuse BB.
De manière tout à fait inattendue, et contrairement aux connaissances actuelles et admises de l'homme de l'art, les inventeurs ont mis en évidence une alternative à l'utilisation de protéines porteuses. Plus particulièrement, les inventeurs ont caractérisé un procédé d'amélioration de l'immunogénicité d'un immunogène reposant sur l'identification d'un peptide, appelé ci-après peptide support, de très petite taille et par conséquent non immunogène, facilitant leur synthèse et/ou la synthèse des complexes immunogènes-peptide support auxquels ils participent.
Pour ce faire, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un complexe immunogène dans lequel on associe un immunogène, antigène ou haptène, à un peptide support pour former ledit complexe immunogène, caractérisé en ce que ledit peptide support consiste en un peptide de moins de 10 acides-aminés comprenant au moins le fragment peptidique de 3 résidus d'acide aminé de séquence SEQ ID N 2 (Met-Glu-Phe).
Par immunogène, il faut comprendre toute substance capable d'entraîner une réponse immunitaire. A titre d'exemple non limitatif, l'immunogène est de préférence une protéine, une glycoprotéine un lipopeptide, ou tout composé immunogène comprenant dans sa structure un peptide d'au moins 5 acides aminés, de préférence d'au moins 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, composé capable d'entraîner une réponse immunitaire, notamment capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce peptide après son administration chez un mammifère.
Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines sont interchangeables.
Au regard de ce qui a été décrit plus haut, il faut bien comprendre que l'expression peptide support est à différencier de l'expression protéine porteuse. En effet, une protéine porteuse se caractérise par une taille importante (218 acides aminés pour la protéine BB) et surtout la présence d'épitopes T capables de se lier aux récepteurs T pour l'antigène présents à la surface des lymphocytes T. Le peptide support objet de la présente invention diffère d'une protéine porteuse du fait de sa taille très réduite (moins de 10 acides aminés) et également du fait qu'il ne présente pas d'épitopes T. Selon un premier aspect avantageux, le procédé objet de la présente invention permet d'obtenir des complexes immunologiques permettant d'améliorer l'immunogénicité d'un immunogène dont la production est plus aisée ou avec des rendements de production plus importants. En effet, le complexe comprenant le peptide support objet de l'invention étant de bien plus petite taille que des complexes comprenant des protéines porteuses de l'art antérieur, il est plus facile à produire par synthèse peptidique/chimique ou toute autre technique connue de l'homme de l'art.
Selon un deuxième aspect avantageux, les complexes immunogènes selon l'invention objet de l'invention permettent d'éliminer, à tout le moins de limiter, les effets indésirables liés à la nature même de la protéine porteuse. Il est admis de l'homme de l'art qu'une protéine porteuse, comme BB, de taille relativement importante a de fortes chances d'être à la base de réponses immunitaires non souhaitées. Par exemple, il a été montré pour l'anatoxine tétanique que la sensibilisation préalable de l'hôte à cette protéine porteuse pouvait empêcher le développement d'une réponse anticorps contre l'antigène associé à l'anatoxine tétanique lors de la vaccination avec un conjugué (Kaliyaperumal et al., Eur. J. Immunol. , 25(12) : 3375-80, 1995). Ce phénomène est connu sous le terme de suppression épitopique.
Par conséquent, il ressort clairement de la présente description que l'invention apporte une alternative avantageuse à l'utilisation de protéines porteuses. En effet, de par sa taille réduite, le peptide support n'a aucune, à tout le moins très peu, de chance d'être à l'origine d'effets secondaires ou indésirables.
Selon une forme d'exécution préférée de la présente invention, le peptide support de moins de 10 acides aminés comprend au moins le peptide codé par la SEQ ID N 2 et est constitué d'au plus 8 acides aminés, préférentiellement d'au plus 5 acides aminés, et encore mieux 4 acides aminés.
Selon encore une forme d'exécution plus préférée, le peptide support de moins de 10 acides aminés objet de la présente invention consiste en le peptide de séquence SEQ ID N 2.
L'association entre ledit peptide support et l'immunogène peut être effectuée par toute technique de couplage connue de l'homme de l'art permettant de préserver l'intégrité ainsi que les propriétés immunogéniques de l'immunogène. Plus particulièrement, le procédé objet de l'invention est caractérisé en ce que ladite association consiste en un couplage covalent. Par couplage covalent, il faut comprendre couplage chimique ou encore fusion protéique par la technique dite de l'ADN recombinant (protéine de fusion obtenue après traduction d'un acide nucléique codant pour la protéine de fusion (complexe immunogène) par une cellule hôte (eucaryote ou procaryote) transformée avec ledit acide nucléique.
Ledit peptide support peut être couplé à l'extrémité N-terminale ou Cterminale dudit immunogène lorsque ledit immunogène est un peptide. De préférence ledit peptide support est couplé à l'extrémité N-terminale dudit immunogène.
Le complexe entre le peptide support et le composé dont on souhaite améliorer l'immunogénicité peut être produit par les techniques d'ADN recombinant, notamment par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour le support, de l'ADN codant pour l'immunogène.
Selon un autre mode de mise en oeuvre le couplage covalent entre le peptide support et l'immunogène est réalisé par voie chimique, selon des techniques connues de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet un procédé selon l'invention dans lequel ledit complexe immunogène est obtenu par recombinaison génétique (protéine recombinante) à l'aide d'un acide nucléique résultant de la fusion de (ou de l'insertion dans) la molécule d'ADN codant pour le peptide support avec l'ADN codant pour l'immunogène, le cas échéant avec un promoteur.
Dans ce procédé, il pourra être mis en oeuvre un vecteur contenant un tel acide nucléique de fusion, ledit vecteur pouvant avoir notamment pour origine un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide, et l'acide nucléique de fusion codant pour ledit complexe peut être intégrée dans le génome d'une cellule hôte pour y être exprimé.
Ainsi le procédé selon l'invention comprend, dans l'un de ses modes de mise en oeuvre, une étape de production du complexe, par génie génétique, dans une cellule hôte.
La cellule hôte peut être de type procaryote et être notamment choisie dans le groupe comprenant: E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus; il peut également s'agir d'une levure.
Selon un autre aspect, la cellule hôte est une cellule eucaryote, telle qu'une cellule de mammifère ou une cellule d'insecte (type Sf9).
L'acide nucléique de fusion codant pour le complexe immunogène peut notamment être introduit dans la cellule hôte par l'intermédiaire d'un vecteur viral.
L'immunogène utilisé provient de préférence de bactéries, de parasites, de virus ou d'antigènes associés aux tumeurs, comme les antigènes associés aux mélanomes ou dérivés de la béta hCG.
Le procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour un polypeptide de surface d'un agent pathogène. Lorsque celui-ci est exprimé sous forme de protéine de fusion, par les techniques d'ADN recombinant, la protéine de fusion est avantageusement exprimée, ancrée et exposée à la surface de la membrane des cellules hôtes. On utilise des molécules d'acides nucléiques qui sont capables de diriger la synthèse de l'antigène dans la cellule hôte.
Elles comprennent des séquences promoteur, signal de sécrétion liée de façon fonctionnelle et séquence codant pour une région d'ancrage membranaire, qui seront adaptées par l'homme du métier.
L'immunogène peut notamment dériver d'une glycoprotéine de surface du VRS humain de type A ou B, ou du VRS bovin, notamment choisie parmi les protéines F et G. Des résultats particulièrement avantageux sont obtenus avec des fragments de la protéine G du VRS humain, sous-groupes A ou B, ou bovin.
De manière préférée, l'immunogène consiste en un polypeptide codé par une séquence comprise entre les résidus 130-230 de la séquence peptidique de la protéine G du VRS ou par toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence peptidique, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence comprise entre les résidus 130-230 de la séquence peptidique de ladite protéine G, ou l'un de ses fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
Par pourcentage d'identité ou pourcentage d'homologie (les deux expressions étant utilisées indifféremment dans la présente description) entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Par séquence d'acides aminés présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de référence, on préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans lesquelles les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps correspondants. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents anticorps susceptibles d'être effectués.
Selon encore une autre forme d'exécution préférée, le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que l'immunogène est le polypeptide de séquence SEQ ID N 3, ou de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 3, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence comprise entre les résidus 130-230 de la séquence peptidique de ladite protéine G, ou l'un des fragments de la séquence SEQ ID N 3 d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
D'autres immunogènes adaptés à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention comprennent un dérivé de la protéine de surface du virus de l'hépatite A, B et C, une protéine de surface du virus de la rougeole, une protéine de surface du virus parainfluenza 3, en particulier une glycoprotéine de surface telle que hémaglutinine, neuraminidase HN et la protéine de fusion F. Selon une autre forme d'exécution, la présente invention concerne un complexe immunogénique obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un complexe immunogène, comprenant un immunogène, un antigène ou un haptène, caractérisé en ce que ledit immunogène est associé à un peptide support de moins de 10 acides aminés comprenant au moins le fragment peptidique de 3 résidus d'acide aminé de séquence SEQ ID N 2.
De préférence, dans ledit complexe immunogène selon l'invention, ledit peptide support comprenant au moins le peptide codé par la SEQ ID N 2 est constitué d'au plus 8 acides aminés, préférentiellement d'au plus 5 acides aminés, et encore mieux de 4 acides aminés.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit peptide support du complexe immunogène selon l'invention consiste en le peptide codé par la SEQ ID N 2.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit peptide support du complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que ladite association consiste en un couplage covalent entre ledit peptide support et ledit immunogène.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que ledit peptide support est couplé à l'extrémité N- ou C-terminale dudit immunogène lorsque ledit immunogène est un peptide, de préférence N-terminale.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est un antigène issu de bactéries, de parasites et/ou de virus.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est une protéine ou glycoprotéine de surface, notamment F ou G, du virus respiratoire syncytial (VRS), ou de séquence ayant au moins 80 %d'identité avec la séquence de ladite protéine F ou G, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence de ladite protéine F ou G, ou l'un de leurs fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est la protéine G du VRS humain de type A ou B, la protéine G du VRS bovin.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est le polypeptide de séquence comprise entre les résidus 130-230 de la protéine G du VRS, extrémités comprises, ou de séquence présentant au moins 80% d'identité avec ladite séquence 130-230, ou l'un des fragments d'au moins 10 acides aminés de ladite séquence 130-230 de la protéine G du VRS.
De préférence l'immunogène dudit complexe immunogène selon l'invention est le polypeptide de séquence SEQ ID N 3.
Selon encore une autre forme d'exécution préférée, le complexe selon l'invention est le complexe MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4, ou un complexe immunogène analogue dont la séquence présente en position 1 à 3 la séquence MEF de séquence SEQ ID N 2 suivie: - soit d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 3, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 10 3;ou soit d'une séquence de l'un des fragments de la séquence SEQ ID N 3 d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un acide nucléique, de préférence isolé et/ou purifié, codant pour les complexes immunogènes selon l'invention, notamment pour le complexe immunogène MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des
produits de transcription desdits ADNs.
Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet les complexes immunogènes selon l'invention ou les acides nucléiques codant pour les complexes immunogènes selon l'invention à titre de médicament, notamment le complexe immunogène MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4 ou l'acide nucléique tel qu'un ADN ou ARN, codant pour ce complexe MEFG2Na.
Les compositions pharmaceutiques comprenant les complexes immunogènes selon l'invention ou tels que définis précédemment, ou un acide nucléique, ARN ou ADN, codant pour de tels complexes immunogènes, associés avec des excipients physiologiquement acceptables font également partie de l'invention. Ils sont particulièrement adaptés à la préparation d'un vaccin.
L'immunisation pourra être obtenue par l'administration dudit polynucléotide codant pour les complexes immunogènes tels que définis précédemment, seul ou par l'intermédiaire d'un vecteur viral comprenant un tel polynucléotide. On peut également utiliser une cellule hôte, notamment une bactérie inactivée, transformée avec un tel polynucléotide selon l'invention.
La présente invention vise également l'utilisation d'un complexe immunogène selon l'invention, dans lequel complexe ledit immunogène est une protéine ou un peptide dérivé de la protéine G ou F du VRS telle que définie précédemment, notamment le complexe MEFG2Na ou l'un de ses analogues selon l'invention, ou un acide nucléique selon l'invention codant pour ledit complexe immunogène, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement des infections respiratoires liées au VRS.
Les avantages de la présente invention seront mis en évidence à la lumière des exemples et des figures ci-après dans lesquels: - la figure 1 représente le taux d'IgG anti-RSV-A chez des souris immunisées 20 avec BBG2Na ou MEFG2Na; - la figure 2 représente également, selon une autre présentation, le taux d'IgG anti-RSV-A chez des souris immunisées avec BBG2Na ou MEFG2Na après 2 immunisations; - la figure 3 représente le taux d'IgG anti-G2Na chez des souris immunisées avec 25 BBG2Na ou MEFG2Na; et la figure 4 représente également, selon une autre présentation, le taux d'IgG anti-G2Na chez des souris immunisées avec BBG2Na ou MEFG2Na.
Exemple 1: Comparaison des activités in-vivo induites par l'utilisation de la 30 protéine porteuse BB ou du peptide support MEF Des souris BALB/c femelles IOPS âgées de 8 semaines sont infectées par voie nasale avec du RSV-A souche Long (105 pfu) à J-20. A JO, après confirmation de la séroconversion pour le RSV-A, les souris reçoivent une seule injection intra-musculaire de 20 ug de BBG2Na adsorbé sur Adju-Phos (soit 6 g équivalent G2Na) ou 6 g de MEFG2Na adsorbé sur Adju-Phos. Le taux d'IgG anti-RSV-A (antigène viral purifié) et d'anti-MEFG2Na est suivi par ELISA.
Les figures 1 et 2 montrent qu'il n'y a pas de différence significative entre le taux d'IgG anti-RSV-A déclenché par 6 gg de MEFG2Na ou 20 g de BBG2Na, et ceci en aucun point de la cinétique. Il en est de même pour le taux d'IgG anti-G2Na (figures 3 et 4).
Exemple 2: Préparation des complexes BBG2Na et MEFG2Na Préparation de BBG2Na: La protéine BBG2Na est produite en utilisant Escherichia coli RV308 comme cellule hôte et un plasmide où la transcription du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur trytophane. L'étape de fermentation est un procédé de type batch avec un milieu de culture synthétique semi-défini et du glycérol comme source de carbone et d'énergie. Deux étapes de culture sont nécessaires pour préparer l'inoculum qui est utilisé pour ensemencer le fermenteur de production. Dans ce fermenteur, les microorganismes sont cultivés jusqu'à une densité optique à 620 mn de 50, puis l'expression est induite par addition d'un analogue du tryptophane (IAA). La culture est poursuivie jusqu'à ce que la pression partielle d'02 dans le fermenteur remonte subitement, ce qui signale l'épuisement de la source de carbone. A ce stade la densité cellulaire moyenne est de 40 g de cellules sèches/litre avec un taux d'expression de 9,5 %, soit une productivité de 3,8 g de BBG2Na/litre de culture. La culture est refroidie à +4 C, les micro-organismes sont récupérés par centrifugation et congelés à -15/-25 C.
L'extraction de BBG2Na nécessite une solubilisation du culot de microorganismes décongelé avec un tampon contenant de la guanidine, HCl et du 1,4-dithiothreitol (DTT) pour réduire les ponts disulfures. La renaturation de la protéine et l'oxydation des ponts disulfures sont obtenues par dilution de la suspension dénaturée et agitation àtempérature ambiante pendant une nuit dans un réacteur ouvert. La suspension contenant la protéine renaturée est clarifiée par centrifugation puis filtrée.
Ensuite, du PEG 6000 est ajouté au filtrat et le précipité qui en résulte est récupéré par centrifugation. Le précipité contenant BBG2Na est solubilisé de nouveau dans un tampon contenant de l'urée. L'extrait obtenu est filtré sur un support 0,22 gm et conservé à-15/-25 C.
La purification de BBG2Na à partir de l'extrait décongelé comporte cinq étapes qui sont: (1) une chromatographie d'échange de cations sur une colonne de SPSepharose fast flow, (2) une chromatographie d'interaction hydrophobe sur une colonne de methyl Macroprep, (3) une gel filtration sur une colonne de Superdex S200, (4) une chromatographie d'échange d'anions sur une colonne de DEAE-Sepharose et finalement (5) une étape de dessalage sur une colonne de Sephadex G25. La solution de protéine purifiée est filtrée stérilement et répartie dans des poches stériles et apyrogènes. Préparation de MEFG2Na: La protéine MEFG2Na est produite en utilisant Escherichia colt ICONE 200 comme cellule hôte et un plasmide ou la transcription du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur trytophane. E. colt ICONE 200 est un mutant de E. colt RV308 qui a été développé pour améliorer le contrôle de l'expression pendant la phase de croissance. L'étape de fermentation est un procédé de type fed-batch avec un milieu de culture chimiquement défini et du glycérol comme source de carbone et d'énergie. Deux étapes de culture sont nécessaires pour préparer l'inoculum qui est utilisé pour ensemencer le fermenteur de production. Dans ce fermenteur, les microorganismes sont cultivés jusqu'à une densité optique à 620 nm de 110, puis l'expression est induite par addition d'un analogue du tryptophane (IAA). La culture est poursuivie jusqu'à ce que la pression partielle d'02 dans le fermenteur remonte subitement, ce qui signale l'épuisement de la source de carbone. A ce stade la densité cellulaire moyenne est de 56 g de cellules sèches / litre avec un taux d'expression de 5,4 %, soit une productivité de 3 g de MEFG2Na/litre de culture. La culture est refroidie à +4 C, les micro-organismes sont récupérés par centrifugation et congelés à -15/25 C.
L'extraction de MEFG2Na nécessite une solubilisation du culot de microorganismes décongelé avec un tampon contenant de la guanidine, HC1. La suspension contenant la protéine dénaturée est clarifiée par centrifugation puis filtrée. La guanidine étant incompatible avec l'étape de purification subséquente une étape de concentration dialyse, sur un support d'ultrafiltration en polyéthersulfone avec un seuil de coupure à kDa, est mise en place pour effectuer le changement de tampon. L'extrait obtenu est filtré sur un support 0,22 m et purifié dans la foulée.
La purification de MEFG2Na comporte trois étapes qui sont: (1) une chromatographie d'échange de cations sur une colonne de Fractogel EMD SE Hicap, (2) une gel filtration sur une colonne de Superdex 75 Prep Grade, (3) une chromatographie d'échange d'anions sur une colonne de DEAE Sépharose Fast Flow. Le vrac de protéine purifiée est filtré stérilement et réparti dans des poches stériles et apyrogènes. Rendements d'expression: Les données d'expression de MEFG2Na et de BBG2Na sont regroupées dans le 10 tableau 1 suivant.
Tableau 1: Quantité de protéine MEFG2Na et de BBG2Na obtenue exprimée en Mol/100g de cellules sèches Mol. de protéine/100g de cellules sèches BBG2Na 2,46.104 MEFG2Na 4,54.104 Il apparaît que le taux d'expression du complexe MEFG2Na est supérieur d'environ deux fois au taux d'expression du complexe BBG2Na.
Bien que la présente description, ainsi que les exemples, sont basés uniquement sur l'antigène G2Na, il faut comprendre que tout immunogène peut également être couplé au peptide support objet de la présente invention.
Claims (22)
1. Procédé de préparation d'un complexe immunogène dans lequel on associe un immunogène, antigène ou haptène, à un peptide support pour former ledit complexe immunogène, caractérisé en ce que ledit peptide support consiste en un peptide de moins de 10 acides aminés comprenant au moins le peptide de séquence SEQ ID N 2.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide support de moins de 10 acides aminés consiste en le peptide codé par la SEQ ID N 2.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite association consiste en un couplage covalent entre ledit peptide support et ledit immunogène.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit peptide support est couplé à l'extrémité N-terminale dudit immunogène lorsque ledit 15 immunogène est un peptide.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit couplage covalent est réalisé par la technologie de l'ADN recombinant.
6. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit couplage covalent est réalisé par voie chimique.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'immunogène est un antigène issu de bactéries, de parasites et/ou de virus.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'immunogène est une protéine ou glycoprotéine de surface du virus respiratoire syncytial (VRS), une protéine de séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence de ladite protéine de surface du VRS ou l'un des fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs de ladite protéine de surface du VRS, ladite protéine de séquence présentant au moins 80 % d'identité ou ledit fragment étant capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre cette protéine ou cedit fragment après son administration chez un mammifère.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'immunogène est la protéine G du VRS humain de type A ou B, la protéine G du VRS bovin, une protéine de séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence de ladite protéine G ou l'un des fragments de ladite protéine G d'au moins 10 acides aminés.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'immunogène est le polypeptide de séquence comprise entre les résidus 130-230 de la protéine G du VRS, extrémités comprises, ou de séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence 130-230, ou l'un des fragments d'au moins 10 acides aminés de ladite protéine G.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'immunogène est le polypeptide de séquence SEQ ID N 3.
12. Complexe immunogène obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon
l'une des revendications 1 à 11.
13. Complexe immunogène, comprenant un immunogène, antigène ou haptène, associé à un peptide support, caractérisé en ce que ledit immunogène est associé, de préférence couplé par liaison covalente, à un peptide support de moins de 10 acides aminés comprenant au moins le peptide de séquence SEQ ID N 2.
14. Complexe selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit peptide support est le peptide de séquence SEQ ID N 2.
15. Complexe immunogène selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que l'immunogène est une protéine ou glycoprotéine de surface, notamment F ou G, du virus respiratoire syncytial (VRS), ou de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence de ladite protéine de surface du VRS, ou l'un des fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs de ladite protéine de surface du VRS, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre cette dite protéine de séquence ayant au moins 80 % d'identité ou de ce fragment après leur administration chez un mammifère.
16. Complexe selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit du complexe MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4, ou d'un complexe immunogène dont la séquence présente en position 1 à 3 la séquence SEQ ID N 2 suivie: soit d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 3, de 30 préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 3; ou - soit d'une séquence de l'un des fragments de la séquence SEQ ID N 3 d'au moins 10 acides aminés consécutifs capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
17. Complexe selon la revendication 16, de séquence SEQ ID N 4.
18. Acide nucléique codant pour un complexe immunogène selon l'une des
revendications 12 à 17.
19. Acide nucléique codant pour un complexe immunogène selon l'une des revendications 15 à 17.
20. Acide nucléique selon la revendication 19 codant pour le complexe immunogène de séquence SEQ ID N 4.
21. Complexe selon l'une des revendications 12 à 17 ou acide nucléique selon l'une des revendications 18 à 20, à titre de médicament.
22. Utilisation d'un complexe immunogène selon l'une des revendications 15 à 17 ou d'un acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des infections respiratoires liés au VRS.
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