FR2806913A1 - Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du diméthyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale.
Description
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La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale. L'invention porte également sur l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène, immunogène ou haptène.
Les nouvelles approches vaccinales soulignent l'importance de l'utilisation de protéines sous unitaires, de peptides ou de polysaccharides pour l'immunisation. L'avantage de ces approches mettant en jeu des protéines purifiées est l'élimination de composés responsables d'effets indésirables. Par ailleurs, ces antigènes pourront être sélectionnés sur la base de l'effet immunologique recherché comme par exemple l'induction de CTL (Lymphocytes T Cytotoxiques) ou au contraire la génération d'une forte réponse de type humoral. Cependant, le désavantage de ce type de préparation est que les antigènes possèdent généralement une faible immunogénicité et qu'il est nécessaire de les mélanger à des adjuvants.
Un autre axe de recherche particulièrement étudié en matière de vaccin concerne les voies mucosales. L'immunisation par voie mucosale représente en effet un formidable enjeu dans la mesure où la majorité des pathogènes initient une infection en interagissant avec les muqueuses de l'hôte et qu'après colonisation de la muqueuse, certains micro-organismes génèrent une maladie par le biais d'une sécrétion de facteurs toxiques alors que d'autres pénètrent les tissus de l'hôte pour générer des maladies systémiques. Les défenses mucosales sont par conséquent très importantes dans le contrôle de l'infection et le déroulement de la maladie.
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La vaccination par voie mucosale et plus particulièrement l'immunisation par voie nasale présentent plusieurs avantages par rapport à la vaccination systémique. En effet, l'administration intramusculaire d'un immunogène ou d'un antigène n'induit pas de réponse immunitaire au niveau des muqueuses. Ces réponses muqueuses jouent pourtant un rôle essentiel contre une invasion d'un pathogène à porte d'entrée et/ou à tropisme muqueux. Tout d'abord, les immunisations par voie mucosale induisent la production d'IgA spécifiques directement au site de l'infection. Ces anticorps peuvent inhiber l'attachement des pathogènes à la muqueuse et la colonisation de celle-ci. Par ailleurs, en plus de la réponse locale, une immunisation par voie muqueuse peut stimuler une réponse systémique de type IgG qui représentera une seconde barrière contre l'invasion des tissus par le micro-organisme pathogène. Enfin, d'un point de vue pratique, l'administration d'un vaccin par voie nasale est plus aisée qu'une injection par voie systémique.
L'utilisation de vaccin par voie orale ou par voie nasale aurait une grande influence sur l'éradication de germes pathogènes. En effet, toute modification d'un vaccin lui permettant d'être utilisé avec une plus grande flexibilité (thermostabilité, distribution sans seringue,...) aurait pour conséquence une vaccination plus efficace et plus étendue.
D'autre part, l'immunisation par les voies muqueuses permet d'induire une immunité locale constituant la première barrière à l'invasion par un micro-organisme.
Le problème majeur rencontré lors d'un protocole d'immunisation par la voie muqueuse est l'état de tolérance qui est en général obtenu avec les préparations vaccinales. Cet état de tolérance est nécessaire pour maintenir l'homéostasie entre le soi et le milieu extérieur, par exemple il permet que l'organisme ne reconnaisse pas comme étranger les aliments nécessaire à sa survie.
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A l'image de ce qui est pratiqué lors des vaccination systémique, les préparations vaccinales administrées par la voie muqueuse doivent être associées à des adjuvants pour induire des réponses immunitaires efficaces. De nombreuses molécules chimiques et biologiques sont utilisées comme adjuvants muqueux, le plus connu et le plus efficace est dérivé d'une toxine sécrétée par une bactérie : la toxine cholérique. La sous unité B de la toxine cholérique (CTB) va permettre au système immunitaire de générer un réponse immunitaire muqueuse et systémique dirigée contre un immunogène ou un antigène administrée par la voie muqueuse en association avec la CTB.
Bien que la CTB soit potentiellement un très bon adjuvant muqueux, son utilisation chez l'homme nécessite la démonstration de sa totale innocuité. Des préparations d'enveloppes bactériennes de Neisseria meningitidis (OMV : outer membrane vésicules) peuvent également servir de vecteur pour induire une réponse immunitaire muqueuse et systémique contre un antigène incorporé dans ces OMV. Bien que des études chez l'animal aient donné des résultats très prometteurs, la production à l'échelle industrielle des OMV est un processus qui va demander un gros effort afin d'obtenir une reproductibilité du produit final.
D'autres essais ont ainsi été effectués sur des administrations mucosales de la PspA qui correspond à la protéine de surface A de Pneumocoque (Briles D. E., brevet EP 0 682 950) sur les filaments d'hémaglutinine (Capron A., brevet FR 2 718 750 ; KimuraA., brevet EP 0 471 177 ; R.D., brevet US 7532327), sur un fragment de la toxine tétanique (Dougant G. , brevet WO 93/21950) , sur le choléra toxin B (CTB) .
Une protéine de la membrane externe de Neisseria meningitidis est utilisée mélangée à l'haptène en tant qu'adjuvant pour une immunisation par voie nasale (Van de Verg LL., infection and immunity, 1996, 64 : 5263-5268). On peut encore citer la demande internationale de brevet déposée sous le No. PCT/FR/99/00703 le 26 mars 1997 décrivant l'utilisation de la protéine OmpA de
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Klebsiella pneumoniae pour la préparation de vaccins administrables par voie nasale, notamment pour la prévention ou le traitement des infections par le virus syncytial respiratoire (VRS) .
Une autre alternative permettant l'obtention de réponses immunitaires muqueuse et systémique contre un immunogène ou un antigène administré par la voie muqueuse et l'expression dudit immunogène dans un vecteur vivants. Différents vecteurs vivants sont en cours de développement pré-clinique ou clinique, ces vecteurs peuvent être de type bactérien ou viral. Les bactéries utilisées sont des pathogènes atténuées (Salmonella typhi, Vibrio cholerae, bacille de Calmette-Guerin (BCG)) ou des bactéries non pathogènes comme des bactéries lactiques ou des Staphylocoques. Des adenovirus ou poxvirus sont également utilisés comme vecteurs délivrants des immunogènes au niveau des muqueuses. L'utilisation de ces vecteurs vivants pose également de très gros problème de sécurité sanitaire, en effet, ces organismes sont génétiquement modifiés et les conséquences de leur dissémination dans la nature ne sont pas connues et devront être définies avant tout mise sur la marché de nouveau vaccin avec un vecteur vivant comme principe actif.
L'immunogène ou l'antigène peut également être incorporé ou associé à des préparations chimiques : liposomes, ISCOM, acide polylactique, acide poly(lactide-co-glycolide) et des détergents (polysorbates, caprylic/capric glycérides par exemple). Ces préparations chimiquement définies permettent dans certain cas une production industrielle de la préparation vaccinale et la mise en place d'études de toxicité pré-clinique et clinique bien adaptées assurant une définition optimale des critères d'innocuité du vaccin.
Il est connu que les détergents sont indispensables à la solubilisation de nombreuses protéines, et notamment les protéines issues de membranes, et ces complexes protéines/détergents qui forment des micelles peuvent être
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utilisés comme immunogènes par voie systémique dans des protocoles expérimentaux (Mukhlis et al. 1984, Vaccine 2,199- 203 ; Playfair J. H. L. et al., 1988, Parasite Immunol . 8,409- 414). Il est connu que les bases azotées aliphatiques, parmi lesquelles se trouve cité le chlorure de diméthyl dioctadécyl ammonium peuvent être utilisées comme adjuvants par voie systémique (Gall, D. 1966. The adjuvant activity of aliphatic nitrogenous bases. Immunology 11:369).
Un brevet européen revendique l'utilisation d'une suspension adjuvante de bromure de diméthyl dioctadécyl ammonium stabilisée à l'aide de Carbopol comme vaccin. (EP 0 273 512).
Mais il n'a jamais été démontré que les détergents de type ammonium quaternaires peuvent être adjuvants des voies nasales.
Ainsi, il existe un grand besoin de disposer de nouveaux adjuvants, dépourvus de toxicité ou faiblement toxique et permettant la génération ou l'amplification d'une réponse immunitaire pour la préparation de composition pharmaceutique destinées à être administrées par voies mucosales, notamment par voie nasale.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
La Demanderesse a mis en évidence que les détergents de type aliphatiques , tels que le DDAB ou DDAC ou ses dérivés et analogues, sont, de manière surprenante, capables d'induire ou d'améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène lorsque lesdits détergents sont administrés par voie mucosale, notamment par voie nasale.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule générale :
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dans laquelle R1, R2, R3, et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, et X représente un anion, comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale.
Avantageusement, R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à 4.
Avantageusement, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 10 à 30 atomes de carbone, et préférentiellement de 16 à 20.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente un atome d'halogène.
De façon particulièrement préféré, l'ammonium quaternaire aliphatique est choisi parmi le diméthyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
La présente invention concerne encore l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis à vis d'un antigène, immunogène ou haptène.
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De manière générale, l'homme de l'art saura adapter la concentration dudit ammonium quaternaire aliphatique en fonction de sa concentration micellaire critique spécifique, de la nature et de la concentration des autres composés contenus dans la composition pharmaceutique, en particulier de la nature et de la concentration de l'antigène ou haptène choisi, et des éventuels adjuvants qui pourront être également incorporés dans ladite composition.
De manière avantageuse, ledit ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention est à une concentration comprise entre 0,1 et 1000 g. l-1, préférentiellement entre 1 et 100 g. l-1, et plus préférentiellement entre 2 et 50ug. l-1.
La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique selon l'invention comprend ledit ammonium quaternaire aliphatique mélangé audit antigène, immunogène ou haptène.
De préférence, ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques ou les lipides.
Par le terme "peptide", on entend également désigner une protéine ou un polypeptide, ces trois termes étant utilisés indifféremment.
De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention caractérisée en ce qui ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un microorganisme tel que d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.
L'antigène, immunogène ou l'haptène selon l'invention comprendra au moins un fragment dudit micro-organisme, tel qu'un
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fragment connu pour contenir un épitope antigénique, ou que l'homme de l'art saura déterminer pour sa capacité à conférer l'immunité recherchée par des techniques standards telles que celles décrites dans les exemples ci-après.
De préférence ledit antigène ou haptène est de nature peptidique ou un ADN codant pour un tel peptide immunogène.
De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes, en particulier choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'infuenza virus, l'hantivirus, les streptocoques, les pneumocoques, heamophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.
De manière préférée, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin, en particulier un fragment de la protéine G du VRS, tel qu'un peptide choisi parmi ceux identifiés dans la liste des séquences SEG ID No 2 à 74 de la demande internationale de brevet déposée sous le No PCT/FR/99/00703 le 26 mars 1997, incorporé ici par référence, de manière plus particulière les peptides G2Na et G5a de séquence SEQ ID No 2 et SEQ ID No 4, ou les peptides présentant après alignement optimal avec ces séquences un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %.
Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acide aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique
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ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisée, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith de Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1998) [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconti Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, "BLAST 2 sequences", disponible sur le site http ://www.ncbi.nim.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres "open gap pensitie" : 5, et "extension gap penaltie" : 2 ; la matrice
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choisie étant par exemple la matrice "BLOSUM 62" proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Sous un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'une cellule tumorale.
Parmi les antigènes, immunogènes ou haptènes dérivés d'une cellule tumorale, on préfère ceux immunogènes capables d'induire une réponse immune, de type humoral ou CTL, en particulier destinée à inhiber ou à diminuer la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
On peut citer comme exemple mais sans s'y limiter les peptides immunogènes dérivés de cellules de mélanomes, du pancréas, de la prostate, vessie, sein ou des poumons.
L'antigène tumorale est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. Il est notamment choisi parmi tout composé capable de diriger spécifiquement une réponse CTL contre ladite cellule tumorale.
Sous un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, à un composé porteur.
De préférence, ledit composé porteur est choisi dans le groupe de peptide comprenant les anatoxines, notamment le toxoïde diphtérique (DT) ou le toxoïde tétanique (TT), les protéines dérivées du streptocoque (comme la protéine de liaison à la séralbumine humaine, appelée "BB" décrite dans W096/14415), les protéines membranaires OmpA ou OmpC (OmpA ou OmpC pour "Outer Membrane Protein de type A" et "Outer Membrane Protein de type complexe") ou les protéines de choc thermique ( Heat Shock Protein ou HSP).
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Avantageusement, ledit composé porteur est couplé de façon covalente avec l'antigène ou l'haptène.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le composé porteur et l'antigène ou l'haptène, en particulier lorsqu'ils sont de nature peptidique, le couplage covalent de l'antigène ou l'haptène pouvant être réalisé à l'extrémité N ou C terminale du composé porteur.
Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité du composé porteur choisi et de la nature de l'antigène ou l'haptène à coupler. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme et de l'art.
Les conjugués issus d'un couplage de peptides peuvent être également préparés par recombinaison génétique. Le peptide hybride (conjugué) peut en effet être produit par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le composé porteur, d'une séquence codant pour le ou les peptides antigènes, immunogènes ou haptènes. Ces techniques de préparation de peptide hybride par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme de l'art (cf. par exemple S.C.
MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60,3,512-538).
De préférence, ledit composé porteur est une protéines dérivée du streptocoque ou une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klesiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments.
On préfère tout particulièrement comme composé porteur la protéine P40 de séquence SEQ ID N 6, correspondant à l'OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou une protéine dont la séquence présente après alignement optimal avec la séquence SEQ IN No. 6 un pourcentage d'identité d'au moins 80 %.
L'invention concerne également l'utilisation d'un ammonium quaternaire alphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite
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composition pharmaceutique comprend en outre un deuxième adjuvant différent des ammoniums quaternaires alphatique.
De préférence, ledit deuxième adjuvant est choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour Heat labile enterotoxin entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Sous un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que le mélange ammonium quaternaire aliphatique et immunogène, antigène ou haptène, éventuellement associé au composé porteur, est incorporé dans des vecteurs permettant d'assurer et/ou d'améliorer leur stabilité ou leur biodisponibilité, en particulier les vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment IL 12, IL 2, GMCSF et IL 18, qui permettent de potentialiser la réponse.
La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes ou parasitaires.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement à inhiber la croissance des tumeurs.
L'invention concerne encore l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini ci-dessus en
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association avec une substance thérapeutique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
Ladite substance thérapeutique est notamment choisie parmi les antibiotiques, les hormones, les anticancéreux, les antiinflammatoires, les vitamines, les oligoéléments, les facteurs de croissance et les anticorps monoclonaux.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique selon l'invention en association avec une séquence d'acides nucléiques pouvant être comprise dans un vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini ci-dessus et d'une séquence d'acides nucléiques dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique permettant l'expression d'un peptide codé par ladite séquence d'acide nucléique dans les cellules de l'organisme recevant la préparation et préférentiellement les cellules épithéliales du tractus respiratoire.
Un objet de l'invention est l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire tel que défini ci-dessus en association avec un vecteur vivant exprimant un antigène, immunogène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
Une composition ou un vaccin tel que défini ci-dessus sous forme solide est un objet supplémentaire de l'invention. Cette composition ou vaccin peut notamment être sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule.
Enfin, l'invention a aussi pour objet un dispositif adapté pour une administration par voie muccosale, et notamment nasale, caractérisé en ce qu'il contient une composition ou un vaccin tel que défini ci-dessus.
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Ce dispositif peut notamment être un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Ils seront notamment décrits en référence aux figures annexées sur lesquelles :
Figure 1A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA
FigurelB : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA
Figure 2A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA.
Figure 1A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA
FigurelB : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA
Figure 2A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA.
Figure 2B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA.
Figure 3 : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA chez le rat des cotons.
Figure 4A : systémique obtenue après administration par la voie nasale de DT associée au DDA.
Figure 4B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de DT associée au DDA.
Figure 5A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de TT associé au DDA.
Figure 5B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de TT associé au DDA.
Exemple 1 Production d'une protéine chimèrique recombinante BBG2Na
Cet exemple illustre l'obtention de BBG2Na recombinante à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, transformé par un vecteur plasmide d'expression, nommé pvaBBG2Na : le plasmide contient le gène codant pour l'Albumin binding domaine de la protéine G du Streptocoque (BB) suivi par un fragment de 101 aa de la protéine G du VRS (Long strain) (aa 130 à aa 230), l'expression du gène est sous contrôle du promoteur de l'opéron
Cet exemple illustre l'obtention de BBG2Na recombinante à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, transformé par un vecteur plasmide d'expression, nommé pvaBBG2Na : le plasmide contient le gène codant pour l'Albumin binding domaine de la protéine G du Streptocoque (BB) suivi par un fragment de 101 aa de la protéine G du VRS (Long strain) (aa 130 à aa 230), l'expression du gène est sous contrôle du promoteur de l'opéron
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tryptophane (trp). Dans un fermenteur équipé de sondes de régulation de t , de pH et de taux d'oxygénation, contenant 2 litres de milieu contenant(en g/1) : glycérol, 5 ; d'ammonium, 2.6 ; dihydrogénophosphate de potassium, 3 ; hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; de sodium 0.5 ; extrait de levure, 1 ; Amplicilline, 0.1 ; Tétracycline 0.008 ; Thiamine, 0.07 ; de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0.65 ml/1 de solution de vitamines.
L'alimentation de sources carbonées (Glycérol et/ou Glucose).
Sont maintenus constants : le pH à 7.3 ; la température à 37 C ; le signal de tension en Oxygène dissous à 30%. Lorsque la turbidité de la culture (à 580 nm) atteint la valeur de 80, l'expression de la protéine est induite par ajout de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1 Environ 3 heures après, les cellules sont récoltées par centrifugation. On obtient environ 150 g de biomasse humide par litre de culture.
On resuspend une fraction de biomasse (environ 30 g) dans une solution de TST (Tris-HCl 50mM pH 8. 0, NaCl 200 mM, 0. 05 % Tween 20 et EDTA 0. 5 mM) . On peut lyser les cellules soit par sonication soit par French press. Après centrifugation du lysat cellulaire, on filtre sur 1. 2 mm, les protéines solubles peuvent être purifiées directement sur colonne d'affinité, les protéines insolubles (corps d'inclusion) présentes en majorité sont solubilisées dans 30 ml de Chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris- HCl 25 mM (pH 8.5), Dithiotreitol (DTT) 10 mM, suivi d'une incubation à 37 C pendant 2 H. On dilue le milieu avec un tampon de renaturation (Tris-HCl 25 mM (pH 8.5) ; 150 mM et 0. 05 % Tween 20) afin d'arriver à ajuster en concentration finale 0.5M (HCl-Guanidine). Incubation à température ambiante sous agitation pendant 16 heures. Après filtration, les protéines solubles sont purifiées soit par chromatographie d'affinité soit par chromatographie par échange d'ions.
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Exemple 2 : Préparation du mélange immunogène ou antigène et DDA sous forme d'une suspension
Le DDA est mis en suspension en PBS, NaCl 0. 9 % ou tout autre tampon (de 0. 01 mg/ml à 40 mg/ml), vortexé 2 min, soniqué 20 min au bain à ultrasons. On ajoute ensuite une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisée dans l'eau. Cette solution est mise sous agitation. La quantité de BBG2Na adsorbée mesurée par BCA est de 100% à une concentration en DDA de 3 mg/ml.
Le DDA est mis en suspension en PBS, NaCl 0. 9 % ou tout autre tampon (de 0. 01 mg/ml à 40 mg/ml), vortexé 2 min, soniqué 20 min au bain à ultrasons. On ajoute ensuite une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisée dans l'eau. Cette solution est mise sous agitation. La quantité de BBG2Na adsorbée mesurée par BCA est de 100% à une concentration en DDA de 3 mg/ml.
Exemple 3 : Préparation du mélange BBG2Na, mannitol et DDA sous forme de lyophilisat
Le DDA est mis en suspension dans de l'eau (de 0. 01 mg/ml à 20 mg/ml). La solution de DDA est chauffée pendant 30 min à 62 C. Elle est ensuite laissée à température ambiante. Lorsque la température est de 37 C environ, on ajoute une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisé dans l'eau ainsi qu'une quantité adéquate de mannitol. Le mélange est ensuite congelé et lyophilisé. Le lyophilisat peut être repris dans de l'eau de qualité ppi (préparation pour injection) avant l'injection.
Le DDA est mis en suspension dans de l'eau (de 0. 01 mg/ml à 20 mg/ml). La solution de DDA est chauffée pendant 30 min à 62 C. Elle est ensuite laissée à température ambiante. Lorsque la température est de 37 C environ, on ajoute une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisé dans l'eau ainsi qu'une quantité adéquate de mannitol. Le mélange est ensuite congelé et lyophilisé. Le lyophilisat peut être repris dans de l'eau de qualité ppi (préparation pour injection) avant l'injection.
Exemple 4 : Administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à 10mg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à 10mg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 1A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, BBG2Na 40mg) ne présentent pas de titre sériques anti-G2Na, au contraire les groupes BBG2Na
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40mg+DDA ou BBG2Na 40mg+CTB montrent de très forts titres antiG2Na. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 1B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, BBG2Na 40mg) ne présentent pas d'IgA anti-G2Na, au contraire les groupes BBG2Na 40mg+DDA ou BBG2Na 40mg+CTB montrent de très forts titres d'IgA anti-G2Na.
Exemple 5 : Administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20mg de G2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20mg de G2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 2A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, G2Na 20mg) ne présentent pas ou très peu de titre sériques anti-G2Na, au contraire les groupes G2Na 20mg+DDA ou G2Na 20mg+CTB montrent de très forts titres anti-G2Na. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20mg de G2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à 10mg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20mg de G2Na associé ou non à 400mg de DDA ou à 10mg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les
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fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 2B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, G2Na 20mg) ne présentent pas d' IgA anti-G2Na, au contraire les groupes G2Na 20mg+DDA ou G2Na 20mg+CTB montrent de très forts titres d'IgA anti-G2Na.
Exemple 6 Administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA
Des groupes de 6 rats des cottons sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10, 20 et 30 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na, 400mg de DDA ou 40mg de BBG2Na associé à 400mg de DDA. Un dernier groupe a reçu 80mg de BBG2Na associé à 400mg de DDA solubilisés dans de l'eau. Au jour 40, les séra des rats des cottons sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 6 rats des cottons sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10, 20 et 30 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40mg de BBG2Na, 400mg de DDA ou 40mg de BBG2Na associé à 400mg de DDA. Un dernier groupe a reçu 80mg de BBG2Na associé à 400mg de DDA solubilisés dans de l'eau. Au jour 40, les séra des rats des cottons sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 3 reprend les résultats obtenus On peut noter que les groupes contrôles (PBS, PBS+DDA, BBG2Na 40mg+PBS) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-G2Na, au contraire les groupes BBG2Na 40mg+DDA+PBS ou BBG2Na 80mg+DDA+PBS montrent de très forts titres anti-G2Na.
Exemple 7 : Administration par la voie nasale de DT associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10mg de DT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10mg de DT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
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La figure 4A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, DT lOmg) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-DT, au contraire les groupes DT lOmg+DDA ou DT lOmg+CTB montrent de très forts titres anti-DT. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant lOmg de DT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant lOmg de DT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
La figure 4B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, DT lOmg) ne présentent pas d'IgA anti-DT, au contraire les groupes DT lOmg+DDA ou DT lOmg+CTB montrent de très forts titres d'IgA anti-DT.
Exemple 8 : Administration par la voie nasale de TT associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10mg de TT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène TT sont déterminés par ELISA.
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10mg de TT associé ou non à 400mg de DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les séra des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène TT sont déterminés par ELISA.
La figure 5A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, TT lOmg) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-TT, au contraire les groupes TT lOmg+DDA ou TT lOmg+CTB montrent de très forts titres anti-TT. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant lOmg de TT associé ou non à 400mg de
Des groupes de 5 souris sont immunisées par la voie nasale au jour 0,10 et 20 avec 20ml de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant lOmg de TT associé ou non à 400mg de
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DDA ou à lOmg de Toxine Cholérique B (CTB). Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène TT sont déterminés par ELISA.
La figure 5B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS,TT lOmg) ne présentent pas ou très peu d'IgA anti-TT, au contraire les groupes TT lOmg+DDA ou TT lOmg+CTB montrent de très forts titres d'IgA anti-TT.
Claims (32)
1. Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule générale :
dans laquelle RI, R2, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, et X représente un anion, comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que RI et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à 4.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 10 à 30 atomes de carbone, et préférentiellement de 16 à 20.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que X représente un atome d'halogène.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'ammonium quaternaire aliphatique est choisi parmi le diméthyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
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6.Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène, immunogène ou haptène.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend ledit ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 mélangé audit antigène, immunogène ou haptène.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques ou les lipides.
9. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.
10. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes.
11. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que ledit micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes est choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les
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streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.
12. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide de séquences SEQ ID N 2 ou à SEQ ID N 4 ou un peptide présentant après alignement optimal avec l'une des ces séquences un pourcentage d'identité d'au moins 80% .
14. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
15. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé , par mélange ou par couplage, à un composé porteur.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit composé porteur est choisi parmi les anatoxines, dont le toxoïde diphtérique ou le toxoïde tétanique, les protéines dérivées du streptocoque, les protéines de membrane Omp A ou OmpC ou les HSP.
17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit composé porteur est une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments.
18. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 17, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend un deuxième adjuvant différent des ammonium quaternaire aliphatiques tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit adjuvant est choisi dans le groupe d'adjuvant
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comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, la Leif, la CT, la LT ou les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 19, caractérisée en ce que le mélange ammonium quaternaire aliphatiques tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 et l'antigène, immunogène ou haptène associé éventuellement à un composé porteur est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
21. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 20, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre une cytokine ou un facteur de croissance.
22. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 21, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
23. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 21, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs.
24. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 en association avec une substance thérapeutique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ladite substance thérapeutique est choisie parmi les antibiotiques, les hormones, les anticancéreux, les antiinflammatoires, les vitamines, les oligoéléments, les facteurs de croissance et les anticorps monoclonaux.
26. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 en association avec une séquence d'acides
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nucléiques pouvant être comprise dans un vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
27. Utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 et d'une séquence d'acides nucléiques dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique permettant l'expression d'un peptide codé par ladite séquence d'acide nucléique dans les cellules de l'organisme recevant la préparation et préférentiellement les cellules épithéliales du tractus respiratoire.
28. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 en association avec un vecteur vivant exprimant un antigène, immunogène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
29. Composition ou vaccin tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 27 sous forme solide.
30. Composition ou vaccin selon la revendication 29, sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule.
31. Dispositif adapté pour une administration par voie muccosale, caractérisé en ce qu'il contient une composition ou un vaccin tel que défini dans l'une des revendications 29 ou 30.
32. Dispositif selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur.
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|---|---|---|---|
| FR0004120A FR2806913B1 (fr) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |
| AU48441/01A AU4844101A (en) | 2000-03-31 | 2001-04-02 | Use of aliphatic quaternary ammonium as adjuvant in a pharmaceutical compositionadministered by mucosal delivery |
| PCT/FR2001/000984 WO2001074387A1 (fr) | 2000-03-31 | 2001-04-02 | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |
| EP01921451A EP1267923A1 (fr) | 2000-03-31 | 2001-04-02 | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| FR0004120A FR2806913B1 (fr) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |
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| Publication Number | Publication Date |
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| FR2806913B1 FR2806913B1 (fr) | 2003-01-31 |
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| FR0004120A Expired - Fee Related FR2806913B1 (fr) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |
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