WO1996031235A1 - Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale - Google Patents

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WO1996031235A1
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inducing
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Bruno Guy
Jean Haensler
Marie-José Quentin-Millet
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Pasteur-Merieux Serums & Vaccins
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Definitions

  • the present invention relates to a vaccination kit intended to induce in a mammal, a protective immune response against a pathogenic organism infecting mucous membranes.
  • lymphocytes migrate into the secondary lymphoid organs.
  • the latter can be sites inducing systemic immunity or mucosal immunity. They can thus be called “systemic” or “mucous" organs.
  • the spleen which responds to antigens entering the bloodstream and the peripheral ganglia which provide protection against antigens entering the anatomical area from which they provide lymphatic drainage.
  • the immune system associated with the mucous membranes for its part, protects the body against antigens entering and residing in the mucous epithelial surfaces.
  • the immune system associated with the mucous membranes (inducing sites) is presented in the table below:
  • Immunoglobulins type A constitute the majority of immunoglobulins on the surface of the gastrointestinal, respiratory, urogenital or other mucous membranes. They are secreted within these mucous membranes and reputed to confer protection against infections affecting these sites.
  • a mucosal immune response is usually obtained after immunization by mucosal route, either directly at the level of the effector mucosa, or at another mucosal site distant from the site where to fight the infection.
  • the mucosal routes which are a priori accessible for immunization are the oral route, the intragastric route, the nasal route, the urogenital route and the rectal route.
  • the oral route is the one that is preferred, because of its ease of use, whether to vaccinate against infections of the gastrointestinal mucosa or to vaccinate against infections affecting another mucosa.
  • Jertborn et al. Vaccine (1992) 10: 130 relates a cholera vaccination study carried out with a small group of Swedes. The vaccine was administered twice, as an oral liquid solution. This vaccine has been shown to be both effective and safe. Nasal influenza vaccination has been successfully implemented in children and adults, as reported by Anderson et al, J. Clin. Microbiol. (1992) 30: 2230 and Treanor et al, Arm. Inter. Med. (1992) 117: 625.
  • rectal route may be a common route of entry for the entire mucosal immune system and that it should be possible to induce an immune response mucosal at a site distant from the rectal mucosa, used as an entry route to
  • mice receive the antigen intramuscularly and intragastrically using a tube, under anesthesia.
  • Hartman et al, Infect. Immun. (1994) 62 (2): 412 describes several immunization protocols against Shigella.
  • one of them comprises a first injection by the intraperitoneal or subcutaneous route followed by a booster by the ocular route.
  • This protocol is tested in the guinea pig model of keratoconjontivitis. The authors show that in naive animals, mucosal immunization is necessary for the induction of protection. Parenteral and mucosal double immunization increases the level of protection.
  • Nedrud et al J. Immunol. (1987) 139: 3484 describes a method of immunization against Sendai virus infections (nasopharyngeal infections which may eventually develop into bronchitis and pneumonia).
  • the effector site at which the immune response could be sought by the implementation of this method, is therefore the entire respiratory tract.
  • the method of Nedrud et al comprises two major steps: a primary immunization by the oral (intragastric) route and a booster via the nasal route.
  • the oral (intragastric) route is not the optimal route which would allow an inducing agent (here the Sendai virus) to reach one of the inducing sites of an immune response in the respiratory tract.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition intended to induce in a host mammal, a protective immune response against an antigen, at the level of an effector mucosal site, which comprises at least two identical products. or different containing each an agent inducing the immune response selected from the antigen and provided that the antigen is of a protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, for concomitant or consecutive administration; one of the products being formulated so as to be administered via the nasolabial route so that the inducing agent is targeted towards the site (s) inducing an immune response at the level of the nasopharynx or salivary glands, the other product being formulated to be administered via an appropriate mucosal route other than the nasal route, so that the inducing agent is targeted towards the inducing site (s) of a immune response at the effector site where the immune response is sought.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises a third product, identical or different to the first two, which contains an agent inducing the immune response, selected from the antigen and provided that the antigen is of protein nature.
  • the subject of the invention is a kit for inducing in a host mammal, a mucosal immune response against an antigen, at an effector site, which comprises: (i) so optional, a first agent inducing the immune response selected from the antigen and. provided the antigen is protein in nature. an expression cassette capable of expressing the antigen, a DNA or RNA fragment encoding the antigen; and (ii) a second and a third agent inducing the immune response selected from the antigen and. provided the antigen is protein in nature. an expression cassette capable of expressing the antigen, a DNA or RNA fragment encoding the antigen; with (a) optionally, instructions for systemic administration. of the first inducing agent,
  • the invention also relates to a method for inducing, in a host mammal, an immune response against an antigen, at a mucosal effector site, according to which, in any order:
  • a second agent inducing the immune response selected from the antigen is administered to the host mammal.
  • the antigen is of a protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, a DNA or RNA fragment coding for the antigen, via the nasal and / or buccal (nasal) route;
  • a third agent inducing the immune response selected from the antigen is administered to the host mammal and, provided the antigen is of protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, a fragment DNA or RNA encoding the antigen, by the appropriate mucosal route other than the nasal route so that the antigen is targeted to the site (s) inducing the immune response at the site effector where the immune response is sought.
  • the administration of the first inducing agent can advantageously be carried out in a single dose, by systemic injection, such as an intravenous, intramuscular, intra-dermal or subcutaneous injection.
  • systemic injection such as an intravenous, intramuscular, intra-dermal or subcutaneous injection.
  • site and injection route will depend in particular on the lymph nodes that one wishes to target. We indicate that if we want to target the lymph nodes for example celiac, it is best to inject in the dorso-lumbar region using the intramuscular route (rather than the subcutaneous route).
  • this inducing agent must be in particulate form.
  • the inducing agent is advantageously supplemented with an adjuvant, either by precipitation or by adsorption.
  • the adjuvant can be any conventional adjuvant of the aluminum phosphate or hydroxide type, calcium phosphate, or even an adjuvant such as polyphosphazene. It can also be an adjuvant of the liposome, microsphere, ISCOM or virus-like-particles (VLPs) type; the latter being of a particularly advantageous use when it is desired to target the ganglia which drains the urogenital region. All these adjuvants are within the reach of those skilled in the art.
  • the appropriate dosage varies according to certain parameters, for example the individual treated or the nature of the inducing agent. For all practical purposes, it is indicated that a dose of an antigen can vary from 5 to 100 ⁇ g, preferably from 25 to 50 ⁇ g.
  • nasolabial or buccal
  • oral route should not be confused with what is commonly called “oral route” and which should be more aptly called “intragastric route”.
  • the oral route including the intragastric route, must allow the inducing agent (antigen) to reach mainly the mucous membranes of the lower parts (digestive tract and mainly the small intestine and Peyer's patches). while the buccal route carries the inducing agent essentially towards the mucous membranes of the upper parts.
  • the entry site of the oral route and that of the oral route can be the same; in this case it is the mouth. However, the trajectories are essentially different.
  • the third inducing agent When it comes to the stomach or the intestine, the third inducing agent will advantageously be formulated to be administered orally, including the intragastric route (eg in the presence of enteric protection, such as liposomes, microspheres , bicarbonate or gelatin capsule).
  • enteric protection such as liposomes, microspheres , bicarbonate or gelatin capsule.
  • the third inducing agent In the case of the intestine or the urogenital tract, the third inducing agent will advantageously be formulated to be administered by the urogenital route, for example in the form of a vaginal capsule or by the rectal route, for example under suppository form.
  • the second or third inducing agent may also be supplemented with an adjuvant other than liposomes or microspheres, and devoid of toxicity other than the non-toxic subunits or the detoxified forms of bacterial toxins.
  • the adjuvant of the second or third inducing agent is used, the major lipopolysaccharide (MPLA: major lipopolysaccharide antigen) of a bacterium, for example of E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium or Shigellaflexneri.
  • MPLA major lipopolysaccharide antigen
  • MPLA mucosal adjuvant for the preparation of a composition (i) containing an antigen or, provided that the antigen is of a protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, a DNA or RNA fragment coding for the antigen, (ii) intended for the induction of a mucosal immune response against the antigen and (iii) intended to be administered by mucosal route.
  • the second or third inducing agent when it is an antigen, can be administered at a rate of 100 ⁇ g to 1 mg per dose.
  • the first inducing agent (systemic route), when administered, is administered by primary injection, allowing a period of 7 to 45 days to run, preferably 20 to 30 days before the first booster (administration of the second or of the third inducing agent).
  • the first inducing agent can also be administered at the same time as the second or third inducing agent.
  • the second and third inducing agents can be administered concomitantly or consecutively. When administered over a period of time, they are advantageously administered from 7 to 45 days, preferably 28 days apart.
  • each of the three inducing agents is carried out independently of each other.
  • at least one of the three must be the antigen.
  • these three inducing agents can be the same and in this case, it will advantageously be the antigen.
  • a vaccine vector eg poxvirus or adenovirus comprising a DNA fragment coding for this antigen and placed under the control of an appropriate promoter
  • this DNA fragment as it is (non-vectorized), put in plasmid form or not (preferably the DNA fragment will be inserted in a plasmid rather than remaining in the state of simple transcription unit), presented in formulation liposomal (anionic or cationic) or not, (iii) or the corresponding RNA fragment.
  • a promoter capable of inducing in mammalian cells the expression of the DNA fragment coding for the antigen is used.
  • DNA-based vaccines to be distinguished from vaccines based on viral vectors
  • hCMV human cytomegalovirus
  • use will preferably be made of a plasmid incapable of replicating in mammals. Such a plasmid must also be essentially non-integrative.
  • the antigen of a bacterium pathogenic for the host mammal is an H antigen.
  • pylori for example the apoenzymatic form of H urease.
  • the invention also relates to the use of a DNA fragment coding for a H. antigen. pylori. in the manufacture of a composition intended to prevent or treat an infection with H. pylori and intended to be administered by nasal or nasal route.
  • the DNA fragment used as a vaccine agent meets the criteria set out above. It has also been found that to induce a mucosal immune response against a pathogenic organism infecting the stomach or the intestine, it would not be essential to administer an immunogen at one of these sites, but that it might suffice to administer it by the high route, that is to say by the nasal-oral route, possibly by combining a systemic route .
  • the invention relates to a composition intended to induce, in a host mammal, an immune response against an antigen, in the stomach or the intestine, which comprises an agent inducing the immune response, selected from the antigen and, provided that the antigen is of a protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, a DNA or RNA fragment coding for the antigen, the inducing agent being formulated so as to be administered by the nasal-oral route.
  • the invention also relates to the use of a product selected from an antigen and, provided that the antigen is of a protein nature, an expression cassette capable of expressing the antigen, a fragment DNA or RNA coding for the antigen, for the preparation of a composition intended to induce, in a host mammal, an immune response against the product, in the stomach or intestine, and intended for administration by the nasal-oral route.
  • Such a composition when it comprises an antigen from a pathogenic organism infecting the stomach or intestinal mucosa, is in particular useful in that it protects the host mammal against the infection in question, in particular by offering long-term protection, by using memory T and B lymphocytes.
  • These can be infections with H. pylori, V. cholerae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enteritis, Clostridium difficile. Yersinia enlerocolilica, enteroxigenic and enteropathogenic E. coli.
  • the antigen may be the pathogenic agent itself in killed, lysed or attenuated form, or else antigenic components of this pathogen, such as a capsular polysaccharide, or membrane antigens, under purified form, or a polypeptide characteristic of this pathogen, either directly purified from the pathogen, or obtained by recombinant DNA techniques.
  • an antigen of choice may be the apoenzyme of urease, composed of the subunits A and B, the fragments of which Corresponding DNAs are described in eg
  • an antigen of choice may be the B subunit of cholera toxin, as already described in the literature.
  • FIG. 1 shows the analysis by Elispot of the immune response induced by administration of the cholera toxin (CTB) B subunit, in the salivary glands (1A ) and in the stomach (1B).
  • CTB cholera toxin
  • the results relate to three immunization protocols: subcutaneous / oral (Se O); subcutaneous / nasal (Se N); and subcutaneous / oral + nasal (Se O + N).
  • oral of course means "intragastric”.
  • the dark hatching on a light background corresponds to the IgA response.
  • the light hatching on a dark background corresponds to the IgG2a response.
  • the response in the stomach is presented in number of responding mice on a batch of 5 mice: the number of spots per million cells is of the order of 9.
  • Figure 2 presents the Elispot analysis of the induced immune response in the salivary glands (2A) and in the stomach (2B) by administration according to the subcutaneous / subcutaneous + oral + nasal protocol (Se / Se + O + N). from BTC.
  • oral of course means "intragastric”.
  • the dark hatching on a light background corresponds to the IgA response.
  • the light hatching on a dark background corresponds to the IgG2a response.
  • the response in the stomach is presented in number of responder mice out of a batch of 5 mice; the number of spots per million cells is around 8.2.
  • Figure 3 shows the Elispot analysis of the immune response induced in the salivary glands (3A) and in the stomach (3B).
  • Jack Bean urease according to the subcutaneous (alum) / oral + nasal (liposome) protocol.
  • oral of course means “intragastric”.
  • the dark hatching on a light background corresponds to the IgA response.
  • the light hatching on a dark background corresponds to the IgG2a response.
  • the response in the stomach is presented in number of responder mice out of a batch of 5 mice; the number of spots per million cells is around 620.
  • Figure 4 shows the Elispot analysis of the immune response induced in the salivary glands (4A) and in the stomach (4B) by administration of Jack Bean urease according to the subcutaneous (liposomes) / oral + nasal protocol (liposomes).
  • oral of course means “intragastric”.
  • the dark hatching on a light background corresponds to the IgA response.
  • the light hatching on a dark background corresponds to the IgG2a response.
  • the response in the stomach is presented in number of responder mice out of a batch of 5 mice; the number of spots per million cells is of the order of 15.
  • Figure 5 shows the plasmid pTG8665, used to produce the apoenzyme of H urease. pylori.
  • Figure 6 shows the plasmid pCMC / Ela in which the HmDIII (1) - S ⁇ cll (754) fragment contains the hCMV promoter, the Xhol (771) - Smal (2104) fragment contains the ORF E 1 a, and the Smal fragment (2104) - EcoRl (2810) contains the 3 'BG ⁇ end and the EcoRI (2810) - HinDIII (1) fragment corresponds to the pUC19 backbone.
  • Figure 7 shows the plasmid pCB-1 1.
  • Figure 8 shows the plasmid pCB-ureB in which the ORF ureB goes from nucleotide 777 to nucleotide 2487.
  • ⁇ corresponds to a primary immunization by intramuscular route (plasmid only), followed by two reminders at D21 and 42 by intranasal route (plasmid + liposomes) • corresponds to a primary immunization by intradermal route (plasmid only), followed by two reminders at D21 and 42 by intranasal route (plasmid + liposomes).
  • Figure 10 shows in diagram form, the optical density of the stomach medium of mice, after possible immunization with the apoenzyme of H urease. pylori and ordeal.
  • First column uninfected mice: second column: mice having received empty liposomes, by subcutaneous primary immunization followed two boosters per channel (nasal + intragastric); third column: mice having received liposomes with urease, by subcutaneous primoimmunization followed by two boosters per route (nasal + intragastric); fourth column: mice having received liposomes with urease, by repeated administration three times by routes (nasal + intragastric). In all cases, these are DC-Chol liposomes.
  • a volume of latex beads of 3 ⁇ M (Polysciences cat 17 34) is taken and then washed 3 times in PBS buffer (centrifugation 1,000 rev / min. For three minutes).
  • the beads are then mixed with a preparation of purified CTB and concentrated to 10 mg / ml in order to obtain a preparation in which the CTB is diluted to 1/20 (ie to a final concentration of 0.5 mg / ml). This preparation is placed for 2 hrs with stirring.
  • a CTB preparation coated on latex beads is obtained as described in section 1.A. b) with the exception of the final dilution in carbonate buffer.
  • the preparation is then diluted in PBS buffer as required.
  • BalbC mice receive, subcutaneously, 10 ⁇ g of CTB adjuvanted with alum as described in section 1.A. a), in a volume of 500 ⁇ l.
  • mice constituted in a control batch receive subcutaneously 500 ⁇ l of PBS. 28 days after the subcutaneous injection, the test mice are divided into 3 groups.
  • mice of the first group receive intragastrically, via a cannula coupled to a 1 ml syringe, 10 ⁇ g of CTB coated on latex beads as described in section 1.A. b) in a volume of 500 ⁇ l. Mice from the control batch receive 500 ⁇ l of carbonate buffer, by the same route.
  • mice of the second group receive 10 ⁇ g of CTB nasally coated on latex beads as described in section 1.A. c) in a volume of 20 ⁇ l. These 20 ⁇ l are deposited dropwise on the nostrils. Mice from the control batch receive 20 ⁇ l of PBS. by the same way.
  • mice of the third group simultaneously receive 10 ⁇ g of CTB by the oral route (intragastric) and 10 ⁇ g of CTB by the nasal route.
  • the preparation of CTB coated on latex beads is obtained as described in section 1.A. d). Mice are constituted as controls.
  • the subcutaneous / oral (intragastric) protocol proves incapable of inducing a significant mucosal immune response, while such a response is observed in the case of the subcutaneous / nasal and subcutaneous / oral (intragastric) + nasal protocols. .
  • mice 15 days after the recall, the stomach and salivary glands of the mice are removed; the cells are extracted and the IgA response is analyzed in Elispot.
  • Example 2 Induction of a mucosal immune response against Jack Bean urease.
  • lipid mixture composed of Cholesterol (Sigma), Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) and sodium salt of Dimyristoylphosphatidylglycerol in molar proportions of 5: 4: 1 are dissolved in 50 ⁇ l of absolute ethanol.
  • the solution is injected via a Hamilton syringe into 2 ml of an aqueous solution containing 4 mg / ml of Jack Bean urease, optionally buffered with PBS buffer diluted 1/10.
  • the preparation is maintained at 45 ° C, with stirring.
  • the lipids spontaneously organize themselves in the form of liposomes (mainly unilamellar of average size 50-100 nm) by trapping a certain volume of the urease solution.
  • liposomes are purified (isolated from excess free urease) by gel filtration on a Sepharose CL-4B column (Pharmacia). The degree of encapsulation of urease measured using iodine-labeled urease 125 (Enzymobeads TM technique, Biorad). ranges from 3 to 6%. If necessary, the liposomal suspension is concentrated by ultrafiltration in a Novacell TM cell (Filtron) having an exclusion limit of 10 kD. 2. Extrusion 16.4 mg of a lipid mixture composed of Cholesterol (Sigma),
  • Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) and sodium salt of Dimyristoylphosphatidylglycerol in molar proportions of 5: 4: 1 are dissolved in 4 ml of chloroform in a 25 ml Pyrex flask. The solution is evaporated (Rotavapor Buchi) to form a thin lipid film on the walls of the flask. The lipid film is dried under high vacuum for 2 hours, then taken up with 2 ml of water containing 8 mg of Jack Bean urease.
  • the suspension is extruded (Extruder TM, Lipex Biomembranes Inc., Vancouver) 5 times through 2 superimposed polycarbonate membranes with a porosity of 400 nm (Nucleopore TM, Costar) to form a homogeneous population of predominantly unilamellar liposomes of around 400 nm in diameter and containing urease.
  • These liposomes are purified (isolated from excess free urease) by gel filtration on a column of Sepharose CL-4B, Pharmacia).
  • the degree of encapsulation of urease measured using urease labeled with iodine 125 (Enzymobeads TM labeling technique,
  • 82 mg of a lipid mixture composed of Cholesterol, Dipalmitoylphosphatidylcholine and sodium salt of Dimyristoylphosphatidylglycerol in molar proportions of 5: 4: 1, obtained by lyophilization of an ethanolic solution (D3F - France) are taken up with 10 ml of 10 mM Hepes buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4, containing 3.6 mg / ml of the recombinant apoenzymatic form of H. pylori urease.
  • the suspension is micorfluidized by 5 passages at 500 kPa in an M1 10S microfluidizer (Microfluidics Co.) to form a homogeneous population of predominantly unilamellar liposomes of approximately 100 nm in diameter and containing urease.
  • M1 10S microfluidizer Microfluidics Co.
  • These liposomes are purified by gel filtration (Sepharose Column CL-4B, Pharmacia).
  • the urease encapsulation rate measured by protein assay using the Micro BCA kit (Pierce) is 14.5%.
  • the liposomal suspension is concentrated by ultrafiltration in a Novacell cell (Filtron) having an exclusion limit of 10 kD.
  • MPLA Extra of E. coli; Sigma
  • OF 1 mice receive subcutaneously: - either 20 ⁇ g urease adjuvanted with alum as described in section 2.
  • A. b) in a volume of 500 ⁇ l ; and - by nasal route, 20 ⁇ g urease in liposomal preparation as obtained in section 2.
  • the stomach and salivary glands of the mice are removed; the cells are extracted according to the protocol described in the preamble to the examples and the IgA response is analyzed in Elispot according to the method described in the preamble.
  • Figure 3 shows that, in the case of the subcutaneous (alum) / [oral (intragastric) + nasal] (liposomes) protocol, the IgA response in the salivary glands (3a ), although weak, is in the majority, while for the stomach (3b). 3 mice on
  • kits three preparations are combined containing the apoenzyme of H. pylori urease. each formulated differently, depending on the method of administration
  • the transformed strain is cultured in LB medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin. In the exponential growth phase, 0.2% arabinose is added in order to induce the expression of ure A and ureB. After different induction times (1 to 3 hrs). the level of production of UreA and UreB is very high (around 10% of the total proteins) and the cells are then removed.
  • the purification is carried out according to a protocol similar to that described by Hu et al, Infect. Immun. (1992) 60: 2657.
  • the supernatant containing the soluble proteins is adjusted to pH 6.8 and then loaded with a flow rate of 4 ml / min on an anion exchange column (DEAE-Sepharose Pharmacia) of volume 5 cm x 25 cm , equilibrated with 20 mM KPO 4 buffer pH 6.8 containing 1 mM PMSF (PO buffer).
  • the column is eluted with a linear gradient from 0 to 0.5 M KCl. 14 ml fractions are collected and analyzed by SDS PAGE. The fractions containing the urease in the purest form are combined.
  • KCl is added to the fraction thus obtained so that the final concentration of KCl is equal to 1M, the solution is loaded onto a Phenyl-Sepharose column (Pharmacia). The column is eluted with a KCl gradient from 1 M to 0 M. As before, the fractions are collected and analyzed by SDS PAGE. The fractions containing the urease in the purest form are combined and dialyzed against a 20 mM KPO 4 buffer, pH 7.5.
  • the fraction obtained is loaded onto an anion exchange column (Q-Sepharose Fast Flow; Pharmacia) balanced with KPO 4 20mM buffer pH 7.5; as before, the column is eluted with a linear gradient from 0 to 0.5 M KCl and the fractions are collected and analyzed by SDS PAGE.
  • the fractions containing the urease are combined, concentrated by diafiltration on a membrane whose cutoff threshold is 100 kDa and the fraction is deposited on a gel filtration column (Sephacryl 400
  • This supernatant is adjusted to pH 7.5 and then loaded at a flow rate of 4 ml / min. on an anion exchange column (Q - Fast flow sepharose; Pharmacia; ref. 17-0510-01) of volume 5 cm x 25 cm, equilibrated with a 20 mM KPO 4 equilibrium buffer pH 7.5 containing 1 mM PMSF.
  • the column is eluted with a linear gradient from 0 to 0.5 M KCl in the equilibrium buffer (vol. Of the gradient: 2.25 1; flow rate: 4 ml / min).
  • the Q - Sepharose pool is loaded at a flow rate of 2 ml / min, on a column of zinc chelate (Chelating - Sepharose fast flow; Pharmacia: ref. 17-0575-02) of volume 2.6 cm x 1 1 cm, previously prepared as follows.
  • the column is loaded with metal with 2 volumes of 0.2 M ZnCl 2 solution, then rinsed with 3 volumes of 0.5 M NaCl and then with 3 volumes of 50 mM Tris-HCl equilibration buffer pH 8, containing 0.5 M NaCl, 1 mM imidazole and 1 mM PMSF.
  • the column is washed with 1 volume of 10 mM imidazole equilibration buffer and then rinsed with 3 volumes of 1 mM imidazole equilibration buffer.
  • the column is washed with the equilibration buffer until the return to the baseline (washing carried out overnight at 0.2 ml / min).
  • the column is then washed with 200 ml of 7.5 mM imidazole equilibration buffer at a flow rate of 1 ml / min.
  • Elution takes place in a linear gradient from 7.5 mM to 30 mM imidazole in the equilibration buffer (volume of the gradient: 250 ml; flow rate 1 ml / min).
  • Chromatography is carried out at a flow rate of 0.5 ml / min. 10 ml fractions are recovered which are analyzed by SDS-PAGE. The fractions containing pure urease are combined (in general, these are fractions 21 to 27 from the end of the charge) and concentrated to approximately 2.5 mg / ml by ultrafiltration on an Amicon YM 100 membrane. The apoenzyme preparation is filtered through a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m and is stored frozen at -20 ° C or freeze-dried in the presence of sucrose, for example.
  • kit preparations are as follows:
  • a dose for injection is prepared by adsorbing 20 ⁇ l of the apoenzyme solution obtained in 3. A. (i.e. 50 ⁇ g) with 250 ⁇ l of an aluminum hydroxide preparation (alhydrogel; Superfos) at 1 mg / ml , after adsorption for 2 hrs at + 4 ° C, the final volume is adjusted to 500 ⁇ l by the addition of PBS. 3.C. Apoenzyme liposomes, for nasal administration, aerosol
  • the apoenzymatic form of H urease. pylori is encapsulated in liposomes. These liposomes have an average diameter of 100 nm and a protein content of 60 ⁇ g / mg of lipid.
  • a total amount of 0.1 mg of formulated urease is administered via the nasal route.
  • An aerosol with two tips (nose and mouth) of the type sold by the company VALOIS (Le Prierance, BPG, 271 10 Le Neubourg) is used. Pumps make it possible to deliver a finished volume depending on the type of pump, a nozzle of variable size adapting to the container fitted with its pump (300 ⁇ l maximum per administration, this dose being able to be repeated within selected times).
  • VALOIS Le Prierance, BPG, 271 10 Le Neubourg
  • a total of 0.5 mg of formulated urease is administered intragastrically.
  • the apoenzyme is prepared according to the method described in paragraph 3.C., then lyophilized and taken up in 20 ml of a 200 mM bicarbonate solution.
  • An adult receives the dose prepared in 3.B subcutaneously. 28 days after the first injection, he receives the dose prepared in 3.C. and ingests the same day as the dose prepared in 3.D.
  • the eukaryotic expression vector pCB-1 1 is constructed from the following three elements: - The plasmid pUC19 (commercially available) previously digested with Xbal and EcoRI; - A Spel-Sacll fragment isolated from the plasmid pCMV-Ela ( Figure 6), which comprises the early promoter of the human cytomegalovirus (hCMV) as described in eg USP 5,168,062; and - A S ⁇ cII-EcoRI fragment comprising the 3 ′ part of the bovine growth hormone gene including the polyadenylation signal of the mRNA as well as the stabilization sequences of the mRNA.
  • hCMV human cytomegalovirus
  • This Sacll-EcoRl fragment is obtained from the plasmid pBS-BGH constructed by inserting a BamHI-EcoRl fragment from the plasmid pCMV-Ela, in the Bluescript plasmid (commercially available). These three fragments are ligated together to form the plasmid pCB-
  • the ureB gene is amplified by PCR from the plasmid pILL914 and using the following primers.
  • upstream primer 5 'cgtctcgagccaccatgaaaagattagcagaaaag
  • the upstream primer makes it possible to introduce the Xhol restriction site and the Kozak sequence upstream of the open reading frame (ORF) of ureB. while the downstream primer makes it possible to introduce the Smal site downstream of the ORF.
  • the fragment generated by PCR is digested and then inserted into the plasmid pCB-1 1. previously digested with XhoI and SmaI, to generate the plasmid pCB-ureB ( Figure 8).
  • E. coli XL1 is transformed with this plasmid and then cultured according to conventional techniques.
  • the plasmid thus amplified is harvested in the usual way by alkaline lysis followed by an isopicnic gradient in cesium chloride.
  • the DNA is taken up either in distilled water or in physiological water (NaCl 9% o).
  • 100 ⁇ l of the preparation obtained above are diluted by adding 150 ⁇ l of distilled water. Then 250 ⁇ l of an aqueous preparation of the plasmid pCB-ureB are added at 2 ⁇ g / ⁇ l.
  • the charge ratio (TC1-12 / nucleotide) is of the order of 0.35.
  • Balb / c mice aged 6 to 8 weeks are previously anesthetized by injection of a xylazine + ketamine mixture. They receive 3 administrations of 50 ⁇ g of pCB-ureB, 3 weeks apart.
  • the intranasal route (IN), the intramuscular route (IM) and the intradermal route (ID) are used.
  • a DNA solution at 100 ⁇ g / ml in physiological water are injected into the quadriceps using a Hamilton syringe equipped with a 29 gauge needle.
  • Example 5 Induction of a mucosal immune response against H. urease. pylori.
  • the resulting multilamellar vesicle suspension is then microfluidized by 10 passages at 500 kPa in an M 1 10S S microfluidizer (Microfiuidics Co.) to form a homogeneous population of predominantly unilamellar liposomes of approximately 100 nm in diameter and containing the apoenzyme. These liposomes are filtered through a Strouvex-HV filter (0.45 ⁇ , Millipore) and then lyophilized after the addition of 20g of sucrose.
  • M 1 10S S microfluidizer Microfiuidics Co.
  • the size of the liposomes measured by light scattering is 148 ⁇ 52nm.
  • the degree of packaging of the apoenzyme is of the order of 20%; the remainder of the total amount being in free form (not packaged).
  • mice aged 6 to 8 weeks are divided into 4 groups (10 mice / group) and receive on D0, D28 and D56 by different routes, a dose of the preparation obtained above. Two immunization protocols are tested. It is :
  • the doses are as follows: For nasal administration, an amount of lyophilisate corresponding to 10 ⁇ g of total apoenzyme (encapsidated + non-encapsidated) is taken up immediately with 30 ⁇ l of physiological water (NaO 9 ° / °°). The dose is applied dropwise to the nostrils. For subcutaneous administration, the same dose of lyophilisate is taken up in 300 ⁇ l of saline. For intragastric administration. an amount of lyophilisate corresponding to 40 ⁇ g of total apoenzyme (encapsidated + non-encapsidated) is taken up in 300 ⁇ l of saline supplemented with 0.2 M NaHCO 3 . The dose is administered using a cannula coupled to a 1 ml syringe.
  • mice 15 days after the last administration, the mice are tested by intragastric gavage with 10 8 germs of a strain of H. pylori adapted to the mouse.
  • a urease activity test Jatrox ND
  • the optical density of the medium is measured at 550nm. The results are shown in Figure 10.

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Abstract

L'invention a pour objet une composition pharmaceutique destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal effecteur, qui comprend au moins deux produits identiques ou différents contenant chacun un agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, pour une administration concomitante ou consécutive; l'un des produits étant formulé de manière à être administré par voie naso-buccale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oro-pharynx ou des glandes salivaires, l'autre produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée. De manière optionnelle, une telle composition peut aussi comprendre un troisième produit, identique ou différent aux deux premiers, formulé pour être administré par voie systémique.

Description

COMPOSITION DESTINEE A L'INDUCTION D'UNE REPONSE
IMMUNITAIRE MUCOSALE
La présente invention a pour objet un kit de vaccination destiné à induire chez un mammifère, une réponse immunitaire protectrice à rencontre d'un organisme pathogène infectant des muqueuses.
Les cellules de l'immunité peuvent être concentrées au sein d'organes ou former un tissu lymphoïde plus ou moins diffus, ces tissus et organes constituant dans leur ensemble le système lymphoïde. On distingue les organes lymphoïdes primaires qui sont les sites majeurs de la lymphopoïese (thymus, moelle osseuse), et les organes et tissus lymphoïdes secondaires au sein desquels les lymphocytes peuvent interagir entre eux ou avec l'antigène. Les organes lymphoïdes secondaires comprennent la rate, les ganglions lymphatiques et les formations lymphoïdes associées aux muqueuses (MALT pour mucosal associated lymphoïd tissue), plaques de Peyer et amygdales palatines entre autres. En plus du tissu lymphoïde organisé constituant le MALT, on trouve de nombreux lymphocytes dans la muqueuse de l'estomac, de l'intestin grêle, du colon, des bronches et de divers autres organes.
Après s'être différenciés dans les organes lymphoïdes primaires, les lymphocytes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Ces derniers peuvent être des sites inducteurs de l'immunité systémique ou de l'immunité mucosale. On peut ainsi les appeler organes "systémiques" ou "muqueux".
Parmi les organes "systémiques", on distingue la rate qui répond aux antigènes pénétrant dans la circulation sanguine, et les ganglions périphériques qui assurent la protection vis-à-vis des antigènes pénétrant dans la zone anatomique dont ils assurent le drainage lymphatique. Dans le tableau ci-après, on présente une liste des différents ganglions en liaison avec les zones qu'ils drainent (sites inducteurs ou effecteurs). Le système immunitaire associé aux muqueuses, pour sa part, protège l'organisme contre les antigènes pénétrant par les surfaces épithéliales muqueuses et y résidant. On trouve l'anneau de Waldeyer et les tissus lymphoïdes associés au tractus respiratoire (BALT pour bronchial associated lymphoïd tissue), au tube digestif (GALT pour gut associated lymphoïd tissue) et au tractus uro-génital. Le système immunitaire associé aux muqueuses (sites inducteurs) est présenté dans le tableau ciaprès :
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
Une fois stimulés dans les organes secondaires inducteurs, les lymphocytes peuvent migrer vers les sites effecteurs en transitant par la lymphe, via les ganglions associés aux sites inducteurs, éventuellement via les ganglions plus importants drainant ces premiers ganglions, les veinules lymphatiques efférentes aboutissant dans le canal thoracique. La lymphe de ce dernier rejoint la circulation sanguine par laquelle les cellules rejoignent les organes cibles ou sites effecteurs. En ce qui concerne les cellules lymphoïdes du MALT, celles-ci recirculent vers les territoires muqueux. Par exemple, des cellules stimulées dans les plaques de Peyer traversent les ganglions associés puis passent dans le sang pour venir se localiser dans certains sites muqueux. Cette recirculation sélective est due à la capacité des lymphocytes à reconnaître des molécules d'adhérence exprimées spécifiquement sur les cellules endothéliales des veinules post-capillaires des muqueuses. Grâce à ce mécanisme, la stimulation antigénique d'un territoire muqueux (inducteur) peut induire une réponse dans d'autres territoires muqueux (effecteurs). A ce jour, de nombreuses méthodes d'immunisation ont été rapportées dans la littérature scientifique. Les caractéristiques-clé de ces méthodes sont, d'une manière générale, (i) la nature de l'immunogène, (ii) la ou les voies d'administration de l'immunogène ainsi que (iii) la formulation de l'immunogène. En ce qui concerne la nature de l'immunogène. la possibilité d'utiliser en alternative à un antigène de nature protéique. un immunogène de nature nucléique (ARN. ADN) est déjà connue depuis longtemps. Il n'y a donc pas lieu de s'étendre plus avant. Les voies et méthodes d'immunisation favorisant la prévention ou le traitement des infections mucosales ont déjà fait l'objet d'un certain nombre d'études sans pour cela être couronnées d'autant de succès que la vaccination à rencontre des infections systémiques. Néanmoins, l'ensemble de ces études indique que. lorsqu'il s'agit d'un pathogène s'implantant au niveau des muqueuses, la seule immunisation par voie svstémique ne semble pas suffisante pour que se développe une protection convenable. Il semble souhaitable, sinon indispensable d'induire une immunisation par voie mucosale, éventuellement en surplus à une immunisation par voie svstémique, pour lutter avec efficacité contre ce type d'infection. L'immunisation par voie mucosale permet essentiellement de stimuler le tissu lymphoïde drainant la ou les muqueuses où se niche le pathogène et d'obtenir ainsi une réponse immunitaire ciblée au niveau de cette ou ces muqueuses.
Les immunoglobulines de type A (IgA) constituent la majorité des immunoglobulines à la surface des muqueuses gastro-intestinale, respiratoire, urogénitale ou autres. Elles sont sécrétées au sein de ces muqueuses et réputées conférer une protection à l'encontre des infections affectant ces sites.
Une réponse immunitaire mucosale est usuellement obtenue après immunisation par voie mucosale, soit directement au niveau de la muqueuse effectrice, soit en un autre site mucosal éloigné du site où combattre l'infection. Les voies mucosales qui sont a priori accessibles pour immunisation sont la voie orale, la voie intragastrique, la voie nasale, la voie uro-génitale et la voie rectale. Toutefois, la voie orale est celle sur qui le choix se porte de préférence, en raison de sa facilité d'utilisation, que ce soit pour vacciner contre des infections de la muqueuse gastrointestinale ou pour vacciner contre des infections affectant une autre muqueuse.
Pour illustrer ce propos, différents exemples de l'art antérieur sont donnés comme suit : Récemment, Czinn et al. Vaccine (1993) 11 : 637 ont proposé l'ébauche d'une méthode de vaccination à l'encontre de Helicobacier pylori. agent pathogène de nombreux ulcères de l'estomac. Des souris axéniques ont reçu un sonicat d' H. felis adjuvé par la toxine cholérique, par voie intragastrique (sonicat directement administré, par intubation, au niveau de l'estomac). Après une épreuve par H. felis. on constate que les souris immunisées ont été protégées.
Cette procédure est par commodité, appelée dans la suite de l'article "immunisation orale". Cet article trouve son équivalent dans la demande de brevet Czinn & Nedrud WO 93/20 843.
Jertborn et al. Vaccine ( 1992) 10 : 130 relate une étude de vaccination anticholérique effectuée auprès d'un petit groupe de Suédois. Le vaccin était administré par deux fois, sous forme de solution liquide buvable. Ce vaccin s'est révélé à la fois efficace et sans risque. La vaccination contre la grippe par voie nasale a été mise en oeuvre avec succès chez les enfants et les adultes, comme le rapporte Anderson et al, J. Clin. Microbiol. (1992) 30 : 2230 et Treanor et al, Arm. Inter. Med. (1992) 117 : 625.
Gallichan et al, J. Infect. Dis. (1993) 168 : 622 montre qu'il est possible d'induire à la fois une réponse immunitaire mucosale et systémique après administration par voie intranasale d'un adénovirus recombinant exprimant la glycoprotéine B de l'Herpès Simplex Virus (HSV). En conclusion, les auteurs suggèrent que d'une manière générale, leur approche permettrait d'obtenir une protection à long terme à l'encontre des virus transmis par voie mucosale ou sexuelle.
Certaines études telles que Forest et al, Vaccine (1990) 8 : 209, suggèrent que la voie rectale pourrait être une voie d'entrée commune à l'ensemble du système immunitaire mucosal et qu'il devrait être possible d'induire une réponse immunitaire mucosale en un site éloigné de la muqueuse rectale, utilisée comme voie d'entrée de
L'association de différentes voies d'immunisation a déjà été décrite par plusieurs auteurs comme étant un moyen de choix pour obtenir une réponse optimale. L'association d'une voie mucosale et d'une voie systémique est par exemple décrite dans les articles suivants.
Keren et al. Infect. Immun. (1988) 56 (4) : 910 indique qu'une méthode d'immunisation par voies combinées, parentérale et orale, donne de meilleurs résultats en termes de réponse IgA à l'encontre de Shigella flexneri, qu'une immunisation par voie unique. En pratique, des souris reçoivent l'antigène par voie intramusculaire et par voie intragastrique à l'aide d'un tube, sous anesthésie.
Yoshimura et al. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. ( 1991 ) 117 : 889 propose de vacciner contre les otites à pneumocoques en associant l'administration par voies systémique et orale. Les protocoles d'immunisation sont testés chez le cobaye. L'administration dite par voie orale, s'effectue en fait au niveau du duodénum ou de l'estomac au moyen d'un cathéter ou bien consiste en l'absorption de capsules entériques. Les auteurs montrent que seule l'association voie systémique + voie orale sous forme de capsules, donne de bons résultats. Forest et al, Infect. Immun. (1992) 60 (2) : 465 teste chez l'homme, plusieurs modes d'immunisation en vue d'induire une réponse IgA à l'encontre de Salmonella typhi. Les voies orale et sous-cutanée sont utilisées comme suit : orale ; orale/orale ; orale/sous-cutanée ; et sous-cutanée/orale. Les auteurs montrent qu'une première injection parentérale suivie quelques jours après par une deuxième dose absorbée par voie orale ne favorise pas la réponse IgA. Par contre, l'absorption du vaccin par voie orale, répétée une fois, donne de bons résultats.
Hartman et al, Infect. Immun. (1994) 62 (2) : 412 décrit plusieurs protocoles d'immunisation à l'encontre de Shigella. En particulier, l'un d'entre eux comprend une première injection par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée suivie d'un rappel par voie oculaire. Ce protocole est testé dans le modèle cobaye de la keratoconjontivite. Les auteurs montrent que chez les animaux naïfs, l'immunisation par voie mucosale est nécessaire à l'induction d'une protection. La double immunisation parentérale et mucosale augmente le niveau de protection.
Nedrud et al, J. Immunol. (1987) 139 : 3484 décrit une méthode d'immunisation à l'encontre des infections à virus Sendai (infections du naso-pharynx pouvant éventuellement évoluer en bronchite et pneumonie). Le site effecteur au niveau duquel la réponse immunitaire pourrait être recherchée par la mise en oeuvre de cette méthode, est donc l'ensemble du tractus respiratoire. La méthode de Nedrud et al comprend deux étapes majeures : une primo-immunisation par voie orale (intragastrique) et un rappel par voie nasale. De manière générale, on considère que la voie orale (intragastrique) n'est pas la voie optimale qui permettrait à un agent inducteur (ici le virus Sendai) d'atteindre un des sites inducteurs d'une réponse immunitaire au niveau du tractus respiratoire.
Il a maintenant été trouvé qu'une réponse immunitaire en un site mucosal quelconque et à l'encontre d'un antigène quelconque, pouvait être grandement favorisée en mettant en oeuvre un protocole d'immunisation associant plusieurs voies.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal effecteur, qui comprend au moins deux produits identiques ou différents contenant chacun un agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, pour une administration concomitante ou consécutive ; l'un des produits étant formulé de manière à être administré par voie naso-buccale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oro-pharynx ou des glandes salivaires, l'autre produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée.
De manière optionnelle, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un troisième produit, identique ou différent aux deux premiers, qui contient un agent inducteur de la réponse immunitaire, sélectionné parmi l'antigène et à condition que l'antigène soit de nature protéique. une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène et qui est formulé pour être administré par voie systémique. de préférence avant les deux premiers produits déjà cités.
En d'autres termes, l'invention a pour objet un kit pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire mucosale à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur, qui comprend : (i) de manière optionnelle, un premier agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et. à condition que l'antigène soit de nature protéique. une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène ; et (ii) un deuxième et un troisième agents inducteurs de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et. à condition que l'antigène soit de nature protéique. une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène ; avec (a) de manière optionnelle, des instructions pour l'administration par voie systémique. du premier agent inducteur,
(b) des instructions pour l'administration par voie naso-buccale du deuxième agent inducteur, (c) des instructions pour l'administration du troisième agent inducteur par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'antigène soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) de la réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée, et (d) des instructions pour l'administration concomitante ou consécutive des premier, deuxième et troisième agents inducteurs.
L'invention concerne également une méthode pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur mucosal, selon laquelle, dans un ordre quelconque :
(i) on administre de manière optionnelle au mammifère hôte, un premier agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, par voie systémique ;
(ii) on administre au mammifère hôte, un deuxième agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et. à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, par voie nasale et / ou buccale (nasobuccale) ; et
(iii) on administre au mammifère hôte, un troisième agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, par la voie mucosale appropriée autre que la voie nasale afin que l'antigène soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) de la réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée.
L'administration du premier agent inducteur peut être mise en oeuvre avantageusement en dose unique, par injection systémique, telle qu'une injection intra-veineuse, intra-musculaire, intra-dermique ou sous-cutanée. Le choix du site et de la voie d'injection dépendra notamment des ganglions lymphatiques que l'on souhaite cibler. On indique que si on veut par exemple cibler les ganglions coeliaques, il est préférable d'effectuer l'injection dans la région dorso-lombaire en utilisant la voie intramusculaire (plutôt que la voie sous-cutanée). De manière préférée, cet agent inducteur doit se trouver sous forme particulaire. L'agent inducteur est avantageusement complémenté par un adjuvant, soit par précipitation, soit par adsorption. L'adjuvant peut être n'importe quel adjuvant classique de type phosphate ou hydroxide d'aluminium, phosphate de calcium, ou encore un adjuvant tel que le polyphosphazène. Ce peut être aussi un adjuvant de type liposome, microsphère, ISCOM ou virus-like-particules (VLPs) ; ces derniers étant d'un usage particulièrement avantageux lorsque l'on veut cibler les ganglions qui draine la région uro-génitale. Tous ces adjuvants sont à la portée de l'homme de l'art. Le dosage approprié varie en fonction de certains paramètres, par exemple de l'individu traité ou de la nature de l'agent inducteur. A toutes fins utiles, on indique qu'une dose d'un antigène peut varier de 5 à 100 μg, de préférence de 25 à 50 μg.
Par "voie naso-buccale", on entend aux fins de la présente invention, la voie qui permet à un immunogène d'atteindre essentiellement l'anneau de Waldeyer ou son équivalent le NALT, chez des espèces autres que l'espèce humaine. On précise que la voie naso-buccale (ou buccale) ne doit pas être confondue avec ce qui est communément appelé "voie orale" et qui devrait être plus justement dénommée "voie intragastrique".
La voie orale, y compris la voie intragastrique, doit permettre à l'agent inducteur (antigène) d'atteindre majoritairement les muqueuses des parties basses (tube digestif et principalement l'intestin grêle et les plaques de Peyer). tandis que la voie buccale véhicule l'agent inducteur essentiellement vers les muqueuses des parties hautes. Le site d'entrée de la voie buccale et celui de la voie orale peuvent être les mêmes ; dans ce cas là il s'agit de la bouche. Néanmoins les trajectoires sont essentiellement différentes.
La même remarque s'applique lorsqu'il s'agit de la voie pulmonaire qui permet à l'agent inducteur d'atteindre les muqueuses des parties médianes (bronches).
En vue d'optimiser la réponse immunitaire que l'on recherche, la formulation de l'immunogène a aussi son importance. D'une manière générale, il a déjà été montré qu'un antigène particulaire était plus efficace dans l'induction d'une réponse immunitaire mucosale, qu'un antigène soluble. La voie qui sera suivie par l'agent inducteur au départ d'un site d'entrée identique dépend de plusieurs facteurs ; entre autres, de la nature et de la taille des particules sous lesquelles l'agent inducteur sera mis en forme, et de l'appareil, avantageusement spray ou aérosol, qui est utilisé pour propulser les particules, en particulier de sa forme, de son jet directionnel, et de la vitesse de propulsion.
Pour ce qui concerne la nature des particules, un grand choix est à la disposition de l'homme du métier ; ce choix, bien que non-limitatif se répartit avantageusement en deux groupes : les liposomes et les microsphères. Lés méthodes de préparation de ces particules sont conventionnelles et il est à la portée de' l'homme de l'art d'en sélectionner une selon ses besoins propres et de déterminer la taille des particules qui doit être appropriée pour que l'agent inducteur soit véhiculé selon la voie qui aura été retenue, et réparti de manière optimale au niveau de la muqueuse ciblée. Ainsi, on propose un diamètre particulaire inférieur à 10 μm, pour administration par voie nasale ou buccale ; pour administration par voie pulmonaire, un diamètre de 0,05 à 10 μm. de préférence de 0.05 à 5 μm, : pour administration par voie orale, un diamètre de 0.05 à 10 μm, de préférence de 0.05 à 5 μm. Les sites effecteurs principaux au niveau desquels une réponse immunitaire peut être recherchée sont l'appareil respiratoire (bronches, naso-pharynx. poumons), l'estomac, l'intestin et l'appareil uro-génital. Lorsqu'il s'agit de l'appareil respiratoire, le troisième agent inducteur sera avantageusement formulé pour être administré par voie pulmonaire (e.g. liposomes, microsphères, ... etc.). Lorsqu'il s'agit de l'estomac ou de l'intestin, le troisième agent inducteur sera avantageusement foπnulé pour être administré par voie orale, y compris la voie intragastrique (e.g. en présence d'une protection entérique, telle que liposomes, microsphères, bicarbonate ou capsule de gélatine). Lorsqu'il s'agit de l'intestin ou de l'appareil uro-génital, le troisième agent inducteur sera avantageusement formulé pour être administré par voie uro-génitale, par exemple sous forme de capsule vaginale ou par voie rectale, par exemple sous forme de suppositoire.
Le deuxième ou troisième agent inducteur peut être en outre complémenté par un adjuvant autre que les liposomes ou les microsphères, et dépourvu de toxicité autre que les sous-unités non-toxiques ou les formes détoxifiées des toxines bactériennes. Selon un mode de réalisation préféré, on utilise pour adjuvant du deuxième ou du troisième agent inducteur, le lipopolysaccharide majeur (MPLA : major lipopolysaccharide antigen) d'une bactérie, par exemple d'E. coli, de Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium ou Shigellaflexneri.
En effet, on a maintenant trouvé que ce type de composé avait de bonne propriétés adjuvantes lorsqu'il s'agissait d'immuniser par voie mucosale. C'est pourquoi un autre aspect de l'invention porte sur l'utilisation du MPLA à titre d'adjuvant mucosal pour la préparation d'une composition (i) contenant un antigène ou, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, (ii) destinée à l'induction d'une réponse immunitaire mucosale à l'encontre de l'antigène et (iii) destinée à être administrée par voie mucosale.
A titre indicatif, on mentionne que le deuxième ou troisième agent inducteur, lorsqu'il s'agit d'un antigène, peut être administré à raison de 100 μg à 1 mg la dose. Selon un mode préféré, le premier agent inducteur (voie systémique), quand administré, est administré en primo-injection en laissant courir un délai de 7 à 45 jours, de préférence de 20 à 30 jours avant le premier rappel (administration du deuxième ou du troisième agent inducteur). Selon un mode alternatif, le premier agent inducteur peut être aussi administré en même temps que le deuxième ou troisième agent inducteur.
Le deuxième et troisième agents inducteurs peuvent être administrés de manière concomitante ou consécutive. Lorsqu'administrés de manière étalée dans le temps, ils le sont avantageusement de 7 à 45 jours, de préférence à 28 jours d'intervalle.
Si nécessaire, on peut aussi envisager d'administrer le premier et le deuxième agents inducteurs simultanément (c'est-à-dire approximativement le même jour) et de répéter une fois cette opération à plusieurs jours d'intervalle. Le choix de chacun des trois agents inducteurs s'effectue de manière indépendante les uns des autres. Avantageusement au moins un des trois devra être l'antigène. Assez communément, ces trois agents inducteurs peuvent être les mêmes et dans ce cas là, il s'agira avantageusement de l'antigène. En alternative à un antigène de nature protéique, on peut aussi utiliser (i) soit un vecteur vaccinal e.g. type poxvirus ou adénovirus comportant un fragment d'ADN codant pour cet antigène et placé sous le contrôle d'un promoteur approprié, (ii) soit ce fragment d'ADN tel quel (non-vectorisé), mis sous forme plasmidique ou non (de préférence le fragment d'ADN sera inséré dans un plasmide plutôt que de rester en l'état de simple unité de transcription), présenté en formulation liposomale (anionique ou cationique) ou non, (iii) ou encore le fragment d'ARN correspondant. Ces opportunités ont déjà été décrites dans la littérature.
Afin de mettre en oeuvre l'une quelconque des différentes possibilités évoquées au paragraphe précédent, on utilise un promoteur capable d'induire dans des cellules de mammifères, l'expression du fragment d'ADN codant pour l'antigène. Pour ce que l'on appelle communément les vaccins à base d'ADN (pour se différentier des vaccins à base de vecteurs viraux), le promoteur précoce du cytomégalovirus humain (hCMV) est un promoteur de choix. Pour ce type de vaccination, on utilisera de préférence, un plasmide incapable de se répliquer chez les mammifères. Un tel plasmide se doit aussi d'être essentiellement non-intégratif.
Selon un mode de réalisation préféré, l'antigène d'une bactérie pathogène pour le mammifère-hôte est un antigène d'H. pylori, par exemple la forme apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori ou l'une des sous-unités ureA ou ureB de cette même uréase.
De manière à la fois plus générale en ce qui concerne la méthode d'mmunisation et plus ciblée en ce qui concerne l'antigène, on précise que l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un fragment d'ADN codant pour un antigène d'H. pylori. dans la fabrication d'une composition destinée à prévenir ou traiter une infection à H. pylori et destinée à être administrée par voie nasale ou naso-buccale. A cette fin, le fragment d'ADN utilisé à titre d'agent vaccinal, répond aux critères énoncés ci-dessus. II a été aussi trouvé que pour induire une réponse immunitaire mucosale à l'encontre d'un organisme pathogène infectant l'estomac ou l'intestin, il ne serait pas indispensable d'administrer un immunogène au niveau de l'un de ces sites, mais qu'il pourrait suffire de l'administrer par la voie haute c'est-à-dire par voie naso-buccale, éventuellement en y associant une voie systémique. C'est pourquoi, sous un autre aspect, l'invention concerne une composition destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau de l'estomac ou de l'intestin, qui comprend un agent inducteur de la réponse immunitaire, sélectionné parmi l'antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, l'agent inducteur étant formulé de manière à être administré par la voie naso-buccale.
Sous ce même aspect, l'invention porte également sur l'utilisation d'un produit sélectionné parmi un antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, pour la préparation d'une composition destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre du produit, au niveau de l'estomac ou de l'intestin, et destinée à être administrée par la voie naso- buccale.
Une telle composition, lorsqu'elle comprend un antigène d'un organisme pathogène infectant la muqueuse stomacale ou intestinale, est notamment utile en ce qu'elle protège le mammifère hôte contre l'infection en question, notamment en offrant une protection de longue durée, en mettant en jeu des lymphocytes T et B à mémoire. Il peut s'agir des infections à H. pylori, à V. cholerae, à Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enteritis, Clostridium difficile. Yersinia enlerocolilica, E. coli entéroxigènes et entéropathogènes. Pour ce qui concerne l'antigène, ce dernier peut être l'agent pathogène lui-même sous forme tuée, lysée ou atténuée, ou bien des composants antigéniques de ce pathogène, tel qu'un polysaccharide capsulaire, ou des antigènes de membrane, sous forme purifiée, ou un polypeptide caractéristique de ce pathogène, soit directement purifié à partir du pathogène, soit obtenu par les techniques de l'ADN recombinant.
Par exemple, lorsqu'il s'agit d'une composition destinée à prévenir les infections à H. pylori, un antigène de choix peut être l'apoenzyme de l'uréase, composée des sous-unités A et B dont les fragments d'ADN correspondants sont décrits dans e.g.
Labigne et al, J. Bact. (1991) 173 (6) : 1920, ou bien l'une des sous-unités de l'apoenzyme, ou bien la cytotoxine (WO93/18150) ou bien encore des protéines de la famille des adhésines (protéines capables de se lier aux récepteurs des cellules hôte et se faisant, capables de médier l'accrochage du pathogène aux cellules hôte et d'initier le processus infectieux) ou des protéines régulées par le fer. Dans le cas d'un vaccin anti-choléra, un antigène de choix peut être la sous- unité B de la toxine cholérique, comme déjà décrit dans la littérature.
L'invention est illustrée ci après par référence aux figures 1 à 5. La Figure 1 présente l'analyse par Elispot de la réponse immunitaire induite par administration de sous-unité B de la toxine cholérique (CTB), dans les glandes salivaires (1A) et dans l'estomac (1B). Les résultats concernent trois protocoles d'immunisation : sous-cutanée / orale (Se O) ; sous-cutanée / nasale (Se N) ; et sous- cutanée / orale + nasale (Se O + N). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse IgA. Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a. La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris : le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 9. La Figure 2 présente l'analyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glandes salivaires (2A) et dans l'estomac (2B) par administration selon le protocole sous-cutanée / sous-cutanée + orale + nasale (Se / Se + O + N). de la CTB. Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse IgA. Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a. La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 8,2.
La Figure 3 présente l'analyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glandes salivaires (3A) et dans l'estomac (3B). par administration de l'uréase Jack Bean selon le protocole sous-cutanée (alum) / orale + nasale (liposome). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse IgA. Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a. La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 620. La Figure 4 présente l'analyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glandes salivaires (4A) et dans l'estomac (4B) par administration de l'uréase Jack Bean selon le protocole sous-cutanée (liposomes) / orale + nasale (liposomes). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse IgA. Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a. La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 15. La Figure 5 présente le plasmide pTG8665, utilisé pour produire l'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori.
La Figure 6 présente le plasmide pCMC/Ela dans lequel le fragment HmDIII (1 ) - Sαcll (754) contient le promoteur hCMV, le fragment Xhol (771 ) - Smal (2104) contient l'ORF E 1 a, et le fragment Smal (2104) - EcoRl (2810) contient l'extrémité 3' BGΗ et le fragment EcoRI (2810) - HinDIII (1 ) correspond au squelette pUC19.
La Figure 7 présente le plasmide pCB-1 1. La Figure 8 présente le plasmide pCB-ureB dans lequel l'ORF ureB va du nucléotide 777 au nucléotide 2487.
La figure 9 indique sous forme de diagramme, les titres en anticorps anti-uréase relevés chez des souris Balb/c immunisées avec le plasmide pCB-ureB. Les courbes en plein présente les titres en IgG et les courbes en pointillés, les titres en IgA.■ correspond à une immunisation par voie intranasale répétée trois fois (J0, 21 et 42 ; plasmide seul ou plasmide + liposomes). ♦ correspond à une primo-immunisation par voie intramusculaire (plasmide seul), suivie par deux rappels à J21 et 42 par voie intranasale (plasmide + liposomes).• correspond à une primo-immunisation par voie intradermique (plasmide seul), suivie par deux rappels à J21 et 42 par voie intranasale (plasmide + liposomes).
La Figure 10 présente sous forme de diagramme, la densité optique du milieu stomacal des souris, après immunisation éventuelle avec l'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori et épreuve. Première colonne : souris non-infectées : deuxième colonne : souris ayant reçues des liposomes vides, par primo-immunization sous-cutanée suivie de deux rappels par voies (nasale + intragastrique) ; troisième colonne : souris ayant reçues des liposomes avec urease, par primo-immunization sous-cutanée suivie de deux rappels par voies (nasale + intragastrique) ; quatrième colonne : souris ayant reçues des liposomes avec urease, par administration répétée trois fois par voies (nasale + intragastrique). Dans tous les cas, il s'agit de liposomes DC-Chol.
Exemple 1 : Induction d'une réponse immunitaire mucosale à l'encontre de la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB)
1.A. Préparation des compositions immunisantes 1.A. a) Pour administration par voie sous-cutanée
1 μl d'une préparation de CTB purifiée et concentrée à 10 mg/ml (soit 10 μg de CTB) est mélangée à 100 μl d'une préparation d'hydroxyde d'aluminium à 1 % . On dilue en tampon PBS pour obtenir un volume final de 500 μl. Ceci constitue une dose individuelle.
1.A. b) Pour administration par voie orale (intragastrique)
Un volume de billes de latex de 3 μM (Polysciences cat 17 34) est prélevé puis lavé 3 fois en tampon PBS (centrifugation 1.000 trs/min. pendant trois minutes). Les billes sont ensuite mélangées à une préparation de CTB purifiée et concentrée à 10 mg/ml afin d'obtenir une préparation dans laquelle la CTB est diluée au 1/20 (soit à une concentration finale de 0.5 mg/ml). Cette préparation est placée pendant 2 hrs sous agitation.
La préparation est ensuite diluée au 1/25 avec du tampon carbonate 200 μM. 1.A. c) Pour administration par voie nasale
Une préparation de CTB coatée sur billes de latex est obtenue comme décrit dans la section 1.A. b) à l'exception de la dilution finale en tampon carbonate.
La préparation est ensuite diluée en tampon PBS selon les besoins.
1.1. d) Pour administration par voie orale + nasale L'administration est réalisée par la conjonction des administrations orale et nasale telles que décrites en 1.A. b) et 1.A. c). 1.B. Protocole d'immunisation
Trois protocoles d'immunisation sont comparés. Il s'agit de : 1 ) sous-cutanée / orale (intragastrique)
2) sous-cutanée / nasale
3) sous-cutanée / orale (intragastrique) + nasale
Des souris balbC reçoivent par voie sous-cutanée, 10 μg de CTB adjuvé par de l'alum comme décrit dans la section 1.A. a), sous un volume de 500 μl.
Des souris constituées en lot témoin reçoivent en sous-cutanée 500 μl de PBS. 28 jours après l'injection sous-cutanée, les souris de l'essai sont réparties en 3 groupes.
Les souris du premier groupe reçoivent en intragastrique, par l'intermédiaire d'une canule couplée à une seringue de 1 ml, 10 μg de CTB coatés sur billes de latex comme décrit dans la section 1.A. b) sous un volume de 500 μl. Des souris issues du lot témoin reçoivent 500 μl de tampon carbonate, par la même voie.
Les souris du deuxième groupe reçoivent par voie nasale 10 μg de CTB coatés sur billes de latex comme décrit dans la section 1.A. c) sous un volume de 20 μl. Ces 20 μl sont déposés goutte à goutte sur les narines. Des souris issues du lot témoin reçoivent 20 μl de PBS. par la même voie.
Les souris du troisième groupe reçoivent simultanément 10 μg de CTB par voie orale (intragastrique) et 10 μg de CTB par voie nasale. La préparation de CTB coatée sur billes de latex est obtenue comme décrit dans la section 1.A. d). Des souris sont constituées en témoins.
15 jours après le rappel, l'estomac et les glandes salivaires des souris sont prélevés ; les cellules sont extraites selon le protocole décrit dans Mega et al, J. of Immunology (1992) 148 : 2030 et la réponse IgA est analysée en Elispot selon la méthode décrite dans Czerkinsky et al, In Theoretical and Technical aspects of ELIS A and other Solid Phase Immuno Assays (DM. Kenneny ans S. J. Chalacombe Eds) : 217-239. John Willy & Sons, Chichester, NY
Les résultats sont présentés dans la Figure 1 et commentés comme suit :
Le protocole sous-cutané / orale (intragastrique) se révèle incapable d'induire une réponse immunitaire mucosale importante tandis qu'une telle réponse est observée dans le cas des protocoles sous-cutanée / nasale et sous- cutanée / orale (intragastrique) + nasale.
Ce dernier protocole se révèle être le meilleur dans la mesure où une bonne réponse locale représentée par les IgA, est obtenue tant dans les glandes salivaires que dans l'estomac. 1.C. Protocole d'immunisation supplémentaire
Des souris ayant reçu une injection sous-cutanée de CTB comme décrit dans la section 1.B., reçoivent 28 jours après, en simultané : - 40 μg de CTB telle que préparée dans la section 1 .A. d) par voie orale
(intragastrique), sous un volume de 500 μl. - 10 μg de CTB telle que préparée dans la section 1.A. d), par voie nasale, sous un volume de 20 μl. - 10 μg de CTB telle que préparée dans la section 1.A. a), par voie sous- cutanée, sous un volume de 300 μl.
15 jours après le rappel, l'estomac et les glandes salivaires des souris sont prélevés ; les cellules sont extraites et la réponse IgA est analysée en Elispot.
Les résultats sont présentes dans la Figure 2. On obtient une bonne réponse immunitaire de type IgA (5/5 souris répondent), marqueur d'une réponse immunitaire locale au niveau des muqueuses. Exemple 2 : Induction d'une réponse immunitaire mucosale à l'encontre de l'uréase Jack Bean.
2. A. Préparation des compositions immunisantes 2. A. a) urease adjuvée en alum.
5 μl d'une préparation urease Jack Bean (Boehringer ; réf. 737 348) concentré à 4 mg/ml en tampon PBS sont mélangés à 100 μl d'une préparation d'hydroxyde d'aluminium à 1 %. On dilue en tampon PBS pour obtenir un volume final de 500 μl contenant 20 μg urease. Ceci constitue une dose individuelle.
2.A. b) urease en liposomes Trois techniques sont utilisées comme suit :
1. Injection d'éthanol
16,4 mg d'un mélange lipidique composé de Cholestérol (Sigma), de Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) et de sel de sodium du Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires de 5:4: 1 sont dissous dans 50 μl d'éthanol absolu. La solution est injectée par l'intermédiaire d'une seringue Hamilton dans 2 ml d'une solution aqueuse contenant 4 mg/ml d'uréase Jack Bean, éventuellement tamponnée par du tampon PBS dilué au 1/10. La préparation est maintenue à 45 ° C, sous agitation.
Au contact de l'eau les lipides s'organisent spontanément sous forme de liposomes (majoritairement unilamellaires de taille moyenne 50-100 nm) en piégeant un certain volume de la solution d'uréase.
Ces liposomes sont purifiés (isolés de l'excès d'uréase libre) par gel filtration sur une colonne de Sepharose CL-4B (Pharmacia). Le taux d'encapsulation de l'uréase mesuré à l'aide d'uréase marquée à l'iode 125 (technique Enzymobeads™, Biorad). varie de 3 à 6 %. Si nécessaire, la suspension liposomale est concentrée par ultrafiltration dans une cellule Novacell™ (Filtron) possédant une limite d'exclusion de 10 kD. 2. Extrusion 16,4 mg d'un mélange lipidique composé de Cholestérol (Sigma), de
Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) et de sel de sodium du Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires de 5:4: 1 sont dissous dans 4 ml de chloroforme dans un ballon Pyrex de 25 ml. La solution est évaporée (Rotavapor Buchi) pour former un fin film lipidique sur les parois du ballon. Le film lipidique est séché sous vide poussé pendant 2 heures, puis repris avec 2 ml d'eau contenant 8 mg d'uréase de Jack Bean. Après 4 heures d'agitation à 45 ° C la suspension est extrudée (Extruder™, Lipex Biomembranes Inc., Vancouver) 5 fois à travers 2 membranes superposées en polycarbonate de porosité 400 nm (Nucléopore™, Costar) pour former une population homogène de liposomes majoritairement unilamellaires d'environ 400 nm de diamètre et contenant l'uréase. Ces liposomes sont purifiés (isolés de l'excès d'uréase libre) par gel filtration sur une colonne de Sepharose CL- 4B, Pharmacia). Le taux d'encapsulation de l'uréase, mesuré à l'aide d'uréase marquée à l'iode 125 (technique de marquage Enzymobeads™,
Biorad), varie de 5 à 10 %. Si nécessaire, la suspension liposomale est concentrée par ultrafiltration dans une cellule Novacell™ (Filtron) possédant une limite d'exclusion de 10 kD. 3. Méthode microfluidiseur
82 mg d'un mélange lipidique composé de Cholestérol, de Dipalmitoylphosphatidylcholine et de sel de sodium du Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires de 5:4: 1 , obtenu par lyophilisation d'une solution éthanolique (D3F - France) sont repris avec 10 ml de tampon Hepes 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7, 4 contenant 3,6 mg/ml de la forme apoenzymatique recombinante de l'uréase de H. pylori. Après 4 heures d'agitations à 45 °C, la suspension est micorfluidisée par 5 passages à 500 kPa dans un microfluidiseur M1 10S (Microfluidics Co.) pour former une population homogène de liposomes majoritairement unilamellaire d'environ 100 nm de diamètre et contenant l'uréase. Ces liposomes sont purifiés par gel filtration (Colonne de Sépharose CL-4B, Pharmacia). Le taux d'encapsulation de l'uréase, mesuré par dosage de protéine à l'aide du kit Micro BCA (Pierce) est de 14,5 %. Si nécessaire, la suspension liposomale est concentrée par ultrafiltration dans une cellule Novacell (Filtron) possédant une limite d'exclusion de 10 kD.
2.A. c) urease en liposomes, adjuvé par du MPLA
Lorsque l'on prépare des liposomes, du MPLA (Extrait d'E. coli ; Sigma) peut être ajouté au mélange lipidique, dans la proportion de 1.2 ou 5 % par rapport à la masse de lipide.
2.B. Protocole d'immunisation Deux protocoles d'immunisation sont testés. Il s'agit de :
1 ) sous-cutanée (alum) / [orale (intragastrique) + nasale] (liposomes)
2) sous-cutanée (liposomes) / [orale (intragastrique) + nasale] (liposomes)
Des souris OF 1 reçoivent par voie sous-cutanée : - soit 20 μg urease adjuvée par de l'alum comme décrit dans la section 2. A. a) sous une volume final de 500 μl, - soit 20 μg urease en préparation liposomale telle que obtenue dans la section 2. A. b) sous un volume de 500 μl. 28 jours après l'injection sous-cutanée, les souris reçoivent en simultané : - par voie orale, (intragastrique), 20 μg urease en préparation liposomale telle que obtenue dans la section 2. A. b), sous un volume de 500 μl ; et - par voie nasale, 20 μg urease en préparation liposomale telle que obtenue dans la section 2. A. b), sous un volume de 50 μl.
15 jours après le rappel, l'estomac et les glandes salivaires des souris sont prélevés ; les cellules sont extraites selon le protocole décrit dans le préambule aux exemples et la réponse IgA est analysée en Elispot selon la méthode décrite dans le préambule.
Les résultats sont présentés dans les Figures 3 et 4. La Figure 3 montre que, dans le cas du protocole sous-cutanée (alum) / [orale (intragastrique) + nasale] (liposomes), la réponse IgA dans les glandes salivaires (3a), bien que faible, est majoritaire, tandis que pour ce qui est de l'estomac (3b). 3 souris sur
5 répondent à l'immunisation avec un nombre élevé de spots.
La Figure 4 montre que, dans le cas du protocole sous-cutanée
(liposomes) / [orale + nasale] (liposomes), la réponse est très bonne dans les glandes salivaires (4a) tandis qu'elle est faible dans l'estomac (4b). Ceci suggère qu'outre le protocole utilisé, la formulation de l'antigène à son importance.
Exemple 3 : Kit de vaccination contre les infections à H. pylori
Dans un kit, sont réunies trois préparations contenant l'apoenzyme de urease d' H. pylori. formulées chacune de manière différente, selon le mode d'administration
3. A. Préparation de l'apoenzyme
A partir d'un des plasmides décrits dans Labigne et al (supra) (pILL914), on génère par PCR, à l'aide des amorces OTG5973 et OTG5974. un fragment codant pour la partie N-terminale d'UreA (jusqu'au site Hindlll interne) et contenant un site BspHl au niveau du codon d'initiation de la traduction de
UreA.
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Le fragment généré par PCR est digéré par BspHl et Hindlll et inséré simultanément avec le fragment Hindlll de 2.35 kb de pILL914 porteur de la partie 3' de wreA et de ureB, dans le vecteur pTG3704 digéré par Ncol et Hindlll, pour donner le plasmide pTG8665 tel que montré dans la Figure 5. Ce plasmide porte les gènes ureA et ureB fusionnés au promoteur araB. Le vecteur pTG3704 est décrit dans la demande de brevet européen EPA 584 266 publiée le 9 Mars 1994. Ce vecteur dérive du plasmide parai 3 (Cagnon et al, Prot. Eng. (1991) 4 : 843), par destruction du site Sphl par traitement à la polymérase Klenow.
On transforme la souche d'E. coli Xac-I (Νormandy et al, PΝAS (1986)
83 : 6548) par le plasmide pTG8665. La souche transformée est mise en culture en milieu LB complémenté à 100μg/ml d'ampicilline. En phase exponentielle de croissance, on ajoute 0.2 % d'arabinose en vue d'induire l'expression de ure A et ureB. Après différents temps d'induction (1 à 3 hrs). le niveau de production de UreA et UreB est très élevé (environ 10 % des protéines totales) et on prélève alors les cellules.
220 g de cellules sont récupérées par centrifugation à partir de 2.5 1 de cultures.
Ces cellules sont reprises dans environ 1 litre de tampon phosphate de sodium 20 mM pH 7.5 contenant 175 mg de PMSF ( 1 mM). Puis on ajoute à la suspension cellulaire 4 μl une solution de benzonase à 250 U/μl (Merck ; réf. 1654), soit 1 unité/ml final, ainsi que 1 ml d'une solution de MgCl2 1 M. On laisse agir pendant 30 min.
La suspension est ensuite introduite dans un appareil Rannie (homogénéisateur haute-pression) et soumise à une pression de 1.000 bars pendant 1 h. afin de casser les cellules. Deux méthodes de purification peuvent être ensuite alternativement choisies.
3.A. a) Première méthode Le cassage des cellules est suivi par densité optique. Lorsque la D.O. est de l'ordre de 2,5 - 2, la suspension est retirée de l'appareil, et supplémentée avec 1 ml d'une solution d'EDTA 0,5 M. On centrifuge pendant 2 hrs à 10.000 rpm, puis on récupère le surnageant qui est centrifugé à 100 000 x g pendant 1 heure afin d'éliminer les membranes.
La purification est réalisée selon un protocole voisin de celui décrit par Hu et al, Infect. Immun. (1992) 60 : 2657. Le surnageant contenant les protéines solubles est ajusté à pH 6,8 puis chargé avec un débit de 4ml/min sur une colonne d'échange d'anions (DEAE-Sepharose Pharmacia) de volume 5cm x 25 cm, équilibrée avec le tampon KPO4 20 mM pH 6,8 contenant du PMSF 1mM (tampon PO). La colonne est éluée par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de KCl. Des fractions de 14 ml sont recueillies et analysées par SDS PAGE. Les fractions contenant l'uréase sous la forme la plus pure sont rassemblées.
On ajoute à la fraction ainsi obtenue du KCl afin que la concentration finale en KCl soit égal à 1M, la solution est chargée sur une colonne de Phényl-Sépharose (Pharmacia). La colonne est éluée par un gradient de KCl de 1 M à 0 M. Comme précédemment les fractions sont recueillies et analysées par SDS PAGE. Les fractions contenant l'uréase sous la forme la plus pure sont rassemblées et dialysées contre un tampon KPO4 20mM pH 7,5.
La fraction obtenue est chargée sur une colonne d'échange d'anions (Q- Sépharose Fast Flow; Pharmacia) équilibrée avec le tampon KPO4 20mM pH 7,5; comme précédemment la colonne est éluée par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de KCl et les fractions sont recueillies et analysées par SDS PAGE. Les fractions contenant l'uréase sont rassemblées, concentrées par diafiltration sur une membrane dont le seuil de coupure est de 100 kDa et la fraction est déposée sur une colonne de gel filtration (Sephacryl 400
HR) équilibrée dans le tampon NaPO4 20mM pH 7,5, après analyse par SDS PAGE des différentes fractions, celles contenant l'uréase sont recueillies, concentrées par diafiltration sur une membrane dont le seuil de coupure est de 100 kDa et la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 μm. Une solution de saccharose stérile est ajoutée à la solution d'uréase pour obtenir une concentration finale de 2%. La solution est ensuite lyophilisée et est conservée sous cette forme dans l'attente des étapes ultérieures. 3.A. b) Deuxième méthode
Ce surnageant est ajusté à pH 7,5 puis chargé à un débit de 4 ml/min. sur une colonne d'échange d'anion (Q - Sépharose fast flow ; Pharmacia ; réf. 17-0510-01 ) de volume 5 cm x 25 cm, équilibrée avec un tampon d'équilibre KPO4 20 mM pH 7,5 contenant du PMSF 1 mM. La colonne est éluée par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de KCl dans le tampon d'équilibre (vol. du gradient : 2.25 1 ; débit : 4 ml/min).
On recueille des fractions de 14 ml que l'on analyse par SDS-PAGE. Les fractions les plus propres sont collectées et assemblées (en général il s'agit des fractions 82 à 121 à partir du début du gradient).
Le pool Q - Sépharose est chargé à un débit de 2 ml/min, sur une colonne de chelate de zinc (Chelating - Sépharose fast flow ; Pharmacia : réf. 17- 0575-02) de volume 2.6 cm x 1 1 cm, auparavant préparée comme suit.
La colonne est chargée en métal avec 2 volumes d'une solution de ZnCl2 0,2 M, puis rincée avec 3 volumes de NaCl à 0,5 M et ensuite avec 3 volumes d'un tampon d'équilibrage Tris-HCl 50 mM pH 8, contenant du NaCl 0,5 M, de l'imidazole 1 mM et du PMSF 1 mM. La colonne est lavée par 1 volume du tampon d'équilibrage à 10 mM d'imidazole puis rincée par 3 volumes du tampon d'équilibre à 1 mM d'imidazole.
Une fois la charge effectuée, on lave la colonne avec le tampon d'équilibrage jusqu'au retour à la ligne de base (lavage mis en oeuvre pendant la nuit à 0,2 ml/min). La colonne est ensuite lavée par 200 ml de tampon d'équilibrage à 7,5 mM d'imidazole à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min.
L'élution a lieu en gradient linéaire de 7,5 mM à 30 mM d'imidazole dans le tampon d'équilibrage (volume du gradient : 250 ml ; débit 1 ml/min).
On recueille des fractions de 10 ml que l'on analyse par SDS-PAGE. Les fractions contenant l'uréase pure sont collectées et assemblées (en général, il s'agit des fractions 19 à 30 à partir du début du gradient). Le pool chelating-Sepharose est ensuite concentré par ultrafiltration sur membrane Amicon YM100, jusqu'à 25 ml.
Ce concentré est ensuite chargé sur une colonne de Sephacryl S-300 (Pharmacia ; réf. 17-0599-01) de volume 2,6 cm x 96 cm équilibrée en tampon KPO4 20 mM, NaCl 0, 15 M, pH 7,5.
La chromatographie s'effectue à un débit de 0,5 ml/min. On récupère des fractions de 10 ml que l'on analyse par SDS-PAGE. Les fractions contenant l'uréase pure sont assemblées (en général, il s'agit des fractions 21 à 27 à partir de la fin de la charge) et concentrées jusqu'à environ 2,5 mg/ml par ultrafiltration sur membrane Amicon YM 100. La préparation de l'apoenzyme est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 μm et est conservée congelée à -20 °C ou lyophilisée en présence de sucrose par exemple.
Les préparations du kit sont les suivantes :
3.B. Apoenzyme adjuvée en alum pour administration par voie sous- cutanée
Une dose pour injection est préparée en adsorbant 20 μl de la solution d'apoenzyme obtenue en 3. A. (soit 50 μg) avec 250 μl d'une préparation d'hydroxide d'aluminium (alhydrogel ; Superfos) à 1 mg/ml, après une adsorp tion de 2 hrs à +4 °C, le volume final est ajusté à 500 μl par l'addition de PBS. 3.C. Apoenzyme en liposomes, pour administration par voie naso-buccale, en aérosol
La forme apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori est encapsulée dans des liposomes. Ces liposomes présentent un diamètre moyen de 100 nm et une teneur en protéine de 60 μg/mg de lipide.
On administre par voie naso-buccale une quantité totale de 0,1 mg d'uréase formulée. On utilise un aérosol à deux embouts (nez et bouche) de type commercialisé par la société VALOIS (Le Prieuré, BPG, 271 10 Le Neubourg). Des pompes permettent de délivrer un volume fini dépendant du type de pompe, un embout de taille variable s'adaptant sur le récipient muni de sa pompe (300 μl maximum par administration, cette dose pouvant être répétée dans des délais choisis). 3.D. Apoenzyme en liposomes pour administration intragastrique
On administre une quantité totale de 0,5 mg d'uréase formulée par voie intragastrique. L'apoenzyme est préparée selon la méthode décrite dans le paragraphe 3.C., puis lyophilisée et reprise par 20 ml d'une solution de bicarbonate à 200 mM.
3.E. Protocole d'immunisation
Un adulte reçoit en sous-cutanée, la dose préparée en 3.B. 28 jours après la primo-injection, il reçoit par voie naso-buccale, la dose préparée en 3.C. et ingère le même jour, la dose préparée en 3.D.
Exemple 4 : Kits de vaccination contre les infections à H. pylori (ADN codant pour la sous-unité ureB de l'uréase, utilisé à titre d'agent vaccinal)
4. A. Construction des vecteurs plasmidiques
Le vecteur d'expression eucaryote pCB-1 1 est construit à partir des trois éléments suivants : - Le plasmide pUC19 (disponible dans le commerce) préalablement digéré par Xbal et EcoRI ; - Un fragment Spel-Sacll isolé du plasmide pCMV-Ela (Figure 6), qui comporte le promoteur précoce du cytomegalovirus humain (hCMV) tel que décrit dans e.g. USP 5 168 062 ; et - Un fragment SαcII-EcoRI comportant la partie 3' du gène de l'hormone de croissance bovine incluant le signal de polyadenylation de l'ARNm ainsi que les séquences de stabilisation de l'ARNm. Ce fragment Sacll-EcoRl est obtenu à partir du plasmide pBS-BGH construit par insertion d'un fragment BamHl- EcoRl issu du plasmide pCMV-Ela, dans le plasmide Bluescript (disponible dans le commerce). Ces trois fragments sont ligués ensemble pour former le plasmide pCB-
1 1 (Figure 7).
Le gène ureB est amplifié par PCR à partir du plasmide pILL914 et à l'aide des amorces suivantes.
amorce amont : 5' cgtctcgagccaccatgaaaaagattagcagaaaag
amorce aval : 5' atcgtcccgggcaggcctcttagaaaatgctaaagagttgcgccaagct. L'amorce amont permet d'introduire le site de restriction Xhol et la séquence Kozak en amont du cadre de lecture ouvert (ORF) de ureB. tandis que l'amorce avale permet d'introduire le site Smal en aval de l'ORF. Le fragment généré par PCR est digéré puis inséré dans le plasmide pCB-1 1. préalablement digéré par Xhol et Smal, pour générer le plasmide pCB-ureB (Figure 8).
E. coli XL1 est transformé par ce plasmide puis mis en culture selon des techniques conventionnelles. Le plasmide ainsi amplifié est récolté de manière usuelle par lyse alcaline suivie d'un gradient isopicnique en chlorure de césium.
L'ADN est repris soit en eau distillée, soit en eau physiologique (NaCl 9%º).
4.B. Préparation d'une composition liposome/ADN On fabrique du bromure de O,O',O"-tridodécanoyl-N-(ω triméthylammo- niododécanoyI)-tris-(hydroxyméthyl)aminoéthnae (communément appelé TC 1 - 12) selon la méthode décrite par Kunitake et al, J. Am. Chem. Soc. (1984) 106
: 1978. Puis on dissout 10mg de ce produit dans 50μl d'éthanol. Cette préparation est ensuite injectée rapidement à l'aide d'une seringue Hamilton dans 2ml d'eau désionisée sous agitation à 42°C. Des liposomes d'environ 50nm de diamètre se forment spontanément au cours de la dissolution de l'éthanol dans l'eau. On obtient ainsi une préparation liposomale contenant 5.2mM de TC1-12.
100μl de la préparation obtenue précédemment sont dilués par addition de 150μl d'eau distillée. Puis on ajoute 250μl d'une préparation aqueuse du plasmide pCB-ureB à 2μg/μl. Le rapport de charge (TC1-12/nucléotide) est de l'ordre de 0,35.
4.C. Protocoles d'immunisation
Des souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines sont préalablement anesthésiées par injection d'un mélange xylazine + ketamine. Elles reçoivent 3 administrations de 50μg de pCB-ureB, à 3 semaines d'intervalle. Dans les différents protocoles d'immunisation, on utilise la voie intranasale (IN), la voie intramusculaire (IM) et la voie intradermique (ID).
Lors d'une administration par voie intranasale, 50μl d'une solution d'ADN à 100μg/ml en eau physiologique ou en mélange liposome/ ADN tel que obtenu en 4.B. sont déposés gouttes à gouttes dans les narines.
Lors d'une administration par voie intramusculaire, 50μl d'une solution d'ADN à 100μg/ml en eau physiologique sont injectés dans les quadriceps à l'aide d'une seringue Hamilton équipée d'une aiguille de gauge 29.
Lors d'une administration par voie intradermique. 100μl d'une solution d'ADN à 500μg/ml sont injectés en 5 sites dans la peau du dos rasée au préalable, à l'aide d'un injecteur à jet pneumatique (Mesoflash™ 10). Les différents protocoles d'immunisation sont comme suit :
Figure imgf000035_0001
Aux jours 14, 35 et 56, on prélève des échantillons de sérum chez chacune des souris. La production d'anticorps anti-uréase est recherchée par ELISA (on utilise un extrait soluble purifié d'H. pylori).
Les résultats présentés en résumé dans la Figure 9 montrent que les différents protocoles d'immunisation permettent d'induire une forte réponse IgG et une moindre réponse IgA.
Exemple 5 : Induction d'une réponse immunitaire mucosale à l'encontre de l'uréase d'H. pylori.
S.A. Préparation de la composition immunisante
A 20ml de chloroforme, on ajoute 0.8g de DC-Chol et 2,4g de dioleoylphosphatidycholine (DOPC). dans un ballon de 1 litre. Ce mélange est évaporé sous vide de manière à former un film lipidique sur les parois du ballon. Ce film est ensuite séché sous vide poussé pendant la nuit.
Le film est ensuite repris par 400ml d'une solution d'apoenzyme à 1.5mg/ml (préparée comme décrit dans l'Exemple 3. A.) dans du tampon Ηepes 20mM pΗ6.2. On laisse 6 heures à température ambiante sous agitation.
La suspension de vésicules multilamellaires qui en résulte, est ensuite microfluidisée par 10 passages à 500kPa dans un microfluidiseur M 1 10S S (Microfiuidics Co.) pour former une population homogène de liposomes majoritairement unilamellaires d'environ 100nn de diamètre et contenant l'apoenzyme. Ces liposomes sont filtrés à travers un filtre Sténivex-HV (0,45 μ, Millipore) puis lyophilisés après addition de 20g de sucrose.
La taille des liposomes mesurée par light scattering (Zetamaster, Malvern Instruments) est de 148 ± 52nm. Le taux d'encapsidation de l'apoenzyme est de l'ordre de 20% ; le restant de la quantité totale étant sous forme libre (non- encapsidée).
5.B. Protocoles d'immunisation
Des souris Swiss âgées de 6 à 8 semaines sont réparties dans 4 groupes (10 souris/groupe) et reçoivent à J0, J28 et J56 par différentes voies, une dose de la préparation obtenue ci-avant. Deux protocoles d'immunisation sont testés. Il s'agit de :
1) Sous-cutanée/intragastrique + nasale/intragastrique + nasale ; et
2) Intragastrique + nasale, répété 3 fois.
Les doses sont comme suit : Pour administration par voie nasale, une quantité de lyophilisât correspondant à 10μg d'apoenzyme totale (encapsidée + non-encapsidée) est reprise extemporanéement par 30μl d'eau physiologique (NaO 9°/°°). La dose est déposée goutte à goutte sur les narines. Pour administration par voie sous-cutanée, la même dose de lyophilisât est reprise par 300 μl de saline. Pour administration par voie intragastrique. une quantité de lyophilisât correspondant à 40μg d'apoenzyme totale (encapsidée + non- encapsidée) est reprise par 300μl de saline complémentée par 0.2 M NaHCO3. La dose est administrée à l'aide d'une canule couplée à une seringue de 1 ml.
15 jours après la dernière administration, les souris sont éprouvées par gavage intragastrique avec 108 germes d'une souche d'H. pylori adaptée à la souris. Un mois après épreuve, les estomacs sont prélevés et un test d'activité urease (Jatrox ND) est effectué sur 1/4 de l'estomac. 4 heures après prélèvement, la densité optique du milieu est mesurée à 550nm. Les résultats sont présentés dans la Figure 10. Ces résultats montrent que même si une protection complète n'est pas obtenue aux doses de DC-Chol utilisées, une réduction significative de l'activité urease, donc de l'infection, est observée par rapport aux contrôles positifs (souris ayant reçu des liposomes vides). Ces résultats démontrent aussi l'intérêt d'une primo-immunisation par voie parentérale ciblée dans la région dorso-lombaire (sous-cutanée ; la voie intramusculaire aurait pu être utilisée de même et aurait avantageusement permis de cibler plus spécifiquement les ganglions coeliaques).
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001

Claims

Revendications
1. Une composition pharmaceutique destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal effecteur, qui comprend, pour une administration concomitante ou consécutive : (i) de manière optionnelle, un premier produit et, (ii) au moins un deuxième et un troisième produit ; ces trois produits identiques ou différents, contenant chacun un agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène ; le premier produit étant formulé de manière à être administré par voie systémique, le deuxième produit étant formulé de manière à être administré par voie naso-buccale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oro- pharynx ou des glandes salivaires, et le troisième produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée.
2. Une composition selon la revendication 1 , dans laquelle le premier produit est formulé de manière à être administré par voie parentérale.
3. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau de l'appareil respiratoire (bronches, naso-pharynx, poumons), dans laquelle le troisième produit est formulé pour être administré par voie pulmonaire.
4. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur mucosal sélectionné parmi le groupe constitué de l'intestin et des muqueuses génitales, dans laquelle le troisième produit est formulé pour être administré par voie uro-génitale.
5. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau de l'estomac ou de l'intestin, dans laquelle le troisième produit est formulé pour être administré par voie orale, y compris la voie intragastrique.
6. Une composition selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le premier produit contient en outre un adjuvant tel que l'hydroxide ou le phosphate d'aluminium ou par un adjuvant de type ISCOM.
7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le deuxième produit est formulé sous forme de particules telles que des liposomes ou des microsphères.
8. Une composition selon la revendication 7, dans laquelle le deuxième produit est formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 μm.
9. Une composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le troisième produit est formulé sous forme de particules telles que des liposomes ou des microsphères, pour être administré par voie pulmonaire ou par voie orale, y compris la voie intragastrique.
10. Une composition selon la revendication 9, dans laquelle le troisième produit est formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 μm, pour être administré par voie pulmonaire.
1 1. Une composition selon la revendication 9, dans laquelle le troisième produit est formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 μm, pour être administré par voie orale, y compris la voie intragastrique.
12. Une composition selon l'une des revendications 10 à 1 1 , dans laquelle le deuxième ou le troisième produit est un spray ou un aérosol.
13. Une composition selon l'une des revendications 1 à 12, dans laquelle le troisième produit est une préparation entériquement protégée.
14. Une composition selon l'une des revendications 1 à 13, dans laquelle le deuxième ou le troisième produit contient en outre un adjuvant dépourvu de toxicité, autre que les sous-unités non-toxiques ou les formes détoxifiées des toxines bactériennes et autre que des liposomes ou des microsphères.
15. Une composition selon l'une des revendications 1 à 14, dans laquelle le deuxième ou le troisième produit contient en outre du MPLA.
16. Une composition selon l'une des revendications 1 à 15, dans laquelle l'agent inducteur contenu dans le premier, le deuxième ou le troisième produit est l'antigène.
17. Une composition selon l'une des revendications 1 à 16, dans laquelle les agents inducteurs contenus dans le deuxième et troisième produits sont les mêmes.
18. Une composition selon la revendication 17, dans laquelle les agents inducteurs contenus dans le premier, deuxième et troisième produits sont les mêmes.
19. Une composition selon l'une des revendications 2 à 18, dans laquelle le premier produit est formulé pour être administré par voie sous-cutanée, intra-dermique ou intra-musculaire.
20. Une composition selon l'une des revendications 1 à 19, dans laquelle l'antigène est un antigène d'une bactérie pathogène pour le mammifère hôte.
21. Une composition selon les revendications 5 et 20, dans laquelle l'antigène est un antigène d'Helicobacter pylori.
22. Une composition selon la revendication 21, dans laquelle l'antigène est la forme apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori.
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