JPH10501556A - 粘膜性免疫応答誘発用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主哺乳動物における粘膜エフェクー部位での抗原の防御免疫応答を誘発するための医薬組成物が開示されている。該組成物は、同時投与または連続投与のための、タンパク抗原である抗原および抗原発現能を有する発現カセットから選択される免疫応答誘発因子を含有する少なくとも２つの同一または異なる成分を含む。成分の１つは、誘発因子が鼻／口腔／咽頭または唾液腺における免疫応答誘発部位に向けられるように鼻腔／経口デリバリーのために製剤化され、一方、他の成分は、誘発因子が、免疫応答が望まれるエフェクター部位の免疫応答誘発部位に向けられるように鼻腔デリバリー以外の適切な粘膜デリバリーのために製剤化される。かかる組成物は、所望により、第１の２つの成分と同一または異なり、全身投与のために製剤化される第３の成分を含有してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 粘膜性免疫応答誘発用組成物 本発明は、哺乳動物において粘膜に感染する病原体に対する防御免疫応答を誘 発するための予防接種キットに関する。 免疫性を有する細胞は、器官内に集中され得るか、多少広汎性のリンパ系組織 を形成することができ、これらの組織および器官は、集合的にリンパ系を構成す る。リンパ球生成の主要部位である一次リンパ系器官（胸腺、骨髄）、およびリ ンパ球が互いにまたは抗原と相互に作用することができる二次リンパ系器官およ び組織が認識されている。二次リンパ系器官は、とりわけ、脾臓、リンパ節およ び粘膜に関連するリンパ系形成体（粘膜関連リンパ系組織の代わりにＭＡＬＴと 略記する）、パイアー斑および口蓋扁桃からなる。ＭＡＬＴを構成する組織化（ organized）リンパ系組織に加えて、多数のリンパ球は、胃の粘膜、小腸の粘膜 、結腸の粘膜、気管支の粘膜および種々の他の器官の粘膜において見られる。 一次リンパ系器官において識別された後、リンパ球は、二次リンパ系器官に移 動する。後者は、全身性免疫性または粘膜性免疫性のためのインデューサー部位 となり得る。したがって、それらは、「全身性」器官または「粘膜性」器官と称 されてもよい。 「全身性」器官のうち、血液循環に侵入する抗原に対して応答する脾臓、およ び抗原がリンパ系ドレナージに影響を及ぼす解剖学的領域に侵入する抗原に対す る保護手段を提供する末梢結節が認識されている。それらがドレーンする領域（ インデューサーまたはエフェクター部位）に関係する種々の結節のリストを以下 の表に示す。 粘膜に関連する免疫系は、その一部について、粘膜上皮面を介して侵入し、そ の上に駐在する抗原から体を保護する。これは、ヴァルダイアー咽頭輪を含み、 リンパ系組織は、気道に関連して（気管支関連リンパ系組織の代わりにＢＡＬＴ と略記する）、消化管に関連して（腸関連リンパ系組織の代わりにＧＡＬＴと略 記する）および尿生殖管に関連して見られる。粘膜に関連する免疫系（インデュ ーサー部位）を以下の表に示す。 インデューサー二次器官において刺激されると、リンパ球は、インデューサー 部位に関連する結節を介して、所望により、これらの最初の結節をドレーンする 大きな結節、すなわち、胸管において終わる流出性リンパ系小静脈（effluent l ymphatic venule）を介して、リンパによって運搬されてエフェクター部位に移 動することができる。後者からのリンパは、血液循環と結合し、これを介して、 該細胞は、標的器官またはエフェクター部位へ進む。ＭＡＬＴのリンパ系細胞に 関して、後者は、粘膜領域に再循環する。例えば、パイアー斑において刺激され た細胞は、関連結節を通過し、次いで、血液中に入って、ある粘膜部位に位置す るようになる。この選択的再循環は、粘膜の後毛細管小静脈の上皮細胞上で特異 的に発現された付着分子を認識するリンパ部位の能力による。このメカニズムの 結果として、粘膜領域（インデューサー）の抗原性刺激は、他の粘膜領域（エフ ェクター）における応答を誘発することができる。 現在まで、免疫化の多くの方法が科学文献に報告されてきた。これらの方法の 重要な特徴は、概して言えば、（ｉ）免疫原の性質、（ii）免疫原の投与経路お よび（iii）免疫原の形成である。 免疫原の性質に関して、天然タンパクである抗原に代わるものとして天然核酸 （ＲＮＡ、ＤＮＡ）である免疫原を用いる可能性は、すでに長い間知られてきた 。したがって、この点については、さらに詳しく説明する必要はない。 粘膜感染の予防または治療に好都合である免疫化経路および方法は、すでに多 くの研究課題を有していたが、それにもかかわらず、それらは、全身感染に対す る予防接種ほどには成功しなかった。 それにもかかわらず、これらの研究は、集合的には、粘膜に定着する病原に関 係する場合、全身性投与による免疫化が、それ自体で適切な保護を発生させるの に充分であるとは思われないことを示す。このタイプの感染と有効に戦うために 、ことによると全身性投与による免疫化に加えて、粘膜性投与によって免疫化を 誘発することが、必須ではないが望ましい。粘膜性投与による免疫化は、実質的 に、病原が位置するリンパ系組織ドレーン粘膜を刺激することを可能にし、した がって、この／これらの粘膜で目標とされる免疫応答を得ることを可能にする。 Ａ型免疫グロブリン（ＩgＡ）は、胃腸粘膜、呼吸器粘膜、尿生殖器粘膜また は他の粘膜の表面の免疫グロブリンの大部分を構成する。該ＩgＡは、これらの 粘膜内に分泌され、これらの部位に影響を及ぼす感染に対する保護を与えると思 われる。 粘膜性免疫応答は、通常、エフェクター粘膜で直接または感染が戦われるべき である部位から離れた別の粘膜部位での粘膜性投与による免疫化の後に得られる 。原則として、免疫化のためにアクセス可能な粘膜経路は、経口経路、胃内経路 、鼻腔経路、尿生殖経路および直腸経路である。しかしながら、経口経路は、そ の使用が容易であるために、胃腸粘膜の感染に対して予防接種するためまたは別 の粘膜に影響を及ぼす感染に対して予防接種するために好ましく選択されるもの である。 この点を説明するために、従来技術の種々の例を以下に挙げる： 最近では、Ｃzinnら、Ｖaccine（１９９３）１１：６３７には、多くの胃潰瘍 の病原因子であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter pylori）に対する予 防接種方法が概略開示されている。無菌マウスに、アジュバントとしてコレラ毒 素と一緒にヘモバルトネラ・フェリス（Ｈ.felis）を音波処理したものを胃内経 路により投与した（胃内に挿管することによって音波処理したものを直接投与し た）。ヘモバルトネラ・フェリス（Ｈ.felis）の抗原投与後、免疫化マウスが保 護されたことが判明する。 この方法は、便宜上、以下の文献において、「経口投与」と記す。この文献と 等価なものは、Ｃzinn ＆ Ｎedrudの特許出願ＷＯ９３／２０８４３に見出だす ことができる。 Ｊertbornら、Ｖaccine（１９９２）１０：１３０には、スウェーデン人患者 の小グループを用いて行ったコレラ予防接種の研究が開示されている。該ワクチ ンは、嚥下されるべき水溶液の形態で２回投与で投与された。このワクチンは、 有効であり、危険性がないことが証明された。 Ａndersonら、Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobiol.（１９９２）３０：２２３０およびＴrea norら、Ａnn.Ｉnter.Ｍed.（１９９２）１１７：６２５には、鼻腔経路に よるインフルエンザに対する予防接種が、子供および成人において成功裏に行わ れたことが開示されている。 Ｇallichanら、Ｊ．Ｉnfect.Ｄis.（１９９３）１６８：６２２には、単純疱 疹ウイルス（ＨＳＶ）糖タンパクＢを発現する組換えアデノウイルスの鼻腔投与 後の粘膜性免疫応答および全身性免疫応答の両方を誘発することが可能であるこ とが開示されている。結論として、著者は、概して言えば、それらのアプローチ が得られるべき粘膜的または性的感染ウイルスに対する長期保護を可能にするこ とを示唆している。 いくつかの研究、例えば、Ｆorestら、Ｖaccine（１９９０）８：２０９には 、直腸経路が粘膜免疫系の全体に共通する侵入経路であること、および免疫原の ための侵入経路として用いられた直腸粘膜から離れた部位で粘膜免疫応答を誘発 することが可能であることが開示されている。 異なる免疫化経路の組合せは、最適な応答を得るための選択手段であるとして すでに数人の著者によって開示されている。粘膜性投与と全身性投与の組合せは 、例えば、以下の文献に開示されている。 Ｋerenら、Ｉnfect.Ｉmmun.（１９８８）５６（４）：９１０には、非経口経 路と経口経路とを組み合わせた経路による免疫化方法が、単独経路による免疫化 よりも、シゲラ・フレクスネリ（Ｓhigella flexneri）に対するＩgＡ応答に関 して良好な結果を与えることが開示されている。実際問題として、マウスは、麻 酔下、抗原を筋肉内投与または管によって胃内投与される。 Ｙoshimuraら、Ａrch.Ｏtolaryngol.Ｈead Ｎeck Ｓurg.（１９９１）１１７ ：８８９には、全身性投与および経口投与を組み合わせることによる肺炎球菌性 耳炎に対する予防接種が開示されている。免疫化プロトコールは、モルモットに おいて試験される。いわゆる経口投与は、実際、カテーテルによって十二指腸ま たは胃において行われるか、別法としては、腸溶カプセルの投与からなる。著者 は、全身性投与＋カプセル形態の経口投与の組合せだけが良好な結果を与えるこ とを示している。 Ｆorestら、Ｉnfect.Ｉmmun.（１９９２）６０（２）：４６５には、サルモネ ラ・テイフィ（Ｓalmonella typhi）に対するＩgＡ応答を誘発するためにヒトに おける免疫化のいくつかのモードを試験することが開示されている。経口経路お よび皮下経路は、以下のとおり用いられる：経口；経口／経口；経口／皮下；お よび皮下／経口。著者は、第１の非経口注射の数日後の第２の経口投与は、Ｉg Ａ応答を促進しないことを示している。対照的に、該ワクチンの経口投与を１回 繰り返すと、良好な結果が得られる。 Ｈartmanら、Ｉnfect．Ｉmmun.（１９９４）６２（２）：４１２には、シゲラ （Shigella）属に対する免疫化のためのいくつかのプロトコールが開示されてい る。それらのうちの１つは、特に、第１の腹腔内または皮下注射、次いで、眼球 経路による追加免疫からなる。このプロトコールは、角結膜炎のモルモットモデ ルにおいて試験される。著者は、ナイーブ動物において、粘膜性投与による免疫 化が保護の誘発のために必要であることを示している。非経口投与および粘膜性 投与の二重免疫化は、保護のレベルを増大させる。 Ｎedrudら、Ｊ．Ｉmmunol.（１９８７）１３９：３４８４には、センダイウイ ルス感染（気管支および肺に進行することもある鼻咽頭の感染）に対する免疫化 の方法が開示されている。したがって、この方法を行うことによって免疫応答が 求められるエフェクター部位は、気道全体である。Ｎedrudらの方法は、２つの 主な工程：経口（胃内）一次免疫化および鼻腔経路による追加免疫からなる。概 して言えば、経口（胃内）経路は、気道における免疫応答のためにインデューサ ー部位の１つに誘発因子（この場合、センダイウイルス）を到達させることを可 能にするために最適な経路ではないと思われる。 ここで、いずれの粘膜部位でのいずれの抗原に対する免疫応答も、いくつかの 経路を組み合わせる免疫化プロトコールを行うことによって非常に促進されるこ とが見いだされた。 したがって、本発明は、宿主哺乳動物において粘膜エフェクター部位で抗原に 対する防御免疫応答を誘発するための医薬組成物であって、同時投与または連続 投与のための、タンパクである抗原および抗原発現能を有する発現カセットから 選択される各々免疫応答誘発因子を含有する少なくとも２つの同一または異なる 成分からなり；該成分のうちの１つが、誘発因子が鼻−中咽頭または唾液腺にお ける免疫応答のためのインデューサー部位に向けられるように経鼻口腔 （nasobuccal）経路により投与されるように製剤化され、他の成分が、免疫応答 が求められるエフェクター部位での免疫応答のために誘発因子がインデューサー 部位に向けられるように鼻腔経路以外の好適な粘膜経路により投与されるように 製剤化されることを特徴とする医薬組成物に関する。 所望により、本発明の医薬組成物は、天然タンパクである抗原および抗原発現 能を有する発現カセットから選択される免疫応答誘発因子を含有し、好ましくは 、前記の最初の２つの成分の前の全身性投与のために製剤化される、最初の２つ の成分と同一または異なる第３の成分を含有してもよい。 換言すれば、本発明の課題は、宿主哺乳動物においてエフェクター部位での抗 原に対する粘膜性免疫応答を誘発するためのキットであって、 （ｉ）所望により、タンパクである抗原、抗原発現能を有する発現カセット、 抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択される第１免疫応答 誘発因子；ならびに （ii）天然タンパクである抗原、抗原発現能を有する発現カセット、抗原をコ ードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択される第２および第３の免疫 応答誘発因子からなり； （ａ）所望により、第１の誘発因子の全身性投与についての指示、 （ｂ）第２の誘発因子の経鼻口腔投与についての指示、 （ｃ）免疫応答が求められるエフェクター部位での免疫応答のためのインデュ ーサー部位に抗原が向けられるように鼻腔経路以外の好適な粘膜経路による第３ の誘発因子の投与についての指示、および （ｄ）第１、第２および第３の誘発因子の同時または連続投与についての指示 を有することを特徴とする、粘膜性免疫応答誘発用キットである。 本発明は、宿主哺乳動物において粘膜エフェクター部位で抗原に対する免疫応 答を誘発するための方法であって、いずれかの順序で、 （ｉ）タンパクである抗原、抗原発現能を有する発現カセット、抗原をコード するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択される第１の免疫応答誘発因子が 所望により宿主哺乳動物に全身投与されてもよく； （ii）タンパクである抗原、抗原発現能を有する発現カセット、抗原をコード するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択される第２の免疫応答誘発因子が 宿主哺乳動物に鼻腔および／または口腔（経鼻口腔）経路により投与され； （iii）天然タンパクである抗原、抗原発現能を有する発現カセット、抗原を コードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択される第３の免疫応答誘発 因子が、免疫応答が求められるエフェクター部位での免疫応答ためのインデュー サー部位に抗原が向けられるように鼻腔経以外の好適な粘膜経路により宿主哺乳 動物に投与されることを特徴とする、免疫応答誘発方法にも関する。 第１の誘発因子の投与は、好都合には、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射ま たは皮下注射などの全身性注射により単一投与で行われる。注射部位および経路 の選択は、特に、標的とするのが望まれるリンパ節に依存するであろう。例えば 腹腔結節を標的とするのが望まれる場合、（皮下経路よりも）筋肉内経路を用い て腰背領域で注射するのが好ましい。この誘発因子は、粒状形であるのが好まし い。該誘発因子は、沈殿法または吸着法によりアジュバントを補足するのが好都 合である。該アジュバントは、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムま たはリン酸カルシウムタイプの慣用のアジュバント、または、別法としてポリホ スファゼンなどのアジュバントであってもよい。リポソーム、マイクロスフェア 、ＩＳＣＯＭまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）タイプのアジュバントを用いるこ ともできる；尿生殖領域をドレーンする結節を標的とするのがのぞまれる場合に 後者を用いるのが特に好都合である。これらのアジュバントの全ては、当業者に よく知られている。適当な投与は、あるパラメーター、例えば、治療される個体 または誘発因子の性質に従って変化する。情報の点で、抗原の投与量は、５〜１ ００μg、好ましくは、２５〜５０μgを変化することができる。 「経鼻口腔経路（nasobuccal route）」は、本発明のためには、免疫原を実質 的にヴァルダイアー輪またはその等価物、ヒト以外の種におけるＮＡＬＴに到達 させることができる経路を意味する。経鼻口腔（または口腔）経路は、「胃内経 路」と称されるべきてある一般的に「経口経路」と称されるものと混同されるべ きではないことは、明らかである。 胃内経路を含む経口経路は、誘発因子（抗原）を下部領域（消化管、主に小腸 およびパイアー斑）の粘膜に顕著に到達させることができ、一方、口腔経路は、 実質的に上部領域の粘膜に誘発因子を運搬する。口腔経路の進入部位と経口経路 の進入部位は、同一であってもよい；この場合、進入部位は、口である。それに もかかわらず、経路は、実質的に異なる。 誘発因子を中間領域（気管支）の粘膜に到達させることができる肺経路の場合 にも同様のことが適用される。 望まれる免疫応答を最適化するために、免疫原の製剤化も重要なことである。 概して言えば、可溶性抗原よりも粒状抗原の方が粘膜性免疫応答を誘発するのに 有効であることは、すでに判明している。 同一の進入部位から始まる誘発因子がたどる経路は、いつくかのファクター、 とりわけ、誘発因子が提供されるべき形態での粒子の性質および大きさ、ならび に装置、好都合には、該粒子を推進させるために用いられるスプレイまたはエア ロゾル、特に、その形状、その指向性ジェットおよび推進力の速度に依存するで あろう。 粒子の性質に関して、当業者は、自由に選択する；この選択は、限定されない が、好都合には、２つのグループ：リポソームとマイクロスフェアとの間で行わ れる。これらの粒子の調製方法は、慣用的であり、それは、当業者が、自分自身 の要求に従ってそれらのうちの１つを選択し、採用された経路に従って誘発因子 が運搬され、標的粘膜で最適に分布されるのに適切でなければならない粒子のサ イズを決定するのは、当業者の許容範囲内である。 したがって、鼻腔または口腔経路による投与のためには、粒径１０μm未満； 肺経路による投与のためには、粒径０.０５〜１０μm、好ましくは、０.０５〜 ５μm；経口経路による投与のためには、粒径０.０５〜１０μm、好ましくは０. ０５〜５μmが提案される。 免疫応答が求められる主なエフェクター部位は、呼吸器系（気管支、鼻咽頭、 肺）、胃、腸および尿生殖系である。呼吸器系の場合、第３の誘発因子は、好都 合には、肺経路による投与のために製剤化される（例えば、リポソーム、マイク ロスフェアなど）。胃または腸の場合、第３の誘発因子は、好都合には、胃内経 路経口を含む経路による投与のために製剤化される（例えば、腸溶保護の存在下 、リポソーム、マイクロスフェア、重炭酸塩またはゼラチンカプセルなど）。腸 または尿生殖系の場合、第３の誘発因子は、好都合には、例えば膣用カプセルの 形態で尿生殖経路による、または、例えば坐剤の形態で直腸経路による投与のた めに製剤化される。 第２または第３の誘発因子は、さらに、リポソームまたはマイクロスフェア以 外の、および、非毒性サブユニットまたは細菌毒素の無毒化形態以外の毒性を欠 いているアジュバントを補足してもよい。 好ましい具体例によると、例えば、イー・コリ（Ｅ.coli）、サルモネラ・ミ ネソタ（Ｓalmonella minnesota）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはシゲラ・フレクスネリ（Ｓhigella flexneri）などの細菌 の主要リポ多糖類（ＭＰＬＡ：主要リポ多糖抗原）を第２または第３の誘発因子 のためのアジュバントとして用いる。 ここで、結果として、このタイプの化合物は、免疫が粘膜経路により行われる べきである場合に良好なアジュバント特性を有することが見いだされた。 したがって、本発明のもう１つの態様は、（ｉ）天然タンパクである抗原、抗 原発現能を有する発現カセット、抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有し 、（ii）抗原に対して粘膜免疫応答を誘発するための、および（iii）粘膜経路 による投与のための組成物の調製のための粘膜アジュバントとしてのＭＰＬＡの 使用を網羅する。 指針として、第２または第３の誘発因子が、後者が抗原である場合、投与当た り１００μg〜１mgの割合で投与されることが記載される。 好ましい具体例によると、第１の誘発因子（全身性投与）は、投与される場合 には、第１追加免疫（第２または第３の誘発因子の投与）前に、７〜４５日間、 好ましくは、２０〜３０日間経過させて、一次注射として投与される。 別の具体例によると、第１の誘発因子は、第２または第３の誘発因子と同時に 投与されてもよい。 第２および第３の誘発因子は、同時に投与されても連続的に投与されてもよい 。時間間隔をおいて投与される場合、それらは、好都合には、７〜４５日の間隔 で、好ましくは２８日の間隔で投与される。 所望により、第１および第２の誘発因子を同時に（すなわち、ほぼ同日に）投 与し、数日の間隔の後、この操作を１回繰り返すことも考えられる。 ３つの誘発因子の各々の選択は、お互いに独立して行われる。好都合には、３ つのうち少なくとも１つは、抗原であるべきである。これらの３つの誘発因子が 同一のものであることは、かなり一般的であり、この場合、抗原であるのが好都 合である。 天然タンパクである抗原について別のものとしては、（ｉ）例えば、この抗原 をコードするＤＮＡフラグメントを含有し、好適なプロモーターの制御下に置か れたポックスウイルスまたはアデノウイルス型のワクチンベクター、（ii）プラ スミド形態または別の形態に置かれたこのＤＮＡフラグメント自体（ワクチンベ クターによって担持されない）（好ましくは、ＤＮＡフラグメントは、単一の転 写ユニットの状態のままである代わりにプラスミド中に挿入されるであろう）、 または（iii）対応するＲＮＡフラグメントのいずれかを用いることも可能であ る。これらの可能性は、すでに文献に開示されている。 前記した種々の可能性のうちいずれか１つを実行するために、哺乳動物細胞中 で抗原をコードするＤＮＡフラグメントの発現を誘発させる能力を有するプロモ ーターが用いられる。一般にＤＮＡベースと称される（それらをウイルスベクタ ーに基づくワクチンと区別するために）ワクチンについて、ヒトサイトメガロウ イルス（ｈＣＭＶ）初期プロモーターは、選択されたプロモーターである。この タイプの予防接種のために、哺乳動物において複製する能力を有しないプラスミ ドを用いるのが好ましいであろう。かかるプラスミドが実質的に非集成的である のも適切である。 好ましい具体例によると、宿主哺乳動物についての病原である細菌の抗原は、 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）抗原、例えば、ヘリコバクター・ピロリ （Ｈ.pylorｉ）ウレアーゼのアポ酵素形態またはこの同一のウレアーゼのサブユ ニットureＡまたはureＢのうちの１つである。 さらに一般的には、免疫化の方法の見地から、同時に、正確に標的とされる抗 原の見地から、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）感染の予防用または治療 用の鼻腔または経鼻口腔投与用の組成物の製造における、ヘリコバクター・ピロ リ（Ｈ.pylori）抗原をコードするＤＮＡフラグメントの使用でもある。結局、 予防接種薬として用いられるＤＮＡフラグメントは、前記特徴を満たす。 胃または腸に感染する病原微生物に対する粘膜免疫応答を誘発するために、こ れらの部位の１つで免疫原を投与することが必須ではないが、上部経路により、 すなわち、経鼻口腔経路により、それを、所望により全身性投与と組み合わせて 投与するのは充分である。 したがって、もう１つの態様では、本発明は、天然タンパクである抗原、抗原 発現能を有する発現カセット、抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメン トから選択される免疫応答のための誘発因子からなり、該誘発因子が経鼻口腔経 路により投与されるように製剤化されることを特徴とする、宿主哺乳動物におい て胃または腸において抗体に対する免疫応答を誘発するための組成物に関する。 この同一の態様では、本発明は、天然タンパクである抗原、抗原発現能を有す る発現カセット、抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから選択さ れる成分の、宿主哺乳動物において胃または腸において該成分に対する免疫応答 を誘発するための経鼻口腔経路投与用組成物の調製のための使用を網羅する。 かかる組成物は、胃または腸粘膜に感染する病原微生物の抗原からなる場合、 特に、問題の感染から宿主哺乳動物を保護する、長期永続性のある保護を与える 、メモリーＴおよびＢリンパ球を働かせるという点で有用である。起こり得る感 染は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）、ビブリオ・コレレ（Ｖ.cholerae ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓhigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Ｓhige lla sonnei）、サルモネラ・エンテレティディス（Ｓalmonella enteritidis） 、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃlostridium difficile）、エルシニア・ エン テロコリチカ（Ｙersinia enterocolitica）、ならびに毒素原性および腸管病原 性イー・コリ（Ｅ.coli）によって引き起こされるものである。抗原に関しては 、後者は、殺されたか、溶解されたか、または、弱毒化された形態の病原因子自 体であっても、または、莢膜多糖などのこの病原の抗原性成分、または純粋な形 態の膜抗原、または病原から直接精製されたか、もしくは、組換えＤＮＡ技術に よって得られたこの病原のポリペプチド特性であってもよい。 例えば、ヘクコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）感染を予防するための組成物 の場合、選択された抗原は、対応するＤＮＡフラグメントが例えばＬabigneら、 Ｊ.Ｂact.（１９９１）１７３（６）：１９２０に開示されているサブユニット ＡおよびＢからなるウレアーゼのアポ酵素、または、アポ酵素のサブユニット、 または細胞毒素（ＷＯ９３／１８１５０）、または付着性ファミリーのタンパク （宿主細胞の受容体への結合能を有し、病原と宿主細胞とのカップリングを媒介 する能力および感染プロセスを開始する能力を有するようになるタンパク）、ま たは、鉄調節タンパクである。 コレラワクチンの場合、選択された抗原は、文献に開示されているようなコレ ラ毒素サブユニットＢであっもよい。 本発明を第１図〜第５図を引用して説明する。 第１図は、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の唾液腺（１Ａ）および胃（ １Ｂ）への投与により誘発された免疫応答のエリスポット（Ｅrispot）分析を示 す。結果は、３つの免疫化プロトコールに関する：皮下／経口（Ｓc Ｏ）；皮下 ／鼻腔（Ｓc Ｎ）；および皮下／経口＋鼻腔（Ｓc Ｏ＋Ｎ）。もちろん、「経口 」は、「胃内」を意味すると解される。明るいバックグラウンドに密な陰を付し た方は、ＩgＡ応答に対応する。暗いバックグラウンドに明るい陰を付した方は 、ＩgＧ２ａ応答に対応する。胃における応答は、１グループ５匹のマウスにお いて応答するマウスの数として表す；細胞１００万個当たりのスポット数は、９ のオーダーのものである。 第２図は、皮下／皮下＋経口＋鼻腔（Ｓc／Ｓc＋Ｏ＋Ｎ）プロトコールに従っ たＣＴＢの投与による唾液腺（２Ａ）および胃（２Ｂ）において誘発される免疫 応答のエリスポット分析を示す。もちろん、「経口」は、「胃内」を意味すると 解される。明るいバックグラウンドに密な陰を付した方は、ＩgＡ応答に対応す る。暗いバックグラウンドに明るい陰を付した方は、ＩgＧ２ａに対応する。胃 における応答は、１グループ５匹のマウスにおいて応答するマウスの数として表 す；細胞１００万個当たりのスポット数は、８.２のオーダーのものである。 第３図は、皮下（アルミニウム）／経口＋鼻腔（リポソーム）プロトコールに 従ったタチナタマメウレアーゼの投与による唾液腺（３Ａ）および胃（３Ｂ）に おいて誘発された免疫応答のエリスポット分析を示す。もちろん、「経口」は、 「胃内」を意味すると解される。明るいバックグラウンドに密な陰を付した方は 、ＩgＡ応答に対応する。暗いバックグラウンドに明るい陰を付した方は、ＩgＧ ２ａに対応する。胃における応答は、１グループ５匹のマウスにおいて応答する マウスの数として表す；細胞１００万個当たりのスポット数は、６２０のオーダ ーのものである。 第４図は、皮下（リポソーム）／経口＋鼻腔（リポソーム）プロトコールに従 ったタチナタマメウレアーゼの投与による唾液腺（４Ａ）および胃（４Ｂ）にお いて誘発された免疫応答のエリスポット分析を示す。もちろん、「経口」は、「 胃内」を意味すると解される。明るいバックグラウンドに密な陰を付した方は、 ＩgＡ応答に対応する。暗いバックグラウンドに明るい陰を付した方は、ＩgＧ２ ａに対応する。胃における応答は、１グループ５匹のマウスにおいて応答するマ ウスの数として表す；細胞１００万個当たりのスポット数は、１５のオーダーの ものである。 第５図は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼのアポ酵素を誘 発するために用いられるプラスミドｐＴＧ８６６５を示す。 第６図は、ＨindIII（１）−ＳacII（７５４）フラグメントがｈＣＭＶプロモ ーターを含有し、ＸhoＩ（７７１）−ＳmaＩ（２１０４）フラグメントがＥ１ａ ＯＲＦを含有し、ＳmaＩ（２１０４）−ＥcoＲＩ（２８１０）フラグメントが ＢＧＨ ３'末端を含有し、ＥcoＲＩ（２８１０）−ＨindIII（１）フラグメント がｐＵＣ１９骨格に対応するプラスミドｐＣＭＣ／Ｅ１ａを示す。 第７図は、プラスミドｐＣＢ−１１を示す。 第８図は、ureＢ ＯＲＦがヌクレオチド７７７からヌクレオチド２４８７まで 伸長するプラスミドｐＣＢ−ureＢを示す。 第９図は、プラスミドｐＣＢ−ureＢで免疫化されたＢalb／cマウスにおいて 記録された抗ウレアーゼ抗体力価をグラフで示す。連続的な曲線は、ＩgＧ力価 を示し、破線の曲線は、ＩgＡ力価を示す。■は、３回繰り返した鼻腔内経路に よる免疫化に対応する（Ｄ０、２１および４２；プラスミド単独またはプラスミ ド＋リポソーム）。◆は、筋肉内経路による一次免疫化（プラスミド単独）、次 いで、鼻腔内経路によるＤ２１および４２での２つの追加免疫（プラスミド＋リ ポソーム）に対応する。●は、皮内経路による一次免疫化（プラスミド単独）、 次いで、鼻腔内経路によるＤ２１および４２での２つの追加免疫（プラスミド＋ リポソーム）に対応する。 第１０図は、所望によりヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼの アポ酵素による免疫化および抗原投与後のマウスの胃培地の光学密度をグラフで 示す。第１カラム：非感染マウス；第２カラム：皮下一次免疫化、次いで、（鼻 腔＋胃内）経路による２つの追加免疫によって空のリポソームを投与したマウス ；第３カラム：皮下一次免疫化、次いで、（鼻腔＋胃内）経路による２つの追加 免疫によってウレアーゼを有するリポソームを投与したマウス；第４カラム：（ 鼻腔＋胃内）経路により３回繰り返して投与することによるウレアーゼを有する リポソームを投与したマウス。全ての場合、ＤＣ−Ｃholリポソームを用いた。 実施例１：コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）に対する粘膜性免疫応答の誘 発 １.Ａ．免疫化用組成物の調製 １.Ａ.ａ）皮下経路による投与のため 精製し、１０mg／mlに濃縮したＣＴＢの調製物１μl（ＣＴＢ １０μgと等価 ）を１％水酸化アルミニウム調製物１００μlと混合する。該混合物をＰＢＳ緩 衝液中で希釈して、最終容量５００μlを得る。これは、１個の個別投薬を構成 する。 １.Ａ.ｂ）経口（胃内）経路による投与のため ３μmラテックスビーズ（ポリサイエンシズ（Ｐolysciences）カタログ１７３ ４）の体積を引き、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する（１,０００rpmで３分間遠心分 離）。次いで、該ビーズと、精製し、１０mg／mlに濃縮したＣＴＢの調製物とを 混合して、ＣＴＢが１／２０に希釈された調製物（最終濃度０.５mg／mlと等価 ）を得る。この調製物を２時間撹拌する。 次いで、該調製物を２００μＭ炭酸塩緩衝液で１／２５に希釈する。 １.Ａ.ｃ）鼻腔経路による投与のため 炭酸塩緩衝液中での最終希釈を除いてセクション１.Ａ.ｂ）における記載に従 って、ラテックスビーズ上に被覆されたＣＴＢの調製物を得る。 次いで、該調製物を所望によりＰＢＳ緩衝液中で希釈する。 １.１.ｄ）経口＋鼻腔経路による投与のため 該投与は、１.Ａ.ｂ）および１.Ａ.ｃ）における記載に従って、経口投与およ び鼻腔投与を組み合わせることによって行われる。 １.Ｂ．免疫化プロトコール ３つの免疫化プロトコールを比較する。それらは、以下のとおりである： １）皮下／経口（胃内） ２）皮下／鼻腔 ３）皮下／経口（胃内）十鼻腔。 セクション１.Ａ.ａ）における記載に従って、アジュバントとしてアルミニウ ムを有するＣＴＢ１０μgを５００μlの容量でＢalbＣマウスに皮下経路により 投与する。 対照グループを形成するマウスには、ＰＢＳ５００μlを皮下投与する。 皮下注射後２８日目に、試験マウスを３つのグループに分ける。 第１のグループにおけるマウスには、１ml注射器に接続したカニューレを介し て、セクション１.Ａ.ｂ）に記載したラテックスビーズ上で被覆されたＣＴＢ１ ０μgを５００μlの容量で胃内投与する。対照グループから採取したマウスには 、同一経路により炭酸塩緩衝液５００μlを投与する。 第２のグループにおけるマウスには、セクション１.Ａ.ｃ）に記載したラテッ クスビーズ上に被覆されたＣＴＢ １０μgを２０μlの容量で鼻腔経路によって 投与する。これらの２０μlを外鼻孔に滴下投与する。対照グループから採取し たマウスには、同一経路によりＰＢＳ ２０μlを投与する。 第３のグループにおけるマウスには、経口（胃内）経路によりＣＴＢ １０μg および鼻腔経路によりＣＴＢ １０μgを同時に投与する。セクション１.Ａ.ｂ） に記載したラテックスビーズ上に被覆されたＣＴＢの調製物を得る。数匹のマウ スを対照として用いる。 追加免疫後１５日目に、マウスの胃および唾液腺を取り出す；Ｍegaら、Ｊ.of Immunology（１９９２）１４８：２０３０に開示されたプロトコールに従って 細胞を抽出し、Ｃzerkinskyら、Ｔheoretical and Ｔechnical aspects of ＥＬ ＩＳＡ and other Solid Phase Ｉmmuno Ａssays（Ｄ.Ｍ.ＫennyおよびＳ.Ｊ.Ｃ halacombe編、Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons、ニューヨーク州チチェスター）：２１７ −２３９に開示されている方法に従ってＩgＡ応答をエリスポット分析に付す。 結果を第１図に示し、以下のことが判明する： 皮下／経口（胃内）プロトコールは、強い粘膜性免疫応答を誘発する能力を有 しないことを証明するが、かかる応答は、経皮／鼻腔および皮下／経口（胃内） ＋鼻腔プロトコールの場合に観察される。 後者のプロトコールは、ＩgＡによって表される良好な局所応答が唾液腺およ び胃の両方において得られる限り最良であることを証明する。 Ｉ.Ｃ．サプリメンタリー免疫化プロトコール セクション１.Ｂ．に記載したＣＴＢを皮下注射したマウスに、２８日後、以 下のものを同時に投与する： 経口（胃内）経路により、セクション１.Ａ.ｄ）において調製したＣＴＢ ４ ０μgを５００μlの容量で； 鼻腔経路により、セクション１.Ａ.ｄ）において調製したＣＴＢ １０μgを２ ０μlの容量で； 皮下経路により、セクション１.Ａ.ａ）において調製したＣＴＢ １０μgを３ ００μlの容量で。 追加免疫後１５日目に、マウスの胃および唾液腺を取り出す；細胞を抽出し、 ＩgＡ応答をエリスポット分析に付す。 結果を第２図に示す。良好なＩgＡタイプ免疫応答が得られる。これは、粘膜 における局所性免疫応答のインデックスである。 実施例２：タチナタマメウレアーゼに対する粘膜性免疫応答の誘発 ２.Ａ．免疫化用組成物の調製 ２.Ａ.ａ）アジュバントとしてアルミニウムを有するウレアーゼ ＰＢＳ緩衝液中で４mg／mlに濃縮したタチナタマメウレアーゼ調製物（ベーリ ンガー（Ｂoehringer）；ref ７３７３４８）５μlを１％水酸化アルミニウム調 製物１００μlと混合する。該混合物をＰＢＳ緩衝液中で希釈して、ウレアーゼ ２０μgを含有する最終容量５００μlを得る。これは、１個の個別投薬を構成す る。 ２.Ａ.ｂ）リポソーム中のウレアーゼ 以下のとおり、３つの技術を用いる： １．エタノールの注射 モル比５：４：１のコレステロール（シグマ（Ｓigma））、ジパルミトイルホ スファチジル−コリン（ナッターマン・ホスホリピッズ（Ｎattermann Ｐhospho lipids））およびジミリストイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩から なる脂質混合物１６.４mgを無水エタノール５０μlに溶解させる。該溶液を、ハ ミルトン注射器により、タチナタマメウレアーゼ４mg／mlを含有する水溶液２ml 中に注入し、所望によりＰＢＳ緩衝液で緩衝化させて、１／１０に希釈す。該調 製物を４５℃で撹拌し続ける。 水と接触させると、該脂質は、自然に、ある容量のウレアーゼ溶液を取り込ん だリポソームの形態になる。 これらのリポソームを、セファロース（Ｓepharose）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ ア（Ｐharmacia））のカラムを介してゲル濾過により精製する（過剰の遊離ウレ アーゼから単離する）。ヨウ素−１２５−標識したウレアーゼ（エンザイモビー ズ（Ｅnzymobeads^TM）法、バイオラッド（Ｂiorad））を用いて測定したウレア ーゼの被包化の程度は、３〜６％変化する。所望により、１０kＤの排除限界を 有するノヴァセル（Ｎovacell^TM）セル（フィルトロン（Ｆiltron））中で限外 濾過によりリポソーム懸濁液を濃縮する。 ２．押出し成形 モル比５：４：１のコレステロール（シグマ（Ｓigma））、ジパルミトイルホ スファチジル−コリン（ナッターマン・ホスホリピッズ（Ｎattermann Ｐhospho lipids））およびジミリストイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩から なる脂質混合物１６.４mgを、２５mlの丸底パイレックスフラスコ中、クロロホ ルム４mlに溶解させる。該溶液を蒸発させて（ブッチ・ロータベイパー（Ｂuchi Ｒotavapor））、フラスコの壁上に薄い脂質膜を形成させる。該脂質膜を高真 空下で２時間乾燥させ、次いで、タチナタマメウレアーゼ８mgを含有する水２ml と一緒にする。４５℃で４時間撹拌した後、懸濁液を４００nmの孔を有する２枚 重ねのポリカーボネート膜を介して５回押し出して（エクストゥルーダー(Ｅxtr uder^TM）、リペックス・バイオメンブランズ・インコーポレイテッド（Ｌipex Ｂiomembranes Ｉnc.）、ヴァンクーヴァー）、直径約４００nmの有力な単層リ ポソームの均質な群を形成する。これらのリポソームを、セファロース（Ｓepha rose）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア（Ｐharmacia））のカラムを介するゲル濾過に よって精製する（過剰の遊離ウレアーゼから単離する）。ヨウ素−１２５−標識 したウレアーゼ（エンザイモビーズ（Ｅnzymobeads^TM）標識法、バイオラッド（ Ｂiorad））を用いて測定したウレアーゼの被包化の程度は、５〜１０％変化す る。所望により、１０kＤの排除限界を有するノヴァセル（Ｎovacell^TM）セル（ フィルトロン（Ｆiltron））中で限外濾過によりリポソーム懸濁液を濃縮する。 ３．マイクロフルイダイザー（microfluidizer）法 エタノール溶液（Ｄ３Ｆ−フランス）の凍結乾燥によって得た、モル比５：４ ：１のコレステロール（シグマ（Ｓigma））、ジパルミトイルホスファチジルコ リン（ナッターマン・ホスホリピッズ（Ｎattermann Phospholipids））およ びジミリストイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩からなる脂質混合物 ８２mgを、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼの組換えアポ酵素 形態３.６mg／mlを含有する１０mＭ Ｈepes緩衝液、１５０mＭ ＮaＣl、pＨ７. ４の１０mlと一緒にする。４５℃で４時間撹拌した後、Ｍ１１０Ｓマイクロフル イダイザー（マイクロフルイディクス・カンパニー（Ｍicrofluidics Ｃo.）） において５００kＰaで５回のランによって微小流体化して、ウレアーゼを含有す る直径約１０nmの有力な単層リポソームの均質な群を形成する。これらのリポソ ームをゲル濾過（セファロース（Ｓepharose）ＣＬ−４Ｂのカラム、ファルマシ ア（Ｐharmacia））により精製する。マイクロ（Ｍicro）ＢＣＡキット（ピアス （Ｐierce））を用いてタンパクアッセイによって測定したウレアーゼの被包化 の程度は、１４.５％である。所望により、１０kＤの排除限界を有するノヴァセ ル（Ｎovacell^TM）セル（フィルトロン（Ｆiltron））中で限外濾過によりリポ ソーム懸濁液を濃縮する。 ２.Ａ.ｃ）アジュバントとしてＭＰＬＡを有するリポソーム中のウレアーゼ リポソームを調製する場合、脂質の塊に対して１、２または５％の割合で、脂 質混合物にＭＰＬＡ（イー・コリ（Ｅ.coli）から抽出した、シグマ（Ｓigma） ）を添加してもよい。 ２.Ｂ．免疫化プロトコール ２つの免疫化プロトコールを試験する。それらは、以下のものである： １）皮下（アルミニウム）／［経口（胃内）＋鼻腔］（リポソーム） ２）皮下（リポソーム）／［経口（胃内）＋鼻腔］（リポソーム） ＯＦ１マウスに皮下経路によって以下のものを投与する： セクション２.Ａ.ａ）に記載したアジュバントとしてアルミニウムを有するウ レアーゼ２０μgを容量５００μlで、または セクション２.Ａ.ｂ）において得られたリポソーム調製物中のウレアーゼ２０ μgを容量５００μlで。 皮下注射後２８日目に、マウスに同時に以下のものを投与する： 経口経路により、セクション２.Ａ.ｂ）において得られたリポソーム調製物中 のウレアーゼ２０μgを容量５００μlで、および 鼻腔経路により、セクション２.Ａ.ｂ）において得られたリポソーム調製物中 のウレアーゼ２０μgを容量５０μlで。 追加免疫後１５日目に、マウスの胃および唾液腺を取り出す；前記実施例のプ ロトコールに従って、細胞を抽出し、前記方法に従って、ＩgＡ応答をエリスポ ット分析に付す。 結果を第３図および第４図に示す。第３図は、皮下（アルミニウム）／［経口 （胃内）＋鼻腔］（リポソーム）プロトコールの場合、唾液腺（３Ａ）における ＩgＡ応答が、弱いけれども、有力であり、一方、胃（３Ｂ）に関しては、５匹 のうち３匹のマウスが非常に多くのスポットによる免疫化に応答することを示す 。 第４図は、皮下（リポソーム）／［経口＋鼻腔内］（リポソーム）プロトコー ルの場合、応答が唾液腺（４Ａ）において非常に良好であるが、胃（４Ｂ）にお いて弱いことを示す。これは、用いたプロトコールの他に抗原の製剤化が重要で あることを示す。 実施例３：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）感染用予防接種キット 各々、所定の投与方法に依存して異なる方法で製剤化された、ヘリコバクター ・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼのアポ酵素を含有する３つの調製物をキット 中で一緒にする。 ３.Ａ．アポ酵素の調製 Ｌabigneら（前掲）に開示されたプラスミドのうちの１つ（ｐＩＬＬ９１４） から、ＵreＡのＮ末端部分（内部ＨindIII部位まで）をコードし、かつ、ＵreＡ の翻訳開始コドンでＢspＨＩ部位を含有するフラグメントを、プライマーＯＴＧ ５９７３およびＯＴＧ５９７４を用いてＰＣＲによって産生する。 ＰＣＲによって産生されたフラグメントをＢspＨＩおよびＨindIIIで消化し、 ureＡおよびureＢの３'部分を有するｐＩＬＬ９１４のＨindIIIフラグメント２. ３５kbと同時に、ＮcoＩおよびＨindIIIで消化したベクターｐＴＧ３７０４中に 挿入して、第５図に示すプラスミドｐＴＧ８６６５を得る。このプラスミドは、 araＢプロモーターと融合したureＡおよびureＢ遺伝子を有する。ベクターｐＴ Ｇ３７０４は、１９９４年３月９日に公開された欧州特許出願ＥＰＡ ５８４,２ ６６に開示されている。このベクターは、プラスミドpara１３（Ｃagnonら、Ｐr ot.Ｅng.（１９９１）４：８４３）をクレノウポリメラーゼで処理してＳphＩ部 分を破壊することによって誘導される。 イー・コリ（Ｅ.coli）菌株Ｘac-Ｉ（Ｎormandyら、ＰＮＡＳ（１９８６）８ ３：６５４８）をプラスミドｐＴＧ８６６５で形質転換する。形質転換した菌株 を、アンピシリン１００μg／mlを補足したＬＢ培地中で培養する。指数増殖期 に、ureＡおよびureＢの発現を誘発するために、アラビノース０.２％を添加す る。種々の誘発期間（１〜３時間）の後、ＵreＡおよびＵreＢの産生レベルは、 非常に高く（合計タンパクの約１０％）、次いで、該細胞を除去する。 遠心分離により培養液２.５リットルから細胞２２０gを回収する。 これらの細胞を、ＰＭＳＦ（１mＭ）１７５mgを含有する２０mＭリン酸ナトリ ウム緩衝液（pＨ７.５）約１リットル中に取る。次いで、該細胞懸濁液に、最終 的に１ユニット／mlと等価の２５０Ｕ／μｌの濃度のベンゾナーゼ溶液（Ｍerck ：ref．１６５４）４μlおよび１Ｍ ＭgＣl₂溶液１mlを添加する。反応を３０分 間進行させる。 次いで、懸濁液をラニー（Ｒannie）装置（高圧ホモジナイザー）中に導入し 、１,０００バールの加圧に付して、細胞を破裂させる。 次いで、２つの精製方法から選択する。 ３.Ａ.ａ）第１の方法 細胞の破裂を光学密度によってモニターする。ＯＤが２.５〜２のオーダーの ものになると、該懸濁液を装置から取り出し、０.５Ｍ ＥＤＴＡ溶液１mlを補足 する。１０,０００rpmで２時間遠心分離し、次いで、上清を回収し、１００,０ ００×ｇで１時間遠心分離して、膜を除去する。 Ｈuら、Ｉnfect.Ｉmmun.（１９９２）６０：２６５７に開示されているものと 同様のプロトコールに従って、精製を行う。可溶性タンパクを含有する上清をp Ｈ６.８に調整し、次いで、１mＭ ＰＭＳＦを含有する２０mＭ ＫＰＯ₄緩衝液（ pＨ６.８）（ＰＯ緩衝液）で平衡化した容量５cm×２５cmの陰イオン交換カラム 上に流速４ml／分で負荷する。該カラムを０〜０.５ＭのＫＣlの直線勾配液で溶 離する。フラクション１４mlを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。最 も純粋な形態のウレアーゼを含有するフラクションをプールする。 得られたフラクションにＫＣlを添加して、最終ＫＣl濃度を１Ｍと等しくし、 該溶液をフェニル−セファロース（ファルマシア（Ｐharmacia））のカラム上に 負荷する。該カラムを１Ｍ〜０ＭのＫＣlの勾配液で溶離する。前記のとおり、 該フラクションを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。最も純粋な形態 で尿素を含有するフラクションをプールし、２０mＭ ＫＰＯ₄緩衝液（pＨ７.５ ）に対して透析する。 得られたフラクションを、２０mＭ ＫＰＯ₄緩衝液（pＨ７.５）で平衡化した 陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロース・ファースト・フロー（Ｑ−Ｓepharose Ｆast Ｆlow）；ファルマシア（Ｐharmacia））上に負荷する；前記のとおり、 カラムを、０〜０.５ＭのＫＣlの直線勾配液で溶離し、フラクションを回収し、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。 尿素を含有するフラクションをプールし、遮断閾値が１００kＤaである膜を横 切る透析濾過（diafiltration）によって濃縮し、フラクションを、２０mＭ Ｎa ＰＯ₄緩衝液（pＨ７.５）中で平衡化したゲル濾過カラム（セファクリル（Ｓeph acryl）４００ＨＲ）に適用する；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる種々のフラクション の分析の後、ウレアーゼを含有するフラクションを回収し、遮断閾値が１００k Ｄaである膜を横切る透析濾過によって濃縮し、該溶液を０.２２μmの孔の膜を 介して濾過する。該ウレアーゼ溶液に無菌スクロース溶液を添加して、２ ％の最終濃度を得る。次いで、該溶液を凍結乾燥し、次工程を待つ間、この形態 で貯蔵する。 ３.Ａ.ｂ）第２の方法 この上清をpＨ７.５に調整し、次いで、１mＭ ＰＭＳＦを含有する２０mＭ Ｋ ＰＯ₄平衡化緩衝液（pＨ７.５）で平衡化した容量５cm×２５cmの陰イオン交換 カラム（Ｑ−セファロース・ファースト・フロー（Ｑ−Ｓepharose Ｆast Ｆlow ）；ファルマシア（Ｐharmacia）；ref．１７−０５１０−０１）上に流速４ml ／分で負荷する。該カラムを平衡化緩衝液中０〜０.５ＭのＫＣlの直線勾配液（ 勾配液容量：２.２５リットル；流速：４ml／分）で溶離する。 フラクション１４mlを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。最もきれ いなフラクションを回収し、プールする（これらは、一般的に、勾配の開始から 始めて８２〜１２１番目のフラクショである）。 Ｑ−セファロース（Ｑ−Ｓepharose）プールを、以下のとおり事前に調製した 容量２.６cm×１１cmの亜鉛キレートのカラム（キレーティング・セファロース ・ファースト・フロー（Ｃhelating Ｓepharose Ｆast Ｆlow）；ファルマシア （Ｐharmacia）；ref．１７−０５７５−０２）上に２ml／分の流速で負荷する 。 該カラムは、０.２Ｍ ＺnＣl₂溶液２容量倍を有する金属で負荷し、０.５Ｍ ＮaＣl ３容量倍で洗浄し、０.５Ｍ ＮaＣl、１mＭイミダゾールおよび１mＭ Ｐ ＭＳＦを含有する５０mＭトリス−ＨＣl平衡化緩衝液（pＨ８）３容量倍で洗浄 する。該カラムを１０mＭイミダゾールを含有する平衡化緩衝液１容量倍で洗浄 し、次いで、１mＭイミダゾールを含有する平衡化緩衝液３容量倍で洗浄する。 負荷が終了した後、洗液が基線値に戻るまで、該カラムを平衡化緩衝液で洗浄 する（洗浄は、０.２mｌ／分で一晩行った）。 次いで、該カラムを、７.５mＭイミダゾールを含有する平衡化緩衝液２００ml で流速１ml／分で洗浄する。 溶離は、平衡化緩衝液中７.５mＭ〜３０mＭのイミダゾール直線勾配液（勾配 液量：２５０ml；流速１ml／分）において行われる。 フラクション１０mlを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。純粋なウ レアーゼを含有するフラクションを回収し、プールする（これらは、一般的に、 勾配の開始から始めて１９〜３０番目のフラクションである）。 次いで、キレート化セファロースプールを、アミコン（Ａmicon）ＹＭ１００ 膜を横切る限外濾過によって、２５mlに濃縮する。 次いで、この濃縮物を、２０mＭ ＫＰＯ₄緩衝液、０.１５Ｍ ＮaＣl（pＨ７. ５）中で平衡化した容量２.６cm×９６cmのセファクリル（Ｓephacryl）Ｓ−３ ００（ファルマシア（Ｐharmacia）；ref．１７−０５９９−０１）のカラム上 に負荷する。 流速０.５ml／分でクロマトグラフィーを行う。フラクション１０mlを回収し 、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。純粋なウレアーゼを含有するフラクショ ンをプールし（これらは、一般に、負荷の最後から２１〜２７番目のフラクショ ンである）、アミコン（Ａmicon）ＹＭ１００膜を横切る限外濾過によって、約 ２.５mg／mlに濃縮する。該アポ酵素調製物を０.２２μmの孔の膜を介して濾過 し、例えば、−２０℃で冷凍保存するか、または、スクロースの存在下で凍結乾 燥する。 キットの調製は、以下のとおりである： ３.Ｂ．皮下経路による投与のためのアジュバントとしてアルミニウムを有す るアポ酵素 水酸化アルミニウム調製物（アルヒドロゲル；スーパーフォス（Ｓuperfos） ）２５０μlを用いて、３.Ａ.において得たアポ酵素溶液２０μl（５０μgと等 価）を吸着させ；＋４℃で２時間吸着させた後、ＰＢＳを添加することによって 最終容量を５００μlに調製することによって、注射用投薬物を調製する。 ３.Ｃ．経鼻口腔（nasobuccal）経路による投与のための、リポソーム中のア ポ酵素 ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼのアポ酵素形態をリポソー ム中に被包する。これらのリポソームは、平均直径１００nmであり、タンパク含 量が脂質mg当たり６０μgである。 合計量０.１mgの製剤化したウレアーゼを経鼻口腔経路により投与する。ＶＡ ＬＯＩＳ（Ｌe Ｐrieure、ＢＰＧ、２７１１０ Ｌe Ｎeubourg）によって市販 されているタイプの２本のノズル（鼻および口）を有するエアロゾルを用いる。 ポンプにより最終容量をデリバリーさせ、ポンプのタイプに依存して、可変性サ イズのノズルを、ポンプを装着した容器に装着する（投与当たり３００μl以下 、この投与により、選択された時間間隔で繰り返すことが可能である）。 ３.Ｄ．胃内投与のためのリポソーム中のアポ酵素 合計量０.５mgの製剤化したウレアーゼを胃内経路により投与する。セクショ ン３.Ｃ.において記載した方法に従って、アポ酵素を調製し、次いで、凍結乾燥 させ、２００mＭ重炭酸塩溶液２０mlと一緒にする。 ３.Ｅ．免疫化プロトコール ３.Ｂ.で調製した投薬物を成人に皮下投与する。一次注射後２８日目に、該成 人に、３.Ｃ.で調製した投薬物を経鼻口腔経路により投与し、同日に、３.Ｄ.に おいて調製した投薬物を摂取させる。 実施例４：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）感染用予防接種キット（ウ レアーゼサブユニットureＢをコードするＤＮＡを予防接種薬として用いた） ４.Ａ．プラスミドベクターの構築 真核性発現ベクターpＣＢ−１１を以下の３つの素子から構築する： ＸbaＩおよびＥcoＲＩで予め消化したプラスミドｐＵＣ１９（市販品）； 例えば、ＵＳＰ ５,１６８,０６２に開示されているヒトサイトメガロウイル ス（ｈＣＮＶ）の初期プロモーターを含有するプラスミドpＣＭＶ／Ｅ１ａから 単離したＳpeＩ−ＳacIIフラグメント（第６図）；および ｍＲＮＡポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡ安定化配列を含むウシ成長ホ ルモン遺伝子の３'部分を含有するＳacII−ＥcoＲＩフラグメント。このＳacII −ＥcoＲＩフラグメントは、プラスミドpＢＳ−ＢＧＨから得られ、プラスミドp ＣＭＶ／Ｅ１ａ由来のＢamＨＩ−ＥcoＲＩフラグメントをブルースクリプトプラ スミド（市販品）中に挿入することによって構築される。 これらの３つのフラグメントを一緒に結合させて、プラスミドpＣＢ−１１を 形成する（第７図）。 プラスミドpＩＬＬ９１４から、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって、u reＢ遺伝子を増幅する： 上流プライマー： 下流プライマー： 上流プライマーは、ＸhoＩ制限部位およびＫozak配列をureＢのオープンリー ディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に導入させることができ、下流プライマーは 、該ＯＲＦの下流にＳmaＩ部位を導入させることができる。ＰＣＲによって産生 されたフラグメントを消化し、次いで、ＸhoＩおよびＳmaＩで予め消化したプラ スミドＰＣＢ−１１中に挿入して、プラスミドpＣＢ−ureＢを産生する（第８図 ）。 このプラスミドでイー・コリ（Ｅ.coli）ＸＬ１を形質転換し、次いで、慣用 技術に従って培養する。このようにして増幅されたプラスミドを、アルカリ溶解 法、次いで、イソピクニックカゼインクロリド勾配液による標準的な方法で収穫 する。ＤＮＡを蒸留水または生理食塩水（０.９％ＮaＣl）中に取る。 ４.Ｂ．リポソーム／ＤＮＡ組成物の調製 Ｋunitakeら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.（１９８４）１０６：１９７８によって開 示されている方法に従って、Ｏ,Ｏ',Ｏ"−トリドデカノイル−Ｎ−(ω−トリメ チルアンモニオドデカノイル)トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタンブロミド （一般に、ＴＣ１−１２として知られている）を製造する。この生成物１０mgを エタノール５０μlに溶解させる。次いで、この調製物を４２℃で撹拌しつつ脱 イオン水２ml中にハミルトン注射器を用いて迅速に注入する。 水にエタノールを溶解させる間に、自然に直径約５０nmのリポソームが形成さ れる。これにより、５.２mＭ ＴＣ１−１２を含有するリポソーム調製物が得ら れる。 前記で得られた調製物１００μlを、蒸留水１５０μlを添加することによって 希釈する。次いで、濃度２μg／μlのプラスミドpＣＢ−ureＢの水性調製物２５ ０μlを添加する。負荷比（ＴＣ１−１２／ヌクレオチド）は、０.３５のオーダ ーのものである。 ４.Ｃ．免疫化プロトコール ６〜８週齢Ｂalb／cマウスにキシラジン＋ケタミン混合物を注射することによ って予め麻酔する。それらにpＣＢ−ureＢ ５０μgを３週間おきに３回投与する 。 種々の免疫化プロトコールにおいて、鼻腔内（ＩＮ）経路、筋肉内（ＩＭ）経 路および皮内（ＩＤ）経路を用いる。 鼻腔内経路による投与のために、生理食塩水中または４.Ｂ.において得られた リポソーム／ＤＮＡ混合物中濃度１００μg／mlのＤＮＡ溶液５０μlを外鼻孔中 に滴下投与する。 筋肉内経路による投与のために、２９ゲージの針を装着したハミルトン注射器 を用いて四頭筋に生理食塩水中濃度１００μg／mlのＤＮＡ溶液５０μlを注射す る。 皮内経路による投与のために、空気ジェットインジェクター（メソフラッシュ （Ｍesoflash^TM１０））を用いて、予め剃毛した皮膚の５カ所に濃度５００μg ／mlのＤＮＡ溶液１００μlを注射する。 種々の免疫化プロトコールは、以下のとおりである： １４日目、３５日目および３６日目に、各マウスから血清試料を採取する。Ｅ ＬＩＳＡにより抗ウレアーゼ抗体の産生を試験する（ヘリコバクター・ピロリ（ Ｈ.pylori）の精製した可溶性抽出物を用いる）。 第９図に示す結果は、種々の免疫化プロトコールにより強いＩgＧ応答および 小さなＩgＡ応答が誘発されることを示す。 実施例５：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレァーゼに対する粘膜免 疫応答の誘発 ５.Ａ．免疫用組成物の調製 １リットルの丸底フラスコ中、クロロホルム２０mlにＤＣ−Ｃhol ０.８gおよ びジオレオイルホスファチジコリン（ＤＯＰＣ）２.４gを添加する。この混合物 を真空下で蒸発させて、フラスコの壁に脂質膜を形成する。次いで、この膜を高 真空下で一晩乾燥させる。 次いで、膜を、Ｍ１１０Ｓマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス ・カンパニー（Ｍicrofluidics Ｃo.））中、５００kＰaで１０回のランにより 微小流体化して、アポ酵素を含有する直径約１００nmの有力な単層リポソームの 均質な群を形成する。 これらのシポソームをステニベックス（Ｓtenivex）−ＨＶフィルター（０.４ ５μ、ミリポア（Ｍillipore））を介して濾過し、次いで、スクロース２０gを 添加した後、凍結乾燥させる。 光散乱によって測定した（ゼータマスター（Ｚetamaster）、マルヴァーン・ インストゥルメンツ（Ｍalvern Ｉnstruments））リポソームの大きさは、１４ ８±５２nmである。アポ酵素の被包化の程度は、２０％のオーダーのものである ；合計量の残りは、遊離（被包されない）形態である。 ５.Ｂ．免疫化プロトコール ６〜８週齢スイス種（Ｓwiss）マウスを４つのグループに分け（マウス１０匹 ／グループ）、０日目、２８日目、および５６日目に、種々の経路により、前記 で得られた調製物を投与する。 ２つの免疫化プロトコールを試験す。それらは、以下のものである： １）皮下／胃内＋鼻腔／胃内＋鼻腔；および ２）胃内＋鼻腔、３回繰り返す。 投与量は、以下のとおりである；鼻腔経路による投与のために、使用直前に、 合計アポ酵素（被包したもの＋被包しないもの）１０μgに対応する量の凍結乾 燥物を生理食塩水（０.９％ＮaＣl）３０μl中に取る。これを外鼻孔に滴下投与 する。皮下経路による投与のために、同一の凍結乾燥物を生理食塩水３００μl と一緒にする。胃内経路による投与のために、合計アポ酵素（被包したもの＋被 包しないもの）４０μgに対応する量の凍結乾燥物を、０.２Ｍ ＮaＨＣＯ₃を補 足した生理食塩水（０.９％ＮaＣl）３０μl中に取る。１ml注射器に接続したカ ニューレを用いてこれを投与する。 最後の投与後１５日目に、マウスに適合したヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．py lori）菌株の微生物１０⁸個を用いて胃内胃管栄養法によりマウスに抗原投与 試験（Ｊatrox ＮＤ）を行う。取り出した後４時間目に、培地の光学密度を５５ ０nmで測定する。結果を第１０図に示す。 これらの結果は、用いたＤＣ−Ｃholの投与で完全な保護が得られなかった場 合でさえ、正の対照（空のリポソームを投与したマウス）と比較して、ウレアー ゼ活性の有意な低下、したがって、感染の減少が観察される。これらの結果は、 腰背領域に向けられた非経口経路（皮下；筋肉内経路も用いることができ、好都 合には、腹腔結節に、より特異的に向けることができる）による一次免疫化の長 所も示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主哺乳動物において粘膜エフェクター部位で抗原に対する防御免疫応答 を誘発するための医薬組成物であって、同時投与または連続投与のための、タン パクである抗原および抗原発現能を有する発現カセットから選択される免疫応答 誘発因子を各々含有する少なくとも２つの同一または異なる成分からなり；該成 分のうちの１つが、誘発因子が鼻−中咽頭または唾液腺における免疫応答のため のインデューサー部位に向けられるように経鼻口腔経路により投与されるように 製剤化され、他の成分が、免疫応答が求められるエフェクター部位での免疫応答 のために誘発因子がインデューサー部位に向けられるように鼻腔経路以外の好適 な粘膜経路により投与されるように製剤化されることを特徴とする医薬組成物。 ２．第１の成分が非経口経路により投与されるように製剤化される請求項１記 載の組成物。 ３．第３の成分が肺経路による投与のために製剤化される、宿主哺乳動物にお いて呼吸器系（気管支、鼻咽頭、肺）で抗原に対する免疫応答を誘発するための 請求項１または２記載の組成物。 ４．第３の成分が尿生殖経路による投与のために製剤化される、宿主哺乳動物 における腸および生殖器粘膜からなる群から選択される粘膜エフェクター部位で 抗原に対する免疫応答を誘発するための請求項１または２記載の組成物。 ５．第３の成分が胃経路を含む経口経路による投与のために製剤化される、宿 主哺乳動物において胃または腸で抗原に対する免疫応答を誘発するための請求項 １または２記載の組成物。 ６．第１の成分がさらに水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなど のアジュバントまたはＩＳＣＯＭタイプのアジュバントを含有する請求項１〜５ のいずれか１項記載の組成物。 ７．第２の成分がリポソームまたはマイクロスフェアなどの粒子の形態で製剤 化される請求項１〜６のいずかれ１項記載の組成物。 ８．第２の成分が直径０.０５〜５μmの粒子の形態で製剤化される請求項７記 載の組成物。 ９．第３の成分が肺経路または胃内経路を含む経口経路による投与のための、 リポソームまたはマイクロスフェアなどの粒子の形態で製剤化される請求項１〜 ８のいずれか１項記載の組成物。 １０．第３の成分が肺経路による投与のための、直径０.０５〜５μmの粒子の 形態で製剤化される請求項９記載の組成物。 １１．第３の成分が胃内経路を含む経口経路による投与のための、直径０.０ ５〜５μmの粒子の形態で製剤化される請求項９記載の組成物。 １２．第２または第３の成分がスプレイまたはエアロゾルである請求項１０ま たは１１記載の組成物。 １３．第３の成分が腸溶的に保護した調製物である請求項１〜１２のいずれか １項記載の組成物。 １４．第２または第３の成分が、さらに、細菌毒素の非毒性サブユニットまた は無毒化形態以外であり、かつ、リポソームまたはマイクロスフェア以外である 毒性を欠くアジュバントを含有する請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物 。 １５．第２または第３の成分がさらにＭＰＬＡを含有する請求項１〜１４のい ずれか１項記載の組成物。 １６．第１、第２または第３の成分に含有される誘発因子が抗原である請求項 １〜１５のいずれか１項記載の組成物。 １７．第２または第３の成分に含有される誘発因子が同一のものである請求項 １〜１６のいずれか１項記載の組成物。 １８．第１、第２および第３の成分に含有される誘発因子が同一のものである 請求項１７記載の組成物。 １９．第１の成分が皮下経路、皮内経路または筋肉内経路による投与のために 製剤化される請求項２〜１８のいずれか１項記載の組成物。 ２０．抗原が宿主哺乳動物についての病原である細菌の抗原である請求項１〜 １９のいずれか１項記載の組成物。 ２１．抗原がヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）抗原である請 求項５または２０記載の組成物。 ２２．抗原がヘリコバクター・ピロリ（Ｈ.pylori）ウレアーゼのアポ酵素で ある請求項２１記載の組成物。