ES2267101T3 - Vacuna contra virus de inmunodeficiencia felina. - Google Patents

Vacuna contra virus de inmunodeficiencia felina. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN VACUNAS QUE CONTIENEN TANTO SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PARA LA PROTEINA FIV GAG, COMO UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA FIV ENV. LAS PROTEINAS GAG Y ENV SON EXPRESADAS PREFERENTEMENTE POR SISTEMAS DE EXPRESION DE BACULOVIRUS QUE CONTIENEN LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PARA LAS PROTEINAS FIV GAG Y ENV. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS DE INOCULACION PARENTERAL/PARENTERAL, MUCOSA/MUCOSA, Y MUCOSA/PARENTERAL COMBINADOS.

Description

Vacuna contra virus de inmunodeficiencia felina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a los campos de la inmunología y la genética recombinante. Más específicamente, la invención se refiere a una vacuna recombinante que incluye tanto las secuencias de ADN que codifican la envuelta viral y las proteínas gag del virus de inmunodeficiencia felina y procedimientos para usar vacunas basadas en estas secuencias codificadas de ADN.
Antecedentes de la invención
El virus de inmunodeficiencia felina (FIV), llamado originalmente lentivirus linfotrófico T felino, se aisló por primera vez en 1986 a partir de una gran familia de gatos en Petaluma, California (Pederson y col., Science (1987) 235:790). El FIV se ha clasificado como un miembro de la subfamilia Lentiviridae dentro de la familia Retroviridae. Esta es la familia que incluye los virus de inmunodeficiencia humana y de simios, anemia infecciosa equina, maedi visna de ovejas y el de la artritis encefalitis caprina (CAEV). El genoma del FIV se organiza como el de otros lentivirus con tres largos marcos de lectura abiertos que corresponden a gag, pol y env (Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743; Olmsted y col., Proc Natl. Acad. Sci. (1989) 86:2448). El gen gag codifica los principales componentes estructurales del virus, el gen env codifica la envuelta glicoproteica, y el gen pol codifica la proteína polimerasa.
El gen gag se expresa como una poliproteína de 50 kD que se procesa dentro de tres subunidades: una proteína matriz p15, una proteína de la cápsida p24 y una proteína de la nucleocápsida p10. El gel pol codifica tres proteínas: la proteasa, la transcriptasa inversa y una proteína p14.6 de función desconocida. El autoprocesamiento por la parte proteasa del gen da origen a las tres proteínas de la región pol. Adicionalmente, la proteasa es responsable del procesamiento del precursor de gag. El gen pol se expresa como una proteína de fusión gag-pol. El gen de la envuelta se expresa como una glicoproteína de 160 kD, gp160. La antigenicidad de las proteínas del núcleo de FIV es similar a la de otros lentivirus.
Los estudios indican que la edad media de gatos infectados por FIV en la población general es de aproximadamente 3 años, mientras que la edad media de los gatos infectados con FIV enfermos crónicos es de aproximadamente 10 años de edad (Shelton y col., J. Am. Anim. Hosp. Assoc. (1989) 25:7). Las secuelas clínicas de infección por FIV en los gatos se han dividido en cinco etapas. Etapa I, la fase primaria, es bastante variable con algunos animales mostrando grados de fiebre, neutropenia, linfadenopatía generalizada, diarrea y depresión. Los animales en esta etapa, normalmente no los reconocen los dueños como enfermos y los síntomas enumerados anteriormente se han reconocido de forma variable en infecciones experimentales. La mortalidad es baja y, a pesar de recuperarse de esta fase, virtualmente todos los gatos se convierten en vehículos de por vida. La viremia es de lejos el síntoma más consistente asociado con esta fase.
Durante la Etapa II, aún puede encontrarse el virus en la sangre de los gatos y es ahora cuando evolucionan las principales anormalidades en las cantidades circulantes de células T CD4+ y CD8+. Es durante la Etapa III cuando muchos gatos se presentan por primera vez a los veterinarios con síntomas que varían desde síntomas clínicos vagos como fiebre recurrente, pérdida de peso y anorexia, a animales que muestran indicios obvios de infecciones secundarias crónicas u oportunistas que pueden incluir infecciones crónicas de la cavidad bucal, enteritis crónica, infecciones respiratorias crónicas, conjuntivitis crónica e infecciones bacterianas del tracto urinario y de la piel. La Etapa IV está dominada por las infecciones secundarias crónicas descritas en la Etapa III con pérdida de peso adicional y anormalidades hematológicas. Finalmente, en la Etapa V, la salud de los gatos se deteriora adicionalmente durante un periodo de meses a años, y unos pocos animales supervivientes pueden desarrollar una afección análoga al síndrome de inmunodeficiencia adquirida humano (SIDA) con infecciones oportunistas en muchos puntos del cuerpo.
El virus se replica de forma óptima en células mononucleares de la sangre y tiene un tropismo para los linfocitos T, macrófagos peritoneales, macrófagos del cerebro y astrocitos. En común con otros retrovirus, el material genético de FIV está constituido de ARN y la producción de una copia de ADN del ARN viral es una etapa esencial en la replicación del FIV en el huésped. Esta etapa requiere la enzima transcriptasa inversa que se transporta dentro del huésped por el virus invasor. La versión de ADN del genoma viral se inserta en el material genético de células huésped infectadas en las que continúa residiendo como un provirus. Este provirus se replica cada vez que la célula se divide y puede codificar la producción de nuevas partículas de virus. Las células infectadas por FIV permanecen infectadas durante todo su margen de vida.
El virus parece extenderse mediante transmisión horizontal, predominantemente mediante heridas de mordedura de un gato infectado puesto que estos animales derraman cantidades apreciables de virus en la saliva (Yamamoto y col., Am. J. Vet. Res. (1988) 8:1246). Se ha informado de la transmisión vertical, pero es rara. Dado este modo de transmisión, es teóricamente posible dar una medida de protección con anticuerpos.
En estos momentos, no existen vacunas disponibles en el mercado que proporcionen protección contra la infección por FIV. El trabajo reciente sugiere que los gatos inmunizados con células infectadas completas o virus sin células están protegidos contra la exposición y que esta protección está en correlación en gran medida con la presencia de anticuerpos neutralizantes de suero (Yamamoto y col., J. Virol. (1993) 67:601; Yamamoto y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1991) 7:911). Una desventaja de estos sistemas, sin embargo, es que el uso de vacunas inactivadas no excluye completamente la transmisión iatrogénica de FIV. Otra desventaja de usar preparaciones inactivadas es que generalmente no proporcionan la presentación correcta del antígeno de FIV para el desarrollo de células T citotóxicas. Otros investigadores se han centrado sobre enfoques recombinantes para desarrollar una vacuna para FIV, en forma de vacunas de subunidad o de vectores virales. El documento WO 92/15684 representa dicho esfuerzo.
El documento WO 92/15684 informa de la clonación y expresión de la proteína de la envuelta glicoproteína (gp) 160, la proteína de la envuelta gp120 y la proteína gag p24 deFIV y sugiere que estas proteínas son útiles en el diagnóstico, tratamiento y prevención de FIV. Específicamente, sugiere usar proteínas recombinantes de la proteína de la envuelta gp160 o de la proteína gag para desarrollar vacunas para la prevención de la infección por FIV en gatos. Resúmenes de presentaciones realizadas por los inventores del documento WO 92/15684, o sus colaboradores, en el Internacional Symposium on Feline Retrovirus Research, Research Triangle Park, North Carolina, Estados Unidos, del 6-9 de octubre de 1993, revelan que aunque su producto de gen env de FIV recombinante induce altos títulos de anticuerpo de ELISA, estos altos títulos no están en correlación con la neutralización de virus o con la protección de la infección por FIV.
Por tanto, permanece una necesidad continua de una vacuna recombinante que produzca un producto de FIV no infeccioso y que elimine la necesidad de inactivar vacunas de células completas infectadas con FIV, mientras proporciona buenos niveles de protección. Además de este uso profiláctico, las vacunas pueden también ser útiles para inmunoterapia de post-exposición. Por ejemplo, las vacunas contra la rabia actuales se dan a individuos después de la exposición potencial al virus de la rabia. Puesto que el FIV tiene un largo periodo de latencia entre la infección y el desarrollo de la enfermedad, la inmunoterapia podría ser también valiosa en la detención del desarrollo de una enfermedad de FIV en gatos infectados.
Cole GE y col., J. Virol. (1990) 64:4930, informan de la expresión de la envuelta del virus de la leucemia felina y de proteínas gap en herpesvirus felinos recombinantes
Olmsted y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:2448, informan de la clonación molecular de virus de la inmunodeficiencia felina.
Olmsted y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:8088, informan de un análisis de secuencia de nucleótidos de virus de inmunodeficiencia felina y describen la organización del genoma y las relaciones de FIV con otros lentivirus.
Pederson y col., Science (1987) 235:790, informan del aislamiento de un virus linfotrófico T de gatos domésticos con un síndrome similar al de la inmunodeficiencia.
Shelton y col., J. Am. Anim. Hosp. Assoc. (1989) 25:7, informan de la prevalencia de las infecciones por virus de inmunodeficiencia felina y virus de leucemia felina en gatos domésticos.
Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743, informan de la secuencia de nucleótidos y la organización del genoma del virus de inmunodeficiencia felina.
Yamamoto y col., J. Virol (1993) 67:601, informan de la protección experimental contra cepas homólogas y heterólogas del virus de inmunodeficiencia felina.
Yamamoto y col., AIDS Res, Hum. Retroviruses (1991) 7:911, informan de la protección con una vacuna experimental contra virus de inmunodeficiencia felina.
Nunberg y col., J. Virol. (1989) 63:3240, informan de la creación de un vector de herpesvirus felino (FHV) con la timidina quinasa delecionada.
Hu y col., Science (1992) 255:456, informan de la protección de macacos contra la infección por SIV mediante vacunas de subunidad de la glicoproteína de la envuelta de SIV gp160.
Lutz y col., "Vaccination of Cats with Recombinant FIV env-gene Products," international Symposium on Feline Retrovirus Research, Research Triangle Park, North Carolina, Estados Unidos, 6-9 de octubre de 1993, informan que, aunque es relativamente fácil inducir altos títulos de anticuerpo de ELISA usando productos del gen env recombinantes (baculovirus y E. coli) los títulos de anticuerpos de ELISA no están en correlación con la neutralización del virus y con la protección.
Morikawa y col., Virology (1991) 183:288, informan de la expresión de una proteína gag de FIV en un sistema de expresión de baculovirus.
El documento WO 93/08836 describe un procedimiento para potenciar la inmunogenicidad de una glicoproteína de la envuelta del virus de inmunodeficiencia felina (FIV) en un huésped, que comprende administrar al huésped una vacuna viva recombinante que comprende un microorganismo recombinante, tal como un virus o una bacteria, modificado para expresar la glicoproteína de la envuelta y un péptido seleccionado entre los antígenos env, pol, gag, nef y vif.
El documento WO 94/06921 describe procedimientos para tratar o prevenir infecciones por FIV que comprenden administrar a un felino una construcción vector que dirige la expresión de al menos una parte inmunogénica de un antígeno de FIV seleccionado entre el grupo constituido por p15gag, p24gag, p10gap, p13pol, p62pol, p15pol, p36pol o pg68 env y gp27 env, de modo que se genere una respuesta inmune celular. Las construcciones se llevan mediante retrovirus recombinantes o mediante un virus recombinante seleccionado entre el grupo constituido por virus, adenovirus, herpesvirus, etc.
El documento WO 94/06471 describe vacunas para FIV que comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende una porción completa del gen env de FIV que codifica residuos de la proteína de la envuelta de FIV. Las secuencias de ADN que codifican la proteína env de FIV pueden usarse para preparar composiciones de vacuna para estimular una respuesta inmune en un felino contra FIV, administrando al animal un vector de expresión capaz de expresar los polipéptidos en cuestión, de modo que los polipéptidos inmunogénicos se expresan in situ en el
animal.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, una vacuna contra virus de la inmunodeficiencia felina recombinante (FIV) comprende un sistema de expresión de baculovirus para expresar la proteína gag de FIV y la proteína env de FIV.
La vacuna puede comprender un vector de replicación, para expresar las proteínas de las secuencias de ADN que codifican las proteínas gag y env de FIV. Entre los vectores de replicación disponibles están los herpes-, pox-, adeno-, retro- y paramixo- virus, prefiriéndose el herpesvirus como el vector de replicación. Otros vectores de replicación disponibles son las bacterias de salmonella.
La vacuna se adapta preferiblemente para la administración parenteral o mucosal.
La vacuna puede usarse para vacunar un gato contra HIV. Puede usarse junto con cualquier otra vacuna de virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína gag de FIV y una secuencia de ADN que codifica una proteína env de FIV.
Un recombinante preferido comprende un procedimiento de inoculación mucosal/parenteral donde hay una primera inoculación mediante administración mucosal de una vacuna de env de FHVFI y de gag de FHVFI, seguida de una segunda inoculación mediante administración parenteral de la vacuna de baculovirus recombinante.
Más particularmente, la invención proporciona la administración mucosal de una proteína gag y env mediante el vector FHV a un gato, seguida de administración subcutánea de una proteína gag y env producida por el baculovirus recombinante.
También se proporcionan kits de inmunización adecuados para uso en el procedimiento de la invención.
Descripción detallada de la invención
Las secuencias gag y env de FIV usadas en la construcción de baculovirus recombinante se obtuvieron de un clon proviral infeccioso del virus de inmunodeficiencia felina, FIV-14. Este clon se obtuvo originalmente de la cepa Petaluma silvestre. La situación y las secuencias de los genes que codifican gag y env de FIV, así como las secuencias de proteínas codificadas por ellas, se conocen y pueden aislarse siguiendo técnicas bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743; Olmsted y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:2448). La numeración de la secuencia es como se ha descrito en Olmsted RA y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:8088 (número de acceso al GenBank M25381).
Como alternativa, pueden usarse estas secuencias publicadas para gag y env para sintetizar químicamente los genes usando un aparato diseñado para este fin, siguiendo técnicas bien conocidas en la técnica. Usando técnicas recombinantes, los genes que codifican gag y env de FIV, o partes inmunogénicas de los mismos, se han transformado en plásmidos y por tanto, los genes pueden obtenerse convenientemente, de dicha fuente, y se obtienen preferiblemente en los vectores de transferencia de la invención. Plásmidos ejemplares son pVLFIgag* (que codifica el gen gag) y pVLFIenv (que codifica el gen de la envuelta). Se siguieron procedimientos generales de subclonación como los descritos en Sambrook, y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
El sistema del vector de expresión de baculovirus (BEVS) se conoce bien en la técnica como un sistema recombinante conveniente de expresión de genes que en algunos casos ha demostrado producir grandes cantidades de proteína heteróloga. En resumen, BEVS usa vectores de expresión para insertar genes heterólogos dentro del genoma del baculovirus en una posición tal que el gen se expresará bajo el control de los elementos reguladores del baculovirus. Se permite al baculovirus infectar una línea celular de insecto cultivada, donde se expresa la proteína heteróloga.
Varios grupos usando BEVS han expresado las glicoproteínas de la superficie de dos retrovirus. Además, Morikawa y col., Virology (1991) 183:288-297, informan de la expresión de gag de FIV en el sistema de baculovirus. BEVS se revisa en detalle por Luckow, V.A., Cloning and expression of heterologous genes in insect cells with baculovirus vectors, en Recombinant DNA Technology and Applications, Eds. C. Ho, A. Prokop, y R. Bajpai (1990) McGraw-Hill, New York, y Luckow, V.A. y Summers, M.D. Bio/Technology 6:47-55 (1988). Para la construcción del baculovirus recombinante de la invención se usa el procedimiento descrito en detalle en la última publicación.
Aunque existe una gran cantidad de especies conocidas de baculovirus, el virión preferido para uso en BEVS es el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica, también conocido como AcNPV o AcMNPV. El AcNPV infecta más de 30 variedades de células de Lepidópteros, siendo el huésped preferido la línea celular Sf9 de Spodoptera frugiperda.
Los genes ajenos a insertar en baculovirus usan plásmidos que contienen un sitio de clonación flanqueado por ADN de baculovirus. La célula huésped cultivada se co-transfecta con este plásmido y con ADN genómico de baculovirus silvestre, que recombina para producir un genoma viral que lleva el gen heterólogo. Los procedimientos y condiciones mediante los cuales se produce la co-transfección se conocen bien en la técnica. Ejemplos incluyen co-precipitación con fosfato de calcio (Graham, F. L. y van der Eb, A. J., Virology 52:456-467 (1973)), protamina (Wienhues, U, y col, DNA (NY) 6:81-89 (1987)), lipofectina (Bio-techniques 11:310-312) y electroporación (Mann, S. G. y King, L A., J. Gen. Virology 70:3501-3505 (1989)). Se usa el procedimiento del fosfato de calcio, descrito con más detalle a continuación, que es el procedimiento de transfección preferido para producir el baculovirus recombinante de la invención.
Típicamente, el gen heterólogo se dirige para la inserción en el gen poliedro, un gen que no es esencial para la replicación o producción de virus extracelular. Esto se consigue generalmente incluyendo en el plásmido ADN del vector baculovirus de transferencia que codifica el promotor del poliedro y secuencias de ADN 3' y 5' que flanquean al promotor del poliedro. Los genes ajenos se insertan después dentro del vector de transferencia cadena abajo del promotor usando las técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Se conocen una amplia diversidad de vectores de transferencia adecuados, que podrían ser adecuados para uso en las realizaciones de la invención. Entre estos están pACYMI, pEV55, pAC373, pACRP, pEVIV, pEV51, y pVL941; el vector preferido es pVL941. Además, los dos genes gag y env podrían insertarse en un único virus usando varios de los vectores de sitio de clonación múltiple que están disponibles. Ejemplo de vectores de sitio múltiple adecuados incluye p2XIVVI^{-}X3, pXIVVI^{-}, pSyn nWTVI^{-} (como se describe en Gene 100:131-137 (1991)), o pACVC2, como se describe en Protein Engineering 1: 359-366(1987).
El baculovirus recombinante de la invención puede identificarse mediante exploración visual seguida de hibridación de ADN dot blot, técnicas de afinidad celular, hibridación en placas, u otras técnicas conocidas en la técnica. El baculovirus recombinante de la invención puede también incluir proteínas para las que hay sustratos cromogénicos y/o enzimáticos para facilitar la identificación y purificación. El procedimiento preferido es la exploración visual de recombinantes puesto que los recombinantes carecen de los cuerpos de oclusión característicos de los baculovirus silvestres; la exploración visual es una técnica que se conoce bien en la técnica. Se toman después los morfolitos que carecen de oclusión, y se sitúan en una placa de 96 pocillos para hibridación dot blot de ADN. La técnica de hibridación se conoce bien en la técnica de la tecnología del ADN recombinante y no requiere mención especial. Es preferible purificar y caracterizar más completamente varios de los virus que corresponden a las señales de hibridación más fuertes.
Los baculovirus recombinantes de la invención pueden propagarse en cualquier cantidad de líneas celulares de insectos cultivadas de forma continua, más típicamente, Anticarsa gemmitalis (oruga de la soja), Bombyx mori (gusano de seda), Estigmene acrea (gusano peludo), Heliothis virescens (cogollero del tabaco), Leucania separata, Lymantria dispar (lagarta peluda), Malacasoma disstria (oruga del álamo temblón), Mammestra brassicae (gusano del repollo), Manduca sexta (palometa del tabaco), Plutella zylostella (polilla de dorso de diamante), Spodoptera exigua (garadama), y Spodoptera littoralis. La línea celular de insecto preferida para la propagación del baculovirus recombinante de la invención es Sf-9 de Spodoptera frugiperda. Además del sistema de expresión de baculovirus, otros sistemas de expresión génica que pueden usarse en la presente invención incluyen sistemas de expresión de E. coli, levaduras, y CHO.
Un sistema alternativo para introducir inmunógenos en huéspedes son vectores de replicación bien conocidos, tales como el herpesvirus felino. Los genes a expresar en un vector de herpesvirus felino se sitúan bajo el control de un promotor heterólogo y se insertan en el genoma del herpesvirus. Típicamente, los genes a expresar se insertarán dentro del locus de timidina quinasa, permitiendo la selección de los virus recombinantes mediante la pérdida de la función de timidina quinasa. El herpesvirus felino recombinante se usa después para infectar directamente el animal, donde la replicación permite la expresión de los genes insertados. Virus de replicación alternativos que pueden usarse incluyen pox-, adeno, paramixo-, y retrovirus. Además, pueden usarse bacterias de salmonella como vectores de
replicación.
El inmunógeno puede prepararse en forma de dosificación de vacuna mediante procedimientos bien conocidos que incluyen la inoculación directa de plásmidos que contienen ADN que codifica el inmunógeno ("vacunas de ADN desnudo").
Una vacuna preparada utilizando las glicoproteínas de la presente invención puede estar constituida de células huésped fijadas, un extracto de célula huésped, una preparación de glicoproteínas de FIV parcial o completamente purificadas a partir de las células huésped o producidas por síntesis química. El inmunógeno de glicoproteína de FIV preparado de acuerdo con la presente invención es preferiblemente sin virus FIV intacto. Por tanto, el inmunógeno de vacuna de la invención se compone básicamente en su totalidad de los polipéptidos de FIV inmunogénicos deseados que demuestran antigenicidad para FIV.
La vacuna puede administrarse después por vía parenteral o por vía mucosal. Para la administración parenteral, tal como inyección intramuscular o subcutánea, el inmunógeno puede combinarse con un vehículo adecuado, por ejemplo, puede administrase en agua, vehículos de suero salino o tamponados con o sin diversos adyuvantes o agentes inmunomoduladores, incluyendo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato potásico de aluminio (alumbre), sulfato de berilio, sílice, caolina, carbono, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, muramil dipéptido, endotoxina bacteriana, lípido X, Corynebacterium parvum (Propionibacterium acnes), Bordetella pertussis, polirribonucleótidos, alginato de sodio, lanolina, lisolecticina, vitamina A, saponina, liposomas, levamisol, DEAE-dextrano, copolímeros bloqueados u otros adyuvantes sintéticos. Dichos adyuvantes están disponibles en el mercado de diversas fuentes, por ejemplo, adyuvante de Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Otro adyuvante adecuado es el Adyuvante Incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Otras vacunas pueden prepararse de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica, como se muestra, por ejemplo, en I. Tizard, An introduction to Veterinary Immunology, 2ª ed. (1982), que se incorpora en este documento como referencia.
Para administración parenteral, la proporción de inmunógeno y adyuvante puede modificarse en un amplio intervalo siempre que ambos estén presentes en cantidades eficaces. Por ejemplo, el hidróxido de aluminio puede estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,5% de la mezcla de vacuna (base de Al_{2}O_{3}). En una base por dosis, y dependiendo de la pureza y la inmunogenicidad del antígeno, la concentración del inmunógeno puede variar de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 100 mg por gato. La concentración de inmunógeno y volumen a administrar preferidos variará dependiendo de la edad y el peso del huésped, así como de otros factores conocidos por los especialistas en la técnica de técnicas de vacunación. Por ejemplo, en gatos, un intervalo preferible es de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 1,0 mg; un tamaño de dosis adecuado es de aproximadamente 0,5-5 ml, preferiblemente aproximadamente 1,0 ml. Por consiguiente, una dosis para inyección, por ejemplo, comprendería 1 ml que contiene 1,0 mg de inmunógeno en una mezcla con hidróxido de aluminio al 0,5%. También pueden prepararse formas de dosificación comparables para administración parenteral a mamíferos inmaduros, pero la cantidad de inmunógeno por dosis puede ser más pequeña, en cachorros de gato, por ejemplo, aproximadamente el 0,25 a aproximadamente 1,0 ml por dosis.
Para administración mucosal, el inmunógeno puede combinarse con un vehículo adecuado, por ejemplo agua, solución salina, o vehículos tamponados. Además, pueden añadirse varios agentes inmunomoduladores conocidos en la técnica para potenciar específicamente la respuesta inmune mucosal. Dichos agentes incluyen toxina del cólera o partes de la misma, DEAE-dextrano, interleuquinas (por ejemplo, IL-5), toxina LT de E. coli, toxina Shiga, y otras toxinas de organismos gram negativo. Una vez formuladas, dichas vacunas pueden introducirse en cualquier superficie mucosal, típicamente y más convenientemente en los orificios nasales y/o orofaringe, usando dispositivos adecuados para este fin, por ejemplo, goteros con una pequeña cánula nasal, mediante pulverización, etc. La concentración de inmunógeno, así como el tamaño de dosis para administración mucosal es similar al usado para administración parenteral.
La vacunación puede conseguirse siguiendo un régimen de dos dosis como se describe en el documento WO 9208427; en una primera realización, el régimen de dos dosis comprende una primera dosis administrada a una membrana mucosal, como se ha descrito anteriormente, seguida de una segunda dosis administrada por vía parenteral. Siguiendo este aspecto de la invención, la segunda dosis se administra algún tiempo después de la primera inoculación mucosal. El periodo de tiempo que debe transcurrir entre la primera inoculación mucosal y la segunda y posterior, inoculación parenteral, depende de la edad, peso, estado de salud, etc. del huésped, el virus contra el que se busca protección, la inmunogenicidad de las vacunas respectivas, etc. Se reconoce bien que, en condiciones normales, la administración mucosal normalmente podría normalmente, pero no siempre, comprender un agente de replicación, es decir, un virus o bacteria recombinante vivo, permitiendo a los antígenos acceder al sistema inmune. Además, la segunda inoculación parenteral puede estar constituida de un agente replicante o un agente no replicante. Sin embargo, este protocolo no es el modo exclusivo de suministrar un antígeno puesto que los antígenos no replicantes pueden suministrarse al sistema inmune mucosal, por ejemplo mediante la encapsulación de los antígenos en microesferas. Estos y otros factores se conocen bien en la técnica, y la determinación del peso y la importancia relativa de cualquiera de estos factores está dentro de la consideración rutinaria de un especialista en la técnica.
El procedimiento doble es eficaz contra virus que muestran una respuesta inmunogénica compartimentalizada, es decir, virus que entran dentro del huésped mediante un sitio de mucosa pero que también se replican sistemáticamente. El procedimiento doble es también eficaz contra organismos, tales como virus de inmunodeficiencia felina, que se replican de forma predominante en el sitio de mucosa o en el sitio parenteral.
Este régimen de dosificación doble de la invención puede también realizarse administrando los dos componentes de vacuna simultáneamente en sus sitios apropiados. La administración a los dos sitios exactamente al mismo tiempo, se reconoce por los especialistas en la técnica como improbable, y por tanto, el periodo de tiempo para la administración simultánea incluye el retraso que puede experimentarse, mientras, por ejemplo, el huésped se prepara para la segunda dosis, la segunda dosis se preparara para la administración, se observa el huésped para signos de agotamiento después de la administración de la primera dosis, etc. Por tanto, cuando se sigue el procedimiento de administración simultánea de la invención, un gato, por ejemplo, recibiría una dosis adecuada de una formulación de vacuna apropiada por vía intranasal y/o por vía oral y una vacunación intramuscular simultánea con una vacuna apropiada.
Cuando las vacunas se administran siguiendo los procedimientos dobles de la invención, las vacunas pueden contener el mismo componente inmunogénico fabricado o presentado en el mismo o en diferentes vectores o formulado en el mismo o diferente vehículo. Se cree que una administración doble simultánea como se acaba de describir proporciona estimulación a los dos compartimentos inmunogénico y por tanto disminuye la necesidad de una segunda dosis posterior.
En una segunda realización, la vacunación con las vacunas para FIV de la invención puede también realizarse siguiendo regímenes tradicionales. Típicamente, se administra una primera dosis en un sitio parenteral, o más raramente en el caso de algunas vacunas, en un sitio mucosal. La elección del sitio de la primera inoculación depende del animal a tratar así como de la disponibilidad y adecuabilidad de la vacuna para este sitio. Después de un periodo de tiempo adecuado, se administra una segunda dosis. Tradicionalmente, la segunda dosis se administra en el mismo sitio que la primera, es decir, si la primera es mucosal, la segunda es mucosal. La decisión de qué sitio es apropiado para la administración inicial, la necesidad de y el periodo de tiempo antes de una segunda dosis, la dosis a dar, etc. son factores conocidos y comprendidos por un especialista en la técnica de vacunación de mamíferos.
Por ejemplo, cuando se vacunan gatos, la primera dosis puede darse a las 6-10 semanas de edad. La segunda dosis de la vacuna debe entonces administrarse alguna semana después de la primera dosis, por ejemplo, aproximadamente 2 a 4 semanas después. Como alternativa, la vacuna puede administrarse como una única dosis de 1 ml, por ejemplo, a aproximadamente 6-10 semanas de edad. Sin embargo, se considera preferible un régimen de dos dosis para una inmunización del gato más eficaz. Se recomienda la revacunación anual. Los adultos pueden revacunarse en cualquier momento. Los cachorros de gato nacidos de adultos sin vacunar pueden vacunarse a aproximadamente 3-10 días y otra vez a 4-6 meses y anualmente en lo sucesivo.
Las vacunas para FIV de la invención, así como las vacunas conocidas, cuando se administran siguiendo técnicas tradicionales o cuando se administran siguiendo el procedimiento doble del documento WO 9208427, pueden combinarse con otras vacunas para otras enfermedades para producir vacunas multivalentes. Además, las vacunas de la invención, así como las vacunas conocidas, cuando se administran siguiendo técnicas tradicionales o cuando se administran siguiendo el procedimiento doble de la invención, pueden también combinarse con otros medicamentos, por ejemplo, antibióticos.
Una "partícula similar a un virus" es una partícula producida por células de insecto infectadas con baculovirus que se parece a una partícula de FIV inmaduro en densidad (en cromatografía) y en tamaño, forma y estructura del anillo (en análisis EM).
Las técnicas de biología molecular, de virología y de cultivo celular descritas en la construcción de los baculovirus recombinantes y los herpesvirus felinos recombinantes que expresan los antígenos de inmunodeficiencia felina están dentro de las capacidades de la técnica. La bibliografía que describe estas técnicas podría incluir Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2ª edición, 1989); Ausubel, y col., Current Protocols in Molecular Biology (1987); O'Reilly, y col,, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992); Practical Molecular Virology (Collins, ed., 1991); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Freshney, ed., 2ª edición, 1989); J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972); D. A. Morrison, Transformation and Preservation of Competent Bacteria! Cells by Freezing, Methods Enzymol. 68:326-331 (1979); J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons (1984), y M. D. Summers y G. E. Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin Nº. 1555 (1987), todas las cuales se incorporan como referencia. Excepto donde se indique, todas las enzimas de restricción, productos químicos, y materiales, o sus equivalentes, están disponibles fácilmente de proveedores comerciales. La restricción de endonucleasa sigue las recomendaciones del fabricante.
Sin elaboración adicional, se cree que un especialista en la técnica puede, usando la descripción precedente, llevar a la práctica la presente invención en su alcance completo. Los siguientes ejemplos detallados describen como construir las diversas vacunas recombinantes de la invención y/o realizar los diversos procedimientos de la invención y se deben interpretar como meramente ilustrativos, y de ninguna manera en absoluto como limitaciones de la descripción precedente. Los especialistas en la técnica reconocerán fácilmente variaciones apropiadas de los procedimientos tanto de los reactivos como de las condiciones y técnicas de reacción.
Materiales y procedimientos Células, virus, y plásmidos
El baculovirus parental Autographica californica virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV), cepa E2, se obtiene de Max Summers (Texas A & M University). La línea celular de Spodoptera frugiperda, Sf-9, se obtiene de la American Type Culture Collection (CRL 1711). El plásmido pSP72 se obtuvo de Promega Biotec. El plásmido p3CL-DHFR se obtuvo de Fred Homa (The Upjohn Company). El plásmido pGC113 se obtuvo de Jack Nunberg y se describe en Nunberg y col., J. Virol. (1989) 63:3240.
El plásmido p3CL-DHFR es un vector basado en pUC18 construido para la expresión de genes heterólogos en células eucariotas. Usa la secuencia promotora inmediata y líder (secuencias -1140 a + 74 en relación al sitio de inicio de la trascripción) de citomegalovirus humano (CMV) para dirigir la trascripción. Se usa un fragmento BamHI-BgIII de 550 pares de bases que contiene secuencias de hormona del crecimiento bovina para suministrar las funciones de poliadenilación. El vector contiene sitios HindIII y SalI únicos entre el promotor de CMV y las secuencias de poliadenilación bGH para inserción de genes ajenos.
La línea celular FIV-14 se obtuvo de la cepa Petaluma de tipo silvestre (Olmsted y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:8088 (1989). Las células, virus parentales y virus recombinantes se propagan mediante procedimientos descritos en detalle en Texas Agricultural Experimental Bulletin No. 1555 (1987).
El plásmido pVL941 se describe por Luckow, V. E. y M.D. Summers, Virology 170:31-39 (1989).
Animales
Se usan en todos los experimento dieciocho gatos libres de patógenos específicos de aproximadamente 12 semanas de edad. Los animales se alojan en una instalación de contención en tres grupos de seis animales cada uno, y se alimentaron con comida para gatos y agua ad libitum.
Análisis de transferencia de Western
Para el análisis de transferencia de Western, se separan alícuotas de cada fracción de los gradientes usando SDS PAGE convencional después de electroforesis, las proteínas se electrotransfieren en 0,22 \mum de nitrocelulosa siguiendo el procedimiento de Towbin, H., y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979). Los sitios sin ocupar de la nitrocelulosa se bloquean mediante incubación secuencial en PBS que contiene un 5% de leche desnatada seca (NFDM). Las transferencias se incuban con el anticuerpo primario y el desarrollo de color realizado como se describe por Hink, W.F., y col, Biotechnology Progress 7:9-14 (1991). Se usó suero de gatos convalecientes de gatos experimentales infectados con FIV para detectar las proteínas gag y env en las transferencias de Western.
Preparación de antígeno para uso como vacuna
Células de Spodoptera frugiperda (Sf-9) en matraces de agitación se infectan a una densidad celular de 1x10^{6} células/ml en una multiplicidad de infección de 5 unidades formadores de placa (pfu)/célula. Las células se infectan con los siguientes virus recombinantes: AcNPVFIgag* o AcNPVFIenv, o se co-infectan con AcNPVFIgag* y AcNPVFIenv. Cada cultivo se recoge 66 horas después de la infección. Las células infectadas se separan del medio de cultivo mediante centrifugado a baja velocidad y se almacenan congeladas hasta el uso.
Los recombinantes de CHV que expresan los genes gag o env de FIV se hacen crecer en células CRFK y se recogen 3 días después de la infección. Después de clarificar para retirar los restos de células, se titula el fluido sobrenadante y se almacena a -70ºC antes del uso. La vacuna se formula para contener 10^{5}-10^{7} pfu/ml.
Ensayos de laboratorio
Los niveles de p24 en gatos se miden usando un kit disponible en el mercado (IDEXX, Portland, ME). p24, un antígeno específico de grupo de FIV, se encuentra en la sangre de animales infectados persistentemente, y de este modo puede usarse como un ensayo para viremia. La estandarización en el laboratorio indicó que dentro del contexto de sueros positivos y negativos conocidos, los valores de D.O. de \geq 0,25 son positivos para viremia.
El análisis de PCR de los PBMC de gatos ser realizó usando dos pares de cebadores anidados durante dos rondas de amplificación en el ciclador térmico (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.). Las secuencias del cebador de oligonucleótidos usado en PCR y como sondas para transferencia de Southern se seleccionaron de los datos de secuencia de FIV (Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743 y Olmsted y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:2448). Cada ronda de amplificación estaba constituida por 30 ciclos (Ronda 1: 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1,5 min, 72ºC durante 2 min, 0,1 ml de volumen final de ciclado; Ronda 2: 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1,5 min, 72ºC durante 1 min, 0,05 ml de volumen final de ciclado) donde la ronda 1 empieza con el ADN genómico y la ronda 2 amplifica una muestra de 0,01 ml de cada una de las reacciones de la primera ronda.
Las muestras se analizaron después sobre un gel de agarosa al 0,9% en un tampón TBE cargando 0,05 ml del producto de la ronda 2 de PCR. El producto de ADN de 804 pb se visualizó mediante una tinción de bromuro de etidio y se confirmó por transferencia de Southern.
Después de la electroforesis, la transferencia del ADN a nitrocelulosa se realizó de acuerdo con procedimientos convencionales (Sambrook, J., E.F, Fritsch, y T. Maniatis, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). La hibridación del filtro se realizó usando sistema de oligomarcado-3' de Amersham con detección no radioactiva usando quimioluminiscencia potenciada (ECL). En la reacción de ECL, la peroxidasa de rábano rusticano cataliza la oxidación de luminol para detectar sondas que tiene fluoresceína-dUTP en el extremo 3' y que hibridan con las secuencias diana en los filtros. Usando la sonda PJD 83: 5'- ACA TCC CCC TGA TGC TCC CAG ACC ATT ACC -3' (Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743) [SEC ID Nº: 3] a una concentración de 10 ng/ml, la membrana hibridó a 55ºC durante 2 horas.
Ejemplo 1
Expresión de genes gag y env de FIV A. Clonación del gen gag en el vector de expresión de baculovirus recombinante
Para construir un baculovirus recombinante que exprese el producto del gen gag de FIV, el clon proviral infeccioso pFIV14 se digiere con Hinc II y Eco RV para liberar un fragmento de 1450 bases (bases 599-2049) que contiene el gen gag. Este fragmento se subclona en el vector pSP72, se digiere con Sma I y se desfosforila con fosfatasa intestinal de ternero (CIP). El plásmido intermedio resultante (denominado D4) se digiere después con BgI II y Bam HI para liberar el fragmento de 1450 bases que contiene gag, que se liga después dentro del vector de expresión de baculovirus pVL941 (Talbott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5743) se digiere con Bam HI y se desfosforila con fosfatasa intestinal de ternero. El vector resultante se denomina pVLFIgag (Véase Fig. 1).
El diseño de pVLFIgag da como resultado una disposición que permite el enmarcado natural de FIV gag-pol para producir una proteína de fusión constituida por el gag de FIV unido al producto del gen poliedro de baculovirus. Para eliminar este producto enmarcado, se insertan condones de terminación en los tres marcos de lectura, inmediatamente después al marco de lectura de gag. Se usa PCR para producir un extremo 3' "de sustitución" del gen gag, que contiene los codones de terminación deseados. Los cebadores de PCR (DAD-1: 5'-CCATGGAATTCTACCTATTTATAAATCCAATAGTTCTCCTC-3'[SEC ID Nº: 1], DAD-2: 5'-GCAATGGCCACCTTAAGCCAGAAAG-3' [SEC ID Nº: 2]) se usan para amplificar una parte de FIV-14 de 389 bases que contiene los codones de terminación manipulados. El fragmento de PCR se digiere con Eco RI y el fragmento de 125 bases que contiene el gag 3' "de sustitución" se aísla. Este fragmento se liga después dentro del plásmido D4 que contiene gag que se ha digerido con Eco RI (y se ha desfosforilado) para retirar el fragmento que contiene el extremo 3' natural. El plásmido resultante, denominado D4*, se sitúa después dentro de pVL941 de la mima manera que se ha descrito anteriormente para D4, para producir el vector de baculovirus pVLFIgag*. La sección del gen que se amplificó por PCR se secuencia para confirmar la presencia de los codones de terminación deseados.
B. Clonación del gen env en el vector de expresión de baculovirus recombinante
Se construye un vector para expresar env de FIV en baculovirus digiriendo en primer lugar pFIV-14 con Ase I y Nde I para retirar un fragmento de 2649 bases (bases 6257-8906) que contiene el gen env de FIV. Después del tratamiento con Klenow para rellenar los extremos, el fragmento se subclona en pSP72, se digiere con Sma I y se desfosforila. Este plásmido intermedio, denominado B1, se digiere con Bam HI y Bgl II (digestión parcial) para retirar un fragmento de 2660 bases que se liga dentro de pVL941, se digiere con Bam HI y se desfosforila. El plásmido resultante se denomina pVLFlenv.
C. Transformación de baculovirus
Los plásmidos pVLFIgag* y pVLFIenv se co-transfectan con el ADN de baculovirus de tipo silvestre en células Sf9 usando técnicas de vector de expresión de baculovirus convencionales (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº. 1555 (1987). Los virus recombinantes se seleccionan en base a su fenotipo negativo para la oclusión. Se toman cinco placas individuales para cada construcción y se purifican en placa cinco veces. Las soluciones madre virales se ensayan para expresión del gen heterólogo de FIV infectando primero una placa de 60 mm de células Sf9 a una multiplicidad de infección estimada de 10. 60 horas. después de la infección, el medio condicionado y las células se recogen y se ensayan para la expresión de proteínas de FIV mediante análisis de transferencia de Western. Se usa suero de un gato infectado experimentalmente con FIV para sondear la transferencia de Western. Se seleccionan los clones positivos que producen los niveles más altos de proteína para fabricar soluciones madre
virales.
D. Expresión de env y gag de FIV (baculovirus)
Se usan células de Sf9 que crecen en cultivo de suspensión para producir grandes cantidades de proteínas para experimentos animales. Las células en suspensión se cultivan en matraces de agitación en medios constituidos por medio de Grace suplementado (Gibco BRL) que contiene suero fetal de ternero al 10%. El medio se suplementa también con anfotericina B (2,5 \mug/ml), penicilina (10 U/ml), y estreptomicina (10 \mug/ml). Las células se infectan a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml con un m.o.i de 10. Sesenta y seis horas después de la infección, se recogen las células mediante centrifugación. La expresión se confirma mediante análisis de transferencia de Western antes del uso. La transferencia se sondea con antisuero reactivo de FIV de un gato infectado experimentalmente. Las células infectadas se almacenan congeladas a -20ºC.
E. Clonación de genes gag y env en herpesvirus felino recombinante
Las mismas secuencias de FIV usadas para la expresión de genes gag y env de FIV en baculovirus se usan para construir herpesvirus felinos recombinantes que expresan productos de genes gag y env de FIV.
El gen que contiene las secuencias codificantes de gag de FIV se retira del clon proviral de FIV, FIV-14 mediante digestión con Hind II y Eco RV. Este fragmento de 1450 bases se subclona en el vector p3CL-DHFR que se ha digerido con Hind III, los extremos se rellenan con Klenow, y se desfosforila. El plásmido resultante, p3CLFIgag se digiere después con Eco RI (parcial) y Bgl II para liberar un fragmento que contiene la unidad de trascripción completa, que está constituida por el promotor inmediato temprano de CMV, el gen gag de FIV, la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Este fragmento se subclona en el plásmido pGC113 (Nunberg JH y col., J. Virol. (1989) 63:3240) en el sitio Hind III (tanto el inserto como el vector con el extremo hecho romo con Klenow) para dar el plásmido pGCFIgag. La unidad de trascripción está flanqueada por secuencias de genes de timidina quinasa de FHV para permitir la recombinación homóloga en el genoma de FHV, y pierde aproximadamente 450 bases de la parte media del gen de la timidina quinasa para atenuar el virus (ausente de pGC113 como se describe en Nunberg JH y col., J. Virol. (1989) 63:3240).
Se usa una estrategia similar para producir un plásmido de transferencia para expresar env de FIV. La secuencia que codifica env de FIV se retira de FIV-14 mediante digestión con Ase I y Nde I y se subclona en pSP72 digerido con Pvu I y se desfosforila para producir el plásmido denominado F5. El gen env se retira del plásmido F5 con Hind III y Xho I y se subclona en p3CL-DHFR digerido con Hind III y Sal I, produciendo el plásmido p3CLFIenv. El fragmento que contiene el promotor CMV, el gen de env de FIV y las secuencias de poliadenilación de la bGH se retira mediante digestión con Eco RI y Pvu II, se hacen romos los extremos con Klenow, y se subclona en el sitio Hind III de pGC113 (rellenado con Klenow) para dar el plásmido pGCFIenv.
F. Expresión de env y gag de FIV (FHV)
FHVs recombinantes que expresan gag o env de FIV se producen esencialmente como se describe en Nunberg JH y col., J. Virol. (1989) 63:3240). Esto implica usar recombinación homóloga para sustituir el gen de timidina quinasa nativo con el gen con la timidina quinasa delecionada que contiene la unidad de trascripción del gen FIV. Las células CRFK se co-transfectan usando un protocolo de transfección con precipitación de fosfato de calcio convencional, con cantidades iguales de pGCFIgag o PGCFIenv y ADN de FHV purificado (UT88). Después de que se ha alcanzado el 100% del CPE (3-5 días), la reserva de virus resultante se diluye serialmente y se resitua en placas de células CRFK en presencia de 100 \mug/ml de arabinósido de timidina (araT) para seleccionar virus negativos para timidina quinasa. Se toman ocho placas de cada transfección, se amplifican en células CRFK, y se prepara el ADN viral. El ADN viral se analiza mediante digestión por restricción con Eco RI y el posterior análisis de transferencia de Southern usando sondas de ADN específicas para FIV y específicas para tq (timidina quinasa). Los clones de ADN positivo se analizan para la expresión de proteínas de FIV mediante análisis de transferencia de Western de lisados de células
infectadas.
Las células CRFK se infectan con tres clones diferentes de FHVFIgag (pistas 1, 2, 3), cuatro clones diferentes de FHVFIenv (pistas 5, 6, 7, 8) y el virus parental UT88 como control negativo (pistas 4, 9). Los lisados de las células se analizan mediante transferencia de Western usando un antisuero reactivo para FIV de un gato infectado experimentalmente. Los FHV recombinantes que expresan gag o env de FIV se seleccionan en base a la máxima expresión de proteínas, se purifican en placa dos veces adicionales, y se usan para producir soluciones madre
virales.
Ejemplo 2
Vacunación y experimentos de exposición
Se usan en este experimento dieciocho gatos específicos sin patógenos de aproximadamente 12 semanas de edad. Los animales se alojan en instalaciones de contención en tres grupos de seis animales cada uno y se alimentan con comida para gatos seca y agua ad. libitum.
A. Grupos de vacunación 1. Vacunación Mucosal/Parenteral Combinada
Después de un periodo de aclimatación, a los animales en el Grupo I (n = 6) se les inocula por vía intranasal 0,5 ml de FHVFIgag y 0,5 ml de FHVFIenv (1 ml en total). Esto se realiza usando una jeringuilla a la que se ha unido una pequeña cánula nasal. Los animales se sujetan con suavidad y se dejan caer gotas de aproximadamente 0,25 ml en cada fosa nasal y 0,5 ml se colocan en la parte trasera de la orofaringe. Cada diferente preparación contiene 10^{6,5} de TCID_{50} por ml. Aproximadamente tres semanas después, los animales se revacunan por vía subcutánea con 10^{6,5} células de Sf9, suspendidas en solución salina, que 72 horas antes se habían infectado a un MOI de 1, con baculovirus recombinantes con inserciones de gag y env de FIV.
2. Vacunación Parenteral/Parenteral Combinada
A los animales en el Grupo II (n =6) se les inoculan por vía subcutánea 10^{6,5} células de Sf9, suspendidas en solución salina, que 72 horas antes se habían infectado a un MOI de 1, con baculovirus recombinantes con inserciones de gag y env de FIV. Aproximadamente tres semanas después, estos animales se revacunan con una preparación de baculovirus recombinante similar.
3. Vacunación Mucosal/Mucosal Combinada
Después de un periodo de aclimatación, a los animales se les inocularon por vía intranasal 0,5 ml de FHVFlgag y 0,5 ml de FHVFIenv (1 ml en total). Esto se realiza usando una jeringuilla a la que se ha unido una pequeña cánula nasal. Los animales se sujetan con suavidad y se dejan caer gotas de aproximadamente 0,25 ml en cada fosa nasal y 0,5 ml se colocan en la parte trasera de la orofaringe. Cada diferente preparación contiene 10^{6,5} de TCID_{50} por ml. Aproximadamente tres semanas después, los animales se revacunan de manera similar con la dosis idéntica.
4. Control
Los animales en el grupo III (n = 6) se dejan como controles sin vacunar.
B. Exposición
Aproximadamente dos semanas después de la última vacunación, los animales en cada uno de los tres grupos se exponen por vía intravenosa con una dosis de un ml de una dilución 10^{-3} de una solución madre viral clonada del Petaluma de FIV aislado. No hay pruebas de inmunosupresión. La titulación de esta solución madre en gatos susceptibles usando una vía y cantidad de inoculación similares, ha demostrado tener un título de 10000 ID50.
La sangre tomada de estos gatos 24 semanas después de la exposición se separa en gradientes de Ficol para enriquecer las células mononucleares. Estas células se cultivan a 10^{5} por ml en RPMI 1640 con suero fetal de ternero al 10% en presencia de 2 \mug de Con A y 100 IU de IL-2 humana recombinante por ml. Después de tres días, las células se centrifugan y se resuspenden en RPMI 1640 con suero fetal de ternero al 10% y 100 IU de IL-2 humana recombinante por ml. Después de 21 días en cultivo, las células se preparan para el análisis de PCR.
Las células mononucleares de sangre periférica de gato (PBMC) se recogen el 21er día de cultivo por centrifugación a 1500 x g. Las células se lavan después con solución de sal equilibrada de Hank (HBSS). El ADN genómico se aísla de aproximadamente 10^{7} células usando el kit Turbogen (Invitrogen Corporation, San Diego, CA.). En resumen, las células se lisan usando un detergente catiónico desnaturalizante. Después el detergente y la proteína desnaturalizada se retiran mediante extracción con cloroformo. El ADN genómico se precipita de la fase acuosa con un tampón bajo en sal y etanol y se disuelve después en tampón TBE y se almacena a 4ºC hasta el análisis mediante PCR (descrito en Ensayos de Laboratorio).
C. Resultados
La Tabla 1 muestra que cuatro de seis animales en el grupo de control son virémicos en 24 semanas, mientras que ninguno de los animales inoculados por vía parenteral/por vía parenteral o por vía mocusal/por vía parenteral son positivos en el ensayo de antígeno de ELISA o de PCR. Esto indica que estos programas de vacunación previenen con éxito la epidemia persistente con FIV. Se espera que la vacunación mucosal/mucosal, consiga resultados similares.
Ejemplo 4
Kit de Vacunación
Un kit que contiene las vacunas para administración e instrucciones sobre la administración doble mucosal/parente-
ral de vacunas, la administración parenteral/parenteral o mucosal/mucosal de vacunas, como se ha descrito en este documento, puede producirse como un medio seguro y eficaz de suministrar una vacuna. El kit de vacunación contiene vacunas en viales, ampollas u otros recipientes adecuados de uso único o múltiple. Para administración mucosal, la vacuna formulada puede estar en recipientes o en forma de aerosol. Para uso parenteral, las jeringuillas de único uso que contienen una dosis eficaz adecuada para el mamífero huésped representan una manera fácil y rápida en la que se realiza la administración. Como alternativa, el kit puede contener las vacunas mucosal y parenteral en viales multiuso u otros recipientes adecuados, y puede suministrarse preparada para el uso o requerir una preparación o mezcla adicional anteriores al uso. Se incluye una hoja de instrucciones que describe más completamente la(s) vacuna(s) incluida(s) a administrar y su formulación, el orden y el momento de inoculación, así como factores adicionales que conciernan al médico.
Para gatos, como ejemplo, un kit de vacunación tal puede contener una formulación mucosal de dosis única de un ml, que contiene FHVFIenv y FSVFlgag (2 x 10^{5} pfu/vacuna) para administrar 0,5 ml a cada fosa nasal. La formulación parenteral incluye un ml de AcNPVenv y AcNPVgag (2 x 10^{5} pfu/vacuna) para administración intramuscular.
TABLA 1 Antígeno de FIV y resultados de PCR en muestras de 24 semanas
Resultado del Ensayo*
número de gato e historial de ensayo del antígeno de resultado de PCR en el día 21 de
vacunación FIV PBMC cultivado
XXD3 CONTROL - -
XXE2 CONTROL + +
XXH3 CONTROL + +
XXA2 CONTROL + +
XXH2 CONTROL + +
XXS3 CONTROL - -
XXQ3 BACULO REC. - -
XXE3 BACULO REC. - -
XWL2 BACULO REC. - -
XXH1 BACULO REC. ND ND
XWG2 BACULO REC. ND ND
XWE3 BACULO REC. ND ND
XXL1 FHV REC. - -
XXB1 FHV REC - -
XWX3 FHV REC ND ND
XWP3 FHV REC - -
XWR2 FHV REC - -
XWR1 FHV REC - -
* \begin{minipage}[t]{158mm} La presencia de antígeno ensayada en los análisis de ELISA IDEXX y PCR se realiza de acuerdo con el texto. + significa un resultado positivo, - significa un resultado negativo. ND - no realizado (las células cultivadas se perdieron debido a la carencia de crecimiento y no estuvieron disponibles para ensayar al término del experimento). \end{minipage}

Claims (10)

1. Una vacuna recombinante contra virus de inmunodeficiencia felina (FIV) que comprende un sistema de expresión de baculovirus que expresa proteína gag de FIV y proteína env de FIV.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un vector de replicación para expresar dichas proteínas.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el vector de replicación se selecciona entre herpes, pox-, adeno-, repro- y paramixovirus, y bacterias de salmonella.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el vector de replicación es herpesvirus felino.
5. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, adaptada para administración parenteral.
6. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, adaptada para administración mucosal.
7. Uso de un sistema de expresión de baculovirus como se ha definido en cualquier reivindicación anterior, para la fabricación de un medicamento para vacunar un gato contra FIV.
8. Un kit que comprende (a) una primera dosis, de una vacuna que comprende una secuencia de ADN que codifica proteína gag de FIV y una secuencia de ADN que codifica proteína env de FIV y (b) una segunda dosis, de una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8, donde la primera y segunda dosis está cada una adaptada para administración parenteral o mucosal.
10. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la primera dosis se administra por vía mucosal y comprende secuencias de ADN que codifican proteínas gag y env de FIV expresadas por FHVFIenv y FHVFIgag, y la segunda dosis se administra por vía parenteral.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348449B1 (en) 1993-09-21 2002-02-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of inducing mucosal immunity
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
US5849303A (en) * 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
US6254872B1 (en) * 1995-08-25 2001-07-03 University Of Florida Multi-subtype FIV vaccines
FR2741806B1 (fr) * 1995-11-30 1998-02-20 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus felin de type 1, notamment contre la peritonite infectieuse feline
FR2751223B1 (fr) * 1996-07-19 1998-12-04 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique felin
CA2266656A1 (en) * 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
US7255862B1 (en) 1996-11-14 2007-08-14 Connaught Technology Corporation ALVAC/FIV constructs
US20030118601A1 (en) * 1997-03-11 2003-06-26 Neil James Charles FIV vaccine
US6458528B1 (en) * 1998-05-15 2002-10-01 Idexx Laboratories, Inc. Diagnosis of feline immunodeficiency virus infection using ENV/GAG polypeptide markers
US6770282B1 (en) 1998-10-23 2004-08-03 Heska Corporation Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats
WO2000024428A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Heska Corporation Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats
US20030198661A1 (en) * 2000-01-31 2003-10-23 Mars Incorporated Antioxidant compositions and methods for companion animals
EP1074625A3 (en) 1999-06-14 2002-01-02 Pfizer Products Inc. DNA vaccine against feline immunodeficiency virus
DE50010240D1 (de) * 1999-07-08 2005-06-09 Mologen Forschungs Entwicklung Impfstoff gegen infektionen mit lentiviren, wie dem felinen immunschwäche-virus der katze
FR2825280B1 (fr) * 2001-06-01 2005-04-15 Merial Sas Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline
WO2006011919A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-02 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7201903B2 (en) * 2003-09-11 2007-04-10 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7285272B2 (en) * 2003-12-18 2007-10-23 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
DE602005027326D1 (de) * 2004-02-19 2011-05-19 Idexx Lab Inc Verfahren und vorrichtung zum nachweis von katzen-immunschwächevirus
WO2006011917A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-02 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7335360B2 (en) * 2004-06-30 2008-02-26 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7291338B2 (en) * 2005-03-09 2007-11-06 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
JP2011500036A (ja) * 2007-10-15 2011-01-06 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 構築物系およびその使用
US20100291142A1 (en) * 2007-10-18 2010-11-18 Roger Maes Bacterial Artificial Chromosome Containing Feline Herpes Virus Type 1 Genome and Uses Thereof
WO2011123781A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Idexx Laboratories, Inc. Detection of feline immunodeficiency virus
US9795658B2 (en) 2010-04-20 2017-10-24 Admedus Vaccines Pty Ltd Expression system for modulating an immune response
PT2772265T (pt) 2010-05-14 2018-04-20 Univ Oregon Health & Science Vectores de hcmv e rhcmv recombinantes e seus usos
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
BR112015021945A8 (pt) 2013-03-05 2019-12-03 Univ Oregon Health & Science vetores de citomegalovírus humanos ou animais e seus usos
WO2016011293A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Oregon Health & Science University Human cytomegalovirus comprising exogenous antigens
CN114317611A (zh) 2015-02-10 2022-04-12 俄勒冈健康与科学大学 可用于产生非典型cd8+t细胞应答的方法和组合物
US10688164B2 (en) 2015-11-20 2020-06-23 Oregon Health & Science University CMV vectors comprising microRNA recognition elements
CN108601951B (zh) 2015-12-09 2022-11-22 金港医疗(澳大利亚)私人有限公司 用于治疗的免疫调节组合物
US10532099B2 (en) 2016-10-18 2020-01-14 Oregon Health & Science University Cytomegalovirus vectors eliciting T cells restricted by major histocompatibility complex E molecules

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118602A (en) * 1987-08-26 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Feline T-lymphotropic lentivirus assay
CA1341439C (en) * 1987-08-26 2003-09-23 Niels C. Pedersen Feline t-lymphotropic lentivirus
US5324664A (en) * 1988-08-08 1994-06-28 The Upjohn Company Herpes virus thymidien kinase-encoding DNA
WO1990013573A1 (en) * 1989-05-08 1990-11-15 Idexx Corporation Polypeptides of feline t-cell lymphotropic lentivirus
JP3034025B2 (ja) * 1989-06-01 2000-04-17 アプライド・バイオテクノロジー・インコーポレーテツド 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子
US6228608B1 (en) 1991-02-28 2001-05-08 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Recombinant FIV glycoprotein 160 and P24 gag protein
AU2800392A (en) * 1991-10-28 1993-06-07 Institut Pasteur Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides
DK0576092T3 (da) * 1992-06-26 2003-02-17 Akzo Nobel Nv Rekombineret felin herbesvirusvaccine
GB9215232D0 (en) * 1992-07-17 1992-09-02 Pitman Moore Inc Vaccines
GB9215233D0 (en) * 1992-07-17 1992-09-02 Pitman Moore Inc Vaccines
DE69332480T2 (de) * 1992-07-30 2003-07-17 Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem Impfstoff-vektoren von rekombinantem katzen-herpesvirus
GB9219936D0 (en) * 1992-09-21 1992-11-04 Pitman Moore Inc Vaccines
EP0662139A1 (en) * 1992-09-21 1995-07-12 Chiron Corporation Recombinant retroviral vector against felv and/or fiv

Also Published As

Publication number Publication date
DE69535125T2 (de) 2007-08-30
WO1995030019A1 (en) 1995-11-09
EP1679377A1 (en) 2006-07-12
US5833993A (en) 1998-11-10
AU2234995A (en) 1995-11-29
EP0758396A1 (en) 1997-02-19
JPH09512177A (ja) 1997-12-09
DE69535125D1 (de) 2006-09-07
EP0758396B1 (en) 2006-07-26
ATE334216T1 (de) 2006-08-15

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