FR2732605A1 - Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet une composition pharmaceutique destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal effecteur, qui comprend au moins deux produits identiques ou différents contenant chacun un agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, pour une administration concomitante ou consécutive; l'un des produits étant formulé de manière à être administré par voie naso-buccale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oropharynx ou des glandes salivaires, l'autre produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée. De manière optionnelle, une telle composition peut aussi comprendre un troisième produit, identique ou différent aux deux premiers, formulé pour être administré par voie systémique.

Description

présente invention a pour objet un kit de vaccination destiné à induire chez un mammite, une réponse imnmitaire protectrice à l'encontre d'un organisme pathogène infectant des muqueuses.

Les cellules de Immunité peuvent être concentrées au sein d'organes ou folmer un tissu lymphoïde pals ou moins diffils, ces tissus et organes constituant dans leur ensemble le système lymphoïde. On distingue les organes Iymphoides primaires qui sont les sites majeurs de la lymphopoïese (thymus, moelle osseuse), et les organes et tissus lymphoïdes secondaires au sein desquels les lymphocytes peuvent interagir entre eux ou avec rantigène. Les organes lymphoïdes secondaires comprennent la rate, les ganglions lymphatiques et les fondations lymphoïdes associées aux muqueuses (MALT pour mucosal associated lymphoïd tissue), plaques de Peyer et amygdales palatines entre autres.En plw du tissu Iymphoide organisé constituant le MALT, on trouve de nombreux lymphocytes dans la muqueuse de l'estomac, de l'intestin grêle, du colon, des bronches et de divers autres organes.

Après s'être différenciés dans les organes lymphoïdes primaires, les lymphocytes migrent dans les organes lympholdes secondaires. Ces derniers peuvent être des sites inducteurs de rimmunité systémique ou de l'immunité mucosale. On peut ainsi les appeler organes "systémiques" ou "muqueux".

Parmi les organes "systémiques", on distingue la rate qui répond aux antigènes pénétrant dans la circulation sanguine, et les ganglions périphériques qui assurent la protection vis-à-vis des antigènes pénétrant dans la zone anatomique dont ils assurent le drainage lymphatique. Dans le tableau après, on présente une liste des différents ganglions en liaison avec les zones qu'ils drainent (sites inducteurs ou effecteurs).

Le système immunitaire associé aux muqueuses, pour sa part, protège rorganisme contre les antigènes pénétrant par les surfaces épithéliales muqueuses et y résidant. On trouve l'anneau de Waldeyer et les tissus lymphoïdes associés au tractus respiratoire (BALT pour bronchial associated lymphoïd tissue), au tube digestif (GALT pour gut associated lymphoïd tissue) et au tractus uro-géniial. Le système immunitaire associé aux muqueuses (sites inducteurs) est présenté dans le tableau ciaprès:: Sites inducteurs Ganglions Sites effecteurs lymphatiques

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Une fois stimulés dans les organes secondaires inducteurs, les lymphocytes peuvent migrer vers les sites effecteurs en transitant par la lymphe, via les ganglions associés aux sites inducteurs, éventuellement via les ganglions plus importants drainant ces premiers ganglions, les veinules lymphatiques efférentes aboutissant dans le canal thoracique. La lymphe de ce dernier rejoint la circulation Sanguine par laquelle les cellules rejoignent les organes cibles ou sites effecteurs.En ce qui concerne les cellules lymphoïdes du MALT, cella-ci revrculent vers les territoires muqueux Par exemple, des cellules stimuées dans les plaques de Peyer traversent les ganglions associés puis passent dans le sang pour venir se localiser dans certains sites muqueux
Cette recirculation sélective est due à la capacité des lymphocytes à à reconnaître des molécules d'adhérence exprimées spécifiquement sur les cellules endothéliales des veinules post-capillaires des muqueuses. Grâce à ce mécanisme, la stinon antigénique d'un territoire muqueux (inducteur) peut induire une réponse dans d'autres territoires muqueux (effecteurs).

A ce jour, de nombreuses méthodes drunnamisation ont été rapportées dans la littérature scientifique. Les caractéristiquesSclé de ces méthodes sont, d'une manière générale, (i) la nature de l'immunogène, (ii) la ou les voies d'administration de l'immunogène ainsi que (iii) la formulation de l'immunogène.

En ce qui concerne la nature de l'immunogène, la possibilité d'utiliser en alternative à un antigène de nature protéiques un immunogène de nature nucléique (ARN, ADN) est déjà connue depuis longtemps. n n'y a donc pas lieu de s'étendre plus avant.

Les voies et méthodes d'immunisation favorisant la prévention ou le traitement des infections mucosales ont di fait objet d'un certain nombre d'études sans pour cela être couronnées d'autant de succès que la vaccination à l'encontre des infections systémiques.

Néanmoins, rensemble de ces études indique que, lorsqu'il s'agit d'un pathogène s'implantant au niveau des muqueuses, la seule immunisation par voie systémique ne semble pas suffisante pour que se développe une protection convenable. n semble souhaitable, sinon indispensable d'induire une immunisation par voie mucosale, éventuellement en surplus à une immunisation par voie systémique, pour lutter avec efficacité contre ce type d'infection. L'immunisation par voie mucosale permet essentiellement de stimuler le tissu lymphoïde drainant la ou les muqueuses où se niche le pathogène et d'obtenir ainsi une réponse immunitaire ciblée au niveau de cette ou ces muqueuses.

Les immunoglobulines de type A (IgA) constituent la majorité des immunoglobulines à la surface des muqueuses gastro-intestinale, respiratoire, urogénitale ou autres. Elles sont sécrétées au sein de ces muqueuses et réputées conférer une protection à rencontre des infections affectant ces sacs.

Une réponse immunitaire mucosale est usuellement obtenue après immunisation par voie mucosale, soit directement au niveau de la muqueuse effectrice, soit en un autre site mucosal éloigné du site où combattre rinfection. Les voies mucosales qui sont a priori accessibles pour immunisation sont la voie orale, la voie iiitra-r- la voie nasale, la voie uro-génitale et la voie rectale. Toutefois, la voie orale est celle sur qui le choix se porte de préférence, en raison de sa facilité d'utilisation, que ce soit pour vacciner contre des infections de la muqueuse gastro-intestinale ou pour vacciner contre des infections affectant une autre muqueuse.

Pour illustrer ce propos, différents exemples de l'art antérieur sont donnés comme suit:
Récemment, Czinn et al, Vaccine (1993) 11 : 637 ont proposé débauche d'une méthode de vaccination Q rencontre de Helicobacter pylori, agent pathogène de nombreux ulcères de restomac. Des souris axéniques ont reçu un sonicat d' H. felta adjuvé par la toxine cholérique, par voie intragastrique (sonicat directement administré, par intubation, au niveau de restcanac). Après une épreuve par H. felis, on constate que les souris immunisées ont été protégées.

Cette procédure est par commodité, appelée dans la suite de rarticle "immunisation ode". Cet article trouve son équivalent dans la demande de brevet Czinn & Nedrud WO 93/20 843.

Jertborn et al, vaccine (1992) 10: 130 relate une etude de vaccination anti cholérique effectuée auprès d'un petit groupe de Suédois. Le vaccin était administré par deux fois, sous forme de solution liquide buvable. Ce vaccin s'est révélé à la fois efficace et sans risque.

La vaccination contre la grippe par voie nasale a été mise en oeuvre avec suès chez les enfants et les adultes, comme le rapporte Anderson et al, J. Clin. Microbiol.

(1992) 30 : 2230 et Treanor et al, Ann. Inter. Med. (1992) 117 : 625.

Gallichan et al, J. Infect. Dis. (1993) 168: : 622 montre qu'il est possible d'induire à la fois une réponse immunitaire mucosale et systémique après administration par voie intranasale d'un adénovirus recombinant exprimant la glycoprotéine B de l'eeepes Simplex Virus (EISV). En conclusion, les auteurs suggèrent que d'une manière générale, leur approche permettrait d'obtenir une protection à long terme à l'encontre des virus transmis par voie mucosale ou sexuelle.

Certaines études telles que Forest et al, Vaccine (1990) 8 : 209, suggèrent que la voie rectale pourrait être une voie d'entrée commune à l'ensemble du système immunitaire mucosal et qu'il devrait être possible d'induire une réponse immunitaire mucosale en un site éloigné de la muqueuse rectale, utilise comme voie d'entrée de l'immunogène.

L'association de différentes voies d'immunisation a déjà été décrite par plusieurs auteurs comme étant un moyen de choix pour obtenir une réponse optimale.

L'association d'une voie mucosale et d'une voie systémique est par exemple décrite dans les articles suivants.

Keren et al, Infect. Immun. (1988) 56 (4): 910 indique qu'une métode d'immunisation par voies combinées, parentérale et orale, donne de meilleurs résultats en termes de réponse IgA à l'encontre de Shigella flexneri, qu'une immunisation par voie unique. En pratique, des souris reçoivent rantigène par voie intramusculaire et par voie intragastrique à l'aide d'un tube, sous anesthésie.

Yoshimura et al, Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. (1991)117 : 889 propose de vacciner contre les otites à pneumocoques en associant l'administration par voies systémique et orale. Les protocoles d'immunisation sont testés chez le cobaye. L'administration dite par voie orale, s'effectue en fait au niveau du duodénum ou de restomac au moyen d'un cathéter ou bien consiste en rabsorption de capsules entériques. Les auteurs montrent que seule rassociation voie systémique + voie orale sous forme de capsules, donne de bons résultats.

Forest et al, Infect. Immun. (1992) 60 (2) : 465 teste chez l'homme, plusieurs modes d'immunisation en vue d'induire une réponse IgA à rencontre de Salmanella typhi. Les voies orale et sous-cutanée sont utilisées comme suit: orale; orale/orale ; orale/sous-cutanée ; ; et sowtanécIorale. Les auteurs montrent quine première injection parentérale suivie quelques jours après par une deuxième dose absorbée par voie orale ne favorise pas la réponse IgA Par contre, rabsorption du vaccin par voie orale, répétée une fois, donne de bons résultats.

Hartman et al, Infect. Immun. (1994) 62 (2): 412 décrit plusieurs protocoles d'immunisation à rencontre de Shigella. En particulier, l'un d'entre eux comprend une première injection par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée suivie d'un rappel par voie oculaire. Ce protocole est testé dans le modèle cobaye de la keratoconjontivite.

Les auteurs montrent que chez les animaux na, l'immunisation par voie mucosale est nécessaire à l'induction d'une protection. La double immunisation parentérale et mucosale augmente le niveau de protection.

Il a maintenant été trouvé qu'une réponse immunitaire en un site mucosal quelconque et à rencontre d'un antigène quelconque, pouvait être grandement favorisée en mettant en oeuvre un protocole d'immunisation associant plusieurs voies et induisant une réponse majoritairement d'isotype IgA
En outre, un des buts recherchés entait aussi d'éviter l'induction d'une réponse locale à isotypes capables de fixer k complément (IgG2a chez la souris, IgG1 chez l'homme), ou à médiation cellulaire (de type THî chez la souris, reflétée par la présence d'isotype IgG2a). Ce type de réponse peut déclencher une inflammation à long terme, plus nocive que bénéfique, voire une réaction d'hypersensibilité retardée.

Par exemple, un adjuvant trop puissant de type toxine cholérique ou lymphotoxine d'E colt peut entraîner. outre une réponse humorale de type IgA, une forte réponse cellulaire associée à une réponse présentant des anticorps susceptibles de fixer le complément. De tels adjuvants ont par exemple dans le cas d'immunisation anti H. pylori, été montrés capables d'induire une forte gastrite dans toute restomac après épreuve (P. Michetti et al, Gastroenterology (1994) 107 : 1002-1011).

On a maintenant trouvé qu'en jouant sur les conditions d'immunisation et en évitant l'utilisation d'adjuvants trop puisa, on pouvait atteindre le but recherché.

Une primo immunisation systémique permet par exemple, suivie d'un rappel par voie mucosale dans nos conditions, d'augmenter la réponse locale IgA sans entraîner de réponse d'isotype indésiré ou de tolérance, locale ou périphérique.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique destinée à induire chez un inamnèlère hôte, une réponse immunitaire protectrice à rencontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal effecteur, qui comprend au moins deux produits identiques ou différents contenant chacun un agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi rantigène et à condition que rantigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, pour une administration concomitante ou consécutive;; l'un des produits étant formulé de manière à être administré par voie naso-buccale afin que ragent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oro-pharynx ou des glandes salivaires rautre produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'agent inducteur soit ciblé vers k ou les site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée.

De manière optionnelle, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend un troisième produit, identique ou différent aux deux premiers, qui contient un agent inducteur de la réponse immunitaire, sélectionné parmi rantigène et à condition que rantigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène et qui est formulé pour être administré par voie Systémique, de préférence avant les deux premiers produits déjà cités.

En d'autres termes, rinvention a pour objet un kit pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire mucosale à rencontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur, qui comprend:
(i) de manière optionnelle, un premier agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et, à condition que rantigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène ; et
(ii) un deuxième et un troisième agents inducteurs de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour rantigène ; avec
(a) de manière optionnelle, des instructions pour l'administration par voie systémique, du premier agent inducteur,
(b) des instructions pour l'administration par voie naso-buccale du deuxième agent inducteur,
(c) des instructions pour radminîstration du du troisième agent inducteur par une voie mucosale appropriée autre que la voie nasale, afin que l'antigène soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) de la réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée, et
(d) des instructions pour l'administration concomitante ou consécutive des premier, deuxième et troisième agents inducteurs.

L'invention concerne également une méthode pour induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à rencontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur mucosal, selon laquelle, dans un ordre quelconque:
(i) on administre de manière optionnelle au mante hôte, un premier agent inducteur de la réponse iminuniaire séloctionné parmi rantigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour l'antigène, par voie systémique;;
(ii) on administre au mammifère hôte, un deuxième agent inducteur de la réponse immuniaire sélectionné parmi l'antigène et, à condition que rantigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour rantigène, par voie nasale et / ou buccale (nasobuccale); et
(iii) on administre au nèalere hôte, un troisième agent inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi rantigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, un fiagment d'ADN ou d'ARN codant pour rantigène, par la voie mucosale appropriée autre que la voie nasale afin que l'antigène soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s) de la réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la réponse immunitaire est recherchée.

L'administration du premier agent inducteur peut être mise en oeuvre avantageusement en dose unique, par injection systémique, telle qu'une injection intraveineuse, intra-musculaire, intra-dermique ou sous-cutanée, ce dernier nsode d'injection étant préféré. Cet agent inducteur est avantageusement complémenté par un adjuvant, soit par précipitation, soit par adsorption. L'adjuvant peut être n'importe quel adjuvant classique de type phosphate ou hydroxide d'aluminium, phosphate de calcium, ou encore un adjuvant tel que k polyphosphazène. Ce peut être aussi un adjuvant de type liposome, microsphère ou ISCOM.Tous ces adjuvants sont à la portée de l'homme de l'art. Le dosage approprié varie en fonction de certains paramètres, par exemple de l'individu traite ou de la nature de l'agent inducteur. A toutes finns utiles, on indique qu'une dose d'un antigène peut varier de S à 100 g, de préférence de 25 à 50 llg.

Par "voie naso-buccale", on entend aux fins de la présente invention, la voie qui permet à un immunogène d'atteindre essentiellement ranneau de Waldeyer ou son équivalent le NALT, chez des espèces autres que l'espèce humaine. On précise que la voie naso-buccale (ou buccale) ne doit pas être confondue avec ce qui est communément appelé "voie orale" et qui devrait être plus justement dénommée "voie intragastrique".

La voie orale, y compris la voie i'ira-rique, doit permettre à l'agent inducteur (antigène) d'atteindre majoritairement les muqueuses des parties basses (tube digestif et principalement l'intestin grêle et les plaques de Peyer), tandis que la voie buccale véhicule ragent inducteur essentiellement vers les muqueuses des parties hautes. Le site crentrée de la voie buccale a celui de la voie orale peuvent être les mêmes ; daas ce cas là il s'agit de la bouche. Néanmoins les trajectoires sont essentiellement différentes.

La même remarque s'applique lorsqu'il s'agit de la voie pulmonaire qui pennet à ragent inducteur d'atteindre les muqueuses des parties médianes (bronches).

En vue d'optimiser la réponse immunitaire que l'on recherche, la formulation de l'immunogène a aussi son importance. Dune manière générale, il a déjà été montré qu'un antigène particulaire était plus efficace dans l'induction d'une réponse immunitaire mucosale, qu'un antigène soluble.

La voie qui sera suivie par ragent inducteur au départ d'un site d'entrée identique dépend de plusieurs facteurs; entre autres, de la nature et de la taille des particules sous lesqudis l'agent inducteur sera mis en forme, et de l'appareil, avantageusement spray ou aérosol, qui est utilisé pour propulser les particules, en particulier de forme, de sonjet directionnel, et de la vitesse de propulsion.

Pour ce qui concerne la nature des particules, un grand choix est à la disposition de homme du métier; ce choix, bien que non-limitatif se répartit avantageusement en deux groupes: les liposomes et les microsphères. Les méthodes de préparation de ces particules sont conventionnelles et il est à la portée de l'homme de l'art d'en sélectionner une selon ses besoins propres et de déterminer la taille des particules qui doit être appropriée pour que ragent inducteur soit véhiculé selon la voie qui aura été retenu, et reparti de manière optimale au niveau de la muqueuse ciblée.

Ainsi, on propose un diamètre particulaire inférieur 9 10 m, pour administration par voie nasale ou buccale ; pour administration par voie pulmonaire, un diamètre de 0,05 à 10 m, de préférence de 0,05 à 5 m, ; pour administration par voie orale, un diamètre de 0,05 à 10 m, de préférence de 0,05 à 5 m.

Les sites effecteurs principaux au niveau desquels une réponse immunitaire peut être recherchée sont rappareil respiratoire (bronches, naso-pharar, poumons), l'estomac, l'intestin et l'appareil uro-génital. Lorsqu'il s'agit de l'appareil respiratoire, le troisième agent inducteur sera avantageusement formulé pour être administré par voie pulmonaire (e.g. liposomes, microsphères,... etc.).Lorsqu'il s'agit de l'estomac ou de rmte,tin, le troisième agent inducteur sera avantageusement formulé pour être administré par voie orale, y compris la voie intragastrique (e. g. en présence d'une protection entérique, telle que liposomes, micro sphères, bicarbonate ou capsule de gélatine). Lorsqu'il s'agit de intestin ou de rappareil uro-génital, le troisième agent inducteur sera avantageusement formulé pour être administré par voie uro-génitale, par exemple sous forme de capsule vaginale ou par voie rectale, par exemple sous forme de suppositoire.

Le deuxième ou troisième agent inducteur peut être en outre complémenté par un adjuvant autre que les liposomes ou les microsphères, et dépourvu de toxicité autre que les sousités non-toxiques ou les formes détoxifiées des toxines bactériennes.

Selon un mode de réalisation préféré, on utilise pour adjuvant du deuxième ou du troisième agent inducteur, k lipopo-halide majeur (MPLA : major lipopolysaccharide antigen) d'une bactérie, par exemple d'E. coli, de Salmonella minnesoia, Salmonella typhimurium ou Shigella flexneri.

En effet, on a maintenant trouvé que ce type de composé avait de bonne propriétés adjuvantes lorsqu'il s'agissait d'immuniser par voie mucosale.

Cest pourquoi un autre aspect de l'invention porte sur l'utilisation du MPLA à titre d'adjuvant mucosal pour la préparation d'une composition (i) contenant un antigène ou, à condition que rantigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer l'antigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour rantigène, (ii) destinée à l'induction d'une réponse immunitaire mucosale à rencontre de rantigène et (iii) destinée à être adminhistrée par voie mucosale.

A titre indicatif on mentionne que le deuxième ou troisième agent inducteur, lorsqu'il s'agit d'un antigène, peut être administré à raison de 100 g à l mg la dose.

Selon un mode préféré, le premier agent inducteur, quand adininistré, est administré en pnmo-injection en laissant courir un délai de 7 à 45 jours, de présence de 20 à 30 jours avant le premier rappel (administration du deuxième ou du troisième agent inducteur).

Selon un mode alternatif; le premier agent inducteur peut être aussi administré en même temps que le deuxième ou troisième agent inducteur.

Le deuxième et troisième agents inducteurs peuvent être administrés de manière concomitante ou consécutive. Lorsqu'administrés de manière étalée dans le temps, ils k sont avantageusement de 7 à 45 jours, de préférence à 28 jours d'intervalle.

Si nécessaire, on peut aussi envisager d'administrer le premier et le deuxième agents inducteurs simultanément (c'est-à-dire approximativement le même jour) et de répéter une fois cette opération à plusieurs jours d'intervalle.

Le choix de chacun des trois agents inducteurs s'effectue de manière indépendante les uns des autres. Avantageusement au moins un des trois devra être rantigène. Assez communément, ces trois agents inducteurs peuvent être les mêmes et dans ce cas là, il s'agira avantageusement de l'antigène.

En alternative à un antigène de nature protéique, on peut aussi utiliser soit un vecteur vaccinal tppe pox ou adénovirus comportant un frçent d'ADN codant pour cet antigène soit ce fragment d'ADN tel quel, non-vectorisé, ou le fient d'ARN correspondant. Ces opportunités ont déjà été décrites dans la littérature.

Selon un mode de réalisation préféré, rantigène d'une bactérie pathogène pour le mammifère-hôte est un antigène d'H. Rylori, par exemple la forme apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori.

Il a été aussi trouvé que pour induire une réponse immunitaire mucosale à rencontre d'un organisme pathogène infectant restomac ou l'intestin, il ne serait pas indispensable d'administrer un immunogène au niveau de l'un de ces sites, mais qu'il pourrait suffire de l'administrer par la voie haute c'est-à-dire par voie naso-buccale, éventuellement en y associant une voie systémique.

Cest pourquoi sous un autre aspect, Invention concerne une composition destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à rencontre d'un antigène, au niveau de l'estomac ou de l'intestin, qui comprend un agent inducteur de la réponse immunitaire, sélectionné parmi rantigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, un fragment d'ADN ou t'ARN codant pour rantigène, ragent inducteur étant formulé de manière à être administré par la voie naso-buccale.

Sous ce même aspect, l'invention porte également sur l'utilisation d'un produit sélectionné parmi un antigène et, à condition que l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer rantigène, un fragment d'ADN ou d'ARN codant pour rantigène, pour la préparation d'une composition destinée à induire chez un mammifère hôte, une réponse immunitaire à l'encontre du produit, au niveau de restomac ou de rintestin, et destinée à être administrée par la voie naso-buccale.

Une telle composition, lorsqu'elle comprend un antigène d'un organisme pathogène infectant la muqueuse stomacale ou intestinale, est notamment utile en ce qu'elle protège k mammifère hôte contre l'infection en question, notamment en offrant une protection de longue durée, en mettant en jeu des lymphocytes T et B à mémoire.
Il peut s'agir des infections à H. pylovi, à V. cholerae, à Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enteritis, Clostridium difficile, Yersinia enterocolitica, E. coli entéroxigénes et entéropahtogènes.Pour ce qui concerne rantigène, ce dernier peut être l'agent pathogène lui-même sous forme tuée, lysée ou atténuée, ou bien des composants antigéniques de ce pathogène, tel qu'un polysaccharide capsulaire, ou des antigènes de membrane, sous forme purifiée, ou un polypeptide actéisqu de ce pathogène, soit directement purifié à partir du pathogéne, soit obtenu par les techniques de rADN recombinant.

Par exemple, lorsqu'il s'agit d'une composition destinée à prévenir les à H. pylori, un antigène de choix peut être l'apoenzyme de l'uréase, composée des sous-unités A et B dont les fragments d'ADN correspondants sont décrits dans e.g.

Labigne et al, J. Bact. (1991) 173 (6): 1920, ou bien la cytotoxine (WO93/18150) ou bien encore des protéines de la famille des adhésines (protéines capables de se lier aux récepteurs des cellules hôte et se faisant, capables de médier l'accrochage du pathogène aux cellules hôte et d'initier le processus infectieux) ou des protéines régulées par le fer.

Dans le cas d'un vaccin anti-choléra, un antigène de choix peut être la sous-unité
B de la toxine cholérique, comme déià décrit dans la littérature.

Invention est illustrée ci après par référence aux figures 1 9 5.

La Figure 1 présente l'analyse par Elispot de la réponse immunitaire induite par administration de sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). dans les glandes salivaires (1A) et f l'estomac (lB). Les résultats concernent trois protocoles d'immunisation : sous-cutanée / orale (Sc O); sous I nasale (Sc N) ; et souscutanée / orale + nasale (Sc O + N). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique".

Les hachures foncés sur fond clair correspondent à la réponse Igk Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a La réponse dans restomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 9.

La Figure 2 présente ranalyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glandes salivaires (2A) et dans restomac (2B) par administration selon le protocole sous cutanée / sous-cutanée + orale + nasale (Sc / Sc + O + N), de la CTB. Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse IgA Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de tordre de 8,2.

La Figure 3 présente ranalyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glandes salivaires (3A) et dans restomac (3B), par administration de Liuéase Jack
Bean selon le protocole sous-cutanée (alum) / orale + nasale (liposome). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures foncées sur fond clair correspondent à la réponse Igk Les hachures claires sur fond foncé correspondent à la réponse
IgG2a. La réponse dans restomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de l'ordre de 620.

La Figure 4 présente ranalyse par Elispot de la réponse immunitaire induite dans les glanda salivaires (4A) et dans restomac (4B) par administration de l'uréase Jack
Bean selon le protocole sous-cutanée (liposomes) / orale + nasale (liposomes). Par "orale" on entend bien sûr "intragastrique". Les hachures fonces sur fond clair correspondent à la réponse Igk Les hachures clairs sur fond foncé correspondent à la réponse IgG2a. La réponse dans l'estomac est présentée en nombre de souris répondeuses sur un lot de 5 souris ; le nombre de spots par million de cellules est de tordre de 15.

La Figure 5 présente le plasmide pTG8665, utilisé pour produire Fapoenyme de l'uréase d'H. flylon.

Exemple 1 : Induction d'une réponse immunitaire mucosale i l'encontre de la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB)
1.A. Préparation des compositions immunisantes
1.A. a) Pour administration par voie sous-cutanée
1 pi d'une préparaion de CIB purifiée et concentrée à 10 mg/ml (soit 10
pg de CTB) est mélangée à 100 FI d'une préparation d'hydroxyde
d'aluminium à 1 %. On dilue en tampon PBS pour obtenir un volume final
de 500 IIL Ceci constitue une dose individuelle.

1 b) Pour administration par voie orale (intragastrique)
Un volume de billes de latex de 3 pM (Polysciences cat 17 34) est prélevé
puis lavé 3 fois en tampon PBS (centrifugation 1.000 trs/min. pendant
trois minutes). Les billes sont ensuite mélangées à une préparation de
CIB purifiée et concentrée à 10 mg/ml afin d'obtenir une préparation dans
laquelle la CTB est diluée au 1/20 (soit à une concentration finale de 0,5
mg/ml). Cette préparation est placée pendant 2 hrs sous agitation.

La préparation est ensuite diluée au 1/25 avec du tampon carbonate 200
M.

1.A. c) Pour administration par voie nasale
Une préparation de B coatée sur billes de latex est obtenue comme
décrit dans la section 1.A. b) i l'exception de la dilution finale en tampon carbonate.

La préparation est ensuite diluée en tampon PBS selon les besoins.

1.1. d) Pour administration par voie orale + nasale
L'administration est réalisée par la conjonction des administrations orale et
nasale telles que décrites en 1.A. b) et 1.A. c).

1.B. Protocole d'immunisation
Trois protocoles d'immunisation sont comparés. Il s'agit de:
1) sous-cutanée / orale (intragastrique)
2) sous-cutanée / nasale
3) sous-cutanée IcraleCintragastrique) + nasale
Des souris balbC reçoivent par voie sous-cutanée, 10 g de CTB adjuvé par de l'aluni comme décrit dans la section 1k a), sous un volume de 500 PI.

Des souris constituées en lot témoin reçoivent en sous-cutanée 500 PI de
PBS.

28 jours après l'injection sous-cutanée, les souris de l'essai sont réparties en 3 groupes.

Les souris du premier groupe reçoivent en intragastrique, par l'intermédiaire d'une canule couplée à une seringue de 1 mi, 10 pg de CTB coatés sur billes de latex comme décrit dans la section 1.A. b) sous un volume de 500 PI. Des souris issues du lot témoin reçoivent 500 Cll de tampon carbonate, par la même voie.

Les souris du deuxième groupe reçoivent par voie nasale 10 Fg de CTB coatés sur billes de latex comme décrit dans la section 1.A. c) sous un volume de 20 pi. Ces 20 FI sont déposés goutte à goutte sur les narines. Des souris issues du lot témoin reçoivent 20 PI de PBS, par la même voie.

Les souris du troisième groupe reçoivent simultaément 10 g de CTB par voie orale (intragastrique) et 10 Fg de CTB par voie nasale. La préparation de CTB coatée sur billes de latex est obtenue comme décrit dans la section 1.A.

d). Des souris sont constituées en témoins.

15 jours après le rappel, l'estomac et les glandes salivaires des souris sont prélevés ; les cellules sont extraites selon le protocole décrit dans Mega et al, J.

of Immunology (1992) 148 : 2030 et la réponse IgA est analysée en Elispot selon la méthode décrite dans Czerkinsky et al, In Theoretical and Technical aspects of ELISA and other Solid Phase Immuno Assays (DM. Kenneny ans S.

J. Chalacombe Eds) :217-239. John Willy & Sons, Chichester, NY
Les résultats sont présentés dans la Figure 1 et commentés comme suit:
Le protocole sous-cutané / orale Cintragastrique) se révèle incapable d'induire une réponse immunitaire mucosale importante tandis qu'une telle réponse est observée dans le cas des protocoles sous-cutanée w / nasale et sous cutanée / orale (intragastrique) + nasale.

Ce denier protocole se révèle être le meilleur dans la mesure où une bonne réponse est obtenue tant dans les glanda salivaires que dans restomac.

Cette réponse est exclusivement de type 1 On n'observe pas de réponse
IgG2A susceptible d'entraîner une inflammation.

1.C. Protocole d'immunisation supplémentaire
Des souris ayant reçu une injection sous-cutanée de CTB comme décrit dans la section 1.B., reçoivent 28 jours après, en simultané: - 40 g de CTB telle que préparée dans la section 1.PL d) par voie orale
Crntragasrique), sous un volume de 500 l.

- 10 pg de CTB telle que préparée dans la section 1.A. d), par voie nasale,
sous un volume de 20 pL 10 g de CTB telle que préparée dans la section 1.A. a), par voie sous
cutanée, sous un volume de 300 l.

15 jours après le rappel, restomac et les glands salivaires des souris sont prélevés ; les cellules sont extraites et la réponse IgA est analysée en Elispot.

Les résultants sont présentes dans la Figure 2. On obtient une bonne réponse immunitaire de type IgA (5/5 souris répondent) ; mais une faible réponse IgG2a non-désirée apparaît cependant.

Exemple 2 : Induction d'une réponse immunitaire mucosale à l'encontre de l'uréase Jack Bean.

2.A. Préparation des compositions Immunisantes
2Â a) uréase adjuvée eu alun.

5 FI d'une préparation uréase Jaci: Bean (Boehringer ; ref. 737 348)
concentré à 4 mg/ml en tampon PBS sont mélangés à 100 l d'une
préparation d'hydroxyde d'aluminium à à 1 %. On dilue en tampon PBS
pour obtenir un volume final de 500 l contenant 20 g uréase. Ceci
constitue une dose individuelle.

2.A. b) uréase en liposomes
Trois techniques sont utilisées comme suit:
1. Injection d'éthanol
16,4 mg dtn mélange lipidique composé de Cholestérol (Sigma), de
Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) et de sel de
sodium du Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires
de 5:4:1 sont dissous dans 50 FI d'éthanol absolu. La solution est injectée
par rintermédiaire d'une seringue Hamilton dans 2 ml d'une solution
aqueuse contenant 4 mg/ml d'évase Jack Bean, éventuellement
tamponnée par du tampon PBS dilue au 1/10. La préparation est
maintenue à 450 C, sous agitation.

Au contact de l'eau les lipides s'orgenisent spontanément sous forme de
liposomes (majoritairement unilamellaires de taille moyenne 50-100 nm)
en piégeant un certain volume de la solution d'uréase.

Ces liposomes sont purifiés Ciblés de l'excès d'uréase hbre) par gel
filtration sur une colonne de Sepharose CL-4B (Pharmacia). Le taux
d'encapsulation de l'uréase mesuré à raide d'uréase marquée à l'iode 125
(technique EnzymobeadsTM, Biorad), varie de 3 à 6 %. Si nécessaire, la sussion liposomale est concentrée par ultrafiltration dans une cellule
NovacellTM (Filtron) possédant une limite d'exclusion de 101(1).

2.Extrusion
16,4 mg d'un mélange lipidique composé de Cholestérol (Sigma), de
Dipalmitoylphosphatidylcholine (Nattermann Phospholipids) et de sel de sodium du Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires de 5:4:1 sont dissous dans 4 mi de chloroforme dans un ballon Pyrex de 25 mL La solution est évaporée (Rotavapor Buchi) pour former un fin film lipidique sur les parois du ballon.Le film lipidique est séché sous vide poussé pendant 2 heures, puis repris avec 2 ml d'eau contenant 8 mg d'uréase de Jack BeaL Après 4 heures d'agitation à 450 C la suspension est extrudée (ExtruderTM, Lipex Biomembranes Inc., Vancouver) 5 fois à travers 2 membranes superposes en polycarbonate de porosité 400 nm (NucléoporeTM, Costar) pour former une population homogène de liposomes majoritairement unilamellaires d'environ 400 Ml de diamètre et coetenant ruréase. Ces liposomes sont purifiés (isolés de l'excés d'uréase libre) par gel filtration sur une colonne de Sepharose CL-4B, Pharmacia).

Le taux d'encapsuiation de l'uréase, mesuré à l'aide d'uréase marquée à l'iode 125 (technique de marquage EnzymobeadsTM, Biorad), varie de 5 9
10 %. Si nécessaire, la suspension liposomale est concentrée par ultrafiltration dans une cellule NovacellTM (Filtron) possédant une linite d'exclusion de 10 kD.

3. Méthode microfluidiseur 82 mg d'un mélange lipidique composé de Cholestérol, de
Dipalmitoylphosphatidylcholine et de sel de sodium du
Dimyristoylphosphatidylglycérol dans des proportions molaires de 5:4:1, obtenu par lyophilisation d'une solution éthanolique (D3F - France) sont repris avec 10 ml de tampon Hepes 10 mM, 150 mM NaCI, pH 7, 4 contenant 3,6 mglmi de la forme apoenzymatique recombinante de l'uréase de H. pylori. Après 4 heures d'agitations à 45 C, la suspension est micorfluidisée par 5 passages i 500 kPa dans un microfluidiseur
M110S (Microfluidics Co.) pour former une population homogène de liposomes majoritairement unilamellaire d'environ 100 nm de diamètre et
contant l'uréase.Ces liposomes sont purifiés par gel filtration (Colonne
de Sépharose CL-4B, Pharmacia). Le taux d'encapsulation de l'uréase,
mesuré par dosage de protéine i raide du kit Micro BCA (Pierce) est de
14,5 %. Si nécessaire, la suspension liposomale est concentrée par
uhrafiltration dans une cellule Novacell (Filtron) possédant une limite
d'exclusion de 10 kD.

2.A. c) uréase en liposomes, adjuvé par du MPLA
Lorsque l'on prépare des liposomes, du MPLA (Extrait d'E coli ; Sigma)
peut être ajouté au mélange lipidique, dans la proportion de 1,2 ou 5 %
par rapport i la masse de lipide.

2.B. Protocole d'immunisation
Deux protocoles d'iminunisation sont testés. Il s'agit de:
1) sous-cutanée (alum) / [orale (intragastrique) + nasale] (liposomes)
2) sous-cutanée (liposomes) / [orale (intragastrique) + nasale] (liposomes)
Des souris OFI reçoivent par voie sous cutanée:
- soit 20 g uréase adjuvée par de l'alum comme décrit dans la section
2.A a) sous une volume final de 500 l,
- soit 20 g uréase en préparation liposomale telle que obtenue dans
la section 2.A. b) sous un volume de 500 l.

28 jours après l'injection sous-cutanée, les souris reçoivent en simultaaé:
- par voie orale, (intragastrique), 20 g uréase en préparation
liposomale telle que obtenue dans la section 2.A b), sous un volume
de 500 l ; et
- par voie nasale, 20 g uréase en préparation liposomale telle que
obtenue dans la section 2.k b), sous un volume de 50 l
15 jours après le rappel, restomac et les glandes salivaires des souris sont
prélevés; les cellules sont extraites selon le protocole débit dans le préambule
aux exemples et b réponse IgA est analysée en Elispot selon la méthode décite
dans le préambule.

Les résultats sont présentés dans les Figures 3 et 4. La Figure 3 montre
que, dans le cas du protocole sous-cutanée (alum) / [orale (intrrique) +
nasale] (liposomes), la réponse IgA dans les glanes salivaires (3 a), bien que
faible, est majoritaire, tandis que pour ce qui est de restomac (3b), 3 souris sur
5 répondent à l'immunisation avec un nombre élevé de spots.

La Figure 4 montre que, dans k cas du protocole sous-cutanée
(liposomes) I [orale + nasale] (liposomes), la réponse est très bonne dans ks
glandes salivaires (4a) tandis qu'elle est faible dans l'estomac (4b). Ceci suggère
qu'outre le protocole utilisé, la formultion de rantigène à son importance.

Exemple 3 : Kit de vaccination contre les infections à H. pylori
Dans un kit, sont réunies trois préparations contenant l'apoenzyme de uréase d'
H. pylori, formulées chacune de manière diffèrente, selon le mode d'administration envisagé.

3.A. Préparation de l'anoenzyme
A partir d'un des plasmides décits dans Labigne et al (supra) (pILL914),
on génère par PCR, à raide des amorces OTG5973 et OTG5974, un fragment
codant pour la partie N-terminale d'UreA (jusqu'au site HindIII intene) et
contenant un site BspHI au niveau du codon d'initiation de la traduction de
UreA.

BspHI
OTG5973: CCCAAATC ATG AAA CTC ACC CCA AAA GAG TTA
Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu
GAT AAG TTG
Asp Lys Leu
HindIII
OTG 5974 : GCTTCTACATAGTTAAGCTTAATGCCTT
Le fragment généré par PCR est digéré par BspHI et HindIII et inséré simultanément avec le fragment Hindi de 2.35 kb de pILL914 porteur de la partie 3' de ureA et de weB, dans le vecteur pTG3704 digéré par NcoI et
HindIII, pour donner le plasmide pTG8665 tel que montré dans la Figure 5. Ce plasmide porte les gènes ureA et ureB flisionnés au promoteur araB. Le vecteur pTG3704 est décrit dans la demande de brevet européen EPA 584 266 publiée le 9 Mars 1994. Ce vecteur dérive du plasmide para13 (Cagnon et al, Prot. Eng.

(1991) 4 : 843), par destruction du site Sphî par traitement 9 la polymérase
Klenow.

On transforme la souche d'E li Xac-I (Normandy et al, PNAS (1986) 83 : : 6548) par le plasmide pTG8665. La souche transformée est mise en culture en milieu LB complémenté å à 100 g/ml d'ampicilline. En phase exponentielle de croissance, on ajoute 0.2 % d'arabinose en vue d'induire Pexpression de sreA et ureB. Après différents temps drmduction (1 à 3 hrs), le niveau de production de
UreA et UreB est très élevé (environ 10 % des protéines totales) et on prélève alors les cellules.

220 g de cellules sont récupérées par centrifligation à partir de 2,51 de cultures.

Ces cellules sont reprises dans environ 1 litre de tampon phosphate de sodium 20 mM pH 7.5 contenant 175 mg de PMSF (1 mM). Puis on ajoute i la suspension cellulaire 4 l une solution de benzonase à 250 / l (Merck ; ref.

1654), soit 1 unitélmi final, ainsi que 1 ml d'une solution de MgCl2 1 M On laisse agir pendant 30 min.

La suspension est ensuite introduite dans un appareil Rannie (homogénéisateur haute-pression) et soumise à une pression de 1.000 bars pendant 1 h, afin de casser les cellules.

Deux méthodes de purification peuvent être ensuite alternativement choisies.

3A a) Preinière méthode
Le cassage des cellules est suivi par densité optique. Lorsque la D.O. est de l'ordre de 2,5 - 2, la suspension est retirée de l'appareil, et supplémentée avec 1 ml d'une solution d'EDTA 0,5 M On centrifuge pendant 2 hrs à 10.000 rpm, puis on récupère le surnageant qui est centrifugé à 100 000 x g pendant 1 heure afin d'éliminer les
La purification est réalisée selon un protocole voisin de celui décrit par Hu et al, Infect. Immun (1992) 60 : : 2657.Le surnageant contenant les protéines solubles est ajusté à pH 6,8 puis chargé avec un débit de 4ml/min sur une colonne d'échange d'anions (DEAE-Sepharose
Pharmacia) de volume 5cm x 25 cm, équilibrée avec le tampon KPO4 20 mM pH 6,8 contenant du PMSF lmM (tampon PO). La colonne est éluée par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de KCl. Des fractions de 14 ml sont recueillies et analysées par SDS PAGE. Les fractions contenant l'uréase sous la forme la plus pure sont rassemblées.

On ajoute à la fraction ainsi obtenue du KCI afin que la concentration finale en KCl soit égal à 1M, la solution est chargée sur une colonne de
Phényl-Sépharose (Pharmacia). La colonne est éluée par un gradient de
KCl de 1 M à 0 M. Comme précédemment les fractions sont recueillies et analysées par SDS PAGE. Les fractions contenant l'uréase sous la forme la plus pure sont rassemblées et dialysées contre un tampon KPO4 20mM pH 7,5.

La fiaction obtenue est chargée sur une colonne d'échange d'anions (Q Sepharose Fast Flow; Pharmacia) équilibrée avec le tampon KPO4 20mM pH 7,5; comme précédemment la colonne est éluée par un gaadiadt linéaire de 0 à 0,5 M de KCl et les fractions sont recueillies et analysées par SDS PAGE.

Les fractions contenant l'uréase sont rassemblées, concentrées par diafiltration sur une membrane dont le seuil de coupure est de 100 kDa et la fraction est déposée sur une colonne de gel filtration (Sephacryl 400
HR) équilibrée dans le tampon NaPO4 20mM pH 7,5, après analyse par
SDS PAGE des différentes fractions, celles contenant l'uréase sont recueillies, concentrées par diafiltration sur une membrane dont le seuil de coupure est de 100 kDa et la solution est filtréesur une membrane de porosité 0,22 m. Une solution de saccharose stérile est ajoutée à la solution d'uréase pour obtenir une concentration finale de 2%.La solution est ensuite lyophilisée et est conervéesous cette forme dans Parente des étapes ultérieures.

3.A. b) Deuxiéme méthode
Ce surnageunt est ajusté à pH 7,5 puis chargé à un débit de 4 ml/min, sur une colonne d'échange d'anion (Q - Sepharose fast flow : Pharmacla ; rif 17-0510-01) de volume 5 cm x 25 cm, équilibrée avec un tampon d'équilibre KPO4 20 mM pH 7,5 contenant du PMSF 1 mM. La colonne est éludée par un gradient linéaire de O à 0,5 M de KCl dans le tapon d'équilibre (voL du gradient: 2,251; débit : 4 ml/min).

On recueille des fractions de 14 ml que Pon analyse par SDS-PAGE. Les fractions les plus propres sont collectées et assemblées (en général il s'agit des fractions 82 à 121 i partir du début du gradient).

Le pool Q - Sepharose est chargé à un débit de 2 ml/min, sur une colonne de chelate de zinc (Chelating - Sepharose Last flow ; Pharmacia ; rea. 170575-02) de volume 2,6 cm x 11 cm, auparavant préparée comme suit.

La colonne est chargée en métal avec 2 volumes d'une solution de ZnCI2 0,2 M, puis rincée avec 3 volumes de NaCI à 0,5 M et ensuite avec 3 volumes d'un tampon d'équilibrage Tris-HCl 50 mM pH 8, contenant du
NaCI 0,5 M, de rimidazole 1 mM et du PMSF 1 mM. La colonne est lavée par 1 volume du tampon d'équilibrage à 10 mM d'imidazole puis rincée par 3 volumes du tampon d'équilibre a 1 mM d'imidazole.

Une fois la charge effectuée, on lave la colonne avec le tampon d'équilibrage jusqu'au retour à la ligne de base (lavage mis en oeuvre pendant la nuit à 0,2 ml/min).

La colonne est ensuite lavée par 200 ml de tampon d'équilibrage à 7,5 mM d'imidazole à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min.

L'élution a lieu en gradient linéaire de 7,5 mM à 30 mM d'imidazole dans le tampon d'équilibrage (volume du gradient: : 250 mi; débit 1 ml/min).

On recueille des fractions de 10 ml que l'on analyse par SDS-PAGE. Les
fractions contenant ruréase pure sont collectées et assemblées (en général,
il s'agit des fractions 19 à 30 à partir du début du gradient).

Le pool chelating-Sepharose est ensuite concentré par ultrafiltration sur
membrane Amicon YM100, jusqu'à 25 ml.

Ce concentré est ensuite chargé sur une colonne de Sephavyl S-300
(Pharmacia ; ref. 17-0599-01) de volume 2,6 cm x 96 cm équilibrée en
tampon KPO4 20 mM, NaCI 0,15 M, pH 7,5.

La chromatographie s'effectue à un débit de 0,5 ml/min On récupère des
fractions de 10 ml que l'on analyse par SDS-PAGE. Les fractions
contenant ruréase pure sont assemblées (en général, il s'agit des fractions
21 à 27 à partir de la fin de la charge) et concentrées jusqu'à environ 2,5
mg/ml par ultrafiltration sur membrane Amicon YM100. La préparation
de l'apoenzyme est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 m et est
conservée congelée à -20 C ou lyophilisée en présence de sucrose par
exemple.

Les préparations du kit sont les suivantes: 3.B. Apoenzyme adjuvée cm alum pour administration par voie sous cutanée
Une dose pour injection est préparée en adsorbant 20 l de la solution d'apoenyme obtenue en 3.k (soit 50 g) avec 250 l d'une préparation d'hydroxide d'aluminium (alhydrogel ; Superfos) à 1 mg/ml, aprés une adsorption de 2 hrs à +4 C, le volume final est ajusté à 500 l par l'addition de
PBS.

3.C. Apoenzyme en liposomes, pour administration par voie naso-buccale,
en aérosol
La forme apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori est encapsulée dans des liposomes. Ces liposomes présentent un diamètre moyen de 100 nm et une teneur en protéine de 60 g/mg de lipide.

On administre par voie naso-buccale une quantité totale de 0,1 mg d'uréase formulée. On utilise un aérosol à deux embouts (nez et bouche) de type commercialisé par la société VALOIS (Le Prieuré, BPG, 27110 Le Neubourg).

Des pompes permettent de délivrer un volume fini dépendant du type de pompe, un embout de taille variable s'adaptant sur le récipient muni de sa pompe (300 pi maximum par administrtion, cette dose pouvant être répétée dans des délais choisis).

3.D. Apoenzyme en liposomes pour administration intragastrique
On administre une quantité totale de 0,5 mg d'uréase formulée par voie intragastrique. L'apoenyme est préparée selon la méthode décrite dans le paragraphe 3.C., puis lyophilisée et reprise par 20 ml d'une solution de bicarbonate 1200 'L 3.E. Protocole d'immunisation
Un adulte recoit en sous-cutanée, la dose préparée en 3.B. 28 jours après la primo injection, il reçoit par voie naso-buccale, la dose préparée en 3.C. et ingère le même jour, la dose préparée en 3.D.

Claims (22)

Revendications

1. Une composition pharmaceutique destinée à induire chez un mammifère hôte, une

réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site mucosal

effecteur, qui comprend, pour une administration concomitante ou consécutive : (i) de

manière optionnelle, un premier produit et, (ii) au moins un deuxième et un troisième

produit ; ces trois produits identiques ou différents, contenant chacun un agent

inducteur de la réponse immunitaire sélectionné parmi l'antigène et à condition que

l'antigène soit de nature protéique, une cassette d'expression capable d'exprimer

l'antigène ; le premier produit étant formulé de manière à être administré par voie

systémique, le deuxième produit étant formulé de manière à être administré par voie

naso-buccale afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les site(s) inducteur(s)

d'une réponse immunitaire au niveau du naso-oro-pharynx ou des glandes salivaires, et

le troisième produit étant formulé de manière à être administré par une voie mucosale

appropriée autre que la voie nasale, afin que l'agent inducteur soit ciblé vers le ou les

site(s) inducteur(s) d'une réponse immunitaire au niveau du site effecteur où la

réponse immunitaire est recherchée.

2. Une composition selon la revendication 1, dans laquelle le premier produit est formulé

de manière à être administré par voie parentérale.

3. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte,

une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau de l'appareil respiratoire

(bronches, naso-pharynx, poumons), dans laquelle le troisième produit est formulé

pour être administré par voie pulmonaire.

4. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte,

une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau d'un site effecteur

mucosal sélectionné parmi le groupe constitué de l'intestin et des muqueuses génitales,

dans laquelle le troisième produit est formulé pour être administré par voie uro

génitale.

5. Une composition selon la revendication 1 ou 2, pour induire chez un mammifère hôte,

une réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, au niveau de l'estomac ou de

l'intestin, dans laquelle le troisième produit est formulé pour être administré par voie

orale, y compris la voie intragastrique.

6. Une composition selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le premier produit

contient en outre un adjuvant tel que l'hydroxide ou le phosphate d'aluminium ou par

un adjuvant de type ISCOM.

7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le deuxième

produit est formulé sous forme de particules telles que des liposomes ou des

microsphères.

8. Une composition selon la revendication 7, dans laquelle le deuxième produit est

formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 llm.

9. Une composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le troisième

produit est formulé sous forme de particules telles que des liposomes ou des

microsphères, pour être administré par voie pulmonaire ou par voie orale, y compris

la voie intragastrique.

10. Une composition selon la revendication 9, dans laquelle le troisième produit est

formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 clam, pour être

administré par voie pulmonaire.

11. Une composition selon la revendication 9, dans laquelle le troisième produit est

formulé sous forme de particules ayant un diamètre de 0,05 à 5 ",lm, pour être

administré par voie orale, y compris la voie intragastrique.

12. Une composition selon l'une des revendications 10 à 11, dans laquelle le deuxième ou

le troisième produit est un spray ou un aérosol.

13. Une composition selon l'une des revendications 1 à 12, dans laquelle le troisième

produit est une préparation entériquement protégée.

14. Une composition selon l'une des revendications 1 à 13, dans laquelle le deuxième ou

le troisième produit contient en outre un adjuvant dépourvu de toxicité, autre que les

sous-unités non-toxiques ou les formes détoxifiées des toxines bactériennes et autre

que des liposomes ou des microsphères.

15. Une composition selon l'une des revendications 1 à 14, dans laquelle le deuxième ou

le troisième produit contient en outre du MPLA.

16. Une composition selon l'une des revendications 1 à 15, dans laquelle l'agent inducteur

contenu dans le premier, le deuxième ou le troisième produit est l'antigène.

17. Une composition selon l'une des revendications 1 à 16, dans laquelle les agents

inducteurs contenus dans le deuxième et troisième produits sont les mêmes.

18. Une composition selon la revendication 17, dans laquelle les agents inducteurs

contenus dans le premier, deuxième et troisième produits sont les mêmes.

19. Une composition selon l'une des revendications 2 à 18, dans laquelle le premier

produit est formulé pour être administré par voie sous-cutanée, intra-dermique ou

intra-musculaire.

20. Une composition selon l'une des revendications 1 à 19, dans laquelle l'antigène est un

antigène d'une bactérie pathogène pour le mammifère hôte.

21. Une composition selon les revendications 5 et 20, dans laquelle l'antigène est un

antigène d'Helicobacter pylori.

22. Une composition selon la revendication 21, dans laquelle l'antigène est la forme

apoenzymatique de l'uréase d'H. pylori.