JP2005509598A - エクスビボで抗体を産生する方法 - Google Patents

Abstract

鳥類種、特に家禽類について飲料水もしくは食物のいずれかの中に投与するための、またはエアゾール化してメスのニワトリの上方に散布するための医薬組成物であって、２〜３０ポリオキシエチレン単位を含むＰＥＧ’ｓから選択される水溶性ポリマー基と結合したモノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドと、抗原と、必要に応じて細菌毒素、好ましくはＣＴＢとを含有してなる溶媒系からなる医薬組成物が、卵黄中での抗体産生について有用である。結合したグリセリドによって、動物のストレスおよび侵襲的手法を最小化しつつ、卵黄中でのエクスビボ抗体産生を増加させることが可能となる。

Description

本発明は、家禽類、特にメスのニワトリなどの鳥類種において、アジュバントと一緒に抗原を当該生物種の粘膜（口の膜、呼吸器の膜、目の膜および耳の膜）に投与することによって卵黄中の抗体産生を増加させるための新規な非侵襲的手法に関する。

侵襲的手法、たとえば、不完全フロイントアジュバントなどの種々のアジュバントを用いて抗原またはワクチンを筋肉内注射、皮内注射または皮下注射経由でメスのニワトリなどの動物に投与することなどは、ポリクローナル抗体を産生させるための通常のやり方であるとみなされている。しかしながら、このような注射には、ある範囲の不都合が存在する。これらには滅菌した注射針を用いる必要があり、そしてこれらによって、ストレス、痛みおよび炎症が動物に生じるかもしれず、特に繰り返し注射する場合は感染リスクなどを含み、これらは十分に許容され得るものではない。筋肉内注射の場合に、特に刺激性のアジュバントを用いた後では、注射部位において硬結（組織が硬くなること）、出血（血液が漏れ出ること）および／または膿瘍の形成および／または壊死（組織の局所的な死）が生じ得ることはより顕著である。さらに、訓練を受けていない人物または資格がない人物が注射にて動物に投与することは許されない。

米国特許第５，７５３，２２８号には、動物に激しい痛みと病気とを生じさせる物質である完全フロイントアジュバントを用いて、メスのニワトリの皮下に抗原を投与することによって、卵黄中での抗体産生を増加させるための方法が開示されている。米国特許第６，１４３，５５９号にはさらに、メスのニワトリに抗原を注射することによって、抗体を産生させる方法が開示されている。

メスのニワトリなどの家禽類に抗原を粘膜投与することは、現在特別の関心が持たれている。というのは、この経路によって、非経口投与に関連する生物体への直接的な介入によって引き起こされる不都合であって、繰り返して注射などをする期間のストレス、出血または心理的なトラウマさえをも生じさせる不都合を避けられるかもしれないからである。

さらに、訓練を受けていない人物または資格がない人物が実施することが許容されていることから、この投与経路を都合よく用いることができるかもしれない。

種々のアジュバントを用いて、経口にて、呼吸器を介して、さらにはその他の粘膜表面を経由して、メスのニワトリなどの家禽類に抗原を粘膜投与することが試みられてきた。粘膜表面を経由して、このような抗原での局所的な免疫応答が惹起されることがこのような場合においては予想できない、と判断することはできない。というのは、粘膜に病原体が侵入するのは自然なことであり、無症状感染を経由して免疫が生じるからである。しかしながら、卵黄全体での抗体産生を増加させることは困難である。なぜならば、サブユニットタンパク質、精製抗原およびワクチンは、卵に応答を生じさせる誘導物質としては十分なものではないからであり、したがって、卵中で抗体を産生させるためには、効果的な製剤およびアジュバントがますます必要となる。

したがって、適切な医薬組成物の形態で抗原を投与することが必要である。家禽類にて抗体を産生させるのに用いる組成物を開発するために、抗原の化学的特性に依存して異なる態様を検討する必要があるかもしれない。

粘膜投与のための薬物送達システムとして種々の溶媒を用いるということの可能性について、文献内で検討されてきた。このような溶媒系を用いる場合、賦形剤だけでなく抗原も血流内に迅速に吸収されるかもしれない。多数の溶媒系を用いる際に直面する課題のうちのいくつかは、賦形剤が吸収されるかもしれないという事実に関するものであり、そしてその結果、生体適合性および生体分解性が要求される。それゆえに、動物にいかなる形の害をも生じさせることがなく、そしてそれと同時に卵黄中での抗体産生を増加させるようなアジュバントシステムであって、家禽類に安全に投与することが可能なアジュバントシステムを含有する抗原性組成物を提供する必要がある。

国際公開公報第９９／０２１８６号には、抗原と、エトキシル化モノおよび／またはエトキシル化ジグリセリドを含むアジュバントとを含有する、ヒトを免疫化するための医薬組成物が開示されている。特定の病原体を阻害するかまたは除去するような適切な免疫応答を惹起するための、極めて多数の動物にとって有用な医薬組成物についても記載されている。それゆえに、動物における所定の病気を予防するかまたは治療することについて、この組成物は有用である。家禽類において工業規模で抗体を製造するために、同様の組成物を用いることについては、示唆されていない。

米国特許第４，３４９，５４０号には、ポリオキシエチレン化オレイン酸グリセリドだけでなくペプチドグリカンも含有する抗原調製品が開示されており、その中で、アジュバントとしてペプチドグリカンが用いられていること、それゆえにポリオキシエチレン化オレイン酸グリセリドが組成物中で可溶化剤としての機能を果たしていることが記載されている。

驚くべきことに、２〜３０のポリオキシエチレン単位を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ’ｓ）から選択される水溶性ポリマー基が結合したモノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドまたはその混合物と、抗原とを含んでなる溶媒系によって、非侵襲的投与法に起因するストレスまたは痛みを動物に生じさせることなく、卵黄中での顕著な抗体の産生、特にポリクローナル抗体の産生が提供されることが明らかになった。同時に本発明によるシステムは環境への負担が小さい。

したがって、本発明の第一の目的は、動物にストレスを生じさせることがなく、結果として多量の免疫特異的抗体を卵黄中で産生させるような、鳥類種、特にメスのニワトリなどの家禽類における粘膜表面に抗原を投与するための方法および組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、家禽類における粘膜投与のための送達システムを提供することであり、ここでの送達システムは天然原料を基礎とし、それゆえに環境への負担が小さいものである。

本発明は、鳥類の卵黄中でポリクローナル抗体を産生させるために、鳥類種への粘膜投与用の抗原を含有する生理学的に許容され得る組成物の中のアジュバントとして、式（Ｉ）のモノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドの一種または複数を使用することに関する。

式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃の一つまたは二つは、飽和もしくは不飽和の脂肪酸またはアルコールのＣ₆〜₂₄の残基であって、そして残りの一つの基／複数の基は、ポリオキシエチレンのＰＥＧ₂〜₃₀の残基から選択される水溶性ポリマー基である。

本発明はさらに、抗原を含有する組成物であって生理学的に許容され得る組成物中のアジュバントとして、式Ｉによるモノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドの一種以上を、粘膜を経る経路にて鳥類種、特に家禽類に投与するステップを含む、鳥類の卵黄中でポリクローナル抗体を産生させる方法に関する。

本発明にしたがって用いられるアジュバントの化学構造の例を、（ＩＩ）〜（Ｖ）に示す。ここで、水溶性ポリマー基はＰＥＧ₃〜₆（ポリオキシエチレンの３〜６残基を含有するＰＥＧ）、すなわち−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）₃〜₆−ＯＨである。

式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は、飽和もしくは不飽和の脂肪酸またはアルコールのＣ₆〜₂₄の残基であり、好ましくは飽和のＣ₈〜₁₈の残基であり、およびより好ましくは飽和のＣ₈〜₁₄の残基である。好ましい態様において、Ｒ₁およびＲ₂は飽和のＣ₆〜₁₈のアルコール残基であり、そしてより好ましくは飽和のＣ₈〜₁₂のアルコール残基である。

ポリオキシエチレンのＰＥＧ₂〜₃₀残基またはその誘導体は２〜３０ポリオキシエチレン単位を有し、およびより好ましくは３〜６ポリオキシエチレン単位を有する。

組成物中の（ＩＩ）〜（Ｖ）によって乳化されるグリセリドの濃度は、０．０１％から３０％まで変化してもよい。モノグリセリドとジグリセリドとの間の比率は、０．１％：９９．９％から９９．９％：０．１％まで変化してもよく、好ましくは５％：９５％から９５％：５％まで変化してもよい。グリセリド中のキラル炭素は、Ｓ体またはＲ体のどちらでもよい。エステルグリセリドとエーテルグリセリドとの間の比率は、０：１００％から１００：０％まで変化してもよく、好ましくは０：１００％または１００：０％である。より好ましい組成物は、モノ／ジ脂肪酸グリセリド（エステルグリセリド）だけを含有するものである。エーテルグリセリドとエステルグリセリドとの間の相違点を、ＶＩ（エーテルグリセリド）およびＶＩＩ（エステルグリセリド）によって、より明確に示す。

モノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドの濃度は、０．０１から３０％ｗ／ｗの範囲内であればよく、０．５から２０％が好ましく、および１から１５％がより好ましい。

組成物は細菌毒素もしくはその誘導体またはそのサブユニットをさらに含有してもよい。好ましい毒素はコレラ毒素であり、より好ましくはコレラ毒素ＢサブユニットＢ（ＣＴＢ）である。組成物に毒素を添加すると、結果として、形成される抗体の収率が改善する。

本発明にしたがって用いられる組成物は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および／または一種以上の防腐剤が混合した状態のアジュバントを提供する懸濁液、エマルションまたは分散体であってもよい。このような組成物は、消化器の粘膜、頬の粘膜、鼻の粘膜、直腸の粘膜、目の粘膜、呼吸器の粘膜、または膣の粘膜などの粘膜上での使用に適するべきである。適切な分散剤もしくは湿潤剤としては、例えば、レシチンまたはダイズレシチンなどの自然に存在するリン脂質や、エチレンオキシドと、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、または脂肪酸およびヘキシトールもしくはアンヒドロヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどがある。適切な懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、またはトラガカントゴムなどの自然に存在する粘性物質や、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース（たとえばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＲＣ５９１）、メチルセルロースなどのセルロースや、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩がある。本発明にしたがって用いられる組成物中での使用に適した防腐剤の例としては、パラオキシ安息香酸メチルまたはパラオキシ安息香酸プロピルなどのパラベン類、および塩化ベンザルコニウムがある。

頬の粘膜、口の粘膜、耳の粘膜、目の粘膜または鼻の粘膜へ塗布するために、組成物を吸入用のスプレーまたはエアゾールとして投与してもよい。典型的な頬用／口用または鼻用の組成物において、抗原は粒子状組成物の形態で、必要に応じて適切な溶媒内に分散した形態で存在する。薬学的に許容され得る溶媒および賦形剤、そして必要に応じてその他の薬学的に許容され得る材料が組成物中に存在し、たとえば、希釈剤、賦活剤、香料、防腐剤などはすべて従来からの製薬上の実務にしたがって、医薬の調剤分野の当業者によって理解されるやり方で選択される。本発明にしたがって用いられる組成物を投与した後は、最も近接したリンパ組織によって抗原が取り込まれるのかもしれない。粘膜に吸着することは、たとえば、浸透賦活剤または浸透促進剤などを含有する液体溶媒を採用する場合よりも刺激の影響を小さくすると考えられている。

口の粘膜に適用するために、本発明にしたがって用いられる組成物は、ミクロスフェアおよびリポソームを含めた、従来より用いられている無毒性の薬学的に許容され得る担体および賦形剤を含有してもよい。薬学的に許容され得る賦形剤には、乳化剤、酸化防止剤、緩衝化剤、防腐剤、保水剤、キレート剤、またはゲル化剤を含めてもよい。

乳化剤の例としては、自然に存在する粘性物質、たとえばアラビアゴムまたはトラガカントゴム、自然に存在するリン脂質、たとえばダイズレシチン、およびモノオレイン酸ソルビタン誘導体がある。酸化防止剤の例としては、アスコルビン酸およびシステインがある。防腐剤の例としては、パラオキシ安息香酸メチルまたはパラオキシ安息香酸プロピルなどのパラベン類、および塩化ベンザルコニウムがある。保水剤の例としては、グリセリン、プロピレングリコール、およびソルビトールがある。上記の製剤は、関連する体の（単数または複数の）開口部、たとえば鼻、目、肺、頬、直腸、尿道、膣または口の開口部内に導入することに適している。組成物をただ単に直接粘膜上に添加してもよい。

多くの粘膜用組成物にとって、いくつかの賦形剤の特化した混合物が必要とされている。したがって、多くの組成物は、一種以上の界面活性剤および／または吸水性ポリマーおよび／または酵素による分解を阻害する物質および／またはアルコール、ｐＨ調整剤、可溶化剤、安定剤、ＨＬＢ調整剤、粘度調整剤、浸透圧調整剤、水ならびにこれらの混合物を含んでもよい。ノノキシノール、オクトキシノール、ツィーン類、スパン類、ラウリル硫酸ナトリウム、モノパルミチン酸ソルビタンから、界面活性剤を選択してもよい。グリコフロールおよびその誘導体、ポリエチレングリコール２００〜７５００およびその誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、プロピレングリコール、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体から、吸水性ポリマーを選択してもよい。アプロチニン、ＤＦＰ、カルボポールから、酵素による分解を阻害する物質を選択してもよい。酢酸、塩酸、硝酸、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、トロラミンから、ｐＨ調整剤を選択してもよい。アルコール、イソプロピルアルコール、水、グリコフロール、ポリエチレングリコール２００〜７５００から、可溶化剤を選択してもよい。シクロデキストリンなどが安定剤としてある。Ｔｗｅｅｎ２０〜８５、Ｓｐａｎ２０〜８０、Ｂｒｉｊ３０〜９８、アカシアから、ＨＬＢ調整剤を選択してもよい。セルロースおよびその誘導体、Ｔｗｅｅｎおよびその誘導体、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、セチルアルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、ゼラチンから、粘度調整剤を選択してもよい。デキストース、塩化ナトリウム、マンニトールから、浸透圧調整剤を選択してもよい。

本発明にしたがって用いられる組成物において採用される抗原は、卵黄中での抗体産生の増加に適したものであるべきである。抗原としては、タンパク質、薬物または（診断目的のため、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどの分析用の作製のための）酵素、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、プリオン感染、もしくは寄生虫感染に対するワクチンなどのワクチン、ＩｇＡプロテアーゼ、ｐ３８タンパク質、ｐ４３タンパク質もしくはムチナーゼなどの微生物が産生する成分でかまわない。抗原は、さらにチリダニ類、ネコアレルゲン、ライグラスの花粉、ブタクサの花粉、ユスリカ、卵白、乳タンパク質、ハチの毒液などのアレルゲンであってもよく、またはミエリン、インスリンのＢペプチドなどの自己免疫疾患を誘発する原因となる成分であってもよい。抗原はさらに、癌抗原などの疾患の抗原であってもよい。本発明による技術を用いて産生し得る適切な抗体としては、多種の癌を治療するのに特異的な抗体、アルツハイマー病を治療するのに特異的な抗体（抗アミロイド抗体）、抗サイトメガロウイルス抗体または抗ＨＴＬＶ抗体もしくは抗ＲＳＶ抗体などのウイルス性の病気を治療するのに特異的な抗体、抗マラリア抗体などの寄生虫病を治療するのに特異的な抗体である。免疫グロブリンを単離するものとして知られている従来からのタンパク質精製手法、たとえば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたはその他の当業者が知っている技術を採用して、卵黄から抗体を回収する。当業者が、たとえば抗体を回収することとして知っている技術を用いて、抗体を同定してもよく、そして抗体を同定するためにＥＬＩＳＡを用いることは、米国特許第６，１４３，５５９号に記載されている。

粒子状の形態でまたは溶解した形態で、抗原を用いてもよい。組成物は、溶解した抗原に特に適している。しかしながら、組成物内で抗原を粒子状の形態に分散させることも容易である。

本発明にしたがって用いられる組成物は、メスのニワトリへの投与に特に適している。この製剤の性質は、種々の方面における免疫応答に影響を与える可能性を提供する。そしてそれゆえに、様々な年齢のメスのニワトリにこの組成物を用いてもよい。本発明にしたがって用いられる組成物は、シチメンチョウ、ガチョウ、ダチョウ、アヒルまたは野鳥などのその他の鳥類種にも非常に適したものである。

鼻の粘膜、肺の粘膜、口の粘膜、目の粘膜、耳の粘膜、消化管の粘膜、膣の粘膜、直腸の粘膜などの種々の粘膜表面に組成物を投与してもよく、目の粘膜、鼻の粘膜および口の粘膜が本組成物にとって非常に適している。このような場合において、スプレー、液滴として組成物を投与すべきであるか、または飲料水もしくは食物に組成物を添加すべきである。

１．５μｇの（ａ）ヒトＩｇＧと、（ｂ）コレラ毒素Ｂサブユニットと、（ｃ）ミエリン塩基性タンパク質とを含有する１００μＬの組成物を、次の組成（Ｉ）等張食塩水（比較）と、組成（ＩＩ）６ポリオキシエチレン（ＰＥＧ₆）単位を含むＰＥＧ化Ｃ８／Ｃ１０のモノ／ジグリセリドである「Ｓｏｆｔｉｇｅｎ７６７」（Ｃｏｎｄｅａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧで販売されている）が５％の等張食塩水（本発明によるもの）にて、メスのニワトリに経口投与するとともに、比較のため、組成（ＩＩＩ）従来技術によるＦＩＡ（不完全フロイントアジュバント）にて腹腔内（ｉｐ）注射した。最初のワクチン接種の四週間後に、メスのニワトリに同一のワクチンを含有するブースターを与えた。ブースターの後に卵を集め、そして卵黄中の抗体を単離してその濃度を測定した。ヒトＩｇＧを含有する組成物ａ）に対する結果は、次のとおりであった（卵黄中の抗体濃度）。
（ａ）食塩水：０ＡＵ／ｍＬ
（ｂ）Ｓｏｆｔｉｇｅｎ：７０，０００ＡＵ／ｍＬ
（ｃ）ｉｐ投与でのフロイントアジュバント：９０，０００ｍＬＡＵ／ｍＬ

ｉｐ注入によって得られるものより桁違いに高い力価の抗体が、本発明にしたがって用いられるアジュバントによって得られることがわかる。

総計で１８羽の非近交系白色レグホーン種のニワトリ（２０週齢、３６系統、スウェーデン大学農学部）を、この研究に使用した。レフスタ−フンボ（Ｌｏｅｆｓｔａ−Ｆｕｎｂｏ）（スウェーデン大学農学部、ウプサラ、スウェーデン）にて、一羽用のゲージ内にこれらを収容し、８時間の暗期と１６時間の明期とした。エサ（レフスタ−フンボにて製造されたもの（１０））と水道水とを自由に摂取できるようにした。温度を１８〜２３℃とし、そして通気状態をコントロールした（湿度は測定せず）。実験の開始時点のニワトリの体重は１３６１ｇ（±１６０）であった。免疫化プログラムを通して、卵を集めて個々に印を付け、そして１０ヶ月後メスのニワトリの全血を、麻酔下（メトミダトの２０ｍｇ／ｋｇを筋肉注射＋ジアゼパムの２．５ｍｇ／ｋｇを静脈注射）で採取した。試験群は、各群につき二羽のメスのニワトリから成るものであった。ポジティブコントロール群以外は、経口での胃管栄養法によってすべてのメスのニワトリを免疫化し、そして次のアジュバントのうちの一つと共に、１００μｇのヒトＩｇＧを与えた。抗原／アジュバント混合物の投与後に、胃管栄養法によって１ｍＬの食塩水を投与した。

Ａ群：Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドのコポリマー（ＰＬＧ）のミクロスフェア、ダブルエマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗ型）の手順で作製されたもの（６２．５ｍｇ／ｍＬ）を与え、そして１日目と１４日目に１ｍＬ／ニワトリの分量を投与した。

Ｂ群：１ｍＬのＰＢＳにＰＬＧ（６．２５ｍｇ／ｍＬ）を懸濁させたものを与え、そして１日目、２日目、３日目および１７日目に１ｍＬ／ニワトリの分量を投与した。

Ｃ群：食塩水にコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を（ＣＴＢ：ＩｇＧのモル比で）１０：１に混合したものを与え、そして１日目、１４日目および３３日目に投与（分量：２００μＬ）した。

Ｄ群：食塩水にコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を（ＣＴＢ：ＩｇＧのモル比で）３：１に混合したものを与え、そして１日目、１４日目および３３日目に投与（分量：２００μＬ）した。

Ｅ群：グルタルアルデヒドによってＩｇＧと１０：１で結合させたコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を与えた。ＰＢＳに対して一晩、室温で透析した後、１日目、１４日目および３３日目に２００μＬの分量の混合物を投与した。

Ｆ群：３：１で結合させたコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を与えた。グルタルアルデヒドによって、上記のようにしてＣＴＢとＩｇＧとを結合（３：１）させた。１日目、１４日目および３３日目に、２００μＬの分量でこの混合物を投与した。

Ｇ群：ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を与えた。５００μｇのＤＤＡと１００μｇのＩｇＧを２００μＬの食塩水に溶解させ、そして１日目、１４日目および３３日目に混合（分量：２００μＬ／ニワトリ）した。

Ｈ群（本発明による）：ＩｇＧ溶液（１ｍｇ／ｍＬの食塩水）で１：２０（ｖ：ｖ）の濃度としたＳｏｆｔｉｇｅｎ（著作権表示）（Ｃｏｎｄｅａ Ｃｈｅｍｉｅ Ｇｍｂｈ、ウィッテン、ドイツ）を与えた。分量は２００μＬ／ニワトリとし、そしてこのものを１日目、１９日目および４６日目に投与した。

ポジティブコントロール群：１００μＬの食塩水（０．９％のＮａＣｌ）中に、等体積のＦＩＡ（不完全フロイントアジュバント、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、ストックホルム、スウェーデン）によって１００μｇのヒトＩｇＧ（シグマ社、ストックホルム、スウェーデン）を乳化させたもので、二羽のメスのニワトリの皮下にて１日目、１４日目、および３３日目に免疫化した。

ネガティブコントロール群：産卵頻度、卵重および体重についての基準群として、３６系統から８３羽のニワトリを用いた。

以下の記載のとおりに、卵黄からの免疫グロブリン（ＩｇＹ）の精製を実施した。卵黄分離器によって、卵白から卵黄を分離した。蒸留水で卵黄を洗浄して、不必要な卵白を除去した。卵黄膜に穴を開け、そして５０ｍＬのファルコンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、Ｌａｎｄｓｋｒｏｎａ、スウェーデン）内に卵黄を回収した。体積（当初体積と称する）を測定し、そして蒸留水で１：１０（ｖ：ｖ）に希釈した。さらに精製するまで、混合物を−２０℃で凍結させた。この混合物を室温で解凍し、クロロホルムを１：５０（ｖ：ｖ）で添加、混合して遠心分離に付した（４５分間、１８００ｇ、４℃）。上清を回収し、そしてＰＥＧ６０００の中で透析チューブ（カットオフ分子量１２〜１４０００）を用いて当初体積より少なくなるまで濃縮した。卵黄溶液を１４ｍＬのファルコンチューブ（ザルスタット社、ランスクローナ、スウェーデン）に移し、そしてその体積を当初体積に合致させた。硫酸アンモニウム（ＡｍＳ）を５０％飽和にまで添加し、そしてこの混合物を緩やかに撹拌しつつ４℃で一晩放置した。この溶液を遠心分離に付し（４５分間、１８００ｇ、４℃）、ペレットを１ｍＬの蒸留水中に溶解させ、そして０．０５％の濃度となるようにアジ化ナトリウムを添加した。分析まで、このＩｇＹ溶液を４℃で保存した。

結果：ＣＴＢ群の四羽のうちの一羽のニワトリが高力価を示し、そしてＳｏｆｔｉｇｅｎ群（本発明による）のニワトリの両方が高力価を示した。ＤＤＡ群およびＰＬＧミクロスフェア群の動物は、全くまたはほとんど力価を示さなかった。

５％のＳｏｆｔｉｇｅｎ７６７（ＰＥＧ−Ｃ８／Ｃ１０グリセリド）の等張食塩水中のヒトＩｇＧ抗原を、メスのニワトリに与えた。この組成物を、（Ｉ）鼻腔内に５μＬと、（ＩＩ）経口的に口内粘膜内に１００μＬと、（ＩＩＩ）メスのニワトリの頭部上に向けるスプレーとして１００μＬと、（ＩＶ）直腸に５μＬと、（Ｖ）皮膚に５μＬとを投与した。最初のワクチン接種の四週間後に、同一のワクチンを含有するブースターをメスのニワトリに与えた。一週間後に、卵を回収して卵黄から抗体を単離した。

Claims (17)

1. 鳥類の卵黄中のポリクローナル抗体を増加させるために、鳥類種に粘膜投与するための抗原を含有する生理学的に許容される組成物の中のアジュバントとしての、式（Ｉ）のモノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドまたはその混合物の使用。
   

   

   式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃の一つまたは二つは、飽和もしくは不飽和の脂肪酸またはアルコールのＣ₆〜₂₄の残基であって、残りの基は、ポリオキシエチレンの２〜３０残基を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ’ｓ）から選択される水溶性ポリマー基である。
2. Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃の一つまたは二つが、飽和のＣ₆〜₁₈のアルコール残基、好ましくはＣ₈〜₁₂のアルコール残基から選択される請求項１に記載の組成物の使用。
3. 水溶性ポリマー基が、２〜３０ポリオキシエチレン単位を有する、好ましくは３〜６ポリオキシエチレン単位を有するポリオキシエチレンのＰＥＧ₂〜₃₀の残基から成る請求項１または２に記載の組成物の使用。
4. ＰＥＧ置換グリセリドまたはその混合物の濃度が、約０．０１重量％から約３０重量％、好ましくは約０．５から約２０重量％、より好ましくは約０．５から約５重量％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
5. 組成物が、細菌毒素もしくはその誘導体またはそのサブユニットをさらに含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
6. 細菌毒素が、コレラ毒素もしくはその誘導体またはそのサブユニットであり、好ましくはコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）である請求項５に記載の組成物の使用。
7. 抗原が、タンパク質、細胞構成成分、薬物またはその他の物質であって、特定の抗原が、病気の治療用もしくは予防的治療用の診断目的もしくは分析目的または抗体の産生にとって都合の良いものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
8. 抗原が粒子状の形態である請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
9. 抗原が溶解した形態である請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
10. 界面活性剤、吸収促進剤、吸水性ポリマー、酵素による分解を阻害する物質、アルコール、有機溶媒、油、ｐＨ調整剤、可溶化剤、安定剤、ＨＬＢ調整剤、粘度調整剤、防腐剤、浸透圧調整剤、高圧ガス、エアーディスプレイスメント、水およびこれらの混合物からなる群より選択される一種以上の成分をさらに含有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
11. メスのニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、ダチョウ、アヒルまたはその他の鳥などの家禽類に投与するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
12. ヒト治療用のポリクローナル抗体を製造するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
13. 診断目的または分析目的のためのポリクローナル抗体を製造するための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
14. 鼻、肺、口、目、耳、消化管、生殖管、膣、または直腸の粘膜表面の群から選択される粘膜表面を経由して、好ましくは頬の粘膜、口の粘膜、鼻の粘膜および目の粘膜を経由して投与される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
15. 組成物を、飲料水または食物内に与えて経口投与するか、または鳥類種の上部に、ここでは直接その鳥類種の頭部にスプレーする請求項１４に記載の組成物の使用。
16. 抗原と、アジュバントを含有する組成物とを逐次投与する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
17. 抗原を含有する組成物であって請求項１〜６のいずれか１項に記載の生理学的に許容され得る組成物の中のアジュバントとして、ＰＥＧ結合モノ／ジ−エステル／エーテルグリセリドの一種または複数を粘膜を経る経路にて鳥類種、特に家禽類に投与することを特徴とする鳥類の卵黄中のポリクローナル抗体を増加させる方法。