BE1022174B1 - Vaccin - Google Patents

Vaccin Download PDF

Info

Publication number
BE1022174B1
BE1022174B1 BE2014/0161A BE201400161A BE1022174B1 BE 1022174 B1 BE1022174 B1 BE 1022174B1 BE 2014/0161 A BE2014/0161 A BE 2014/0161A BE 201400161 A BE201400161 A BE 201400161A BE 1022174 B1 BE1022174 B1 BE 1022174B1
Authority
BE
Belgium
Prior art keywords
peptides
immunogenic composition
picornavirus
hrv
peptide
Prior art date
Application number
BE2014/0161A
Other languages
English (en)
Inventor
Guy Baudoux
Mathieu Boxus
Brigitte COLAU
Martine Marchand
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals S.A. filed Critical Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Application granted granted Critical
Publication of BE1022174B1 publication Critical patent/BE1022174B1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C07K14/095—Rhinovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

La présente description concerne des compositions immunogènes comprenant des peptides de picornavirus humains dérivés de protéines structurales du virus, des constructions comprenant les peptides, les peptides eux-mêmes et leur utilisation dans la prévention d'une infection et d'une maladie à picornavirus. Les peptides de VP4 et VPl particuliers sont décrits.

Description

VACCIN
Arrière-plan de 1'invention
La présente description concerne le domaine des vaccins humains. Plus particulièrement, la présente description concerne des compositions pharmaceutiques et immunogènes pour la prévention ou le traitement d'une infection ou d'une maladie à picornavirus humain, en particulier d'une infection ou d'une maladie à rhinovirus humain (HRV).
Les picornaviridés sont l'une des plus grandes familles virales qui est constituée de 14 genres dont six comprennent des agents pathogènes humains. Les picornavirus bien connus sont les entérovirus (comprenant les polio- et rhinovirus), le virus de la fièvre aphteuse (FMDV) et le virus de l'hépatite A (HAV) . D'autres membres de la famille des picornaviridés sont les coxsackievirus, les échovirus, les paréchovirus humains et le virus Aichi. Les picornaviridés entraînent des maladies telles que le rhume commun, la gastroentérite, l'hépatite, la pneumonie, la poliomyélite, la méningite, la fièvre aphteuse. Bien que les infections soient souvent bénignes, certaines souches peuvent provoquer des flambées pandémiques s'accompagnant d'une méningite et/ou d'une paralysie.
Les rhinovirus sont la principale cause des infections aiguës des voies respiratoires hautes chez l'être humain, connues sous le nom de rhume commun. Ils sont également la cause virale la plus fréquente de sévères exacerbations de maladies respiratoires chroniques telles que l'asthme et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO). Actuellement, il existe plus de 100 sérotypes de HRV. La protection croisée entre ces sérotypes est faible voire nulle en raison de l'existence d'épitopes neutralisants immunodominants de type spécifique et aucun vaccin n'a été développé à ce jour. Un vaccin contre le rhinovirus qui devrait être capable de protéger contre de multiples sérotypes représente donc un large besoin médical qu'il reste à combler.
Bref résumé
La présente description concerne des vaccins contre des picornavirus humains qui contiennent des antigènes conférant une protection contre différents picornavirus, provenant soit de différents sérotypes ou souches du même picornavirus, soit de différents membres de la famille des picornavirus. Des modes de réalisation spécifiques concernent des vaccins contre des entérovirus humains, en particulier des rhinovirus, contenant des antigènes qui confèrent une protection contre différents sérotypes d'entérovirus ou HRV. Les vaccins contiennent des peptides de picornavirus de régions conservées des protéines structurales de picornavirus, qui génèrent une réponse par une réaction croisée ou une neutralisation croisée permettant de conférer une protection croisée contre une série de picornavirus, par exemple contre une série de HRV de sérotypes différents. L'invention propose une composition immunogène comprenant un premier et un deuxième peptide dérivés d'une protéine structurale d'un picornavirus, lesdits peptides étant chacun capables d'induire une réponse immunitaire par une neutralisation croisée contre deux picornavirus ou plus, et un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Certains nouveaux peptides de picornavirus et de rhinovirus de VP4 et VP1 sont également proposés ici.
Dans un autre aspect, l'invention propose un peptide de picornavirus consistant 20 acides aminés au plus depuis la terminaison N de VP4, ledit peptide comprenant les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou une variante des acides aminés 1 à 16 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité.
Dans un autre aspect, l'invention propose un peptide de picornavirus consistant en 40 acides aminés au plus depuis la région terminale N de VP1, ledit peptide comprenant les acides aminés 32 à 45 ou une variante des acides aminés 32 à 45 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité.
Dans un autre aspect, l'invention propose une particule de polypeptide chimérique comprenant un polypeptide de squelette capable de former une particule et au moins un peptide comprenant un épitope d'un polypeptide structural de picornavirus.
Dans un autre aspect, l'invention propose une composition immunogène comprenant un peptide ou une particule de polypeptide chimérique de l'invention, associé -à un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un autre aspect, l'invention propose l'utilisation d'une composition immunogène décrite ici dans la prévention ou le traitement d'une infection à picornavirus telle qu'une infection à HRV. L'invention propose en outre l'utilisation d'une composition immunogène décrite dans ce document dans la production d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une infection à picornavirus telle qu'une infection à HRV.
Dans un autre aspect, l'invention propose un procédé pour induire des anticorps neutralisants contre un picornavirus tel que HRV chez l'être humain, comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène telle que décrite dans ce document.
Dans un autre aspect, l'invention propose un procédé d'induction d'anticorps entraînant une neutralisation croisée contre des picornavirus tels que HRV chez l'être humain, comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène décrite dans ce document.
Dans un autre aspect, l'invention propose un procédé de prévention d'une infection à picornavirus ou d'une maladie à picornavirus associée à une infection à picornavirus, telle qu'une infection à HRV ou une maladie à HRV associée à une infection à HRV, ledit procédé comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène telle que décrite dans ce document.
Dans un autre aspect, l'invention propose un procédé de préparation d'une composition immunogène, ledit procédé comprenant la combinaison de (i) deux ou plusieurs peptides de picornavirus de protéines structurales de picornavirus, lesdits peptides étant respectivement capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs picornavirus ou sérotypes de picornavirus, et (ii) d'un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un autre aspect, l'invention propose un procédé de préparation d'une composition immunogène, ledit procédé comprenant la combinaison (i) d'une particule de polypeptide chimérique comprenant un ou plusieurs peptides de picornavirus dérivés de protéines structurales de picornavirus ; et (ii) d'un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Brève description des dessins
La figure 1 présente un diagramme schématique du génome du picornavirus.
La figure 2 présente des anticorps spécifiques d'un peptide générés chez des lapins immunisés par des peptides VP1 conjugués à KLH.
La figure 3 présente des anticorps spécifiques d'un peptide générés chez des lapins immunisés avec des peptides VP4, conjugués à KLH ou dans des constructions chimériques d'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg).
La figure 4 présente des anticorps spécifiques d'un peptide générés chez des lapins immunisés avec VP4 de pleine longueur sous la forme d'un concatamère.
La figure 5 présente des anticorps neutralisants contre diverses couches de HRV, induits chez des lapins immunisés avec des peptides VP1 conjugués à KLH.
La figure 6 présente des anticorps neutralisants contre diverses souches de HRV, induits chez des lapins immunisés avec des peptides VP4 conjugués à KLH ou dans une construction chimérique avec HBsAg ou avec des concatamères de pleine longueur de VP4.
La figure 7 présente des anticorps spécifiques de la région 1 à 16 de VP4 chez des lapins immunisés par VP4 1-31 ou VP4 de pleine longueur, par rapport à VP4 1-16.
La figure 8 présente un alignement des acides aminés 32 à 45 de VPl de différents sérotypes de HRV de clade A alignés sur HRV14.
La figure 9 présente un alignement des acides aminés 32 à 45 de VPl de différents sérotypes de HRV de clade B alignés sur HRV14.
La figure 10 présente un alignement des acides aminés 32 à 45 de VPl de différents sérotypes de HRV de clade C alignés sur HRV14.
La figure 11 présente un alignement des acides aminés 1 à 16 de VP4 de différents sérotypes de HRV de clade A alignés sur HRV14.
La figure 12 présente un alignement des acides aminés 1 à 16 de VP4 de différents sérotypes de HRV de clade B alignés sur HRV14.
La figure 13 présente un alignement des acides aminés 1 à 16 de VP4 de différents sérotypes de HRV de clade C alignés sur HRV14.
La figure 14 présente un alignement des résidus N-terminaux des protéines VP1 de certains picornavirus. Les peptides similaires à HRV14 32-45 sont marqués dans 1'encadré.
La figure 15 présente un alignement des protéines VP4 des picornavirus choisis. Les peptides sont similaires au peptide HRV14 VP4 1-16 marqué dans l'encadré.
Les figures 16 à 24 présentent les séquences de nucléotides et d'acides aminés et des plasmides, pour le polypeptide chimérique VP4-S construit dans l'exemple 2 ci-dessous.
Description détaillée Introduction 1
La présente description concerne des compositions et des procédés pour la prévention et le traitement d'une infection à picornavirus, en particulier à picornavirus du genre des entérovirus, plus particulièrement un entérovirus humain tel qu'un rhinovirus humain (HRV).
Les rhinovirus sont des virus non enveloppés et sont composés d'une capside formée de quatre protéines virales VP1, VP2, VP3 et VP4. VP1, VP2 et VP3 constituent la majeure partie de la capside de la protéine. La protéine VP4 beaucoup plus petite, d'environ 70 acides aminés de longueur, a une structure plus étendue et se situe à l'interface entre la capside et 1'ARN génomique. La capside est constituée de 60 copies de chacune de ces protéines assemblées en un icosaèdre.
Le génome du rhinovirus consiste en un ARN linéaire, à brin simple, à sens positif comprenant entre 7,2 et 8,5 kb de longueur. Les protéines structurales sont codées dans la région 5' du génome (à partir de l'extrémité 5' : VP4, VP2, VP3 et VP1) et non structurale à l'extrémité 3', comme c'est le cas pour tous les picornavirus. L'ARN est traduit en une polyprotéine simple qui est clivée de façon co-traductionnelle et post-traductionnelle en quatre protéines structurales et sept protéines non structurales. Les gènes non structuraux sont impliqués dans le traitement du génome viral, la réplication virale et l'arrêt de la production de protéine dans la cellule hôte.
Actuellement, il existe plus de 100 sérotypes de HRV. Sur la base de l'identité de nucléotides et de la sensibilité de composés antiviraux, les HRV ont été
classés en clades A, B, C et éventuellement D (Rollinger & Schmidtke, 2011 ; Palmenberg, Rathe & Liggett, 2010), voir le tableau 1.
Tableau 1
De plus, une spécificité du récepteur de la cellule hôte a été utilisée pour classer encore ces virus en groupes majeur et mineur. Les sérotypes qui utilisent le récepteur de la molécule d'adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1) (sérotypes 62 HRV-A et tous les sérotypes B) font partie du groupe de récepteurs majeurs et les 12 sérotypes HRV-A restants utilisent des membres de la famille de récepteurs des
lipoprotéines basse densité (LDL) et font partie du groupe de récepteurs mineurs. Par conséquent, les termes « HRV-A majeur », « HRV-A mineur » et « HRV-B majeur » sont utilisés.
Les sérotypes sont en outre classés en fonction des sites antigéniques qu'ils utilisent pour échapper au système immunitaire de l'hôte. Pour le groupe de récepteurs majeurs, quatre sites immunogènes neutralisants primaires (NIm) ont été affectés à des régions proéminentes sur les protéines de capside externe VP1, VP2 et VP3. Ils sont connus sous les noms NIm-IA, NIm-IB, NIm-II et NIm-III. Pour les sérotypes du récepteur mineur, il existe trois sites antigéniques distincts A, B et C qui sont situés dans le même voisinage que les sites NIm (décrits par Lewis-Rogers et al 2009) . Il a été démontré que les anticorps induits avec des protéines HRV-14 ou 89 VP1 recombinantes ou un peptide couvrant les acides aminés 147 à 162 de HRV14 VP1 présentent une activité spécifique et neutralisante croisée (McCray & Werner, 1998 ; Edlmayr et al., 2011) . On a observé que la structure de capside du rhinovirus est dynamique et on constate qu'elle oscille entre deux états structuraux différents : l'un dans lequel VP4 est profondément enfoui et l'autre dans lequel les terminaisons N de VP4 et VP1 sont accessibles aux protéases (Lewis et al 1998). Les anticorps dirigés contre les 30 acides aminés N-terminaux de VP4 mais non de VP1 se sont avérés neutraliser avec succès le pouvoir infectieux viral in vitro (Katpallyet al 2009). Les anticorps dirigés contre les 30 acides aminés N-terminaux de VP4 se sont avérés neutraliser HRV14, HRV16 et HRV29. De plus, les anticorps dirigés contre une séquence consensus des 24 premiers résidus du rhinovirus VP4 ont aussi une activité neutralisante croisée (Katpally et al, 2009).
On peut trouver d'autres occurrences de peptides et/ou épitopes de rhinovirus dans la littérature, chez Niespodziana et al 2012 pour lesquels une réponse contre un 20-mère N-terminal de VP1 n'était pas une réponse neutralisante c'est-à-dire était un épitope non protecteur ; Miao et al 2009 - des MAb générés contre la partie N-terminale de 1'entérovirus VPl qui est hautement conservé sont utiles pour reconnaître un large éventail d'entérovirus ; le document WO 2006/078648 concernant des vaccins peptidiques contre HRV dérivé de régions de VP4 exposées de façon transitoire, en particulier les acides aminés 1 à 31 ou 1 à 24 de VP4 ; le document WO 2011/050384 concernant des peptides de la région N-terminale de VPl comprenant les acides aminés 1 à 8 ; le document WO 2008/057158 concernant Nim IV du rhinovirus, en particulier un peptide comprenant les acides aminés 277 à 283 ou 275 à 285 de la région carboxy-terminale de VPl, en particulier de HRV-14.
La mise à disposition d'un vaccin contre HRV est un défi particulier en raison du grand nombre de sérotypes du virus et de l'absence d'une réponse protectrice générée chez les individus infectés par un sérotype contre une infection par un autre sérotype. Un aspect important d'un vaccin contre HRV qui assure une protection contre un nombre suffisant de sérotypes de HRV pour conférer une protection efficace contre une infection à HRV est la mise à disposition d'épitopes de plus d'une protéine structurale de HRV, par exemple, de VP4 et de VPl. Un autre aspect important est la mise à disposition de peptides qui sont conservés parmi les sérotypes de HRV. Un autre aspect important est la mise à disposition de peptides qui génèrent une réponse en anticorps neutralisants. Dans ce document sont proposés des peptides de HRV et des combinaisons de peptides de HRV de différentes protéines structurales de HRV et des constructions contenant les peptides et des combinaisons de peptides. En proposant des peptides qui sont conservés parmi les sérotypes de HRV, les inventeurs ont également découvert des peptides qui sont remarquablement conservés parmi les picornavirus en général.
En conséquence, la présente description concerne des peptides de protéines structurales de picornavirus qui sont choisis comme étant capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre différents picornavirus qui peuvent être différents picornavirus ou différents sérotypes du même picornavirus, par exemple, différents sérotypes de rhinovirus. Ces peptides peuvent être distribués selon de nombreuses façons comprenant des peptides couplés ou conjugués à des protéines vectrices telles que CRM197 ou dans une construction chimérique, à un polypeptide dans lequel le peptide ou les peptides sont insérés, par exemple un polypeptide qui forme une particule telle qu'une particule de type viral ou une particule subvirale.
Dans un mode de réalisation, une combinaison de peptides de picornavirus est proposée, qui comprend des premier et deuxième peptides de différentes protéines structurales de picornavirus. Par exemple, les premier et deuxième peptides peuvent être des picornavirus VP4 et VP1. Avantageusement, les peptides sont des peptides courts de 20 acides aminés au plus, bien qu'ils puissent être plus longs que cela. Dans un mode de réalisation, les peptides sont dérivés de la région N-terminale des protéines structurales.
Dans un mode de réalisation, les premier et deuxième peptides proviennent d'un entérovirus humain et les peptides d'entérovirus sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs entérovirus. Dans un mode de réalisation particulier, l'un ou les deux des premier et deuxième peptides proviennent d'un rhinovirus humain et les peptides de rhinovirus sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs sérotypes de rhinovirus c'est-à-dire contre le sérotype de rhinovirus duquel le peptide est dérivé et au moins un autre sérotype de rhinovirus.
Dans un mode de réalisation, le premier peptide comprend les acides aminés 32 à 45 de VP1 ou une variante des acides aminés 32 à 45 de VP1 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés ou dans la séquence de peptide.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide VPl est un peptide de rhinovirus humain et, en particulier, comprend le peptide ayant une séquence choisie parmi : HRV14 (B) : 32-PILTANETGATMPV-45 [SEQ ID N° : 1] HRV8 (A-M) : 32-PALDAAETGHTSSV-45 [SEQ ID N° : 2] HRV25(A-m) : 32-PILDAAETGHTSNV-45 [ SEQ ID N° : 3] HRV_C_°26 : 32-QALGAVEIGATADV-45 [SEQ ID : 4] ou une variante de celles-ci ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide.
Dans un mode de réalisation, le deuxième peptide présente les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou une variante des acides aminés 1 à 16 de VP4 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide VP4 est un peptide de rhinovirus humain et, en particulier, comprend le peptide ayant une séquence choisie parmi : HRV14 (B) : l-GAQVSTQKSGSHENQN-16 [SEQ ID N° : 5] HRV100(A-M) : l-GAQVSRQNVGTHSTQN-16 [SEQ ID N° : 6] HRV_C_02 6 : l-GAQVSRQSVGSHETMI-16 [SEQ ID N° : 7] ou une variante de celles-ci ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide. L'invention propose également des peptides de picornavirus individuels, par exemple les peptides de rhinovirus présentant les séquences indiquées dans SEQ ID N° 1 à 7 et des variantes de celles-ci, telles que décrites ici.
Lorsqu'une variante d'une séquence de peptide présente 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide, cela signifie que la variante a au moins une différence d'acides aminés par rapport à la séquence de peptide de référence, qui peut comprendre entre 0 et 4 additions ou délétions d'acides aminés sur une extrémité et entre 0 et 4 additions ou délétions sur l'autre extrémité et entre 0 et 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence.
Dans un mode de réalisation, un peptide de picornavirus proposé dans ce document consiste en 20 acides aminés au plus de la terminaison N de VP4, ledit peptide comprenant les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou une variante des acides aminés 1 à 16 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide VP4 consiste en les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou une variante ayant une ou deux ou trois ou quatre additions ou délétions ou substitutions d'acides aminés. D'autres peptides VP4 spécifiques comprennent, par exemple, les acides aminés 1 à [16-20], les acides aminés 2 à [17-21], 3 à [18-22], 4 à [19-23], 5 à [2024], où l'on comprendra que les nombres entre crochets comprennent tous les nombres figurant individuellement dans l'intervalle indiqué. Avantageusement, le peptide VP4 consiste en 16 acides aminés contigus de VP4 au plus. On comprendra que la numérotation du peptide VP4 telle qu'elle est utilisée ici est indépendante de la méthionine compte tenu du codon de départ.
Dans un autre mode de réalisation, un peptide de picornavirus consiste en 40 acides aminés au plus de la région N-terminale de VPl, ledit peptide comprenant les acides aminés 32 à 45 de VPl ou une variante des acides aminés 32 à 45 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide VPl consiste en les acides aminés 32 à 45 de VP4 ou une variante ayant une ou deux ou trois ou quatre additions ou délétions ou substitutions d'acides aminés. Les peptides de VPl comprennent, par exemple, les acides aminés [5-35] à 45, [6-35] à 46, [7-35] à 47, [8-35] à 48, [9-35] à 49 et de même 32 à [45-72], 33 à [45-73], 34 à [45-74], 35 à [45-75] et 36 à [45-76], où les nombres entre crochets comprennent tous les nombres figurant individuellement dans l'intervalle indiqué. Ces peptides peuvent être associés dans une composition immunogène décrite ici. Ces peptides de picornavirus en général, ou de virus du genre des entérovirus et du genre des rhinovirus en particulier, sont une caractéristique de la présente invention, individuellement et en combinaison en tant que premier et deuxième peptides.
Dans un mode de réalisation, le peptide ou les peptides de picornavirus sont couplés à une protéine vectrice telle que CRM197. Les protéines vectrices appropriées comprennent CRM197, la protéine D dérivée de Haemophilus influenza non typable, PhtD, PhtDE, 1'adénylatécyclase, l'anatoxine tétanique (TT), le fragment C de l'anatoxine tétanique, des mutants non toxiques de l'anatoxine tétanique, l'anatoxine diphtérique (DT), la pneumolysine (Ply), 1'exotoxine A (ExoA) et des nanoparticules telles que des nanoparticules synthétiques. D'autres protéines vectrices appropriées comprennent les protéines de picornavirus, par exemple des protéines non structurales de HRV telles qu'une protéase virale, la polymérase et d'autres protéines impliquées dans la réplication du picornavirus ou d'autres virus. Avantageusement, la protéine vectrice est une protéine non structurale du picornavirus telle que HRV, conférant un bénéfice supplémentaire d'une réponse immunitaire contre la protéine non structurale. Les premier et deuxième peptides dans la composition immunogène décrits ici peuvent être couplés à des protéines vectrices identiques ou différentes qui peuvent être sélectionnées dans la liste ci-dessus. Lorsqu'ils sont couplés à la même protéine vectrice, les peptides peuvent être couplés séparément à la même protéine vectrice puis les peptides couplés peuvent être combinés ou les peptides peuvent exister tout d'abord mélangés l'un à l'autre puis couplés à la protéine vectrice.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide ou les peptides sont combinés à ou insérés dans un polypeptide pour donner une construction de polypeptide chimérique. Dans ce mode de réalisation, la composition immunogène comprend au moins une construction de polypeptide chimérique comprenant un polypeptide de squelette et un peptide ou des peptides. Si deux ou plusieurs peptides sont présents, ceux-ci peuvent être dans la même construction de polypeptide chimérique ou dans des constructions de polypeptides chimériques distinctes qui peuvent avoir le même squelette de polypeptide ou un squelette différent. Avantageusement, la construction de polypeptide chimérique forme une particule telle qu'une particule de type viral. Le polypeptide de squelette peut être tout polypeptide approprié, tel que des polypeptides structuraux ou non structuraux de virus tels que le papillomavirus humain (HPV), le rhinovirus, le virus de l'hépatite B, EV-71, le virus de la grippe ou un norovirus.
Dans certains modes de réalisation, les peptides sont présents sur une région exposée de la particule en étant insérés dans une région appropriée du polypeptide de squelette, par exemple une boucle exposée en surface, par exemple dans la boucle « a » de l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) ou la région N-terminale ou C-terminale de HBsAg comprenant l'une des terminaisons. Dans certains modes de réalisation, deux des peptides identiques ou différents de HRV sont insérés dans différents sites dans un polypeptide unique tel que la boucle « a » et la région N-terminale ou C-terminale du polypeptide de HBsAg, donnant ainsi une particule de polypeptide chimérique de HBsAg à double insertion de peptide. Dans un mode de réalisation particulier, un peptide VP1 tel que décrit ici, tel qu'un peptide VPl 32-45 ou une variante de celui-ci, est inséré dans la boucle « a » de HBsAg et un peptide VP4 tel que décrit dans ce document, tel qu'un peptide VP4 1-16 ou une variante de celui-ci, est inséré dans la région N-terminale du même polypeptide de HBsAg ou inversement. Dans un autre aspect de la description est proposée une particule de polypeptide chimérique comprenant un polypeptide de squelette capable de former une particule et au moins un peptide comprenant un épitope d'un polypeptide structural d'un picornavirus. Le polypeptide de squelette peut être par exemple HBsAg, HPV L1 ou une protéine structurale de rhinovirus ou toute autre particule virale, avantageusement, l'une qui soit capable de former une particule telle qu'une VLP.
Dans un mode de réalisation particulier, la particule est un HBsAg chimérique comprenant un polypeptide de HBsAg ou un fragment de celui-ci, dans laquelle sont insérés un ou plusieurs picornavirus VP4 ou peptides de VPl comme on le décrit dans ce document. Dans un mode de réalisation, HBsAg chimérique comprend deux ou plusieurs peptides de protéines structurales de picornavirus qui peuvent être identiques ou différents. Avantageusement, les peptides sont chacun capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs picornavirus différents, par exemple deux ou plusieurs sérotypes de rhinovirus. Avantageusement, le polypeptide chimérique de HBsAg chimérique forme une particule de type viral. Dans un mode de réalisation est proposée la particule de HBsAg chimérique dans laquelle un peptide VP4 tel que décrit dans ce document, avantageusement, un peptide VP4 qui contient un épitope d'un picornavirus capable d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée, par exemple un peptide VP4 comprenant VP4 1-16, par exemple, VP4 1-31 ou VP1-24 ou VPl-16, est fusionné à HBsAg à l'extrémité N-terminale ou dans la boucle « a » de HBsAg. Dans un autre mode de réalisation est proposée une particule de HBsAg chimérique dans laquelle un peptide VP1 tel que décrit ici, avantageusement, un peptide VP4 qui contient un épitope d'un picornavirus capable d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée, par exemple un peptide VPl comprenant VP1 32-45, est fusionné à HBsAg à l'extrémité N-terminale ou dans la boucle "a" de HBsAg. Dans un autre mode de réalisation est proposée une chimère à peptide double dans lequel à la fois les peptides VPl et VP4 tels que décrits dans ce document sont insérés dans HBsAg, l'un à l'extrémité N-terminale et l'autre dans la boucle « a ». Dans un mode de réalisation, les peptides VPl et VP4 proviennent d'un rhinovirus.
Les compositions immunogènes proposées dans ce document peuvent comprendre en outre un adjuvant qui peut être par exemple, un sel minéral tel qu'un sel d'aluminium, par exemple, 1'hydroxyde d'aluminium. Dans un autre mode de réalisation, l'adjuvant comprend le lipide A 3-désacylé monophosphoryle (3D-MPL).Dans un autre mode de réalisation, l'adjuvant comprend QS21.
Un autre aspect de la présente description concerne des molécules d'acide nucléique qui codent pour un peptide ou un polypeptide chimérique tel que décrit ci-dessus. Ces acides nucléiques peuvent être présents dans un vecteur d'expression procaryote ou eucaryote. Les vecteurs d'expression appropriés comprennent par exemple, une levure telle que Pichia pastoris. Des acides nucléiques recombinants, par exemple, des vecteurs d'expression, peuvent être introduits (par exemple, par infection, transfection ou transformation) dans des cellules hôtes. Ces cellules hôtes sont également un aspect de la présente description. Ces cellules hôtes peuvent être utilisées pour produire les polypeptides chimériques, par exemple par réplication de la cellule hôte dans des conditions appropriées pour l'expression du polypeptide recombinant. Eventuellement, le polypeptide peut ensuite être isolé et/ou purifié, par exemple, avant la formulation en une composition immunogène. L'un quelconque des peptides ou des polypeptides chimériques décrits dans ce document peut être utilisé en médecine, par exemple, en tant que compositions immunogènes (telles que des vaccins) pour la prévention ou le traitement d'une infection provoquée par un picornavirus tel que HRV. Ces compositions sont appropriées pour l'utilisation dans des procédés d'induction d'anticorps contre un picornavirus tel que HRV chez l'être humain en administrant la composition immunogène à un sujet humain. Avantageusement, l'administration de la composition immunogène au sujet humain induit le développement d'anticorps qui préviennent, améliorent ou traitent l'infection ou la maladie à picornavirus, par exemple, une infection ou maladie à HRV.
Par conséquent, la présente description propose également des compositions immunogènes pour leur utilisation dans la prévention, l'amélioration ou le traitement d'une infection ou d'une maladie à picornavirus. Ces compositions immunogènes comprennent un polypeptide chimérique comprenant un ou plusieurs peptides de picornavirus tels que décrits dans ce document, ledit polypeptide chimérique pouvant se présenter sous la forme d'une particule de VLP telle que décrite ci-dessus, en combinaison avec un excipient, diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène comprend également un adjuvant. Les adjuvants appropriés comprennent un sel d'aluminium tel que 1'hydroxyde d'aluminium, le 3D-MPL et le QS21. Les combinaisons appropriées d'adjuvants comprennent 1'hydroxyde d'aluminium et le 3D-MPL ; et les 3D-MPL et QS21 éventuellement préparés avec des liposomes. Définitions
Afin de faciliter l'examen des divers modes de réalisation de la présente description, les explications suivantes des termes sont fournies. Des termes et explications supplémentaires peuvent être proposés dans le contexte de la présente description.
Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans ce document ont la même signification que celle communément admise par l'homme du métier auquel la présente description est destinée. Les définitions des termes courants de biologie moléculaire peuvent être trouvées dans les ouvrages de Benjamin Lewin, Genes V, publié par Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) ; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publié par Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9) ; et Robert A. Meyers (éd.), Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference, publié par VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081569-8).
Les articles singuliers « un », « une », et « le/la » comprennent des référents pluriels sauf si le contexte indique clairement le contraire. De même, le mot « ou » est destiné à comprendre « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Le terme « pluralité » fait référence à deux ou plus. On comprendra en outre que toutes les tailles de base ou les tailles d'acides aminés et tous les poids moléculaires ou valeurs de masse moléculaire, mentionnés pour les acides nucléiques ou les polypeptides, sont approximatifs et sont mentionnés à des fins de description. De plus, les limites numériques mentionnées eu égard aux concentrations ou taux d'une substance telle qu'un antigène, sont entendus comme étant approximatifs. Par conséquent, s'il est indiqué qu'une concentration est d'au moins (par exemple) 200 pg, il est entendu que la concentration sera comprise comme étant d'au moins à peu près (ou « environ » ou « ~ ») 200 pg.
Bien que des procédés et matériaux similaires ou équivalents à ceux décrits dans ce document puissent être utilisés dans la mise en pratique ou le test de la présente description, des procédés et matériaux appropriés sont décrits ci-dessous. Le terme « comprend » signifie « inclus ». Par conséquent, sauf si le contexte indique le contraire, le mot « comprend » et ses variantes telles que « comprendre » et « comprenant » seront compris comme impliquant l'inclusion d'un composé ou d'une composition mentionné(e) (par exemple, un acide nucléique, un polypeptide, un antigène) ou une étape ou un groupe de composés ou d'étapes mais non l'exclusion de tout autre composé, composition, étapes ou groupes de ceux-ci.
Un « polypeptide » est un polymère dans lequel les monomères sont des résidus d'acides aminés qui sont joints les uns aux autres par des liaisons amide. Un « peptide » est une courte séquence d'acides aminés, par exemple, environ 10 à 50 ou 10 à 40 acides aminés de longueur. Les termes « polypeptide » ou « protéine » ou « peptide » tels qu'ils sont utilisés dans ce document, sont entendus de façon à comprendre toute séquence d'acides aminés et comprennent des séquences modifiées telles que des glycoprotéines. Les termes « polypeptide » et « peptide » sont spécifiquement destinés à couvrir des protéines existant à l'état naturel ainsi que celles qui sont produites de façon recombinante ou synthétique. Le terme « fragment », en référence à un polypeptide, désigne une partie (c'est-à-dire, une sous-séquence) d'un polypeptide. Le terme « fragment immunogène » désigne tous les fragments d'un polypeptide qui conservent au moins un épitope immunogène prédominant de la protéine ou du polypeptide de pleine longueur de référence. L'orientation dans les protéines structurales de picornavirus et les peptides cités en exemple désigne une orientation N-terminale à C-terminale, définie par l'orientation des fractions amino et carboxy des acides aminés individuels. Les polypeptides et peptides sont traduits de la terminaison N ou amino-terminale vers la terminaison C ou carboxy-terminale.
Les « protéines structurales » d'un virus tel qu'un picornavirus sont des protéines qui sont des composants de la particule virale mature assemblée et peuvent comprendre une protéine de noyau de nucléocapside, des enzymes empaquetées dans la particule virale et les protéines membranaires. Les protéines structurales de picornavirus tels que HRV comprennent VP1, VP2, VP3, VP4. Les protéines structurales ne comprennent pas les « protéines non structurales » du virus qui sont des protéines qui sont produites dans des cellules infectées mais qui ne sont pas présentes dans la particule virale mature. La région « N-terminale » des protéines structurales de picornavirus désigne la moitié N-terminale des protéines de pleine longueur, avantageusement une région dans la moitié N-terminale de la protéine et dans la région N-terminale ou proche de la région N-terminale de la protéine de pleine longueur. Par conséquent, pour VP4 qui n'est que d'environ 70 acides aminés de longueur, la région N- terminale est considérée comme étant les acides aminés 1 à 35 de la protéine de pleine longueur ou une région dans les acides aminés 1 à 35 sur la terminaison N ou proche de la terminaison N de la protéine de pleine longueur, les acides aminés 1 à 30 ou 1 à 25 ou 1 à 20 de la protéine de pleine longueur ou d'une région dans les acides aminés 1 à 30 ou 1 à 25 ou 1 à 20 sur la terminaison N ou proche de la terminaison N de la protéine de pleine longueur. Pour VP1 qui est une protéine plus longue de près de 300 acides aminés, la région N-terminale est considérée comme étant les acides aminés 1 à 100, avantageusement, 1 à 80 ou 1 à 70 ou 1 à 60 ou 1 à 50 de la protéine de pleine longueur ou une région dans les 100 ou 80 ou 70 ou 60 ou 50 acides aminés N-terminaux et sur la terminaison N ou proche de la terminaison N de la protéine.
Le terme « picornavirus » désigne tout virus de la famille des picornaviridés comprenant les virus humains et animaux. L'expression « rhinovirus humain » abrégée par HRV désigne tout sérotype de rhinovirus de la famille des picornaviridés qui est capable d'infecter des êtres humains et a été identifié ou doit encore être identifié en tant que rhinovirus. Il existe plusieurs façons différentes de regrouper les HRV comme on le décrit dans ce document et chaque regroupement contient de multiples « sérotypes » ou « souches » de virus (par exemple, HRV-14, HRV-8, HRV-25, etc.) catégorisés en fonction de similitudes génétiques. Dans le contexte de la présente description, le terme « sérotype » peut être utilisé pour désigner un HRV, et/ou un polypeptide ou peptide du type de HRV indiqué.
Les termes . « polynucléotide » et « séquence d'acide nucléique » désignent une forme polymère de nucléotides d'au moins 10 bases de longueur. Les nucléotides peuvent être des ribonucléotides, des désoxyribonucléotides ou des formes modifiées de l'un ou l'autre nucléotide. Le terme comprend les formes simple et double d'ADN. L'expression « polynucléotide isolé » désigne un polynucléotide qui n'est pas immédiatement contigu aux deux séquences codantes desquelles il est immédiatement contigu (l'une à l'extrémité 5' et l'autre à l'extrémité 3') dans le génome existant à l'état naturel de l'organisme duquel il provient. Dans un mode de réalisation, un polynucléotide code pour un polypeptide. Les directions 5' et 3' d'un acide nucléique sont définies en référence à la capacité de raccordement des unités de nucléotides individuels et nommées en fonction des positions du carbone du cycle du sucre désoxyribose (ou ribose). Le contenu informationnel (codage) d'une séquence de polynucléotide est lu dans une direction 5' à 3 ' . L'expression « protéine vectrice » désigne toute protéine à laquelle le peptide est couplé ou fixé ou conjugué, habituellement afin de renforcer ou de faciliter la détection de l'antigène par le système immunitaire. Le terme est destiné à couvrir à la fois les petits peptides et les grands polypeptides (>10 kDa) . La protéine vectrice peut comprendre un ou plusieurs épitopes T auxiliaire. Le peptide peut être couplé à la protéine vectrice par tout moyen tel que la conjugaison chimique. L'expression « particule de type viral » (VLP) désigne une capside virale qui ressemble à la structure de la protéine externe du virus natif mais est non infectieuse car elle ne contient pas de matériau génétique viral. L'expression des protéines structurales virales, connues sous le nom de protéines d'enveloppe ou de capside ou de surface peut entraîner l'auto-assemblage des VLP. Les VLP peuvent être enveloppées ou non enveloppées. Les VLP ont généralement une structure icosaédrique constituée de sous-unités de protéine identique répétées connues sous le nom de capsomères. Les capsomères s'auto-assemblent pour former les VLP. Les « particules » des constructions de polypeptides chimériques sont des structures telles que des agrégats amorphes ou des structures plus ordonnées, par exemple, un capsomère (capsomère) ou une particule de type virale (VLP) ou de petites structures non VLP. Les particules comprenant les VLP, capsomères et les structures moins ordonnées comprennent des particules HBsAg du virus de l'hépatite B constituées du petit antigène de surface de HBV, des particules de HPV constituées des protéines Ll ou L1 et L2 de HPV, des particules de HRV constituées de VP1, VP2, VP3 et VP4 ou VPl, VP2 et VP3 de HRV et des particules d'autres virus tels que le virus de la grippe ou un norovirus ou entérovirus, par exemple, EV-71. Plus récemment, des particules comprenant des VLP ont été produites à partir de composants d'une large diversité de familles de virus comprenant les parvoviridés (par exemple, virus adéno-associés), les rétroviridés (par exemple, VIH) et les flaviviridés (par exemple, virus de l'hépatite C) . Les VLP d'EV71 sont décrits par Cheng-Yu Chung et al 2010. Les VLP peuvent être produites dans divers systèmes de culture cellulaire comprenant des lignées de cellules de mammifères, des lignées de cellules d'insecte, des levures, des cellules de plantes et E. coli.
Le terme « hétérologue » eu égard à un acide nucléique, un polypeptide ou un autre composant cellulaire, indique que le composant existe là où on ne le trouve pas normalement à l'état naturel et/ou qu'il provient d'une source ou espèce différente.
Les termes « natif » et « existant à l'état naturel » désignent un élément tel qu'une protéine, un polypeptide ou un acide nucléique qui est présent dans le même état qu'à l'état naturel. Cela signifie que l'élément n'a pas été modifié artificiellement. On comprendra que dans le contexte de la présente description, il existe de nombreux sérotypes natifs/existant à l'état naturel de HRV (et des protéines et polypeptides de HRV), par exemple, obtenus à partir de différents sérotypes de HRV existant à l'état naturel.
Une « variante » lorsqu'elle désigne un acide nucléique ou un polypeptide (par exemple, un acide nucléique ou un polypeptide de picornavirus VP1 ou VP4) est un acide nucléique ou un polypeptide qui diffère d'un acide nucléique ou d'un polypeptide de référence. Généralement, la/les différence(s) entre la variante et l'acide nucléique ou le polypeptide de référence constituent un nombre proportionnellement réduit de différences par rapport au référent. Un acide nucléique variant peut différer de l'acide nucléique de référence auquel il est comparé par l'addition, la délétion ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides ou par la substitution d'un analogue de nucléotide artificiel. De même, un peptide ou polypeptide variant peut différer du polypeptide de référence auquel il est comparé par l'addition, la délétion ou la substitution d'un ou plusieurs acides aminés ou par la substitution d'un analogue d'acide aminé. Des variantes des peptides VP1 et VP4 sont décrites plus précisément et plus spécifiquement dans le présent document.
Un « antigène » est un composé, une composition ou une substance qui peut stimuler la production d'anticorps et/ou une réponse en lymphocytes T chez un animal, comprenant des compositions qui sont injectées, absorbées ou introduites d'une autre façon chez un animal. Le terme « antigène » comprend tous les épitopes antigéniques apparentés. Le terme « épitope » ou l'expression « déterminant antigénique » désigne un site ou un antigène auquel répondent des lymphocytes B et/ou T. L'expression « épitopes antigéniques dominants » ou « épitope dominant » désigne des épitopes auxquels une réponse immunitaire de l'hôte fonctionnellement significative, par exemple, une réponse en anticorps ou une réponse en lymphocytes T est produite. Par conséquent, eu égard à une réponse immunitaire protectrice contre un agent pathogène, les épitopes antigéniques dominants sont les fractions antigèniques qui, lorsqu'elles sont reconnues par le système immunitaire de l'hôte, entraînent une protection contre une maladie provoquée par l'agent pathogène. Le terme « épitope de lymphocyte T » désigne un épitope qui, lorsqu'il est lié à une molécule de MHC appropriée, est spécifiquement lié par un lymphocyte T (via un récepteur de lymphocyte T) . Un « épitope de lymphocyte T » est un épitope qui est lié spécifiquement par un anticorps (ou une molécule du récepteur des lymphocytes B) . Un « épitope neutralisant » est un épitope qui est capable d'induire une réponse immunitaire neutralisante.
Un « adjuvant » est un agent qui renforce la production d'une réponse immunitaire de manière non spécifique. Les adjuvants courants comprennent des suspensions de minéraux (alun, hydroxyde d'aluminium, phosphate d'aluminium) sur lesquelles un antigène est adsorbé ; des émulsions comprenant des émulsions eau dans huile et huile dans eau (et leurs variantes comprenant des émulsions doubles et des émulsions réversibles), des liposaccharides, des lipopolysaccharides, des acides nucléiques immunostimulants (tels que des oligonucléotides de CpG), des liposomes, des agonistes du récepteur de type Toll (en particulier, les agonistes TLR2, TLR4 , TLR7/8 et TLR9) et leurs diverses combinaisons de ces composants.
Une « composition immunogène » est une composition de matériaux appropriés pour l'administration à un sujet humain ou animal (par exemple, dans un cadre expérimental) qui est capable de provoquer ou d'induire une réponse immunitaire spécifique, par exemple, contre un agent pathogène tel qu'un picornavirus. En tant que telle, une composition immunogène comprend un ou plusieurs antigènes (par exemple, des antigènes polypeptidiques) ou des épitopes antigéniques. Une composition immunogène peut également comprendre un ou plusieurs composants supplémentaires capables de provoquer ou d'induire ou de renforcer une réponse immunitaire, tels qu'un excipient, un véhicule et/ou un adjuvant. Dans certains cas, des compositions immunogènes sont administrées de façon à provoquer ou induire une réponse immunitaire qui protège le sujet contre des symptômes ou des affections induites par un agent pathogène. Dans certains cas, des symptômes ou maladies provoquées par un agent pathogène sont empêchés (ou réduits ou améliorés) par l'inhibition de la réplication de l'agent pathogène (par exemple, un picornavirus) après l'exposition du sujet à l'agent pathogène. Dans le contexte de la présente description, l'expression « composition immunogène » sera comprise de façon à comprendre les compositions qui sont prévues pour l'administration à un sujet ou une population de sujets afin de provoquer ou induire une réponse protectrice ou palliative contre des picornavirus, par exemple, HRV (c'est-à-dire des compositions vaccinales ou des vaccins).
Une « réponse immunitaire » est une réponse d'une cellule du système immunitaire telle qu'un lymphocyte B, un lymphocyte T ou un monocyte, à un stimulus. Une réponse immunitaire peut être une réponse en lymphocytes B qui entraîne la production d'anticorps spécifiques tels que des anticorps neutralisants spécifiques d'un antigène. Une réponse immunitaire peut également être une réponse en lymphocytes T telle qu'une réponse en CD4+ ou une réponse en CD8 + . Dans certains cas, la réponse est spécifique d'un antigène particulier (c'est-à-dire, une « réponse spécifique à l'antigène »). Si l'antigène est dérivé d'un agent pathogène, la réponse spécifique à un antigène est une « réponse spécifique à un agent pathogène ». Une « réponse immunitaire protectrice » est une réponse immunitaire qui inhibe une fonction ou une activité préjudiciable d'un agent pathogène, qui réduit une infection par un agent pathogène ou qui diminue les symptômes (y compris la mort) qui résultent d'une infection par l'agent pathogène. Une réponse immunitaire protectrice peut être mesurée, par exemple, par l'inhibition de la réplication virale ou de la formation de plaque dans un essai de réduction de plaque ou un essai de neutralisation ELISA ou en mesurant la résistance à une provocation par un agent pathogène in vivo. Une réponse immunitaire est une réponse immunitaire de neutralisation croisée lorsqu'elle est induite par un antigène d'un sérotype de picornavirus et neutralise non seulement un virus de ce sérotype mais également un virus d'un sérotype de picornavirus différent. Ainsi par exemple, un peptide de HRV d'un sérotype de HRV peut induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre un autre sérotype de HRV. Un peptide d'un picornavirus peut également induire une réponse de neutralisation croisée contre un autre picornavirus. La neutralisation croisée peut donc avoir lieu entre des virus ou entre des sérotypes ou des souches du même virus. Une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs virus ou sérotypes comprend la réponse immunitaire contre le virus duquel l'antigène est . dérivé et une réponse immunitaire contre un autre virus ou sérotype. Une réponse immunitaire de neutralisation croisée peut comprendre la génération d'anticorps neutralisants qui peut être mesurée par un essai de neutralisation approprié en utilisant un virus ou un pseudovirus pour évaluer une capacité de neutralisation des anticorps.
Les peptides de picornavirus décrits dans ce document peuvent être dits à réaction croisée ou à neutralisation croisée ou à protection croisée. Les peptides à réaction croisée sont des peptides qui sont capables d'induire une réponse immunitaire contre des virus ou des sérotypes supplémentaires à celui dont est dérivé le peptide. Les peptides à neutralisation croisée sont des peptides qui sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée c'est-à-dire une réponse immunitaire qui neutralise le virus contre lequel la réponse a été induite et également contre un autre virus apparenté, par exemple, le même virus mais d'un sérotype différent ou un virus différent de la même famille. Un peptide à protection croisée est un peptide qui induit une réponse immunitaire qui peut prévenir une infection ou une maladie provoquée par le virus contre lequel la réponse a été induite et également contre une infection ou une maladie provoquée par un autre virus apparenté, par exemple d'un sérotype différent.
Protéines et peptides structuraux de HRS
La présente invention est centrée sur le besoin de disposer d'un vaccin contre un rhinovirus et concerne l'utilisation de protéines et peptides structuraux de rhinovirus qui peuvent stimuler une réponse immunitaire contre un certain nombre de sérotypes de HRV et donc conférer une protection contre une infection et une maladie à HRV.
Les protéines et peptides de rhinovirus utilisés dans l'invention peuvent être choisis parmi tous les sérotypes de HRV, par exemple HRV IB, 2, 3, 8, 10, 14,26, 29, 31, 39, 47, 61, 62, 63, 66, 77, 97, 100 ou d'autres sérotypes qui peuvent être non typés ou non typables. Les sérotypes présentant un intérêt particulier comprennent les sérotypes HRV 8, HRV 25 et HRV 100 de clade A, le sérotype HRV 14 de clade B et le sérotype HRV_C_026 de clade C. Les sérotypes HRV A et C sont associés aux maladies de la plus haute sévérité et donc, la présence de la combinaison d'une séquence de sérotype HRV A et d'une séquence de sérotype HRV C dans une composition décrite dans ce document est spécifiquement envisagée.
Plusieurs structures tridimensionnelles (3D) de capsides de HRV sont disponibles. Pour HRV 14, par exemple, une analyse très détaillée a été publiée par Arnold & Rossmann (1990). La capside a une organisation icosaédrique de symétrie pseudo T = 3. La surface du virus est définie par 12 pentons en forme d'étoile, l'un à chaque axe de symétrie d'ordre 5. Ils sont entourés par un sillon ou « canyon » de 20 ang. de profondeur. On observe également 20 faces triangulaires, une sur chaque axe de symétrie d'ordre 3. Les structures en 3D de HRV IA, HRV 2, HRV 3 et HRV 16 ont également été déterminées, parfois complexées avec des récepteurs ou des fragments d'anticorps.
Il a été démontré que la dynamique de capside de HRV 14 ressemble à une « respiration » (Lewis et al 1998). La structure de la capside semble osciller entre deux états structuraux différents, l'un observé dans les structures 3D dans lesquelles VP4 est profondément enfoui et l'autre dans lequel les terminaisons N de VP4 et VP1 sont accessibles aux protéases. Cela a été démontré également par l'accessibilité de différents fragments de capside au cours du temps, par protéolyse et spectroscopie de masse (Lewis et al 1998) . Cette « respiration » peut être bloquée par des composés antiviraux se liant dans une poche à l'arrière du canyon de la capside.
Katpally et al (2009) ont montré que des anticorps dirigés contre une séquence consensus des 24 premiers résidus les plus probables du rhinovirus VP4 pouvaient neutraliser de façon croisée HRV 14 et 16 et qu'un peptide correspondant aux 30 premiers acides aminés de HRV 14 VP4 permettait de produire un antisérum qui neutralisait HRV 16 et HRV 29. Toutefois, les inventeurs n'ont pas trouvé qu'en fait, un peptide plus court était plus efficace.
Par conséquent, l'invention propose un peptide VP4 qui présente 20 acides aminés au plus à partir de la terminaison N de VP4, en particulier, les acides aminés 1 à 16 de VP4 et ses variantes.
Miao et al (2009) ont montré qu'un peptide conservé de la terminaison N d'autres entérovirus, spécifiquement, Polio 1 et Cox B3, est reconnu par des anticorps monoclonaux (MAb) générés contre des protéines de VP1 de pleine longueur, de différentes espèces d'entérovirus.
Un peptide conservé équivalent de HRV VP1 est également capable de générer une réponse en anticorps de neutralisation croisée contre différents sérotypes de HRV. Le peptide HRV VPl provient de la région N-terminale de VPl, en particulier, des acides aminés 32 à 45 de VPl et ses variantes. En effectuant un alignement de séquences de VPl et VP4 de tous les picornavirus, on a également découvert de façon surprenante, qu'il existe des peptides similaires de HVR14 VP4 1-16 et HVR14 32-45. Ainsi, les picornavirus autres que le rhinovirus ont également potentiellement des peptides à neutralisation croisée équivalents à ceux de HVR14 VP4 1-16 et HVR14 32-45. Ces peptides de picornavirus sont un autre aspect de l'invention décrite dans ce document.
Tout au long de la description, les séquences de VPl et VP4 de HRV 14 sont utilisées comme séquences de référence pour déterminer la région de laquelle proviennent les peptides VPl et VP4 (Palmenberg et al 2010).
Les peptides de rhinovirus choisis sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre HRV. Cela signifie que lorsqu'ils sont présentés de façon appropriée, les peptides génèrent une réponse immunitaire, par exemple, une réponse en anticorps, contre plusieurs sérotypes de HRV. Par conséquent, par exemple, la réponse immunitaire générée neutralise le sérotype de HRV duquel provient le peptide et au moins un autre sérotype de HRV. Par exemple, la réponse de neutralisation croisée peut neutraliser plus de 2 ou plus de 5 ou plus de 10 sérotypes de HRV différents. Dans un mode de réalisation, la réponse de neutralisation croisée neutralise plus de 2 ou plus de 5 ou plus de 10 sérotypes de HRV différents choisis parmi HRV IB, 2, 3, 8, 10, 14, 26, 29, 31, 39, 47, 61, 62, 63, 66, 77, 97, 100.
De façon appropriée, on choisit le peptide de HRV qui présente un niveau élevé d'identité de séquence (« homologie ») entre les sérotypes de HRV, qui est supérieur à 80 % entre deux sérotypes (ou plus) . Dans certains cas, le peptide de HRV a une identité de séquence entre les sérotypes supérieure à 85 %, ou une identité de séquence entre les sérotypes supérieure à 90 %, ou une identité de séquence entre les sérotypes supérieure à 95 %. L'identité de séquence peut également être évaluée en examinant le nombre de différences d'acides aminés, donc, par exemple, on peut choisir le peptide de HRV qui présente uniquement une ou uniquement deux différences d'acides aminés, ou uniquement une ou uniquement deux différences conservatives d'acides aminés ou aucune différence d'acides aminés entre deux sérotypes ou plus sur la longueur du peptide. Dans certains modes de réalisation, on choisit le peptide de HRV qui présente une identité de séquence de 100 % entre au moins deux sérotypes de HRV, c'est-à-dire qu'il n'y a pas de
différences d'acides aminés. Ces peptides de HRV peuvent être nommés dans ce document, séquences « consensus » de VP4 ou VP1.
Le peptide de HRV VP4 1-16 décrit dans ce document, de HRV 14 a une identité de séquence de 100 % avec ceux de clade B pour les sérotypes de clade B actuellement connus. Le peptide de HRV VP4 décrit dans ce document, de HRV 100(A-M) a une identité de séquence de 100 % avec ceux de clade A pour les sérotypes de clade A actuellement connus.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide de HRV est une séquence consensus de clade A qui est identique (c'est-à-dire a une identité de séquence de 100 %) entre 2 sérotypes de HRV ou plus choisis parmi les sérotypes de HRV énumérés sur la figure 8 ou la figure 11. Dans un autre mode de réalisation, le peptide de HRV est une séquence consensus de clade B qui est identique entre
2 sérotypes de HRV ou plus, choisis parmi les sérotypes de HRV énumérés sur la figure 9 ou la figure 12. Par exemple, dans un exemple de mode de réalisation spécifique, la séquence consensus est identique entre deux sérotypes ou plus de clade A ou de clade B présentés sur les figures 8 et 11, au niveau des acides aminés 32 à 45 de VP1, ou entre deux sérotypes de clade A ou de clade B présentés sur les figures 9 et 12, au niveau des acides aminés 1 à 16 de VP4.
La numérotation commence à l'acide aminé 1 de la terminaison N, la terminaison N étant ici du côté gauche d'une séquence et la terminaison C, du côté droit. On comprendra évidemment que les peptides peuvent présenter des variabilités. Ainsi par exemple, les peptides peuvent être plus longs ou plus courts de un ou deux ou trois ou quatre acides aminés sur l'une ou l'autre des extrémités, par rapport aux séquences de peptides spécifiques indiquées. Ainsi, par exemple, si l'on utilise un peptide VP4 1-16, il peut être possible d'utiliser un peptide 1 à 14 ou 1 à 15 ou 1 à 17 ou 1 à 18 ou 2 à 14 ou 2 à 15 ou 2 à 16 ou 2 à 17 ou 2 à 18, par exemple, ou un peptide équivalent comportant une ou deux substitutions conservatives d'acides aminés, ou une ou deux délétions d'acides aminés, sans modifier les propriétés immunologiques du peptide ou sans éliminer l'épitope. Un peptide VP4 tel que décrit dans ce document, peut commencer par exemple à l'acide aminé 1, 2, 3 ou 4 et se terminer par exemple à l'acide aminé 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. De même, pour le peptide VPl 32-45, il peut être possible d'utiliser un peptide plus long contenant les acides aminés 32 à 45, par exemple, 32 à 43 ou 32 à 44 ou 32 à 46 ou 32 à 47 ou 30 à 45 ou 31 à 45 ou 33 à 45 ou 34 à 44 ou un peptide équivalent comportant une ou deux substitutions conservatives d'acides aminés, ou une ou deux délétions d'acides aminés, sans modifier les propriétés immunologiques du peptide ou sans éliminer l'épitope. Un peptide VPl tel que décrit dans ce document peut commencer par exemple à l'acide aminé 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 et se terminer par exemple à l'acide aminé 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50, en utilisant ces nombres comme pour HRV14. On comprendra que cette variabilité entre dans le cadre des peptides décrits dans ce document et que les peptides spécifiques décrits dans ce document sont donnés à titre d'exemple et ne sont pas restrictifs pour ce qui concerne les peptides qui sont capables de conférer une réponse immunitaire de neutralisation croisée telle que décrite dans ce document.
Les peptides HRV VP4 et VP1 à réaction croisée qui sont capables d'induire une réponse immunitaire contre d'autres sérotypes de HRV peuvent être identifiés selon la présente description. Comme on le montre dans ce document, les séquences de HRV de différents sérotypes de HRV peuvent être alignées pour identifier des régions présentant une similitude élevée entre les sérotypes de HRV. De nombreux programmes de séquences sont disponibles pour réaliser ces alignements et identifier l'endroit où se trouve une homologie de séquence. Ceci peut permettre la sélection de peptides HRV VP4 et VPl qui sont les plus similaires entre les sérotypes de HRV d'intérêt et peuvent donc potentiellement réagir de façon croisée entre certains ou tous les sérotypes de HRV.
De façon appropriée, le peptide ou les peptides de HRV VP4 ou VPl sont des peptides pouvant réagir de façon croisée, de sorte qu'ils peuvent induire une réponse immunitaire qui reconnaît non seulement les VP4 ou VPl du sérotype de HRV duquel le peptide VP4 ou VPl est dérivé mais également un peptide ou une protéine VP4 ou VPl d'un sérotype de HRV autre que celui duquel il est dérivé. De façon appropriée, le peptide réagit de façon croisée avec 1 ou 2 autres sérotypes ou plus, dans le même clade ou un clade différent. De façon appropriée, le peptide ou les peptides de HRV VP4 ou VP1 utilisés dans l'invention sont capables de générer une réponse immunitaire de neutralisation croisée qui est une réponse immunitaire qui est capable de neutraliser HRV d'un sérotype de HRV différent du sérotype de HRV duquel le peptide VP4 ou VP1 est dérivé, dans le même clade ou un clade différent. Une neutralisation croisée peut être testée en utilisant des essais bien connus dans l'art tels que l'essai décrit par Katpally et al (2009) ou par Phillips et al (2011) ou l'essai décrit dans ce document à l'exemple 1 qui est adapté de ces essais publiés.
De façon appropriée, le peptide VP4 ou VP1 peut conférer une protection croisée et comprend de façon appropriée, un épitope de neutralisation croisée.
Une protection croisée se produit de façon appropriée lorsqu'un peptide VP4 ou VP1 est capable de générer une réponse immunitaire protectrice contre une infection/maladie provoquée par au moins deux sérotypes de HRV. Une protection croisée peut se produire lorsqu'un peptide consensus VP4 ou VPl est choisi et présenté dans le contexte d'une protéine vectrice telle que CRM197 ou en tant que construction chimérique dans laquelle le peptide est inséré dans un polypeptide, par exemple, un polypeptide de HBsAg ou HPV ou HRV qui forme une particule telle qu'une particule de type viral.
Une protection croisée peut être évaluée en comparant l'incidence d'une infection et/ou d'une maladie pour un groupe de sérotypes de HRV chez des individus vaccinés avec un peptide HRV VP4 ou VPl donné ou une combinaison de ceux-ci, à un groupe non vacciné. Une protection croisée complète contre un sérotype ou un groupe de sérotypes, n'est pas nécessaire selon la présente description ; en effet, tout niveau de protection croisée procure un bénéfice. De façon appropriée, le niveau de protection croisée observé est tel que le groupe vacciné présente 5 % de moins d'infection et/ou de maladie associée à un sérotype ou des sérotypes de HRV non vaccinaux, par rapport à un groupe comparable non vacciné, de manière davantage appropriée, jusqu'à 10 %, jusqu'à 15 %, jusqu'à 20 %, jusqu'à 25 %, jusqu'à 30 %, jusqu'à 35 %, jusqu'à 40 %, jusqu'à 45 %, jusqu'à 50 %, jusqu'à 55 %, jusqu'à 60 %, jusqu'à 65 %, jusqu'à 70 %, jusqu'à 80 %, jusqu'à 90 % ou même jusqu'à 100 % de moins d'infection et/ou de maladie.
Les peptides et constructions de HRV VP1 et VP4 les contenant peuvent être testés pour déterminer l'immunogénicité, la réactivité croisée et la neutralisation croisée, par des techniques standard bien connues dans l'art. Par exemple, les peptides peuvent être injectés dans des modèles animaux ou humains et une mesure des réponses en anticorps et/ou réponses immunitaires cellulaires peut être réalisée, par exemple par ELISA ou une analyse/mesure des cytokines, respectivement. Les procédés de criblage d'anticorps sont bien connus dans l'art. Un essai ELISA peut être utilisé pour évaluer la réactivité croisée des anticorps. Les anticorps peuvent être testés pour déterminer les propriétés de neutralisation et de neutralisation croisée en utilisant un essai tel que décrit dans ce document à l'exemple 1.
Une protection croisée contre différents sérotypes de HRV différents de celui duquel le peptide VP4 ou VP1 est dérivé, peut être identifiée en utilisant un modèle animal, par exemple, un modèle de souris (Bartlett et a!2008).
Les peptides de picornavirus tels que les peptides de rhinovirus VP1 et VP4 peuvent être synthétisés chimiquement par des techniques standard ou produits de façon recombinante. Les peptides peuvent se présenter sous la forme de peptides individuels ou de concatamères de peptides liés en séries, par exemple de 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 peptides ou plus.
Protéines vectrices pour peptides de picornavirus
Les peptides de picornavirus décrits dans ce document tels que les peptides HRV peuvent être couplés à une protéine vectrice. Le couplage peut s'effectuer par tout moyen approprié, par exemple par l'expression sous forme d'une construction avec la protéine vectrice ou par couplage chimique ou conjugaison du peptide avec la protéine vectrice en utilisant une étape de conjugaison chimique. Les protéines vectrices comprennent CRM197 qui est bien connu. Les protéines vectrices comprennent également KLH qui peut être utilisé dans une composition immunogène pour un animal mais non pour l'utilisation humaine. CRM197 est une forme non toxique de toxine diphtérique mais on ne peut pas la distinguer d'un point de vue immunologique de la toxine diphtérique. CRM197 est produit par C. diphtheriae infecté par la phase non toxigène ßl97tox créée par mutagenèse par nitrosoguanidine du corynéphage b (Uchida et al. Nature New Biology (1971) 233 ; 8-11). La protéine CRM197 a le même poids moléculaire que la toxine diphtérique mais diffère de celle-ci par un changement de base unique dans le gène structural. Ceci entraîne un changement d'acide aminé d'une glycine en une glutamine en position 52, ce qui rend le fragment A incapable de se lier à NAD et donc, non toxique (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46 ; 69-94, Rappuoli Applied et Environmental Microbiology Sept 1983 p. 560-564).
La conjugaison de peptides à une protéine vectrice peut être réalisée par de nombreux moyens chimiques différents, bien connus. Les exemples de procédés chimiques comprennent la conjugaison de groupes amino entre le peptide et le véhicule par des réactifs amino-réactifs tels que le glutaraldéhyde ou un réactif d'ester de bis-succinimidyle (DSG - disuccinimidyl-glutarate ou DSS - disuccinimidylsubérate (Greg T. Hermanson. Bioconjugate techniques. Academie Press. 1996, 218-220 et 194-196) ; ou par condensation de groupes carboxyle et de groupes amino avec des réactifs de carbodiimide (Greg T. Hermanson. Bioconjugate techniques. Academie Press. 1996, 171-173). Il est également possible d'utiliser une liaison thio-éther pour conjuguer des peptides à des protéines vectrices. On peut y parvenir par exemple en ajoutant une fraction comportant un groupe thiol terminal sur le peptide, par exemple en ajoutant une cystéine, puis en faisant réagir le groupe thiol réactif avec une protéine vectrice dérivatisée de maléimide (voir Greg T. Hermanson. Bioconjugate techniques. Academie Press. 1996). Un autre procédé consiste à coupler un véhicule thiolé avec un groupe sulfydryle sur le peptide pour former un pont disulfure. Les peptides peuvent également être synthétisés avec un groupe halogénoalkyle supplémentaire tel qu'un groupe iodoalkyle ou bromoalkyle. De façon appropriée, le groupe bromoalkyle est un groupe bromoacétyle. L'utilisation de groupes bromoacétyle pour lier les peptides à des véhicules est décrite dans la littérature (Ivanov et al., 1995, Bioconjugatechemistry, 6, 269-277). L'amination réductrice peut également être utilisée pour conjuguer une molécule contenant un aldéhyde avec une molécule contenant une amine. Les peptides peuvent également être synthétisés avec un groupe hydrazide supplémentaire. Des macromolécules contenant un aldéhyde peuvent également réagir spontanément avec des composés hydrazide pour former des liaisons hydrazone. Les hydrazides sont des nucléophiles plus puissants et réagissent plus facilement avec les aldéhydes que les amines primaires. La liaison hydrazone est une forme de base de Schiff qui est plus stable que celle formée par l'interaction d'un aldéhyde et d'une amine. Par conséquent, une conjugaison spécifique peut être obtenue par amination réductrice en utilisant des peptides ayant un hydrazide supplémentaire (Shannessy D.J. et Wilcheck. 1990. Analytical Biochemistry 191 : 1-8).
Dans un mode de réalisation, les peptides sont couplés à CRM197 selon des techniques de conjugaison chimiques bien connues, voir par exemple, Mattson et al, MolBiol Reports, 17, 167-183, 1993. Dans un mode de réalisation, CRM197 est purifié à partir de
Corynebacterium et la fermentation de CRM197 est réamisée comme on le décrit dans le document WO 2006/100108. Dans un mode de réalisation, le procédé de purification comprend trois étapes chromatographiques (Q-sepharose-XL, hydroxyapatite type I et Octyl-Sepharose) et une étape d'ultrafiltration. La chimie du maléimide peut être utilisée pour conjuguer des peptides ayant une cystéine au niveau N ou C-terminal.
Polypeptides chimériques comprenant des peptides de picornavirus
Comme autre moyen de présentation des peptides de picornavirus, on peut utiliser une construction de polypeptide chimérique. Avantageusement, la construction de polypeptide chimérique forme des particules telles que des capsomères ou des particules de type viral (VLP) ou de petites structures de type non VLP.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention est proposée une construction de polypeptide chimérique comprenant un polypeptide qui forme des particules et un peptide comprenant un épitope d'un polypeptide structural de picornavirus tel qu'un peptide structural de rhinovirus, par exemple de VP1 ou VP4. Les particules peuvent être des capsomères ou des VLP ou de petites structures de type non VLP.
Un exemple de polypeptide qui peut être utilisé dans une construction de polypeptide chimérique avec un peptide de picornavirus tel qu'un peptide ou des peptides de HRV, est un polypeptide d'antigène de surface de l'hépatite B. HBsAg est utilisé depuis les années 1980 comme base de vaccin contre l'hépatite B. HBsAg est également utilisé dans un vaccin candidat contre le paludisme connu sous le nom de RTS, S, qui comprend des polypeptides chimériques de HbsAg ayant un prolongement de 226 acides aminés de la protéine S du virus de l'hépatite B (sérotype adw) fusionné via sa terminaison N-terminale à un fragment de la protéine circumsporozoite (CSP)de P. falciparum, via quatre acides aminés, Pro, Val, Thr, Asn, représentant les quatre résidus carboxy-terminaux de la protéine preS2 du virus de l'hépatite B (sérotype adw) . RTS, S est décrit dans le document WO 93/10152. Le polypeptide chimérique est exprimé dans une souche de levure qui porte déjà dans son génome, plusieurs copies d'une cassette d'expression de l'antigène de surface de l'hépatite B. La souche obtenue synthétise deux polypeptides, S et RTS, qui se co-assemblent spontanément en particules de lipoprotéine mixtes (RTS, S) qui présentent les séquences de CSP sur leur surface.
Avantageusement, la chimère de peptide de picornavirus/polypeptide de HBsAg forme une particule qui ressemble à une particule HBsAg. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide de l'antigène S est un segment contigu de 226 acides aminés, spécifiant la protéine S du virus de l'hépatite B (sérotype adw). La chimère du peptide de picornavirus/polypeptide HBsAg est construite avantageusement de façon à former spontanément des particules. Les particules peuvent être des particules mixtes comprenant un polypeptide de HBsAg non chimérique conjointement à un peptide de picornavirus/polypeptide de HBsAg chimérique. Les sites appropriés pour l'insertion des peptides de picornavirus tels que le peptide ou les peptides de HRV comprennent la boucle « a », la terminaison N et la terminaison C de HBsAg. Les peptides qui peuvent être inclus dans un HBsAg chimérique comprennent l'un quelconque des peptides décrits ici, comprenant les peptides VP4 tels que les peptides 1 à 16 et les peptides VP1 tels que 32 à 45 et de variantes de l'un ou l'autre ou des deux et d'autres peptides de protéines structurales de picornavirus comprenant VP4 et VPl, tels que les peptides de rhinovirus VP4 et VPl. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide dans la construction du polypeptide chimérique contient un épitope neutralisant. Les peptides de HRV contenant un épitope neutralisant peuvent être trouvés dans la littérature et comprennent 1-31 de VP4 (Katpally et al 2009) et 147-162 de HRV14 VPl (Edlmayret al 2011).
Dans le cas de particules de type viral de HPV, il existe des particules de type viral de HPV 16 ou HPV 18 appropriées. La protéine L1 de HPV s'auto-assemble dans des particules de type viral qui ressemblent habituellement aux virus de HPV observés au microscope électronique. Habituellement, elles sont constituées de 72 capsomères qui sont eux-mêmes constitués de 5 polypeptides LI dans une unité pentamère. De façon appropriée, la protéine L1 est une protéine Ll tronquée capable de s'auto-assembler, par exemple dans des capsomères de VLP. De façon appropriée, Ll est tronquée pour éliminer un signal de localisation nucléaire. De façon appropriée, la troncature est une troncature C-terminale. De façon appropriée, la troncature C-terminale retire moins de 50 acides aminés, par exemple, moins de 40 acides aminés. Dans un mode de réalisation particulier, la troncature C-terminale retire 34 acides aminés de HPV 16 et 35 acides aminés de HPV 18. L'emplacement du peptide ou des peptides de picornavirus/HRV dans un polypeptide de HPV Ll chimérique décrit dans ce document est important. Un emplacement du peptide de picornavirus est un emplacement des boucles exposées ou le bras entrant dans la terminaison C de la protéine Ll. Les boucles et le bras entrant sont trouvés lorsque Ll est sous la forme de capsomères ou de particules de type viral (Chen et al 2000).
Dans l'un quelconque des modes de réalisation décrits dans ce document, le peptide HRV peut être situé sur une position choisie parmi les régions suivantes de la séquence Ll, les emplacements correspondants à la séquence de référence de HPV 16 et HPV 18 Ll ou à une position équivalente dans une autre séquence de HPV Ll : (i) boucle BC dans les acides aminés 50 à 61 (ii) boucle DE dans les acides aminés 132 à 142, par exemple, les acides aminés 132 à 141, en particulier, les acides aminés 137 à 138 (iii) bouclé EF dans les acides aminés 172 à 182, par exemple 176 à 182, en particulier 176 à 179 (iv) boucle FG dans les acides aminés 271 à 290, par exemple 272 à 275, en particulier 272 à 273 (v) boucle HI dans les acides aminés 345-359, par exemple 347 à 350, en particulier 349 à 350 (vi) bras de la terminaison C dans les acides aminés 429 à 445, par exemple 423 à 440, en particulier, 423 à 424, 431 à 433 ou 437 à 438 pour HPV 16, et 424 à 425, 432 à 433 ou 439 à 440 pour HPV 18.
Dans un mode de réalisation décrit dans ce document, le peptide de picornavirus peut être inséré dans la séquence polypeptidique sans retirer les acides aminés du polypeptide. En variante, le peptide de picornavirus peut être inséré dans la séquence polypeptidique avec le retrait d'un ou plusieurs acides aminés de la séquence polypeptidique sur la position d'insertion, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés de la séquence polypeptidique peuvent être retirés sur le site où le peptide est inséré. Par conséquent, le peptide de picornavirus peut remplacer un ou plusieurs acides aminés dans la séquence polypeptidique, par exemple, le peptide de picornavirus peut remplacer une séquence polypeptidique de longueur équivalente à celle de la séquence du peptide du picornavirus.
Lorsque deux ou plusieurs peptides de picornavirus sont présents dans une construction chimérique de peptide de picornavirus/polypeptide, il peut s'agir de différents peptides de picornavirus du même picornavirus ou de peptides du même picornavirus mais de sérotypes différents, auquel cas ils peuvent provenir d'une région correspondante dans les différents picornavirus ou de différentes régions dans les différents picornavirus. Par exemple, lorsque des peptides de HRV sont présents dans une construction chimérique de peptide de HRV peptide/polypeptide, ils peuvent être des peptides de HRV différents du même sérotype de HRV ou ils peuvent être des peptides de ’ différents sérotypes de HRV, auquel cas, ils peuvent provenir de la région correspondante dans les différents sérotypes de HRV ou de différentes régions des différents sérotypes de HRV.
Dans un mode de réalisation, le peptide de picornavirus tel qu'un peptide de HRV est inséré sur un site qui permet l'assemblage d'un ensemble supramoléculaire de polypeptides chimériques, par exemple dans des particules de polypeptide telles que de particules de type viral (VLP) ou des capsomères ou de petites structures de type non VLP. Par exemple, dans le cas de particules chimériques de HPV, pour conserver la structure de VLP, le peptide de picornavirus est inséré dans le polypeptide Ll sur un site qui n'interfère pas avec les sites impliqués dans la formation de ponts disulfure qui sont impliqués dans la conservation d'interactions inter-capsomères et donc, la conformation de VLP. Habituellement, les VLP chimériques sont de taille similaire ou identique par rapport aux VLP natives c'est-à-dire, dans le cas de HPV, les VLP chimériques sont de taille similaire ou identique par rapport aux VLP dans lesquelles la protéine Ll est de pleine longueur ou tronquée mais ne contient pas de peptide de picornavirus. Les HPV VLP chimériques peuvent être de l'ordre de 50 nm de diamètre. Dans d'autres modes de réalisation, de petites structures non VLP entre 20 et 35 nm sont formées.
Dans un mode de réalisation comprenant deux peptides de picornavirus ou plus dans un polypeptide, les peptides de picornavirus peuvent être insérés dans des sites identiques ou différents dans la séquence polypeptidique. Lorsque des peptides de picornavirus sont insérés sur le même site, cela peut s'effectuer dans la même boucle et dans la même région hypervariable de la même boucle. Il peut être avantageux d'avoir un court prolongement d'acides aminés entre les peptides de picornavirus, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés entre les peptides de picornavirus.
Eventuellement, un segment d'espacement d'un ou plusieurs acides aminés tel que des résidus de glycine peut également être inclus dans la terminaison N ou C du peptide de picornavirus. Par exemple, les peptides peuvent comprendre en outre un ou deux ou trois acides aminés d'espacement ajoutés à la terminaison amino ou carboxy (ou entre les peptides liés dans lesquels deux peptides de picornavirus ou plus sont présents). Généralement, le segment d'espacement n'aura pas d'activité biologique spécifique autre que celle de joindre le peptide immunogène à la séquence polypeptidique ou de conserver une distance minimale ou une autre relation spatiale entre eux. Un segment d'espacement peut être nécessaire ou utile pour conserver la conformation correcte de la particule de polypeptide et/ou une présentation efficace ou améliorée du peptide de picornavirus inséré par rapport à l'absence d'un segment d'espacement. L'un quelconque des peptides de picornavirus peut être modifié, par exemple, par l'insertion (addition), délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés. Par exemple, les peptides de HRV peuvent incorporer des acides aminés qui diffèrent de la séquence HRV de la séquence native (c'est-à-dire existant à l'état naturel) de HRV VP4 ou VP1. Par exemple, les peptides peuvent avoir une ou deux insertions ou substitutions d'acides aminés dans la séquence, ou une délétion d'un ou deux ou de plusieurs acides aminés, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou jusqu'à 10 acides aminés par rapport à la séquence native, par exemple pour éliminer l'occurrence d'un pont disulfure entre deux cystéines et/ou la région entre les cystéines. Dans des exemples spécifiques, les modifications présentes dans les peptides de HRV de la présente description, en relation avec une séquence de HRV native sont limitées à 1 ou 2 insertions, délétions ou substitutions d'acides aminés, et/ou une délétion allant jusqu'à 10 acides aminés contigus entre deux résidus de cystéine.
Lorsque des modifications de la séquence de HRV sont effectuées dans les peptides décrits dans ce document, ces modifications peuvent être limitées de sorte qu'une proportion substantielle d'au moins 50 % ou d'au moins 70 % ou d'au moins 90 % ou d'au moins 95 % des acides aminés dans le peptide corresponde aux acides aminés dans la séquence native HRV VP4 ou VPl.
En variante ou de plus, tout peptide de HRV particulier peut être une chimère de deux ou trois peptides de HRV ou plus comme on le décrit dans ce document. Dans le cas de l'une quelconque de ces modifications de la séquence de HRV, le caractère immunogène de la séquence de HRV est conservé. Cela signifie que l'épitope ou les épitopes de HRV dans le peptide qui induit la réponse immunitaire souhaitée sont conservés. L'objet des modifications peut être d'améliorer les propriétés du peptide de HRV, par exemple d'améliorer la réactivité croisée avec des protéines structurales d'autres sérotypes de HRV.
Acides nucléiques codant pour des peptides de RVH, construction les contenant et procédés de production de polypeptides chimériques
Un autre aspect de la présente description concerne des molécules d'acide nucléique qui codent pour l'un quelconque des peptides mentionnés précédemment et les polypeptides chimériques contenant les peptides des peptides structuraux de HRV.
Dans certains modes de réalisation, les acides nucléiques recombinants qui codent pour les peptides ou les polypeptides chimériques sont optimisés par un codon pour leur expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote choisie.
Pour faciliter la réplication et l'expression, les acides nucléiques qui codent pour les peptides ou les polypeptides chimériques peuvent être incorporés dans un vecteur tel qu'un vecteur d'expression procaryote ou eucaryote.
Les peptides et polypeptides chimériques décrits ici peuvent être produits en utilisant des procédures bien établies pour l'expression et la purification de protéines recombinantes. Des procédures suffisantes pour orienter l'homme du métier peuvent être trouvées dans les références suivantes : Sambrooket al.,
Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200 ; et Ausubelet al. Short Protocols in Molecular Biology, 4ème éd., John Wiley & Sons, Inc., 999. Des détails supplémentaires et spécifiques sont proposés ci-dessous.
Les cellules hôtes qui comprennent les acides nucléiques codant pour le peptide ou le polypeptide chimérique constituent donc également un aspect de la présente description. Les cellules hôtes appropriées comprennent les cellules hôtes procaryotes (c'est-à-dire bactériennes) telles que E. coli, ainsi que de nombreuses cellules hôtes eucaryotes comprenant des champignons (par exemple, une levure telle que Saccharomyces cerevisiae et Picchia pastoris), des cellules d'insectes, des cellules de plante et des cellules de mammifères (telles que les cellules CHO et HEK293). Les acides nucléiques recombinants qui codent pour les peptides ou les polypeptides chimériques sont introduits (par exemple, transduits, transformés ou transfectés) dans des cellules hôtes, par exemple, via un vecteur tel qu'un vecteur d'expression. Le vecteur peut être un plasmide, une particule virale, un phage, un baculovirus, etc. Les exemples d'hôtes d'expression appropriés comprennent : des cellules bactériennes telles que E. coli, Streptomyces, et Salmonella typhimurium ; des cellules de champignons tels que Saccharomyces cerevisiae, Pichiapastoris, et
Neurosporacrassa ; des cellules d'insecte telles que Trichoplusia, Drosophila, Spodopterafrugiperda ; des cellules de mammifère telles que 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 2 93 ou de mélanome de Bowes ; des cellules de plantes comprenant des cellules d'algues, etc.
Les cellules hôtes peuvent être cultivées dans des milieux nutritifs classiques modifiés si appropriés pour activer des promoteurs, sélectionner des transformants ou amplifier les séquences polynucléotidiques insérées. Les conditions de culture telles que la température, le pH et autres, sont celles qui sont utilisées précédemment avec la cellule hôte choisie pour l'expression et apparaîtront à l'homme du métier et dans les références citées dans ce document, comprenant par exemple, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, troisième édition, Wiley- Liss, New York et les références citées dans ce document. En plus de l'ouvrage de Sambrook, Berger et Ausubel, des détails relatifs à la culture cellulaire peuvent être trouvés dans les ouvrages de Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY ; Gamborg and Phillips (éd.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture ; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) et . Atlas and Parks (éd. ) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
Compositions immunogènes et procédés
Un autre aspect de la présente description concerne des compositions immunogènes qui contiennent des peptides de picornavirus ou des constructions de polypeptides chimériques les contenant, tels que des polypeptides qui forment des particules telles que des VLP ou des particules subvirales telles que des capsomères. Les compositions immunogènes décrites ici comprennent habituellement au moins un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement, un adjuvant. Les véhicules et excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et peuvent être choisis par l'homme du métier. Par exemple, le véhicule ou l'excipient peut comprendre favorablement un tampon. Eventuellement, le véhicule ou excipient peut contenir également au moins un composant qui stabilise la solubilité et/ou favorise la stabilité. Les exemples d'agents de solubilisation/ stabilisation comprennent des détergents, par exemple, la lauryl-sarcosine et/ou le tween. D'autres agents de solubilisation/stabilisation comprennent l'arginine et des polyols vitrifiants (tels que le saccharose, le tréhalose et autres). De nombreux véhicules pharmaceutiquement acceptables et/ou excipients pharmaceutiquement acceptables sont connus dans l'art et sont décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5ème édition (975).
En conséquence, les excipients et véhicules appropriés peuvent être choisis par l'homme du métier pour produire une formulation appropriée pour la distribution à un sujet par une voie d'administration choisie. Les excipients appropriés comprennent, de manière non restrictive : le glycérol, le polyéthylène glycol (PEG), le sorbitol, le tréhalose, le sel de N-lauroylsarcosine sodium, la L-proline, la sulfobétaine non détergente, le chlorure de guanidine, l'urée, l'oxyde de triméthylamine, le KC1, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ et autres sels apparentés à cations divalents, le dithiothréitol, le dithioérytrol et le ß-mercaptoéthanol. D'autres excipients peuvent être des détergents (comprenant : le Tween 80, le Tween 20, le
Triton X-00, le NP-40, 1'Empigen BB, 1'octylglucoside, le lauroylmaltoside, le Zwittergent 3-08, le Zwittergent 3-0, le Zwittergent 3-2, le Zwittergent 3-4, le Zwittergent 3-6, le CHAPS, le désoxycholate de sodium, le dodécylsulfate de sodium, le bromure de cétyltriméthyl-ammonium).
Eventuellement, les compositions immunogènes comprennent également un adjuvant. L'adjuvant est choisi de façon à être inoffensif et bien toléré dans la population cible. Par exemple, dans le cas d'un adjuvant choisi pour sa sécurité et son efficacité chez de jeunes enfants, on peut choisir une dose d'adjuvant qui est une dilution (par exemple, une dose fractionnée) d'une dose habituellement administrée à un sujet adulte.
Un adjuvant approprié est un dérivé de lipopolysaccharide bactérien non toxique. Un exemple de dérivé non toxique approprié de lipide A, est le lipide A monophosphoryle ou plus particulièrement le lipide A monophosphoryle 3-désacylé (3D-MPL). Le 3D-MPL est commercialisé sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals N.A., et est nommé tout au long de ce document, MPL ou 3D-MPL. Voir par exemple, les brevets US n° 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094.
Le 3D-MPL favorise principalement les réponses en lymphocytes T CD4+ avec un phénotype d'IFN-γ (Thl) . Le 3D-MPL peut être produit selon les procédés décrits dans le document GB2220211 A. Chimiquement, il s'agit d'un mélange de lipide A monophosphoryle 3-désacylé comportant 3, 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans les compositions de la présente invention, de petites particules de 3D-MPL peuvent être utilisées. Le 3D-MPL à petites particules a une taille de particules telle qu'il peut être filtré de façon stérile dans un filtre de 0,22 pm. Ces préparations sont décrites dans le document W094/21292.
Un lipopolysaccharide, tel que le 3D-MPL, peut être utilisé en quantités entre 1 et 50 pg, par dose humaine de la composition immunogène. Le 3D-MPL peut être utilisé à un niveau d'environ 25 pg, par exemple entre 20 et 30 pg, de façon appropriée, entre 21 et 29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg ou 25 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend le 3D-MPL à un niveau d'environ 10 pg, par exemple entre 5 et 15 pg, de façon appropriée, entre 6 et 14 pg, par exemple entre 7 et 13 pg ou entre 8 et 12 pg ou entre 9 et 11 pg, ou 10 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend le 3D-MPL à un niveau d'environ 5 pg, par exemple entre 1 et 9 pg ou entre 2 et 8 pg ou de façon appropriée, entre 3 et 7 pg ou 4 et pg, ou 5 pg.
Dans d'autres modes de réalisation, le lipopolysaccharide peut être un disaccharide de β(1-6) glucosamine tel que décrit dans le brevet US n° 6 005 099 et le brevet EP n° 0 729 473 Bl. L'homme du métier pourra produire facilement divers lipopolysaccharides, tels que le 3D-MPL, sur la base des enseignements figurant dans ces références. Néanmoins, chacune de ces références est incorporée dans la présente demande. En plus des immunostimulants mentionnés précédemment (qui sont de structure similaire à celle des LPS ou MPL ou 3D-MPL), les dérivés de monosaccharide et disaccharide acylés qui sont une sous-partie de la structure de MPL ci-dessus sont également des adjuvants appropriés. Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant est un dérivé synthétique de lipide A, dont certains sont décrits comme des antagonistes de TLR-4 et comprennent, de manière non restrictive : 1ΌΜ174 (2-désoxy-6-o-[2- désoxy-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétra-décanoylamino]-4-o-phosphono-ß-D-glucopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxytétra-décanoylamino]-a-D-glucopyranosyldihydrogénophosphate) , (WO 95/14026) ; 1'OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]décane-1,10-diol,1,10-bis(dihydrogénophosphate) (WO 99/64301 et WO 00/0462) ; et l'OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[ (R)- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]décan-1,10-diol,1-dihydrogéno phosphate 10-(6-aminohexanoate) (WO 01/46127). D'autres ligands de TLR4 qui peuvent être utilisés sont les phosphates d'alkyl-glucosaminide (AGP) tels que ceux décrits dans le document WO 98/50399 ou le brevet US n° 6 303 347 (des procédés de préparation des AGP sont également décrits), de façon appropriée RC527 ou RC529 ou des sels d'AGP pharmaceutiquement acceptables décrits dans le brevet US n° 6 764 840. Certains AGP sont des agonistes de TLR4 et d'autres sont des antagonistes de TLR4. Tous deux sont censés être des adjuvants utiles. D'autres ligands de TLR-4 appropriés, capables d'entraîner une réponse de signalisation par TLR-4 (Sabroe et al, JI 2003 pl630-5) sont par exemple, le lipopolysaccharide de bactérie à gram négatif et ses dérivés ou fragments, en particulier, un dérivé non toxique de LPS (tel que le 3D-MPL) . D'autres agonistes de TLR appropriés sont : les protéines de choc thermique (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ou 90 ; la protéine A tensioactive, les oligosaccharides de hyaluronane, les fragments de sulfate d'héparane, les fragments de fibronectine, les peptides de fibrinogène et de b-défensine-2, et le dipeptide de muramyle (MDP). Dans un mode de réalisation, l'agoniste de TLR est le HSP 60, 70 ou 90. D'autres ligands de TLR-4 appropriés sont tels que décrits dans les documents WO 2003/011223 et WO 2003/099195, tels que le composé I, le composé II et le composé III décrits en pages 4 et 5 du document WO 2003/011223 ou en pages 3 et 4 du document WO 2003/099195 et en particulier, les composés décrits dans le document WO 2003/011223 sous les noms de ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 et ER804764. Par exemple, un ligand de TLR-4 approprié est le ER804057.
Des agonistes de TLR supplémentaires sont également utiles comme adjuvants. L'expression « agoniste de TLR » désigne un agent qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par une voie de signalisation TLR, soit comme ligand direct, soit indirectement par la génération d'un ligand endogène ou exogène. Ces agonistes de TLR naturels ou synthétiques peuvent être utilisés comme adjuvants alternatifs ou supplémentaires. Un bref examen du rôle des TLR comme récepteurs d'adjuvant est proposé par Kaisho & Akira, dans Biochimica et BiophysicaActa 1589 : 1-13, 2002. Ces adjuvants potentiels comprennent, de manière non restrictive, des agonistes de TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9. En conséquence, dans un mode de réalisation, l'adjuvant et la composition immunogène comprennent en outre un adjuvant qui est choisi dans le groupe comprenant : un agoniste de TLR-1, un agoniste de TLR-2, un agoniste de TLR-3, un agoniste de TLR-4, un agoniste de TLR-5, un agoniste de TLR-6, un agoniste de TLR-7, un agoniste de TLR-8, un agoniste de TLR-9 ou une combinaison de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-1. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-1 est choisi parmi : les lipopeptides tri-acylés (LP) ; la moduline phénol-soluble ; Mycobacterium tuberculosis LP ; le trichlorhydrate de S-(2,3-bis(palmitoyloxy)-(2-RS)-propyl)-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH (Pam3Cys) LP qui imite la terminaison amino acétylée d'une lipoprotéine bactérienne et 1'OspA LP de Borrelia burgdorferi.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-2. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-2 est l'un ou plusieurs des composés parmi une lipoprotéine, un peptidoglycane, un lipopeptide bactérien de M. tuberculosis, de B. burgdorferi ou de T. pallidum ; des peptidoglycanes provenant d'espèces comprenant Staphylococcus aureus ; des acides lipotéichoïques, des acides mannuroniques, des porines de Neisseria, des fimbriae bactériennes, des facteurs de virulence de Yersina, des virions de CMV, 1'hémagglutinine du virus de la rougeole et du zymosane de levure.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-3. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-3 est un ARN à brin double (ARNdb) ou un acide polyinosinique-polycytidylique (Poly IC), une configuration d'acide nucléique moléculaire associée à une infection virale.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-5. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-5 est une flagelline bactérienne.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-6. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-6 est une lipoprotéine mycobactérienne, une LP di-acylée et une moduline phénol-soluble. Des agonistes supplémentaires de TLR6 sont décrits dans le document WO 2003/043572.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-7. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-7 est un ARN à brin simple (ARNbs), la loxoribine, un analogue de guanosine sur les positions N7 et C8 ou un composé d'imidazoquinoline ou des dérivés de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, l'agoniste de TLR est l'imiquimod. D'autres agonistes de TLR7 sont décrits dans le document WO 2002/085905.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste de TLR est utilisé, qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-8. De façon appropriée, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par TLR-8 est un ARN à brin simple (ARNbs), une molécule d'imidazoquinoline ayant une activité antivirale, par exemple le résiquimod (R848) ; le résiquimod peut également être reconnu par TLR-7. D'autres agonistes de TLR-8 qui peuvent être utilisés comprennent ceux décrits dans le document WO 2004/071459.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un agoniste de TLR qui est capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-9. Dans un mode de réalisation, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-9 et HSP90. En variante, l'agoniste de TLR capable d'entraîner une réponse de signalisation par le biais de TLR-9 est un ADN bactérien ou viral, un ADN contenant des nucléotides de CpG non méthylés, en particulier des contextes de séquence particuliers connus sous le nom de motifs CpG. Les oligonucléotides contenant CpG induisent principalement une réponse Thl. Ces oligonucléotides sont bien connus et sont décrits par exemple, dans les documents WO 96/02555, WO 99/33488 et les brevets U.S. n° 6 008 200 et 5 856 462. De façon appropriée, les nucléotides de CpG sont des oligonucléotides de CpG. Les oligonucléotides appropriés pour leur utilisation dans les compositions immunogènes de la présente invention sont des oligonucléotides contenant CpG, éventuellement contenant deux motifs CpG de dinucléotides séparés par au moins trois, de façon appropriée au moins six nucléotides ou plus. Un motif de CpG est un nucléotide de cytosine suivi par un nucléotide de guanine. Les oligonucléotides de CpG de la présente invention sont habituellement des désoxynucléotides. Dans un mode de réalisation spécifique, l'internucléotide dans l'oligonucléotide est le phosphorodithioate ou, de façon appropriée, une liaison phosphorothioate bien que des liaisons phosphodiester et autres liaisons par internucléotides entrent dans le cadre de l'invention. Dans le cadre de l'invention sont également compris des oligonucléotides comportant des liaisons internucléotides mixtes. Les procédés de production d'oligonucléotidesde phosphorothioate ou de phosphorodithioate sont décrits dans les brevets US n° 5 666 153, 5 278 302 et WO 95/26204. D'autres adjuvants qui peuvent être utilisés dans des compositions immunogènes avec des peptides de picornavirus ou des constructions de polypeptides chimériques, par exemple, d'eux-mêmes ou en combinaison avec le 3D-MPL, ou un autre adjuvant décrit dans ce document, sont les saponines, telles que QS21.
Les saponines sont décrites par Lacaille-Dubois, M. et Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicinevol 2 pp 363-386). Les saponines sont des stéroïdes ou des glycosides triterpènes largement distribués dans le règne végétal et animal marin. Les saponines sont connues pour former des solutions colloïdales dans l'eau, qui moussent lorsqu'elles sont agitées et pour précipiter le cholestérol. Lorsque les saponines sont proches des membranes cellulaires, elles créent des structures de type poreux dans la membrane, ce qui entraîne un éclatement de la membrane. L'hémolyse d'érythrocytes est un exemple de ce phénomène qui est une propriété de certaines saponines mais non de toutes.
Les saponines sont connues comme adjuvants dans les vaccins destinés à une administration systémique. L'adjuvant et l'activité hémolytique des saponines individuelles ont été largement étudiés dans l'art (Lacaille-Dubois and Wagner, supra). Par exemple, le Quil A (dérivé de l'écorce de l'arbre d'Amérique du sud Quillaja Saponaria Molina), et des fractions de celui-ci sont décrits dans le document US 5 057 540 et dans « Saponins as vaccine adjuvants », Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2) : 1-55 ; et EP 0 362 279 Bl. Des structures particulaires nommés complexes immunostimulants (ISCOMS) comprenant des fractions de Quil A sont hémolytiques et ont été utilisées dans la production de vaccins (Morein, B., EP 0 109 942 Bl ; WO 96/11711 ; WO 96/33739). Les saponines hémolytiques QS21 et QS17 (fractions purifiées par HPLC de Quil A) ont été décrites en tant que puissants adjuvants systémiques et le procédé pour leur production est décrit dans le brevet US n° 5 057 540 et EP 0 362 279 Bl qui sont inclus ci-joint en référence. D'autres saponines qui ont été utilisées dans des études de vaccination systémique comprennent celles dérivées d'autres espèces de plantes telles que le gypsophile et la saponaire (Bomfordet al., Vaccine, 10(9) : 572-577, 1992).
Le QS21 est une fraction de Hplc non toxique purifiée, dérivée de l'écorce de Quillaja Saponaria Molina. Un procédé de production de QS21 est décrit dans le brevet US n° 5 057 540. Des formulations d'adjuvant non réactogènes contenant QS21 sont décrites dans le document WO 96/33739. Les références mentionnées ci-dessus sont incorporées en annexe au présent document. Ladite saponine immunologiquement active telle que QS21, peut être utilisée en quantités entre 1 et 50 pg, par dose humaine de la composition immunogène. Avantageusement, QS21 est utilisé au niveau d'environ 25 pg, par exemple entre 20 et 30 pg, de façon appropriée, entre 21 et 29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend QS21 à un niveau d'environ 10 pg, par exemple entre 5 et 15 pg, de façon appropriée, entre 6 et 14 pg, par exemple, entre 7 et 13 pg ou entre 8 et 12 pg ou entre 9 et 11 pg, ou 10 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend QS21 à un niveau d'environ 5 pg, par exemple entre 1 et 9 pg, ou entre 2 et 8 pg ou de façon appropriée, entre 3 et 7 pg ou 4 à 6 pg, ou 5 pg. Ces formulations comprenant QS21 et du cholestérol se sont avérées des adjuvants stimulants de Thl efficaces lorsqu'ils sont formulés conjointement avec un antigène. Par conséquent, par exemple, des peptides de picornavirus et des constructions de polypeptides chimériques peuvent être utilisés favorablement dans des compositions immunogènes avec un adjuvant comprenant une combinaison de QS21 et de cholestérol.
Eventuellement, l'adjuvant peut également comprendre des sels minéraux tels que des sels d'aluminium ou de calcium, en particulier, 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium et le phosphate de calcium. Par exemple, un adjuvant contenant le 3D-MPL en combinaison avec un sel d'aluminium (par exemple, 1'hydroxyde d'aluminium ou « alun ») est approprié pour une formulation dans une composition immunogène contenant des peptides de picornavirus ou une construction de polypeptide chimérique pour l'administration à un sujet humain.
Une autre classe d'adjuvants à base de Thl pour son utilisation dans des formulations avec des peptides de picornavirus et des constructions de polypeptides chimériques comprend des compositions immunostimulantes à base d'OMP. Les compositions immunostimulantes à base d'OMP sont particulièrement appropriées comme adjuvants muqueux, par exemple, pour l'administration intranasale. Les compositions immunostimulantes à base d'OMP sont un genre de préparations de protéines de membrane externe (OMP comprenant certaines porines) de bactéries à gram négatif telles que, de manière non restrictive, Neisseria species (voir par exemple, Lowell et ai., J. Exp. Med. 167 : 658, 1988 ; Lowell et ai., Science 240 : 800, 1988 ; Lynch et ai., Biophys. J. 45 : 104, 1984 ; Lowell, dans « New Generation Vaccines » 2ème éd, Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997 ; le brevet U.S. n° 5 726 292 ; le brevet U.S. n° 4 707 543) qui sont utiles comme véhicules ou dans les compositions pour des immunogènes tels que des antigènes bactériens ou viraux. Certaines compositions immunostimulantes à base d'OMP peuvent être nommées « protéosomes », qui sont hydrophobes et d'une utilisation inoffensive pour l'être humain. Les protéosomes ont la capacité de s ' auto-assembler dans des vésicules ou des amas d'OMP de type vésicules d'environ 20 nm à environ 800 nm et de s'incorporer, se coordonner, s'associer de façon non covalente, (par exemple, de façon électrostatique ou hydrophobe), ou coopérer d'une autre façon avec des antigènes de protéine (Ag), en particulier, des antigènes qui ont une fraction hydrophobe. Tout procédé de préparation qui donne le composant de protéine de membrane externe sous forme vésiculaire ou analogue à une vésicule, comprenant des structures membranaires multimoléculaires ou des compositions d'OMP de type globulaire fondu d'un ou plusieurs OMP, est compris dans la définition du protéosome. Les protéosomes peuvent être préparés, par exemple, comme on le décrit dans l'art (voir par exemple, les brevets U.S. n° 5 726 292 ou U.S. n° 5 985 284) . Les protéosomes peuvent également contenir un lipopolysaccharide, un lipooligosaccharide endogène (LPS ou LOS, respectivement) provenant des bactéries utilisées pour produire les porines d'OMP (par exemple, de l'espèce Neisseria) qui constitueront généralement moins de 2 % de la préparation d'OMP totale.
Les protéosomes sont constitués principalement de protéines de membrane externe extraites chimiquement (OMP) de Neisseria menigitidis (principalement, les porines A et B ainsi que l'OMP de classe 4), maintenues en solution par un détergent (Lowell GH. Protéosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines, dans : Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, éd, New Generation Vaccines. New York : Marcel Dekker, Inc. 1997 ; 193-206). Les protéosomes peuvent être formulés avec divers antigènes tels que des protéines purifiées ou recombinantes dérivées de sources virales, comprenant les peptides de picornavirus et des constructions de polypeptide chimériques décrites ici, par exemple par diafiltration ou des procédés de dialyse classique. L'élimination progressive du détergent permet la formation de complexes hydrophobes particulaires d'environ 100 à 200 nm de diamètre (Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. dans : Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, éd, New Generation Vaccines. New York : Marcel Dekker, Inc. 1997 ; 193-206).
Les termes « protéosome : LPS ou protolline » tels qu'ils sont utilisés ici désignent des préparations de protéosomes mixtes, par exemple, par addition exogène, avec au moins une sorte de lipo-polysaccharide pour donner une composition OMP-LPS (qui peut faire effet de composition immunostimulante). Par conséquent, la composition d'OMP-LPS peut être constituée de deux des composants basiques de la protolline, qui comprend (1) une préparation de protéine de membrane externe de protéosomes (par exemple, Projuvant) préparée à partir de bactéries à gram négatif telles que Neisseria meningitidis, et (2) une préparation d'un ou plusieurs liposaccharides. Un lipo-oligosaccharide peut être endogène (par exemple, contenu à l'état naturel avec la préparation de protéosome d'OMP), peut être mélangé ou combiné avec une préparation d'OMP d'un lipo-oligosaccharide préparé de façon exogène (par exemple, préparé à partir d'une culture de microorganisme différente de celle de la préparation d'OMP), ou peut être une combinaison de ceux-ci. Ce LPS ajouté de façon exogène peut provenir de la même bactérie à gram négatif à partir de laquelle la préparation d'OMP a été produite ou à partir d'une bactérie à Gram négatif différente. La protolline doit également être comprise comme incluant éventuellement des lipides, des glycolipides, des glycoprotéines, de petites molécules ou autres, et leurs combinaisons. La protolline peut être préparée par exemple, comme l'a décrit la publication de la demande de brevet ü.S. n° 2003/0044425.
Des combinaisons de différents adjuvants tels que ceux mentionnés ci-dessus, peuvent également être utilisées dans des compositions avec les peptides de picornavirus et les constructions de polypeptides chimériques. Par exemple, comme on l'a déjà indiqué, QS21 peut être formulé conjointement avec 3D-MPL. Les rapports de QS21 : 3D-MPL seront habituellement de l'ordre de 1 : 10 à 10 : 1 ; tels que de 1 : 5 à 5 : 1, et souvent, substantiellement, de 1:1. Habituellement, le rapport est de l'ordre de 2,5 : là 1:1 de 3D-MPL : QS21. Une autre formulation d'adjuvant combinée comprend le 3D-MPL et un sel d'aluminium tel que 1'hydroxyde d'aluminium. Lorsqu'elle est préparée de façon combinée, cette combinaison peut renforcer une réponse immunitaire de Thl spécifique d'un antigène.
Dans certains cas, la formulation d'adjuvant comprend un sel minéral tel qu'un sel de calcium ou d'aluminium (alun), par exemple, le phosphate de calcium, le phosphate d'aluminium ou 1'hydroxyde d'aluminium. En présence d'alun, par exemple en combinaison avec le 3D-MPL, la quantité est habituellement entre environ 100 Hg et 1 mg, par exemple, d'environ 100 μρ ou d'environ 200 μρ à environ 750 μς, par exemple environ 500 μς par dose.
Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant comprend une émulsion d'huile et d'eau, par exemple, une émulsion huile dans eau. Un exemple d'émulsion huile dans eau comprend une huile métabolisable telle que le squalène, un tocol tel que le tocophérol, par exemple, 1'alpha-tocophérol et un tensioactif tel que le trioléate de sorbitane (Span 85™) ou mono-oléate de polyoxyéthylène sorbitane (Tween 80™), dans un véhicule aqueux. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion huile dans eau ne contient pas d'immunostimulants(s) supplémentaires, (en particulier, elle ne contient pas de dérivé de lipide A non toxique tel que le 3D-MPL ou une saponine, telle que QS21). Le véhicule aqueux peut être, par exemple, une solution physiologique tamponnée au phosphate. De plus, l'émulsion huile dans eau peut contenir du span 85 et/ou de la lécithine et/ou de la tricapryline.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention est proposée une composition vaccinale comprenant un antigène ou une composition antigénique et une composition d'adjuvant comprenant une émulsion huile dans eau et éventuellement, un ou plusieurs autres immunostimulants, dans laquelle ladite émulsion huile dans eau comprend 0,5 à 10 mg d'huile métabolisable (de façon appropriée, le squalène), 0,5 à 11 mg de tocol (de façon appropriée, un tocophérol, tel que 1'alpha-tocophérol) et 0,4 à 4 mg d'agent émulsifiant.
Dans un mode de réalisation spécifique, la formulation d'adjuvant comprend le 3D-MPL préparé sous la forme d'une émulsion, telle qu'une émulsion huile dans eau. Dans certains cas, l'émulsion a une petite taille de particules de moins de 0,2 μιη de diamètre comme le décrit le document WO 94/21292. Par exemple, les particules de 3D-MPL peuvent être suffisamment petites pour être filtrées de façon stérile dans une membrane de 0,22 microns (comme le décrit le brevet européen n° 0 689 454) . En variante, le 3D-MPL peut être préparé dans une formulation liposomale. Eventuellement, l'adjuvant contenant le 3D-MPL (ou un dérivé de celui-ci) comprend également un composant immunostimulant supplémentaire.
Il convient de noter que quel que soit l'adjuvant choisi, la concentration dans la formulation finale est calculée de façon à être inoffensive et efficace dans la population cible. Par exemple, des compositions immunogènes peuvent être destinées à induire une réponse immunitaire contre un picornavirus tel que HRV chez des nourrissons humains (par exemple, des nourrissons entre la naissance et 1 an, par exemple entre 0 et 6 mois, à l'âge de l'administration initiale). Dans un autre exemple, les compositions immunogènes peuvent être destinées à induire une réponse immunitaire contre un picornavirus tel que HRV chez des êtres humains âgés. La composition immunogène peut également être destinée à l'administration à des adultes ou des enfants. On comprendra que le choix d'un adjuvant peut être différent dans ces applications différentes et l'adjuvant et la concentration optimaux pour chaque situation peuvent être déterminés de façon empirique par l'homme du métier.
Des constructions de polypeptides chimériques sous la forme de particules pour leur utilisation comme on le décrit dans ce document peuvent être adsorbées sur des adjuvants contenant de l'aluminium. Dans le cas de plusieurs constructions de polypeptides chimériques différentes, par exemple, une particule telle que VLP, l'adjuvant peut être ajouté aux différentes constructions ou particules ou VLP pour les pré-adsorber avant mélange des différentes constructions ou des particules ou VLP pour former la composition immunogène finale.
La composition immunogène peut également comprendre de l'aluminium ou un composé d'aluminium tel qu'un stabilisant et la présente description concerne également une composition stabilisée dans laquelle les constructions de polypeptide chimériques telles que les VLP sont adsorbées sur un sel d'aluminium. De façon appropriée, les VLP sont plus stables dans le temps après adsorption sur un sel d'aluminium qu'en l'absence d'aluminium.
Les compositions immunogènes décrites ici peuvent être administrées sous forme de vaccins par l'une des diverses voies telles que la voie orale, topique, sous-cutanée, muqueuse, intraveineuse, intramusculaire, intranasale, sublinguale, intradermique et par suppositoire. Les distributions par voie intramusculaire, sublinguale et intradermique sont préférées.
Le dosage des peptides ou constructions de polypeptide chimériques tels que les VLP peut varier en fonction de l'état de santé, du sexe, de l'âge et du poids de l'individu et de la voie d'administration du vaccin. La quantité peut également varier en fonction du nombre de peptides ou de constructions chimériques différents.
Une composition immunogène contient habituellement une quantité immunoprotectrice (ou une dose fractionnée de celle-ci) de l'antigène et peut être préparée par des techniques classiques. Une préparation de compositions immunogènes, comprenant celles destinées à l'administration à des sujets humains, est généralement décrite dans Pharmaceutical Biotechnology, vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, édité par Powell and Newman, Plénum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, édité par Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. L'encapsulation dans des liposomes est décrite par exemple, par Fullerton, brevet U. S. 4 235 877. La conjugaison de protéines à des macromolécules est décrite, par exemple, par Likhite, brevet U. S. 4 372 945 et par Armoret al., brevet U.S. 4 474 757.
Habituellement, la quantité de protéine dans chaque dose de composition immunogène est choisie comme une quantité qui induit une réponse immunoprotectrice sans entraîner d'effets secondaires indésirables significatifs chez le sujet humain. Le terme « immunoprotectrice » dans ce contexte ne signifie pas nécessairement « protectrice de façon complète » contre une infection ; il signifie une protection contre des symptômes ou maladies, en particulier, des maladies graves associées au virus. La quantité d'antigène peut varier en fonction de l'immunogène spécifique qui est utilisé. Généralement, on s'attend à ce que chaque dose humaine comprenne 1 à 1000 μg de protéine. De façon appropriée, chaque dose de vaccin comprend 1 à 100 μς de chaque conjugué de peptide ou construction de polypeptides chimérique, de façon appropriée au moins 5 μρ, ou au moins 10 pg, par exemple, entre 5 et 50 μρ de chaque conjugué de peptide ou de construction de polypeptide chimérique, de manière la plus appropriée 10 à 50 μρ de chacun, par exemple, 10 μρ, 15 μρ, 20 μρ, 40 pg ou 50 pg. Par exemple, une dose de vaccin peut contenir 10 ou 15 ou 20 ou 30 ou 40 pg de chaque conjugué de peptides ou construction de polypeptides chimériques. La quantité utilisée dans une composition immunogène est choisie sur la base de la population visée (par exemple, nourrissons ou personnes âgées). Une quantité optimale pour une composition particulière peut être assurée par des études standard comprenant l'observation des titres en anticorps et d'autres réponses chez les sujets. Après une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir un rappel environ 4 semaines plus tard.
Les compositions immunogènes décrites dans ce document génèrent de façon appropriée, une réponse immunitaire chez un sujet humain ou animal contre au moins 2 picornavirus différents ou deux sérotypes différents d'un picornavirus tel que deux sérotypes différents de HRV, de façon appropriée 2 ou plus, 3 ou plus, 4 ou plus, 5 ou plus, ou 10 sérotypes différents ou plus.
Les compositions de HRV décrites dans ce document confèrent de façon appropriée, une protection contre une infection et/ou une maladie d'au moins 2 sérotypes de HRV différents, de façon appropriée 2 ou plus, 3 ou plus, 4 ou plus, 5 ou plus ou 10 sérotypes différents ou plus.
En outre, les compositions décrites ici qui comprennent une protéine vectrice ou un polypeptide chimérique tel qu'une VLP, généreront également une réponse immunitaire contre la protéine vectrice ou la VLP elle-même. Il peut s'agir d'une réponse protectrice. Par conséquent, les compositions immunogènes peuvent conférer une protection contre une infection ou une maladie provoquée par le virus natif correspondant à la VLP de la composition immunogène. Par exemple, une particule chimérique de HBsAg ou de VLP contenant un ou plusieurs peptides d'un picornavirus tel que HRV peut protéger contre une infection ou une maladie provoquée par HBsAg ainsi que contre une infection à picornavirus. De même, une particule de protéine non structurale de rhinovirus chimérique ou une VLP contenant un ou plusieurs peptides d'un picornavirus tel que HRV peut conférer une autre réponse immunitaire bénéfique contre la protéine non structurale de picornavirus.
Eventuellement, la composition immunogène de HRV ou le vaccin peut également être formulé (e) ou coadministré (e) avec d'autres antigènes tels que des antigènes d'autres virus respiratoires tels que le virus de la grippe ou RSV, ou d'autres causes de BPCO telles que Haemophilus influenzae non typable, Moraxella catharralis et Streptococcus pneumoniae.
Pour tous les vaccins décrits ici, le vaccin est utilisé de façon appropriée pour la vaccination chez tout groupe d'âges, en particulier pour la vaccination des populations d'enfants et de personnes âgées.
De façon appropriée, le vaccin est distribué selon un calendrier de 2 ou 3 doses, par exemple selon un calendrier de 0, 1 ou de 0, 2 ou de 0, 3 ou de 0, 4 ou de 0, 5 ou de 0, 6 ou de 0, 12 mois ou un calendrier de 0, 1, 6 ou 0, 2, 6 ou 0, 6, 12 mois, respectivement.
De façon appropriée, le vaccin est une formulation vaccinale liquide, bien que le vaccin puisse être lyophilisé ou reconstitué avant administration.
Exemples
Exemple 1
Immunogénicité des peptides et protéines de pleine longueur associés au Rhinovirus humain
Obj ectifs
Dans cette expérience, on a évalué les points suivants : (1) l'immunogénicité des peptides associés à VP1/VP4 conjugués à KLH ou des protéines de pleine longueur et (2) la performance des constructions de polypeptides chimérique de peptides de HRV/antigène de surface de l'hépatite B.
On a choisi les peptides sur la base des prévisions bioinformatiques et on les a comparées à des données publiées montrant la capacité de divers peptides à induire des anticorps de neutralisation (croisée) (McCray & Werner, 1987, 1989 ; Katpally et al., 2009 ; Miao et al., 2009 ; Edlmayr et al., 2011). Parallèlement aux peptides, on a produit et purifié des concatémères de protéines de pleine longueur de clade B VP4 . Ces concatémères ont été conçus sur la base d'une analyse de séquence d'acides aminés de façon à couvrir le panel entier des séquences existantes dans le cadre B.
La réactivité spécifique et la réactivité croisée de sérums de lapins ont été mesurées à l'aide d'un essai ELISA à base de peptide et des essais de neutralisation croisée.
Matériels et méthodes
Schéma de l'étude L'immunogénicité de peptides apparentés à HRV et de protéines de pleine longueur a été étudiée dans quatre expériences conçues de façon similaire.
Des groupes de lapins de NZW (N = 2-3/groupe) ont été immunisés par voie intramusculaire, (dans le muscle tibial) les jours 0, 14, 42 et 70, avec 20 à 100 pg d'antigène formulé avec un adjuvant eau dans huile (Specol, Leonards et al, 1994). Un prélèvement sanguin a été réalisé 14 jours après les 2ème, 3ème et 4ème injections. Sauf indication contraire, la réponse humorale a été mesurée 14 jours après la 4ème injection par ELISA et des essais de neutralisation.
Le tableau 2 ci-dessous montre les peptides qui ont été injectés et également, les deux constructions de concatémères 5x VP4 de pleine longueur que l'on a utilisées. Des constructions de polypeptide chimérique de HBsAg avec des peptides de rhinovirus VP4 ont été préparées comme on le décrit à l'exemple 2.
Tableau 2
Peptides
Des peptides de HRV ont été produits par
Polypeptide Laboratories. Les peptides ont été conjugués à KLH en utilisant du N-hydroxysuccinimide-ester d'acide m-maléimidobenzoïque (MBS) après addition de cystéine à la région N-terminale et amidation de la région C-terminale.
Clonage, expression et purification de protéines VP4 de clade A (Rhi002), de clade B (Rhi004), de clade C (Rhi006) et de sérotype 5x HRV14 de clade B (Rhi008)
Plasmide d'expression et souche recombinante
Des gènes codant pour des protéines de pleine longueur de polyprotéines VP4 (Rhi002/Rhi004/Rhi006/ Rhi008) et un marqueur His ont été clonés dans le vecteur d'expression pET24b(+) (Novagen) en utilisant les sites de restriction Ndel/Xhol selon des procédures standard. Des constructions finales ont été générées par la transformation de souche d'E. coli C43 (DE3) (Rhi004/Rhi006/Rhi008) ou Rosetta2 (DE3) (Rhi002) avec le vecteur d'expression recombinant selon un procédé standard avec des cellules traitées par CaCl2 (Hanahan D. Plasmid transformation by Simanis, chez Glover, D. M. (éd.), DNA cloning. IRL Press London. (1985) : p. 109-135.).
Souches hôtes : C43(DE3) est un dérivé de la souche C41 qui est un dérivé de BL21. Les souches ayant la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage À qui contient une ARN polymérase T7 inductible par IPTG. Les lysogènes À DE3 sont conçus pour l'expression de la protéine à partir de vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT. Les souches C43 contiennent des mutations génétiques choisies du point de vue du phénotype, de façon à conférer une tolérance aux protéines toxiques. Cette souche a au moins une mutation qui empêche la mort cellulaire associée à l'expression de nombreuses protéines toxiques recombinantes et est sélectionnée pour sa résistance à une protéine toxique différente et peut exprimer un groupe différent de protéines toxiques. Génotype : E. coli souche C43::DE3, F~ompThsdSB ( rB_ me") gal dem (DE3) #
Rosetta2 (DE3) est un dérivé de BL21 conçu pour renforcer l'expression de protéines eucaryotes qui contiennent des codons rarement utilisés dans E. coli. Ces souches fournissent les ARNt pour 7 codons rares (AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC et CGG) . Les souches ayant la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage À qui contient une ARN polymérase T7 inductible par IPTG. Les lysogènes À DE3 sont conçus pour l'expression de la protéine à partir des vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT. Génotype : E. coli, souche Rosetta2: :DE3, F-ompThsdSB (rB“mB_) gal dem (DE3) pRARE2 (CamR) .
Expression des protéines recombinantes :
Des transformants d'E. coli sont prélevés de plaques de gélose et utilisés pour inoculer 200 ml de bouillon LBT ± 1 % (p/v) glucose + kanamycine (50 pg/ml) pour obtenir une O.D.6oonm entre 0,1 et 0,2. Les cultures sont incubées pendant la nuit à 37° C, à 250 t/m.
Ces cultures réalisées pendant la nuit ont été diluées à raison de 1 : 20 dans 500 ml de milieu LBT contenant de la kanamycine (50 pg/ml) et cultivées a 37° C à une vitesse d'agitation de 250 t/m jusqu'à atteindre une valeur O.D.620 de 0,5/0,6. A une O.D.600 » autour de 0,6, les cultures ont été induites pour déterminer l'expression des protéines recombinantes par l'addition de 1 mM d'isopropyle ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ; EMD Chemicals Inc., numéro de catalogue : 5815) et incubées pendant la nuit à 37° C, 250 t/m pour la souche C43 (DE3) (Rhi004/Rhi006/Rhi008 ) ou pendant 3 h à 37° C, 250 t/m pour la souche Rosetta2(DE3) (Rhi002).
Après l'induction pendant la nuit (environ 16 heures) ou 3 h, la valeur O.D.ôoonm a été évaluée et les cultures ont été centrifugées à 14 000 t/m pendant 15 minutes et les agglomérats ont été congelés séparément à -20° C.
Purification de Rhi002 : L'agglomérat bactérien a été mis en suspension dans du PBS (pH 7,4) . Les bactéries ont été lysées à l'aide d'un système French Press 3 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (agglomérat) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4° C.
La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions dénaturantes sur IMAC. Les composants insolubles ont été solubilisés dans un tampon de 50 mM de bicine, pH 8,0, contenant 6 M de guanidine, 500 mM de NaCl. Le composant solubilisé a été chargé sur une colonne de 5 ml GE Histrap (GE) pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour la solubilisation de l'agglomérat. Après la charge de la colonne, la colonne a été lavée avec 50 mM de tampon de bicine, pH 8,0, contenant 6 M d'urée et 500 mM de NaCl. L'élution a été réalisée en utilisant 50 mM de tampon de bicine, pH 8,0, contenant 6 M d'urée, 500 mM de NaCl et de 1'imidazole (250 mM).
Après analyse du gel, l'élution d'IMAC contenant le fragment Rhi002 a été dialysée contre un tampon de bicine (25 mM bicine, 4 M urée, 500 mM NaCl, 0,1 % acide pluronique - 5 mM EDTA, 1 % saccharose, pH 9,5) . La fraction dialysée a été chargée sur une colonne de chromatographie SEC pour une nouvelle étape de purification.
Après la chromatographie SEC, des fractions plus pures ont été sélectionnées et dialysées contre du PBS, pH 7,4 contenant 1 % d'empigène.
La concentration de protéine a été déterminée à l'aide d'un essai de protéine Lowry RC/DC de BioRad. Les protéines ont ainsi été regroupées, filtrées de façon stérile sur un filtre de 0,22 pm, stockées à -80° C.
Purification de Rhi004 : L'agglomérat bactérien a été remis en suspension dans 20 mM de tampon de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl-benzonase et un cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche). Les bactéries ont été lysées à l'aide d'un système French Press 2 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (agglomérat) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4° C.
La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions natives sur IMAC. Les composants solubles (surnageant) ont été chargés sur une colonne 5 ml GE Histrap (GE) pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour lyser les cellules, sans benzonase, et un cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche). Après la charge de la colonne, la colonne a été lavée avec un tampon de 20 mM de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl. L'élution a été réalisée en utilisant un tampon de 20 mM de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl et de 1'imidazole (gradient de 500 mM). Après analyse sur gel, des fractions plus pures ont été sélectionnées, concentrées et chargées sur une colonne de chromatographie SEC superdex 75 pour une nouvelle étape de purification.
Après la chromatographie SEC dans 20 mM de bicine, pH 8,3 contenant 150 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA, des fractions plus pures ont été sélectionnées pour une nouvelle étape de purification. Les fractions plus pures ont été regroupées et chargées sur une colonne de chromatographie SEC G25 dans 20 mM de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl.
Après l'analyse sur gel, des fractions plus pures ont été sélectionnées et chargées sur une colonne de 5 ml GE Histrap (GE) pré-équilibrée avec 20 mM de tampon de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl. Après chargement de la colonne, la colonne a été lavée avec un tampon de 20 mM de bicine, pH 8,3 contenant 500 mM de NaCl. L'élution a été réalisée en utilisant un tampon de 20 mM de bicine, pH 8,3, contenant 500 mM de NaCl et de 1' imidazole (gradient 500 mM) . Après analyse sur gel, des fractions plus pures ont été sélectionnées, regroupées et dialysées a nouveau contre 20 mM de tampon de bicine contenant 150 mM de NaCl et 5 mM d'EDTA.
La concentration de protéine a été déterminée à partir d'un essai de protéine Lowry DC de BioRad. Les protéines ont ainsi été regroupées, filtrées de façon stérile sur un filtre de 0,22 pm, stockées à -80° C.
Purification of Rhi006 : L'agglomérat bactérien a été mis en suspension dans du PBS (pH 7,4) . Les bactéries ont été lysées à l'aide d'un système French Press 1 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (agglomérat) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4° C.
La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions dénaturantes sur IMAC. Les composants insolubles ont été solubilisés dans un tampon de 50 mM de bicine, pH 8,0, contenant 6 M de guanidine, 500 mM de NaCl, un cocktail complet d'inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche). Le composant solubilisé a été chargé sur une colonne de 5 ml GE Histrap (GE) pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour la solubilisation de l'agglomérat. Après la charge de la colonne, la colonne a été lavée avec 50 mM de tampon de bicine, pH 8,0, contenant 6 M d'urée et 500 mM de NaCl. L'élution a été réalisée en utilisant 50 mM de tampon de bicine, pH 8,0, contenant 6 M d'urée, 500 mM de NaCl et de 1'imidazole (250 mM).
Après analyse du gel, l'élution d'IMAC contenant le fragment Rhi06 a été dialysée contre du PBS, pH 8 contenant 4 M d'urée. La fraction dialysée a été chargée sur une colonne de chromatographie SEC pour une nouvelle étape de purification. Après la chromatographie SEC, des fractions plus pures ont été sélectionnées et dialysées contre du PBS, pH 8 contenant 1 M d'urée et 5 mM d'EDTA.
La concentration de protéine a été déterminée à l'aide d'un essai de protéine Lowry RC/DC de BioRad. Les protéines ont ainsi été regroupées, filtrées de façon stérile sur un filtre de 0,22 pm, stockées à -80° C.
Purification de Rhi008 : L'agglomérat bactérien a été remis en suspension dans du PBS (pH 7,4) contenant un cocktail complet d'inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche). Les bactéries ont été lysées à l'aide d'un système French Press 2 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (agglomérat) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4° C.
La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions dénaturantes sur IMAC. Les composants insolubles ont été solubilisés dans un tampon de 50 mM de bicine, pH 8,3, contenant 8 M d'urée, 500 mM de NaCl, un cocktail complet d'inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche). Le composant solubilisé a été chargé sur une colonne de 10 ml de résine NiNTA pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour la solubilisation de l'agglomérat. Après la charge de la colonne, la colonne a été lavée avec 50 mM de tampon de bicine, pH 8,3, contenant 8 M d'urée et 500 mM de NaCl. L'élution a été réalisée en utilisant 50 mM de tampon de bicine, pH 8,0, contenant 6 M d'urée, 500 mM de NaCl et de 1'imidazole (500 mM).
Après analyse du gel, l'élution d'IMAC contenant le fragment Rhi08 a été dialysée par étape contre un tampon de bicine de 25 mM, pH 8,3 contenant 4 M d'urée et 250 mM de NaCl, puis dans une deuxième étape de dialyse, contre du PBS, pH 7,4.
La concentration de protéine a été déterminée à l'aide d'un essai de protéine Lowry RC/DC de BioRad. Les protéines ont ainsi été regroupées, filtrées de façon stérile sur un filtre de 0,22 pm, stockées à -80° C.
Des constructions de polypeptides chimériques HRV-HBsAq sont décrites à l'exemple 2.
Essai ELISA pour la détection d'anticorps contre des protéines ou peptides
La quantification d'anticorps contre des peptides ou protéines associés à anti-VPl/VP4 a été réalisée par un essai ELISA en utilisant des peptides ou concatémères spécifiques de protéines de pleine longueur comme antigène de revêtement. Les antigènes ont été dilués à une concentration finale de 2 pg/ml dans du PBS et ont été adsorbés pendant la nuit à 4° C dans les puits de plaques de microtitrage à 96 puits (Maxisorplmmuno-plate, Nunc, Danemark). Les plaques ont ensuite été incubées pendant 1 h à 37° C avec du PBS + 0,1 % Tween 20 + 1 % BSA (tampon de saturation) . Les sérums dilués dans le tampon de saturation ont été ajoutés aux plaques et incubés pendant 1 h à 30 min à 37° C. Les plaques ont été lavées quatre fois avec du PBS à 0,1 % de Tween 20 et une Ig anti-lapin conjuguée a la biotine (Amersham Biosciences, RU) diluée dans un tampon de saturation a été ajoutée dans chaque puits et on a incubé pendant 1 h à 37° C. Après que les plaques ont été lavées quatre fois avec du PBS à 0,1 % de Tween 20, on a ajouté de la streptavidine-peroxydase de raifort (Roche), diluée dans un tampon de saturation, pendant encore 30 min à 37° C. Les plaques ont été lavées 4 fois avec du PBS à 0,1 % de Tween 20 à nouveau, et incubées pendant 20 min à température ambiante avec une solution de 0,04 % d'o-phénylènediamine (Sigma) à 0,03 % de H2O2 dans 0,1 % de Tween 20, 0,05 M de tampon de citrate, pH 4,5. La réaction a été stoppée avec du 2NH2SO4 et le résultat a été lu à 492/620 nm. Les titres ELISA ont été calculés à partir d'une référence par SoftMaxPro (avec une équation à quatre paramètres) et exprimés en UE/ml.
Production de Rhinovirus
Des souches de HRV2, 8, 10, 14, 39 et 61 ont été achetées auprès de l'ATCC et amplifiées sur des cellules Hela-Hl cultivées dans un milieu d'infection (MEM contenant 2 % de FCS, 30 mM de MgC12 et 1 mM de glutamine) . A cette fin, on a ensemencé 5 millions de cellules Hela-Hl dans des plaques de 75 cm2 et on les a cultivées pendant la nuit à 34° C. Les plaques ont ensuite été infectées à une multiplicité d'infection de 15 et ensuite, incubées jusqu'à lyse complète de monocouches de cellules (24 h à 48 h en fonction de la souche) . Les surnageants ont été recueillis et les débris éliminés par centrifugation (1 000 g-10 min). Les surnageants purifiés ont été aliquotés, stockés a -80° C et tiré sur Hela-Hl.
Titrage de la production de rhinovirus
Des cellules Hela-Hl ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits (5 000 cellules/puits) et cultivées pendant la nuit à 34° C avec 5 % de CO2. Les plaques ont ensuite été infectées avec des dilutions sérielles doubles (dilution de départ = 1/1000) de suspensions de rhinovirus testées en 8 exemplaires. Trois à cinq jours après l'infection, la présence d'effets cytopathiques médiés par HRV a été révélée en mesurant la viabilité des cellules. A cette fin, les cellules ont été incubées avec le réactif WST-1 selon les instructions du fabricant (Promega). Une valeur seuil a ensuite été définie pour chaque plaque en tant que moyenne -3 écarts types des densités optiques (O.D.) des puits contenant des cellules non infectées. Les puits présentant une O.D. inférieure à cette valeur seuil ont été qualifiés de positifs à CPE. La concentration virale a été calculée selon la formule de Reed et Muench.
Essai de neutralisation
Des cellules Hela-Hl ont été étalées sur des plaques de 96 puits (5 000 cellules/puits) et incubées pendant la nuit à 37° C avec 5 % de CO2. Les sérums ont été inactivés à 56° C pendant 30 min. On a placé 100 TCID50 de HRV (du sérotype pertinent, en fonction de 1'essai de neutralisation ou de neutralisation croisée) en présence de dilutions sérielles (dilutions doubles à partir de la dilution = 1/2) de sérum de lapin à 37° C pendant 2 h. Le mélange a ensuite été placé sur des monocouches de cellules et on a encore incubé les plaques à 37° C pendant 3 à 5 jours jusqu'à ce que la lyse complète de monocouches de cellules témoins soit réalisée. La viabilité des cellules a ensuite été mesurée en utilisant un réactif WST-1 selon les instructions du fabricant (Promega). Les O.D. ont ensuite été converties en pourcentage d'effet cytopathique et réciproque de la dilution donnant une réduction de 50 % de l'effet cytopathique (CPE) par rapport aux cellules témoins. Le CPE a ensuite été extrapolé selon une régression non linéaire avec le logiciel GraphpadPrism. Résultats
Immunogénicité des peptides - réponse spécifique des peptides
La réponse spécifique des peptides chez les lapins qui ont reçu KLH ou des peptides conjugués à HB-S a été mesurée 14 jours après la 4ème immunisation en utilisant l'essai ELISA à base de peptides décrit dans ce document.
Les résultats étaient les suivants et sont présentés sur les figures 2 et 3. Aucune réponse n'a été détectée dans le groupe témoin NaCl.
Conjugués VP1 - KLH (figure 2)
Des taux élevés d'anticorps spécifiques de VP1 ont été détectés chez les lapins qui ont reçu - HRV14 VP1 147-162, - HRV14 VP1 1-30 and - HRV14 VP1 32-45
Des taux faibles d'anticorps ont été induits par - les peptides HRV8, HRV25 ou HRV_C_026VP1 32-45, bien que l'augmentation de la dose d'antigène ait affecté positivement les titres d'anticorps.
Conjugués VP4 - KLH (figure 3)
Globalement, les peptides associés à VP4 ont induit des taux plus faibles d'anticorps que les peptides VP1. Toutefois, des titres élevés d'anticorps spécifiques du peptide VP4 ont été mesurés chez les lapins qui ont reçu - HRV14 VP4 39-68 ou - HRV14, HRVIOO et HRVC VP4 1-16.
Contrairement à l'article publié par Katpally et coll. (2009), HRV14 VP4 1-31 était faiblement immunogène. Toutefois, ceci peut s'expliquer par l'agrégation et la faible solubilité de ce peptide observée après la conjugaison à KLH.
Constructions chimériques de VP4 - HbsAg (figure 3) L'insertion de HRV14 VP4 1-31 dans la boucle A mais non dans la terminaison N de HBsAg induit des taux élevés d'anticorps spécifiques du peptide chez 2 lapins sur 3. Les résultats sont présentés sur la figure 3.
Immunogénicité des protéines de pleine longueur -réponse spécifique des protéines L'immunogénicité des protéines de pleine longueur sous la forme de concatémères a été mesurée 14 jours après la 4ème immunisation par ELISA. Les résultats sont présentés sur la figure 4. - Aucune réponse n' a été détectée dans le groupe
NaCl - Des taux élevés d'anticorps dirigés contre VP4 ont été détectés chez les lapins qui ont reçu les concatémères de clade B ou les protéines HRV14 VP4.
Comparaison des titres d'anticorps neutralisants induits par les peptides et les protéines de pleine longueur
Les taux d'anticorps neutralisants induits par les peptides et protéines associés à VP1/VP4 ont été mesurés 14 jours après la 4ème vaccination en utilisant un panel de souche de HRV (c'est-à-dire HRV2, 8, 10, 14, 39 et 61). Les résultats sont présentés sur la figure 5 et la figure 6. - Aucun anticorps neutralisation n'a été détecté dans le groupe NaCl témoin - Des anticorps spécifiques et/ou de neutralisation croisée ont été détectés dans tous les groupes qui ont reçu les peptides associés à VP1. De façon importante, le peptide HRV14 VP1 32-45 a induit la réactivité croisée la plus large car ce peptide particulier a pu neutraliser toutes les souches testées. - Des taux significatifs d'anticorps neutralisants spécifiques et de neutralisation croisée ont été détectés chez les lapins immunisés par les peptides . HRV14 VP4 39-68, VP4 1-16 et HRV100 VP4 1-16 alors qu'une réponse contradictoire a été observée dans d'autres groupes vaccinés avec des peptides conjugués à KLH ou des protéines de pleine longueur. Notamment, le peptide HRV100 VP4 1-16 a induit la réactivité croisée la plus large car ce peptide particulier a été capable de neutraliser l'ensemble des 6 souches testées. Par conséquent, dans VP4 1-16, un peptide plus court que VP4 1-31 a été identifié, qui est plus conservé et peut introduire une activité de neutralisation croisée plus large.
Les protéines VP4 complètes induisent des taux faibles d'anticorps spécifiques des régions 1 à 16
Les données recueillies dans des essais de neutralisation ont suggéré qu'un épitope neutralisant se situe dans les régions VP4 1-16 et qu'une immunisation avec des séquences de peptides plus . longues (1 à 31) ou de protéine VP4 de pleine longueur pouvait donner la mauvaise réponse immunitaire contre des épitopes non neutralisants. Un mécanisme similaire, contribuant à l'évasion immunitaire de HRV, a été décrit pour la protéine VP1 (Niespodziana et al 2012).
En effet, la majeure partie des anticorps était dirigée contre la région 1 à 30 de VPl après immunisation avec la protéine VPl de pleine longueur et cette région est bien connue pour induire des anticorps à faible neutralisation (croisée) (Niespodziana et al 2012) (et comme on l'a observé dans ces expériences) . On a donc vérifié si la protéine de pleine longueur a induit des anticorps dirigés contre la région VP4 1-16. Des sérums de lapin ont été testés pour déterminer la présence d'anticorps spécifiques de VP4 1-16 par ELISA et les titres relatifs (par rapport au groupe vacciné par HRV14 VP4 1-16) ont été calculés. Des taux très faibles d'anticorps VP4 1-16 ont été détectés chez les lapins qui ont reçu VP4 1-31 dans la boucle HBsAg ou la protéine de pleine longueur VP4. Les résultats sont présentés sur la figure 7. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'immunisation avec la protéine VP4 de pleine longueur (ou VPl) a entraîné la mauvaise réponse immunitaire contre les épitopes non neutralisants.
Tableau 3
Titres des anticorps du peptide anti-HRV14 VP4 1-16 induits par le peptide HRV14 VP4 1-16, le peptide HRV14 VP4 1-31 et la protéine VP4 de pleine longueur. HRV14 VP4 1-16 17561,5 HRV14 VP4 1-31 dans HBS (une 2163 boucle) 5x HRV14 complète 427
NaCl <25
Protéines VP4 de pleine longueur
Lapins : l'immunogénicité des protéines de pleine longueur VP4 de clades Ä et C et protéine HRV14 VP1
Dans une autre expérience, on a réalisé des essais ELISA et essais de neutralisation 14 jours post-IV. Comme le monte le tableau 4 ci-dessous, des taux élevés d'IgG anti-VP4 de réaction croisée ont été induits par des concatémères de protéines VP4 et dans une moindre mesure, par la construction chimérique VP4-HBs. Toutefois, même s'i l'on a observé une certaine neutralisation de la souche HRV14, aucune de ces constructions n'a pu induire des anticorps qui neutralisent HRV39. Ces données confirment les résultats précédents suggérant que les protéines HRV VP4 de pleine longueur induisent des taux élevés d'anticorps non neutralisants. De même, la protéine HRV14 VP1 était hautement immunogène mais n'a pas induit d'anticorps fonctionnels.
Tableau 4
Conclusions
Cette étude démontre que HRV14 VPl 32-45 et HRV100 VP4 1-16 sont immunogènes et induisent des anticorps à large réaction croisée. En revanche, les protéines VP4 de pleine longueur ont induit des taux élevés d'anticorps qui ne se sont pas avérés fonctionnels. Les données suggèrent que l'immunisation avec les protéines VP4 de pleine longueur entraîne une mauvaise réponse immunitaire contre des épitopes non neutralisants. Ceci a été confirmé par le fait que les protéines VP4 de pleine longueur n'induisent pas d'anticorps dirigés contre la région VP4 1-16. Ce mécanisme a également été démontré pour la protéine HRV14 VPl et confirme encore la nécessité que la vaccination avec un peptide dirige la réponse immunitaire contre des anticorps de neutralisation croisée bien conservés.
Exemple 2. Construction de particules mixtes de VP4-S,S exprimant la souche Pichiapastoris
Introduction
On a produit une construction codant pour le peptide VP4i-3i (sérotype HRV14) fusionnée génétiquement à la terminaison N de l'antigène S du virus de l'hépatite B (HBsAg). Cette protéine de fusion (VP4-S) a été co-exprimée dans la levure Pichiapastoris, avec un fragment de HBsAg de type sauvage 230aa (S) . La souche obtenue synthétise deux polypeptides, S et la protéine de fusion VP4-S qui se co-assemblent spontanément en particules de lipoprotéine mixte (VP4-S,S) .
La souche Pichiapastoris utilisée pour la production de ces particules mixtes porte des cassettes d'expression séparées pour chaque protéine. Ces cassettes étaient intégrées de façon stable dans le génome de Pichia en utilisant des vecteurs d'intégration linéaires.
Construction du plasmide recombinant peptide VP4-pMK
Un fragment d'ADN synthétique codant pour le peptide VP4 (31aa) a été généré par Geneart. Le fragment a été cloné dans le vecteur pMK en utilisant les sites de clonage Pad et Ascl (plasmide propriété de Geneart). La séquence nucléotidique (optimisée par codon pour l'expression dans Pichia) et la séquence d'acides aminés correspondante sont illustrées sur la figure 16-A. La carte du plasmide peptide VP4-pMK est illustrée sur la figure 16-B.
Construction du vecteur d'intégration PHIL-D2mod/VP4-S Le fragment d'ADN synthétique de VP4 a été amplifié par PCR en utilisant le plasmide peptide de VP4-pMK comme matrice et la paire d'amorces suivante : VP4-Fw : CTCACTATAGGGCGAATTGAAGGAAGG VP4-Rv : TTTGAATAGTATCCCGGGGTAGTTGATAAC Le produit de PCR a été clivé avec Ncoland Smal, purifié sur gel et cloné dans le vecteur PHIL-D2mod qui portait déjà le gène S du virus de l'hépatite B (vecteur de fusion PHIL-D2mod/S). Le plasmide recombinant obtenu porte le gène de fusion VP4-S et a été nommé vecteur PHIL-D2mod/VP4-S. Le gène de fusion VP4-S et la séquence d'acides aminés correspondante sont détaillés sur la figure 17.
La carte du vecteur PHIL-D2mod/VP4-S est illustrée sur la figure 20. Dans ce vecteur d'expression, le gène recombinant est sous le contrôle du puissant promoteur AOX1 étroitement régulé, inductible par le méthanol.
Le vecteur du squelette PHIL-D2-mod est un dérivé du vecteur PHIL-D2 disponible dans le commerce (Invitrogen). Le vecteur PHIL-D2 du commerce a été modifié de façon à ce que l'expression d'une protéine hétérologue commence au codon de départ natif ATG du gène A0X1 de Pichia et il produira potentiellement une protéine recombinante avec un marqueur histidine exterminai. Le vecteur PHIL-D2-mod est illustré sur la figure 19.
Construction du vecteur d'intégration PHIL-D2mod/ S
Le vecteur PHIL-D2mod/ S a été conçu pour permettre la production de l'antigène S seul (sans partenaire de fusion).
Un fragment d'ADN synthétique codant pour l'antigène S (227aa) a été généré par Geneart. Le gène synthétique était optimisé par un codon pour l'expression dans Pichiapastoris (nommé gène Sco) . Ce fragment d'ADN synthétique a été cloné dans le vecteur PHIL-D2mod entre les sites Ncol et EcoRI. Le plasmide recombinant contenant le gène Sco a été nommé PHIL-D2mod/S. La carte du vecteur PHIL-D2mod/S est illustrée sur la figure 21. Dans ce vecteur d'expression, le gène recombinant est sous le contrôle du puissant promoteur A0X1 étroitement régulé, inductible par méthanol.
Génération de la souche de P.pastoris co-exprimant les protéines VP4-S et S
Les vecteurs d'expression PHIL-D2mod/VP4-S et PHIL-D2mod/S ont été utilisés pour transformer la souche Pichiapastoris GS115 (his4). Avant la transformation, les vecteurs ont été digérés avec l'enzyme Notl afin de libérer un fragment d'ADN contenant la cassette d'expression (VP4-S ou S) plus le gène HIS4 (pour compléter his4 dans le génome de 1'hôte) .
Comme les deux extrémités du fragment d'intégration d'ADN Notl sont homologues à la région A0X1 du génome de Pichia, il peut s'intégrer dans le locus A0X1 par recombinaison homologue. Au total, 100 transformants His+ ont été obtenus et des clones d'intégration « multicopie » ont été sélectionnés par analyse d'ADN dot blot semi-quantitative. Certains candidats à « nombre de copies élevé » ont été sélectionnés, induits par le méthanol et leur production de protéine recombinante a été analysée sur gel coloré au bleu de Coomassie et par Western blot. Enfin, le clone transforment n° 49 a été sélectionné pour une nouvelle analyse.
Evaluation de la formation de particules
Afin de déterminer si les protéines VP4-S et S produites dans le clone recombinant Pichia n°49 s'assemblent en structures particulaires, l'extrait soluble a été préparé (après induction au méthanol) et analysé par centrifugation à gradient de densité CsCl. L'extrait soluble (15 mg de protéine totale) a été chargé sur un gradient de 10 ml, 1,5 M, de CsCl (72 heures à 40000 t/m, +8° C dans un rotor Beckman 50 Ti). Des fractions (0,5 ml) ont été recueillies et passées sur un SDS-PAGE à 12 %, transférées sur membrane de nitrocellulose et analysées en utilisant un anticorps monoclonal anti-S (groupe A). Comme le montre la figure 22, les pics de Western blot correspondant à la protéine de fusion VP4-S et la protéine S apparaissent sur la même fraction du gradient correspondant à une masse volumique (rho) de rho = 1,20 suggérant que des particules mixtes contenant à la fois les monomères VP4-S et S sont formées dans cette souche.
La masse volumique (rho) de la fraction de pic a été calculée a partir d'une mesure de son indice de réfraction (groupe A).
Groupe B : deux fractions de pic ont été analysées par coloration à l'argent (à gauche) et au bleu de Coomassie (à droite).
Purification des particules mixtes VP4-S,S
Le procédé suivant a été utilisé pour les particules mixtes VP4-S,S à partir de la fraction soluble du clone recombinant n° 49 de Pichia.
Le procédé de purification comprend les étapes suivantes : - homogénéisation de la pâte cellulaire (French Press) - clarification par centrifugation
- 2 gradients successifs de de CsCl 1,5 M - 1 étape de filtration sur gel (HR300) - Concentration (Amicon) - Filtration stérile (0,22 pm) A titre d'exemple, la masse de BMP201 purifiée est illustrée sur la figure 23.
Analyse par ME
Une analyse par microscopie électronique a été réalisée sur la masse purifiée de BMP201. Les particules ont été visualisées après coloration négative avec de l'acide phosphotungstique. L'échelle est équivalente à 100 nm (figure 24) . De nombreuses particules (20 à 40 nm) ont pu clairement être identifiées.
Liste de références
Arnold E, Rossmann MG (1990) . Analysis of the structure of a common cold virus, human rhinovirus 14, refined at a resolution of 3.0 A. J Mol Biol. 211(4) : 763-801.
Bartlett NW et al (2008) Mouse models of rhinovirus-induced disease and exacerbation of allergic airway inflammation. Nat Med. Feb. 14(2) : 199-204. doi: 10.1038/nml713. Epub 2008 Feb 3.
Chen et al (2000). Mol. Cell 5, 557-567.
Cheng-Yu Chung et al (2010). Vaccine 28 (2010) 6951-6957.
Edlmayr et al (2011) . Antibodies induced with recombinantVPl from human rhinovirus exhibitcross-neutralisation. Eur. Respir. J. 37 : 44-52.
Katpally U, Fu TM, Freed DC, Casimiro DR, Smith TJ (2009). Antibodies to the buried N terminus of rhinovirus VP4 exhibit cross-serotypic neutralization.J Virol. 83(14) : 7040-8.
Leenaars PP, Hendriksei CF, Angulo AF, Koedam MA, Claassen E. (1994) Evaluation of several adjuvants as alternatives to the use of Freund's adjuvant in rabbits. Vet ImmunolImmunopathol. Mar. 40(3) : 225-41.
Lewis JK, Bothner B, Smith TJ, Siuzdak G (1998) . Antiviral agent blocks breathing of the common cold virus. Proc Natl Acad Sei USA. 95(12) : 6774-8.
Lewis-Rogers N, Bendall ML, Crandall KA (2009). Phylogenetic Relationships and Molecular Adaptation Dynamics of Human Rhinoviruses. Mol Biol. Evol. 26(5) : 969-981.
Miao LY et al (2009). Monoclonal Antibodies to VP1 Recognize a Broad Range of Enteroviruses. J. Clin. Micorbiol. Vol 47, No 10, 3108-3113.
McCray J, Werner G (1987). Different rhinovirus serotypes neutralized by antipeptide antibodies. Nature. Oct 22-28 ; 329(6141) : 736-8.
Niespodziana K et al (2012). Misdirected antibody responses against an N-terminal epitope on human rhinovirus VP1 as explanation for recurrent RV infections. The FASEB Journal. Vol 26, 1001-1008.
Palmenberg AC, Rathe JA, Liggett SB (2010). Analysis of the complete genome sequences of human rhinovirus. J. Allergy Clin. Immunol. Vol 125, No 6, 1190-1199.
Phillips T, Jenkinson L, McCrae C, Thong B, Unitt J. (2011). Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J Virol Methods. May. 173(2) : 182-8.
Rollinger JM and Schmidtke M (2009). The Human Rhinovirus : Human-Pathological Impact, Mechanisms of Antirhinoviral Agents, and Strategies for Their Discovery. Medicinal Research Reviews, 31, n° 1, 42-92.

Claims (30)

  1. REVENDICATIONS
    1. Composition immunogène comprenant un premier et un deuxième peptide dérivés d'une protéine structurale d'un picornavirus, lesdits peptides étant capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs picornavirus ou sérotypes de picornavirus, et un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle lesdits peptides de picornavirus proviennent de la région N-terminale des protéines structurales de picornavirus.
  2. 2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle les premier et deuxième peptides proviennent de différentes protéines de picornavirus.
  3. 3. Composition immunogène selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle les premier et deuxième peptides proviennent des protéines structurales VPl et VP4 de picornavirus.
  4. 4. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'un ou les deux des premier et deuxième peptides de picornavirus consistent en moins de 20 acides aminés de la protéine structurale de picornavirus.
  5. 5. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'un ou les deux des premier et deuxième peptides proviennent d'un entérovirus humain et les peptides d'entérovirus sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs entérovirus.
  6. 6. Composition immunogène selon la revendication 5, dans laquelle l'un ou les deux des premier et deuxième peptides proviennent d'un rhinovirus humain et les peptides de rhinovirus sont capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs rhinovirus.
  7. 7. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le premier peptide consiste en les acides aminés 32 à 45 de VP1 ou une variante des acides aminés 32 à 45 de VP1 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide.
  8. 8. Composition immunogène selon la revendication 7, dans laquelle le peptide est choisi parmi : HRV14 (B) : 32-PILTANETGATMPV-45 [SEQ ID N° : 1] HRV8 (A-M) : 32-PALDAAETGHTSSV-45 [SEQ ID N° : 2] HRV25(A-m) : 32-PILDAAETGHTSNV-45 [SEQ ID N0 : 3] HRV_C_026 : 32-QALGAVEIGATADV-45 [SEQ ID N° : 4] ou une variante de celles-ci ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide.
  9. 9. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le deuxième peptide consiste en les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou une variante des acides aminés 1 à 16 de VP4 ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre des extrémités et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés avec la séquence de peptide.
  10. 10. Composition immunogène selon la revendication 9, dans laquelle le peptide est choisi parmi : HRV14 (B) : 1-GAQVSTQKSGSHENQN-l6 [SEQ ID N° : 5] HRVIOO(A-M) : 1-GAQVSRQNVGTHSTQN-16 [SEQ ID N° : 6] . HRV_C_026 : 1-GAQVSRQSVGSHETMI-l6 [SEQ ID N° : 7] ou une variante de celles-ci ayant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés sur l'une ou l'autre des extrémités et/ou 1 à 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés dans la séquence de peptide.
  11. 11. Composition immunogène selon l'une quelconque des · revendications 1 à 10, dans laquelle les premier et deuxième peptides sont couplés à des protéines vectrices.
  12. 12. Composition immunogène selon la revendication 11, dans laquelle les premier et deuxième peptides sont couplés à CRM197.
  13. 13. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant au moins une construction de polypeptide chimérique comprenant les premier et deuxième peptides.
  14. 14. Composition immunogène selon la revendication 13, dans laquelle les premier et deuxième peptides sont dans des constructions chimériques distinctes.
  15. 15. Composition immunogène selon la revendication 13, dans laquelle les premier et deuxième peptides sont dans la même construction de polypeptides chimériques.
  16. 16. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans laquelle la construction de polypeptides chimériques est sous la forme d'une particule.
  17. 17. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans laquelle le polypeptide de squelette provient d'un papillomavirus humain (HPV), d'un rhinovirus, de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg), EV-71, du virus de la grippe, d'un norovirus.
  18. 18. Composition immunogène selon la revendication 16 ou 17, dans laquelle la particule est une particule de type viral (VLP).
  19. 19. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, comprenant en outre un adjuvant.
  20. 20. Composition immunogène selon la revendication 19, dans laquelle l'adjuvant comprend un sel d'aluminium.
  21. 21. Composition immunogène selon la revendication 20, dans laquelle l'adjuvant comprend 1'hydroxyde d'aluminium.
  22. 22. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, dans laquelle l'adjuvant comprend le lipide A monophosphoryle 3-O-désacylé (3D-MPL).
  23. 23. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans laquelle l'adjuvant comprend QS21.
  24. 24. Composition immunogène selon la revendication 22 ou 23, dans laquelle l'adjuvant comprend le 3D-MPL et le QS21 dans une formulation de liposome.
  25. 25. Utilisation d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, dans la prévention ou le traitement d'une infection à picornavirus telle qu'une infection à HRV.
  26. 26. Utilisation d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, dans la production d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une infection à picornavirus telle qu'une infection à HRV.
  27. 27. Procédé d'induction d'anticorps neutralisants contre un picornavirus tel que HRV chez des êtres humains, comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 24.
  28. 28. Procédé d'induction d'anticorps de neutralisation croisée contre un picornavirus tel que HRV chez des êtres humains, comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 24.
  29. 29. Procédé de prévention d'une infection à picornavirus ou une maladie à picornavirus associée à une infection à picornavirus telle qu'une infection à HRV ou une maladie à HRV associée à une infection à HRV, ledit procédé comprenant l'administration à un être humain d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 24.
  30. 30. Procédé de préparation d'une composition immunogène, ledit procédé comprenant la combinaison de (i) deux ou plusieurs peptides de picornavirus à partir de la région N-terminale des protéines structurales de picornavirus, lesdits peptides étant capables d'induire une réponse immunitaire de neutralisation croisée contre deux ou plusieurs picornavirus ou sérotypes de picornavirus et (ii) d'un diluant, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
BE2014/0161A 2013-03-15 2014-03-13 Vaccin BE1022174B1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361786765P 2013-03-15 2013-03-15
US61/786765 2013-03-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BE1022174B1 true BE1022174B1 (fr) 2016-02-24

Family

ID=50382421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BE2014/0161A BE1022174B1 (fr) 2013-03-15 2014-03-13 Vaccin

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10058603B2 (fr)
EP (2) EP3608332B1 (fr)
AR (1) AR095425A1 (fr)
BE (1) BE1022174B1 (fr)
ES (1) ES2924914T3 (fr)
TW (1) TW201502136A (fr)
UY (1) UY35418A (fr)
WO (1) WO2014140166A2 (fr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016134288A1 (fr) * 2015-02-19 2016-08-25 University Of Virginia Patent Foundation Compositions et procédés de prévention et de traitement d'infection à rhinovirus
RU2617043C1 (ru) * 2016-03-24 2017-04-19 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) Вакцина против ящура и способ её получения и применения
WO2018002902A1 (fr) 2016-07-01 2018-01-04 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Conjugués anticorps-médicament et procédés thérapeutiques utilisant ceux-ci
GB201616904D0 (en) * 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
WO2023114951A1 (fr) 2021-12-17 2023-06-22 Viiv Healthcare Company Polythérapies pour infections par vih et utilisations associées

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0358485A2 (fr) * 1988-09-08 1990-03-14 The Wellcome Foundation Limited Peptides du rhinovirus humain
WO1992003475A1 (fr) * 1990-08-16 1992-03-05 Replico Medical Aktiebolag Peptides anti-enterovirus
WO2006029887A2 (fr) * 2004-09-16 2006-03-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccins
WO2008057158A2 (fr) * 2006-09-29 2008-05-15 Sanofi Pasteur Biologics Co. Nouvel immunogène de neutralisation (nimiv) de rhinovirus et son utilisation pour des applications dans la vaccination

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4707543A (en) 1985-09-17 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
CA1331443C (fr) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Adjuvant a saponine
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5726292A (en) 1987-06-23 1998-03-10 Lowell; George H. Immuno-potentiating systems for preparation of immunogenic materials
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1993010152A1 (fr) 1991-11-16 1993-05-27 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Proteine hybride entre la proteine cs de plasmodium et l'antigene de surface du virus de l'hepatite b
DE69405551T3 (de) 1993-03-23 2005-10-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5961970A (en) 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
SI0729473T1 (en) 1993-11-17 2001-02-28 Om Pharma Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
WO1995026204A1 (fr) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Stimulation immunitaire par des analogues d'oligonucleotides de phosphorothioate
EP0772619B2 (fr) 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Oligonucleotides immunomodulateurs
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU7924598A (en) 1998-06-08 1999-12-30 Sca Emballage France Fast flattening packaging
DK1091928T3 (da) 1998-06-30 2007-07-23 Om Pharma Nye acylerede pseudodipeptider, fremgangsmåde til disses fremstilling og sammensætninger, som indeholder dem
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
AU2002245636B2 (en) 2001-03-09 2004-10-14 Id Biomedical Corporation Of Quebec A novel proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant
CN1250548C (zh) 2001-04-17 2006-04-12 大日本住友制药株式会社 新的腺嘌呤衍生物
DE60230340D1 (de) 2001-11-16 2009-01-22 3M Innovative Properties Co N-Ä4-(4-Amino-2-ethyl-1H-imidazoÄ4,5-cÜchinolin-1-yl)butylÜmethanesulfonamide, diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung und deren Verwendung
EP1592302A4 (fr) 2003-02-13 2007-04-25 3M Innovative Properties Co Procedes et compositions associes a des composes modificateurs de reponse immunitaire et recepteur 8 de type toll
WO2006078648A2 (fr) * 2005-01-19 2006-07-27 Donald Danforth Plant Science Center Vaccins contre les rhinovirus
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
WO2009127081A1 (fr) * 2008-04-17 2009-10-22 Biomerieux Rhinovirus humain nouvellement identifié de type rvh-c et procédés et coffrets pour la détection de rvh-c
GB0815872D0 (en) * 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
EP2316481A1 (fr) 2009-10-30 2011-05-04 Biomay Ag Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention d'une infection par rhinovirus
MX356426B (es) * 2011-04-04 2018-05-29 Univ Iowa Res Found Metodos para mejorar inmunogenicidad de vacuna.
KR101895768B1 (ko) * 2011-06-01 2018-09-07 시아먼 유니버시티 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질
WO2013019603A2 (fr) * 2011-07-29 2013-02-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cassettes d'expression linéaire et leurs utilisations

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0358485A2 (fr) * 1988-09-08 1990-03-14 The Wellcome Foundation Limited Peptides du rhinovirus humain
WO1992003475A1 (fr) * 1990-08-16 1992-03-05 Replico Medical Aktiebolag Peptides anti-enterovirus
WO2006029887A2 (fr) * 2004-09-16 2006-03-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccins
WO2008057158A2 (fr) * 2006-09-29 2008-05-15 Sanofi Pasteur Biologics Co. Nouvel immunogène de neutralisation (nimiv) de rhinovirus et son utilisation pour des applications dans la vaccination

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DELPEYROUX F ET AL: "Structural factors modulate the activity of antigenic poliovirus sequences expressed on hybrid hepatitis B surface antigen particles", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 64, no. 12, 1 January 1990 (1990-01-01), pages 6090 - 6100, XP002979831, ISSN: 0022-538X *
EDLMAYR J ET AL: "Antibodies induced with recombinant VP1 from human rhinovirus exhibit cross-neutralisation", EUROPEAN RESPIRATORY JOURNAL, WILEY INTERSCIENCE, vol. 37, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 44 - 52, XP008132310, ISSN: 1399-3003, DOI: 10.1183/09031936.00149109 *
KOTIW MICHAEL ET AL: "Immunological response to parenteral vaccination with recombinant hepatitis B virus surface antigen virus-like particles expressing Helicobacter pylori KatA epitopes in a murine H. pylori challenge model.", CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY : CVI FEB 2012, vol. 19, no. 2, February 2012 (2012-02-01), pages 268 - 276, XP002729859, ISSN: 1556-679X *
LIU J N ET AL: "Combined peptides of human enterovirus 71 protect against virus infection in mice", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, vol. 28, no. 46, 28 October 2010 (2010-10-28), pages 7444 - 7451, XP027434001, ISSN: 0264-410X, [retrieved on 20100908], DOI: 10.1016/J.VACCINE.2010.08.080 *
MCCRAY J ET AL: "DIFFERENT RHINOVIRUS SEROTYPES NEUTRALIZED BY ANTIPEPTIDE ANTIBODIES", NATURE (LONDON), vol. 329, no. 6141, 1987, pages 736 - 738, XP002725976, ISSN: 0028-0836 *
PUMPENS P ET AL: "EVALUATION OF HBS, HBC, AND FRCP VIRUS-LIKE PARTICLES FOR EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 E7 ONCOPROTEIN EPITOPES", INTERVIROLOGY, KARGER, CH, vol. 45, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 24 - 32, XP008026494, ISSN: 0300-5526, DOI: 10.1159/000050084 *
U. KATPALLY ET AL: "Antibodies to the Buried N Terminus of Rhinovirus VP4 Exhibit Cross-Serotypic Neutralization", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 83, no. 14, 15 July 2009 (2009-07-15), pages 7040 - 7048, XP055066241, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.00557-09 *
ZHANG Y-L ET AL: "Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus", SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, BLACKWELL SCIENCE PUBL., OXFORD, GB, vol. 65, no. 4, 1 April 2007 (2007-04-01), pages 320 - 328, XP009136276, ISSN: 0300-9475, [retrieved on 20070322], DOI: 10.1111/J.1365-3083.2007.01900.X *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201502136A (zh) 2015-01-16
US10058603B2 (en) 2018-08-28
EP3608332B1 (fr) 2022-06-01
US20190076519A1 (en) 2019-03-14
EP2968521A2 (fr) 2016-01-20
EP3608332A1 (fr) 2020-02-12
AR095425A1 (es) 2015-10-14
US20160022803A1 (en) 2016-01-28
WO2014140166A2 (fr) 2014-09-18
US10493145B2 (en) 2019-12-03
WO2014140166A3 (fr) 2014-11-20
ES2924914T3 (es) 2022-10-11
UY35418A (es) 2014-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230390381A1 (en) Immunogenic combinations
TW202222822A (zh) 基於SARS-CoV-2的S抗原蛋白的疫苗和組合物
EP1294400B1 (fr) Vaccin contre la fievre aphteuse
US10493145B2 (en) Immunogenic rhinovirus peptides
JP2008019262A (ja) Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのための免疫原性組成物
US11078491B2 (en) Vaccines against Zika virus based on Zika structure proteins
KR20150036191A (ko) OspA의 돌연변이체 단편 및 이에 관련된 방법 및 용도
BE1022008B1 (fr) Compositions immunogenes combinees
US9884107B2 (en) Immunogenic respiratory syncytial virus glycoprotein-containing VLPs and related compositions, constructs, and therapeutic methods
JP2010504759A (ja) ライノウイルスの新規中和性免疫原（ｎｉｍｉｖ）およびワクチン応用のためのその利用
Narayanan et al. Recombinant helical plant virus-based nanoparticles for vaccination and immunotherapy
Dowaidar Gene-free Viral-like particles (VLPs) offer a safer alternative to inactivating or weakening viral strains for traditional vaccines
BE1024785B1 (fr) Vaccin
WO2021138721A1 (fr) Système d&#39;auto-assemblage, auto-adjuvant pour l&#39;administration de vaccins
BE1022949B1 (fr) Composition immunogene
JP2023519837A (ja) コロナウイルスを処置するためのワクチン組成物
CA2828068A1 (fr) Polypeptides multimeres multi-epitopes utilises dans des vaccins contre la grippe saisonniere et pandemique
Zhao Self-Adjuvanted Virus-like Particle for Safe and Highly Immunogenic Vaccination
JP4771948B2 (ja) Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのための免疫原性組成物
Guillén et al. Desarrollo de plataforma de adyuvación para vacunas preventivas y terapeúticas basada en partículas semejantes a virus: demostración de efecto en modelos animales y humanos
Guillén et al. Development of a technological framework for using virus-like particles as adjuvants in prophylactic and therapeutic vaccines: demonstration of effect in animal models and humans

Legal Events

Date Code Title Description
MM Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20190331