FR2762788A1 - Composition vaccinale anti-helicobacter pour usage par voie systemique sous-diaphragmatique - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à l'induction d'une réponse immune de type T helper 1 (Th1) à l'encontre d'Helicobacter, pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter chez un mammifère. Ceci est notamment réalisé lorsque la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systémique dans la partie du mammifère située sous son diaphragme.

Description

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La présente invention a pour objet l'usage particulier d'une préparation vaccinale destinée à induire chez un mammifère, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un organisme pathogène infectant des muqueuses, notamment à l'encontre des bactéries Helicobacter. Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à

gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères.

On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien qu'H.

pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Helicobacter, Gastrospirillum hominis a également été décrite chez l'homme. Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement; ce qui en

fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.

H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des

carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.

Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de

prévenir ou de traiter les infections à Helicobacter.

A ce jour, plusieurs protéines d'Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et la méthode de vaccination qui est couramment préconisée consiste à délivrer l'antigène au niveau de la muqueuse gastrique, c'est-à-dire à l'endroit même o la réponse immune est souhaitée. Pour ce faire, l'administration

par voie orale a donc été retenue.

Toujours dans le même but (induction d'une réponse immunitaire au niveau de l'estomac), il a été proposé plus récemment, de délivrer l'antigène en un site muqueux autre que la muqueuse gastrique; tel que par exemple la muqueuse nasale ou rectale (WO 96/31235). Des lymphocytes stimulés par l'antigène en un territoire muqueux dit inducteur peuvent migrer et circuler de manière sélective pour aller induire une

réponse immunitaire en d'autres territoires muqueux, dits effecteurs.

Une variante de ces méthodes consiste à effectuer une primo-immunisation par

voie systémique avant d'administrer l'antigène par voie nasale.

Pour administration par voie muqueuse, l'antigène, le plus souvent un lysat bactérien ou une protéine purifiée, est associé à un adjuvant approprié comme la

toxine cholérique (CT) ou la heat-labile toxine (LT) d'E. coli.

Lorsque l'administration par voie muqueuse est mise en oeuvre, la réponse humorale que l'on observe, est de manière prédominante de type IgA. Ceci indique

bien qu'il y a eu une réponse immunitaire locale.

Certains auteurs ont pensé très tôt qu'il existait une bonne corrélation entre une forte réponse de type IgA et un effet protecteur (Czinn et al, Vaccine (1993) 11: 637). D'autres ont émis un avis plus réservé (Bogstedt et al, Clin. Exp. Immunol. (1996) 105: 202). Bien qu'il n'existe pas à ce jour de véritable certitude concernant ce sujet, l'induction d'anticorps qui soient notamment de type IgA. apparaît quoi qu'il

en soit souhaitable pour la plupart des auteurs.

De manière générale, l'apparition des IgA témoigne de la mise en oeuvre d'une

réponse de la part des lymphocytes T-helper de type 2 (réponse Th2).

En effet, la stimulation des lymphocytes T-helper par un antigène particulier permet d'obtenir différentes sous-populations de cellules Thelper, caractérisées par

des profils de synthèse de cytokines différents.

Les cellules Thl produisent notamment de manière sélective l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron-y (IFN-y), tandis que les cellules Th2 sécrètent de préférence l'IL-4, -5, et -10. En raison de leur production différentiée de cytokines, ces deux types de cellules T- helper ont des rôles distincts: les cellules Thl favorisent l'immunité à médiation cellulaire i.a. une réponse de type inflammatoire, tandis que

les cellules Th2 stimulent la réponse humorale de type IgA, IgE et de certaines sous-

classes d'IgG. On sait aussi que les cytokines produites par des cellules Thl de souris -3- peuvent stimuler la réponse anticorps et en particulier que 'IFN-y induit une réponse IgG2a. Ainsi, des différentes études de l'art antérieur, émerge l'opinion selon laquelle l'induction d'une réponse Th2 caractérisée par l'apparition d'IgA est indispensable,

sinon suffisante, afin d'obtenir un effet protecteur.

De manière surprenante, on a maintenant découvert que, même si une réponse Th2 ne nuit pas, il est aussi nécessaire d'induire une forte réponse Thl. En effet, des résultats expérimentaux démontrent maintenant qu'un effet protecteur peut être

corrélé plus aisément avec une réponse Thl qu'avec une réponse Th2.

Contrairement à ce qui était initialement recherché (D'Elios et al, J. Immunol. (1997) 158: 962), la présente demande révèle donc l'importance d'induire une réponse Th l de type inflammatoire au moment de l'immunisation, sans laquelle on ne

peut observer d'effet protecteur.

En conséquence, la présente invention a pour objet: (i) l'usage d'un agent immunogène dérivé un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g. dérivé d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à l'induction d'une réponse immunitaire de type Thl à l'encontre dudit microorganisme e.g. d'Helicobacter, pour traiter ou prévenir une infection e.g., à Helicobacter chez un mammifère; et (ii) une méthode pour prévenir ou traiter une infection promue par un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g., une infection à Helicobacter, selon laquelle on administre au mammifère, en une ou plusieurs fois, au moins un agent immunogène dérivé dudit microorganisme e.g. d'Helicobacter, et par laquelle une réponse

immunitaire de type Thl est induite à l'encontre e.g. d'Helicobacter.

On peut mettre en évidence l'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention en estimant l'importance relative de la réponse Thl par rapport à la réponse Th2, en comparant par exemple les taux d'IgG2a et d'IgGI induits chez la souris à l'encontre d'Helicobacter, qui témoignent respectivement de la mise en -4- oeuvre des réponses Thl et Th2. En effet, la réponse Thl que l'on recherche est généralement accompagnée d'une réponse Th2. Néanmoins, on considère que la réponse Th2 ne doit pas être significativement prédominante par rapport à la réponse Thl. Les taux d'IgG2a et d'IgGl induits chez la souris peuvent être appréciés de manière conventionnelle à l'aide d'un test ELISA, à condition que les tests utilisés pour chacun des deux sous isotypes soient de même sensibilité et en particulier que

les anticorps anti-IgG2a et anti-IgGI soient de même affinité.

Les quantités d'IgG2a et d'IgG1 peuvent être notamment mesurées à l'aide d'un test ELISA identique ou similaire à celui décrit ci-après. Les puits d'une plaque ELISA en polycarbonate sont enduits avec 100 gl d'un extrait bactérien d'Helicobacter e.g. H. pylori à environ 10 pig/ml dans du tampon carbonate. La plaque ELISA est incubée 2 heures à 37 C puis une nuit à 4 C. La plaque est lavée avec du tampon PBS (phosphate buffer saline) contenant 0.05 % de Tween 20 (tampon PBS / Tween). Les puits sont saturés avec 250 lil de PBS contenant 1 % de

serum albumine bovine afin d'empêcher la liaison non-spécifique des anticorps.

Après une heure d'incubation à 37 C, la plaque est lavée avec le tampon PBS / Tween. L'antisérum prélevé chez la souris, un certain nombre de jours après que cette dernière ait reçu la composition destinée à l'induction d'une réponse immune de type Thl à l'encontre d'Helicobacter, est dilué en série dans du tampon PBS / Tween. 100 tl des dilutions sont ajoutés dans les puits. La plaque est incubée 90 minutes à 37 C, lavée et évaluée selon des procédures standard. Par exemple, on utilise un anticorps de chèvre anti-IgG2a ou anti-IgGI de souris couplé à une enzyme telle que la peroxydase. L'incubation en présence de cet anticorps est poursuivie 90 minutes à 37 C. On lave la plaque puis la réaction est développée avec le substrat approprié (par exemple de l'O-phenyldiamine dihydrochloride lorsque l'enzyme utilisée est la peroxydase). La réaction est évaluée par colorimétrie (en mesurant l'absorbance par spectrophotométrie). Le titre de l'antisérum en IgG2a ou en IgGl correspond à

l'inverse de la dilution donnant une absorbance de 1,5 à 490 nm.

L'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention est marquée par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGl chez la souris qui doit être supérieur à 1/100, 1/50 ou 1/20, avantageusement supérieur à 1/10, de préférence supérieur à 1/3, de manière tout à fait préférée, supérieur à 1/2, 5 ou 10. Lorsque ce rapport est aux alentours de 1, on parle alors de réponse Thl / Th2 mixte ou équilibrée. Lorsque le rapport est supérieur ou égal à 5, on peut alors parler de

réponse Thl prépondérante.

-5- L'obtention d'une réponse Thl (ou Th2) chez la souris est prédictive d'une réponse Thl (ou Th2) chez l'homme. Bien qu'il soit plus facile d'évaluer le type de réponse chez la souris, on peut le faire également chez l'homme en mesurant les taux des cytokines spécifiques de la réponse Thl d'une part et d'autre part de la réponse Th2, qui sont induites subséquemment. Les réponses Thl et Th2 peuvent être évaluées directement chez l'homme l'une par rapport à l'autre sur la base des taux de cytokines spécifiques des deux types de réponse (voir ci-dessus) e.g., sur la base du

rapport IFN-y / IL-4.

Alternativement, si la méthode de dosage décrite ci-dessus est mise en oeuvre, on peut prévoir que le titre ELISA qui reflète la quantité d'IgG2a, doit être égal ou supérieur à 10 000, de préférence égal ou supérieur à 100 000, de manière particulièrement préférée égal ou supérieur à 1 000 000; ceci signifie alors que la

réponse Thl est significative.

Le mammifère auquel est destinée la composition pharmaceutique ou la

méthode est avantageusement un primate, de préférence un humain.

On peut parvenir à induire une réponse Thl à l'encontre d'Helicobacter en jouant sur un certain nombre de facteurs, comme par exemple la voie d'administration. On a en effet mis en évidence qu'en utilisant la voie systémique on peut obtenir un taux de protection similaire ou supérieur à celui observé lorsque l'on

utilise la voie muqueuse.

C'est pourquoi l'invention a notamment pour objet: (i) l'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie systémique dans la partie d'un mammifère, notamment d'un primate, située sous son diaphragme, pour traiter ou prévenir une infection à Helicobacter; et (ii) une méthode pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter chez un mammifèere, selon laquelle on administre audit mammifère, en une ou plusieurs fois, par voie systémique, au moins un agent immunogène dérivé d'Helicobacter. -6- En ce qui concerne la méthode, on indique que, de manière avantageuse, l'administration de l'agent immunogène par voie systémique est répétée une ou plusieurs fois, de préférence au moins deux fois, pour que soit induite la réponse immunitaire recherchée. Une méthode préférée par laquelle un effet protecteur est obtenu, est notamment une méthode selon laquelle l'agent immunogène est administré exclusivement par voie systémique (voie systémique stricte). "Une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systémique stricte" est définie comme une méthode ne mettant pas en jeu de voie d'administration autre que la voie systémique. Par exemple, une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systémique et par voie muqueuse, ne répond pas à la définition énoncée ci-avant. En d'autres termes, "une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systémique stricte" doit être comprise comme une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systémique à l'exclusion de toute autre voie,

notamment la voie muqueuse.

Toujours en ce qui concerne la méthode, l'administration par voie systémique

est avantageusement effectuée dans la partie sous-diaphragmatique du mammifère.

L'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est avantageusement sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire

d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée.

L'agent immunogène peut être aussi une molécule polynucléotidique, notamment une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère; ou bien encore un vecteur vaccinal viral comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le

contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.

Aux fins de la présente invention, une préparation de bactéries inactivées peut

être obtenue selon des méthodes conventionnelles bien connues de l'homme de l'art.

Il en est de même d'un lysat bactérien. Une dose de bactéries inactivées ou de lysat cellulaire, appropriée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, peut être déterminée par l'homme de l'art et dépend d'un certain nombre de facteurs tel que l'individu auquel est destiné le vaccin e.g., âge, de l'antigène lui-même, de la voie et du mode d'administration, de la présence/absence ou du type d'adjuvant, ainsi que -7- cela peut être déterminé par l'homme de l'art. D'une manière générale, on indique

qu'une dose appropriée est d'environ 50 lg à 1 mg à environ I mg, de lysat.

Un peptide ou un polypeptide dérivé d'Helicobacter peut être purifié à partir d'Helicobacter ou obtenu par les techniques du génie génétique ou bien encore par synthèse chimique. Ce dernier procédé est avantageux dans le cas des peptides. On appelle "peptide" toute chaîne d'acides aminés dont la taille est inférieure à environ acides aminés. Lorsque la taille est supérieure, on utilise le terme de "polypeptide" qui est aussi interchangable avec le terme "protéine". Un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à celui existant dans les conditions naturelles. Il est similaire en ce qu'il est capable d'induire une réponse immune de la même nature mais il peut comporter certaines variations structurelles comme par exemple une mutation, l'ajonction d'un résidu de nature lipidique ou bien

être sous forme de peptide ou de polypeptide de fusion.

Une dose du peptide ou du polypeptide, appropriée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, peut être déterminée par l'homme de l'art et dépend d'un certain nombre de facteurs tel que l'individu auquel est destiné le vaccin e.g., âge, de l'antigène lui-même, de la voie et du mode d'administration, de la présence/absence ou du type d'adjuvant, ainsi que cela peut être déterminé par l'homme de l'art. D'une manière générale, on indique qu'une dose appropriée est d'environ 10 lag à environ 1

mg, de préférence à environ 100 pg.

La molécule d'ADN peut avantageusement être un plasmide qui est incapable à la fois de se répliquer et de s'intégrer de manière substantielle dans le génome d'un mammifère. La séquence codante citée ci-dessus est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dans une cellule de mammifère. Ce promoteur peut être ubiquitaire ou spécifique d'un tissu. Parmi les promoteurs ubiquitaires, on cite le promoteur précoce du Cytomegalovirus (décrit dans le brevet US n 4,168,062) et le promoteur du virus du sarcome de Rous (décrit dans Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5: 281). Le promoteur desmine (Li et al, Gene (1989) 78: 244443; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268: 10403) est un promoteur sélectif permet l'expression dans les cellules musculaires et aussi dans les cellules de la peau. Un promoteur spécifique des cellules musculaires est par example le promoteur du gène de la myosine ou de la dystrophine. Des vecteurs plasmidiques que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention sont décrits i.a, dans WO

94/21797 et Hartikka et al, Human Gene Therapy (1996) 7: 1205.

-8- Dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention, la molécule nucléotidique e.g. la molécule d'ADN peut être formulée ou non. Le choix de la formulation est très varié. L'ADN peut être simplement dilué dans une solution acceptable d'un point de vue physiologique avec ou sans porteur. Lorsque ce dernier est présent, il peut être isotonique ou faiblement hypertonique et avoir basse force ionique. Par exemple, ces conditions peuvent être remplies par une solution de

sucrose e.g. à 20 %.

De manière alternative, le polynucléotide peut être associé avec des agents qui favorise l'entrée dans la cellule. Ce peut être (ii) un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire, telle que la bupivacaine (voir par exemple WO 94/16737) ou (ii) un agent s'associant au polynucléotide et agissant en tant que véhicule facilitant le transport du polynucléotide. Ce dernier peut être notamment des polymères cationiques e.g. de la polylysine ou une polyamine e.g. des dérivés de la spermine tel que la spermidine (voir WO 93/18759). Ce peut être également des peptides fusogéniques e.g. du GALA ou de la Gramicidine S (voir WO 93/19768) ou bien

encore des peptides dérivés des protéines de fusion virales.

Il peut aussi s'agir de lipides anioniques ou cationiques. Les lipides anioniques ou neutres sont connus depuis longtemps comme pouvant servir d'agents de transport, par exemple sous forme de liposomes, à un grand nombre de composés y

compris les polynucléotides. Une description détaillée de ces liposomes, de leurs

constituants et de leurs procédés de fabrication est par exemple fournit par

Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).

Les lipides cationiques sont aussi connus et communément utilisés comme agents de transport pour les polynucléotides. On cite par exemple la LipofectinTM

aussi connue sous le nom de DOTMA (N-[l-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-

trimethylammonium chloride), le DOTAP (1,2-bis(oleyloxy)-3(trimethylammonio) propane), le DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), le DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) et les dérivés du cholestérol tel que le DC-chol (3

bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-carbamoyl) cholestérol). Une description de

ces lipides est fournie par EP 187,702, WO 90/11092, le brevet US N 5, 283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 et le brevet US N 5,527,928. Les lipides cationiques sont utilisés de préférence avec un lipide neutre tel que le DOPE (dioleyl

phosphatidylethanolamine) comme cela est par exemple décrit dans WO 90/11092.

-9- Des microparticules d'or ou de tungstène peuvent aussi être utilisées comme agents de transport, tel que c'est décrit dans WO 91/359, WO 93/17706 et Tang et al, Nature (1992) 356: 152. Dans ce cas là, le polynucléotide est précipité sur les microparticules en présence de chlorure de calcium et de spermidine puis l'ensemble est administré par jet à haute vitesse dans le derme ou dans l'épiderme, à l'aide d'un appareil sans aiguille tel que ceux décrits dans les brevets US N 4,945, 050 et N ,015,580 et WO 94/24243. La quantité d'ADN qui peut être utilisée pour vacciner un individu dépend d'un certains nombre de facteurs tels que par exemple la force du promoteur utilisé afin d'exprimer l'antigène, l'immunogénicité du produit exprimé, la condition du mammifère auquel est destinée l'administration (e.g., le poids, l'âge, et l'état de santé général), le mode d'administration et le type de formulation. On indique en particulier, que l'administration par voie intramusculaire requièrt une quantité d'ADN plus importante que l'administration par voie intradermique à l'aide d'un appareil sans aiguille. En général une dose appropriée à un usage prophylactique ou thérapeutique chez un adulte de l'espèce humaine est d'environ 1 gig à environ 5 mg, de préférence d'environ 10 zig à environ 1 mg, et de manière tout particulièrement préférée

d'environ 25 gtg à environ 500 p.g.

Parmi les agents immunogènes cités précédemment, on trouve les vecteurs vaccinaux. Parmi les vecteurs d'origine virale on trouve notamment les adénovirus et les poxvirus. Un exemple de vecteur derivé d'un adénovirus ainsi qu'une méthode pour construire un vecteur capable d'exprimer une molécule d'ADN codant pour un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention sont décrits dans le brevet US N 4,920,209. Des poxvirus qui peuvent être utilisés de même, sont par exemple les virus de la vaccine et du canarypox. Ils sont décrits de manière respective dans les brevets US N 4,722,848 et 5,364,773 (voir aussi e.g. , Tartaglia et al, Virology (1992) 188: 217 et Taylor et al, Vaccine (1995) 13: 539). Des poxvirus capable d'exprimer un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peuvent être obtenus par recombinaison homologue tel que décrit dans Kieny et al, Nature (1984) 312: 163, de manière à ce que le fragment d'ADN codant pour le peptide ou le polypeptide soit placé dans des conditions appropriées à son expression dans des cellules de mammifèeres. Un vecteur bactérien tel que le Bacille bilié de

Calmette-Guérin peut être aussi envisagé.

-10- D'une manière générale, la dose d'un vecteur viral destinée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques peut être d'environ lx104 à environ lx1011, de manière avantageuse d'environ lx107 à environ 1x1010, de préférence d'environ

1x107 à environ 1 x 109 unités formant plaquesper kilogram.

L'agent immunogène dérivé d'Helicobacter peut être n'importe quel polypeptide d'Helicobacter e.g., d'H. pylori. Il peut notamment s'agir d'un polypeptide présent dans le cytoplasme, d'un polypeptide de la membrane interne ou externe ou d'un polypeptide sécrété dans le milieu extérieur. De nombreux polypeptides d'Helicobacter ont déjà été décrits dans la littérature, soit par référence à leur séquence d'acides aminés déduites de la séquence du gène correspondant cloné ou identifié, soit par référence à un procédé de purification qui permet de les obtenir sous forme isolée du reste de leur environnement naturel. A titre indicatif, on cite en particulier les document suivants: WO 94/26901 and WO 96/34624 (HspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (HpaA), WO 93/181150 (cytotoxine), WO /27506 et Hazell et al, J. Gen. Microbiol. (1991) 137: 57 (catalase), FR 2 724 936 (recepteur membranaire de la lactoferrine humaine), WO 96/41880 (AIpA), EP 752 473 (FibA) and O'Toole et al, J. Bact. (1991) 173: 505 (TsaA). D'autres polypeptides sont aussi décrits dans WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 et WO 96/33220. Un polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à l'un de ceux cités en référence dans la mesure o il est capable de promouvoir une réponse immune à l'encontre d'Helicobacter. A condition de remplir cette dernière condition, l'agent immunogène peut aussi être un peptide dérivé d'un

polypeptide cité en référence.

De manière avantageuse, on utilise un polypeptide sélectionné parmi les sous-

unités UreA et UreB de l'uréase d'Helicobacter (voir WO 90/4030). De préférence, on les utilise toutes les deux, associées en forme d'apoenzymrne de l'uréase ou encore

sous forme multimérique (voir WO 96/33732).

De même, une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal utile aux fins de la présente invention comportent une séquence qui peut coder pour n'importe quel

polypeptide ou peptide décrit ci-dessus.

Une molécule d'ADN ou de préférence, un vecteur vaccinal viral peut aussi comporter une séquence codant pour une cytokine, par exemple une Iymphokine telle que l'interleukine-2 ou -12, sous le contrôle d'élements appropriés pour expression

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dans une cellule de mammifère. Une alternative à cette option consiste aussi à ajouter dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention comprenant une molécule d'ADN ou un vecteur, une autre molécule ou vecteur viral

codant pour une cytokine.

Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut contenir un unique agent immunogène ou plusieurs. Par exemple une composition avantageuse peut comprendre UreA et UreB e.g., sous forme d'apoenzyme, ainsi que

un ou plusieurs autres polypeptides, notamment sélectionnés parmi ceux cités ci-

avant. De même, lorsqu'il s'agit d'une molécule d'ADN ou d'un vecteur vaccinal, la composition peut en contenir plusieurs, chacun codant pour un polypeptide particulier ou un(e) seul(e) molécule d'ADN ou vecteur vaccinal codant pour

plusieurs peptides ou polypeptides.

Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut en outre contenir des composés autres que l'agent immunogène luimême, la nature de ces composés dépendant dans une certaine mesure de la nature de l'agent immunogène, bactéries inactivées, lysat cellulaire, peptide ou polypeptide, molécule d'ADN ou vecteur vaccinal. Ainsi comme on l'a déjà vu précédemment, lorsqu'il s'agit d'une molécule d'ADN, la composition pharmaceutique peut inclure différents agents de formulation. Une composition peut aussi comprendre un adjuvant approprié pour administration par voie systémique e.g. un composé d'aluminium tel que l'aluminium hydroxide, l'aluminium phosphate ou l'aluminium hydroxy phosphate. D'une manière générale, on indique que des bactéries inactivées peuvent ne pas réquérir l'adjonction d'un adjuvant. Il en est de même en ce qui concerne les molécules d'ADN. Par contre, la présence d'un adjuvant est préférable lorsque l'agent immunogène est un lysat bactérien ou un peptide ou polypeptide purifié. Enfin, lorsque l'agent immunogène est un vecteur vaccinal, on évite de préférence d'en

employer afin que la réponse immune à l'égard du vecteur lui-même reste minimale.

Outre les composés d'aluminium, il existe dans l'état de la technique un grand nombre d'adjuvants appropriés pour administration par voie systémique parmi lesquels l'homme du métier est capable de sélectionner celui qui correspond le mieux à ses besoins; en particulier un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl ou d'une réponse équilibrée de type Thl + Th2. A titre indicatif, on cite notamment les liposomes; les ISCOMS; les microsphères; les chochléates protéiques; les vésicules formées de surfactants non-ioniques; les -12- dispersions d'amphiphiles cationiques dans de l'eau; les émulsions huile/eau; le muramidyldipeptide (MDP) et ses dérivés tels que le glucosyl muramidyldipeptide (GMDP), le thréonyl-MDP, le murametide et lamurapalmitine; et le QuilA et ses sous fractions; ainsi que divers autres composés tels que le monophosphoryl-lipide A (MPLA) lipopolysaccharide majeur de la paroi d'une bactérie, par exemple d'E. coli, de Salmonella minnesota, de Salmonella typhimurium ou de Shigellaflexneri;

l'algane-glucane; la gamma-inuline; le calcitriol et la loxoribine.

Des liposomes utiles aux fins de le présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi des liposomes pH-sensibles tels que ceux formés par mélange de d'hémisuccinate de cholestérol (CHEMS) et de dioleyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE); des liposomes contenant des lipides cationiques reconnus pour leurs

propriétés fusiogènes, tels que le 3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-

carbamoyl) cholestérol (DC-chol) et ses équivalents décrits dans le brevet US N0 5,283,185 et WO 96/14831, le bromure de dimethyldioctadecylammonium (DDAB) et les composés BAY décrits dans EP 91645 et EP 206 037, par exemple le Bay

R1005 (N-(2-desoxy-2-L-leucylamino-bétâ-D-glucopyranosyl)-N-octadecyl dodeca-

noylamide acétate; et des liposomes contenant du MTP-PE, un dérivé lipophile du MDP (muramidyldipeptide). Ces liposomes sont utiles pour adjuvanter tous les

agents immunogènes cités.

Des ISCOMs utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi les ceux composés de QuilA ou de QS-21 associé à du cholestérol et éventuellement aussi à un phospholipide tel que la phosphatidylcholine. Ceux ci

sont particulièrement intéressants pour la formulation des antigènes lipidés.

Des microsphères utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment formés à partir de composés tels que le polylactide-coglycolide (PLAGA), l'alginate, le chitosan, le polyphosphazène et de nombreux autres

polymères.

Des chochléates protéiques utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi ceux formés à partir de cholestérol et éventuellement d'un phospholipide additionnel tel que la phosphatidylcholine Ceux-ci sont surtout

intéressants pour la formulation des antigènes lipidés.

-13- Des vésicules formées de surfactants non-ioniques utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment formées par un mélange de 1-monopalmitoyl glycérol de cholestérol et de dicetylphosphate. Elles sont une alternative aux liposomes classiques et peuvent être utilisées pour la formulation de tous les agents immunogènes cités. Des émulsions huile/eau utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnées parmi le MF59 (Biocine-Chiron), le SAF1 (Syntex) et les

montanides ISA51 et ISA720 (Seppic).

Un adjuvant utile aux fins de la présente invention peut aussi être une fraction dérivée de l'écorce de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja Saponaria Molina; par exemple le QS-21, fraction purifiée par chromatographie HPLC comme cela est écrit dans le brevet US N 5,057,540. Dans la mesure o une certaine toxicité peut être associée au QS-21, il peut être intéressant d'utiliser ce dernier dans des liposomes

notamment à base de stérol, comme cela est décrit dans WO 96/33739.

Enfin, un effet adjuvant peut être aussi obtenu en lipidant le peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention. L'association par liaison covalente d'un tel peptide ou polypeptide avec un lipide ou un composé lipidé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl, de manière à former un conjugué lipopeptide ou polypeptide lipidé, peut être réalisée de différentes manières connues de l'homme de l'art. Par exemple, on peut utiliser un des composés décrits

dans EP 431 327 tel que la N-palmitoyl-S-2,3-(bispalmitoyloxy)-propylcystéinyl-

séryl-sérine (Pam3CSS) que l'on couple par des procédés connus à l'extrémité N-

terminale du peptide ou du polypeptide.

L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'une méthode ou d'un usage selon l'invention peut être évaluée selon des méthodes standard e.g., en mesurant l'induction d'une réponse immune ou l'induction d'une immunité thérapeutique ou protectrice en utilisant e.g., le modèle souris / H. felis et les procédures décrits dans Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (1995) 7: 303 ou Lee et al, J. Infect. Dis. (1995) 172: 161. L'homme de l'art s'avisera que H. felis peut être remplacé dans le modèle souris par une autre espèce d'Helicobacter. Par exemple, l'efficacité d'un agent immunogène dérivé d'H. pylori est de préférence évalué dans

un modèle souris metant en oeuvre une souche d'H. pylori adaptée à la souris.

L'efficacité peut être déterminée en comparant le degré d'infection dans le tissu -14- gastrique (en mesurant l'activité uréase, la charge bactérienne ou l'état de la gastrite) à celui d'un groupe contrôle. Il y a effet thérapeutique ou effet protecteur lorsque

l'infection est réduite par comparaison au groupe contrôle.

Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, elle peut être formulée avec un diluent ou un porteur acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g., de l'eau ou une solution saline. En général, le diluent ou le porteur peut être selectionné en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Des porteurs ou des diluents appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine. Les méthodes selon l'invention ainsi que les compositions utiles à ces fins peuvent être mises en oeuvre pour traiter ou prévenir i.a. les infections à Helicobacter et par conséquent, les maladies gastroduodénales associées à ces infections, y compris les gastrites aiguës, chroniques ou atrophiques, les ulcères

peptiques e.g., les ulcères gastriques ou duodénaux.

La voie systémique que l'on utilise, peut être la voie parentérale qui elle-même peut être choisie parmi les voies intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intraépidermique et sous-cutanée; ces quatre dernières étant toutefois préférées à la voie intraveineuse. Les voies intramusculaire et sous-cutanée sont particulièrement recommandées. Dans tous les cas, l'usage qui sera fait de la composition pharmaceutique met en jeu un site d'administration situé sous le diaphragme d'un individu. La région dorso-lombaire constitue par exemple un site d'administration approprié. Afin d'obtenir un effet protecteur ou thérapeutique, l'opération qui consiste à administrer par voie systémique sous-diaphragmatique, une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut être répétée une ou plusieurs fois, en laissant un certain intervalle de temps entre chaque administration; intervalle qui est de l'ordre de la semaine ou du mois. Sa détermination précise est à la portée de l'homme du métier et peut varier en fonction de divers facteurs tels que la nature de l'agent immunogène, l'âge de l'individu, etc. Dans ce cas là, on parle d'administration systémique stricte. A titre illustratif non-limitatif, on évoque un -15- schéma de vaccination qui consiste à administrer l'apoenzyme de l'uréase trois fois par voie sous-cutanée, dans la région dorso-lombaire avec un intervalle de deux à

quatre semaines entre chaque administration.

Selon un mode alternatif, on peut aussi prévoir d'opérer en mode d'administration systémique strict mais en utilisant des agents immunogènes qui

varient lors des administrations constituant les étapes d'un protocole de vaccination.

A titre illustratif non-limitatif, on évoque un schéma de vaccination par voie

systémique stricte, en trois étapes: une première administration (priming ou primo-

administration) consiste à administrer un vecteur pox codant pour e.g. UreA et UreB

suivie de deux administrations consécutives (rappels) de l'apoenzyme de l'uréase.

D'une manière générale, l'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique destinée à traiter ou à prévenir une infection à Helicobacter qui comprend pour administration consécutive, plusieurs produits; chacun des produits étant formulé de manière à être administré par voie systémique sous-diaphragmatique et contenant un agent immunogène dérivé d'Helicobacter sélectionné de manière indépendante, parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide, un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée. une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression et un vecteur vaccinal comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression; de préférence à condition que, lorsqu'un premier produit contient un peptide ou un polypeptide et un deuxième produit contient une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal, ladite séquence codante de la molécule d'ADN ou du vecteur vaccinal code pour le peptide ou

polypeptide contenu dans le premier produit.

Enfin, un protocole de vaccination alternatif comprenant plusieurs administrations étalées dans le temps e.g. dans des intervalles de temps de l'ordre de la semaine ou du mois, à déterminer par l'homme du métier, peut inclure une première administration par voie systémique sousdiaphragmatique et une deuxième administration par voie muqueuse autre que la voie intra-nasale, e.g. par voie oculaire, orale e.g. buccale ou gastrique, pulmonaire, intestinale, rectale, vaginale ou urinaire. A titre illustratif non-limitatif, on évoque un protocole de vaccination qui consiste à administrer une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal par voie -16- systémique sous-diaphragmatique puis à administrer un polypeptide par voie gastrique; la molécule d'ADN ou le vecteur vaccinal codant de préférence pour le

polypeptide administré par voie gastrique.

D'une manière générale, l'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique destinée à traiter ou à prévenir une infection à Helicobacter qui comprend pour administration consécutive, plusieurs produits; un des produits étant étant formulé de manière à être administré par voie systémique sous-diaphragmatique et un autre produit étant formulé de manière à être administré par une voie muqueuse autre que la voie nasale; chacun des produits contenant un agent immunogène dérivé d'Helicobacter sélectionné de manière indépendante, parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide, un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée, une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression et un vecteur vaccinal comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression; de préférence à condition que, lorsqu'un premier produit contient un peptide ou un polypeptide et un deuxième produit contient une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal, ladite séquence codante de la molécule d'ADN ou du vecteur

vaccinal code pour le peptide ou polypeptide contenu dans le premier produit.

Un vecteur vaccinal contenu dans un produit destiné à être administré par voie muqueuse peut être choisi parmi ceux décrits précédemment. En outre il peut être aussi sélectionné parmi des vecteurs bactériens tels que Shigella, Salmonella, Vibrio

cholerae, Lactobacillus et Streptococcus.

Des souches mutantes non-toxiques de Vibrio cholerae qui peuvent être utile comme vaccin vivant, sont décrites dans Mekalanos et al, Nature (1983) 306: 551 et le brevet US N 4,882,278 (souche dans laquelle une partie substantielle de la région codant pour chacun des deux allèles ctxA a été délétée de manière à ce qu'aucune toxine fonctionnelle ne puisse être produite); WO 92/11354 (souche dans laquelle le locus irgA est inactivé par mutation; cette mutation peut être combinée dans une même souche avec des mutations ctxA); et WO 94/1533 (mutant obtenu par délétion à qui il manque des séquences fontionnelles ctxA et attRSl). Ces souches peuvent être modifiées génétiquement afin d'exprimer des antigènes hétérologues, tel que

c'est décrit dans WO 94/19482.

-17- Des souches atténuées de Salmonella typhimurium modifiées génétiquement ou non pour l'expression recombinante d'antigènes hétérologues, ainsi que leurs usage en tant que vaccins sont décrits dans Nakayama et al, BioTechnology (1988) 6: 693 et WO 92/11361. D'autres bactéries utiles en tant que vecteurs vaccinaux sont décrits dans High et al, EMBO (1992) 11: 1991 et Sizemore et al, Science (1995) 270: 299 (Shigella flexneri); Medaglini et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 6868 (Streptococcus gordonii); et Flynn J.L. Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31, WO 88/6626, WO 90/0594, WO 91/13157, WO 92/1796 et WO 92/21376 (Bacille

de Calmette Guerin).

Dans les vecteurs bactériens la séquence d'ADN codant pour un peptide ou polypeptide d'Helicobacter peut être insérée dans le génome bactérien ou bien rester à l'état libre, portée par un plasmide. Bien évidemment cette séquence est placée sous

le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans le vecteur bactérien.

Ces vecteurs bactériens pour administration par voie muqueuse peuvent être utilisés en association avec un adjuvant approprié. De tels adjuvants peuvent être choisis parmi les toxines bactériennes e.g., la toxine cholérique (CT), la heat-labile toxine d'E. coli, (LT), la toxine de Clostridium difficile et la toxine Pertussis (PT) ou

des combinaisons, des sous-unités, des toxoids ou des mutants qui en sont dérivés.

Par exemple, on peut utiliser une préparation purifiée de la sous-unité B de la toxine cholérique native (CTB). Des fragments, des homologues, des dérivés et des fusions de ces toxines conviennent tout aussi bien à condition qu'ils conservent l'activité adjuvante. De préférence, on utilise un mutant dont la toxicité est réduite. De tels mutants sont décrits dans e.g., WO 95/17211 (mutant CT Arg-7-Lys), WO 96/6627

(mutant LT Arg-192-Gly) et WO 95/34323 (mutant PT Arg-9-Lys and Glu-129Gly).

D'autres mutants LT qui peuvent être également utilisés portent au moins une des

mutations suivantes: Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-I 10-Asp et Glu-I 12Asp.

D'autres composés tels que le MPLA, PLGA, DC-chol et QS-21 peuvent aussi

être utilisés en tant qu'adjuvant pour voie muqueuse.

Dans la description ci-avant on s'est essentiellement référé aux infections à

Helicobacter et aux moyens de les combattre en prévention et en prophylaxie.

- 18 -

Neanmoins, on doit comprendre que les principes et méthodes énoncés ciavant peuvent s'appliquer mutatis mutandis à toute autre infection induite par un

microorganisme quelconque dont le siège est l'estomac, le duodénum ou l'intestin.

On précise en outre que tous les documents publiés et cités dans la présente

demande sont incorporés par référence.

L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.

La Figure 1 se réfère à l'Exemple 1 et présente une étude de la réponse locale dans les glandes salivaires (Figure 1A) et au niveau de l'estomac (Figure lB) évaluée par ELISPOT en mesurant la quantité d'IgA anti- uréase induite, exprimée en spots / 106 cellules (Figure IA) ou en nombre des souris répondeuses, présentant plus de 2

IgA spots / souris, (Figure 1B), après (a) administration d'uréase à J0 par voie sous-

cutanée (SC) dans la partie sous-lombaire postérieure gauche [(a) et (c)] ou dans le cou [(b) et (d)], suivie d'un rappel par voie nasale (N) et intragastrique (IG), à J28 [(a)

et (b)] ou à J28 et J56 [(c) et (d)].

La Figure 2 se réfère à l'Exemple I et présente les niveaux d'activité uréase après épreuve, mesurée 4 hrs après le sacrifice des souris ayant reçues par 3 fois, à J0, J28 et J56, une préparation bactérienne inactivée par voie intragastrique [(a) et (c)] ou sous-cutanée dans la partie sous-lombaire postérieure gauche (b). Dans l'expérience (c) 10 pg de toxine cholérique ont été ajoutés à la préparation bactérienne. Les

expériences (d) et (e) correspondent respectivement aux témoins positifs et négatifs.

La Figure 3 se réfère à l'Exemple 1 et présente les niveaux d'activité uréase après épreuve, mesurée 4 hrs après le sacrifice des souris ayant reçues par 3 fois, à J0, J28 et J56: (a) une préparation d'uréase encapsulée à environ 80 % dans des liposomes DC-chol, dans les muscles dorso-lombaires; ou (b) une préparation d'uréase adjuvantée par de la toxine cholérique, par voie intragastrique. Les

expériences (c) et (d) correspondent respectivement aux témoins positifs et négatifs.

La Figure 4 se réfère à l'Exemple I et présente les niveaux d'activité uréase après épreuve, mesurée 4 hrs après le sacrifice des souris ayant reçues par 3 fois, à J0, J28 et J56: (a) une préparation d'uréase adjuvantée par de la toxine cholérique, par voie intragastrique ou (b) une préparation d'uréase adjuvantée par du QS-21, par voie -19- sous- cutanée dans la partie sous-lombaire postérieure gauche. Les expériences (c) et

(d) correspondent respectivement aux témoins positifs et négatifs.

La Figure 5 présente les quantités d'immunoglobulines sériques induites chez les singes soumis à des protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 2, et exprimées en titre ELISA. Un groupe contrôle comprenant 4 singes et trois groupes test sont formés, chacun des groupes test comprenant 8 singes; chaque groupe test est divisé en deux sous-groupes de 4 singes, l'un recevant uniquement la préparation H. pylori inactivée (1, 2 et 3) et l'autre recevant la préparation H. pylori inactivée et de l'uréase recombinante (lu, 2u et 3u). Le groupe 1 et lu correspond au protocole d'administration [nasal + intragastrique, 4 fois]; le groupe 2 et 2u correspond au protocole d'administration [intramusculaire, 4 fois]; le groupe 1 et lu correspond au protocole d'administration [nasal + intragastrique, intramusculaire, nasal + intragastrique, intramusculaire]. Le titre ELISA est mesuré trois fois: une première fois, à JO (bande blanche), une deuxième fois à J42 (bande grise), une troisième fois à

J78 (bande noire).

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Exemple 1: Etudes d'immunisation chez la souris 1A - Matériel et méthodes Souris

Des souris femelles Swiss de 6/8 semaines ont été fournies par Janvier (France).

Pendant toute la durée de l'expérience on a utilisé du matériel stérilisé; les cages étaient protégées par des "isocaps"; les souris ont été nourries avec de l'eau filtrée et

des aliments irradiés.

Protocole d'administration Lors de chaque expérience, les souris ont reçues 3 doses du même produit; chaque dose à 28 jours d'intervalle (les jours 0, 28 et 56). L'administration du produit a été effectuée par voie nasale (jusqu'à 50 ul sur les souris éveillées), par voie orale (300 I 1 en 0,2 M NaHCO3 par gavage gastrique), ou par voie sous-cutanée (300 gl sous la peau du cou ou sous la peau du côté gauche de la région lombaire). Dans certains cas,

une inoculation intramusculaire a été effectuée (50 pil) dans les muscles dorso-

lombaires des souris anesthésiées. 10 p.g d'uréase ont été administrés par voie nasale, sous cutanée ou intramusculaire, et 40 Zig par voie orale. En ce qui concerne la préparation bactérienne inactivée, 400 pig de cellules ont été administrés par voie

sous cutanée ou par voie orale.

Antigènes et adjuvants L'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori a été exprimée dans E. coli et purifiée comme cela a été décrit dans l'exemple 5 de WO96/31235. Dans la suite du texte pour

désigner cette apoenzyme, on emploie le simple terme d'uréase.

Une préparation de bactéries H. pylori inactivée (WC) a été préparée comme suit Une fiole de bactéries congelées ATCC 43579 est diluée dans un milieu biphase en flacon de 75 cm2 (Costar). Ce milieu est composé d'un constituant solide (10 ml Columbia agar (BioMérieux) + 6% de sang de mouton (BioMérieux)) et d'un constituant liquide (3 ml de TSB, BioMérieux). Le flacon est placé dans un generbag contenant un microaer (BioMérieux) et mis en incubation sous agitation douce pendant 48 heures à 37 C. La culture est ensuite analysée (mobilité, uréase, catalase et production d'oxydase) et centrifugée (éventuellement après avoir regroupé plusieurs flacons) à 3000 rpm pendant 20 mn à 4 C. Le culot est resuspendu dans du -21 - PBS (BioMérieux) contenant 1 % de formaline (37 formaline, Sigma). On ajuste le volume afin d'obtenir une concentration finale de 2 mg/ml (1 ml ayant une DO de 1 à 600 nm avant centrifugation correspond à 377 lig de protéine). Le produit est doucement brassé à 4 C pendant 4 heures, lavé 3 fois dans du PBS et la solution finale est concentrée à 100 ig protéine/50 k.l. Les aliquots sont maintenus à - 70 C. Des liposomes DC-chol contenant de l'uréase sont préparés comme suit: Tout d'abord, afin d'obtenir un film lipidique sec contenant 100 mg de DC-chol (R-Gene Therapeutics) et 100 mg de DOPC (dioleylphosphatidylcholine) (Avanti Polar Lipids), on mélange ces produits sous forme de poudre dans environ 5 ml de chloroforme. On laisse la solution s'évaporer sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le film ainsi obtenu sur les parois du récipient est séché sous vide poussé pendant au moins 4 hrs. En parallèle, 20 mg d'un lyophilisat d'uréase et 100 mg de sucrose sont dilués dans 13.33 ml de tampon Hepes 20 mM pH 7.2. Dix ml de cette préparation (qui contient 1.5 mg d'uréase et 0.75 % de sucrose) est filtrée sur filtre Millex 0.220 gm, puis utilisée pour réhydrater le film lipidique. La suspension est mise sous agitation pendant 4 hrs puis soit extrudée (10 passages sur membrane de polycarbonate 0.2 pm) ou microfluidisée (10 passages sous une pression de 500 kPa dans un microfluidiseur YO10 de Microfluidics Co). Dans la suspension de liposomes ainsi obtenue le taux d'uréase encapsulée est de 10 à 60 %. Cette suspension est lyophilisée après avoir ajusté la concentration en sucrose à 5 % (on ajoute 425 mg de sucrose pour 10 ml). Avant utilisation, le lyophilisat est repris par un volume d'eau ou de tampon approprié et la suspension est purifiée sur un gradient discontinu de sucrose (paliers de 0, 30 et 60 %) de manière à obtenir une préparation dans laquelle la quantité d'uréase encapsulée est supérieure à 70 % environ par rapport à la quantité

totale d'uréase.

La toxine cholérique est utilisée comme adjuvant mucosal à raison de 10 kig / dose

d'uréase ou de préparation bactérienne.

Le QS-21 (Cambridge Biosciences) est utilisé comme adjuvant à raison de 15 gg /

dose d'uréase.

Epreuve Deux semaines après le deuxième rappel, les souris ont été soumises à un gavage gastrique avec 300 gl d'une suspension d'une souche d'H. pylori adaptée à la souris, la souche ORV2002 (1 x 107 bactéries vivantes dans 200 1il de PBS; DO550 de 0.5

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environ). Un groupe n'ayant reçu aucune dos d'antigène et servant de contrôle est

éprouvé de même.

Analyse de l'épreuve Quatre semaines après l'épreuve, les souris ont été sacrifiées par rupture des vertèbres cervicales. Les estomacs ont été prélevés pour évaluer l'activité uréase et faire des analyses histologiques. L'activité uréase a été évaluée après 4 et 24 heures (OD à 550 nm) avec le Jatrox test, Procter & Gamble) et après 24 heures le nombre de souris

encore négatives a été relevé.

Mesure de réponse anticorps locale par ELISPOT (glandes salivaires et estomac). Les ELISPOT ont été exécutés conformément à Mega et al, J. Immunol. (1992) 148 2030. Les plaques ont été enduites d'un extrait de protéines d'H. pylori à une

concentration de 50 g.g/ml.

Pour tester la réponse anticorps au niveau de l'estomac nous avons modifié la méthode comme suit: La moitié de l'estomac a été coupée en morceau de I mm2 avec un appareil automatique pour couper les tissus humains (Mc Illwain Laboratories, Gilford, UK) et la digestion effectuée avec de la Dispase (2 mg/ml, Boeringher Mannheim) dans 2 ml d'une solution de Joklil modifiée à laquelle ont été ajoutés % de sérum de cheval (Gibco), de la glutamine et des antibiotiques. Quatre digestions d'une 1/2 heure ont été exécutées à 37 C avec brassage doux. Les cellules ainsi digérées ont été filtrées après chaque étape à l'aide de filtres 70 gim (Falcon), puis lavées 3 fois dans une solution de RPMI 1640 (Gibco) complémentée à 5 % de de sérum de veau foetal (FCS), et incubées dans la même solution pendant au moins 4 heures dans des plaques recouvertes de nitrocellulose (Millipore) (100 1il/puits, 4 puits). Par moitié d'estomac, on obtient entre I et 3,105 cellules (les cellules de

grande taille et les macrophages n'ont pas été comptées).

L'IgA biotinylée et le complexe streptavidine - péroxydase biotinylée provenaient d'Amersham. Les spots ont été révélés sous l'action du substrat AEC (Sigma) et dès que les plaques sont sèches, ils ont été comptés sous un microscope (grossissement 16 ou 40X). Les valeurs moyennes correspondant au nombre de taches d'IgA dans

quatre puits ont été calculées et exprimées comme le nombre de taches/1 06 cellules.

-23 - Analyse de la réponse par ELISA Les analyses par ELISA ont été exécutées conformément au protocole standard (les conjugués biotinylés et la streptavidine péroxydase provenaient de chez Amersham et le substrat OPD (O-phenyldiamine dihydrochloride) de chez Sigma). Les plaques étaient enduites d'extraits H. pylori (5 pig/ml) dans du tampon carbonate. Un sérum de contrôle de souris dirigé contre l'extrait d'H. pylori a été introduit dans chaque expérience. Le titre correspond à l'inverse de la dilution donnant une DO de 1,5 à 490 nim. lB- Résultats Les résultats sont présentés dans les Figures 1 à 4 décrites ci-avant et commentées comme suit: La Figure 1 montre que lorsque l'on utilise la voie sous-cutanée, de bien meilleurs résultats sont obtenus en termes de réponse locale, à la fois dans les glandes salivaires et dans l'estomac, si l'administration a eu lieu dans la partie postérieure de

la souris c'est à dire dans la région sous-lombaire.

Avant tout commentaire au sujet des Figures 2 à 4, on note que ces figures présentent les résultats obtenus avec l'antigène utilisé sous forme adjuvantée par de la toxine cholérique et administré par voie intragastrique. Cette expérience est dite expérience de référence standard dans la mesure o l'association de l'art antérieur CT / IG est

celle qui donne les meilleurs résultats à ce jour.

La Figure 2 compare les résultats obtenus avec une préparation de bactéries inactivées sans adjuvant, par voie intragastrique et voie souscutanée. Il est clair que de bien meilleurs résultats sont obtenus lorsque l'on utilise la voie sous-cutanée en ciblant la région sous- lombaire. De plus, les resultats obtenus après administration par voie sous-cutanée sont identiques, sinon légèrement meilleurs que ceux que l'on obtient dans l'expérience de référence standard avec la même préparation cette fois-ci adjuvantée par de la toxine cholérique et administrée par voie

intragastrique.

De plus, on fait référence aux expériences (a) à (e) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 2 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour -24 - l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 0/8, (b) 4/8, (c) 4/8, (d) 0/8 et (e) 10/10. Ceci est en accord avec ce qui a été conclu au paragraphe précédemment; à savoir que l'expérience (b) conduit à des résultats similaires à ceux

obtenus lors de l'expérience de référence standard.

La Figure 3 montre qu'une préparation d'uréase encapsulée dans des liposomes DC-

chol et administrée par voie sous-cutanée dans la région sous-lombaire donne d'aussi

bons résultats que ceux obtenus dans l'expérience de référence standard.

De plus, on fait référence aux expériences (a) à (d) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 3 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 5/10, (b) 4/10, (c) 0/10 et (d) 10/10. Ceci est en accord avec ce qui a été conclu au paragraphe précédemment; à savoir que l'expérience (a) conduit à des résultats similaires à ceux

obtenus lors de l'expérience de référence standard.

* La Figure 4 montre qu'une préparation d'uréase adjuvantée par le QS-21 et administrée par voie sous-cutanée dans la région sous-lombaire donne d'aussi bons

résultats que ceux obtenus dans l'expérience de référence standard.

De plus, on fait référence aux expériences (a) à (d) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 4 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 1/8, (b) 5/8, (c) 0/8 et (d) 10/10. Ceci est en accord avec ce qui a été conclu au paragraphe précédemment; à savoir que l'expérience (b) conduit à des résultats similaires à ceux

obtenus lors de l'expérience de référence standard.

Le tableau ci-après présente les quantités d'IgA, IgGI et IgG2a induites lors des expériences dont les résultats en termes d'activité uréase sont reportés dans les Figures 2 à 4 ainsi que le nombre de souris dont l'activité uréase est caractérisée par une DO inférieure à 0.1 après 4 et 24 hrs après sacrifice. Les quantités d'IgA, IgG 1 et

IgG2a sont exprimées en titre ELISA.

uréase + CT WC WC + CT WC uréase + uréase + QS-21 lipo DC-chol

IG IG IG SC SC SC

IgA 45 91 107 63 0 1 IgG 1 65700 1920 349 1273146 620000 2970399 IgG2a 20200 399 3440 42900 321000 1136095

DO < 0.1 5/10 0/8 5/8 6/8 5/10 6/8

4 hrs

DO < O. I 4/10 0/8 4/8 4/8 5/10 5/8

24 hrs o Co O0

- 26 -

Exemple 2: Etudes d'immunisation chez les singes 2A - Matériel et méthodes Singes Vingt huit singes (Macacafascicularis) âgés de 2 ans et originaires de l'île Maurice ont été utilisés dans cette étude. Avant de sousmettre les singes aux différents protocoles d'immunisation décrits ci-après, une biopsie a révélé que la plupart d'entre eux étaient infectés de manière chronique par des organismes proches de

Gastrospirillum hominis (GHLO) ou de H. heilmanii.

Protocoles d'administration Puisque presque tous les singes étaient infectés par des GHLO, on a décidé de tester l'efficacité de différents protocoles en thérapie. Trois protocoles ont été mis en oeuvre, tels que résumés dans le tableau ci après: Groupe J0 J21 J42 J63 Iet lu IN + IG IN + IG IN + IG IN + IG 2et2u IM IM IM IM 3 et3u IM IN + IG IM IN+IG On précise que l'administration par voie intramusculaire a été effectuée dans les

muscles dorso-lombaires.

Antigènes et adjuvants Dans la mesure o il existe une réactivité croisée entre les GPLO et H. pylori, on a choisit d'utiliser une préparation de bactéries H. pylori inactivées, telle que décrite dans l'exemple 1IA, seule ou en combinaison avec de l'uréase recombinante préparée selon la méthode référencée dans l'exemple 1 A. La heat-labile toxine d'E. coli (LT) (Sigma) ou la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) (Pasteur Mérieux sérums & vaccins) a été utilisé comme adjuvant mucosal tandis que le DC-chol a été utilisé comme adjuvant parentéral. De la poudre

de DC-chol est simplement réhydratée par une préparation d'antigène.

- 27 -

Les doses utilisées sont comme suit: Voie Germes Urease DC-chol LT CTB IG 400 ig 2,5 mg 25g -g IN 400 lg 400 lag 25 ng 25 pg IM 400 ag 100 lig 400g - -g Biopsies, test uréase et étude bactériologique / histologique On a effectué une biopsie sur chacun des singes avant et après immunisation (un mois après le troisième rappel). A partir des biopsies, un test uréase et une étude

histologique ont été mis en oeuvre.

L'activité uréase est évaluée en utilisant le kit Jatrox (Procter & Gamble).

L'importance de cette activité est estimée comme suit, de manière décroissante: niveau 3, coloration rose apparaissant au cours des 10 premières minutes; niveau 2, coloration rose apparaissant entre 10 et 30 minutes après l'adjonction des réactifs; niveau 1, coloration rose apparaissant entre 30 min et 4 hrs et niveau 0, coloration

faible ou inexistante après 4 hrs.

Les études histologiques ont été réalisées à partir de biopsies fixées dans du formol et la charge bactérienne quantifiée comme suit: absence de bactéries (0); quelques bactéries de type Helicobacter (0,5); d'assez nombreuses bactéries (1); de nombreuses bactéries (2); de très nombreuses bactéries (3). Une différence d'un niveau (de 1 à 2 par exemple) correspond à un nombre 5 fois plus important de bactéries. Analyse de la réponse par test ELISA

Un test ELISA est mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1A.

lB - Résultats Le tableau ci-dessous est relatif à la charge bactérienne qui, avant et après immunisation, est appréciée à l'aide de deux tests: (i) en évaluant l'activité uréase et (ii) en effectuant une étude histologique. Les résultats y afférant sont présentés dans les colonnes 3 à 6. Les trois dernières colonnes indiquent pour chaque groupes (contrôle, 1, 2 ou 3) le nombre de singes pour lesquels la charge bactérienne reste -28- inchangée après immunisation (u+) d'après les deux tests; ou apparaît moindre (U) ou accrue () dans au moins un des deux tests, l'autre test indiquant une charge bactérienne stationnaire. Lorsque les résultats des deux tests vont dans le même sens,

la flèche ascendante ou descendante est double.

Activité Uréase Histologie Variation

Singes Groupe avant après avant après Z -

immunisation immunisation

H 282 C 2-2 3-2 2 3-2

J 005 C 2-2 2-1 2 1-0 1/4 1/4 2/4

J 852 C 0-0 2-0 0 1-1 (2/4 7171)

J476 C 0-0 2-0 0 1-1

H 799 I 2-2 2-2 2 2-2

J 845 I 2-2 3-2 2 2-1

J 205 I 1-1 2-2 0!

J 328 I 2-2 1-2 3 3-2 1/8 5/8 2/8

J 197 lu 2-2 3-2 2 3 (1/8 171) H 025 I u 2-2 2-2 I I -I G 460 I u 2-2 3-2 3 2-3 J 607 l u 2-2 2-2 2 2

H 549 2 3-3 2-2 3 2-3

H 622 2 3-3 I- I 2 2-3

H 504 2 3-3 -1 I 2 2- I

H 798 2 1-1 0-1 I 1-1

J 367 2u 2-2 2-1 3 2-3 6/8 1/8 1/8 G 486 2u 2-2 2-2 I 2-2 J 522 2u 2- 2 0-0 2 2-2 G 722 2u 3-3 2-0 2 2-3

H 820 3 3-3 2-2 3 2-2

J 557 3 2-2 I-0 2 I-2*

H 588 3 2-2 2-0 3 1-2

J 153 3 3-3 3-3 2 3-3 5/8 0 3/8

H 480 3u 2-2 2-2 2 3-3 (3/8 ISJ) J 344 3u 3-3 2-0 3 2-2 H 710 3u 2-2 2-2 2 3-3 J 262 3u 3-3 2-2 3 3-2 -29 - Ainsi, ce tableau révèle que dans le groupe ayant été soumis à un protocole d'immunisation par la voie mucosale stricte, les résultats sont sensiblement identiques à ceux obtenus avec le groupe contrôle négatif. Par contre, dans les groupes ayant été soumis à un protocole d'immunisation par voie mixte mucosale et intramusculaire ou par la voie intramusculaire stricte, on observe une nette réduction de la charge bactérienne. Ceci met en lumière l'importance des conditions d'immunisation et en particulier de la voie d'immunisation; et en conséquence, on recommende l'usage d'un protocole d'immunisation mettant en oeuvre la voie parentérale ciblée dans la région sous- diaphragmatique, afin d'obtenir un effet protecteur. Ces résultats sont à mettre en perspective avec d'autres résultats relatifs aux taux d'anticorps sériques qui sont présentés dans la Figure 5. Cette figure montre que que le schéma d'immunisation par voie mucosale stricte (1 et lu) conduit à des résultats très similaires à ceux du groupe contrôle négatif. Par contre, le schéma d'immunisation par voie mixte mucosale et intramusculaire (2 et 2u) et mieux encore le schéma d'immunisation par voie intramusculaire stricte (3 et 3u), permet d'induire

des taux d'anticorps nettement supérieurs à ceux du groupe contrôle.

Ainsi, une réponse sérique importante peut être corrélée à un effet protecteur, tandis qu'a contrario, une faible réponse est liée à l'absence d'effet protecteur. Les conditions d'immunisation permettant d'obtenir l'effet désiré (réponse sérique importante et effet protecteur) inclut l'usage de la voie parentérale ciblée dans la

région sous-diaphragmatique ou celui d'un adjuvant Thl.

-30 -

Claims (20)

Revendications

1. L'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à l'induction d'une réponse immune de type T helper 1 (Thl) à l'encontre d'Helicobacter, pour prévenir ou traiter

une infection à Helicobacter chez un mammifère.

2. L'usage selon la revendication 1, dans lequel la réponse immune de type Thl est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGl chez la souris supérieur ou égal à 1: 100 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a

: IgA chez la souris supérieur ou égal à 1: 100.

3. L'usage selon la revendication 2, dans lequel la réponse immune de type Thl est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGI chez la souris supérieur ou égal à 1: 10 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a:

IgA chez la souris supérieur ou égal à 1: 10.

4. L'usage selon la revendication 3, dans lequel la réponse immune de type Thl caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGl chez la souris supérieur ou égal à 1: 2 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgA

chez la souris supérieur ou égal à 1: 2.

5. L'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie systémique, dans la partie d'un mammifèere, notamment d'un primate, située

sous son diaphragme, pour traiter ou prévenir une infection à Helicobacter.

6. L'usage selon la revendication 5, dans lequel la composition est capable d'induire une réponse immune de type Thl, lorsqu'elle est administrée par voie

systémique sous-diaphragmatique.

7. L'usage selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la réponse immune de type Thl est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGI supérieur ou égal à 1 100 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgA

supérieur ou égal à 1: 100.

-31 - 8. L'usage selon la revendication 7, dans lequel la réponse immune de type Thl est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgG1 chez la souris supérieur ou égal à 1: 10 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a:

IgA chez la souris supérieur ou égal à 1: 10.

9. L'usage selon la revendication 8, dans lequel la réponse immune de type Thl caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgG I chez la souris supérieur ou égal à 1: 2 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgA

chez la souris supérieur ou égal à 1: 2.

10. L'usage selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel l'agent immunogène

dérivé d'Helicobacter est sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide, un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée, une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression et un vecteur vaccinal comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter plaçée sous le contrôle des éléments

nécessaires à son expression.

Il. L'usage selon la revendication 10, dans lequel l'agent immunogène dérivé

d'Helicobacter est la sous-unité UreB ou UreA de l'uréase d'Helicobacter.

12. L'usage selon la revendication 10, dans lequel l'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal comportant une

séquence codant pour la sous-unité UreB ou UreA de l'uréase d'Helicobacter.

13. L'usage selon la revendication 10, 11 ou 12, dans lequel l'agent immunogène

est dérivé d'Helicobacterpylori.

14. L'usage selon l'une des revendications 5 à 13, dans lequel la composition

pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systémique stricte.

15. L'usage selon l'une des revendications 5 à 14, dans lequel la composition

pharmaceutique est destinée à être administrée par une voie systémique

- 32 -

sélectionnée parmi la voie sous-cutanée, la voie intramusculaire et la voie intradermique.

16. L'usage selon l'une des revendications 5 à 15, dans lequel la composition

pharmaceutique est destinée à être administrée dans la région dorsolombaire

dudit mammifèere.

17. L'usage selon l'une des revendications 5 à 16, dans lequel la composition

pharmaceutique est destinée à être administrée deux ou trois fois par voie systémique au cours d'un même traitement, afin de prévenir ou de traiter une

infection à Helicobacter.

18. L'usage selon l'une des revendications 5 à 17, dans lequel l'agent immunogène

est sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide, un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée et est en outre associé avec au moins un composé capable de

favoriser l'induction d'une réponse immune de type Th l.

19. L'usage selon la revendication 18, dans lequel le composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl, est sélectionné parmi des

liposomes; des microsphères; le QS-21; le DC-chol et le Bay R1005.

20. L'usage selon la revendication 19, dans lequel le composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl, est sélectionné parmi le QS-21

le DC-chol et le Bay R1005.

21. L'usage selon la revendication 20, dans lequel l'agent immunogène est associé avec au moins deux composés capables de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl; le premier composé étant sélectionné parmi des liposomes ou des microsphères et le deuxième composé étant sélectionné parmi

le QS-21; le DC-chol et leurs équivalents.

22. L'usage selon la revendication 18, dans lequel l'agent immunogène est un peptide ou un polypeptide qui est associé par liaison covalente avec au moins un lipide capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl,

de manière à former un conjugué lipopeptide ou polypeptide lipidé.