CZ361799A3

CZ361799A3 - Použití imunogenní látky odvozené od bakterie rodu Helicobacter a způsob prevence nebo léčby infekcí způsobených těmito bakteriemi

Info

Publication number: CZ361799A3
Application number: CZ19993617A
Authority: CZ
Inventors: Bruno Guy; Jean Haensler; Cynthia K. Lee; Richard A. Weltzin; Thomas P. Monath
Original assignee: Merieux Oravax
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2000-07-12

Abstract

Předmětem navrhovaného řešení je specifické použití imunogenní látky, odvozené od bakterie rodu Helicobacter, určené pro indukci ochranné imunitní odpovědi Th-1 typu u savců, namířené proti patogenním organizmům infikujícím sliznice, konkrétně proti bakteriím rodu Helicobacter. Nejlepších výsledků je dosaženo při podání přípravku systémovou nebo parenterální cestou, nejraději v části těla savce umístěné pod bránicí. Předmětem řešení je dále imunizaění schéma zahrnující primární imunizaci slizniční cestou a několik sekundárních zesilujících dávek podaných parenterálně.

Description

POUŽITÍ IMUNOGENNÍ LÁTKY ODVOZENÉ OD BAKTERIE RODU HELICOBACTER A ZPŮSOB PREVENCE NEBO LÉČBY INFEKCÍ ZPŮSOBENÝCH TĚMITO BAKTERIEMI.

Oblast techniky

Předmětem navrhovaného vynálezu je specifické použití očkovacího přípravku, určeného pro indukci ochranné imunitní odpovědi u savců, namířené proti patogenním organizmům infikujícím sliznice, konkrétně proti bakteriím rodu Helicobacter.

Dosavadní stav techniky

Bakterie rodu Helicobacter jsou Gram-negativní bakterie spirálovitého tvaru. Některé druhy, například H. pylori, H. heiltnanii, H. felis a H. nmstelae, kolonizují gastrointestinální trakt savců. Ačkoliv je s infekcemi u člověka nejčastěji asociován druh H. pylori, byly již v některých řídkých případech izolovány u člověka i druhy H. heilmani a, H. felis. Dále byla u člověka popsána také bakterie Gastrospirillum hominis, blízká příbuzná rodu Helicobacter. Helicobacter infikuje více než 50 % dospělé populace ve vyspělých zemích a téměř 100 % dospělé populace v rozvojových zemích. Z toho důvodu je Helicobacter považován za jednoho z nečastějších původců infekčních chorob na celém světě.

H. pylori byl dosud u člověka pozorován výhradně na povrchu žaludeční sliznice, konkrétně v oblasti dolíčkovitých lézí dvanáctníkových a žaludečních vředů. Tato bakterie je v součastné době považována za původce antrální gastritidy a pravděpodobně je také jedním z kofaktorů nezbytných pro vznik vředů. Navíc $e zdá, že je s přítomností H. pylori asociován i rozvoj karcinomu žaludku.

Je tedy velmi žádoucí vyvinout vakcínu vhodnou pro prevenci a léčbu infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter.

Dosud bylo navrženo již několik proteinů Helicobacter sp. pro použití ve funkci antigenů pro vakcinaci. Běžně doporučovaný způsob vakcinace zahrnuje dopravení antigenů na žaludeční sliznici, která je právě tím místem, kde je imunitní odpověď nejvíce žádoucí. Pro tento způsob vakcinace bylo zvoleno orální podání očkovací látky.

V poslední době byl navržen další způsob indukce imunitní odpovědi na úrovni žaludku, a to podání antigenů prostřednictvím jiné sliznice než žaludeční, například nosní nebo rektální sliznice (např. WO 96/31235). Lymfocyty stimulované antigenem v tzv. indukční oblasti sliznice mohou cirkulovat a migrovat selektivně do tzv. efektorových oblastí sliznice a tam indukovat imunitní odpověď.

Modifikací některé ze zmíněných metod je způsob imunizace, kdy poprvé je podán antigen systémovou cestou a následně potom znovu prostřednictvím nosní sliznice.

Pro podávání slizniční cestou je antigen, nejčastěji bakteriální lyzát nebo purifikovaný protein, smíšen s vhodným adjuvans, například s cholera-toxinem (CT) nebo s teplotně labilním toxinem (LT) z £. coli.

Po podání antigenu slizniční cestou je následně pozorovaná humorální odpověď převážně typu IgA. To také samozřejmě dokazuje, že se jedná o lokální imunitní odpověď.

Někteří autoři již velmi brzy uvažovali o tom, že existuje dobrá korelace mezi silnou odpovědí IgA typu a ochrannými účinky (Czinn et al., Vaccine (1993) 11:637). Názory jiných byly o něco rezervovanější (Bogstedt et al., Clin. Exp. Immunol. (1996) 105:202). Ačkoliv zmíněná hypotéza dosud nebyla s jistotou potvrzena, považuje většina autorů indukci protilátkové odpovědi IgA typu přesto za žádoucí.

Obecně indikuje výskyt protilátek typu IgA imunitní odpověď zprostředkovanou pomocnými T lymfocyty 2. typu (Th-2 odpověď).

Samozřejmě stimulací Th lymfocytů nějakým konkrétním antigenem lze získat různé subpopulace Th buněk, charakterizované produkcí různých cytokinů. Th-1 buňky selektivně produkují interleukin-2 (IL-2) a interferon-γ (IFN-γ), zatímco Th-2 buňky produkují především IL-4, IL-5 a IL-10. Díky produkci odlišných typů cytokinů hrají tyto dva typy pomocných T buněk v indukci imunitní odpovědi různé role: Th-1 buňky podněcují buňkami zprostředkovanou imunitní odpověď, tj. zánětlivý typ imunitní odpovědi, zatímco Th-2 buňky stimulují humorální odpověď IgA a IgE typu a některých podtypů IgG. Je také známo, že cytokiny produkované myšími Th-1 buňkami mohou stimulovat protilátkovou odpověď; konkrétně že interferon-γ může indukovat IgG2a odpověď. Na základě dosud získaných poznatků o imunitní odpovědi lze říci, že pro dosažení ochranného efektu je zásadní, ne-li plně dostačující, indukce Th-2 odpovědi charakterizovaná produkcí IgA protilátek.

Překvapivě bylo zjištěno, že i když Th-2 odpověď není poškozující, je nezbytné vyvolat také silnou Th-1 odpověď. A skutečně, experimentální výsledky nyní potvrzují, že ochranný efekt lépe koreluje s Th-1 odpovědí než s Th-2 odpovědí.

• · /

V rozporu s dříve publikovaným názorem (D'Elios et al., J. Immunol. (1997) 158:962) odhaluje navrhovaný vynález nezbytnost indukovat v době imunizace zánětlivou odpověď Th-1 typu, bez které nemůže být dosaženo ochranného účinku.

Podstata vynálezu

Předmětem navrhovaného vynálezu je:

(i) použití imunogenní látky, odvozené od mikroorganizmu, schopného infikovat gastroduodenální sliznici u savců; například od bakterie rodu Helicobacter, pro přípravu farmaceutického prostředku určeného pro indukci imunitní odpovědi Th-1 typu, namířené proti zmíněnému mikroorganizmu; například proti bakterii rodu Helicobacter, pro prevenci a léčbu infekce, například infekce způsobené bakteriemi Helicobacter, u savců a (ii) způsob prevence a léčby infekce, vyvolané mikroorganizmem, schopným infikovat gastroduodenální sliznici savců, například infekce vyvolané bakterií rodu Helicobacter, podle kterého je savci v jedné nebo několika dávkách podána imunogenní látka odvozená od zmíněného mikroorganizmu, například Helicobacter a kterým je vyvolána imunitní odpověď Th-1 typu, namířená proti např. bakterii rodu Helicobacter.

Indukce užitečné Th-1 odpovědi může být pro účely navrhovaného vynálezu demonstrována stanovením relativní úrovně Th-1 odpovědi vzhledem k Th-2 odpovědi, například porovnáním hladin IgG2a a IgGl indukovaných u myši imunizací antigenem odvozeným od bakterie rodu Helicobacter. Hladina IgG2a je totiž indikátorem Th-1 odpovědi a hladina IgGl je indikátorem Th-2 odpovědi. Předpokládá se, že Th-2 odpověď nemusí vzhledem k Th-1 odpovědi výrazně převažovat. Hladiny IgG2a a IgGl, indukované u myši, mohou být stanoveny běžným ELISA testem za předpokladu, že jsou testy pro oba subisotypy imunoglobulinů stejně citlivé a že mají anti-IgG2a a anti-IgGl protilátky ke svým antigenům stejnou afinitu.

Množství IgG2a a IgGl může být měřeno pomocí ELISA testu, který je identický nebo podobný tomu, který je popsán dále. Jamky polykarbonátové ELISA destičky jsou potaženy 100 μΐ bakteriálního extraktu z Helicobacter, například Helicobacter pylori, v koncentraci asi 10 pg/ml uhličitanového pufru. ELISA mikrotitrační destička je inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C a poté přes noc při teplotě 4 °C. Destička je poté promyta PBS pufrem (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBS/Tween pufr). Jamky jsou • · naplněny 250 μΐ PBS s 1% hovězím sérovým albuminem (BSA). Tímto krokem se předchází nespecifickým vazbám protilátek. Destička je inkubována 1 hodinu při teplotě 37 °C a poté promyta PBS/Tween pufrem. Antisérum, odebrané myši několik dní poté, kdy byl této podán prostředek určený pro indukci Th-1 odpovědi proti Helicobacter sp., je sériově rozředěno v PBS/Tween pufru. Do jamek je napipetováno antisérum v množství 100 μΐ zředěného antiséra na jamku a destička je inkubována 90 minut při teplotě 37 °C. Poté je destička promyta a vyhodnocena standardním způsobem. Může být použita například kozí sekundární protilátka proti myšímu IgG2a nebo IgGl s navázaným enzymem, například s peroxidázou. Se sekundární protilátkou je destička inkubována po dobu 90 minut při teplotě 37 °C. Destička je poté promyta a je vyvolána reakce s odpovídajícím substrátem, například O-fenyldiamindihydrochloridem (pokud je použitým enzymem peroxidáza). Intenzita reakce je vyhodnocena kolorimetricky měřením absorbance na spektrofotometru. Titr IgG2a nebo IgGl odpovídá reciproké hodnotě ředění, vykazujícího při vlnové délce 490 nm absorbanci 1,5.

Indukce užitečné Th-1 odpovědi podle navrhovaného vynálezu je charakterizována poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl, stanoveným v myším antiséru, větším než 1/100, 1/50 nebo 1/20, s výhodou větším než 1/10, ještě raději větším než 1/3, nejraději pak větším než 1/2, 5 nebo 10. Je-li poměr blízký 1, říkáme že se jedná o TH-l/Th-2 smíšenou nebo vyrovnanou odpověď. Je-li tento poměr větší nebo roven 5, říkáme že jde o převažující Th-1 odpověď.

Podle intenzity indukce Th-1 (nebo Th-2) odpovědi u myši lze předpovědět intenzitu Th-1 (nebo Th-2) odpovědi u člověka. Ačkoliv je snazší hodnotit typ imunitní odpovědi u myší, lze provádět toto hodnocení i u člověka, a to stanovením hladin cytokinů, specifických pro Th-1 odpověď na straně jedné a Th2 odpověď na straně druhé. Vzájemný poměr indukce Th-1 a Th-2 odpovědi může být u člověka stanoven přímo na základě stanovení hladiny cytokinů, specifických pro jednotlivé typy odpovědi (viz. výše), například na základě stanovení poměru IFN-y/IL-4.

Alternativně, pokud je použita testovací metoda popsaná výše, je možné předpovědět, že ELISA titr odrážející množství IgG2a by měl být větší nebo roven 10 000, raději pak větší nebo roven 100 000, nejraději pak větší nebo roven 1 000 000; v takovém případě je Th-1 odpověď signifikantní.

Savec, pro kterého je farmaceutický přípravek a způsob imunizace určen, je s výhodou primát, nejraději pak člověk.

Je možné indukovat Th-1 odpověď proti Helicobacter sp. regulací celé řady faktorů, jako například modifikací způsobu podávání. Bylo prokázáno, že • ·· · • · · · · · · ···· • · ······· • · · · · ·· ······ • · · · · · · « ··· ·· ·· · »· ·· ·· z

použitím systémového nebo parenterálního způsobu podání prostředku lze dosáhnout podobné nebo vyšší úrovně ochrany, než jaká byla pozorována při podávání slizniění cestou.

V souladu s výše uvedenými údaji je předmětem navrhovaného vynálezu především:

(i) použití imunogenní látky, odvozené od bakterie rodu Helicobacter, pro přípravu farmaceutického prostředku určeného pro systémové nebo parenterální podávání savcům, především primátům, do míst umístěných pod jejich bránicí, za účelem léčby nebo prevence infekce vyvolané Helicobacter sp. a (ii) způsob prevence a léčby infekce, vyvolané bakterií rodu Helicobacter u savců, podle kterého je savci v jedné nebo několika dávkách podána systémovou nebo parenterální cestou alespoň jedna imunogenní látka odvozená od Helicobacter sp.

Co se týká způsobu prevence a léčby podle vynálezu, bylo zjištěno, že je pro indukci požadované imunitní odpovědi s výhodou jednou nebo několikrát, nejraději dvakrát, opakovat podání imunogenní látky systémovou nebo parenterální cestou. Preferovaným způsobem pro dosažení požadovaného ochranného účinku je způsob, podle kterého je imunogenní látka podávána výhradně systémovou nebo parenterální cestou (striktně systémová cesta). „Způsob podle kterého je podávání imunogenní látky prováděno striktně systémovou cestou“ je zde definován jako způsob, který nevyužívá pro podávání imunogenní látky jiné než systémové cesty. Například způsob podle kterého je imunogenní látka podávána systémovou i slizniění cestou neodpovídá výše uvedené definici. Jinými slovy definice „způsob podle kterého je podávání imunogenní látky prováděno striktně systémovou cestou“ označuje způsob podle kterého je imunogenní látka podávána systémovou cestou s vyloučením jakékoliv jiné cesty, zejména slizniění.

Dále je s výhodou, pokud je imunogenní látka podávána systémovou nebo parenterální cestou v subdiafragmatické části těla savce.

Imunogenní látka odvozená od Helicobacter sp. je s výhodou vybrána ze skupiny obsahující inaktivované bakterie Helicobacter sp., buněčný lyzát Helicobacter sp. a purifikované peptidy a polypeptidy pocházející z Helicobacter sp. Imunogenní látkou může být také molekula polynukleotidů, především molekula DNA nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v savčích buňkách. Alternativně může být imunogenní látkou virový vakcinaění

• · · · · · · • · · · · · * · • · · · ♦ · · • · ·· · · · · · · • · · · · »· · · · · · ·· vektor nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v savčích buňkách.

Pro účely navrhovaného vynálezu mohou být inaktivované bakterie získány v oboru běžně používanými metodami. Totéž platí i pro bakteriální lyzát. Dávka inaktivovaných bakterií nebo buněčného lyzátu, vhodná pro prevenci či léčebné účely, musí být určena odborníky a je závislá na množství různých faktorů, jako je například jedinec pro kterého je vakcína určena, například stáří tohoto jedince; dále povaha antigenu samotného, způsob a režim podávání antigenu, přítomnost či nepřítomnost pomocné látky (adjuvans) a případně typ adjuvans atd. Obecně bylo zjištěno, že odpovídající dávka je v rozmezí od 50 gg do 1 mg lyzátu.

Peptid nebo polypeptid odvozený od bakterií Helicobacter sp. může být získán přímou purifikaci z buněk Helicobacter sp., nebo metodami genového inženýrství, nebo alternativně i chemickou syntézou. Metody genového inženýrství a chemické syntézy mohou být výhodné v případě peptidových antigenů.

Termínem „peptid“ je označován jakýkoliv aminokyselinový řetězec, který ie kratší než 50 aminokyselin. Pokud je délka aminokyselinového řetězce větší než 50 aminokyselin, používá se pro jeho popis termín „polypeptid“, který je vzájemně zaměnitelný s termínem „protein“. Peptid nebo polypeptid, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu je identický nebo podobný peptidu či polypeptidu, který existuje v přirozených podmínkách. Podobnost spočívá v tom, že je schopen indukovat imunitní odpověď stejného typu, ale může zahrnovat určitou strukturní variabilitu, jako například mutaci, adici zbytku lipidové povahy nebo se může jednat o fúzní peptid nebo polypeptid.

Dávka peptidu nebo polypeptidu, vhodná pro prevenci či léčebné účely, musí být určena odborníky a je závislá na množství různých faktorů, jako je například jedinec pro kterého je vakcína určena, například stáří tohoto jedince; dále povaha antigenu samotného, způsob a režim podávání antigenu, přítomnost či nepřítomnost pomocné látky (adjuvans) a případně typ adjuvans atd. Obecně bylo zjištěno, že odpovídající dávka je v rozmezí od 10 gg do 1 mg, nejčastěji okolo 100 gg.

Molekulou DNA, vhodnou pro použití podle vynálezu, je s výhodou plazmid, který není schopen samostatné replikace ani integrace do savčího genomu. Výše zmíněná kódující sekvence je umístěna pod kontrolu promotoru, umožňujícího expresi v savčích buňkách. Tento promotor může být všudypřítomný, nebo specifický pro danou tkáň. Ze skupiny všudypřítomných (univerzálních) promotorů můžeme zmínit například časný promotor cytomegaloviru (popsaný v z

• · · · · · • · · · · · • · · · · * · · · • · · · «· · · · ·

US Patent no. 4,168,062) a promotor viru Rousova sarkomu (popsaný v Norton & Coffin, Mol. Cell Biol. (1985) 5:281). „Desmin“ promotor (Li et al., Gene (1989) 78:244443; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403), který je selektivním promotorem, umožňuje expresi ve svalových buňkách a v buňkách kůže. Specifickým promotorem pro svalové buňky je například promotor genu pro myozin nebo dystrofin. Plazmidové vektory, které mohou být použity podle navrhovaného vynálezu jsou popsány například v WO 94/21797 a v Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7:1205.

Ve farmaceutickém prostředku, vhodném pro použití podle navrhovaného vynálezu, může být molekula nukleotidu, například DNA, předem zpracována, nebo nikoliv. Existuje celá řada možných způsobů přípravy molekuly nukleotidu. Molekula DNA může být například jen jednoduše zředěna ve fyziologicky přijatelném roztoku s obsahem nosiče nebo bez něj. Pokud je nosič přítomen, může být izotonický nebo slabě hypertonický a může mít nízkou iontovou sílu. Tyto podmínky splňuje kupříkladu roztok sacharózu, například 20%. Alternativně může být polynukleotid zkombinován s činidlem, které usnadňuje jeho vstup do buňky. Takovým činidlem může být (i) chemická látka, která modifikuje permeabilitu buněčné stěny, například bupivacaine (viz. například WO 94/16737) nebo (ii) látka, která je smíšena s polynukleotidem a která působí jako nosič usnadňující transport polynukleotidu. Příkladem druhého typu mohou být kationtové polymery jako například polylyzin nebo polyamin, např. deriváty sperminu jako spermidin (viz. WO 93/18759). Mohou to být ale také fusogenní peptidy, například GALA nebo Gramicidin S (viz. WO 93/19768), nebo alternativně peptidy odvozené od virových fúzních proteinů.

Mohou to být také aniontové nebo kationtové lipidy. O aniontových nebo neutrálních lipidech je již delší dobu známo, že mohou sloužit jako transportní látky, například ve formě lipozómů, vhodné pro velké množství sloučenin včetně polynukleotidů. Detailní popis zmíněných lipozómů, jejich základních složek a způsobů jejich výroby je uveden například v: Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed., IRL press (1990).

Kationtové lipidy jsou také známé a jsou běžně používány jako transportní látky pro polynukleotidy. Můžeme zde uvést například Lipofectin™, známý také jako DOTMA (N-[l -(2.3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid),

DOTAP (1.2-bis(dioleyloxy)-3-(trimethylamonio)propan), DDAB (dimethyldioktadecylamoniumbromid), DOGS (dioktadecylamidoglycylspermin) a deriv8ty cholesterolu jako D-chol (3-beta-(N-(N',N'dimethylaminoethan)carbamoyl)cholesterol). Popis zmíněných lipidů je uveden v ·· · 4 4 4 4 4 4*4 • · 4 4 4 4 4 4 4 ·· 44 4 4 4444·· • 44 4 4 · 9 φ

444 44 444 44 99 44

EP 187,702, WO 90/11092, US Patent No. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 a US Patent No. 5,527,928. Kationtové lipidy jsou nejraději používány spolu s neutrálními lipidy jako je DOPE (dioleylfosfatidylethanolamin), viz. například WO 90/11092.

Zlaté nebo wolframové mikročástice mohou být také použity ve funkci transportních látek tak jak je to popsáno například v WO 91/359, WO 93/17706 a Tang et al., Nátuře (1992) 356:152. V tomto konkrétním příkladě je polynukleotid vysrážen na mikročásticích v přítomnosti chloridu vápenatého a spermidinu a výsledná směs je poté jako celek vysokou rychlostí vstříknuta do kůže nebo pokožky, a to s použitím systému bez injekční jehly tak jak je to popsáno v US Patentech č. 4,945,050 a 5,015,580 a WO 94/24243.

Množství DNA, které může být použito pro vakcinaci jedince, závisí na množství faktorů jako například na síle promotoru použitého pro expresi antigenu, imunogenicitě produktu, získaného expresí, stavu savce pro kterého je antigen určen (například hmotnost, věk, celkový zdravotní stav atd.), způsobu podávání a způsobu zpracování DNA. Bylo zjištěno, že při intramuskulárním způsobu podávání je potřebné větší množství DNA než při intradermálním způsobu podávání systémem bez použití injekční jehly. Obecně bylo zjištěno, že odpovídající dávka pro prevenci nebo terapii je u dospělého člověka v rozmezí od 1 pg do asi 5 mg, s výhodou je tato dávka 10 pg až 1 mg, nejraději pak 25 pg až 500 pg.

Vakcinační vektory jako imunogenní agens byly zmíněny již výše. Mezi vektory virového původu patří především adenoviry a poxviry. Příklad vektoru, odvozeného od adenoviru, stejně jako způsob konstrukce vektoru vhodného pro expresi DNA molekuly kódující peptid nebo polypeptid, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu, jsou popsány v US Patent No. 4,920,209. Mezi poxviry, které mohou být použity výše popsaným způsobem, patří vakcinia a kanarypox viry. Tyto viry jsou popsány v US Patentech 4,722,848 a 5,364,773 resp. (viz také např. Tartaglia et al. Virology (1992) 188:217 a Taylor et al., Vaccine (1995) 13:539). Poxviry schopné exprimovat peptidy a polypeptidy, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, mohou být získány homologní rekombinací, tak jak je to popsáno v Kieny et al., Nátuře (1984) 312:163, tak že DNA fragment kódující peptid nebo polypeptid je umístěn v podmínkách vhodných pro expresi v savčích buňkách. Mohou být použity také bakteriální vektory jako žlučový Calmette-Guérin bacil.

• · · 9··· 9·«9 • · 9999999 • · · 99 99 999999

999 999 9 9

999 99 999 «9 ·· ·· t

Dávka virového vektoru, vhodná pro preventivní a terapeutické účely je obecně v rozmezí od 1 x 10⁴ do 1 x 10¹¹, raději pak 1 x 10⁷ až 1 x IO¹⁰, nejraději potom 1 x 10⁷ až 1 x 10⁹ plakotvorných jednotek na 1 kilogram.

Imunogenní látkou, odvozenou od Helicobacter sp., může být kterýkoliv polypeptid z Helicobacter sp., například Helicobacter pylori. Konkrétně se může jednat o polypeptid vyskytující se v cytoplazmě, polypeptid z vnitřní nebo vnější buněčné membrány, nebo o polypeptid vylučovaný bakterií do okolního média. Dodnes bylo v literatuře popsáno množství polypeptidů pocházejících z bakterií rodu Helicobacter, a to buď s odkazem na jejich aminokyselinovou sekvenci, odvozenou od sekvence odpovídajícího klonovaného nebo identifikovaného genu, nebo s odkazem na způsob purifikace, který umožňuje jejich získávání ze zbytků jejich přirozeného prostředí. Za průvodce mohou v konkrétních případech sloužit následující dokumenty: WO 94/26901 a WO 96/34624 (HspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (HpaA), WO 93/181150 (cytotoxin), WO 95/27506 a Házeli et al., J. Gen. Microbiol. (1991) 137:57 (kataláza), FR 2 724 936 (membránový receptor pro lidský laktoferin), WO 96/41880 (AlpA), EP 752 473 (FibA) a O'Toole et al., J. Bact. (1991) 173:505 (TsaA). Další polypeptidy jsou popsány také v WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 a WO 96/33220. Polypeptid, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu, je buď identický s výše citovanými polypeptidy, nebo je jim podobný do té míry, aby byl schopen indukovat imunitní odpověď proti bakteriím rodu Helicobacter. S ohledem na výše citované podmínky může být imunogenním agens i peptid odvozený od některého z výše citovaných polypeptidů.

S výhodou je používán polypeptid vybraný ze skupiny obsahující UreA a UreB podjednotky ureázy z Helicobacter sp. (viz. WO 90/4030). Nejraději jsou použity obě podjednotky tvořící spolu apoenzym ureázu, nebo alternativně i v multimerní formě (WO 96/33732).

Podobně DNA molekula nebo vakcinační vektor, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu zahrnují sekvenci, kódující kterýkoliv peptid nebo polypeptid, popsaný výše.

DNA molekula, nebo raději virový vakcinační vektor, mohou zahrnovat také sekvenci, kódující cytokin, například lymfokin jako interleukin-2 nebo interleukin-12, umístěné pod kontrolou elementů nezbytných pro jejich expresi v savčích buňkách. Alternativou k této možnosti je spojení farmaceutického prostředku, vhodného pro použití podle vynálezu, obsahujícího DNA molekulu nebo vektor s další DNA molekulou nebo s dalším virovým vektorem, kódujícím cytokin.

····

• · · * ·· • · « * « · • · · · · · • · » · ♦·· • · · ·

Farmaceutický prostředek, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu, může obsahovat jednu nebo několik imunogenních látek. Jeden z vhodných prostředků může například obsahovat UreA i UreB podjednotky ureázy Helicobacter sp., například ve formě apoenzymu, stejně jako jeden nebo více polypeptidů vybraných ze skupiny polypeptidů, citovaných výše. Podobně v případě použití DNA molekuly nebo vakcinačního vektoru může prostředek obsahovat několik těchto molekul nebo vektorů, z nichž každý kóduje nějaký konkrétní polypeptid, nebo jedinou molekulu DNA kódující několik peptidů nebo polypeptidů.

Farmaceutický prostředek, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu může navíc obsahovat i jiné sloučeniny než jen imunogenní látky, jejichž povaha závisí do jisté míry na povaze imunogenní látky, inaktivované bakterie, buněčného lyzátu, peptidu, polypeptidu, DNA molekuly nebo vakcinačního vektoru. Jak již bylo zmíněno dříve, v případě použití molekuly DNA může farmaceutický prostředek obsahovat různé látky, nezbytné pro úpravu DNA. Prostředek může dále obsahovat odpovídající pomocné látky (adjuvans), vhodné pro podávání parenterální nebo systémovou cestou, například sloučeniny hliníku jako jsou hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo hydroxid fosforečnan hlinitý. Bylo zjištěno, že inaktivované bakterie obecně nevyžadují žádné adjuvans. Stejně tak nevyžadují adjuvans molekuly DNA. Naopak přítomnost adjuvans je s výhodou, je-li imunogenní látkou bakteriální lyzát, nebo purifikovaný peptid nebo polypeptid. Konečně je-li imunogenní látkou vakcinační vektor, je s výhodou adjuvans nepoužívat aby byla imunitní odpověď proti samotnému vektoru minimalizována.

Kromě již zmíněných sloučenin hliníku existuje celá řada dalších adjuvans, vhodných pro podávání systémovou nebo parenterální cestou, mezi kterými si odborník může snadno vybrat takové, které nejlépe odpovídá aktuální potřebě; konkrétně sloučeninu schopnou podněcovat indukci imunitní odpovědi Th-1 typu nebo vyvážené imunitní odpovědi Th-1 + Th-2 typu. Na tomto místě můžeme zmínit například lipozómy; ISCOMS, mikrosféry, vezikuly s obsahem neiontové povrchově aktivní látky; kationtové amfifilní disperze ve vodě, emulze olej/voda, muramidyldipeptid (MDP) a jeho deriváty jako glukosylmuramidyldipeptid (GMDP), threonyl-MDP, murametid a murapalmitin; a QuilA a jeho subfrakce, stejně jako mnohé další sloučeniny jako monofosforyl-lipid A (MPLA), hlavní polysacharid buněčné stěny bakterií, například E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium nebo Shigella flexneri; algan-glukan; gamma-inulin; kalcitriol a loxoribin.

····

• 99 99 99

9 9 9 9 9 9

99 999 999

9 9 9 9

9 99 9 9 9 9

Lipozómy, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, mohou být vybrány ze skupiny pH senzitivních lipozómů, kam patří například lipozómy připravené smíšením cholesterolhemisukcinátu (CHEMS) s dioleylfosfatidylethanolaminem (DOPE); lipozómy obsahující kationtové lipidy, známé pro své fusiogenní vlastnosti, například 3-beta-(N-(N',N'-dimethylaminoethan)karbamoyl)cholesterol (DC-chol) a jeho ekvivalenty, popsané například v US Patent No. 5,283,185 a WO 96/14831, dimethyldioktadecylamoniumbromid (DDAB) a BAY sloučeniny popsané v EP 91645 a EP 206 037, například Bay R1005 (N-(2-deoxy-2-L-leucylamino-beta-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanoylamid acetát; a dále lipozómy obsahující MTP-PE, lipofilní derivát MDP (muramidyldipeptidu). Výše uvedené lipozómy jsou vhodné pro použití ve funkci adjuvans spolu se všemi citovanými imunogenními látkami. ISCOM, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, mohou být vybrány ze skupiny obsahující QuilA nebo QS-21 v kombinaci s cholesterolem a případně také s fosfolipidem, například fosfatidylcholinem. Zmíněná adjuvans jsou zvláště vhodná pro přípravu antigenů s obsahem lipidu.

Mikrosféry, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, jsou připraveny zejména ze sloučenin jako jsou PLAGA (polylaktid-ko-glykolid), alginát, chitosan, polyfosfazen a z mnohých dalších polymerů.

Mezi proteinové „chochleáty“, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, patří ty, které jsou připraveny z cholesterolu a případně dalšího fosfolipidu, například fosfatidylcholinu. Taková adjuvans jsou zvláště vhodná pro přípravu antigenů s obsahem lipidu.

Vezikuly (váčky) s obsahem neiontové povrchově aktivní látky, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, jsou tvořeny převážně směsí 1-monopalmitoylglycerolu, cholesterolu a dicetylfosfátu. Jsou alternativou k běžným lipozómům a mohou být použity spolu se všemi citovanými imunogenními látkami. Mezi emulze olej/voda, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, patří především MF59 (Biocine-Chiron), SAF1 (Syntex) a montanidy ISA51 a ISA720 (Seppic).

Dalším vhodným adjuvans pro použití podle navrhovaného vynálezu může být frakce výtažku z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molincr, například frakceQS-21 purifikovaná HPLC chromatografií tak jak je to popsáno v US Patent No. 5,057,540. Vzhledem k tomu, že může být frakce QS-21 slabě toxická, je s výhodou používat jí v lipozómech, nejraději na bázi sterolů, tak jak je to popsáno v WO 96/33739.

• · <· ·

9 9 9 • 9 9 9

9 9

9

999 999

Funkci adjuvans může splnit také pouhé přidání lipidu k peptidu nebo polypeptidu podle navrhovaného vynálezu. Kovalentní vazby takového peptidu nebo polypeptidu s lipidem nebo sloučeninou lipidu, schopnou podněcovat indukci imunitní odpovědi Th-1 typu, která vede ke vzniku lipid-obsahujícího lipopeptidu nebo polypeptidového konjugátu, může být dosaženo mnoha v oboru dobře známými způsoby. Například lze použít jednu ze sloučenin, které jsou popsány v EP 431 327, například N-palmitoyl-S-2,3-(bispalmitoyloxy)propylcysteinylseryl serin (Pam₃CSS), který se známým způsobem váže k N-konci peptidu nebo polypeptidu.

Terapeutická nebo preventivní účinnost způsobu nebo použití podle navrhovaného vynálezu je hodnocena standardními technikami, například měřením indukce imunitní odpovědi nebo měřením indukce léčebné nebo ochranné imunity, například s pomocí modelu myš/H. felis a metody popsané v Lee et al., Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (1995) 7:303 nebo Lee et al., J. Infect. Dis. (1995) 172:161. Odborníkům je jistě zřejmé, že na tomto modelu lze H. felis snadno zaměnit i jiným druhem Helicobacter. Například účinnost imunogenní látky odvozené od Helicobacter pylori je vhodné hodnotit na myším modelu s použitím kmene Helicobacter pylori, adaptovaného na myší organizmus. Účinnost imunogenní látky je stanovena porovnáním rozsahu infekce žaludeční tkáně (měřením aktivity enzymu ureázy, stanovením bakteriální zátěže nebo stanovením rozsahu gastritidy) s kontrolní skupinou. O terapeutickém a ochranném účinku lze mluvit v případě, kdy je rozsah infekce v porovnání s kontrolní skupinou redukován.

Farmaceutický prostředek, vhodný pro použití podle navrhovaného vynálezu, je připraven běžně známými metodami. Konkrétně bývá součástí zmíněného prostředku farmaceuticky přijatelný nosič nebo rozpouštědlo, například voda nebo fyziologický roztok. Obecně se rozpouštědlo nebo nosič vybírá na základě způsobu a režimu podávání a v souladu se standardními farmaceutickými postupy. Odpovídající nosiče a rozpouštědla, stejně jako vše ostatní, co je nezbytné pro přípravu farmaceutického prostředku, je popsáno v Remingtorťs Pharmaceutical Sciences, standardní příručce tohoto oboru.

Způsoby podle navrhovaného vynálezu, stejně jako prostředky vhodné pro použití podle vynálezu, mohou být použity pro prevenci nebo léčbu infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter a následně gastroduodenálních poruch asociovaných se zmíněnými infekcemi včetně akutní, chronické nebo atrofické gastritidy a peptických vředů, například žaludečních nebo dvanáctníkových vředů.

• · • 9 9 9 • » · Β • * · · •99 999

9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 99 99 99 /

Systémovým způsobem podávání, který je použit podle vynálezu, je s výhodou parenterální způsob podávání. Parenterální způsob podání může být vybrán ze skupiny obsahující intravenózní, intramuskulární, intradermální, intraepidermální a subkutánní způsob podání; z nichž poslední čtyři jmenované způsoby jsou vhodnější než intravenózní způsob podání. Intramuskulární a subkutánní způsoby podávání jsou zvláště doporučované. Ve všech případech použití farmaceutického prostředku podle vynálezu je vhodné zvolit místo podání tak aby bylo situováno pod bránicí jedince. Dorsolumbální oblast je například velmi vhodným místem pro podání zmíněného prostředku.

Pro dosažení ochranného nebo léčebného účinku může být postup, který zahrnuje podání farmaceutického prostředku, vhodného pro použití podle vynálezu, například subdiafragmatickou systémovou cestou, jedenkrát či několikrát zopakován, přičemž mezi jednotlivými dávkami bývá ponechán jistý časový interval, nejčastěji v řádech týdnů nebo měsíců. Přesné určení tohoto intervalu je věcí odborníků a závisí na celé řadě faktorů jako jsou povaha imunogenní látky, věk pacienta a podobně. V tomto konkrétním případě bylo zvoleno podávání imunogenní látky striktně systémovou cestou. Pro ilustraci můžeme uvést očkovací schéma, které se sestává z podání apoenzymu ureázy subkutánně do dorsolumbální oblasti ve třech po sobě následujících dávkách s intervalem 2 až 3 týdnů. Toto schéma je uvedeno jen pro ilustraci a v žádném případě nikterak nelimituje rozsah vynálezu.

Alternativní cestou je zachování striktně systémového způsobu podávání, ovšem s použitím imunogenních látek, jejichž povaha se v jednotlivých krocích očkovacího procesu mění. Pro ilustraci můžeme uvést očkovací schéma, kde je očkovací látka podávána striktně systémovou cestou a které se sestává ze tří kroků: nejprve je pacientovi podána očkovací látka obsahující pox vektor kódující například UreA a UreB podjednotky ureázy („priming“) a následně je pacientovi dvakrát za sebou podán apoenzym ureáza (zesílení efektu).

Předmětem navrhovaného vynálezu je tedy také farmaceutický prostředek, určený pro léčbu nebo prevenci infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter, zahrnující několik produktů určených pro podání následně po sobě, z niž každý je upraven pro podávání subdiafragmatickou systémovou cestou a každý obsahuje imunogenní látku odvozenou od Helicobacter sp., vybranou nezávisle ze skupiny obsahující inaktivované bakterie Helicobacter sp., buněčný lyzát Helicobacter sp. a purifikované peptidy a polypeptidy pocházející z Helicobacter sp., molekulu DNA nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v

9 9 • · 9

9 9

999 99

9 9 9

9 9 9 • 99 999 • 9 9

9 9 9 • ·

savčích buňkách a virový vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v savčích buňkách. Za předpokladu že první produkt obsahuje peptid nebo polypeptid a druhý produkt obsahuje DNA molekulu nebo vakcinační vektor je s výhodou, když kódující sekvence DNA molekuly nebo vakcinačního vektoru kóduje peptid nebo polypeptid obsažený v prvním produktu. Konečně poslední alternativní způsob vakcinace zahrnuje několik časově odstupňovaných aplikací očkovací látky, například v intervalech týdnů nebo měsíců, přičemž určení vhodných intervalů je v kompetenci odborníků, kdy první dávka je podána subdiafragmatickou systémovou cestou a druhá dávka je podána slizniční cestou jinou než intranasální, například okulární, orální, např. bukální (lícní) nebo žaludeční, pulmonální, intestinální, rektální, vaginální nebo urinální. Jako nelimitující příklad může být uvedeno očkovací schéma, které zahrnuje podání DNA molekuly nebo vakcinačního vektoru subdiafragmatickou systémovou cestou a následně podání polypeptidu žaludeční cestou (přes sliznici žaludku), přičemž DNA molekula nebo vakcinační vektor s výhodou kódují polypeptid, podaný v druhém sledu žaludeční cestou.

Předmětem navrhovaného vynálezu je tedy také farmaceutický prostředek, určený pro léčbu nebo prevenci infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter, zahrnující několik produktů určených pro podání následně po sobě, z niž jeden je upraven pro podání subdiafragmatickou systémovou cestou a další je upraven pro podávání slizniční cestou jinou než intranasální. Každý z produktů obsahuje imunogenní látku odvozenou od Helicobacter sp., vybranou nezávisle ze skupiny obsahující inaktivované bakterie Helicobacter sp., buněčný lyzát Helicobacter sp. a purifikované peptidy a polypeptidy pocházející z Helicobacter sp., molekulu DNA nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v savčích buňkách a virový vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp., umístěnou pod kontrolou elementů nezbytných pro expresi zmíněné sekvence v savčích buňkách. Za předpokladu že první produkt obsahuje peptid nebo polypeptid a druhý produkt obsahuje DNA molekulu nebo vakcinační vektor je s výhodou, když kódující sekvence DNA molekuly nebo vakcinačního vektoru kóduje peptid nebo polypeptid obsažený v prvním produktu. Vakcinační vektor obsažený v produktu určeném pro podání slizniční cestou může být vybrán ze skupiny výše popsaných vektorů, nebo to může být bakteriální vektor jako například Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus a a Streptococcus.

• · · ···· · · · « • · »·«··«· • · · · · · · ·«»··· ··· · · · · * ··· ·· ··· ·· 99 99 /

Netoxické mutantní kmeny Vibrio cholerae, které mohou být použity jako živé vakcinační vektory, jsou popsány například v Mekalanos et al., Nátuře (1983) 306:551 a v US Patent No. 4,882,278 (kmen, u kterého byla podstatná část oblastí kódujících každou ze dvou alel ctxA deletována, takže bakterie nemohou produkovat žádný funkční toxin); WO 92/11354 (kmen u kterého byl irgA lokus inaktivován mutací; tato mutace se může vyskytovat v jednom kmeni společně s mutací ctxA) a WO 94/1533 (mutanta získaná deleci zbývajících funkčních ctxA a attRSl sekvencí). Tyto kmeny mohou být geneticky modifikovány a upraveny pro expresi heterologních antigenů tak jak je to popsáno v WO 94/19482.

Oslabené kmeny Salmonella typhimurium, geneticky modifikované nebo jinak upravené pro expresi heterologních antigenů, stejně jako způsob jejich použití jako očkovacích látek jsou popsány v Nakayama et <z/.,BioTechnology (1988) 6:693 a WO 92/11361.

Další bakterie vhodné pro použití ve funkci vakcinačních vektorů popisují High et al., EMBO (1992) 11:1991 a Sizemore et al., Science (1995) 270:299 (Shigella flexneri); Medaglini et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92:6868 (Streptococcus gordonii)& Flynn J.L., Cell Mol. Biol. (1994) 40 (suppl 1):31, WO 88/6626, WO 90/0594, WO 91/13157, WO 92/1796 a WO 92/21376 (bacil Calmette-Guérin)

U bakteriálních vektorů může být DNA sekvence kódující peptid nebo polypeptid Helicobacter sp. integrována do bakteriálního genomu, nebo může zůstat volná (na plazmidu). Samozřejmě musí být tato sekvence umístěna pod kontrolou mechanizmů, nezbytných pro její expresi v bakteriálním vektoru.

Zmíněné bakteriální vektory, určené pro podávání slizniční cestou, mohou být použity v kombinaci s odpovídající pomocnou látkou (adjuvans). Funkci takového adjuvans mohou splňovat některé bakteriální toxiny jako cholera-toxine (CT), teplotně labilní toxine (LT) z E. coli toxin z Clostridium difficile a Pertrusis toxin (PT), jejich kombinace, podjednotky, toxoidy nebo mutanty, které jsou od nich odvozeny. Například je možné použít purifikovanou frakci nativní podjednotky B cholera toxinu (CTB). Dále je možné použít homology, deriváty a fúzní konstrukty zmíněných toxinů, a to za předpokladu že si zachovaly aktivitu pomocné látky (adjuvans). S výhodou se používají mutanty se sníženou toxicitou. Takové mutanty popisují například WO 95/17211 (mutanta CT Arg-7-Lys), WO 96/6627 (mutanta LT Arg-192-Gly) a WO 95/34323 (mutanta PT Arg-9-Lys a Glu129-Gly). Další LT mutanty, které jsou vhodné pro použití podle vynálezu, nesou alespoň jednu z následujících mutací: Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp a Glu-112-Asp.

• ·· ·

• ·· · ··· • · ·· ··

Dalšími vhodnými adjuvans pro slizniění cestu podání antigenu jsou sloučeniny jako MPLA, PLGA, DC-chol a QS-21.

Předmětem vynálezu je dále způsob imunizace, prováděné za účelem prevence nebo léčby infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter (například Helicobacter pylorť), který zahrnuje podání antigenu slizniění cestou (například orální, žaludeční, intranasální, pulmonální, intestinální, rektální, nitrooční, vaginální nebo urinální) a následné druhé podání antigenu parenterálně (intramuskulárně, subkutánně, intradermálně, intravenózně nebo intraperitoneálně). Jedním z příkladů použití této metody je podání antigenu slizniění cestou (nastartování imunitní odpovědi proti podanému antigenu, „priming“) následované parenterálním podáním antigenu (zesílení imunitní odpovědi). Mezi další příklady použití zmíněných metod patří různé kombinace parenterálního a slizničního způsobu podání antigenu, například intramuskulární aplikace antigenu a kombinovaná žaludeční a intranasální aplikace. Antigeny, jejich forma, použitá adjuvans, režim podávání, výběr konkrétní slizniění nebo parenterální cesty a dávky antigenu, to všechno jsou parametry, které mohou být osobou vzdělanou v oboru snadno určeny. Některé specifické příklady těchto parametrů, které mohou být upraveny pro použití ve zmíněných metodách, jsou uvedeny výše.

Výše uvedený popis vynálezu se týkal především infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter a způsobů buje proti těmto infekcím, tj. jejich prevence a léčby. Ovšem mělo by být zřejmé, že principy a způsoby popsané výše mohou být aplikovány mutatis mutandis na kteroukoliv jinou infekci vyvolanou kterýmkoliv jiným mikroorganizmem, napadajícím tkáně žaludku, dvanáctníku nebo střeva. Všechny dokumenty, publikované a citované v této přihlášce jsou zde uvedeny jen jako literární odkazy.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 se týká příkladu 1 a představuje studii lokální imunitní odpovědi ve slinných žlázách (obr. IA) a v žaludku (obr. IB), vyhodnocenou metodou ELISPOT stanovením množství indukovaných IgA protilátek proti ureáze. Výsledky jsou vyjádřeny v grafu jako bod/10⁶ buněk (obr. IA) nebo jako počet odpovídajících myší, vykazujících více než 2 IgA body/myš (obr. IB) po a) podání ureázy v čase DO subkutánně (SC) do sublumbálně posteriorní oblasti [(a) a (c)] nebo do oblasti krku [(b) a (d)] následovaném další dávkou pro zesílení imunitní φφφ · φφ φφ ·· • φ φ · φ • φ ·»····· • φφ φφ β · ΦΦΦ··· • · · · · * · 9

........*.....

/ odpovědi podanou přes nosní sliznici (N) a prostřednictvím sliznice žaludku (1G) v čase D28 [(a) a (c)] nebo D28 a D56 [(b) a (d)].

Obrázek 2 se týká příkladu 1 a zobrazuje aktivitu ureázy, měřenou 4 hodiny po smrti u myši, které byl třikrát za sebou v časech DO, D28 a D56 podán inaktivovaný bakteriální přípravek a to IG cestou [(a) a (c)] nebo subkutánně do sublumbálně posteriorní oblasti (b). V pokusu (c) bylo k bakteriálnímu očkovacímu přípravku přidáno 10 pg cholera toxinu. Pokus (d) je pozitivní kontrolou a pokus (e) negativní kontrolou.

Obrázek 3 se týká příkladu 1 a zobrazuje aktivitu ureázy, měřenou 4 hodiny po smrti u myši, které byl třikrát za sebou v časech DO, D28 a D56 podán (a) přípravek obsahující ureázu zapouzdřený v asi 80% DC-chol lipozómech, a to intramuskulárně do dorsolumbální oblasti nebo (b) přípravek s obsahem ureázy a cholera toxinu jako adjuvans, a to prostřednictvím žaludeční sliznice. Pokus (c) je pozitivní kontrolou a pokus (d) negativní kontrolou.

Obrázek 4 se týká příkladu 1 a zobrazuje aktivitu ureázy, měřenou 4 hodiny po smrti u myši, které byl třikrát za sebou v časech DO, D28 a D56 podán (a) přípravek s obsahem ureázy a cholera toxinu jako adjuvans, a to prostřednictvím žaludeční sliznice nebo (b) přípravek s obsahem ureázy a QS-21 jako adjuvans, a to subkutánně do levé posteriorní sublumbální oblasti. Pokus (c) je pozitivní kontrolou a pokus (d) negativní kontrolou.

Obrázek 5 představuje množství sérových imunoglobulinů indukovaných u opic po imunizaci popsané v příkladu 2, vyjádřené formou ELISA titrů. V kontrolní skupině byly čtyři opice a v každé ze tří testovaných skupin bylo osm opic. Každá testovaná skupina byla rozdělena do dvou podskupin po čtyřech opicích. Jedna z podskupin byla vždy imunizována pouze inaktivovanou frakcí H. pylori (1, 2 a 3) a druhá podskupina byla navíc imunizována ještě rekombinantní ureázou (lu, 2u a 3u). Ve skupinách 1 a lu byla imunogenní látka podávána 4x [nasálně + IG], ve skupinách 2 a 2u byla imunogenní látka podávána 4x [intramuskulárně] a skupinách 1 a lu byla imunogenní látka podávána [nasálně + IG, intramuskulárně, nasálně + IG, intramuskulárně]. ELISA titry byly měřeny 3x: poprvé v čase DO (bílý sloupec), podruhé v čase D42 (stínovaný sloupec) a potřetí v čase D78 (černý sloupec).

Obrázky 6A a 6B zobrazují aktivitu ureázy (obr. 6A) měřenou po 4 hodinách (OD550 nm) s použitím Jatroxova testu (Procter & Gamble) a bakteriální zátěž u myší infikovaných H. pylori a následně léčených různými způsoby A - H [A: LT + ureáza, orálně; B: QS-21 + ureáza, parenterálně do oblasti krku; C: QS-21 + ureáza, parenterálně do lumbální oblasti; D: QS-21, subkutánně do lumbální • ···· ·· « • 9

9 9

999 99

9 9 9 9 9 9

99 999 999

9 9 · · »*· 4· ·· ·« oblasti; Ε: Bay R1005 + ureáza, parenterálně do oblasti krku; F: Bay R1005 + ureáza, parenterálně do lumbální oblasti; G: Bay R1005, subkutánně do lumbální oblasti (kontrola); H: fyziologický roztok, subkutánně do lumbální oblasti (pozitivní kontrola)]. I představuje negativní kontrolu.

Obrázek 7 ukazuje výsledky imunizace myší, kde byl antigen poprvé podán slizniční cestou a následně potom pro zvýšení účinku patenterálně. Antigenem bula ureáza, která indukovala nejúčinnější ochrannou odpověď proti infekci H. pylori. Myši byly imunizovány buď orálně 25 pg ureázy + 5 pg LT, nebo parenterálně 10 pg ureázy se 100 pg hydroxidu hlinitého ve funkci adjuvans nebo bez adjuvans. Nejprve byly myši imunizovány orální cestou ureázou + LT, poté následovaly dvě dávky s třítýdenním odstupem, podané buď parenterální nebo orální cestou, viz. obrázek. Myši byly nakaženy H. pylori dva týdny po poslední imunizaci a po dalších dvou týdnech byly zabity. Z těla byla odebrána podélně 1/3 žaludku, tkáň byla homogenizována a kultivována na H. pylori.

Obrázek 8 ukazuje vliv imunizace ureázou na experimentální expozici opic Macaca fascicularis H. pylori. Opice byly imunizovány ureázou parenterálně (100 pg ureázy + 1 mg hydroxidu hlinitého nebo 800 pg Bay) nebo byly imunizovány nejprve slizniční cestou (orálně 4 mg ureázy + 100 pg LT) a následně pro zvýšení účinku parenterálně (ureáza + hydroxid hlinitý). Imunizace byla provedena ve třech dávkách s odstupem třech týdnů a poslední čtvrtá dávka byla podána 20 týdnů po první dávce antigenu. Opice byly vystaveny nákaze týden po poslední imunizaci. 10 týdnů po expozici H. pylori byly opice usmrceny a u každého zvířete bylo provedeno 10 biopsií nabodnutím žaludku. Tkáň byla kultivována za účelem stanovení kolonizace H. pylori. Každý ze symbolů představuje průměr CFU z 10 kultivovaných vzorků z jedné opice. Vodorovnou linkou je vyznačen medián CFU pro testovanou skupinu.

Obrázek 9 zobrazuje stupeň rozvoje gastritidy u imunizovaných a neimunizovaných opic následně po expozici H. pylori. Opice byly imunizovány orálně úvodní dávkou 4 mg ureázy + 100 pg LT a následně 3 a 20 týdnů po první dávce dvěma parenterálními dávkami. Opice byly vystaveny nákaze týden po poslední imunizaci. 10 týdnů po expozici H. pylori byly opice usmrceny a z každého zvířete byly odebrány 2 cm² velké sekce z těla žaludku (corpus), dutiny žaludku (antrum) a ze spojnice corpus-antrum, řezy byly fixovány 10% pufrovaným formalínem, upevněny v parafínu a řezy byly barveny Η & E. Mikroskopicky byla v barvených řezech stanovena infiltrace lymfocyty, • · • · · ·

• · · · • · · · • · · · · · · • · • · · · /

plazmatickými buňkami a polymorfonukleárními buňkami. Každý ze symbolů představuje průměrné skóre gastritidy ze třech vzorků z každé opice.

Obrázek 10 zobrazuje epiteliální změny u imunizovaných a neimunizovaných opic následně po expozici H. pylori. Opice byly imunizovány orálně úvodní dávkou 4 mg ureázy + 100 pg LT a následně dvěma parenterálními dávkami 100 pg ureázy + 1 mg hydroxidu hlinitého v třítýdenním intervalu a 20 týdnů po první dávce jednou parenterální dávkou ureázy s hydroxidem hlinitým. Opice byly vystaveny nákaze týden po poslední imunizaci. 10 týdnů po expozici H. pylori byly opice usmrceny a z každého zvířete byly odebrány 2 cm² velké sekce z těla žaludku (corpus), dutiny žaludku (antrum) a ze spojnice corpus-antrum, řezy byly fixovány 10% pufrovaným formalínem, upevněny v parafínu a řezy byly barveny Η & E. Pozorováním barvených řezů pod mikroskopem byl stanoven rozsah epiteliálních změn, definovaných jako metaplázie, atrofie a/nebo hyperplázie. Každý ze symbolů představuje průměrné skóre gastritidy ze třech vzorků z každé opice.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Imunizační studie na myším modelu.

1A - Materiál a metody

Myši

6/8 týdnů staré samičky Swiss myší byly poskytnuty Janvier (Francie). V průběhu celého pokusu byly používány sterilní pomůcky; klece byly chráněny proti nákaze („isocaps“), myši byly krmeny filtrovanou vodou a ozářeným krmivém.

Způsob imunizace

V průběhu každého experimentu obdržely myši 3 dávky stejného produktu ve 28 denních intervalech (dny 0, 28 a 56). Produkt byl zvířatům podáván pernasálně (až do 50 pl na myš), perorálně (300 pl v 0,2M NaHCO₃ žaludeční sondou) nebo subkutánně (300 pl podkožně v oblasti krku nebo podkožně na levé straně v lumbální oblasti). V některých případech byla provedena intramuskulární inokulace (50 pl) do některého z dorsolumbálních svalů uspané myši. 10 μg ureázy bylo použito pro dávky podávané pernasálně, subkutánně nebo intramuskulárně, 40 pg bylo podáváno orální cestou. Co se týká inaktivované bakteriální frakce, bylo podáváno 400 pg buněk subkutánně nebo orální cestou.

·· ····· ·· ··

Antigeny a adjuvans

Apoenzym ureáza z H. pylori byl exprimován v E. coli a purifikován tak jak to bylo popsáno v příkladu 5 WO 96/31235. V dalším textu je tento apoenzym nazýván jednoduše ureáza.

Frakce inaktivovaných bakterií H. pylori (WC) byla připravena následujícím způsobem: baňka zmrzlých bakterií ATCC 43579 byla zředěna ve dvoufázovém médiu v 75 ml baňce (Costar). Médium se skládá z pevné fáze (10 ml Columbia agaru (BioMérieux) + 6 % ovčí krve (BioMérieux)) a z kapalné fáze (3 ml TSB, BioMérieux). Baňka byla umístěna na třepačce („generbag“ obsahující „microaer“) (BioMérieux) a inkubována za slabého třepání při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Poté byla kultura analyzována (pohyblivost, ureáza, kataláza, produkce oxidázy) a centrifugována (nejraději několik baněk společně) 20 minut při 3000 rpm a teplotě 4 °C. Pelet byl resuspendován v PBS (BioMérieux) s 1% formalínem (37% formalín, Sigma). Objem byl upraven tak, aby konečná koncentrace byla 2 mg/ml (1 ml kultury mající před centrifugací při vlnové délce 600 nm OD rovnou 1 odpovídá 377 pg proteinů). Výsledný produkt byl slabě míchán po dobu 4 hodin při teplotě 4 °C, poté byl 3x promyt PBS a výsledný roztok byl zahuštěn na konečnou koncentraci 100 pg proteinů na 50 pl. Aliquoty byly uchovány při 70 °C.

DC-chol lipozómy obsahující ureázu byly připraveny následujícím způsobem: nejprve byl připraven suchý lipidový film obsahující 100 mg DC-chol (R-Gene Therapeutics) a 100 mg DOPC (dioleylfosfatidylcholin) (Avanti Polar Lipids) tak, že byly zmíněné produkty smíšeny v práškové formě s asi 5 ml chloroformu. Roztok byl odpařen ve vakuu (rotační odparka). Takto získaný film na stěnách nádoby byl po dobu nejméně 4 hodin vysušován ve vysokém vakuu. Zároveň bylo rozpuštěno 20 mg lyofilizované ureázy a 100 mg sacharózy ve 13,33 ml 20 mM HEPES pufru pH 7,2. 10 ml tohoto roztoku (obsahující 1,5 mg ureázy a 0,75 % sacharózy) bylo přefiltrováno přes 0,220 pm Millex filtr a použito pro rehydrataci lipidového filmu. Suspenze byla míchána po dobu 4 hodin a poté buď lOx protlačována polykarbonátovou membránou (vel. pórů 0,2 pm) nebo mikrofluidizována (lOx při tlaku 500 kPa na přístroji Microfluidics Co Y10). Takto získaná suspenze lipozómů obsahuje 10 až 60 % zapouzdřené ureázy. Koncentrace sacharózy v suspenzi bula dále upravena na 5% (425 mg sacharózy na 10 ml) a suspenze byla lyofilizována. Před použitím byl lyofilizát resuspendován v odpovídajícím množství vody nebo pufru a suspenze byla vyčištěna na • · · ·

• ·

4 diskontinuálním sacharózovém gradientu (0, 30 a 60% koncentrace sacharózy), čímž byla získána frakce, kde množství zapouzdřené ureázy dosahuje asi 70 % z celkového množství obsaženého enzymu.

Cholera toxin byl použit jako adjuvans pro podávání prostřednictvím sliznic a to v množství 10 pg/dávku ureázy nebo inaktivované bakteriální frakce.

QS-21 (Cambridge Biosciences; Aquila) byl použit jako adjuvans v množství 15 pg/dávku ureázy.

Vyvolání reakce proti H. pylori

Dva týdny po druhé posilovači dávce bylo myším podáno žaludeční sondou 300 pl suspenze kmene H. pylori, adaptovaného na myšího hostitele, ORV2002 (lx 10⁷živých bakterií ve 200 pl PBS; OD₅₅₀ asi 0,5). Jedna skupina myší, které nebyla podána žádná dávka antigenu (kontrola) byla nakažena stejným způsobem.

Analýza vyvolané reakce.

Čtyři týdny po podání suspenze H. pylori byly myši usmrceny zlomením krční páteře. Žaludky byly odebrány za účelem stanovení aktivity ureázy a provedení histologické analýzy. Aktivita ureázy byla stanovena po 4 a 24 hodinách (OD₅₅₀, Jatroxův test, Procter & Gamble) a po 24 hodinách byl zaznamenán počet stále ještě negativních myší.

Stanovení lokální protilátkové odpovědi metodou ELISPOT (slinné žlázy a žaludek).

Testování metodou ELISPOT bylo provedeno v souladu s Mega et al., J. Immunol. (1992) 148:2030. Destičky byly potaženy extraktem proteinů H. pylori o koncentraci 50 g/ml.

Pro testování protilátkové odpovědi na úrovni žaludku byla publikovaná metoda modifikována následujícím způsobem: 1/2 žaludku byla pomocí automatického přístroje na řezání lidských tkání (Mclllwain Laboratories, Gilford, UK) rozsekána na kousky o velikosti 1 mm² a byla provedena digesce pomocí enzymu Dispase (2 mg/ml, Boehringer Manheim) ve 2 ml upraveného Joklilova roztoku, ke kterému bylo přidáno 10% koňské sérum (Gibco), glutamin a antibiotika. Byly provedeny 4 půlhodinové digesce při teplotě 37 °C a za stálého jemného míchání. Takto opracované buňky byly po každém kroku filtrovány (filtry Falcon; 70 pm) a 3x promyty roztokem RPMI 1640 (Gibco), obohaceným 5% fetálním telecím sérem (FCS) a inkubovány ve stejném roztoku po dobu nejméně čtyř hodin na destičkách

9 9 9 9 9 ·· ·· ·· «9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 « « 9 9 9 9 9 9 9 « 9 9 · · ·· 9999·· ··· · · · · ·

99··· · 9 9 9 9 99 ·· potažených nitrocelulózou (Millipore) (100 μΐ/jamku, 4 jamky). Z každé 1/2 žaludku bylo získáno asi 1 až 3 x 10⁵ buněk (buňky velkých rozměrů a makrofágy nebyly zahrnuty).

Biotinylovaný IgA a streptavidin-biotin peroxidázový komplex byly získány od firmy Amersham. Skvrny byly vyvolány působením substrátu AEC (Sigma) a jakmile destičky vyschly, skvrny byly spočteny pod mikroskopem (zvětšení xl6 nebo x40). Byly vypočteny průměrné hodnoty odpovídající počtu IgA skvrn ve čtyřech jamkách a výsledky byly vyjádřeny jako počet skvrn na 10⁶ buněk.

Analýza imunologické odpovědi metodou ELISA.

Analýzy metodou ELISA byly prováděny standardním způsobem (biotinylované konjugáty a streptavidin-peroxidáza byly od firmy Amersham, OPD (O-fenyldiamin-dihydrochlorid) substrát byl od firmy Sigma). Destičky byly potaženy extrakty H. pylori (5 pg/ml) v uhličitanovém pufru. V každém experimentu bylo použito kontrolní sérum z myši, namířené proti H. pylori extraktu. Titr odpovídá převrácené hodnotě ředění mající OD₄₉₀ 1,5.

1B - Výsledky

Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 1 až 4, popsaných výše.

Obrázek 1 ukazuje, že v případě subkutánního podání očkovací látky v zadní, tj. sublumbální části těla myši je dosaženo mnohem lepších výsledků co se týká lokální imunologické odpovědi a to jak ve slinných žlázách, tak i v žaludku.

Než začneme hodnotit výsledky zobrazené na obrázcích 2 až 4 je třeba poznamenat, že tyto obrázky dokumentují výsledky, získané s použitím antigenu ve formě preparátu s cholera toxinem jako adjuvans, který byl podáván prostřednictvím žaludeční sliznice. Tento experiment je nazýván standardním referenčním experimentem neboť dává lepší výsledky než až doposud v oboru nejlepší GC/IG kombinace.

Na obrázku 2 jsou znázorněny výsledky získané s frakcí inaktivovaných bakterií bez použití adjuvans při podávání nitrožaludeční nebo subkutánní cestou. Je zcela zřejmé, že mnohem lepší výsledky byly získány při podávání subkutánní cestou v sublumbální oblasti. Dokonce byly výsledky získané při podávání subkutánní cestou v sublumbální oblasti identické, ne-li nepatrně lepší než ty, získané ve standardním referenčním experimentu se stejným přípravkem a cholera toxinem ve funkci adjuvans při podávání nitrožaludeční cestou. Výsledky, získané v testu ureázové aktivity v experimentech a) až e) 4 hodiny po usmrcení myší, zobrazené na obrázku 2, můžeme doplnit počty myší, které byly v testu ureázové aktivity • · ·· · · ·· ·· ·· ·· · ·· · · · · · • · ······ • · · ········· • · · · · · · _ ··· ·· «·· ·· ·· ·♦ 23 ι

negativní i 24 hodin po usmrcení myší: a) 0/8, b) 4/8, c) 4/8, d) 0/8, e) 10/10. Tyto výsledky jsou v soulady se závěry, uvedenými výše, tj. že v experimentu b) byly dosaženy výsledky, srovnatelné se standardním referenčním testem.

Z obrázku 3 vyplývá, že výsledky, dosažené s preparátem obsahujícím ureázu zapouzdřenou v DC-chol lipozómech, podávaným subkutánně v sublumbální části těla jsou stejně dobré jako výsledky získané ve standardním referenčním experimentu. Dále můžeme výsledky, získané v testu ureázové aktivity v experimentech a) až d) 4 hodiny po usmrcení myší, zobrazené na obrázku 3, doplnit počty myší, které byly v testu ureázové aktivity negativní i 24 hodin po usmrcení myší: a) 5/10, b) 4/10, c) 0/10, d) 10/10. Tyto výsledky jsou v soulady se závěry, uvedenými výše v předcházejícím odstavci, tj. že v experimentu a) byly dosaženy výsledky, srovnatelné se standardním referenčním testem.

Z obrázku 4 vyplývá, že výsledky, dosažené $ preparátem obsahujícím ureázu a QS-21 jako adjuvans, podávaným subkutánně v sublumbální části těla jsou stejně dobré jako výsledky získané ve standardním referenčním experimentu. Dále můžeme výsledky, získané v testu ureázové aktivity v experimentech a) až d) 4 hodiny po usmrcení myší, zobrazené na obrázku 4, doplnit počty myší, které byly v testu ureázové aktivity negativní i 24 hodin po usmrcení myší: a) 1/8, b) 5/8, c) 0/8, d) 10/10. Tyto výsledky jsou v soulady se závěry, uvedenými v předcházejícím odstavci, tj. že v experimentu b) byly dosaženy výsledky, srovnatelné se standardním referenčním testem.

V následující tabulce jsou uvedeny hodnoty, udávající množství IgA, IgGl a IgG2a, indukované během experimentů, jejichž výsledky týkající se ureázové aktivity jsou zobrazeny na obrázcích 2 až 4. Dále jsou uvedeny počty myší, jejichž ureázová aktivita byla charakterizována OD nižší než 0,1 4 i 24 hodin po smrti. Množství IgA, IgGl a IgG2a je vyjádřeno formou ELISA titru.

	ureáza CT IG	WC IG	WC CT IG	WC SC	ureáza lípo DC-chol SC	ureáza QS-21 SC
IgA	45	91	107	63	0	1
IgGl	65700	1920	349	1273146	620000	2970399
IgG2a	20200	399	3440	42900	321000	1136095
OD<0,1 (4 hodiny)	5/10	0/8	5/8	6/8	5/10	6/8
OD<0,1 (24 hodin)	4/10	0/8	4/8	4/8	5/10	5/8

• · · · · · · «·· · · ····· ·· · <

Příklad 2: Imunizační studie provedená na opičím modelu.

2A - Materiál a metody

Opice

V této studii bylo použito 28 dvouletých opic (Macaca fascicularis) původem z ostrova Mauritius. Ještě než podstoupily opice nejrůznější imunizační procedury bylo biopsií prokázáno, že většina z nich byla chronicky infikována organizmy podobnými Gastrospirillum hominis (GHLO) nebo H. heilmanii.

Způsob podávání

Vzhledem k tomu, že téměř všechny opice byly infikovány GHLO, bylo rozhodnuto testovat účinnost různých způsobů léčení. Použité způsoby jsou shrnuty v následující tabulce:

Skupina	DO	D21	D42	D63
1 a lu	IN + IG	IN + IG	IN + IG	IN + IG
2 a 2u	IM	IM	IM	IM
3 a 3u	IM	IN + IG	IM	IN + IG

Dávky byly podávány intramuskulárně do svalu v dorsolumbální části těla.

Antigeny a adjuvans

Vzhledem k tomu, že byla prokázána zkřížená reaktivita mezi GPLO a H. pylori, bylo zvoleno použití preparátu s obsahem inaktivovaných bakterií H. pylori tak jak již bylo popsáno v příkladu 1A. Preparát byl použit buď samostatně nebo v kombinaci s rekombinantní ureázou, připravenou způsobem, popsaným v příkladu 1A.

Ve funkci slizničního adjuvans bylo použito E. coli teplotně labilního toxinu (LT) (Sigma) nebo B podjednotky cholera toxinu (CTB) (Pasteur Mérieux sérums & vaccins); ve funkci parenterálního adjuvans byl použit DC-chol. DC-chol prášek byl jednoduše rehydratován roztokem antigenu.

Použité dávky jsou shrnuty v následující tabulce:

způsob podání	mikroorganizmus	ureáza	DC-chol	LT	CTB
IG	400 gg	2,5 mg	-	25 gg	-
IN	400 gg	400 gg	-	25 ng	25 gg
IM	400 gg	100 gg	400 gg	-	-

φφφφ /

Biopsie, ureázový test a bakteriologicko/histologická studie.

Biopsie byla provedena u každé z opic před i po imunizaci (1 měsíc po třetí posilovači dávce). S použitím biopsií byl proveden jak ureázový test tak i histologická studie.

Ureázová aktivita byla stanovena pomocí Jatrox kitu (Procter & Gamble). Úroveň aktivity byla posuzována následujícím způsobem v sestupném pořadí: úroveň aktivity 3, růžová barva, objevující se během prvních 10 minut; úroveň aktivity 2, růžová barva objevující se mezi 10 a 30 minutou po přidání reagencií, úroveň aktivity 1, růžová barva objevující se mezi 30 minutou a 4 hodinou po přidání reagencií a úroveň aktivity 0, charakterizovaná žádným nebo jen velmi slabým zbarvením po 4 hodinách reakce.

Histologické studie byly provedeny na biopsiích fixovaných ve formalínu a bakteriální zátěž byla kvantifikována následujícím způsobem: žádné bakterie (0); několik bakterií typu Helicobacter (0,5); více bakterií (1); mnoho bakterií (2); velmi mnoho bakterií (3). Odstup mezi jednotlivými úrovněmi (například 1 a 2) odpovídá pětinásobnému počtu bakterií ve vyšší úrovni v porovnání s nižší.

Analýza imunologické odpovědi ELISA testem.

ELISA tes byl prováděn stejným způsobem jako v experimentech popsaných v příkladu 1A.

2B - Výsledky.

Následující tabulka se týká bakteriální zátěže, která byla hodnocena před a po imunizaci a to dvěma způsoby: (i) stanovením ureázové aktivity a (ii) histologicky. Výsledky těchto dvou studií jsou shrnuty ve sloupcích 3 až 6. Poslední tři sloupce zobrazují pro každou skupinu (kontrola, 1, 2 nebo 3) počty opic, pro které zůstala bakteriální zátěž (hodnoceno oběma způsoby) po imunizaci nezměněna ( —* ), nebo se snížila ( j ), nebo zvýšila ( | ) podle výsledků alespoň jednoho z testů za předpokladu že druhý test vykazuje stacionární zátěž. Pokud vykazují výsledky obou testů podobnou změnu zátěže, je šipka indikující směr změny bakteriální zátěže dvojitá.

·· ♦· ··♦· • · • · • · · · • < · · ··· ··· • ·

Opice	Skupina	Ureázová aktivita před po imunizaci	Histologie před po imunizaci	Změna bakteriální - t	zátěže
H 282 J 005 J 852 J 476	C C C C	2 2 0 0	-	2 2 0 0	3 2 2 2	-	2 1 0 0	2 2 0 0	3 1 1 1	-	2 0 1 1	1/4	1/4	2/4 (2/4 t\|)
H 799	1	2	-	2	2	-	2	2	2	-	2
J 845	1	2	-	2	3	-	2	2	2	-	1
J 205	1	1	-	1	2	-	2	0	1
J 328	1	2	-	2	1	-	2	3	3	-	2	1/8	5/8	2/8
J 197	lu	2	-	2	3	-	2	2	3					(1/8 TT)
H 025	lu	2	-	2	2	-	2	1	1	-	1
G 460	lu	2	-	2	3	-	2	3	2	-	3
J 607	lu	2	-	2	2	-	2	2	2
H 549	2	3	-	3	2	-	2	3	2	-	3
H622	2	3	-	3	1	-	1	2	2	-	3
H504	2	3	-	3	1	-	1	2	2	-	1
H798	2	1	-	1	0	-	1	1	1	-	1
J 367	2u	2	-	2	2	-	1	3	2	-	3	6/8	1/8	1/8
G 486	2u	2	-	2	2	-	2	1	2	-	2
J 522	2u	2	-	2	0	-	0	2	2	-	2
G 722	2u	3	-	3	2	-	0	2	2	-	3
H 820	3	3	-	3	2	-	2	3	2	-	2
J 557	3	2	-	2	1	-	0	2	1	-	2*
H 588	3	2	-	2	2	-	0	3	1	-	2
J 153	3	3	-	3	3	-	3	2	3	-	3	5/8	0	3/8
H 480	3u	2	-	2	2	-	2	2	3	-	3	(3/8 H)
J 344	3u	3	-	3	2	-	0	3	2	-	2
H 710	3 u	2	-	2	2	-	2	2	3	-	3
J262	3u	3	-	3	2	-	2	3	3	-	2

Z této tabulky vyplývá, že ve skupině, která podstoupila imunizaci výhradně slizniční cestou, jsou výsledky v podstatě identické s výsledky negativních kontrol. Naopak ve skupině, která podstoupila imunizaci smíšenou (slizniční a intramuskulární) nebo striktně intramuskulární cestou bylo pozorováno významné snížení bakteriální zátěže. Tyto výsledky zdůrazňují význam podmínek imunizace a to především stupně imunizace a následně použití způsobu imunizace, který zahrnuje parenterální způsob imunizace v subdiafragmatické oblasti, pro dosažení požadovaného ochranného účinku.

• · • · · · • · · ·♦♦♦ ·♦♦· • · ······· « · · · · · · ··* ··· ··· ··· · · ····· ····· ·· ·· 27 t

Tyto výsledky musí být hodnoceny ve vztahu s ostatními výsledky které se týkají hladiny sérových protilátek a které jsou prezentovány na obrázku 3. Na obrázku 3 je znázorněno, že imunizační schéma s výhradně slizniční cestou imunizace (1 a lu) vede k výsledkům, které se velmi podobají výsledkům negativní kontrolní skupiny. Naopak imunizační schéma zahrnující smíšenou imunizaci slizniční a intramuskulární cestou (2 a 2u) a ještě spíše imunizační schéma zahrnující imunizaci výhradně intramuskulární cestou (3 a 3u) umožňuje produkci protilátek v podstatně vyšší koncentraci než jak je tomu u kontrolní skupiny.

Silná sérová odpověď je tedy v korelaci s ochranným účinkem imunizace, zatímco naopak slabá odpověď je spojena s absencí ochranného účinku. Imunizační podmínky, umožňující dosažení požadovaných účinků (silná sérová odpověď, ochranný účinek) zahrnují použití parenterálního způsobu podání imunizační dávky v subdiafragmatické oblasti nebo podání s Th-1 adjuvans.

Příklad 3: Léčba infekce H. pylori u myší.

Byla porovnávána účinnost imunizace subkutánní cestou (SC) a slizniční cestou na účinnost léčby infekce H. pylori u myší.

OF1 myši byly infikovány 10⁶ CFU (kolonie tvořící jednotky) H. pylori kmene ORV2001. Po jednom měsíci byla ověřena úspěšnost rozvoje infekce tak, že bylo náhodně vybráno 10/100 myší a po usmrcení byla u této skupiny otestována aktivita ureázy v 1/4 žaludku. Pokud byly všechny výsledky pozitivní, byly zbylé myši imunizovány (ve skupinách po 10) 3x ve třítýdenních intervalech, a to buď subkutánně 10 pg rekombinantní ureázy doplněné 15 pg QS-21 (Aquila) nebo 400 pg adjuvans Bay R1005 (Bayer), nebo orálně 40 pg ureázy s lpg LT. Pro každé ze dvou parenterálně podávaných adjuvans byla provedena imunizace buď v oblasti krku, aby byly zasaženy lymfatické uzliny v horní části těla, nebo v lumbální oblasti, aby byly zasaženy abdominální lymfatické uzliny. Skupina 10 myší nebyla infikována ani imunizována (negativní kontrola), zatímco v další skupině (pozitivní kontrola) byly myši imunizovány subkutánně (v lumbální oblasti) fyziologickým roztokem, QS-21 nebo Bay adjuvans.

Měsíc po třetí imunizaci byly všechny myši usmrceny a zvířatům byly odebrány žaludky za účelem stanovení rozsahu kolonizace bakteriemi pomocí měření ureázové aktivity (v každé skupině bylo hodnoceno 10/10 myší) a pomocí kvantitativní kultivace (hodnoceno bylo 5/10 myší v každé skupině). Obrázky 6A (test ureázové aktivity) a 6B (kultivace) ukazují, že u myší imunizovaných subkutánně v sublumbální oblasti ureázou, doplněnou QS-21, byla infekce v ·ΒΒ·

Β

• Β

podstatě potlačena (4/5 myší byly v kvantitativním kultivačním testu negativní).

Myši, imunizované ureázou subkutánně v oblasti krku za spolupůsobení QS-21 a myši imunizované ureázou s LT orálně, vykazovaly ve srovnání s neimunizovanými zvířaty desetinásobný až stonásobný pokles infekce. Adjuvans Bay indukovalo srovnatelný pokles infekce, který byl významnější u myší imunizovaných v lumbální oblasti.

Histopatologie u zmíněných zvířat neodhalila žádnou gastritídu, která by byla většího rozsahu než u kontrolní skupiny.

V předešlé profylaktické studii (příklad 1) bylo zjištěno, že chráněné myši vykazují vyšší sérové hladiny dvou izotypů imunoglobulinů, IgGl a IgG2, což ukazuje na vyrovnanou Th-2/Th-l odpověď. Dále vykazovaly myši, imunizované subkutánně v lumbální oblasti, vyšší hladiny sérového IgA, což je ukazatelem slizniční odpovědi.

Tyto výsledky ukazují, že cílenou systémovou imunizací lze léčit získanou infekci H. pylori u myší, a že je v zájmu dosažení požadované úrovně léčby vhodné použít adjuvans, které indukuje vyrovnanou slizniční odpověď Th-l/Th-2 typu.

Příklad 4: Imunizační strategie zahrnující první imunizaci ureázou slizniční cestou a následné podání posilující imunizační dávky parenterální cestou vyvolává u myší ochrannou reakci proti infekci H. pylori.

Swiss Webster myši byly imunizovány strategií „mucosal prime/parenteral boost“, tj. první dávka podaná slizniční cestou navodí primární imunitní odpověď a následné dávky podané parenterálně imunitní odpověď zesílí. Primární dávka 25 pg rekombinantní ureázy H. pylori (ureáza) s 5 pg teplotně labilního enterotoxinu E. coli (LT) byla podána orálně. O tři týdny později obdržely myši parenterálně zesilující dávku 100 pg ureázy + 100 pg hydroxidu hlinitého a o další tři týdny později znovu. Myši imunizované touto strategií vykazovaly ve srovnání s neimunizovanou kontrolní skupinou průměrně 2000 x snížení počtu CFU H. pylori (obr. 7). Imunizace touto strategií byla účinnější než imunizace třemi očkovacími dávkami, podanými slizniční cestou, kde bylo dosaženo jen tisícinásobné redukce kolonizace žaludku bakteriemi. Jediná primární dávka ureázy + LT, podaná orálně, má za následek desetinásobné snížení počtu CFU H. pylori, posilující parenterální dávky bez použití adjuvans dokázaly redukovat počet CFU jen dvakrát (obrázek 7).

Tato imunizační strategie byla použita v dalším experimentu při imunizaci opic proti nákaze H. pylori.

φφφφ

ΦΦ φφ φφ φ φ φ φ · · φ · φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φφ φφ φφ

Příklad 5: Ochrana opic proti infekci H. pylori s využitím imunizační strategie zahrnující první imunizaci ureázou slizniční cestou a následné podání posilující imunizační dávky parenterálně.

Opice, séronegativni na H. pylori, byly ošetřeny čtyřnásobnou terapií a kultivačními a histologickými testy žaludečních biopsií bylo potvrzeno, že opice netrpí infekcí H. pylori. Devatenáct opic bylo náhodně rozděleno do čtyř skupin: 4 opice byly falešně očkovány, 5 bylo očkováno intramuskulárně vakcínou obsahující rekombinantní ureázu H. pylori a hydroxid hlinitý (Rehydragel) jako adjuvans, 5 bylo očkováno orálně primární dávkou obsahující ureázu a E. coli teplotně labilní enterotoxin (LT) jako adjuvans, a následně parenterálně intramuskulárně dvěma posilujícími dávkami ureázy s hydroxidem hlinitým jako adjuvans a 5 opic bylo očkováno intramuskulárně ureázou s Bay adjuvans. První tři očkovací dávky byly podávány v intervalech třech týdnů a poslední čtvrtá dávka byla podána po 20 týdnech od prvního očkování.

Jeden týden po poslední imunizaci byly opice vystaveny nákaze H. pylori. Po dalších 10 týdnech byly opice usmrceny. Pro kultivaci bakterií bylo biopsií ze žaludku odebráno 10 vzorků o průměru 5 mm (1 z oblasti přechodu jícnu do žaludku (cardiac), 2 korporální, 3 korporálně-antrální, 3 antrální a 1 pylorický. Dalších 5 vzorků bylo ze žaludku odebráno pro histopatologickou analýzu.

Přestože byla všechna zvířata experimentálně infikována H. pylori, opice imunizované primárně slizniční cestou ureázou +LT a následně parenterálně 3 posilujícími dávkami ureázy s hydroxidem hlinitým vykazovaly ve srovnání s kontrolní skupinou (falešně imunizovanou) statisticky významně menší (p = 0,05, Wilcoxonův test náhodných součtů) kolonizaci bakteriemi (obrázek 8). Více než dvacetinásobná redukce průměrného počtu CFU/soubor biopsií (5,8 χ 10² CFU, v rozsahu od 10² do 6,7 χ 10² CFU) byla prokázána u opic, které byly imunizovány primární dávkou slizničně a následně posilujícími parenterálními dávkami, ve srovnáni s průměrným počtem CFU 1,3 χ 10⁴ (v rozsahu od 1,5 χ 10³ do 1,8 χ 10⁵CFU) ve skupině falešně imunizovaných opic.

Skupina opic, kterým byla podána vakcína s obsahem ureázy nejprve primárně slizniční cestou a poté několikrát parenterálně jako posilující dávka, vykazovala podobnou gastritidu (obr. 9) i epiteliální změny (obr. 10) po nákaze H. pylori, jako kontrolní falešně očkovaná skupina. Bylo prokázáno, že vakcinace v žádném případě nezhoršuje gastritidu ani neevokuje epiteliální změny.

Na rozdíl od opic, které byly imunizovány strategií primární dávka slizničně/posilující dávka parenterálně, nevykazovaly opice imunizované

9999 • φ 9 99 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 · · ·

9 99 99 9 99 9 9 99 parenterálně ureázou + Bay žádné rozdíly v rozsahu kolonizace bakteriemi H. pylori v porovnání s falešně imunizovanými kontrolami (p = 1,00) a opice imunizované ureázou s hydroxidem hlinitým vykazovaly jen ěásteěný efekt (p = 0,33) (obr. 8). Kultivační data nebyla pro jednu z opic ze skupiny ureáza + Bay dostupná z důvodu kontaminace vzorku žaludeční tkáně jinými bakteriemi.

Z výše popsaných výsledků vyplývá, že imunizaění schéma, využívající primární imunizaci ureázou + LT slizniění cestou a následnou parenterální zesilující imunizaci ureázou s hydroxidem hlinitým, je velmi účinnou prevencí infekcí H. pylori u primátů (netestováno na člověku). Toto schéma bylo zvoleno na základě znalosti faktu, že imunitní systém musí být „nastartován“ pro indukci imunitní odpovědi na slizniění infekci, například slizniění imunizací s odpovídajícím adjuvans. Ovšem jakmile byla imunitní odpověď správně „nastartována“, může být pro parenterální imunizaci zesilující imunitní odpověď použito běžnější adjuvans, například hydroxid hlinitý. Výhodou tohoto imunizačního schématu není jen větší efektivita než v případě striktně slizniění imunizace, ale také používání významně nižších dávek antigenu, neboť posilovači dávka antigenu, podávaná parenterálně může být mnohem nižší (jen 100 pg ureázy) než dávka potřebná pro slizniění imunizaci (4 mg).

Další aspekty vynálezu jsou shrnuty v následujících nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití imunogenní látky odvozené od bakterie rodu Helicobacter pro přípravu farmaceutického prostředku, určeného pro indukci Th-1 typu imunitní odpovědi proti infekci způsobené bakteriemi rodu Helicobacter nebo pro prevenci či léčbu infekcí způsobených bakteriemi rodu Helicobacter u savců.
2. Použití podle nároku 1, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:100 nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:100.
3. Použití podle nároku 2, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:10 nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:10.
4. Použití podle nároku 3, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:2 nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:2.
5. Použití imunogenní látky odvozené od bakterie rodu Helicobacter pro přípravu farmaceutického prostředku, určeného pro podávání systémovou cestou, a to v té části těla savce, nejraději primáta, která je situována pod bránicí, za účelem prevence infekce způsobené bakteriemi rodu Helicobacter.
6. Použití podle nároku 5, kde je farmaceutický prostředek, pokud je podán subdiafragmatickou systémovou cestou, schopen indukovat Th-1 typ imunitní odpovědi.
7. Použití podle nároku 5 nebo 6, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:100, nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:100.

44*4 •4 44 44

44 4 4444 4444

4 4 444 44·· • 4 4 4444 444 444

444 444 4 4 •44 44 444 44 44 44
8. Použití podle nároku 7, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:10 nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:10.
9. Použití podle nároku 8, kde Th-1 typ imunitní odpovědi je charakterizován buď (i) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgGl u myší větším nebo rovném 1:2 nebo (ii) poměrem ELISA titrů IgG2a:IgA u myší větším nebo rovném 1:2.
10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde je imunogenní látka odvozená od bakterie rodu Helicobacter vybrána ze skupiny obsahující frakci inaktivovaných bakterií rodu Helicobacter, lyzát buněk bakterií rodu Helicobacter, purifikovaný peptid nebo polypeptid pocházející z bakterie rodu Helicobacter, molekula DNA nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid z bakterie rodu Helicobacter umístěnou pod kontrolou elementů, nezbytných pro expresi zmíněné sekvence a vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid z bakterie rodu Helicobacter umístěnou pod kontrolou elementů, nezbytných pro expresi zmíněné sekvence.
11. Použití podle nároku 10, kde imunogenní látkou odvozenou od bakterie rodu Helicobacter je UreB nebo UreA podjednotka enzymu ureázy z bakterie rodu Helicobacter.
12. Použití podle nároku 10, kde imunogenní látkou odvozenou od bakterie rodu Helicobacter je molekula DNA nebo vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující UreB nebo UreA podjednotku enzymu ureázy z bakterie rodu Helicobacter.
13. Použití podle nároku 10, 11 nebo 12, kde je zmíněná imunogenní látka odvozena od Helicobacter pylori.
14. Použití podle některého z nároků 5 až 13, kde je farmaceutický prostředek určen pro podávání striktně systémovou cestou.
15. Použití podle některého z nároků 5 až 14, kde je farmaceutický prostředek určen pro podávání systémovou cestou vybranou ze skupiny obsahující subkutánní, intramuskulární a intradermální cestu.

« ·4· ·· 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9999 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 99 9 9 9 9 9 99
16. Použití podle některého z nároků 5 až 14, kde je farmaceutický prostředek určen pro podávání slizniční cestou a následně potom parenterální cestou.
17. Použití podle nároku 16, kde je farmaceutický prostředek určen pro podání parenterální cestou, následně poté slizniční cestou, následně znovu parenterální cestou a následně znovu slizniční cestou.
18. Použití podle některého z nároků 5 až 17, kde je farmaceutický prostředek určen pro podáváni v dorsolumbální části těla zmíněného savce.
19. Použití podle některého z nároků 5 až 18, kde je farmaceutický prostředek určen pro opakované podání systémovou cestou, a to dvakrát až třikrát během jedné léčebné procedury za účelem prevence nebo léčby infekce způsobené bakteriemi rodu Helicobacter.
20. Použití podle některého z nároků 5 až 18, kde je imunogenní látka vybrána ze skupiny obsahující frakci inaktivovaných bakterií rodu Helicobacter, lyzát buněk bakterií rodu Helicobacter, nebo purifikovaný peptid nebo polypeptid pocházející z bakterie rodu Helicobacter, a je navíc v kombinaci s nejméně jednou látkou schopnou podněcovat indukci Th-1 typu imunitní odpovědí.
21. Použití podle nároku 20, kde je látka schopná podněcovat indukci Th-1 typu imunitní odpovědi vybrána ze skupiny obsahující lipozómy, mikrosféry, QS21, DC-chol a Bay R1005.
22. Použití podle nároku 20 kde je látka schopná podněcovat indukci Th-1 typu imunitní odpovědi vybrána ze skupiny obsahující QS-21, DC-chol a Bay R1005.
23. Použití podle nároku 22, kde je imunogenní látka v kombinaci s nejméně dvěmi látkami schopnými podněcovat indukci Th-1 typu imunitní odpovědi; první látka je vybrána ze skupiny obsahující lipozómy a mikrosféry a druhá látka je vybrána ze skupiny obsahující QS-21, DC-chol a jejich ekvivalenty.

φφ φ·*·
24. Použití podle nároku 20, kde je imunogenní látkou peptid nebo polypeptid, který je spojen kovalentní vazbou s nejméně jedním lipidem schopným podněcovat indukci Th-1 typu imunitní odpovědi, se kterým tak dohromady tvoří lipopeptid nebo lipid obsahující polypeptidový konjugát.
25. Použití imunogenní látky odvozené od bakterie rodu Helicobacter pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci prevenci nebo léčbu infekce bakterií rodu Helicobacter v savci, kde uvedený farmaceutický prostředek je podáván slizniční cestou a poté parenterálni cestou zmíněnému savci,
26. Použití podle nároku 25, kde podání imunogenní látky slizniční cestou je provedeno více než jedenkrát.
27. Použití podle nároku 25, kde podáni imunogenní látky parenterálně je provedeno více než jedenkrát.
28. Použití podle nároku 25, kde podání primární dávky imunogenní látky je provedeno slizniční cestou pro imunitní odpověď' proti zmíněné imunogenní látce odvozené od bakterie rodu Helicobacter a parenterálni dávky jsou provedeny pro zesílení imunitní odpovědi proti z mi ne ne i m unog enn i látce o cl vozene od bakterie r o d u ii e 1 i c o b a c ? e r.
29. Použití podle nároku 25 nebo 28. kde slizniční cestou je podání orální cestou.

d a η i ρ a r e n t e r a 1 n i c e s t o u ] e p o d a η i

3í1. Použiti ρ o o 1 e n a r o k u intramuskulární nebo subkutánní.
31. Použití podle nároku 25. kde imunogenní látka odvozená od bakterie rodu H e l i c o b a c i e r j e v y b r á n a z e s k u p i n y o b s a h u j í c í f r a k c i i n a k t i v o v a n ý c h b a k t e r i í r o d u Helicobacter. lyzát buněk bakterií rodu Helicobacter, purifikovaný peptid nebo polypeptid pocházející z bakterie rodu Helicobacter. molekula DNA nesoucí sekvenci kódující, peptid nebo polypeptid z bakterie rodu Helicobacter umístěnou pod kontrolou elementů, nezbvtných pro expresi zmíněné sekvence a vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující peptid nebo polypeptid z bakterie rodu Helicobacter umístěnou pod kontrolou elementů, nezbytných pro expresi zmíněné sekvence
32. Použití podle nároku 31, kde imunogenní látka odvozená od bakterie rodu Helicobacter je UreB nebo UreA podjednotka enzymu ureázy z bakterie rodu Helicobacter.
33. Použiti podle nároku 31, kde imunogenní látka odvozená od bakterie rodu Helicobacter je molekula DNA nebo vakcinační vektor nesoucí sekvenci kódující UreB nebo UreA podjednotku enzymu ureázy z bakterie rodu Helicobacter.

·· ···· • · · • ·*·· ► · · 4 ·· ··
34. Použití podle některého z nároků 31, 32 nebo 33, kde imunogenní látka je odvozena od bakterie Helicobacter pylori.
35. Použití podle nároku 25, kde společně s imunogenní látkou, podávanou slízniění cestou, je podáváno také slízniční adjuvans vybrané ze skupiny obsahující teplotně labilní enterotoxm z Escherichia coli (LT), cholera toxin (CT), toxin z bakterie Clostridium difficile, Pertrussis toxin (PT), jejich kombinace, podjednotky, toxoidy a od nich odvozené mutanty.
36. Použití podle nároku 25, kde společně s parenterálně podávanou imunogenní látkou je podáváno parenterálni adjuvans vybrané ze skupiny obsahující hydroxid hlinitý (alum), QS21, DC-chol a Bav.

1/11