JP4510382B2 - ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む組成物の使用、感染から保護し得る免疫応答を対象体において誘導するための組成物、ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含むワクチン、ワクチンの使用、およびキット - Google Patents
ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む組成物の使用、感染から保護し得る免疫応答を対象体において誘導するための組成物、ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含むワクチン、ワクチンの使用、およびキット Download PDFInfo
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Description
本発明は、グラム陰性細菌の１つまたは複数の異種の種または菌株に対する免疫応答を対象者において生じさせる際に使用される、グラム陰性細菌に由来する組成物Ｉｎｖａｐｌｅｘに関する。
細菌性赤痢はヒト下痢疾患の主要な原因の１つである。１億６千万人を越える患者が、毎年、特に開発途上国において発生し、百万人を越える患者が死亡していると推定される（Ｋｏｔｌｏｆｆら、１９９９、ＷＨＯ、７７、６５１〜６６６）。疾患の原因となる最も一般的な赤痢菌属の種は、フレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）およびボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）である。工業化諸国では、毎年、約１５０万人の細菌性下痢患者が発生していると推定される（Ｋｏｔｌｏｆｆら、１９９９、上掲）。工業化諸国における細菌性赤痢の発生率が低いことは、成人集団は免疫がなく、感受性であることを意味する。このことは、アメリカの軍隊または旅行者が、赤痢菌属について風土病的な地域に行ったときに容易に明らかになる。抗生物質が細菌性赤痢に対して有効であるが、最新の抗生物質に対してさえも、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）における抗生物質耐性が絶えず出現していること（Ｈｏｇｅら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２６：３４１〜３４５）により、赤痢菌属による疾患を防ぐことを助ける効果的なワクチンが必要であることが強調される。
赤痢菌属の病理発生は、結腸上皮に侵入し、結腸上皮内に定着し、結腸上皮内の細胞内で複製するこの生物の能力のためである。赤痢菌による宿主細胞への侵入は、多くの異なる細菌タンパク質が関与する複雑な多因子的事象である。赤痢菌属の重要な毒性タンパク質に対する遺伝子の多くが１４０Ｍｄａｌの大きなプラスミドにコードされる。侵入プラスミド抗原と呼ばれる、プラスミドにコードされるタンパク質の多く（ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤのタンパク質）（Ｂｕｙｓｓｅら、１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９、２５６１〜２５６９）が、不可欠な毒性因子である。Ｓｉｐタンパク質と呼ばれる類似するタンパク質がサルモネラ属のメンバーによって作られる（Ｋａｎｉｇａら、１９９５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９５、３９６５〜３９７１）。宿主細胞に接触または結合したとき、赤痢菌属の様々なインベイシン（ｉｎｖａｓｉｎ）により、宿主細胞による細菌の包み込みおよび内在化をもたらす食作用的事象が誘導される。最近の報告では、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが、赤痢菌属培養物の増殖培地に見出され得る複合体を形成することが確認されている（Ｍｅｎａｒｄら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３、５２９３〜５３０２；Ｗａｔａｒｉら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４、２４６１〜２４７０）。この複合体の成分が侵入プロセスに関与しているが、実際の機構は明らかにされていない（Ｍｅｎａｒｄら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：５１５〜５２５）。さらに、精製されたＩｐａＣは、宿主細胞に結合し、宿主細胞による無毒性赤痢菌属細菌の取り込みに関係することが示されている（Ｍａｒｑｕａｒｔら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６４：４１８２〜４１８７、１９９６）。ＬＰＳとともに、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤは、赤痢菌属細菌による感染の後、感染者が応答する知られている主要な抗原である（Ｌｉら、１９９３、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２５、５６９〜５７７；Ｏａｋｓら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５３、５７〜６３；ｖａｎ ＤｅＶｅｒｇら、１９９２、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６６、１５８〜１６１）。赤痢菌属細菌を感染させたサルまたはヒトは、主にＩｐａＢおよびＩｐａＣに対する抗体を産生し、また、ＩｐａＡ、ＩｐａＤおよびＶｉｒＧ（細胞間の伝染に関与する、プラスミドにコードされる別の毒性タンパク質）に対する抗体をも高頻度で産生する（Ｏａｋｓら、１９８６、上掲）。
赤痢菌属−宿主の相互作用の結果としてもたらされるこれらの炎症性かつ特異的な免疫応答は、病原体を中和し、排除しようとする際に不可欠な毒性成分に向けられていると考えられる。生じる免疫性により、同種の血清型による将来の感染に対する保護がもたらされる（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ、１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１３４：６１４〜６２７；Ｆｏｒｍａｌら、１９９１、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６４：５３３〜５３７）。Ｉｐａタンパク質に対する抗体の機能は完全には理解されていないが、ＩｐａＣまたはＩｐａＢに対するモノクローナル抗体を用いて赤痢菌属またはＥＩＥＣの侵入性を阻害することが可能である（Ｍｉｌｌｓら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６：２９３３〜２９４１；Ｓｈａｉｋｈら、１９９５、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１２５：２４７〜２５３）。より近年には、ＩｐａＣのカルボキシ末端に対するＭａｂにより、ＩｐａＣ誘導のアクチン重合が、透過処理された宿主細胞において阻害されることが示された（Ｖａｎ Ｎｈｉｅｕら、１９９９、ＥＭＢＯ Ｊ．、１７４：１９９０〜２００１）。ＩｐａＣのエピトープマッピングにより、これらのエピトープ領域に応答する感染サルは、重篤な疾患を発症する可能性がより低いこと（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：３９２７〜３９３５）、そしてこれらの３つのエピトープ領域の１つ（領域ＩＩＩ）がアクチン重合ドメインと同時に局在化すること（Ｖａｎ Ｎｈｉｅｕら、１９９９、上掲）が示されている。そうであるとしても、保護免疫性を、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定されるようなインベイシン類のいずれかに対する特定の抗体応答と相関させることはこれまでできなかった。対照的に、数多くの研究では、ＬＰＳが不可欠なワクチン成分であると結論されており（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ、１９９１、上掲；Ｆｏｒｍａｌ、１９９１、上掲；Ｍａｌｌｅｔら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：２３８２〜２３８６；Ｏｒｒら、１９９３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６１：２３９０〜２３９５；Ｐｈａｌｉｐｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：７６９〜７７８）、しかし、自身によって送達されるＬＰＳが保護的でないこともまた明かである（Ａｄａｍｕｓら、１９８０、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３０：３２１〜３２４；Ｍａｌｌｅｔ、１９９５、上掲）。このことは、天然の感染に匹敵し得る保護的な免疫応答を誘発する様式でＬＰＳを提示することが、成功した赤痢菌属ワクチンには必要であることを示唆している。しかし、赤痢菌属に対する保護的な免疫応答のためにＬＰＳのみに依存するワクチンは、同種の攻撃には効果的であるが、異種の赤痢菌属種に対する保護をもたらすその潜在的能力が限られており、このため、多価ワクチンを作製するために一価ワクチンを組み合わせることが必要になる。残念ながら、微々たる明かな交差保護とともに、赤痢菌属の血清型が優位であるために、広い反応性を有するＬＰＳ型赤痢菌属ワクチンを設計することはこれまで困難であった。
本発明者らの方法は、天然の毒性構造にある赤痢菌属のＬＰＳおよびタンパク質抗原（Ｉｐａタンパク質を含む）から構成される亜細胞ワクチンであるＩｎｖａｐｌｅｘを使用することである。Ｉｎｖａｐｌｅｘにより、不可欠な抗原が粘膜免疫系に送達され、それにより、Ｉｎｖａｐｌｅｘが単離された赤痢菌属の菌株による感染に対する保護的な免疫応答が（アジュバントの非存在下で）刺激される。生じた免疫応答は、ＬＰＳおよびインベイシンに対する抗体が産生される点で天然の感染を模倣する（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ＆Ｏａｋｓ、２０００、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６８、６６２４〜６６３２）。二価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンを用いた実験を行っているとき、本発明者らは、驚くべきことに、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が、異種のグラム陰性細菌（すなわち、Ｉｎｖａｐｌｅｘの供給源とは異なるグラム陰性細菌）による感染に対する保護をもたらし得ることを発見した。これは、グラム陰性細菌の異種菌株に対する保護をもたらし得る赤痢菌属ワクチンを最初に明らかにするものである。
Ｉｎｖａｐｌｅｘの単離および精製、ならびに同種の細菌（すなわち、Ｉｎｖａｐｌｅｘが調製された細菌）による感染に対するワクチンとしてのその使用が、米国特許第６，２４５，８９２号および同第６，２７７，３７９号に記載される（それらの内容はその全体が参考として本明細書により組み込まれる）。
簡単に記載すると、Ｉｎｖａｐｌｅｘが、ＩｐａＣを赤痢菌属の水抽出物から単離および精製することを目指した初期の実験のときに単離された。通常、ＩｐａＣは増殖培養培地から抽出される。本発明者らは、水抽出物、すなわち、振とうしながら細菌を滅菌水中でインキュベーションすることから得られる溶液を使用することを選んだ。これは、ＩｐａＣの量がそのような抽出物ではより大きくなると仮定したからである。本発明者らが知る限り、グラム陰性細菌の侵入性に関与するタンパク質は、以前には、グラム陰性細菌の水抽出物からは１つも単離されていなかった。本発明者らが驚いたことには、水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの様々な分離技術にかけたとき、ＩｐａＣが水抽出物から検出され得るときには常に、ＩｐａＢ、ＩｐａＤおよびＬＰＳもまた同じ画分に検出されることが見出された。本発明者らは、この複合体を単離し、特徴づけるための方法を設計することにした。様々なＩｎｖａｐｌｅｘ調製物が毒性の侵襲性赤痢菌属細菌から単離される。粗混合物が、水を用いて赤痢菌属細菌から抽出される。この水抽出物は多くのタンパク質およびリポ多糖（ＬＰＳ）からなる。その後、この水抽出物材料をＦＰＬＣイオン交換カラムに負荷し、これにより、Ｉｎｖａｐｌｅｘ（ｉｎｖａｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０と呼ばれる２つの重要なタンパク質ピークが分離される。Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含有する画分が集められる。本発明者らは、複合体が、ＬＰＳに加えて、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤを含む多くのタンパク質から構成されることを見出した。Ｉｐａタンパク質およびＬＰＳを含有するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物は、完全に天然の立体配置および環境で一定の構造を形成する。Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０はまた、ＶｉｒＧ*と、以前には記載されていない７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドとを含有する。Ｉｐａタンパク質およびＶｉｒＧとは異なり、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドは毒性プラスミドにコードされておらず、それにもかかわらず、Ｉｎｖａｐｌｅｘと会合するタンパク質はそれぞれが、赤痢菌属のすべての種の間において高度に保存されており、従って、赤痢菌属のすべての種に共通する、広い反応性を有する抗原を表す。
Ｉｎｖａｐｌｅｘを使用して、動物が免疫化されたとき、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、感染時にグラム陰性細菌によって提示される天然構造に対する免疫応答をもたらす。Ｉｎｖａｐｌｅｘ調製物で免疫化されたマウスおよびモルモットは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物に存在するいくつかの異なる抗原（水抽出物抗原、ＩｐａＣおよびＬＰＳを含む）に対するＩｇＡおよびＩｇＧの顕著な血清応答を示した。これらの２つのＩｎｖａｐｌｅｘ調製物は、ともに粘膜免疫系を刺激するという点で類似していたが、最も考えられることには抗原含有量が異なるために、生じた免疫応答の特異性が異なっていた。これらの動物は、いずれかのＩｎｖａｐｌｅｘを用いた免疫化によって同種のグラム陰性細菌による攻撃から保護された。いずれかのＩｎｖａｐｌｅｘで免疫化された動物は、苦痛または毒性の認められる徴候を何ら示さなかった。
ワクチンとしてのその有効性に加えて、本発明者らは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ製造物が、関係のない混合されたタンパク質を、これらのタンパク質に対する免疫応答を増強する様式で送達し得ることを見出した。従って、赤痢菌属のＩｎｖａｐｌｅｘ製造物は、細菌性赤痢に対するワクチンとして、そして毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）またはカンピロバクター属などの他の粘膜病原体に対するアジュバントとして、その両方で使用される可能性を有する。
マウスの致死的肺モデルを使用して、本発明らは、フレクスナー赤痢菌２ａから得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が同種の攻撃に対して保護的であることを見出している。ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０はマウスを保護したが、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４は保護しなかった。これは、おそらくは、ＬＰＳおよびＩｐａタンパク質のその量が低いためであると考えられる。免疫化された動物（フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０）は、ＬＰＳおよび水抽出物タンパク質に対する抗体を産生した。これは、ヒトにおける天然感染の後に生じる応答と非常に類似する応答である。ＬＰＳ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが不足しているゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスは、Ｉｐａタンパク質またはＬＰＳに対する検出可能な抗体を産生しなかった。これらの結果は、効果的なＩｎｖａｐｌｅｘワクチンは、保護的な免疫応答を刺激するために十分な量のインベイシン類およびＬＰＳを有しなければならないことを示唆していた。
効果的な一価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンを組み合わせて、フレクスナー赤痢菌２ａ／ゾンネ赤痢菌の成功した二価ワクチンが作製された。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４／ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の二価ワクチンで免疫化されたマウスは、フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃から保護された（フレクスナー赤痢菌２ａ（８７％の保護、ｐ＜０．００１）、ゾンネ赤痢菌（１００％の保護、ｐ＜０．００１））。この保護レベルは、同種保護のために使用される一価成分に匹敵していた。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４／ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の二価組合せ物で免疫化されたマウスは、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳおよび水抽出物（ｖｉｒ＋）に対する血清ＩｇＡ抗体応答および血清ＩｇＧ抗体応答を発達させた。これは、一価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンにより誘発される応答と非常に類似している。一価のフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンはいずれも、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかった。
上記に述べられた二価ワクチン研究の一部として、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫化されたコントロールマウス群が異種の抗原で刺激された。例えば、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスがゾンネ赤痢菌で刺激された。この実験では、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスの３０％のみがゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃を生き延びただけであった（ｐ＝０．０５２）。しかし、驚くべきことに、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたマウスはフレクスナー赤痢菌の致死的な攻撃から保護された（８９％の生存、ｐ＜０．００１）（下記の表１を参照のこと）。ＬＰＳが、保護免疫性のための重要な標的抗原であると考えられており、そして赤痢菌属の種の間における大きな抗原性の違いがＬＰＳであるので、異種保護は、典型的には、赤痢菌属ワクチンについては予測されていない。しかし、赤痢菌属のすべての種に存在するＩｐａＢ、ＩｐａＣ、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａを含む保存されたタンパク質の存在は、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより誘発されるこの交差保護的な異種免疫性において極めて重要な役割を果たしていると考えられる。
（要約）
本明細書には、グラム陰性細菌の同種の種（すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘが調製された種）による感染から保護するために効果的であり、かつグラム陰性細菌の異種の種（すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘに寄与しなかった種）による感染に対して効果的であるグラム陰性ワクチンＩｎｖａｐｌｅｘ５０が記載される。
本明細書には、グラム陰性細菌の同種の種（すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘが調製された種）による感染から保護するために効果的であり、かつグラム陰性細菌の異種の種（すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘに寄与しなかった種）による感染に対して効果的であるグラム陰性ワクチンＩｎｖａｐｌｅｘ５０が記載される。
Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンの潜在的な利点には、下記が含まれる。ａ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは、遺伝的変化を必要とすることなく任意の赤痢菌属の種または毒素原性大腸菌から抽出され得る非感染性の物質である；ｂ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは、小動物における鼻内経路によって送達されたとき、安全かつ有効である；ｃ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは、赤痢菌属の多数の種に対する、広い反応性を有する異種免疫性を刺激する潜在的能力を有する；ｄ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは一次ワクチンまたは二次（追加免疫）ワクチンとして使用することができる；ｅ）多価のＩｎｖａｐｌｅｘワクチンを容易に製造し、評価することができる；ｆ）Ｉｎｖａｐｌｅｘのアジュバント様性質のために、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、ＥＴＥＣまたはカンピロバクター属などの他の粘膜病原体に由来する抗原を送達することができ、これにより、腸病原体に対する真の多価ワクチンをもたらす。
従って、本発明の１つの目的は、グラム陰性細菌の血清型または菌株に由来するＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の７２ｋＤａ成分、およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の８４ｋＤａ成分を、同種または異種のグラム陰性細菌に対する保護抗体を動物において誘発させるために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含むグラム陰性ワクチンを提供することである。これらのワクチン成分のいずれかの供給源は、任意の赤痢菌から単離されたＩｎｖａｐｌｅｘ５０などの天然の供給源であり得るか、または例えば、単離された組換えタンパク質およびＬＰＳまたはその一部分を、それらの天然の立体配置において、適正な化学量論的割合で組み合わせることによる組換え供給源であり得る。ワクチンは、同じ種もしくは血清型の赤痢菌属もしくはグラム陰性細菌に由来する成分、または異なる種および血清型の赤痢菌属もしくはグラム陰性細菌に由来する成分を含み得ることが理解される。
従って、本発明の１つの目的は、赤痢菌属の種または血清型に由来するＩｎｖａｐｌｅｘを、同種の赤痢菌属の種、および／またはＩｎｖａｐｌｅｘの供給源に対して異種の１つ以上の種もしくは菌株に対する保護抗体を対象体において誘発するために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含む赤痢菌属ワクチンを提供することである。
本発明の別の目的は、１つ以上のグラム陰性細菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘを、Ｉｎｖａｐｌｅｘの供給源に対して同種または異種である細菌に対する保護抗体を対象体において誘発するために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含むグラム陰性細菌に対するワクチンを提供することである。
本発明の別の目的は、細胞浸入性大腸菌（ＥＩＥＣ）のワクチンで、ＥＩＥＣから得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を、ＥＩＥＣの同種株および異種株に対する保護抗体を対象体において誘発するために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含むワクチンを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、グラム陰性細菌の同種または１つ以上の異種の種もしくは菌株による感染に対する保護をもたらし得るワクチンを調製する方法で、グラム陰性細菌からＩｎｖａｐｌｅｘ５０を単離することを含む方法を提供することである。
本発明のさらなる目的および利点が下記の説明から明らかになる。
（詳細な説明）
本発明は、天然の構造を形成するために一緒に複合体化したＬＰＳとの組合せでインベイシン類を含み、１つ以上の異種の赤痢菌属の種に対する保護的な免疫原として１つの赤痢菌属の種に由来するＩｎｖａｐｌｅｘの使用を記載する。
本発明は、天然の構造を形成するために一緒に複合体化したＬＰＳとの組合せでインベイシン類を含み、１つ以上の異種の赤痢菌属の種に対する保護的な免疫原として１つの赤痢菌属の種に由来するＩｎｖａｐｌｅｘの使用を記載する。
Ｉｎｖａｐｌｅｘは、Ｉｎｖａｐｌｅｘが単離された細菌、および／またはグラム陰性細菌の少なくとも１つの他の異なる菌株もしくは単離体もしくは種による感染から保護するためにグラム陰性細菌の任意の菌株から調製することができる。グラム陰性細菌には、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ＥＩＥＣ、サルモネラ属（チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の種を含む）、エルシニア属（仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉ））、腸病原性大腸菌、リケッチア属、クラミジア属、ブルセラ属、エールリヒア属、エドワードシエラ属、カンピロバクター属およびナイセリア属が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべてが、グラム陰性の構造体を有する侵襲性細菌である（すなわち、これらは、内膜または細胞質膜と、内膜を囲む外膜とを有する）。
野生型の毒性グラム陰性細菌に加えて、Ｉｐａタンパク質の過剰量を発現する変異体、より多くのＩｎｖａｐｌｅｘの産生をもたらし得る変異体などのこれらの生物の変異体も有用であり得る。Ｉｐａタンパク質の合成は赤痢菌属細菌では高度に調節されている。遺伝子ｖｉｒＦが、他の遺伝子が関与するようにこの調節に関与している（Ｓａｋａｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２、５８９〜５９７）。上記および下記において本明細書中に引用される文書はすべて、それらを示すことによってその全体が本明細書により組み込まれる。さらに、その生物がトキシン（例えば、シガトキシン）を産生しないようにトキシン遺伝子に変異を有する細菌からＩｎｖａｐｌｅｘを調製することは有益であり得る。ｔｏｘ−株から調製されたＩｎｖａｐｌｅｘは、トキシンによる潜在的な混入が除かれるので、潜在的に安全性がより大きい。
増大したＩｎｖａｐｌｅｘレベルを、インベイシンタンパク質の分泌を刺激する化学物質の存在下でこの複合体を抽出することによって達成することができる。そのような化学物質には、コンゴーレッド、エバンスブルーおよびダイレクトオレンジが含まれる（Ｂａｈｒａｎｉ，Ｆ．Ｋ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６５：４００５〜４０１０、１９９７）。これらの化学物質は水抽出時または細菌増殖時に加えることができる。
インベイシンタンパク質（赤痢菌属に対するＩｐａタンパク質、または他の侵襲性細菌における類似するタンパク質）を単離するためには、インベイシンタンパク質が細菌によって発現されなければならない。インベイシンタンパク質が表面に発現されないか、または全く発現されない場合、Ｉｎｖａｐｌｅｘは存在しない。例えば、ゾンネ赤痢菌では、Ｉ型培養物が毒性であるので、Ｉ型培養物を使用しなければならない。ＩＩ型培養物は、毒性プラスミドにおける大きい自発的欠失のためにＩｐａタンパク質を発現しない。さらに、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、インベイシンタンパク質をコードする遺伝子が加えられ、その遺伝子を発現させる細菌から単離することができる。そのような細菌は、インベイシンタンパク質を以前から含有し、かつ発現してもよく、またはそうでなくてもよく、そしてＩｎｖａｐｌｅｘの精製の容易さなどの特定の目的のために、または低下したトキシン産生などの好都合な性質のために選ばれる。
赤痢菌属細菌の表面におけるＩｐａタンパク質の提示は、ｓｐａ遺伝子座またはｍｘｉ遺伝子座における遺伝子を変異させることによって低下させることができる。ｓｐａ／ｍｘｉ遺伝子変異体はＩｐａタンパク質を正常な量で作るが、Ｉｐａタンパク質が生物の外部に提示または分泌されない。以前には、低下した量のＩｐａＢおよびＩｐａＣが、ｓｐａ変異体における水抽出物に存在することが示されている（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら、１９９２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４、１９９０〜２００１）。
無毒性培養物を使用することの可能性を克服するためには、Ｉｎｖａｐｌｅｘの供給源として使用される培養物が試験され、毒性であることを証明することが重要である。これは、通常、セレニー（Ｓｅｒｅｎｙ）試験（下記の「材料および方法」および「実施例」に記載されるようなモルモットにおける角結膜炎）によって行われる。毒性を保証する別の手段は、赤色であるコロニー（またはコンゴーレッド色素と結合するコロニー）がほぼ常に毒性であるコンゴーレッド培地で赤痢菌属細菌の培養物を増殖させることである。無毒性の培養物をもたらす自然変異は珍しくないので、毒性の評価は、赤痢菌属細菌の培養物に関して極めて重要である。いくつかの培養物が部分的に毒性であり得るとしても、収量が損なわれるが、Ｉｎｖａｐｌｅｘを単離することは可能であることが理解される。
１つの実施形態において、本発明は、Ｉｎｖａｐｌｅｘをグラム陰性細菌から単離および精製するための方法に関する。本発明の方法では、Ｏａｋｓら（１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、５３、５７〜６３）によって記載される水抽出技術の改善が使用される。これらの改善は、水抽出調製物を調製するための時間を最小限にすることによって機能的生成物の収量を増大させることを目的とした。これらの改善には、Ｉｎｖａｐｌｅｘを濃縮することができるイオン交換カラムを使用することが含まれ、それにより、イオン交換カラムへの負荷に先立って時間のかかる限外ろ過工程によって水抽出物を濃縮しなければならないことが除かれる。限外ろ過は、タンパク質分解的な分解がその間に生じることがある一晩かけて行われることが多かった。Ｉｐａタンパク質は極めて不安定であり、かなり急速に分解する。別の改善は、タンパク質を抽出するために使用される水の量である。本発明の方法では、以前（Ｏａｋｓら、１９８６、上掲）に使用された１／１０の比率の代わりに、培養物を増殖させるために使用された培地の体積の１／２０である体積の水が使用される。例えば、赤痢菌属細菌が２０リットルの培地で増殖させられる場合、１リットルの水が抽出のために使用される。他の改変には、超遠心分離前および／または超遠心分離後の両方で、水抽出物を０．４５ｕｍまたは０．２２ｕｍのメンブランでろ過することが含まれる。この工程により、細菌が水抽出物材料から除かれ、生細菌を含有する可能性が一層小さくなる。この工程は、ヒトでの試験において使用される任意の製造物については必須である。また、Ｏａｋｓ（１９８６、上掲）に記載された最初の手法では、非常に強力で、危険なプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）が使用された。このプロテアーゼ阻害剤は、毒性であるので、もはや使用されない。複合体中のタンパク質の分解を最小限に抑えるために、水抽出物は、タンパク質分解的な分解を最小限に抑えるために氷上で保たれる。
本発明の方法は、細菌細胞を集める工程、滅菌水中で細胞を抽出する工程、膜断片を水抽出物から分離し、捨て、これにより、Ｉｎｖａｐｌｅｘを含有する溶液を得る工程、そしてＩｎｖａｐｌｅｘを溶液から単離する工程を含む。グラム陰性細菌を培養で増殖させることは当業者には知られている。一般的な参照文献については、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８１、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｐ．Ｇｅｐｈａｒｄら編）を参照されたい。増殖に関する培地および条件が、赤痢菌属については下記の「材料および方法」に詳しく議論される。増殖後、細菌細胞は、滅菌水、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、規定生理的食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ）、またはＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の画分が所望のカラムに結合することを条件が可能にする限り、他の緩衝液においても抽出される。
抽出溶液に界面活性剤を含まないことが好ましい。これは、界面活性剤は、イオン交換カラムで一貫した様式で挙動しないことがある混合ミセル（様々なタンパク質を含有するミセル）を形成する傾向があるからである。界面活性剤はまた、Ｉｎｖａｐｌｅｘ製造物を妨害し得る内在性膜タンパク質を可溶化する。最後に、界面活性剤はＩｎｖａｐｌｅｘを破壊または変性させることがあり、そして複合体の個々の成分をすべて可溶化することがある。滅菌水は、当分野で知られている方法によって、例えば、０．１０ミクロン、０．２２ミクロンまたは０．４５ミクロンのフィルターでろ過することによって調製することができる。水に対する細菌細胞の濃度は、好ましくは、１ｍｌの水または緩衝液に対して１×１０7個〜約２×１０12個の細胞であり、より好ましくは１×１０8個〜約２×１０11個の間である。
抽出時間は、長すぎる場合には製造物の分解が生じることがあり、そして短すぎる場合には生成物の収量が悪くなるので、好ましくは調節される。
プロテアーゼ阻害剤を、最終製造物のタンパク質分解を低下させることを助けるために抽出工程のときに加えることができる。添加され得るプロテアーゼ阻害剤の例には、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が含まれる。セリンプロテアーゼ阻害剤などの他のプロテアーゼ阻害剤を利用することができるが、それらは、通常、少し毒性である。Ｉｎｖａｐｌｅｘが生細胞に投与されることになるならば、プロテアーゼ阻害剤の毒性のために、プロテアーゼ阻害剤を使用しないか、または投与に先立ってプロテアーゼ阻害剤を溶液から除くことが好ましい。しかし、ＩｎｖａｐｌｅｘがＥＬＩＳＡ試薬のために使用されることになるならば、プロテアーゼ阻害剤を溶液中に存在させることが好ましいという事実のために、プロテアーゼ阻害剤を溶液中に残すことができる。
次に、細胞および膜断片が、遠心分離、ろ過、マイクロろ過、限外ろ過などの当分野で知られている方法によって溶液から除かれる。しかしながら、限外ろ過が、溶液をイオン交換クロマトグラフィーに供する前に小さい膜断片を除くためには好ましい。抽出後、複合体は、複合体混合物における粒子を分離するために好適な任意の技術によって細胞破片から分離することができる。その後、複合体は、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーまたは他の単離技術によって精製することができる。そのような単離技術には、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、電気泳動、等電点フォーカシング、免疫吸着、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）、迅速ＬＣ（ＦＰＬＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるが、これに限定されない。アニオン交換体には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）｛−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｈ（ＣＨ２ＣＨ３）２｝；四級アミノエチル（ＱＡＥ）｛−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｈ（Ｃ２Ｈ５）−ＣＨ２ＣＨＯＨ−ＣＨ３｝；および四級アンモニウム（Ｑ）｛−ＯＣＨ２ＣＨＯＨ−ＣＨ３ＣＨＯＨ−ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）Ｃ３｝が含まれる。そのような官能基は、粒子サイズがそれぞれ異なる様々な担体に結合させられるが、担体材料に関してもまた異なる。担体材料の例には、モノビーズ、親水性ポリスチレン／ジビニルベンゼンの１０ｕｍのビーズ｛すなわち、Ｍｏｎｏ Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓｕｌａ、スェーデン）｝；ミニビーズ、親水性ポリマーの３ｕｍのビーズ｛すなわち、Ｍｉｎｉ Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝；１５ｕｍ＆３０ｕｍの単分散型の親水性化された剛直ポリスチレン／ジビニルベンゼンビーズ｛すなわち、Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝；セファロース、３４ｕｍ〜５０ｕｍの高架橋度のアガロースビーズ｛すなわち、ＨｉＴｒａｐ Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）｝；セファロース・ファースト・フロー、９０ｕｍのアガロースビーズ｛すなわち、Ｑセファロース・ファースト・フロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝；セファロース・ビッグ・ビーズ、１００ｕｍ〜３００ｕｍのアガロースビーズ｛すなわち、Ｑセファロース・ビッグ・ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝が含まれる。
塩化物イオン（Ｃｌ−）は、アニオン交換クロマトグラフィーのための優れた対イオンであり、この場合、緩衝液の選択は、要求されるｐＨ間隔に依存する。Ｔｒｉｓは、７．６〜８．０の効果的な緩衝化範囲を有するが、使用され得る他の緩衝液には、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン（ｐＨ８．０〜８．５）、ジエタノールアミン（ｐＨ８．４〜８．８）、１，３−ジアミノプロパン（ｐＨ８．５〜９．０）、エタノールアミン（ｐＨ９．０〜９．５）、および潜在的にはピペラジン（ｐＨ９．５〜９．８）が含まれる。これらの緩衝液は、低濃度（通常的には２０ｍＭ）で使用されるが、５０ｍＭもの高濃度にすることができる。
免疫原性および機能が損なわれていないようにＩｎｖａｐｌｅｘの天然構造が維持され、多量の希薄なタンパク質溶液を負荷し、濃縮することが可能になり、そして緩衝液が生物学的に適合し、そして方法が、製造物の分解を最小限に抑えるために迅速であり、かつ処理工程をほとんど必要としない限り、他のカラムまたは方法を使用することができる。
各カラムを赤痢菌属の特定の血清型および菌株に対して専用にすることが好ましい。最終製造物における最適なタンパク質濃度は、１ｍｌあたり約１０回分の用量である。しかし、範囲は、１ｍｌあたり０．１用量（２．５ｕｇ／ｍｌのタンパク質濃度）もの低さから、溶解性が維持される限り、１ｍｌあたり５０００用量（１２５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）のはるかにより大きいレベルにまですることができ、すなわち、高すぎて沈殿を生じさることがなく、かつ低すぎて、ろ過を、過度な費用および時間がかかるものにしない濃度にすることができる。
理想的ではあるが、本発明者らは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０のピーク画分において０．２５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌを達成している。タンパク質濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌ未満である場合、遠心分離またはタンジェンシャルフローによるサイズ排除ろ過（１００００〜１００，０００のｍｗカットオフ、より好ましくは３０，０００のｍｗカットオフ）によって濃縮しなければならない。
下記の「材料および方法」に記載される方法を使用して、最大量のＩｐａＢおよびＩｐａＣを含有する画分が、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０をもたらす２４％緩衝液および５０％緩衝液でイオン交換カラムから溶出された画分に見出された。
この方法では、他のグラム陰性細菌との使用のために最小限に改変する必要がある。例えば、他のイオン交換カラムを使用することができ、そして異なる抗体を、標的抗原についてプローブするために使用しなければならない。例えば、ＳｉｐＢおよびＳｉｐＣに対する抗体を、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）から得られる複合体を含有するピーク画分を同定するために使用しなければならない。エルシニア属では、抗ＹＯＰタンパク質抗体が必要である（ＣｏｒｎｅｌｉｚおよびＷｏｌｆ−Ｗａｔｚ、１９９７、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２３、８６１〜８６７）。
Ｉｎｖａｐｌｅｘを製造するための他の方法では、天然の立体配置を有する複合体を形成させるために、個々のインベイシンタンパク質がＬＰＳと組み合わせられる方法が含まれる。さらに、インベイシン／ＬＰＳ複合体を、上記および下記に記載されるような精製技術によってＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の画分における他の成分からさらに精製することができる。
１つの実施形態において、本発明は、グラム陰性細菌に対する異種保護のためのワクチンに関する。本発明のワクチンは、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の７２ｋＤａ成分、およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の８４ｋＤａ成分を天然の立体配置で含むグラム陰性細菌由来のＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む。本発明のワクチンは、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが単離されたグラム陰性細菌とは異種のグラム陰性細菌、すなわち、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが単離されたグラム陰性細菌とは異なるグラム陰性細菌による感染から保護するために、対象体を免疫化するために使用することができる。本発明のワクチンは、上記または下記に詳しく記載される方法を使用してＩｎｖａｐｌｅｘ５０を単離することによって、あるいは組換えタンパク質を単離し、それらを組み合わせて、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０様の組成物を形成させることによって調製することができる。１つ以上の単離されたＩｎｖａｐｌｅｘが、当分野で知られている方法によって、哺乳動物への投与のために調製される。そのような方法には、溶液を滅菌するためにろ過すること、溶液を希釈すること、アジュバントを加えること、および溶液を安定化させることを挙げることができる。本発明の具体的な利点の１つが、Ｉｎｖａｐｌｅｘ調製物は、アジュバントまたはキャリアなどの免疫増強剤とともに投与される必要がないということである。Ｉｎｖａｐｌｅｘ自体がそのような免疫増強剤として機能するからである。この特徴は、本発明の組成物で、免疫増強剤の使用を排除するものではない。そのため、１つの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のＩｎｖａｐｌｅｘと、１つ以上のアジュバントまたはキャリアとを含むことができる。
アジュバントは、典型的には、特定の抗原に対する動物の免疫応答を一般には高める物質である。好適なアジュバントには、フロイントアジュバント、他の細菌細胞壁成分、アルミニウムに基づく塩、カルシウムに基づく塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清タンパク質、ウイルスのコートタンパク質、他の細菌由来調製物、γ−インターフェロン、ブロック共重合体アジュバント（Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント（ＣｙｔＲｘ（商標），Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＯ）から入手することができる）など）、ならびにサポニン類およびその誘導体（Ｑｕｉｌ Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ／Ｓ（デンマーク）から入手することができる）が含まれるが、これらに限定されない。
キャリアは、典型的には、処置されている動物において治療組成物の半減期を増大させる化合物である。好適なキャリアには、ポリマーの制御放出配合物、生分解性インプラント、リポソーム、オイル、エステルおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されない。
ワクチンは、輸送および貯蔵における容易さのために、乾燥された形態でグラム陰性細菌に対するワクチンを製造するために凍結乾燥することができる。乾燥された組成物は経口送達のために使用することができる。Ｉｎｖａｐｌｅｘはまた、ワクチンが投与される生物によって許容される等張性の緩衝液などの薬学的に受容可能な賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤の例には、水、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の水性の生理学的平衡塩溶液が含まれる。非水性ビヒクル、例えば、固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどもまた使用することができる。他の有用な配合物には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの粘度増強剤を含有する懸濁物が含まれる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を高める物質などの添加剤の少量を含有することができる。緩衝液の例には、リン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が含まれ、一方、保存剤の例には、チメロサール、ｍ−クレゾールまたはｐ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的な配合物は、液体の注射剤、または注射用の懸濁物もしくは溶液として好適な液体に溶解され得る固体のいずれかにすることができる。従って、非液体の配合物において、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブミン、および／または無菌の水もしくは生理的食塩水が投与前に添加され得る保存剤を含むことができる。
さらに、ワクチンは、添加された抗原がワクチンの有効性を妨げず、副作用および有害な反応が付加的または相乗的に増大しない限り、上記に記載された１つ以上のＩｎｖａｐｌｅｘと、少なくとも１つの他の抗原とを含有する混合ワクチンの形態で調製することができる。ワクチンは、ワクチンの溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る化学的成分と組み合わせることができる。あるいは、そのような成分はワクチンの毒性を低下させることができ、またはワクチンの何らかの望ましくない副作用などを除去もしくは弱化させることができる。そのような作用を媒介し得る様々な成分がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。そのような成分を分子に結合させるための様々な手法が当分野では広く知られている。
ワクチンは、密封されたバイアルまたはアンプルなどに貯蔵することができる。本発明のワクチンは、一般には、鼻腔内投与されるスプレー剤の形態で、あるいは点鼻剤、吸入剤、扁桃での塗布物、または経口投与されるカプセル、液剤、懸濁剤もしくはエリキシル剤によって投与することができる。ワクチンが乾燥形態である場合、ワクチンは、投与前に、滅菌された蒸留水または脱イオン水に溶解または懸濁される。
一般に、ワクチンは、中和抗体を産生させ、感染または疾患からの保護を生じさせるために効果的な用量で、経口投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与または筋肉内投与によって、しかし、好ましくは、鼻腔内投与または経口投与、直腸投与および膣投与によって対象体に投与することができる。本発明の組成物を使用する粘膜ワクチン接種は、血清中に殺菌性の抗体を誘導することに加えて、粘膜表面に分泌性抗体を誘導するので、効果的なワクチン接種経路であると考えられる。
対象体により、動物、鳥類、魚類、およびヒトを含む哺乳動物が意味される。ワクチンは、単回用量調製物の形態であり得るか、または集団ワクチン接種計画のために使用され得る多回用量フラスコであり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、Ｏｓｏｌ編、１９８０）；およびＮｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｖｏｌｌｅｒら編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、１９７８）がワクチンの調製方法および使用方法について参照される。効果的な様式で組成物を投与するための受け入れられ得るプロトコルには、個々の用量サイズ、投薬回数、投薬頻度、および投与様式が含まれる。そのようなプロトコルの決定は当業者によって達成され得る。Ｉｎｖａｐｌｅｘ組成物の好ましい単回用量は約０．１ｕｇ／ｋｇ体重〜約１００ｕｇ／ｋｇ体重である。追加免疫剤が、生物の免疫応答がもはや効果的に変化しないとき、好ましくは投与される。そのような組成物は、最初の投与の後、約２週間後〜数年後に投与することができる。好ましい投与スケジュールは、生物の体重１ｋｇあたり約０．５ｕｇ〜約１０ｕｇの組成物が約１ヶ月〜約６ヶ月の期間にわたって約１回〜約４回投与されるスケジュールである。
別の実施形態において、本発明は、患者におけるグラム陰性感染症状を低下させる方法で、上記に記載されるように、Ｉｎｖａｐｌｅｘに対するポリクローナル抗体、またはＩｎｖａｐｌｅｘに対するモノクローナル抗体の組合せのいずれかで、効果的な量のＩｎｖａｐｌｅｘ抗体（ヒトにおいて作製される抗体を含む）を前記患者に投与することによる方法に関する。患者にＩｎｖａｐｌｅｘ抗体が与えられるとき、投与される投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全体的な医学的状態、以前の病歴などのような要因に依存して変化する。一般には、約１ｐｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲にある上記化合物の投薬量を受容者に与えることが望ましい。しかし、より少ない投薬量またはより多い投薬量を投与することができる。
本発明はまた、上記に記載されるような医薬品（予防用医薬品、すなわち、ワクチン、または治療用医薬品、すなわち、治療剤）を、使用法が印刷されているか、またはグラム陰性細菌の感染により引き起こされる状態を防止もしくは処置するために患者に医薬品を投与することに関する添付物を伴う容器（好ましくは、充填済みのシリンジまたはガラス製バイアル）に含むキットを提供する。
下記には、本発明の範囲を限定するためではなく、例示目的のためだけに提供される本発明の実施例が記載される。当業者には自明である、当分野で通常的に遭遇する様々な条件およびパラメーターの他の好適な改変および適合化は、本発明の精神および範囲に含まれる。
下記の方法および材料が下記の実施例において使用された。
［実施例］
［実施例］
（材料および方法）
細菌の増殖および菌株。本研究において使用された赤痢菌属菌株はＷＲＡＩＲコレクションの一部である。使用された菌株には、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ（２４５７Ｔ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）（Ｍｏｓｌｅｙ）、およびボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）２、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−Ｗ、Ｖｉｒ＋）、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−５５、Ｖｉｒ−）、フレクスナー赤痢菌２ａ（Ｍ４２−４３ａ、Ｖｉｒ−）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１（Ｕｂｏｎ）、そして細胞侵入性大腸菌Ｑ１５２が含まれる。コンゴーレッドＴＳＡ平板で増殖する単離された赤色の赤痢菌属コロニーを使用して、５０ｍｌのＰｅｎＡｓｓａｙ（抗生物質培地＃３、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）培養液に３７℃で接種した。４時間増殖させた後、１０ｍｌの対数期培養物を１リットルの事前に加温（３７℃）されたＰｅｎＡｓｓａｙ培養液のそれぞれに加えた。これらの１リットル培養物を振とうインキュベーターで３７℃において一晩インキュベーションした。
細菌の増殖および菌株。本研究において使用された赤痢菌属菌株はＷＲＡＩＲコレクションの一部である。使用された菌株には、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ（２４５７Ｔ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）（Ｍｏｓｌｅｙ）、およびボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）２、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−Ｗ、Ｖｉｒ＋）、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−５５、Ｖｉｒ−）、フレクスナー赤痢菌２ａ（Ｍ４２−４３ａ、Ｖｉｒ−）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１（Ｕｂｏｎ）、そして細胞侵入性大腸菌Ｑ１５２が含まれる。コンゴーレッドＴＳＡ平板で増殖する単離された赤色の赤痢菌属コロニーを使用して、５０ｍｌのＰｅｎＡｓｓａｙ（抗生物質培地＃３、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）培養液に３７℃で接種した。４時間増殖させた後、１０ｍｌの対数期培養物を１リットルの事前に加温（３７℃）されたＰｅｎＡｓｓａｙ培養液のそれぞれに加えた。これらの１リットル培養物を振とうインキュベーターで３７℃において一晩インキュベーションした。
赤痢菌属タンパク質の水抽出。Ｏａｋｓらによって記載された最初の水抽出法の改変を使用して、赤痢菌属のインベイシン複合体が単離される材料を調製した。典型的には、毒性赤痢菌属細菌の４リットルの一晩培養物を水抽出物の１回の回分処理のために使用した。細菌細胞を遠心分離によって集め、（０．４５ｕｍのメンブランでろ過された）滅菌脱イオン水に、１リットルの一晩培養物あたり５０ｍｌの容量で懸濁し、その後、振とう式の水浴（約２００ｒｐｍ）で２時間、３７℃でインキュベーションした。水による抽出の後、細胞を１６０００×ｇで３０分間の４℃での遠心分離によって集めた。上清を集め、１００，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離して、膜断片をペレット化した。水抽出物の１回の回分処理について１００，０００×ｇの上清のすべてをまとめて、−７０℃で保存した。水抽出物は、可能なときには氷上に保たれ、プロテアーゼ阻害剤は手順のときに使用されなかった。
水抽出物の特徴づけ。水抽出物の各回分処理物の総タンパク質含有量をビシコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって測定した。水抽出物を、ＩｐａＢに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍａｂ ２Ｆ１、Ｍｉｌｌｓら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６、２９３３）およびＩｐａＣに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍａｂ ２Ｇ２、Ｍｉｌｌｓら、１９８８、上掲）を使用するウエスタンブロットまたはスポットブロットによってＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在について分析した。これらのＩｐａタンパク質について陽性である水抽出物のみをインベイシン複合体の精製のために使用した。
ＦＰＬＣ（迅速タンパク質液体クロマトグラフィー）。イオン交換クロマトグラフィーを使用して、インベイシン複合体画分を水抽出物から単離した。５ｍｌのアニオン交換ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑまたは５０ｍｌのＨｉＬｏａｄ（商標）２６／１０Ｑセファロース・ハイ・パーフォーマンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のいずれかのカラムを、周囲温度で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（ｐＨ９．０）（緩衝液Ａ）で平衡化させた。負荷前に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．２Ｍ、ｐＨ９．０）を水抽出物サンプルに２０ｍＭの最終濃度に加え、その後、水抽出物の２０ｍｌ〜９００ｍｌ（約８ｍｇ〜３００ｍｇの総タンパク質）を、５ｍｌのカラムについては２ｍｌ／分の流速で、５０ｍｌのカラムについては６ｍｌ／分の流速でカラムに負荷した。負荷後、カラムを少なくとも６倍のカラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。すべての溶出を、２４％緩衝液Ｂのステップ、その後、５０％緩衝液Ｂのステップからなるステップグラジエントで行い、最後に、カラムを１００％緩衝液Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）で洗浄した。カラムを通過するタンパク質を２８０ｎｍでモニターし、マッキントッシュ・コンピューター・オペレーティングシステム用のＰｏｗｅｒＣｈｒｏｍデータ収集および分析ソフトウエア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって記録した。２ｍｌ〜２．５ｍｌの画分をポリプロピレンチューブに集め、直ちに−７０℃に置いた。２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ２８０）が前回の緩衝液ステップに対するベースラインに戻った後、緩衝液ステップを変えた。緩衝液Ｂ希釈液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）であった。１００％緩衝液Ｂでの洗浄の後、カラムは緩衝液Ａで再び平衡化され、その後、次回の操作が行われた。本研究で使用された各カラムは赤痢菌属の特定の血清型および菌株に対して専用であった。
各画分をＩｐａＣおよびＩｐａＢの存在についてスポットブロットによって分析した。２４％緩衝液Ｂにおいて最大量のＩｐａＢおよびＩｐａＣを含有する画分（通常、１または２）を、５０％緩衝液ＢにおけるピークＩｐａタンパク質画分がそうであるようにまとめて、操作用のＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０をそれぞれ得た。Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の処理物は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤの含有量（ウエスタンブロットによって決定される）、ＬＰＳ含有量（ゲルの銀染色分析（下記参照）によって決定される）、ならびに総タンパク質組成に関して比較的類似していると決定されると、一緒にされ、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０の特定の「ロット」として特定され、−８０℃で保存された。
水抽出物およびＬＰＳのＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡにおいて使用された抗原には、フレクスナー赤痢菌５のｖｉｒ＋株（Ｍ９０Ｔ−Ｗ）およびｖｉｒ−株（Ｍ９０Ｔ−５５）から得られた水抽出物、そしてフレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌のいずれかに由来する精製ＬＰＳが含まれる。抗原を炭酸塩のコーティング緩衝液（０．２Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．８）で希釈し、ポリスチレンの９６ウエルの抗原プレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）に１ｕｇ／ウエルの濃度で加えた。一次抗体をカゼイン（２％カゼイン／Ｔｒｉｓ−生理的食塩水緩衝液、ｐＨ７．５）で希釈し、抗原コーティングプレートとともに２時間インキュベーションした。０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ（１０．７５ｍＭのリン酸ナトリウム、１４５ｍＭのＮａＣｌ）で４回洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼでコンジュゲート化された市販の抗モルモットＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧまたは抗マウスＩｇＡ（Ｋｉｒｋｇａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でプローブした。ＥＬＩＳＡ基質はパラ−ニトロフェニルホスファート（０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ2および０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）において１ｍｇ／ｍｌ）であった。Ｏ．Ｄ．をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）のＥＬＩＳＡプレート読取り装置で４０５ｎｍにおいて測定した。
表面に露出したタンパク質に対する抗体のアフィニティー精製。ニトロセルロースディスクをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）平板の表面に置き、寒天表面に付着させた。１コロニーの毒性フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−Ｗ）を１．０ｍｌの０．９％生理的食塩水に懸濁して、これをニトロセルロースメンブランの表面全体に広げ、多数の単離されたコロニーを、３７℃で一晩増殖させた後に得た。ディスクを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．９％生理的食塩水（Ｔｒｉｓ−生理的食塩水）で洗浄した後、アジ化ナトリウムを含有する２％カゼイン溶液で少なくとも３０分間ブロッキングした。ゾンネ赤痢菌Ｍｏｓｌｅｙから得られたＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、かつ３ｘ１０8個のゾンネ赤痢菌５３Ｇで眼内に攻撃された動物から得られた回復期のモルモット血清を２％カゼイン増量液で１：３００に希釈し、ニトロセルロースディスクと室温で４時間インキュベーションした。その後、それぞれのニトロセルロースディスクを徹底的に洗浄し、続いて抗体の溶出を最少量の０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で３０分間行った。溶出された抗体を集め、Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ７．４に中和した。アフィニティー精製された抗体を２％カゼイン増量液での１：３の希釈で使用して、ウエスタンブロットをプローブした。
電気泳動およびウエスタンブロット。ウエスタンブロットを、以前に記載されるように行った。ウエスタンブロットにおいて使用された抗血清には、ＩｐａＢに対するモノクローナル抗体（２Ｆ１）、ＩｐａＣに対するモノクローナル抗体（２Ｇ２）、およびＩｐａＤに対するモノクローナル抗体（１６Ｆ８、Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌら、１９８８、上掲）、そしてすべてのＩｐａタンパク質（ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤ）およびＶｉｒＧに対する抗体を含有するサル回復期血清プール（Ｍ２１３）が含まれた。ウエスタンブロットのために使用されたモルモット血清は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物から得られた（図１３）。これらの血清は０日目（採血前）および４２日目（免疫化後１４日目）に集められた。血清は、ウエスタンブロットのために１／３００で希釈された。
銀染色を使用して、ゲルへの負荷の前にプロテイナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）で処理されたサンプルにおけるＬＰＳを染色した。
Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の免疫原性および保護能。Ｉｎｖａｐｌｅｘ画分がＢａｌｂ／ｃＢｙＪマウスにおいて免疫応答を促進する能力を、１０匹〜１５匹のマウスからなる群で試験した。各マウスは、フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌から得られた５ｕｇのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０で、０日目、１４日目および２８日目に鼻腔内に免疫化された。二価ワクチンが、等量のフレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０を組み合わせることによって組み立てられた（用量あたり各５ｕｇ）。生理的食塩水が、コントロール動物を免疫化するためにを使用された。２５ｕｌの総抗原容量が、ミクロピペットで外側の鼻孔に付けられた５滴〜６滴の小さい液滴で送達された。血液を、０日目、２８日目および４２日目に、すべてのマウスからの尾採血によって採取した。
フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで最後の免疫化を行った３週間後、マウス（１５匹／群）は、マウス肺モデルについて記載されるように致死量のフレクスナー赤痢菌２ａ（２４５７Ｔ）（１．０ｘ１０7ｃｆｕ／３０ｕｌ）またはゾンネ赤痢菌（８．０ｘ１０6ｃｆｕ／３０ｕｌ）で鼻腔内に攻撃された。生理的食塩水で免疫化されたコントロールマウスがそれぞれの攻撃因子について操作された。動物の二連の群を、フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌のいずれかでの平行した攻撃のために、それぞれの一価ワクチン、二価ワクチン、または生理的食水で免疫化した。
マウスへの攻撃用量は、赤痢菌属細菌について最適な侵襲性の時期である対数期の増殖時に集められ、その後、液体窒素中で保存されていたフレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌の凍結ロットから調製された（Ｏａｋｓ、未発表データ）。鼻腔内の免疫化または攻撃の前に、マウスはケタミン塩酸塩（４０ｍｇ／ｋｇ）（Ｋｅｔａｓｅｔ（登録商標）、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、Ｉｏｗａ）およびキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、Ｋａｎｓａｓ）の混合物で麻酔された。
統計学的分析。統計学的コンピューター計算をＳｔａｔｖｉｅｗプログラム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）により行った。フィッシャーの直説法を保護実験のために使用し、ウィルコクスンの符号付順位検定を血清学的データの分析のために使用した。線形回帰を用量応答実験データの分析のために使用した。
赤痢菌属Ｉｎｖａｐｌｅｘ（インベイシン複合体）が、無傷の毒性赤痢菌属細菌を水で抽出し、その後、水抽出物のアニオン交換クロマトグラフィーによって調製される。０．２４ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＣｌのステップグラジエントで溶出されたピーク部分には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳが含有される（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ、２０００、上掲）。これらのピーク部分は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０と呼ばれる。両方のＩｎｖａｐｌｅｘピーク部分はモルモットにおいて保護的である。Ｉｎｖａｐｌｅｘの２つの形態の共通する成分には、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤが含まれる。しかし、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、ＶｉｒＧ*、そして以前には記載されていない７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドを含むさらなる抗原性タンパク質を含有する。７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドに対する抗体が、フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットにおいて産生され、そして、これらのタンパク質は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌の間で血清学的に交差反応し得る（図１３、図１５、図１６）。７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドは毒性プラスミドにコードされていない。
Ｉｎｖａｐｌｅｘの両方の形態が、赤痢菌属の４つの種のすべてから、そしてまた細胞侵入性大腸菌からも単離される。しかし、ゾンネ赤痢菌の場合、少数の特有の違いが認められる。ゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４は、赤痢菌属の他の種から単離されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４と比較して、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳの量が不足している。対照的に、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、タンパク質含有量およびＬＰＳ含有量に関して、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０と非常に類似している。ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌および細胞侵入性大腸菌から単離されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘと類似している。サイズ排除クロマトグラフィーによるＩｎｖａｐｌｅｘのさらなる特徴づけにより、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳのみを含有するフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４において高分子量の複合体（ＨＭＭＣ、推定されるサイズは１００万ダルトン〜２００万ダルトンの間である）が同定された。類似する高分子量ピーク成分がフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０から単離されたが、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳに加えて、これにはまた、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドが含有される。興味深いことに、この高分子量複合体（図１３におけるＨＭＭＣ複合体またはＨｉＭＷ複合体）は、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４では見出されておらず、しかし、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０には存在する（図２０）。ＨＭＭＣがＩｎｖａｐｌｅｘ製造物の機能的な抗原性成分であるかどうかは未だ明らかにされていない。
今日まで、本発明者らの研究では、フレクスナー赤痢菌２ａから得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０がマウス致死肺モデルにおいて同種の攻撃に対して保護的であることが示されている（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ＆Ｏａｋｓ、２０００、上掲；Ｏａｋｓ、１９９９、上掲）。ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０もまたマウスにおいて保護をもたらすが、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４は保護をもたらさない。免疫化された動物（フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０）はＬＰＳおよび水抽出物に対する抗体を産生し、これは、ヒトにおける天然感染の後に生じる応答と非常に類似する応答である。ＬＰＳ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが不足しているゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスは、Ｉｐａタンパク質またはＬＰＳに対する検出可能な抗体を産生せず、攻撃から保護されなかった。これらの結果は、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが保護的であるためには、保護的な免疫応答を生じさせるために十分な量のインベイシン類およびＬＰＳを有することが必要であることを示している。
他の実験において、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫化されたマウスが異種の病原体で攻撃された。例えば、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスがゾンネ赤痢菌で攻撃された。これらの実験では、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスの３０％のみがゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃を生き延びただけであった（ｐ＝０．０５２）。しかしながら、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたマウスはフレクスナー赤痢菌の致死的な攻撃から保護された（８９％が生存した（ｐ＜０．００１））（表１および図１〜図３）。図２における体重の減少および回復の結果は、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫化されたマウスが同種の病原体による感染の１日後〜３日後に回復し始めることを示している。異種の病原体で攻撃された免疫化マウス（例えば、フレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０免疫化マウス）もまた、初期の体重減少の後に回復した。
これらの結果は、赤痢菌属の異種の種（フレクスナー赤痢菌２ａ）に対する保護がゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより達成され得ることを示している。これらの結果は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより刺激される保護免疫性が、フレクスナー赤痢菌およびゾンネ赤痢菌の両方に共通するタンパク質に向けられ得ることを示唆している。そうであるならば、類似する保護免疫性がボイド赤痢菌および志賀赤痢菌に対して可能になり得る。
異種保護は、典型的には、赤痢菌属ワクチンについては予測されていない。これは、ＬＰＳが、保護免疫性に対する重要な標的抗原であると考えられ、そして赤痢菌属の種の間における主要な抗原性の違いがＬＰＳであるからである。しかし、赤痢菌属のすべての種に存在する、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを含む保存されたタンパク質の存在は、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより誘発されるこの交差保護的な異種免疫性において極めて重要な役割を果たしていると考えられる。さらに、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４と比較したとき、少数のさらなる抗原を有する。具体的には、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドがＩｎｖａｐｌｅｘ５０には存在しており、これらは種間において免疫原性であり、かつ交差反応性である。上記に記載された異種の攻撃研究における免疫応答の評価（図５〜図１２）は、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化された動物が、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳおよび水抽出物（ｖｉｒ＋）に対する著しい血清ＩｇＡ免疫応答および血清ＩｇＧ免疫応答を発達させたことを示している。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンで免疫化されたマウスは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ、そしてまた水抽出物に対するＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を産生した。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンはいずれも、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかった。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物のウエスタンブロット分析により、ＩｐａＢおよび８４ｋＤａの抗原に対する抗体が産生され、これに対して、フレクスナー赤痢菌２４については、ＩｐａＢおよびＩｐａＣに対する抗体のみがウエスタンブロットで認められたことが示される（図１３）。
上記に記載された異種の攻撃研究における免疫応答の評価（図５〜図１２）は、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化された動物が、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳおよび水抽出物（ｖｉｒ＋）に対する著しい血清ＩｇＡ免疫応答および血清ＩｇＧ免疫応答を発達させたことを示している。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンで免疫化されたマウスは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ、そしてまた水抽出物に対するＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を産生した。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンはいずれも、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかった。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物のウエスタンブロット分析により、ＩｐａＢおよび８４ｋＤａの抗原に対する抗体が産生され、これに対して、フレクスナー赤痢菌２４については、ＩｐａＢおよびＩｐａＣに対する抗体のみがウエスタンブロットで認められたことが示される（図１３）。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットにおけるＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）。
２週間の間隔で与えられたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の３回の鼻腔内用量（２５μｇ）で免疫化されたモルモットから得られた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を様々な赤痢菌属抗原とインキュベーションして、様々な赤痢菌属抗原に対するＩｇＡを分泌する循環Ｂ細胞の数を測定した。血液が最後の免疫化の１週間後に集められた。１００万細胞あたりのＡＳＣ数が示される。ＰＢＬを、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（Ｓｏｎ ＬＰＳ）、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｓｏｎ ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｆｌｅｘ ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（Ｆｌｅｘ ＩＶＰ２４）およびフレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（Ｆｌｅｘ ＬＰＳ）を含む５つの異なる赤痢菌属抗原とインキュベーションした。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳおよびゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０に対する抗体を分泌する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を産生し、しかしフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０およびフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４に対する抗体を分泌する抗体分泌細胞をも産生するが、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳに対する抗体を分泌する抗体分泌細胞を産生しない（図１４）。このことは、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が異種の免疫応答を刺激することを示す本発明者らのデータを裏付けている。
２週間の間隔で与えられたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の３回の鼻腔内用量（２５μｇ）で免疫化されたモルモットから得られた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を様々な赤痢菌属抗原とインキュベーションして、様々な赤痢菌属抗原に対するＩｇＡを分泌する循環Ｂ細胞の数を測定した。血液が最後の免疫化の１週間後に集められた。１００万細胞あたりのＡＳＣ数が示される。ＰＢＬを、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（Ｓｏｎ ＬＰＳ）、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｓｏｎ ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｆｌｅｘ ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（Ｆｌｅｘ ＩＶＰ２４）およびフレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（Ｆｌｅｘ ＬＰＳ）を含む５つの異なる赤痢菌属抗原とインキュベーションした。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳおよびゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０に対する抗体を分泌する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を産生し、しかしフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０およびフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４に対する抗体を分泌する抗体分泌細胞をも産生するが、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳに対する抗体を分泌する抗体分泌細胞を産生しない（図１４）。このことは、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が異種の免疫応答を刺激することを示す本発明者らのデータを裏付けている。
すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＬＨ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１５）（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＬＨ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印により示される。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＬＨ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１５）（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＬＨ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印により示される。
すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。
フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてフレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＲＳ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１６）（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＲＳ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印により示される。
フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてフレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＲＳ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１６）（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＲＳ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印により示される。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１７）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１７）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。
フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、その後、フレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１８）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、その後、フレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１８）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
赤痢菌属細菌表面におけるＩｎｖａｐｌｅｘ５０の交差反応性タンパク質抗原の同定。
赤痢菌属細菌の表面に局在化する抗原と反応し得る抗体を精製するために抗体の表面アフィニティー精製を使用して、細菌の表面において接近可能なエピトープを有するとしてゾンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０に見出される新しく記載される抗原を同定することが可能である。そのような表面露出抗原は、感染宿主における細菌の抗体媒介による殺傷または除去のための標的であると考えられる。
赤痢菌属細菌の表面に局在化する抗原と反応し得る抗体を精製するために抗体の表面アフィニティー精製を使用して、細菌の表面において接近可能なエピトープを有するとしてゾンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０に見出される新しく記載される抗原を同定することが可能である。そのような表面露出抗原は、感染宿主における細菌の抗体媒介による殺傷または除去のための標的であると考えられる。
表面タンパク質が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質に対する抗体を（他のタンパク質抗原に対する抗体もまた一緒に）含有する回復期の抗血清を完全な無傷の毒性赤痢菌属細菌とインキュベーションすることによって同定された。短時間のインキュベーション、および非特異的に結合した抗体を除くための洗浄を行った後、表面抗原に結合した抗体を低いｐＨのグリシン緩衝液で溶出した。溶出された抗体溶液をｐＨ７．４に中和し、続いてウエスタンブロットにおいて使用した（図１９）。ブロットにおいて、アフィニティー精製された血清によって認識されるタンパク質バンドのすべてが表面露出であると考えられた。図１９におけるウエスタンブロット（「アフィニティー精製、１：３」でのレーン；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であり、右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物である）は、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、６４ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが赤痢菌属の表面に露出していたことを示している。いくつかのタンパク質が、アフィニティー精製前の抗血清中の抗体により認識される（「全細胞、１：３００」での２つのレーンを参照のこと；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であり、右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物である）が、これらのタンパク質は、アフィニティー精製された血清により認識されなかった。このことは、これらのタンパク質におけるエピトープは赤痢菌属の表面に露出しておらず、従って、このアフィニティー精製技術によって回収されなかったことを示している。表面タンパク質抗原の本質的には同じセットが、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（左側パネル）またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（右側パネル）のいずれかで免疫化されたモルモットから得られたアフィニティー精製の抗血清によって認識された。各パネルの中央レーンは、示された標準物のサイズ（ｋＤａ単位）を有する分子量マーカーである。
赤痢菌属Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０から単離された高分子量複合体（ＨＭＭＣ−５０）の特徴づけ。高分子量複合体（ＨＭＭＣ）がサイズ排除クロマトグラフィーによってＩｎｖａｐｌｅｘ調製物から単離される。図２０のパネルＡには、抗ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０モルモット血清でプローブされた赤痢菌属ＨＭＭＣ−５０のウエスタンブロットが示される。この抗血清は、ＨＭＭＣ−５０に存在する、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢ、５８ｋＤａおよびＩｐａＣのバンドと反応する。図２０のパネルＢは、ＩｐａＢおよびＩｐａＣに対するモノクローナル抗体でプローブされたＨＭＭＣ−５０のウエスタンブロットである。ＩｐａＢおよびＩｐａＣのバンドが示される。図２０のパネルＣは、典型的なＬＰＳバンド形成パターンを示す、プロテイナーゼＫで処理されたＨＭＭＣ−５０の銀染色ゲルである。
異種免疫性がゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０によって誘導されるという予想外の発見は拡張される。これらの研究は、異種免疫性の原因となる重要な抗原を同定しようとするものである。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０およびフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種と交差反応し得る抗体を誘導した（図１７、図１８および図２０）。この血清の特異性には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質に対する抗体が含まれる。現在、候補となるタンパク質には、Ｉｐａタンパク質、そしてまた７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドが含まれる。さらに、赤痢菌属の表面抗原に対してアフィニティー精製された抗体を使用して、下記のタンパク質が赤痢菌属の表面に突き止められた：ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６４ｋＤａのタンパク質。インベイシン類および他のタンパク質がほぼもっぱらＩｎｖａｐｌｅｘのＨＭＭＣに存在することにより、これらのタンパク質が研究のために単離され得る手段が提供される。
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- 無傷の毒性赤痢菌属細菌を水で抽出し、その後、水抽出物のアニオン交換クロマトグラフィーによって調製され、０．２４ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＣｌのステップグラジエントで溶出されたピーク部分に含有される、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、およびＩｐａＤに加え、ＶｉｒＧ * 、並びに７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドを含むさらなる抗原性タンパク質を含有する、ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む組成物の使用であって、フレクスナー赤痢菌２ａ、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌、及び腸管組織侵入大腸菌（ＥＩＥＣ）から選ばれる細菌による感染に対する治療用および／または病気予防用薬剤の製造のためのゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む組成物の使用。
- 無傷の毒性赤痢菌属細菌を水で抽出し、その後、水抽出物のアニオン交換クロマトグラフィーによって調製され、０．２４ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＣｌのステップグラジエントで溶出されたピーク部分に含有される、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、およびＩｐａＤに加え、ＶｉｒＧ * 、並びに７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドを含むさらなる抗原性タンパク質を含有する、ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０の高分子量タンパク質（７２ＫＤａおよび８４ＫＤａ）を含む、フレクスナー赤痢菌２ａ、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌、及び腸管組織侵入大腸菌（ＥＩＥＣ）から選ばれる細菌による感染から保護し得る免疫応答を対象体において誘導するための組成物。
- フレクスナー赤痢菌２ａ、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌、及び腸管組織侵入大腸菌（ＥＩＥＣ）から選ばれる細菌による感染から保護するためのワクチンであって、無傷の毒性赤痢菌属細菌を水で抽出し、その後、水抽出物のアニオン交換クロマトグラフィーによって調製され、０．２４ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＣｌのステップグラジエントで溶出されたピーク部分に含有される、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、およびＩｐａＤに加え、ＶｉｒＧ * 、並びに７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドを含むさらなる抗原性タンパク質を含有する、ゾンネ赤痢菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含むワクチン。
- フレクスナー赤痢菌２ａ、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌、及び腸管組織侵入大腸菌（ＥＩＥＣ）から選ばれる細菌による感染に対する免疫性を提供する薬剤の製造のための請求項３に記載されるワクチンの使用。
- 前記ワクチンが、経口的、直腸的、皮下、皮内または筋肉内、鼻腔内および経皮からなる群から選択される投与様式に調製される、請求項４の使用。
- 請求項３のワクチンを保持するための容器手段を含むキット。
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