BE1022553B1 - Mutants de spy0269 - Google Patents

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BE1022553B1
BE1022553B1 BE2015/5285 BE1022553B1 BE 1022553 B1 BE1022553 B1 BE 1022553B1 BE 2015/5285 BE2015/5285 BE 2015/5285 BE 1022553 B1 BE1022553 B1 BE 1022553B1
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BE
Belgium
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gas40
polypeptide
seq
amino acid
substitutions
Prior art date
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BE2015/5285
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English (en)
Inventor
Romina D'AURIZIO
Marilena Gallotta
Guido Grandi
Y Ros Immaculada Margarit
Mariarosa Mora
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
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Abstract

L'invention concerne des antigènes mutés dérivés du spy0269 de Streptococcus pyogenes et leur utilisation dans des compositions immunogènes et des compositions vaccinales.
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Description

MUTANTS DE SPY0269
Domaine technique L’invention concerne les domaines de l’immunologie et de la vaccinologie. En particulier, elle concerne des antigènes mutés dérivés de Streptococcus pyogenes Spy0269 et leur utilisation dans des compositions immunogènes et des compositions vaccinales.
Contexte de l'état de l’art
Le streptocoque du groupe A (« GAS », S. pyogenes) est une bactérie en forme de coque ne formant pas des spores Gram positif qui apparaît généralement dans des chaînes ou des paires de cellules. GAS est l’un des agents pathogènes les plus fréquents des êtres humains. Il est estimé qu’entre 5 et 15 % des individus normaux abritent la bactérie, habituellement dans le système respiratoire, sans montrer de signes quelconques de la maladie. Lorsque les défenses de l’hôte sont compromises, ou lorsque l’organisme est capable d’exercer sa virulence, ou lorsqu’il est introduit dans des tissus ou des hôtes vulnérables, toutefois, une infection aiguë apparaît. Les affections aiguës à Streptococcus pyogenes peuvent prendre la forme de pharyngite, de scarlatine (rash), d’impétigo, de cellulite, ou d’érysipèles. Les infections invasives peuvent produire une fasciite nécrosante, une myosite et un syndrome de choc toxique streptococcique. Les patients peuvent également développer des séquelles à médiation immunitaire comme une fièvre rhumatismale et une glomérulonéphrite aiguë (Patterson 1996). Bien que S. pyogenes puisse être traité en utilisant des antibiotiques, un vaccin prophylactique pour prévenir l’installation de la maladie est souhaité. Les efforts pour développer un tel vaccin se sont poursuivis sur plusieurs décennies. Alors que diverses approches de vaccin anti-GAS ont été suggérées et que certaines approches sont actuellement en essais cliniques, à ce jour, n’y a aucun vaccin anti-GAS disponible au public. GAS40, également connu sous le nom de « Spy0269 » (M1), « SpyM3_0197» (M3), « SpyM18_0256 » (M18) et « prgA » (No. d’accession Uniprot Q9A1H3), est une protéine d’exclusion de surface putative qui possède une région de 130 acides aminés présentant une similarité avec la protéine EzrA, qui interagit avec la protéine de la division cellulaire FtsZ. GAS40 fournit régulièrement une protection dans le modèle animal d’immunisation et de stimulation (« challenge ») systémiques et d’induction d’anticorps bactéricides. Par conséquent, GAS40 est un candidat potentiel pour la production d’un vaccin contre un GAS. Toutefois, il y a eu certaines inquiétudes dans le passé en ce que des vaccins anti-GAS à base de protéine M contiennent des déterminants antigéniques qui ont été déterminés comme présentant une réactivité croisée avec le tissu cardiaque, se traduisant potentiellement par une réaction importante dans la cardiopathie rhumatismale.
Le mimétisme moléculaire est défini comme la possibilité théorique que des similarités de séquence entre des peptides étrangers et des auto-peptides sont suffisantes pour entraîner l’activation croisée des lymphocytes T ou B autoréactifs par des peptides dérivés d’agents pathogènes. Lors de l’activation des lymphocytes B ou T, on pense que ces lymphocytes T ou B spécifiques de « mimétiques de peptides » peuvent présenter une réactivité croisée avec des auto-épitopes, menant ainsi à une pathologie tissulaire (auto-immunité). Le mimétisme moléculaire est un phénomène qui a été découvert récemment comme étant l’un de plusieurs moyens par lesquels une auto-immunité peut être suscitée. Par conséquent, il doit être choisi des vaccins candidats qui ne déclenchent pas la maladie qu’ils sont supposés prévenir.
Alors qu’il n’existe aucune preuve que des antigènes protéiniques comme GAS40 comprennent des déterminants antigéniques qui pourraient être problématiques, les craintes S®2 passé concernant le mimétisme moléculaire et les vaccins antiGAS en soi peuvent gêner l’adoption et l’utilisation de vaccins anti-GAS.
Afin de réduire ces craintes et la possibilité que GAS40 pourrait produire des séquelles auto-immunes d’une infection par un GAS par mimétisme moléculaire, les inventeurs ont produit des polypeptides GAS40 qui sont moins similaires aux protéines humaines que les protéines GAS40 de type sauvage. Résumé de l’invention
Les inventeurs ont développé des mutants des polypeptides GAS40 qui déclenchent des anticorps qui présentent une réactivité croisée avec le GAS40 de type sauvage mais qui présentent une identité de séquence réduite avec les séquences d’acides aminés présentes au sein des protéines humaines. En particulier, les protéines humaines comprennent la protéine 81 contenant des domaines surenroulés, l’UPF0492 protéine C20orf94, la Janus kinase et la protéine 3 interagissant avec les microtubules, la myosine ou la tropomyosine.
Ainsi, dans un premier aspect, il est proposé un antigène streptococcique GAS40 recombinant purifié qui comprend un épitope qui déclenche des anticorps opsoniques contre Streptococcus du groupe A, l’antigène streptococcique GAS40 recombinant comprenant au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 235 à 243, et/ou au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 684 à 692 et/ou au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 699 à 706 et/ou une délétion de Lysine au niveau de la position 208 et/ou au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 substitutions d’acides aminés au niveau des positions choisies dans le groupe constitué des positions d’acides aminés 38, 52, 66, 148, 158, 179, 182, 186, 196, 203, 218, 225, 544, 558, 562, 576, 586, 614, 618, 621, 665, 672, 683 et 693, où lBP positions d’acides aminés sont numérotées selon SEQ ID NO : 2.
Dans certains modes de réalisation, l’antigène streptococcique GAS40 recombinant purifié comprend des substitutions au niveau des positions d’acides aminés T237, A241, A688, S692, A700 et A703. Par exemple, l’antigène streptococcique GAS40 recombinant purifié comprend les substitutions T237S, A241V, A688S, S692T, A700S et A703S. Le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant peut comprendre une délétion de Lysine au niveau de la position 208. Le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant peut comprendre des substitutions d’acides aminés au niveau des positions d’acides aminés A38, Q52, T66, A148, S158, A179, A182, T186, A196, Q203, Q218, K225, A544, T558, S562, K576, A586, T614, A618, A621, T665, A672, Q683 et T693. Par exemple, les substitutions au niveau des positions d’acides aminés peuvent être A38L, Q52L, T66L, A148L, S158L, A179L, A182L, T186L, A196L, Q203L, Q218L, K225L, A544L, T558L, S562L, K576L, A586L, T614L, A618L, A621L, T665L, A672L, Q683L et T693L. Le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant peut comprendre une combinaison de ces mutations, par exemple, les substitutions T237S, A241V, A688S, S692T, A700S, A703S, A38L, Q52L, T66L, A148L, S158L, A179L, A182L, T186L, A196L, Q203L, Q218L, K225L, A544L, T558L, S562L, K576L, A586L, T614L, A618L, A621L, T665L, A672L, Q683L, T693L et une délétion de L208.
Un objectif de la présente invention est de réduire tout risque théorique de réactivité croisée sérologique des antigènes GAS40 avec des antigènes tissulaires de mammifères. En particulier, le mammifère est un être humain. En particulier, l’antigène streptococcique GAS40 recombinant ne contient pas des 7-mers, 8-mers ou 9-mers qui sont présents dans les protéines humaines. Encore plus particulièrement, l’antigène GAS40 ne contient pas une séquence choisie dans le groupe constitué de QLTEELAAQ (SEQ ID NO : 8), KQDLAKTTS (SEQ ID NO : 9) ou EALAALQA (SEQ ID NO : 10). Encore plus particulièrement, le polypeptide
streptococcique GAS40 recombinant ne comprend pas une séquence d’acides aminés présentant 100 % d’identité de séquence avec une séquence choisie dans le groupe constitué de QLTEELAAQ
(SEQ ID NO : 8), KQDLAKTTS (SEQ ID NO : 9) ou EALAALQA (SEQ ID NO : 10). Encore plus particulièrement, les séquences d’acides aminés de 7-, 8- ou 9-mers du polypeptide streptococcique GAS40 recombinant des positions 235 à 243 et/ou des positions 684 à 692 et/ou 699 à 707, numérotées selon SEQ ID NO : 2, présentent une identité de séquence inférieure à 100 %, inférieure à 95 %, inférieure à 90 %, inférieure à 85 %, inférieure à 80 %, inférieure à 79 %, inférieure à 78 %, inférieure à 77 %, inférieure à 76 %, inférieure à 75 %, inférieure à 74 %, inférieure à 73 %, inférieure à 72 %, inférieure à 71 %, inférieure à 70 %, inférieure à 65 %, inférieure à 60 %, inférieure à 55 %, inférieure à 50 %,
inférieure à 45 %, inférieure à 40 % ou inférieure à 35 % avec une séquence choisie dans le groupe constitué de QLTEELAAQ (SEQ ID NO : 8), KQDLAKTTS (SEQ ID NO : 9) ou EALAALQA (SEQ ID NO : 10).
En particulier, le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant peut partager au moins 92 % d’identité avec l’une quelconque de SEQ ID NO : 4, 6, 7, 16, 17, 18, 24, 25 ou 26.
Plus particulièrement, le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 4, 6, 7, 16, 17, 18, 24, 25 et 26.
Dans certains modes de réalisation, il est proposé un fragment d’un polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon le premier aspect. Par exemple, un fragment qui partage au moins 97 % d’identité avec l’une quelconque de SEQ ID NO : 20, 21, 22, 28, 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 104, 105,
106, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117 et 118. D’autrBP exemples de fragments comprennent des séquences polypeptidiques comprenant ou constituées de l’une quelconque de SEQ ID NO : 4, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 7, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114 et 118. Le terme « fragment » tel qu’utilisé dans la présente se rapporte à un polypeptide qui comporte une délétion amino-terminale et/ou carboxy-terminale comparativement à la protéine pleine longueur, mais où la séquence d’acides aminés restante est identique aux positions correspondantes de la protéine pleine longueur. Les fragments ont généralement une longueur supérieure à 200 acides aminés, en particulier une longueur qui n’est pas supérieure à 850, 849, 848, 847, 846, 845 acides aminés, encore plus particulièrement une longueur qui n’est pas supérieure à 830, 827, 826, 825, 824, 823, 822, 822, 821, 820 acides aminés, encore plus particulièrement une longueur qui n’est pas supérieure à 460, 459, 458, 457, 456, 455, 454, 453, 452, 451, 450 acides aminés, y compris des plages entre ces valeurs. Par exemple, une longueur de 200 à 847 acides aminés, une longueur de 200 à 823 acides aminés, une longueur de 200 à 452 acides aminés, une longueur de 450 à 850 acides aminés, une longueur de 450 à 825 acides aminés. Pour éviter toute ambiguïté, les fragments de la présente invention (numérotés selon SEQ ID NO : 2) comprendront des substitutions correspondant à celles décrites ci-dessus où ces positions d’acides aminés sont présentes dans le fragment.
Dans un deuxième aspect de l’invention, il est proposé une composition immunogène comprenant un ou plusieurs polypeptides GAS40 selon le premier aspect. Généralement, de telles compositions immunogènes comprendront un ou plusieurs polypeptides supplémentaires de GAS tels que, à titre d’exemple non limitatif, GAS57, GAS25 ou leurs mutants. En particulier, les compositions immunogènes de l’invention comprendront une quantité immunologiquement efficace du ou des polypeptide2 GAS40. Encore plus particulièrement, les compositions immunogènes de l’invention sont des vaccins. De telles compositions peuvent comprendre un adjuvant comme l’alun ou le MF59. Les compositions immunogènes particulières comprennent une quantité immunologiquement efficace de (i) un polypeptide GAS40 de l’invention, (ii) un double mutant GAS57 de SEQ ID NO : 120, (iii) un double mutant GAS25 de SEQ ID NO : 121 et éventuellement (iv) un conjugué comprenant une protéine de support choisie dans le groupe constitué de l’anatoxine tétanique, l’anatoxine diphtérique et CRMi97 conjuguée à au moins un glucide du groupe A.
Dans un troisième aspect de l’invention, il est proposé un acide nucléique codant pour le polypeptide GAS40 selon le premier aspect.
Dans un quatrième aspect de l’invention, il est proposé une cellule comprenant l’acide nucléique selon le troisième aspect.
Dans un cinquième aspect, il est proposé un procédé de réduction de la similarité de séquence d’acides aminés d’un polypeptide GAS40 de type sauvage avec une ou plusieurs protéines humaines, où ledit procédé comprend les étapes (a) d’identification des similarités entre la séquence d’acides aminés dudit GAS40 de type sauvage et les protéines humaines ; et (b) d’introduction d’une ou de plusieurs mutations dans la séquence dudit GAS40 de type sauvage. En particulier, lesdites mutations sont introduites dans de courtes suites d’acides aminés qui sont communes au GAS40 de type sauvage et aux protéines humaines. En particulier, les protéines humaines sont une ou plusieurs de la protéine 81 contenant des domaines surenroulés, l’UPF0492 protéine C20orf94, la Janus kinase et la protéine 3 interagissant avec les microtubules, la myosine ou la tropomyosine. Encore plus particulièrement, des mutations sont introduites dans les régions surenroulées de GAS40 où lesdites mutations « idéalisent » les régions surenroulées.
Brève description des dessins
La figure 1 illustre une représentation sous forme de diagramme de la structure du GAS40 de type sauvage.
La figure 2 illustre une prédiction de la structure secondaire de SEQ ID NO : 2 (le polypeptide GAS40 de type sauvage). La prédiction indique que l'intégrité du profil de propension à un surenroulement et du motif leucine zipper demeurera inchangée.
La figure 3 illustre une prédiction de la structure secondaire de SEQ ID NO : 4 (le polypeptide GAS40 mutant de 8 à 9-mers). La prédiction indique que l'intégrité du profil de propension à un surenroulement et du motif leucine zipper demeurera inchangée.
La figure 4 illustre l'identification des régions surenroulées dans GAS40. Ces régions ont été surlignées avec une échelle de couleur du rouge au bleu où le rouge représente les résidus hydrophobes.
La figure 5 illustre l'identification des régions surenroulées dans GAS40. Ces régions ont été surlignées avec une échelle de couleur du rouge au bleu où le rouge représente les résidus hydrophobes.
La figure 6 illustre l'identification des régions surenroulées dans GAS40. Ces régions ont été surlignées avec une échelle de couleur du rouge au bleu où le rouge représente les résidus hydrophobes.
Description de l'invention
Polypeptides de l'invention L'invention propose un procédé de réduction de la similarité de séquence d'acides aminés d'un polypeptide GAS40 avec une ou plusieurs protéines humaines, ce qui peut être obtenu par l'introduction de mutations dans la séquence d'un GAS40 de type sauvage. L'objectif de cette réduction de la similarité de séquence d’acides aminés du polypeptide GAS40 avec une (Pii2 plusieurs protéines humaines est de réduire le risque théorique de déclencher des anticorps qui pourraient présenter une réactivité croisée avec des protéines humaines. De telles mutations peuvent réduire ou éliminer le risque de séquelles auto-immunes d’une infection par un GAS. Ledit polypeptide GAS40 de type sauvage peut être constitué ou comprendre la séquence représentée par SEQ ID NO : 2, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99 ou 103, ou il peut présenter une identité de séquence avec SEQ ID NO : 2, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99 ou 103 qui est supérieure à 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %. De façon générale, de telles protéines évitent le déclenchement d’anticorps qui pourraient présenter une réactivité croisée avec des protéines humaines qui comprennent la protéine 81 contenant des domaines surenroulés (GI : 47271449), l’UPF0492 protéine C20orf94 (GI : 61102723), la Janus kinase et la protéine 3 interagissant avec les microtubules (GI : 157502225), la myosine ou la tropomyosine.
Dans certains modes de réalisation, lesdites mutations comprennent des insertions d’acides aminés simples, des délétions d’acides aminés simples et/ou des substitutions d’acides aminés simples. Dans certains modes de réalisation, un certain nombre de mutations d’acides aminés simples peut être introduit dans GAS40, par exemple : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mutations d’acides aminés ou plus .
Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, lesdites mutations peuvent être introduites dans des suites courtes d’acides aminés, par exemple, 7-mers, 8-mers ou 9-mers, qui sont communes au GAS40 et aux protéines humaines. Les exemples de
telles suites courtes d’acides aminés comprennent QLTEELAAQ2 (SEQ ID NO : 8), QLTEELAA (SEQ ID NO : 128), KQDLAKTTS (SEQ ID NO : 9) et EALAALQA (SEQ ID NO : 10), qui se trouvent dans les protéines humaines, la protéine 81 contenant des domaines surenroulés, l’UPF0492 protéine C20orf94, et la Janus kinase et la protéine 3 interagissant avec les microtubules, respectivement.
Dans certains modes de réalisation de l’invention, les mutations qui sont introduites n’ont aucun effet significatif sur la structure secondaire du GAS40. En d’autres termes, la structure secondaire des polypeptides GAS40 de l’invention est de préférence substantiellement la même que celle des polypeptides GAS40 de type sauvage. La structure secondaire des polypeptides, tels que GAS40, peut être estimée par des procédés informatiques de prédiction ab initio ou par dichroïsme circulaire, ultracentrifugation analytique, analyses d’équilibre de sédimentation, cristallographie aux rayons X, spectroscopie par RMN, etc. Comme il est illustré sur la figure 1, le GAS40 de type sauvage comprend un peptide de tête à son extrémité N-terminale, deux régions surenroulées (entre les résidus d’acides aminés 58 et 261 et entre les résidus d’acides aminés 556 et 733 dans SEQ ID NO : 2), une leucine zipper (localisée au sein de la région surenroulée C-terminale et entre les résidus d’acides aminés 673 et 701 dans SEQ ID NO : 2) et un domaine transmembranaire (localisé entre les résidus d’acides aminés 849 et 866 dans SEQ ID NO : 2). Les localisations de ces domaines et régions dans tout polypeptide GAS40 peuvent être prédites en se basant sur un alignement par paires d’une séquence donnée avec SEQ ID NO : 2, par exemple en alignant la séquence d’acides aminés d’un polypeptide GAS40 d’intérêt avec SEQ ID NO : 2 et en identifiant les séquences qui s’alignent aux domaines/ régions respectifs de SEQ ID NO : 2.
De préférence, toutes les mutations qui sont introduites n’ont aucun effet significatif sur les deux régions surenroulées d’hélice alpha et la leucine zipper. Par exemple, deiiS2 substitutions peuvent être introduites dans chacune des séquences SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et/ou SEQ ID NO : 10. De préférence, lesdites mutations comprennent T237S, A241V, A688S, S692T, A700S et/ou A703S par rapport à la séquence d’acides aminés de SEQ ID NO : 2. Les localisations de ces substitutions dans un polypeptide GAS40 d’une longueur et/ou d’une séquence différente de SEQ ID NO : 2 sont identifiées en se basant sur un alignement par paires d’une séquence donnée avec SEQ ID NO : 2, par exemple en alignant la séquence d’acides aminés d’un polypeptide GAS40 d’intérêt avec SEQ ID NO : 2 et en identifiant les acides aminés qui correspondent à T237, A241, A688, S692, A700 et A703. SEQ ID NO : 4 est un exemple d’un polypeptide GAS40 qui comprend la totalité de ces six substitutions (T237S, A241V, A688S, S692T, A700S et A703S). L’invention propose également des polypeptides GAS40 qui ont été produits par un procédé de l’invention. Dans certains modes de réalisation, l’invention propose un polypeptide GAS40 qui contient un nombre réduit de 9-mers, 8-mers et/ou 7-mers qui sont présents dans tous les polypeptides humains. Par exemple, l’invention propose également un polypeptide GAS40 auquel il manque une ou plusieurs des séquences : SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et/ou SEQ ID NO : 10. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide GAS40 a une structure secondaire qui est substantiellement la même que le GAS40 de type sauvage. De préférence, la structure secondaire des deux régions surenroulées d’hélice alpha et de la leucine zipper qui est localisée au sein de la région surenroulée C-terminale est substantiellement la même que le GAS40 de type sauvage. Les exemples de polypeptide GAS40 auquel il manque une ou plusieurs des séquences : SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 comprennent SEQ ID NO : 4, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112 et 116. Dans certains modes de réalisation, l’invention propose une protéine mutante qui partage au moins 95 %, 96 #^2 96,5 %, 97 %, 97,2 %, 97,4 %, 97,6 %, 97,8 %, 98 %, 98,2 %, 98,4 %, 98,6 %, 98,8 %, 99 %, 99,2 %, 99,4 %, 99,6 %, 99,8 % ou 100 % d'identité avec l’une quelconque des SEQ ID NO : 4, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112 ou 116.
Des irrégularités de surenroulement ont été récemment démontrées dans la protéine M1 (Science 319(5868): 1405-8). Des irrégularités structurales similaires apparaissent dans la myosine et la tropomyosine, fournissant une explication possible des schémas associés aux protéines M de réactivité croisée dans les séquelles auto-immunes d'une infection par un GAS. Lorsque des substitutions sont réalisées au sein de la région surenroulée de M1 se traduisant par des résidus centraux optimaux pour la formation et la stabilité des surenroulements parallèles dimères (« idéalisation de la séquence »), la liaison du fibrinogène, les effets proinflammatoires, et la réactivité croisée des anticorps ont été diminués. Une « idéalisation » similaire des surenroulements a été développée pour le GAS40.
Un surenroulement est un motif structural dans les protéines, dans lequel 2 à 7 hélices alpha sont enroulées ensemble comme les brins d'une corde (les dimères et trimères sont les types les plus courants). Les surenroulements contiennent habituellement un motif répété, hxxhcxc (SEQ ID NO : 14), de résidus d'acides aminés hydrophobes (h) et chargés (c), auquel il est fait référence comme à une répétition heptade. Les positions dans la répétition heptade sont habituellement étiquetées abcdefg, où a et d sont les positions hydrophobes, souvent occupées par une isoleucine, une leucine ou une valine. Toutefois, les surenroulements de de la tropomyosine et de la myosine dévient de la structure canonique des surenroulements par des moyens subtiles, y compris des insertions au sein des heptades et des résidus chargés et des résidus d'alanine au niveau des positions d'heptade a et d. De telles séquences déstabilisant les surenroulements modifient BE2 conformation locale et l’énergétique sans interrompre le surenroulement. On pense que la réactivité croisée des protéines M de GAS attribuable au mimétisme moléculaire peut résulter des similarités structurales entre les surenroulements de ces protéines et ceux de la myosine et de la tropomyosine. Il a été trouvé que GAS40 contient des séquences déstabilisantes des surenroulements similaires. L’invention propose un polypeptide GAS40 qui contient des mutations dans les régions surenroulées de GAS40, de préférence afin de réduire les irrégularités structurales dans les régions surenroulées, « idéalisant » de cette façon lesdites régions surenroulées et rendant la protéine mutante potentiellement moins structuralement similaire à la myosine ou à la tropomyosine. De préférence, les résidus hydrophiles dans les positions 1 et 4 des heptades formant les surenroulements sont substitués par un résidu hydrophobe comme la leucine, et/ou la lysine 208 est délétée afin de corriger un décalage de cadre d’heptade. Les SEQ ID NO : 6, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117 sont des exemples de polypeptides GAS40 qui comprennent ces caractéristiques. Dans certains modes de réalisation, l’invention propose une protéine mutante qui partage au moins 90 %, 91 %, 92 %, 92,5 %, 93 %, 93,5 %, 94 %, 94,5 %, 95 %, 95,5 %, 96 %, 96,5 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % ou 100 % d’identité avec l’une quelconque des SEQ ID NO : 6, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113 ou 117. L’invention propose également un polypeptide GAS40 avec 9 copies ou plus de SEQ ID NO : 14, où ledit polypeptide comprend éventuellement moins de 32 répétitions heptades imparfaites. De préférence, lesdites répétitions heptades imparfaites contiennent une ou deux mutations dans SEQ ID NO : 14 et/ou partagent entre 71 et 86 % d’identité avec SEQ ID NO : 14. Dans un mode de réalisation, l’invention propose un polypeptide GAS40, où ledit polypeptide comporte n copies ou plus de SEQ ID NO : 14 et partage au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec SEQ ID NO : 2.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide GAS40 contient une combinaison quelconque des mutations présentées ci-dessus. Par exemple, l’invention propose un polypeptide GAS40 contenant à la fois : • un nombre réduit de 9-mers, 8-mers et/ou 7-mers qui sont présents dans tous les polypeptides humains (par exemple, auquel il manque une ou plusieurs des séquences : SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et/ou SEQ ID NO : 10) ; et • une ou plusieurs régions surenroulées « idéalisées » dans lesquelles les résidus hydrophiles dans les positions 1 et 4 des heptades formant les surenroulements sont substitués par un résidu hydrophobe comme la leucine, et/ou la lysine 208 est délétée afin de corriger un décalage de cadre d’heptade.
Les exemples de tels polypeptides GAS40 (c’est-à-dire, ceux contenant à la fois : un nombre réduit de 9-mers, 8-mers et/ou 7-mers qui sont présents dans tous les polypeptides humains et une ou plusieurs régions surenroulées « idéalisées ») comprennent : SEQ ID NO : 7, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118. Dans un mode de réalisation, l’invention propose un polypeptide GAS40 polypeptide, où ledit polypeptide partage au moins 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93,5 %, 94 %, 94,5 %, 95 %, 95,5 %, 96 %, 96,5 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 % ou 100 % d’identité avec l’une quelconque des SEQ ID NO : 7, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118.
De préférence, les polypeptides GAS40 de l'inventif2 conservent l'immunogénicité des polypeptides GAS40 de type sauvage, par exemple, les polypeptides GAS40 de l'invention déclencheront de préférence des anticorps qui sont capables de lier les polypeptides GAS40 de type sauvage. Les polypeptides GAS40 de l'invention conservent de préférence substantiellement le même niveau d'immunogénicité que les polypeptides GAS40 de type sauvage. Par exemple, les moyennes géométriques des titres d'anticorps résultant des polypeptides GAS40 de l'invention ne sont pas significativement différentes de celles résultant des polypeptides GAS40 de type sauvage lors d'une estimation par deux tests t pour échantillons (où les différences sont considérées comme significatives si la valeur P obtenue par une analyse unilatérale est < 0,05, < 0,01, ou < 0,001) lorsque les autres variables (comme la dose, la voie d'administration, la souche du GAS40, le groupe de populations, etc.) sont contrôlées. Les procédés de détermination de l'immunogénicité de polypeptides bactériens sont bien connus de l'état de l'art. L'invention propose également des fragments des polypeptides GAS40 de l'invention, où lesdits fragments ont une longueur d'au moins : 177, 203, 250, 300, 400, 450, 460, 465, 470, 471, 500, 550, 600, 650, 700, 750 ou 800 acides aminés. Les exemples de tels fragments comprennent ceux cités dans SEQ ID NO : 107, 111 et 115. L'invention propose un procédé de réduction du risque d'auto-immunogénicité d'un polypeptide GAS40, où ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l'identification de courtes suites d'acides aminés (7-mers, 8-mers ou 9-mers) qui sont communes aux protéines humaines et au GAS40 ; et b) l'introduction de mutations dans lesdites courtes suites d'acides aminés qui sont communes aux protéines humaines et au GAS40. L'invention propose également un procédé de réduction du risque d'auto-immunogénicité d'un polypeptide GAS40, où ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l’identification dêü2 régions surenroulées dans le GAS40 ; et b) l’introduction de mutations pour « idéaliser » la structure surenroulée. L’étape b) peut impliquer l’introduction d’une ou de plusieurs des mutations suivantes : la substitution d’un ou de plusieurs des résidus hydrophiles dans les positions 1 et 4 des heptades surenroulées par un résidu hydrophobe, de préférence la leucine ; et la délétion d’un résidu d’acide aminé, de préférence la lysine 208, afin de corriger un décalage de cadre d’heptade. L’invention propose également un procédé de réduction du risque d’auto-immunogénicité d’un polypeptide GAS40, où ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l’identification de courtes suites d’acides aminés qui sont communes aux protéines humaines et au GAS40 ; b) l’introduction de mutations dans lesdites courtes suites d’acides aminés qui sont communes aux protéines humaines et au GAS40 ; c) l’identification des régions surenroulées dans le GAS40 ; et d) l’introduction de mutations pour « idéaliser » la structure surenroulée. L’étape d) peut impliquer l’introduction d’une ou de plusieurs des mutations suivantes : la substitution d’un ou de plusieurs des résidus hydrophiles dans les positions 1 et 4 des heptades surenroulées par un résidu hydrophobe, de préférence la leucine ; et la délétion d’un résidu d’acide aminé, de préférence la lysine 208, afin de corriger un décalage de cadre d’heptade.
De préférence, les polypeptides GAS40 de l’invention ne provoquent pas de mimétisme moléculaire et/ou ne provoquent pas d’activation croisée des lymphocytes T ou B autoréactifs. L’invention propose un polypeptide GAS40 qui peut déclencher des anticorps qui présentent une réactivité croisée avec les polypeptides GAS40 de type sauvage, mais qui ne déclenche pas des anticorps qui présentent une réactivité croisée avec des polypeptides humains. L’invention propose également un polypeptide GAS40 qui peut déclencher des anticorps qui présentent une réactivité croisée avec les polypeptides GAS40 de type sauvage, mais qui ne contiennent pas des 7-merBE2 8-mers ou 9-mers qui sont présents dans les protéines humaines. L’invention propose également un polypeptide GAS40 qui peut déclencher des anticorps qui présentent une réactivité croisée avec les polypeptides GAS40 de type sauvage et contient 9, 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32 copies ou plus de SEQ ID NO : 14.
Compositions L’invention propose des compositions comprenant les polypeptides GAS40 de l’invention. De telles compositions peuvent comprendre des polypeptides supplémentaires, comme d’autres polypeptides provenant de GAS (par exemple, GAS57, GAS25 et/ou l’antigène polysaccharidique de GAS). Ces compositions peuvent être destinées à une utilisation en tant que médicaments (par exemple, en tant que compositions immunogènes ou vaccins). Les compositions de l’invention sont utiles pour la prévention d’une infection à S. pyogenes, la réduction du risque d’une infection à S. pyogenes, et/ou le traitement d’une maladie provoquée à la suite d’une infection à S. pyogenes, comme une bactériémie, une méningite, une fièvre puerpérale, une scarlatine, des érysipèles, une pharyngite, un impétigo, une fasciite nécrosante, une myosite ou un syndrome de choc toxique.
Les compositions contenant des antigènes de GAS sont de préférence des compositions immunogènes, et sont de manière davantage préférée des compositions vaccinales. Le pH de telles compositions se situe de préférence entre 6 et 8, de préférence environ 7. Le pH peut être maintenu par l’utilisation d’un tampon. La composition peut être stérile et/ou apyrogène. La composition peut être isotonique par rapport aux êtres humains.
Les vaccins selon l’invention peuvent être utilisés de façon soit prophylactique soit thérapeutique, mais ils seront généralement prophylactiques. Par conséquent, l’invention comprend un procédé de traitement thérapeutique ou prophylactique d’une infection à Streptococcus pyogene§.2 L’animal est de préférence un mammifère, de manière préférée entre toutes un être humain. Les procédés impliquent l’administration à l’animal d’une quantité thérapeutique ou prophylactique des compositions immunogènes de l’invention. L’invention propose également les compositions immunogènes de l’invention pour le traitement, la réduction du risque et/ou la prévention d’une infection à S. pyogenes.
Certaines compositions comprennent des polypeptides GAS40 de l’invention et au moins un ou au moins deux antigènes de GAS différents, tels que décrits ci-dessous. D’autres compositions de l’invention comprennent au moins une molécule d’acide nucléique qui code pour les deux antigènes différents. Voir, par exemple, Robinson &amp; Torres (1997) Seminars in Immunology 9: 2712 83 ; Donnelly et al. (1997) Ann. Rev Immunol 15: 617-648 ;
Scott-Taylor &amp; Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9: 471-480 ; Apostolopoulos &amp; Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2: 441-447 ; Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1: 116-120 ; Dubensky et al. (2000) Mol Med 6: 723-732 ; Robinson &amp; Pertmer (2000) Adv Virus Res 55: 1-74 ; Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2): S190-193 ; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66: 84-90. Généralement, la molécule d’acide nucléique est une molécule d’ADN, par exemple, sous la forme d’un plasmide. GAS57 est également appelé 'Spy0416 (M1)', 'SpyM3_0298' (M3), 'SpyM18_0464' (M18), et 'prtS'. Spy0416 a été identifié en tant que protéinase de l’enveloppe cellulaire putative. Voir les documents WO 02/34771 et US 2006/0258849. Les mutants de GAS57 utiles dans l’invention comprennent ceux avec au moins une modification d’acide aminé (c’est-à-dire, une substitution, une délétion, ou une insertion) au niveau d’un ou de plusieurs des acides aminés D151, H279, particulièrement une séquence d’acides aminés de SEQ ID NO : 120. GAS25 (Spy0167, streptolysine, SLO) est une toxine formant des pores puissante qui induit la lyse des cellules de l’hôte et il est décrit, entre autres, dans le document WO 02/34771. LBE2 formes mutantes de GAS25 présentent au moins 50 % de moins d'activité hémolytique que le Spy0167 de type sauvage (par exemple, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 %) par rapport au Spy0167 de type sauvage comme il est déterminé par un test d'hémolyse mais elles sont immunogènes et confèrent de préférence une protection contre une stimulation (« challenge ») létale par un GAS dans un modèle de souris. Les mutants de Spy0167 pour une utilisation dans des compositions de l'invention comprennent ceux avec une modification d'acide aminé (c'est-à-dire, une substitution, une délétion, ou une insertion) au niveau d'un ou de plusieurs des acides aminés P427 et W535 comme il est exemplifié dans SEQ ID NO : 121.
Le polysaccharide (PS) de GAS est un polysaccharide de la paroi cellulaire présent dans toutes les souches de GAS. Les titres d'anticorps dirigés contre le PS sont en corrélation inverse avec la maladie et la colonisation chez les enfants. Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention comprennent un antigène polysaccharidique de GAS. Le glucide du GAS S. pyogenes affiche généralement une structure ramifiée avec un squelette de L-rhamnopyranose (Rhap) constitué de liaisons alpha-(1^2) et alpha-(1^3) en alternance et de résidus de D-N-acétylglucosamine (GlcpNAc) reliés en bêta-(1^3) à des cycles de rhamnose en alternance (Kreis et al., Int. J. Biol. Macromol. 17, 117-30, 1995). Les antigènes polysaccharidiques de GAS utiles dans les compositions de l'invention ont la formule :
[-2)-a-L-Rhap-( l-3)-o-L-Rhap-(l h—R À 1 ß-D-GIcpNAc dans laquelle R représente un L-Rhamnose ou un D-GlcpMSÜ2 réducteur terminal et n est un nombre d’environ 3 à environ 30. L’antigène polysaccharidique de GAS utilisé selon l’invention peut être un glucide de GAS substantiellement pleine longueur, comme il se trouve dans la nature, ou il peut être plus court que la longueur naturelle. Les polysaccharides pleine longueur peuvent être dépolymérisés pour donner des fragments plus courts pour une utilisation dont fait l’invention, par exemple, par hydrolyse dans un acide doux, par chauffage, par chromatographie d’exclusion, etc. Toutefois, il est préférable d'utiliser des saccharides substantiellement pleine longueur. En particulier, il est préférable d'utiliser des saccharides avec un poids moléculaire d’environ 10 kDa. Les masses moléculaires peuvent être mesurées par filtration sur gel par rapport à des étalons de dextrane. Le saccharide peut être modifié chimiquement par rapport au glucide de GAS tel que trouvé dans la nature. Par exemple, le saccharide peut être dés-N-acétylé (partiellement ou totalement), N-propioné (partiellement ou totalement), etc. L’effet de la désacétylation etc., par exemple sur l’immunogénicité, peut être estimé par des tests de routine. Dans certains modes de réalisation, l’antigène polysaccharidique de GAS peut être conjugué à un support, comme la toxine diphtérique mutée CRM197.
Dans un mode de réalisation, l’invention propose des compositions comprenant le GAS57 et un ou plusieurs polypeptides GAS40 de l’invention. Les séquences des exemples de polypeptides GAS57 sont fournies par SEQ ID NO : 119 et 120. De telles compositions peuvent également comprendre d’autres antigènes de GAS, particulièrement GAS25 ayant la séquence SEQ ID NO : 121.
Dans certains modes de réalisation, les polypeptides GAS40 de l’invention (et éventuellement GAS57) peuvent être incorporés dans une composition immunogène, y compris une composition vaccinale. De telles compositions peuvent être utilisées pour déclencher des anticorps chez un mammifère (par exemple, un être humain). Dans ces compositions, les polypeptides GAS40 de2 l’invention (et éventuellement GAS57, si présent) peuvent agir comme des immunogènes et/ou comme des antigènes. L’invention propose des compositions pharmaceutiques comprenant un polypeptide GAS40 de l’invention. De telles compositions pharmaceutiques peuvent également comprendre des polypeptides supplémentaires comme GAS57. L’invention propose également des procédés de fabrication d’une composition pharmaceutique impliquant la combinaison d’un polypeptide GAS40 de l’invention avec un support pharmaceutiquement acceptable. De tels procédés peuvent également comprendre l’étape d’addition de polypeptides supplémentaires, comme GAS57.
Dans certains modes de réalisation, la composition vaccinale comprendra un ou plusieurs supports, diluants et/ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans des compositions de l’invention comprennent, mais n’y sont pas limités : • des sels minéraux, tels que des sels d’aluminium et des sels de calcium, y compris des hydroxydes (par exemple, des oxyhydroxydes), des phosphates (par exemple, des hydroxyphosphates, des orthophosphates) et des sulfates, etc. ; • des émulsions huile dans l’eau, telles que des émulsions squalène dans l’eau, y compris le MF59 (5 % de squalène, 0,5 % de Tween 80, et 0,5 % de Span 85, formulé en particules submicroniques en utilisant un microfluidiseur), l’adjuvant complet de Freund (CFA) et l’adjuvant incomplet de Freund (IFA) ; • des formulations de saponines telles que QS21 et des ISCOM ; • des virosomes et des particules pseudovirales (PPV) ; • des dérivés bactériens ou microbiens, tels que des dérivés non toxiques du lipopolysaccharide entérobactérien (LPS), des dérivés du lipide A, des oligonucléotide2 immunostimulants, tels que IC 31™ ; • des immunomodulateurs humains, y compris des cytokines, telles que des interleukines (par exemple, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, des interférons (par exemple, l’interféron γ), le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale ; • des bioadhésifs et des mucoadhésifs, tels que le chitosane et ses dérivés, des microsphères d’acide hyaluronique estérifié ou des mucoadhésifs, tels que des dérivés réticulés de poly(acide acrylique), polyalcool vinylique, polyvinylpyrrolidone, des polysaccharides et la carboxyméthylcellulose ; • des microparticules (c’est-à-dire, une particule d’un diamètre de ~100 nm à ~150 μm, de manière davantage préférée d’un diamètre de ~200 nm à ~30 μm, et de manière préférée entre toutes d’un diamètre de ~500 nm à ~10 μm) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide α-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.) ; • des liposomes ; • des éthers de polyoxyéthylène et des esters de polyoxyéthylène ; • des formulations de PCPP ; • des muramyl-peptides, y compris la N-acétyl-muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), la N-acétyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP), et la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1’-2’-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-hydroxy-phosphoryloxy)-éthylamine MTP-PE) ; et • des composés d’imidazoquinolone, y compris Imiquamod et ses homologues (par exemple, « Resiquimod 3M »). L’invention peut également comprendre des combinaisons d’H2 ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus. Par exemple, les compositions d’adjuvants suivantes peuvent être utilisées dans l’invention : (1) une saponine et une émulsion huile dans l’eau ; (2) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) ; (3) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) + un cholestérol ; (4) une saponine (par exemple, QS21) + 3dMPL + IL-12 (éventuellement + un stérol) ; (5) des combinaisons de 3dMPL avec, par exemple, du QS21 et/ou des émulsions huile dans l’eau ; (6) SAF, contenant 10 % de squalane, 0,4 % de Tween 80™, 5 % de polymère séquencé Pluronic L121, et thr-MDP, soit microfluidisé en une émulsion submicronique soit passé au vortex pour générer une émulsion avec une taille de particule plus grande ; (7) le système adjuvant RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) contenant 2 % de squalène, 0,2 % de Tween 80, et un ou plusieurs composants de la paroi cellulaire bactérienne du groupe constitué de monophosphoryl-lipide A (MPL), tréhalose dimycolate (TDM), et squelette de la paroi cellulaire (CWS), de préférence MPL + CWS (Detox™) ; et (8) un ou plusieurs sels minéraux (comme un sel d’aluminium) + un dérivé non toxique du LPS (tel que 3dMPL). L’utilisation d’un adjuvant d’hydroxyde d’aluminium et/ou de phosphate d’aluminium est utile, particulièrement chez les enfants, et les antigènes sont généralement adsorbés sur ces sels. Les émulsions squalène dans l’eau sont également préférées, particulièrement chez les personnes âgées. Les combinaisons d’adjuvants utiles comprennent des combinaisons d’adjuvants Th1 et Th2 comme CpG et alun ou résiquimod et alun. Une combinaison de phosphate d’aluminium et de 3dMPL peut être utilisée.
Les vaccins de l’invention peuvent être prophylactiques (c’est-à-dire, pour prévenir une maladie) ou thérapeutiques (c’est-à-dire, pour réduire ou éliminer les symptômes d’uüe2 maladie).
De préférence, lorsque lesdites compositions de l’invention sont administrées à un grand nombre de patients, l’immunité contre les GAS est produite chez certains ou la totalité des patients et un pourcentage réduit de patients développe des séquelles auto-immunes de l’infection par un GAS, comme une fièvre rhumatismale ou une glomérulonéphrite aiguë, comparativement au pourcentage de patients qui développent lesdites séquelles auto-immunes lorsque le GAS40 de type sauvage est administré.
Acides nucléiques L’invention propose également des acides nucléiques codant pour les polypeptides GAS40 de l’invention. Par exemple, les séquences d’acide nucléique représentées par SEQ ID NO : 1, 3 et 5 codent pour les polypeptides GAS40 représentés par SEQ ID NO : 2, 4 et 6. L’invention propose également un acide nucléique comprenant des séquences nucléotidiques présentant une identité de séquence avec de telles séquences nucléotidiques. L’identité entre les séquences est déterminée de préférence par l’algorithme de recherche d’homologie de Smith-Waterman. De tels acides nucléiques comprennent ceux utilisant des alternatives de codons pour coder pour le même acide aminé. L’invention comprend un acide nucléique comprenant des séquences complémentaires de ces séquences (par exemple, pour des antisens ou un sondage, ou pour une utilisation en tant qu’amorces).
Les acides nucléiques de l’invention peuvent être utilisés dans des réactions d’hybridation (par exemple, des Northern ou Southern blots, ou dans des micropuces d’acide nucléique ou des « puces de gènes ») et des réactions d’amplification (par exemple, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.) et d’autriP techniques avec des acides nucléiques.
Un acide nucléique selon l’invention peut prendre des formes diverses (par exemple, simple brin, double brin, vecteurs, marqué, etc.). Les acides nucléiques de l’invention peuvent être circulaires ou ramifiés, mais ils seront généralement linéaires. Sauf indication ou exigence contraire, tout mode de réalisation de l’invention qui utilise un acide nucléique peut utiliser à la fois la forme double brin et chacune des deux formes simple brin complémentaires qui constituent la forme double brin.
Les acides nucléiques de l’invention sont de préférence fournis sous une forme purifiée ou substantiellement purifiée, c’est-à-dire substantiellement dépourvus d’autres acides nucléiques (par exemple, dépourvus d’acides nucléiques existant à l’état naturel), particulièrement d’autres acides nucléiques d’E. coli ou de la cellule hôte, étant généralement au moins purs à environ 50 % (en poids), et habituellement au moins purs à environ 90 %.
Les acides nucléiques de l’invention peuvent être préparés de nombreuses manières, par exemple par synthèse chimique (par exemple, synthèse d’ADN par les phosphoramidites) en totalité ou en partie, par digestion d’acides nucléiques plus longs en utilisant des nucléases (par exemple, des enzymes de restriction), par jonction d’acides nucléiques plus courts ou de nucléotides (par exemple, en utilisant des ligases ou des polymérases), à partir de banques génomiques ou d’ADNc, etc.
Un acide nucléique de l’invention peut être fixé à un support solide (par exemple, une bille, une plaque, un filtre, un film, une lame, un support de micropuce, une résine, etc.). Un acide nucléique de l’invention peut être marqué, par exemple avec un marqueur radioactif ou fluorescent, ou un marqueur de biotine. Ceci est particulièrement utile lorsque l’acide nucléique doit être utilisé dans des techniques de détection, par exemple lorsque l’acide nucléique est une amorce ou en tant que sonde.
Le terme « acide nucléique » comprend de manière général2 une forme polymère de nucléotides d’une longueur quelconque, qui contient des désoxyribonucléotides, des ribonucléotides, et/ou leurs analogues. Il comprend de l’ADN, de l’ARN, des hybrides ADN/ARN. Il comprend également des analogues d’ADN ou d’ARN, tels que ceux contenant des squelettes modifiés (par exemple, des acides nucléiques peptidiques (PNA) ou des phosphorothioates) ou des bases modifiées. Ainsi, l’invention comprend de l’ARNm, de l’ARNt, de l’ARNr, des ribozymes, de l’ADN, de l’ADNc, des acides nucléiques recombinants, des acides nucléiques ramifiés, des plasmides, des vecteurs, des sondes, des amorces, etc. Lorsque l’acide nucléique de l’invention prend la forme d’ARN, il peut comporter ou pas une coiffe en 5’.
Les acides nucléiques de l’invention peuvent faire partie d’un vecteur, c’est-à-dire qu’ils peuvent faire partie d’une construction d’acide nucléique conçue pour la transduction/ transfection d’un ou de plusieurs types cellulaires. Les vecteurs peuvent être, par exemple, des « vecteurs de clonage » qui sont conçus pour l’isolement, la propagation et la réplication de nucléotides insérés, des « vecteurs d’expression » qui sont conçus pour l’expression d’une séquence nucléotidique dans une cellule hôte, des « vecteurs viraux » qui sont conçus pour entraîner la production d’un virus recombinant ou d’une particule pseudovirale, ou des « vecteurs navettes », qui comprennent les attributs de plus d’un type de vecteur. Les vecteurs préférés sont des plasmides, tel que susmentionnés. Une « cellule hôte » comprend une cellule individuelle ou une culture cellulaire qui peut ou qui a été un receveur d’un acide nucléique exogène. Les cellules hôtes comprennent la descendance d’une simple cellule hôte, et la descendance peut ne pas être nécessairement complètement identique (en morphologie ou en complément d’ADN total) à la cellule parente originale à cause d’une mutation et/ou d’un changement naturel, accidentel, ou délibéré. Les cellules hôtes comprennent des cellules transfectées ou infectées in vivo ou in vitro avec un acide nucléique de l’invention.
Lorsqu’un acide nucléique est de l’ADN, il faudra comprendre que « U » dans une séquence d’ARN sera remplacé par « T » dans l’ADN. De façon similaire, lorsqu’un acide nucléique est de l’ARN, il faudra comprendre que « T » dans une séquence d’ADN sera remplacé par « U » dans l’ARN.
Le terme « complément » ou « complémentaire » lorsqu’il est utilisé en relation avec des acides nucléiques se rapporte à l’appariement des bases de Watson-Crick. Ainsi, le complément de C est G, le complément de G est C, le complément de A est T (ou U), et le complément de T (ou U) est A. Il est également possible d’utiliser des bases comme I (la purine inosine), par exemple pour complémenter des pyrimidines (C ou T).
Les acides nucléiques de l’invention peuvent être utilisés, par exemple : pour produire des polypeptides ; en tant que sondes d’hybridation pour la détection d’un acide nucléique dans des échantillons biologiques ; pour générer des copies supplémentaires des acides nucléiques ; pour générer des ribozymes ou des oligonucléotides antisens ; en tant qu’amorces ou sondes d’ADN simple brin ; ou en tant qu’oligonucléotides formant des triples brins. L’invention propose un procédé de production d’un acide nucléique de l’invention, où l’acide nucléique est synthétisé en partie ou en totalité en utilisant un moyen chimique. L’invention propose des vecteurs comprenant des séquences nucléotidiques de l’invention (par exemple, des vecteurs de clonage ou d’expression) et des cellules hôtes transformées avec de tels vecteurs.
Pour certains modes de réalisation de l’invention, les acides nucléiques ont de préférence une longueur d’au moins 1340 nucléotides (par exemple, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, ou 2400 nucléotides ou plus longs).
Cellules de l’invention L’invention propose également une cellule comprenant un acide nucléique de l’invention. Ladite cellule peut être transformée de façon stable avec ledit acide nucléique. L’invention propose également une cellule qui exprime un polypeptide GAS40 de l’invention.
Production d’antigènes protéiniques de GAS
La redondance du code génétique est bien connue. Ainsi, toute molécule d’acide nucléique (polynucléotide) qui code pour l’un des antigènes de GAS décrits dans la présente peut être utilisée pour produire cette protéine de façon recombinante. Les molécules d’acide nucléique codant pour les antigènes de GAS de type sauvage peuvent être également isolées de la bactérie S. pyogenes appropriée en utilisant des techniques classiques de purification d’acide nucléique ou elles peuvent être synthétisées en utilisant une technique d’amplification, comme la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), ou en utilisant un synthétiseur automatisé. Voir Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215, 223, 1980 ; Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225, 232, 1980 ; Hunkapiller et al., Nature 310, 105-11, 1984 ; Grantham et al., Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981. Les molécules d’ADNc peuvent être fabriquées avec des techniques classiques de biologie moléculaire, en utilisant de l’ARNm comme matrice. Les molécules d’ADNc peuvent être ensuite répliquées en utilisant des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'état de l'art. Une technique d’amplification, comme la PCR, peut être utilisée pour obtenir des copies supplémentaires des polynucléotides de l’invention, en utilisant soit de l’ADN génomique soit de l’ADNc comme matrice.
Si c’est souhaité, les polynucléotides peuvent être modifiés en utilisant des procédés connus de façon générale de l'état de l'art pour modifier des séquences codantes d’antigènes pour diverses raisons, y compris mais sans y être limitées, des modifications pour modifier le clonage, le traitement et/tPÜ2 l'expression du polypeptide ou du produit de l'ARNm. La réorganisation d'ADN par fragmentation aléatoire et le réassemblage par PCR des fragments de gènes et des oligonucléotides synthétiques peuvent être utilisés pour modifier les séquences nucléotidiques. Par exemple, une mutagenèse dirigée peut être utilisée pour insérer de nouveaux sites de restriction, pour modifier des profils de glycosylation, pour changer la préférence des codons, pour produire des variants d'épissage, pour introduire des mutations, et ainsi de suite.
Des modifications de séquence, comme l'addition d'une séquence de marqueur pour la purification ou l'optimisation des codons, peuvent être utilisées pour faciliter l'expression. Par exemple, la séquence de tête N-terminale peut être remplacée par une séquence codant pour une protéine marqueur comme une polyhistidine (« HIS ») ou la glutathion S-transférase (« GST »). De telles protéines marqueurs peuvent être utilisées pour faciliter la purification, la détection, et la stabilité de la protéine exprimée. Les codons préférés par un hôte procaryote ou eucaryote particulier peuvent être choisis pour augmenter le taux d'expression de la protéine ou pour produire un transcrit d'ARN possédant des propriétés souhaitables, comme une demi-vie qui est plus longue que celle d'un transcrit généré à partir de la séquence existant à l'état naturel. Ces procédés sont bien connus de l'état de l'art et sont en outre décrits dans le document WO 05/032582.
Une molécule d'acide nucléique qui code pour un antigène de GAS pour une utilisation dans l'invention peut être insérée dans un vecteur d'expression qui contient les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction de la séquence codante insérée. Les procédés qui sont bien connus de l'homme du métier peuvent être utilisés pour construire des vecteurs d'expression contenant des séquences codantes et des éléments de contrôle de la transcription de la traduction appropriés. Ces procédai?2 comprennent les techniques d’ADN recombinant in vitro, les techniques de synthèse, et la recombinaison génétique in vivo.
Les cellules hôtes pour la production d’antigènes de GAS peuvent être procaryotes ou eucaryotes. E. coli est une cellule hôte préférée, mais d’autres hôtes appropriés comprennent Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, des Mycobactéries (par exemple, M. tuberculosis), des levures, des baculovirus, des cellules de mammifères, etc.
Une souche de cellule hôte peut être choisie pour sa capacité à moduler l’expression des séquences insérées ou à traiter le polypeptide exprimé de la façon souhaitée. De telles modifications du polypeptide comprennent, mais n’y sont pas limitées, une acétylation, une carboxylation, une glycosylation, une phosphorylation, une lipidation, et une acylation. Un traitement après la traduction qui clive une forme « prépro » du polypeptide peut être également utilisé pour faciliter une insertion, un repliement et/ou une fonction corrects. Différentes cellules hôtes qui disposent d’une machinerie cellulaire spécifique et de mécanismes caractéristiques pour des activités post-traductionnelles sont disponibles auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC ; 10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) et peuvent être choisies pour assurer la modification et le traitement corrects d’une protéine étrangère. Voir le document WO 01/98340.
Des constructions d’expression peuvent être introduites dans des cellules hôtes en utilisant des techniques bien établies qui comprennent, mais n’y sont pas limitées, le transfert d’ADN médié par des conjugués de transferrine-polycations, la transfection avec des acides nucléiques nus ou encapsulés, la fusion cellulaire médiée par des liposomes, le transport intracellulaire de billes de latex revêtues d’ADN, la fusion de protoplastes, l’infection virale, l’électroporation, les2 procédés avec un « canon à gènes », et la transfection médiée par DEAE ou phosphate de calcium.
Les cellules hôtes transformées avec des vecteurs d’expression peuvent être cultivées dans des conditions appropriées pour l’expression et la récupération de la protéine à partir de la culture cellulaire. La protéine produite par une cellule transformée peut être sécrétée ou contenue au niveau intracellulaire selon la séquence nucléotidique et/ou le vecteur d’expression utilisé. L’homme du métier comprendra que les vecteurs d’expression peuvent être conçus pour contenir des séquences signal qui dirigent la sécrétion des antigènes solubles à travers une membrane de cellule procaryote ou eucaryote.
Les séquences signal ou d’export peuvent être incluses dans un antigène de GAS produit de façon recombinante si bien que l’antigène peut être purifié à partir du milieu de culture cellulaire en utilisant des procédés connus. En variante, les antigènes de GAS produits de façon recombinante peuvent être isolés des cellules hôtes modifiées et séparés des autres composants dans la cellule, comme des protéines, des glucides, ou des lipides, en utilisant des procédés bien connus de l'état de l'art. De tels procédés comprennent, mais n’y sont pas limités, la chromatographie d’exclusion, le fractionnement au sulfate d’ammonium, la chromatographie d’échange d’ions, la chromatographie d’affinité, et l’électrophorèse sur gel préparative. Une préparation d’antigènes de GAS purifiés est au moins pure à 80 % ; de préférence, les préparations sont pures à 90 %, 95 %, ou 99 %. La pureté des préparations peut être estimée par tout moyen connu de l'état de l'art, comme l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec SDS ou analyse par RP-HPLC. Lorsque c’est approprié, les protéines mutantes de Spy0167 peuvent être solubilisées, par exemple, avec de l’urée.
Les antigènes de GAS peuvent être synthétisés, par exempl#^2 en utilisant des techniques sur phase solide. Voir, par exemple, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 54, 1963 ; Roberge et al., Science 269, 202 04, 1995. La synthèse des protéines peut être effectuée en utilisant des techniques manuelles ou par automatisation. La synthèse automatisée peut être obtenue, par exemple, en utilisant un instrument Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Eventuellement, des fragments des antigènes de GAS peuvent être synthétisés séparément et combinés en utilisant des procédés chimiques pour produire une molécule pleine longueur. Généralités
Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut comprendre quelque chose d’autre, par exemple, X + Y.
Le terme « substantiellement » n’exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « substantiellement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c’est nécessaire, le terme « substantiellement » peut être omis de la définition de l’invention. Le terme « constitué essentiellement de » signifie que la composition, le procédé ou la structure peut comprendre des composants, des étapes et/ou des parties supplémentaires, mais seulement si les composants, les étapes et/ou les parties supplémentaires ne modifient pas matériellement les caractéristiques basiques et nouvelles de la composition, du procédé et/ou de la structure revendiqués. Le terme « constitué de » est généralement pris pour signifier que l’invention telle que revendiquée est limitée à ces éléments spécifiquement cités dans la revendication (et cela peut inclure leurs équivalents, tant que la doctrine des équivalents est applicable).
Le terme « environ » tel qu’utilisé dans la présent2 lorsqu’il est fait référence à une valeur mesurable comme une quantité, une durée temporelle, et analogues est censé englober des variations de ± 20 % ou ± 10 %, de manière davantage préférée ± 5 %, de manière même davantage préférée ± 1 %, et de manière encore davantage préférée ± 0,1 % à partir de la valeur spécifiée, tant que de telles variations sont appropriées pour effectuer les procédés divulgués.
Le terme « substantiellement » n’exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « substantiellement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Par exemple, « substantiellement dépourvue » de Y peut être compris comme une composition ne contenant pas plus de 5 % de Y, pas plus de 4 % de Y, pas plus de 3 % de Y, pas plus de 2 % de Y, pas plus de 1 % de Y, ou pas plus de 0,1 % de Y. Lorsque c’est nécessaire, le terme « substantiellement » peut être omis de la définition de l’invention.
Le terme « mutant » se rapporte à un gène ou à un produit de gène qui présente des modifications dans sa séquence et/ou de ses propriétés fonctionnelles (c’est-à-dire, des caractéristiques modifiées) lors d’une comparaison au gène ou au produit de gène de type sauvage. Ainsi, des séquences de type sauvage et des fragments de séquences de type sauvage, qui ne comprennent pas des substitutions de la présente invention, sont exclus. Par exemple, des séquences n’incluant pas au moins deux positions ou plus choisies dans le groupe constitué de T237, A241, A688, S692, A700, A703, A38, Q52, T66, A148, S158, A179, A182, T186, A196, Q203, Q218, K225, A544, T558, S562, K576, A586, T614, A618, A621, T665, A672, Q683, T693 peuvent être exclues.
Tous les numéros d’accession de GenBank fournis dans la présente sont incorporés en référence.
Sauf indication contraire, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus n’exige aucun ordre spécifique de mélange. Ainsi, les composants peuvent être mélangés dans n’importe quel ordre. Lorsqu’il y BE2 trois composants, alors deux composants peuvent être combinés l’un avec l’autre, et ensuite la combinaison peut être combinée avec le troisième composant, etc.
Lorsque des matériaux animaux (et particulièrement bovins) sont utilisés dans la culture des cellules, ils devront être obtenus auprès de sources qui sont dépourvues d’encéphalopathie spongiforme transmissible (ESTs), et en particulier dépourvues d’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Globalement, il est préférable de cultiver des cellules en l’absence totale de matériau d’origine animale.
Lorsqu’un composé est administré au corps dans le cadre d’une composition, alors ce composé peut être remplacé en variante par un précurseur approprié. L’identité de séquence entre des séquences polypeptidiques est déterminée de préférence par un algorithme d’alignement par paires utilisant l’algorithme d’alignement global de Needleman-Wunsch (Needleman &amp; Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453), en utilisant les paramètres par défaut (par exemple, avec une pénalité d’ouverture de brèche = 10,0, et avec une pénalité d’extension de brèche = 0,5, en utilisant la matrice de score EBLOSUM62). Cet algorithme est mis en œuvre de façon pratique dans l’outil needle dans le progiciel EMBOSS (Rice et al. (2000) Trends Genet 16: 276-277). L’identité de séquence devra être calculée sur la longueur entière de la séquence polypeptidique de l’invention.
Exemples
Exemple 1 - Analyse bioinformatique pour identifier des suites courtes d’acides aminés communes aux protéines humaines potentiellement responsables d’un mimétisme des épitopes linéaires, menant à des maladies auto-immunes
Afin de détecter des suites courtes d’acides aminés qiü2 sont communes à la fois à l’antigène GAS40 et à une ou plusieurs protéines humaines et potentiellement responsables d’un mimétisme des épitopes linéaires, les séquences d’acides aminés du GAS40 ont été sous-divisées en 7-mers, 8-mers, 9-mers et 10-mers se chevauchant, avec une fenêtre coulissante de 1 résidu d’acide aminé. Chacun de ces fragments a été comparé à une collection de protéines humaines disponibles sur le ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/H_sapiens/protein/. La même analyse a été réalisée sur la séquence de la toxine tétanique (GI : 135624), dont l’innocuité est largement acceptée, et les protéines M1 et M5 de Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes M1 GAS, GI : 15675799, Streptococcus pyogenes sérotype M5, GI : 126669), qui ont été également rapportées comme contenant des épitopes qui présentent une réactivité croisée avec les tissus humains (Baird et al., 1991). Les résultats de cette analyse sont résumés dans le tableau 1.
Tableau 1
Deux correspondances de 9-mer et une correspondance de 8-mer ont été détectées pour le GAS40. Le premier 9-mer a la séquence représentée par QLTEELAAQ (SEQ ID NO : 8), et il est localisé en position 235 à 243 de GAS40 qui se situe dans le premier domaine surenroulé. Ce 9-mer se trouve également dans une protéine humaine de 562 acides aminés connue sous le nom de protéine « 81 contenant des domaines surenroulés » (GI : 47271449). Le second 9-mer a la séquence représentée p BE2 SEQ ID NO : 9, et il est localisé en position 684 à 692 de GAS40, qui se situe dans le domaine de leucine zipper. Ce 9-mer se trouve également dans une protéine humaine de 408 acides aminés connue sous le nom de « UPF0492 protéine C20orf94 » (GI : 61102723). Le 8-mer a la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 et il est localisé en position 699 à 706, qui fait le pont avec la limite C-terminale du domaine de leucine zipper. Ce 8-mer se trouve également dans une protéine humaine de 844 acides aminés connue sous le nom de « Janus kinase et protéine 3 interagissant avec les microtubules » (GI : 157502225).
Afin de réduire l’identité de séquence des 9-mers et du 8-mer susmentionnés avec les séquences des protéines humaines correspondantes, de multiples mutations ont été introduites dans ces 9-mers et ce 8-mer. Afin d’éviter une réduction de l’efficacité immunologique du GAS40, il a été introduit six substitutions d’acides aminés (deux dans chacune des correspondances des 8/9-mers) qui ont été conçues pour n’avoir aucun effet sur la structure globale de la protéine (surenroulement d’hélice alpha/leucine zipper). Les deux substitutions qui ont été réalisées sur le premier 9-mer (QLTEELAAQ) ont été T237S et A241V, se traduisant par la séquence mutée du 9-mer : QLsEELvAQ (SEQ ID NO : 11). Les deux substitutions qui ont été réalisées sur la SEQ ID NO : 9
ont été A688S et S692T, se traduisant par la séquence mutée du 9-mer : KQDLsKTTt (SEQ ID NO : 12). Les deux substitutions qui ont été réalisées sur la SEQ ID NO : 10 ont été A700S et A703S, se traduisant par la séquence mutée du 8-mer : EsLAsLQA (SEQ ID NO : 13).
La figure 1 représente une prédiction de la structure secondaire de la protéine de type sauvage et mutante du GAS40. Comme il est montré, la prédiction indique que l’intégrité du profil de propension à un surenroulement et du motif de leucine zipper demeurera inchangée par les six mutations susmentionnées. BE2
Exemple 2 - Analyse bioinformatique pour identifier les irrégularités de surenroulement possibles similaires à la myosine et à la tropomyosine humaines dans le GAS40
Des irrégularités de surenroulement ont été récemment démontrées dans la protéine M1 (McNamara et al., 2008). Des irrégularités structurales similaires apparaissent dans la myosine et la tropomyosine, fournissant une explication possible des schémas associés aux protéines M de réactivité croisée dans les séquelles auto-immunes d’une infection par un GAS. Lorsque des substitutions ont été réalisées au sein de la région surenroulée de M1 produisant des résidus centraux optimaux pour la formation et la stabilité des surenroulements parallèles dimères (« idéalisation de séquence »), la liaison du fibrinogène, les effets proinflammatoires, et la réactivité croisée des anticorps ont été diminués. Une « idéalisation » similaire de l’approche du surenroulement a été suivie dans le cas du GAS40 pour mitiger toute réactivité croisée potentielle.
En utilisant le progiciel Jalview (http://www.jalview.org/), les régions surenroulées du GAS40 ont été identifiées et surlignées avec une échelle de couleur du rouge au bleu où le rouge représente les résidus hydrophobes et le bleu représente les résidus hydrophiles. Les résidus hydrophiles dans les positions 1 et 4 des heptades formant les surenroulements ont été substitués par le résidu hydrophobe leucine pour « idéaliser » la structure de surenroulement, et la lysine 208 a été délétée pour corriger un décalage de cadre d’heptade. Une liste des mutations qui ont été introduites dans le GAS40 est présentée dans le tableau 2.
Tableau 2
2
Exemple 3 - Techniques de clonage et générales sur l’ADN 3.1 GAS40 sans les homologies de 8 et 9-mers
Trois codons rares AGA codant pour l’arginine (Arg 359, Arg 360 et Arg 849) ont été mutés en codon commun pour l’arginine CGT afin d’optimiser l’expression du GAS40. La séquence nucléotidique du GAS40 contenant les substitutions AGA en CGT des codons d’arginine, mais excluant les séquences du peptide de tête et du domaine transmembranaire, est représentée par SEQ ID NO : 1 et la séquence d’acides aminés correspondante est représentée par SEQ ID NO : 2.
Un vecteur pET21b+ contenant le gène du GAS40 avec les codons optimisés a été utilisé comme matrice pour créer le mutant 8-9-mers du GAS40. L’introduction des 6 mutations a été réalisée en 3 étapes, chacune incorporant 2 mutations dans l’une des suites homologues à l’être humain, produisant deux constructions intermédiaires et une construction finale incorporant les trois mutations.
Dans chaque étape, le procédé de clonage Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) (Klock and Lesley 2009) a été utilisé pour amplifier le plasmide entier en utilisant deux amorces conçues pour créer deux mutations (substitutions) et pour être complémentaires l’une de l’autre, de telle façon que le produit de PCR linéarisé pourra s’auto-hybrider pour recréer un plasmide mutant viable. Les amorces utilisées dans chacune des trois étapes sont présentées ci-dessous :
Tableau 3_
Les séquences nucléotidiques et d’acides aminés du mutant 8-9-mers du GAS40, avec les séquences du peptide de tête et du domaine transmembranaire délétées, sont représentées par SEQ ID NO : 3 et 4, respectivement. 3.2 GAS40 avec des surenroulements « idéalisés »
Une protéine GAS40 « multi-mutante » à codons optimisés contenant des surenroulements « idéalisés » a été produite par synthèse chimique. Afin d’optimiser l’expression, la teneur en GC a été ajustée pour prolonger la demi-vie de l’ARNm. L’usage des codons a été également adapté à la préférence d’Escherichia coli. Les séquences nucléotidiques et d’acides aminés du GAS40 avec des surenroulements « idéalisés » (multi-mutant), avec les séquences du peptide de tête et du domaine transmembranaire délétées, sont représentées par SEQ ID NO : 5 et 6.
Exemple 4 - Expression et purification du GAS40 recombinant et de ses dérivés
Les dérivés mutants marqués par His du GAS40 recombinant ont été exprimés dans des cellules d’E. coli BL21(DE3) et purifiés par chromatographie d’affinité sur des colonnes de chromatographie d’affinité avec des ions métalliques immobilisés.
Les cellules ont été d’abord incubées à 30 °C sous agitation à 180 tr/min jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité de culture de DO600nm = 0,4 à 0,6, puis les cellules ont été induites avec 1 mM d’IPTG, et incubées pendant encore 3 heures à 25 °C sous agitation à 180 tr/min. Les cellules ont été ensuite récupérées par centrifugation et congelées à -20 °C.
Les culots congelés d’E. coli ont été mis en suspension dans du tampon de lyse (10 ml de B-PER™ (Pierce), 0,1 mM de MgCl2, 100 unités de DNase I (Sigma), et 1 mg/ml de lysozyme (Sigma)) et mélangés pendant 30 à 40 minutes à température ambiante. Les lysats résultants ont été centrifugés à 3000040000 x g pendant 20 à 25 minutes, et les surnageants ont été ensuite chargés sur des colonnes équilibrées avec le tampon de lavage A (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, pH 8,0) (Poly-Prep avec 1 ml de résine Ni-Activated Chelating Sepharose Fast Flow). La résine chargée a été lavée trois fois avec du tampon de lavage A et trois fois avec du tampon de lavage B (70 mM d’imidazole, 50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, pH 8,0). Les protéines ont été éluées avec le tampon d’élution (250 mM d’imidazole, 50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, pH 8,0) dans des tubes Eppendorf contenant 1 mM de DTT. Les protéines éluées totales ont été quantifiées avec du réactif de Bradford, intensivement dialysées avec du PBS et ensuite analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec du SDS (voir la figure 7) en utilisant des gels prémoulés Criterion™ à 4-12 % (Bio-Rad).
Exemple 5 - Immunisation et infection
Pour tester si les mutants de GAS sont capables d’induire une protection contre une stimulation (« challenge ») létale chez des souris, des souris âgées de cinq semaines ont été immunisées par voie intrapéritonéale trois fois (jour 0, jour 21 et jour 35) avec soit du GAS40 de type sauvage marqué par hßi2 soit du mutant 8-9-mers du GAS40 soit du GAS40 multi-mutant, qui ont été chacun combinés avec un adjuvant d’alun (20 μg de protéine dans 2 mg/ml d’hydroxyde d’aluminium). Les souris immunisées avec l’adjuvant seul ont été utilisées en tant que témoins négatifs. Deux semaines après la troisième immunisation, des échantillons de sang ont été prélevés. Quelques jours après, les souris immunisées ont été stimulées (« challengées ») par voie intranasale avec 108 cfu (50 μ!) des souches de GAS M1 3348. La survie des souris a été surveillée pendant une période de 10 à 14 jours.
Comme il est montré dans le tableau ci-dessous, à la fois le multi-mutant et le mutant 9-mer ont augmenté le taux de survie des souris immunisées de 4,2 à 4,3 fois le taux de survie du témoin négatif. Ceci indique que les protéines mutantes produisent des taux de protection élevés. En effet, les protéines mutantes ont été même plus efficaces que le GAS40 de type sauvage.
Tableau 4
Exemple 6 - Réactivité croisée des antisérums de souris contre des tissus humains
Le développement de maladies auto-immunes est associé à d§E2 taux persistants de titre élevé d’anticorps de haute affinité. Afin d’estimer le potentiel du GAS40 à déclencher des anticorps reconnaissant des composants tissulaires humains spécifiques, une étude de réactivité croisée pilote avec des antisérums de souris dirigés contre le GAS40 a été réalisée. Les sérums ont été obtenus à partir de groupes de 8 souris CD1 non consanguines immunisées comme il est montré dans le tableau 10.
Tableau 10
L’étude de réactivité croisée de tissus humains non GLP a été optimisée et effectuée aux Charles River Laboratories/PAI à Frederick, MD. Un panel de tissus humains sélectionnés a été criblé à cause de leur association avec une pathologie postinfection par GAS spécifique : cartilage, cerveau, cœur, valve cardiaque, rein et muscle squelettique. L’intégrité du tissu a été confirmée par coloration avec de la bêta-2-microglobuline. Les sérums groupés provenant des souris avec les titres les plus élevés ont été optimisés pour une utilisation à des dilutions au 1/10 000 et 1/40 000. Des lames témoins de dépôts des antigènes individuels ont été incubées avec les antisérums groupés provenant des groupes respectifs d’animaux afin de confirmer les réponses spécifiques des antigènes. Aucune coloration de la membrane cellulaire spécifique de l’article testé n’a été observée dans aucun groupe suggérant que les anticorps dirigés contre le GAS40 n’ont pas reconnu les éléments de la membrane qui pourraient influencer biologiquement les processus. Une coloration spécifique a été observée dans le cytoplasme avec les antisérums provenant des souris traitées avec la M6, la M12 et le GAS40 et elle a été observée avec plus de fréquence dans la valve cardiaque (M6 et M12) et le cœur (M6, M12 et GAS40). La coloration cytoplasmique a été considérée comme étant peu pertinente d’un point de vue toxicologique car on pense que, de manière générale, le compartiment cytoplasmique est d’accès limité aux anticorps in vivo. C’est la nature de ce test qui permet que le compartiment cytoplasmique soit exposé et disponible pour une liaison par des éléments dans les antisérums de souris. Les résultats de ce criblage préliminaire ont montai2 que (1) le test immunohistochimique a été reproductible entre les séries, (2) il y a eu de légères différences entre la coloration des tissus provenant de donneurs différents, (3) la coloration a diminué avec l’augmentation de la dilution des antisérums, et (4) l’addition de lavages à stringence élevée pour réduire la liaison non spécifique des anticorps de souris non purifiés a diminué ou éliminé la coloration. Cette dernière observation a confirmé indirectement que des anticorps de haute affinité dirigés contre des éléments tissulaires humains n’ont pas été déclenchés chez les souris. Des mutants du GAS40 peuvent être testés en utilisant des protocoles similaires.
Alors que certains modes de réalisation de la présente invention ont été décrits et exemplifiés spécifiquement ci-dessus, il n’est pas prévu que l’invention soit limitée à de tels modes de réalisation. Diverses modifications peuvent y être apportées sans s’écarter de la portée et de l’esprit de la présente invention telle que présentée dans les revendications suivantes. TABLEAU DES NUMEROS D’IDENTIFICATION DE SEQUENCE UTILISES BE2
Références
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Remington, Joseph Price. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th. Edited by Alfonso R. Gennaro. Lippincott Williams and Wilkins, 2000.

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS
    1. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant qui comprend un épitope qui déclenche des anticorps opsoniques contre Streptococcus du groupe A et comprend en outre : (i) au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 235 à 243, au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 684 à 692 et au moins deux substitutions dans l’un quelconque des acides aminés 699 à 700, et/ou (ii) une délétion de lysine en position 208 et des substitutions d’acides aminés au niveau des positions d’acides aminés 38, 52, 66, 148, 158, 179, 182, 186, 196, 203, 218, 225, 544, 558, 562, 576, 586, 614, 618, 621, 665, 672, 683 et 693, où les positions d’acides aminés sont numérotées selon SEQ ID NO : 2.
  2. 2. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon la revendication 1 qui comprend des substitutions au niveau des positions d’acides aminés T237, A241, A688, S692, A700 et A703.
  3. 3. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon la revendication 2 qui comprend les substitutions T237S, A241V, A688S, S692T, A700S et A703S.
  4. 4. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 qui comprend une délétion de lysine en position 208 et les substitutions d’acides aminés A38L, Q52L, T66L, A148L, S158L, A179L, A182L, T186L, A196L, Q203L, Q218L, K225L, A544L, T558L, S562L, K576L, A586L, T614L, A618L, A621L, T665L, A672L, Q683L et T693L.
  5. 5. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon la revendication 1, où ledit polypeptide partage au moins 92 % d’identité avec l’une quelconque de SEQ ID NO : 4, 6, 7, 16, 17,2 18, 24, 25 ou 26.
  6. 6. Polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon la revendication 5, où ledit polypeptide comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 4, 6, 7, 16, 17, 18, 24, 25 et 26.
  7. 7. Fragment d’un polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon l’une quelconque des revendications précédentes, où le fragment partage au moins 97 % d’identité avec l’une quelconque des SEQ ID NO : 20, 21, 22, 28, 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, 117 et 118.
  8. 8. Fragment selon la revendication 7, où le polypeptide comprend ou est constitué de l’une quelconque de SEQ ID NO : 4, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 7, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114 et 118.
  9. 9. Polypeptide comprenant le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 1 à 6 ou le fragment d’un polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 7 à 8.
  10. 10. Composition immunogène comprenant le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 1 à 6 ou le fragment d’un polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 7 à 8.
  11. 11. Composition immunogène selon la revendication 10, où ladite composition comprend un ou plusieurs polypeptides de GAS supplémentaires.
  12. 12. Composition immunogène selon la revendication 11, où ladite composition comprend un polypeptide GAS57 de SEQ ID NO : 120 et un polypeptide GAS25 de SEQ ID NO : 121 et éventuellement un polysaccharide de GAS.
  13. 13. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, où ladite composition est un vaccin.
  14. 14. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 10 à 13, qui comprend un adjuvant.
  15. 15. Acide nucléique codant pour le polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 1 à 6 ou le fragment d’un polypeptide streptococcique GAS40 recombinant selon les revendications 7 à 8.
  16. 16. Cellule comprenant l’acide nucléique selon la revendication 15.
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