JP2018134074A - ヘパリン結合性赤血球凝集素（ｈｂｈａ）融合タンパク質とその用途をコードする組換え型マイコバクテリウム - Google Patents

Abstract

【課題】赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）融合タンパク質をコードする配列を含む組換え型マイコバクテリウム（ｒＭｙｃ）の提供。
【解決手段】マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含み、前記融合配列が、プロモーターに操作可能に結合されるマイコバクテリウム。前記マイコバクテリウムがヒト型結核菌、ウシ型結核菌およびスメグマ菌を含む群から選択される。
【選択図】図２

Description

説明
発明の背景
本発明は一般的にヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）融合タンパク質をコードする配列を含み、明示する組換え型マイコバクテリウムに関するものである。融合タンパク質はアミノ末端マイコバクテリア抗原Ａｇ８５Ｂリーダー配列を含んでおり、融合タンパク質の書換えは適切なプロモーター、例えば、Ａｇ８５Ｂプロモーターによって動かされる。また、本発明は例えば痘苗原として、組換え型マイコバクテリウムおよび組換え型融合タンパク質を製造し、使用する方法を提供する。

結核（ＴＢ）は毎年８００万の新しい症例があり２００万人が死に至る国際的な公衆衛生問題である。結核診療の特に問題の多い側面は、ヒト結核菌（Ｍｔｂ）細菌が潜在的で無症候性の状態に入り、長期間に潜在的に感染した個人に持続する能力である。そのような個人は、例えばＨＩＶなどの病気または状態によって引き起こされた免疫抑制、化学療法や副腎皮質ホルモンの使用、老化等に伴う免疫低下に起因する病気の再発に影響されやすい。現在約２０億人（世界の人口の１／３）が潜在的にＭｔｂに感染しており、潜在的な結核の活性化は、活動性疾患の新しい症例のほとんどを占める。再活性化は、肺の炎症、壊死と空洞化、気管支に病変の排液をもたらすプロセスに関連している。気管支病変を持つ個人が咳をするときに生成されるエアロゾルが、未感染で感染しやすい人々に対するＭｔｂ有機体の拡散を招き、このように感染サイクルが持続される。

結核に対する唯一の現在利用可能なワクチンはウシ型結核菌（カルメット−ゲラン桿菌）（ＢＣＧ）は、１９２１年に最初に導入された。ＢＣＧは広く活用されており、そして研究は、いくらかの目的のためにＢＣＧが有効であることを（例えば、播種性結核に対する）示しているが、潜在的な結核の発生、持続および再発を妨げることに関して効果がないことが知られている。

結核に対する改善された、より有効なワクチンを開発する継続的な必要がある。特に、潜伏結核感染の開発、保持、そして／または、再発に対する保護を提供するワクチンを開発する必要がある。

ＴＢワクチンにおける使用が提案されている１つのタンパク質は、ヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質である。ＨＢＨＡは、結核菌と宿主との相互作用を媒介する２２ｋＤＡのメチル化された表面露出型タンパク質であり、非貪食性細胞への付着因子として作用する。Ｃ末端リジン残基のメチル化は、タンパク質の生物化学的および免疫学的特性の両方に影響を及ぼすことが知られており、複数の実験的発見は、ＨＢＨＡをＭｔｂの肺外播種のプロセスに関連付けている（非特許文献１）。非特許文献２は、ＨＢＨＡの共有原子価のメチル化がＭｔｂで忌避されたネズミでの保護的なＴ細胞応答の誘引に必要であることを示し、Ｚａｎｎｅｔｔｉらは、浄化されたメチル化ＨＢＨＡが、制御と比較して結核患者から得られた血清によって強く認められることを示し、非メチル化ＨＢＨＡはそうではないことを示した（非特許文献３）。これらおよび他の研究を踏まえて、ＨＢＨＡに基づくワクチンの開発がＴＢの予防および／または治療のための効果的な戦略を示し得ることが提示されている。

特許文献１、ここに参考文献として完全に援用される全内容が、メチル化組換え体ＨＢ
ＨＡを含む免疫原組成物を報告する。Ｐｅｔｈｅによると、２つの方法の１つでＨＢＨＡを生産できる。１：異種細胞（大腸菌またはスメグマ菌）内の組換え型非メチル化ＨＢＨＡタンパク質の生産、そして翻訳後に化学的または酵素的な方法を使用することで、精製された組換え体ＨＢＨＡをメチル化すること、または２：ＨＢＨＡおよびマイコバクテリウムメチル基転移酵素をコードする同時発現のヌクレオチド配列に組換え型細胞を使用すること。方法１はタンパク質調製のための複数のことを含む。方法２はワクチンとして処理できない異種細胞の使用を含む。さらに、Ｐｅｔｈｅによって使用される菌株は、抗生物質抵抗性であり、そして、タンパク質収率を最適化することに関する議論は、提供されない。このように、痘苗原として使用できる組換え型Ｍｔｂのための、および／または、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、臨床的に関連するＨＢＨＡの十分な量を生成し、および／または臨床応用において後の使用のための製造現場で大量のＨＢＨＡを生成する技能の必要性が生じる。

米国特許第７，８２９，１０３号Ｐｅｔｈｅら

Ｐｅｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ ４１２：１９０−１９４． Ｔｅｍｍｅｒｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，９３５−９４１（２００４）） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５ ｖｏｌ．１２ ｎｏ．９ １１３５−１１３８

本発明は一般的にヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、発現する組換え型マイコバクテリウム（ｒＭｙｃ）を規定するものである。融合タンパク質はアミノ末端で付着したマイコバクテリア抗原Ａｇ８５Ｂリーダーペプチドを含む。融合白質は翻訳後にメチル化されており、ネイティブのＨＢＨＡのものと同じであるか、または近似のメチル化パターンでタンパク質をもたらす。その結果、得られた融合タンパク質はそのように高抗原性であり、多量の抗原性融合タンパク質は、本発明の方法を使用することで生成できる。融合タンパク質の書換えは適切なプロモーターによって動かされ、そのプロモーターは、構成的または誘導的に可能な場合がある。１つの実施形態では、プロモーターはＡｇ８５Ｂプロモーター配列である。また、本発明はｒＭｙｃを（例えば工業規模で）製造する方法、そして／または免疫反応を誘導するために、または融合タンパク質を製造するために、または種培養を製造するために、痘苗原として例えばｒＭｙｃを使用する方法、そして例えば、痘苗原として融合タンパク質を製造し使用する方法、または、免疫反応を引き出すか、または例えば、潜伏結核感染力を検出する病気の特徴として誘導する。

本発明の目的は、マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質、融合配列が、プロモーターに操作可能に結合されるアミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含み、明示するために遺伝子改変された組換え型マイコバクテリウムを生成することである。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウムは、例えば、ヒト結核菌、ウシ型結核菌、またはスメグマ菌である。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウムは、ウシ型結核菌、例えば、ウシ型結核菌（カルメット−ゲラン桿菌）（ＢＣＧ）である。いくつかの実施形態では、ＢＣＧはＢＣＧデンマークＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（ＳＳＩ）型であり、例えば、ク
ロストリジウム属ウェルチ菌からのｐｆｏの遺伝子などのｐｆｏの遺伝子を明示する可能性がある。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウムは栄養要求変異株、例えば、パントテン酸栄養要求変異株である。

本発明のいくつかの実施形態では、核酸融合配列は、
である。

他の実施例では、核酸融合配列によってコードされたポリペプチドは、アミノ酸配列を持っている：

いくつかの実施形態では、マイコバクテリウムＨＢＨＡタンパク質はヒト結核菌ＨＢＨＡである。さらに別の実施形態では、プロモーターはマイコバクテリウムＡｇ８５Ｂプロモーターである。

また、本発明は、以下のヌクレオチド配列を有する分離された組換え核酸分子を提供する。

また、本発明はマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質のアミノ末端に付着したＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む組換え型の融合タンパク質を生成する。１つの実施形態では、全体の融合タンパク質は、１つのｍＲＮＡとして転写され、単一のポリペプチド（タンパク質）として翻訳される。１つの実施形態では、組換え型の融合タンパク質はアミノ酸配列を持っている：
いくつかの実施形態では、組換え型の融合タンパク質はメチル化される。

また、本発明はマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質のアミノ末端に付着したＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む組換え型の融合タンパク質を生成する方法を提供する。本方法は以下を含む。１）組換え型融合タンパク質をコードしている核酸配列でマイコバクテリウム細胞のような細菌の細胞を導入すること：２）バクテリア細胞を組換え型融合タンパク質を生成させる状況下で導入されたバクテリア（例えばマイコバクテリウム）細胞を成長させること：３）組換え型融合タンパク質を取得すること：いくつかの実施例では、導入は電気穿孔法によって実行される。

また、本発明は、被験者が潜伏結核感染を有するかどうかを決定する方法を提供する。本方法は、マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質のア
ミノ末端に付着するＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む組換え型融合タンパク質に患者の免疫反応性の有無を決定することを含む。免疫反応性の存在は、被験者が潜伏結核感染を有することを示す。免疫反応性の有無を決定することは、以下のものを含み得る。例えば、１）被験者から生体サンプルを取得すること、そして２）生体サンプルで免疫反応性の有無を決定すること。典型的な生体サンプルが含まれるが、痰サンプルと血清サンプルに限定されていない。他の実施例では、免疫反応性の有無を決定することは、以下の検知のことを含み得る。１）被験者に組換え型融合タンパク質を皮内に皮下注射すること。そして、２）皮内注射の場所で免疫反応性の有無を決定すること。

また、本発明は必要に応じて被験者でヒト型結核菌に対して免疫反応を誘導する方法を提供する。この方法は、前記被験者で免疫反応を誘導するのに十分なマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質のアミノ末端に付着したＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む組換え型融合タンパク質を投与することを含み、「治療的な」量と言及される場合がある。１つの実施形態では、誘導された免疫反応は１つまたは複数のＢ細胞、抗体およびＴ細胞の生成である。いくつかの実施形態では、免疫反応は保護免疫反応である。

また、本発明は必要に応じて被験者でヒト型結核菌に対して免疫反応を誘導する方法を提供する。本方法は、被験者にマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含む組換え型融合タンパク質を投与することを含む。本融合配列は、プロモーターに操作可能に結合されており、組換え型マイコバクテリウムは被験者で免疫反応を誘導するのに十分な量で投与される。１つの実施形態では、免疫反応が抗体の生成である。いくつかの実施形態では、免疫反応は保護免疫反応である。

本発明は、組換え型ヘパリン結合性赤血球凝集素（ｒＨＢＨＡ）タンパク質を生産する方法を提供する。本方法は、以下のものを含む。１）マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質アミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含む組換え型マイコバクテリアの培養菌を育てること。ｒＨＢＨＡが生成される条件下で、前記融合配列がプロモーターに操作可能に結合されること。いくつかの実施形態では、本方法はさらに培養菌からｒＨＢＨＡタンパク質を取得することを含む。また、本方法は例えばｒＨＢＨＡを取得することの後に、ｒＨＢＨＡタンパク質を精製することを含み得る。精製は、１つまたは複数の物理化学的なテクノロジーを使用して実行される可能性がある。例えばクロマトグラフィー（例えば１つまたは複数の親和力、立体排除、イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー）そして／または、細胞破壊技術（例えば１つまたは複数の高圧細胞破壊、ビーズ破砕機、均質化、超音波処理、遠心分離、など）がある。また、本方法はｒＨＢＨＡタンパク質の識別の証明を含み得る。いくつかの実施形態では、成長することは振とうまたは発酵により培養において実行される。いくつかの実施形態では、成長はバッチ培養または連続培養を使用することで実行される。

本発明はさらに、組換え型マイコバクテリウムのシードロットを生成する。本方法は、以下のシードロットを含む。１）マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質のアミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含む組換え型マイコバクテリウム、融合配列はプロモーターに操作可能に結合される。そして、２）シードロットの保管の間、生菌状態で、組換え型マイコバクテリアを維持することにふさわしい媒体。

本発明はさらに、ヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質を含む組成物を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法はいかを含む。１）マイコバ
クテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質アミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含む組換え型マイコバクテリアの培養菌を育て、融合配列がプロモーターに操作可能に結合されること。２）培養菌からｒＨＢＨＡタンパク質を取得すること。３）ｒＨＢＨＡタンパク質を精製すること。４）精製されたｒＨＢＨＡタンパク質を生理学的に許容可能な担体と結合すること。成長は振とう培養で発酵により実行され得る。加えて、本方法はさらに１つまたは複数の治療上有益な薬剤を含み得る。含まれるがこれに限定されない、ｒＨＢＨＡおよび生理学的に許容可能な担体に対しての、ＨＢＨＡではない薬品、１つまたは複数の抗原性補強剤および１つまたは複数の免疫原性補強剤。これらの組成物は例えばワクチンとして、治療または診断、または他の目的のために使われ得る。

Ａ：ＨＢＨＡ融合配列をコードする、ＤＮＡ配列（配列番号１）Ａｇ８５Ｂリーダーペプチドは強調されたヌクレオチドによってコードされる。Ｂ：Ａの場合のようにＨＢＨＡ融合タンパク質をコードしているが、また、太字で典型的なＡｇ８５Ｂプロモーター配列を示しているＤＮＡ配列（配列番号２）。 Ａ：ＨＢＨＡ融合配列をコードする、ＤＮＡ配列（配列番号１）Ａｇ８５Ｂリーダーペプチドは強調されたヌクレオチドによってコードされる。Ｂ：Ａの場合のようにＨＢＨＡ融合タンパク質をコードしているが、また、太字で典型的なＡｇ８５Ｂプロモーター配列を示しているＤＮＡ配列（配列番号２）。 コンピュータ上での複製および相補性戦略。 Ａ：パントテン酸塩相補プラスミド（ｐＫＡＭＣＢ）およびＢ：ｐＫＡＭＣＢ２へのＨＢＨＡ遺伝子の複製を図式的に示す。 Ａ：パントテン酸塩相補プラスミド（ｐＫＡＭＣＢ）およびＢ：ｐＫＡＭＣＢ２へのＨＢＨＡ遺伝子の複製を図式的に示す。 カナマイシン耐性のためにｐＫＡＭＣＢ２＋ＨＢＨＡ複製をマーク解除することを図式的に示す。 Ａのアミノ酸配列，Ｂと比較した組換え型のＨＢＨＡ（配列番号３）、アミノ末端メチオニンが開裂された自然のＨＢＨＡ（配列番号４）およびＣ、Ｎ−末端でＡｇ８５Ｂリーダーの場所を図示的に示す。 Ａのアミノ酸配列，Ｂと比較した組換え型のＨＢＨＡ（配列番号３）、アミノ末端メチオニンが開裂された自然のＨＢＨＡ（配列番号４）およびＣ、Ｎ−末端でＡｇ８５Ｂリーダーの場所を図示的に示す。 Ａのアミノ酸配列，Ｂと比較した組換え型のＨＢＨＡ（配列番号３）、アミノ末端メチオニンが開裂された自然のＨＢＨＡ（配列番号４）およびＣ、Ｎ−末端でＡｇ８５Ｂリーダーの場所を図示的に示す。 Ａのために検査された組換え型のＢＣＧ群体ＰＣＲ、ＨＢＨＡ遺伝子、Ｂ、核外遺伝子骨格の存在およびＣ、カナマイシン耐性マーカーの欠損。クローンｎｏ．５は検査でＨＢＨＡの遺伝子の存在、完全な核外遺伝子骨格、およびカナマイシン遺伝子の欠損において陽性と出た。 ＡＥＲＡＳ４４５発育動態、ＢＣＧデンマークＳＳＩ型式クロストリジウム属ウェルチ菌ｐｆｏの遺伝子パントテン酸栄養要求変異株、および本発明のＨＢＨＡ融合タンパク質をコードするようにさらに改変された。 ＡＥＲＡＳ−４４５でＨＢＨＡの式上で４０５７Ｄ２反ＨＢＨＡモノクローナル抗体を使用し示すウエスタンブロット。矢印１および２は内因性ＨＢＨＡと組換え型のＨＢＨＡタンパク質を示す。 ＡＥＲＡＳ−４４５でＨＢＨＡの式上で１Ｇ１０抗体を使用し示すウエスタンブロット。レーン：１ＡＥＲＡＳ−４０１：２ ＡＥＲＡＳ−４１３：３ ＡＥＲＡＳ４４５。矢印１および２は天然のＨＢＨＡと組換え型のＨＢＨＡタンパク質を示す。 ＡＥＲＡＳ−４４５を製造する異なる段階で、１Ｇ１０抗体を使用するウエスタンブロットＨＢＨＡ式。矢印１および２は天然のＨＢＨＡと組換え型のＨＢＨＡタンパク質を示す。レーン：１ＡＥＲＡＳ４１３。２段階２製造のサンプル。３継承発酵槽のサンプル。矢印１および２は内因性ＨＢＨＡと組換え型のＨＢＨＡタンパク質を示す。 サンドイッチＥＬＩＳＡ法で決定している型における、ＨＢＨＡタンパク質の収量。Ａ、視覚的に描写される、およびＢ、および棒グラフとして描写される。 ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡの質量分析法。 ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡのＣ−端末側終端の質量分析法。 ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体３９２１Ｅ４を使用する抗原性分析（Ａ）および４０５７Ｄ２（Ｂ）。

１つの実施形態で、本発明は一般的にヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、発現する組換え型マイコバクテリウム（ｒＭｙｃ）を規定するものである。組換え型マイコバクテリウムは、抗生物質抵抗性ではなく、弱毒生であるため、ワクチン製剤を投与できる。本融合タンパク質はアミノ末端で付着したマイコバクテリア抗原Ａｇ８５Ｂリーダー配列を含む。本発明のｒＭｙｃｓは、転写が適切なプロモーターによって駆動される多量の融合タンパク質を生成する。また、本融合タンパク質は工業生産の過程でｒＭｙｃを回復させて、ワクチン製剤または診断の一部として使用し得る。

１つの実施形態では、本発明の抗原性組換え融合タンパク質をコードする核酸配列は、図１Ａ（配列番号１）で描かれたＤＮＡ配列である。以上のように、核酸はヌクレオチド１から２２５（アンダーラインを引かれる）でＡｇ８５Ｂリーダー配列をコードし、ヌクレオチド２２６から８２５でＨＢＨＡタンパク質をコードする。さらに、５’末端で図１Ｂに描写された例示的な実施形態では、核酸はヌクレオチド１〜１８４（太字で示す）でＡｇ８５Ｂプロモーター配列を含む。図１Ｂに示す実施形態では、それ自体は細胞によって生成される翻訳された融合タンパク質は、ヌクレオチド１８５から１００９によってコードされており、すなわち、プロモーター領域は翻訳されない。

１つの実施形態では、本発明は、配列番号１に記載の配列、または配列を含む核酸を包含する（図１Ａを参照）。別の実施形態では、本発明は、配列番号２に記載の配列、または配列を含む核酸を包含する（図１Ｂを参照）。別の実施形態では、本発明は、配列番号３に記載の配列、または配列を含む核酸を包含する（下記参照）。また、本発明は配列番号１および２を補足するＤＮＡを包含する。そしてまた、配列番号１および２から翻訳されるｍＲＮＡ（または、その補足）またはｍＲＮＡに基づくｃＤＮＡ（ならびにこれらの様々なＤＮＡ−ＲＮＡ混成）単一および二重の両方の鎖核酸を包含する。さらに、当業者は、ここで記載された（すなわち、マイコバクテリウムＨＢＨＡタンパク質のアミノ末端に付けられたＡｇ８５Ｂリーダー・シーケンスを含む）抗原性組換え型の融合タンパク質を生成するために配列番号１および２の正確な配列を使用する必要はないと認める。例えば、配列は、翻訳されたポリペプチドをメチル化でき、それが投与される対象における免疫反応を誘導する抗原性である限り、少なくとも配列番号１および２に対して約７５、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％の相応関係を使用し得る。また、相応関係のこれらのレベルも対応する上記記述の相補的ＤＮＡ、ＲＮＡなどに対して適応できる。当業者は相応関係レベルを決定するための自動プログラムまたはソフトウェアに詳しい。さらに、当業者は、また、融合タンパク質をコードする核酸配列が、様々な役立つ配列、例えば、配列の遺伝子操作の容易さのための制限部位を含み得ると認める。本明細書に記載された％相互関係は決定できる、例えば、以下の検索パラメータ：１２のギャップオープンペナルティ、および１のギャップ拡張ペナルティを有するアフィンギャップ検索を使用することで、ＭＳＰＲＣ
Ｈプログラム（オックスフォード分子）で実施されるようにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相応関係検索アルゴリズムを使用する。

組換え型シーケンスの例示的な変分は含まれるが限定されていない、若干のコードされた残りの保存的なアミノ酸の置換をコードするコドンの代用、例えば、プロモーターおよびリーダー配列間で、例えばリンカーまたはスペーサー配列をコードする配列の挿入、またはリーダー配列と配列をコードするＨＢＨＡとの間で：配列の取扱いまたは操作を容易にする配列への多様な変化、例えば配列に隣接する規制酵素部位での挿入または変化：ベクトルの部分（例えば５フィートまたは３フィートの同じことへの相補的な突出または配列）、下記記述のように様々なタグをコードするシーケンスなど。これは、配列番号３の配列で示される、そこでは、配列の５フィートと３フィートの末端の追加非コード配列がイタリックで示されており、太字でアンダーラインを引かれた配列は前記記載のようにプロモーター領域とリーダーペプチドを表す。

融合タンパク質の発現は、配列番号１に操作可能に結合されるプロモーター配列によって駆動される。１．「操作可能に結合され」ることにより、配列番号１の発現は、プロモーターによって駆動されるか、または制御されるように、プロモーター配列および配列番号１が核酸分子の中に配置されることを意味する。いくつかの実施形態では、プロモーターは分子内で直接配列番号１に先行し得る。他の実施形態では、いくつかの付加配列が介
在し得る。またさらに、配列番号１の発現で支援される他の制御要素は、様々なエンハンサー配列などの核酸分子を含み得る。本発明の実施において使用され得る例示的なプロモーターは含んでいるが、制限されない、例えば、遺伝子のプロモーター ｈｓｐ６０、ｈｓｐＸ、ｐＢ１ａＦまたはｍｔｒＡなど。１つの実施形態では、プロモーターは、Ａｇ８５Ｂプロモーターであり、例えば図１Ｂ（太字の配列）で描写されるように配列番号１に関して配置され、配列番号１は直接上流へ配置される。

翻訳される本発明の融合タンパク質は、抗原性組換え型の融合またはキメラ蛋白（ポリペプチド）であり、以下のものを含む。１）マイコバクテリウムＨＢＨＡタンパク質配列、またはその機能部分。そして２）ＨＢＨＡタンパク質のアミノ末端に付着したか、または関連した、Ａｇ８５Ｂリーダーペプチド（または、その機能部分）。マイコバクテリウムＨＢＨＡタンパク質配列またはその機能部分により私たちは、すなわち、図５Ｂ（配列番号４）で描写される配列で、ＨＢＨＡタンパク質、または、抗原性であるペプチドまたはそのポリペプチド断片、例えば本発明の融合タンパク質の成分として投与されるとネイティブＨＢＨＡに結合する抗体の生成を誘導することを意味する。また、そのような断片も、へパリンと結合して、相互作用するのに十分であり得る。例えば、約５０のアミノ酸の抗原性ペプチド断片または配列番号４のカルボキシル終点にある最後の３０から５０のアミノ酸についての範囲内で含まれる、長さのより少ないものは、使用され得る。そのようなペプチド断片を含むペプチドまたはポリペプチドは、長さのおよそ５０のアミノ酸より大きいが、全長ＨＢＨＡタンパク質より一般に短いポリペプチドで使用され得る。いくつかの実施形態では、長さ約１０〜約２０のアミノ酸までそのような活性ペプチド断片が存在し得る。他の実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、以下配列番号５に示された３９‐アミノ酸のペプチドであるかまた含み得る。または少なくとも約９０％または、より大きい（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％または９９％）配列は、配列番号５に対する識別である。本発明の実施に使用され得る、ＨＢＨＡタンパク質とその断片のさらなる説明は、発行済み米国特許第６，９４９，３４５号（Ｍｅｎｏｚｚｉら）により提供される。その完全な内容はここに参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂリーダー配列は、単一のポリペプチドとして翻訳された２つの効力により、核酸分子の範囲内の直列型の核酸配列から直接ＨＢＨＡタンパク質のアミノ末端に付着している。この場合、付着は共有原子価であり、そして、リーダー配列とＨＢＨＡ配列との間には、介在するアミノ酸配列が存在しない。しかしながら、いくつかの実施形態では、例えば、スペーサーがグリシン、アラニンなどの比較的小さい荷電されていないアミノ酸を含んで、比較的短い（例えば、約１から約１０までの）アミノ酸リンカーまたはスペーサー配列が２つの間に存在し得る。さらに、いくつかの実施例では、本発明の融合タンパク質は他の様々な修正を持ち得る。タグ付け配列の付属のように例えば隔離または発見を容易にする、例えばアフィニティタグのようなＨｉｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン質結合タンパク質（ＣＢＰ）、麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）など、チオレドキシン、ＭＢＰ、ＧＳＴなどの可溶化タグ、ＦＬＡＧタグなどのクロマトグラフィータグ、Ｖ５−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡタグなどのエピトープタグ、様々な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグやその派生物などの蛍光タグなど。

本発明の免疫原性組換え型の融合タンパク質配列は、例えば、ＨＢＨＡのへパリン結合領域でメチル化される、特に、メチル基は前記ヘパリン結合性領域の現在のリジン残留物によって運ばれる。

カルボキシ末端の配列は以下のとおりである。

メチル基はＨＢＨＡのＣ−末端領域の現在のリジン残留物のすべてまたは一部によって運ばれる。有利な点として、単一メチル化されるか、または二重メチル化されるメチル化されたリジン残基で、Ｃ−末端領域の１５の現在からの少なくともおよそ１０（例えば約１０、１１、１２、１３、１４または１５）のリジン残基は、メチル化される。

他の代替の実施形態では、本発明の融合タンパク質は化学的に合成され得る。例えば、周知の技術である方法論を使用する。この実施形態では、例えば、上記記述のＰｅｔｈｅのように、メチル化が試験管内で実行されるか、または実行され得る。

本発明の１つの実施形態では、アミノ酸配列の組換え型の融合タンパク質は以下のとおりである。

他の実施形態では、アミノ酸配列の組換え型の融合タンパク質は、つまり少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８および９９％配列番号３と同一である。まだ十分な機能を保持している間、例えば、被験者で免疫反応を誘発する抗原性、投与される人、またはまだ検出するために分析において反応できること、例えば患者の潜在的な結核感染の存在。例えば保守的なアミノ酸置換は、配列で作られ得る、それによって、正に荷電する側鎖によるアミノ酸は、正に荷電する側鎖で他のアミノ酸によって代えられる（例えばリジン、ヒスチジン、アルギニン）またはそれによって、負に荷電する側鎖によるアミノ酸は、負に荷電する側鎖で他のアミノ酸によって代えられ（例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸）または、それによって、疎水性側鎖によるアミノ酸は、疎水性側鎖で他のアミノ酸によって代えられる（アラニン、ロイシンなど）または、それによって、極地の充電してない側鎖によるアミノ酸は、極地の充電してない側鎖で他のアミノ酸によって代えられる（セリン、トレオニンなど）そして、タンパク質の抗原性に否定的な衝撃を与えない他の代用。さらに単一アミノ酸または配列中のアミノ酸（例えば約２〜５）の短い配列の削除または追加に対して、特定の他の突然変異は、融合タンパク質の生成と抗原性を損なうことなく、許容され得る。通常、そのような変化はタンパク質のヘパリン結合領域で実行されない、または、少なくとも、そのような変化はタンパク質の抗原性形を与えるためにメチル化されるリジン残基を阻害しない。

主要なアミノ酸配列が配列番号３で論述されるＨＢＨＡタンパク質は、ヒト型結核菌に由来し識別されて、天然のＭｔｂ配列である。しかし、当業者は、他のＨＢＨＡタンパク質が本発明の実行において利用され得ることを認める。一般に、ＨＢＨＡはマイココバクテリウム種または型に特定されるか由来する（すなわち、天然である）、例えば様々な型のウシ型結核菌またはヒト型結核菌、ここで記載されるようにそれが機能する限りどの源からも来るかもしれない。（例えば、少なくとも約１０〜約３００またはそれ以上（例えば、総タンパク量のｍｇあたりの一般に、約３０〜約１００のμｇのＨＢＨＡまでの範囲
で、約１５〜約２５０、または約２０〜約２００または約１５〜約２５０、または約１０〜約１００総タンパク量のｍｇあたりμｇ）。正確な量に関係なく、タンパク質の抗原性品質は維持される。すなわち、免疫反応を誘発する観点から、配列番号３によって見受けられる融合タンパク質のそれに、タンパク質の抗原性は相当する。

成長する細菌の培養菌の方法はタンパク質を生産するための周知の技術であり、そのことは取得する方法であり、そして、タンパク質を孤立させるかまたは精製することがこのように生み出される。本発明は融合タンパク質を適切なマイコバクテリウム細胞を導入させる（例えば電気穿孔法によって）ことによってここに記述されるようにする方法を含む。そして、生物の成長と生物によるタンパク質の生産にふさわしい培養条件の下で導入する細胞を発達させ、そして、タンパク質を取得し、精製する。例示的な状況と技術は、下記の例項で記述される。

いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム細胞にもたらされる核酸は、プラスミドのようなベクトルの中に含まる。しかし、他の導入可能であるか、または移動可能なベクトルが、本発明の実行において使用され得る。例えば様々なウイルス・ベクトル、他のエピソーム要素など。加えて、いくつかの実施形態では、関心の核酸配列は、マイコバクテリウムのゲノムに取り込まれ得る。

現在の本発明の実施で生成され、使用される融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、実質的に精製され、例えば、タンパク質の調製は一般に、（例えば、少なくとも８０、９０、９５、または９９％またはそれ以上さえ）他のタンパク質を含まない。同様に、例えば核酸、脂質、および他の高分子のような他の細胞成分を含まない。本発明のｒＨＢＨＡは、ｒＨＢＨＡ生成のためのバイオソースとして使用し得る。そしてそのｒＨＢＨＡ生成は、他の目的でも使用し得る。１つの実施形態では、目的は、隔離され、実質的に精製された融合タンパク質の製剤を刺激している治療用免疫応答を生成することである。以下で議論する。

本発明の実施に使用される細菌性細胞は、ワクチン製剤における使用に適することの評価基準を満たすいずれかであり得る。例えば、それらは弱毒性である（すなわち、容量を引き起こす有毒または病気を縮小するか、または無毒または兆候を引き起こすことができないようにされるか、または当技術分野で理解されるような病気の軽度の症状だけを引き起こし、）抗生物質耐性を示さないものさえあり、抗原性である。いくつかの実施形態では、細胞はマイコバクテリウアの多様な種または異形である。（例えば、変異体または組換え型の）ヒト結核菌、ウシ型結核菌、スメグマ菌、または他のマイコバクテリアなどである。いくつかの実施形態では、細菌性細胞は、ウシ型結核菌ＢＣＧ、そして／または、その様々な型であり、例えば、特定の特性のため選択された変異体ＢＣＧｓ、または遺伝子操作される組換え型のＢＣＧｓである。例えば、例示の組換え型ＢＣＧｓは米国特許で記載される：第７，６２５，５７２号：第７，６６６，６５６号：第７，８２９，１０４号：および第８，０４３，８５７号（すべてＳｕｎ ｅｔ ａｌ．）。それぞれの完全な内容はこの参照により開示に含まれる。例えば、ＢＣＧは、中性ｐＨで活性化されたエンドモリティックスタンパク質を含み、発現するために遺伝子操作され得る。（例えば、クロストリジウム属ウェルチ菌からのペルフリンゴリシンＯ）また栄養要求性であって抗生物質耐性でない可能性がある。例えばロイシン、パントテン酸などの生成のための栄養素要求株、またはロイシンパントテン酸栄養要求変異株などの二重栄養要求変異株がある。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム細胞は、ｐｆｏ遺伝子を発現する。例示的なｐｆｏ遺伝子は、クロストリジウム属ウェルチ菌などの細菌のものに含んでいるが、限定されていない。しかしながら、当業者はまた、本発明の実施で使用できる他の機能上同様のタンパク質が存在しており、それらの野生型形態か、またはそれらを適切にするために遺伝子を組換えられた後のどちらかであることを認める。そのようなエンドモリティッ
クスタンパク質の例は以下のものに含まれるが限定されない。リステリオリシン（リステリア・モノサイトゲネスによって生成される、Ｌｌｏ）、ニューモリシン（肺炎レンサ球菌によって生成される）、連鎖球菌溶血素Ｏ（化膿レンサ球菌によって生成される）、セレオリジン（セレウス菌によって生成される）、α‐溶血毒（黄色ブドウ球菌によって生成される）など。１つの実施形態では、使用される細胞は、本明細書に”ＡＥＲＡＳ−４１３”として参照される、クロストリジウム属ウェルチ菌ｐｆｏの遺伝子を発現するＢＣＧデンマークＳＳＩ型パントテン酸栄養要求変異株である。しかしながら、当業者は、例えばそのすべての開示内容が参照によって援用される、米国特許第７，６６６，６５６号に記載され得る他のマイコバクテリア型、例えば、他のＢＣＧ型、例えばｐｆｏの遺伝子のないＢＣＧ ＳＳＩ、Ｔｉｃｅ、Ｔｏｋｙｏなどが使用され得ると認める。

本発明の融合タンパク質の抗原的活性型はメチル化される。一般に、メチル化はｒＭｙｃ細胞の近くと、内部で実行される。いくつかの実施形態では、細胞は活性メチル基転転移酵素を生成するための天然の、および本質的な能力を持っている。しかしながら、いくつかの実施形態では、細胞が追加メチル基転移酵素を発現しながら核酸配列を含むようにさらに修正し、または天然のメチル基転移酵素のより高レベルを生成するようさらに修正できる。

また、本発明はヒト型結核に対して免疫反応を誘導する、そして／または、結核に対して個人に予防接種することにおける使用のための組成物を提供する。１つの実施形態では、組成物は１つの作用剤として、１つまたは複数のｒＭｙｃ種また型および薬理学的に適切な媒体を含む。１つの実施形態では、組成物は１つの作用剤として、本明細書で記載される１つまたは複数の実質上精製された融合タンパク質および薬理学的に適切な媒体を含む。ワクチンとしての用途であるこれら組成物の調製は、当業者にとって既知の技術である。一般にそのような組成物は、液体溶液または懸濁液として調製されるが、タブレット、錠剤、粉やおよび同様のものなどの固形物もまた考慮される。投与の前に溶液として適切な固形物または懸濁液、液体も調製され得る。本調製はまた乳化され得る。有効成分は、有効成分が薬学的に許容でき互換性がある医薬品添加物に混ぜられ得る。適切な医薬品添加物は、例えば、水、生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールおよびそれらと同様のもの、またはそれらの組み合わせである。さらに、組成物は少量の補助物質、例えば、薬剤を濡らすか、乳状にすること、ｐＨバッファ薬剤および同様のものを含み得る。さらに、組成物は様々な薬剤（抗原または免疫抗原に対する液性のおよび／または細胞免疫反応を引き起こすか、または増加させることができる化合物）を含み得る。経口剤型の組成物の投与を望むならば、様々な増粘剤、調味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤および同種のものを追加し得る。現在の本発明の組成物は、投与に適切な形態に組成物を生成するために、そのようなどんな追加成分をも含み得る。該処方での作用剤の最終的な分量は変化し得る。しかし一般に、該処方での分量は約１〜９９％である。有利な点として、本発明の免疫原組成物は以下のものを含む。投与ごとに、融合タンパク質の約０．１〜５０μｇ、および一般的に約１〜５０μｇ、例えば、精製されたＨＢＨＡ融合タンパク質の１５μｇ。生成物の組成物生きたままの細菌（例えば弱毒化された細菌）を含む場合、投与ことの最近の分量は一般的に約１ｘ１０^５からｌｘ１０^７の範囲であり、通常１ｘ１０^６である。

本発明の組成物（調製、製剤）は、当業者にとって既知の技術である、多くの適切な方法のいずれでも投与され得る。それらの方法は注射で、皮内、吸入、口腔、膣内、鼻腔内、点眼液、スプレー等として作用剤を含む食物またはプロバイオティクス製品の摂取を含むが限定されない。いくつかの実施形態では，投与の様式は注射または皮下によるものである。さらに、免疫システムを高める物質や、様々な化学療法薬や、他の抗原剤や、様々な補助剤や、および同様のものなど他の治療法に関連して組成物を投与し得る。

また、本発明は必要に応じて被験者で免疫反応を誘導する方法を提供する。本方法は、１つの実施形態で、本発明の融合タンパク質を含む組成物の投与、および他の実施形態では、本発明のｒＭｙｃの投与を含む。誘発される免疫反応は、先天的および適応型の１つまたは両方であり得、細胞媒介および液性応答の両方を含み得る、例えば抗体の生成、および／またはＢ細胞、および／または、Ｔ細胞応答など。ワクチンの受容者は、Ｍｔｂのその後の攻撃に対して保護されるので、応答は保護的であり得る。その結果、活発であるか潜在している、結核感染の進行を防ぐ。さらに、結核感染症が起こった後、本発明の組成物が投与される場合、免疫反応は潜伏感染が起こらない可能性があり、または、潜伏感染がすでに存在する場合、進行中の病気への潜伏感染の再開は妨げられるか、または、感染の範囲または深刻さが減少する可能性がある。

本発明はまた、本発明の融合タンパク質を活用する診断検査を提供する。特に、検査は潜在的結核感染を有す個人を識別するのに有効である。検査は一般に含む潜在性結核（例えば、病気の露見、またはその他の理由）を有する可能性があるものとして、免疫細胞の露見または識別する被験者の免疫細胞の生成、タンパク質および免疫細胞または生成物が融合タンパク質をそれについて反応するか、または認識するかどうか決定することを含む。１つの実施形態では、露出が、対象から生体試料を入手することによって実行される。（例えば、唾液、痰、血液、プラズマなど）そして例えば、サンプルでの反ＨＢＨＡ抗体の存在を検出するためにサンプルを融合タンパク質に露出する。別の実施形態では、融合タンパク質は皮下注射され、（マントーや他の類似の検査方法で）タンパク質に対する皮膚の反応が観察される。両方の実施形態で、検査の陽性反応は、対象が潜伏結核感染の可能性があるか、またはそうであるらしいということを示しまたは確認する。

いくつかの実施形態では、本発明はシードロットとしての使用のために本発明のｒＭｙｃの培養を生成するための方法を提供する。特に、ｒＭｙｃの定量生成、精製および検査を含む方法が包含される。一般に、そのような方法は、最初のクローンの分離株の生産を進めること、血清と動物性起源タンパク質を含まない媒体の適度の規模で分離株を育てること、そして、望ましいより大きな量（十分な量が達成されるまで、必要に応じてこのことを繰り返す）の培養に接種をすること、そしてｒＭｙｃが成長し、細胞分裂を経ることができる条件下でｒＭｙｃ培養が成長することを含む。一般に、ｒＭｙｃは約４〜約６、例えば、約５の密度（Ａ_６００）まで育てられる。一定分量の培養は、例えば、商業目的で、培養から直接、またはｒＭｙｃを濃縮し（例えば、遠心分離）、適当な媒体でペレットを再懸濁させるために調製される。最終の培養シードロットの細菌の量は、一般に、約４ｘ１０^７〜約６ｘ１０^７の幅である。当業者は例えば、冷凍保存、凍結乾燥などの培養の長期保守に詳しい。最終的な調製とｒＭｙｃ培養組織の保管の前に、ｒＭｙｃ識別と純度は、当業者にとって既知の方法、例えば、培養のサンプリング、融合タンパク質をコードする核酸の存在のために、または、融合タンパク質自体の存在のために、それを分析することによって検査／確認され得る。

別の実施形態では、本発明は組換え型ヘパリン結合性赤血球凝集素（ｒＨＢＨＡ）タンパク質生成の方法を提供する。本方法は、以下のことを含む。ａ）マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質アミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含む組換え型マイコバクテリアの培養菌を育てること。融合配列がプロモーターに操作可能に結合されており、培養からｒＨＢＨＡタンパク質を取得すること。マイコバクテリアは、核酸融合配列を含み発現するために遺伝子組換えされてきた。培養の成長はどんな適切な方法でも実行され得る、例えば振とう培養、発酵によって、など、そして培養は例えば、バッチまたは連続培養であり得る。

本生成方法は、一般にｒＨＢＨＡタンパク質を精製することも含む。タンパク質の精製は、当業者にとって既知の多くの適切な技術によって実行され得る。一般的に、本技術は
、１つまたは複数の物理化学的な精製技術の使用を含む。例示的な技術が含まれるが限定されない。イオン交換クロマトグラフィー、親近感クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術、ならびに高圧細胞破壊のようないろいろな細胞破壊技術、ビーズ破砕機、均質化、超音波処理、遠心分離、などがある。これらのおよび他の技術の併用がまた使用され得る。

また、本方法はｒＨＢＨＡタンパク質の識別の証明をすることを含み得る。当業者は、タンパク質およびポリペプチドの識別および／または純度を実証するための適切な技術に詳しい。例示的な技術が含まれるが限定されない。電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、アミノ酸配列などである。

本方法はまた精製されたｒＨＢＨＡ融合タンパク質を生理学的に許容可能な担体と結合する方法を含み得る。適切な生理的に許容可能な、または互換性を持つ担体は、本明細書の別の場所で記述される。いくつかの実施形態では、製剤化されたＨＢＨＡタンパク質生成はさらに１つまたは複数の作用剤を含む。例えば、１つまたは複数の、ＨＢＨＡではない抗原（例えば、非ＨＢＨＡ抗原）が含まれ得る。例示的な追加の抗原が含まれるが限定されない。例えば、ジフテリア、百日咳、破傷風、ポリオ、インフルエンザ、肝炎、ロタウイルス、肺炎、はしか、おたふく風邪、風疹、水痘、髄膜炎、乳頭腫ウイルスなどのように病気に対する免疫応答を誘発するものである。ｒＨＢＨＡタンパク質生成は、１つまたは複数の抗原性補強剤および１つまたは複数の免疫原性補強剤を含み得る。それらの例は含むが限定されない。ミネラル塩、例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、油乳剤、例えば、ＭＦ５９、洗剤安定する水中油型乳剤、粒子状アジュバント、例えば、ビロソーム、イスコム（サポニンと脂質の体系化された複合体）、微生物派生体、例えば、ＭＰＬ（ＴＭ）（一リン酸化脂質Ａ）、ＣｐＧのモチーフ、変更された毒素、その他，いろいろな植物派生体、例えば、サポニン（ＱＳ−２１）ならびに内在性免疫賦活性アジュバント，例えば、サイトカイン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）とその断片などがある。

前述の例はさらに本発明の特定の実施形態を例示するのに役立つが、どんな形であれ本発明を制限することと解釈されるべきではない。

複製、過剰発現およびＢＣＧのヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）の検査
これらの研究の目的は、組換え型ウシ型結核菌型過剰発現ＨＢＨＡを開発するためである。以前Ａｅｒａｓ（ＡＥＲＡＳ−４１３）で構築された組換え型ＢＣＧ型が使用された。なぜならそれがｐａｎＣＤ栄養要求体であり、ＨＢＨＡ遺伝子によるプラスミド上のｐａｎＣＤの存在が遺伝子が抗生抵抗がない場合相補性とコロニー選択のために使用されたためである。

ＢＣＧ型
カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）で補充されたＬＢで生育されたエシュリキア属大腸菌ｓｔｂｌ３細胞で初期の複製は獲得された。ＨＢＨＡの過剰発現では、エンドソーム逃避機制を通して抗原提示を容易にするクロストリジウム属ウェルチ菌（ＡＥＲＡＳ−４１３）からｐｆｏの遺伝子を発現するＢＣＧデンマークＳＳＩ型のパントテン酸栄養要求変異株は利用された。（１）ＢＣＧ型はミドルブロック７Ｈ９ブロスで育てられて、グリセロール、ＯＡＤＣ、およびＤ−パントテン酸（２５μｇ／ｍｌ）を補充された。親および組換え型ＢＣＧはパントテン酸補足の有無にかかわらず７Ｈ１０−ＯＡＤＣプレートでそれぞれ蒔かれた。

設計および複製方策
ＨＢＨＡ遺伝子のためのＭｔｂ配列は、結核研究者のウェブサイトから取られて、Ａｇ８５Ｂプロモーターとリーダーペプチドと伴って開始ＨＢＨＡコドン（図１および２）の正面で合成された（ＤＮＡ２．０）。

合成断片は、カナマイシン耐性マーカー（ａｐｈ）およびｐａｎＣＯ遺伝子がｈｓｐ６０プロモーター（図３）を通して操作した補足となる、大腸菌マイコバクテリアルシャトルベクターであるｐＫＡＭＣＢ２ベクトルのＰａｃＩとＳｐｅＩとの間の場所で、複製された。この核外遺伝子はＡＥＲＡＳ−４１３でｐａｎＣＤ栄養要求性の補足となり、また、ＡＥＲＡＳ−４１３で核外遺伝子の安定性を維持できるように使用された。一度複製されると、抗生物質のマーカーはＨｐａＩ酵素で外へ消化され、構造は、それを「抗生物質抵抗性マーカーがない」状態に自己連結された（図４）。自己連結された構造物はＡＥＲＡＳ−４１３に電気穿孔された、回復しているコロニーはパントテン酸補足や抗生物質なしで７Ｈ１０−プレートに蒔かれた。コリニーは抗原の存在、核外遺伝子骨格、およびカナマイシン抗生物質耐性マーカーの欠如のため検査された。

天然および組換えＨＢＨＡのアミノ酸比較
天然のＨＢＨＡはＢＣＧとＭｔｂの両方で１００％配列識別を持つ。組換え型のＨＢＨＡは、タンパク質のＮ−末端と融合したＡｇ８５ＢプロモーターおよびＡｇ８５Ｂリーダーペプチドを使用することで発現される（図５）。

ＡＥＲＡＳ−４１３からのコロニーの遺伝子型分析
ＨＢＨＡの遺伝子を含み、ｐＫＡＭＣＢ２派生体で形質転換されたＡＥＲＡＳ−４１３プレートからのコロニーは、核外遺伝子での完全な長さのＡｇ８５Ｂ−ＨＢＨＡ構造物の存在のために検査された。このＰＣＲに使用される開始剤は、Ａｇ−ＨＢＨＡ．ｆｏｒ：ＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＴＣ（配列番号６）およびＡｇ−ＨＢＨＡ．ｒｅｖ：ＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ（配列番号７）であって、コロニー５番（図６）で見られる２．６ｋｂの生成サイズは予想された。同じコロニーは、ｏｒｉＭからｐａｎＣＤまで補完遺伝子にわたる核外遺伝子骨格の存在、および抗生物質耐性マーカーの欠如のため検査された。核外遺伝子骨格のために使用される開始剤はｏｒｉＭ７９３２．ｆｏｒ ＧＴＣＴＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＣＡＧ（配列番号８）およびｐａｎ９９６９．ｒｅｖ ＴＡＴＣＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧ（配列番号９）であった。核外遺伝子でカナマイシン抗生物質マーカーをチェックするために使用される開始剤は、ｋａｎ＿ｉｎｔｒｎｌ．ｆｏｒ ＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣ（配列番号１０）およびｋａｎ＿ｉｎｔｒｎｌ．ｒｅｖ ＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧ（配列番号１１）であった。コロニー５番は核外遺伝子骨格の存在、および抗生物質マーカーをより少なくする骨格からのカナマイシン遺伝子の欠如を示す。ＨＢＨＡを過剰発現する組換え型のＡＥＲＡＳ−４１３型は、ＡＥＲＡＳ−４４５と命名されて、さらなる表現型分析および拡大製造に使用された。（図６）

ＡＥＲＡＳ−４４５の発育動態
上記記述の条件下で生育されたＡＥＲＡＳ−４４５は、ＡＥＲＡＳ−４０１と同様に親株ＡＥＲＡＳ−４１３のものに同様の成長パターンを持っていることが認められた。種培養は０．２のＯＤ_６００に希釈され、吸収は、成長パターンを観測するために９日間以上測定された。ＡＥＲＡＳ−４４５のための成長パターンは、過剰発現されたＨＢＨＡタンパク質が成長機構（図７）に少しの有害な影響も持っていなかったことを示す親株のものと非常に近似していた。

ＡＥＲＡＳ−４１３からのコロニーの表現型分析
培養は無タンパク質の７Ｈ９メディアでＯＤ_６００＝１．０に生育された。培養は上澄とペレットを分離するために１０分間３，０００ｒｐｍで回転された。細胞可溶化物のた
めのペレットを処理するため、ペレットはプロテアーゼ阻害剤カクテルバッファで再懸濁され、次に、細胞を破壊するためにビーズ破砕で処置された。可溶化物は、破片を取り除くために４度で３，０００ｘｇに遠心分離された。細胞可溶化物蛋白濃度はＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析で測定された。サンプルの正常化は、等しい量のタンパク質、３０マイクログラムの負荷によって、実施された。サンプルは、１５分間７０度で還元剤と積載染料で熱することによって、調製された。次に、サンプルはポリアクリルアミドゲルに勾配に（４〜１２％ビス・トリス）搭載され、ＭＯＰＳバッファで動作する。移動は６分間のｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライブロッティングシステムを使用し実行された。ウエスタンブロット解析はＳｎａｐ ｉ．ｄ．システム（ミリポア）を使用し実行された。使用される主要な抗体は、反ＨＢＨＡモノクローナル４０５７Ｄ２（２）（１：２０００）が、またはヤギ反マウスＨＲＰ二次抗体（ＫＰＬ）の使用が後に続いた１Ｇ１０（１：１０００）反ＨＢＨＡ抗体のどちらかであった。発見は、ＨＲＰ化学発光（Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ、バイオ・ラッド）によって実行される。

図８では、矢印１はＡＥＲＡＳ−４４５の組換え型のＨＢＨＡおよび制御親株ＡＥＲＡＳ−４１３の欠如を示し、矢印２は制御ＡＥＲＡＳ−４１３および組換え型のＡＥＲＡＳ−４４５の両方の現在の天然のＨＢＨＡを示す。４０５７Ｄ２モノクローナル抗体は、ＨＢＨＡタンパク質のメチル化された部分を認識し、ＡＥＲＡＳ−４４５で生成された組換え型ＨＢＨＡが、メチル化されることを示した。ウエスタンブロット手順は、リールパスツール研究所、フランスで開発されたモノクローナル抗体１Ｇ１０で反復された。ＡＥＲＡＳ−４０１およびＡＥＲＡＳ−４１３は、このブロットの制御として使用された。矢印１はＡＥＲＡＳ−４４５の組換え型のＨＢＨＡの存在、および制御親株ＡＥＲＡＳ−４０１およびＡＥＲＡＳ−４１３の欠如を示し、矢印２は天然のＨＢＨＡが、制御および組換え型の両方に存在していることを示す。４０５７Ｄ２抗体とは異なり、１Ｇ１０はＨＢＨＡタンパク質（図９）の非メチル化された領域の中で特定のエピトープを認識する。

ＡＥＲＡＳ−４４５型からのＨＢＨＡのｃＧＭＰ製造
動物性タンパク質濃縮の段階的な縮小で、組換え型のＢＣＧ（ｒＢＣＧ）は、血清と動物起源タンパク質を持っていないメディアで成長するように適合させられた。最終生成物は、接種、例えば、ｃＧＭＰマスター・セル・バンク生成に使用できる液体窒素の気相で保存されたバイアルあたり４．５±０．４ｍｌの濃縮化された継承細胞バンクである。

血清および動物起源のタンパク質が含まれていない媒体で成長するためｒＢＣＧを適合させるために、ＡＣＢ確立の間の培養基におけるオレイン酸アルブミンブドウ糖カタラーゼ（ＯＡＤＣ）補給物の使用は禁止された。表１は血清の動物起源のタンパク質が含まれていない媒体に変換する過程を要約する。ＡＣＢ構造に使用される媒体は、ＯＡＤＣまたはいかなる他の血清または動物派生補給物のない、変更されたミドルブルック７Ｈ９媒体（ＭＭ７Ｈ９）であった。最初の段階の培養は、バッフルなしで５００ｍＬのガス抜きキャップフラスコで生育された。最初の段階の後のすべての培養はバッフル付振とうフラスコで生育された。

培養物が最終的な継代培養に達した後に、それは、回収／回復された。培養物は６±４℃で３０分間１２００ｘｇで遠心分離され、１０％で再懸濁しているＧＳＴ溶液は、室温で１／４の原体積を保存した（表１）。そして、培養は４．０±０．５ｍｌの一定分量で５ｍｌの無菌クライオバイアルに分配された。バイアルは、液体窒素の上に気相に保存されました。

冷凍後のＡＥＲＡＳ−４４５の２個のバイアルが無菌状態かどうか検査された。どんな成長汚染物質に対しても、結果は陰性であった。４倍濃縮ＡＥＲＡＳ−４４５ｒＢＣＧを入れてあるバイアルは、気相液体窒素で凍っていた。図１０に示されるように、反ＨＢＨＡモノクローナル抗体１Ｇ１０を有するウエスタンブロットはＡＥＲＡＳ−４４５の凍っている培養の細胞可溶化物から目標抗原（ＨＢＨＡ）の生成を示している。

ＡＥＲＡＳ４４５の継承細胞バンク開発のための手順
１．成長媒体および冷凍媒体を調製する。
ａ．１．培養基および冷凍媒体を用意する。
４．７ｇ／Ｌ ミドルブロック７Ｈ９パウダー
０．２４％（ｖ／ｖ） グリセロール
０．０５％（ｗ／ｖ） チロキサポール
１０％（ｖ／ｖ） ＯＡＤＣ補給物
ｂ．変更されたミドルブルック７Ｈ９
４．７ｇ／Ｌ ミドルブロック７Ｈ９パウダー
２．０ｇ／Ｌ グルタミン酸ナトリウム
２％（ｖ／ｖ） グリセロール
３ｍｇ／Ｌ 硫酸亜鉛七水和物
０．２ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物
０．０５％（ｖ／ｖ） チロキサポール
１．０％（ｗ／ｖ） ブドウ糖
０％ ＯＡＤＣ補給物
ｃ．１０％ ＧＳＴ溶液
１０％（ｖ／ｖ） グリセロール
０．８５％（ｗ／ｖ） 塩化ナトリウム
０．０５％（ｖ／ｖ） チロキサポール

２．Ｋａｍａｌ Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）からの５ｍｌの生きたＡＥＲＡＳ−４４５培養物を、ＯＡＤＣなしで変更されたミドルブルック７Ｈ９媒体を含む９５ｍｌの予熱された培養物を含む５００ｍｌの振とうフラスコに接種した。

３．残りのプロセスには、変更されたミドルブルック７Ｈ９媒体が使用された。

４．培養物を振とう機／細菌培養器（Ａｅｒａｓ＃１２３０）中で、３７℃および１２５ｒｐｍでインキュベートした。

５．吸光度を、培養物が濁度における可視変化を有したときに、６００ｎｍで測定した。

６．培養物が一旦Ａ_６００＝４．０±１．５Ａｕに達すると、全体の段階１培養物（約９０ｍｌ）とともに、第２段階（ガス抜きキャップを備える振とうフラスコ２Ｌ中、９００ｍｌの作業容量）に接種した。

７．培養物を振とう機／細菌培養器（Ａｅｒａｓ＃１２３０）中で、３７℃および１２５ｒｐｍでインキュベートした。

８．吸光度を、培養物が濁度における可視変化を有したときに、６００ｎｍで測定した。

９．培養物が一旦Ａ_６００＝３．０±１．５Ａｕに達すると、１５０ｍｌの段階２培養物とともに、段階３（ＯＡＤＣなしの８５０ｍｌのＭＭ７Ｈ９媒体）に接種した。合計３個ｘ２Ｌの振とうフラスコ（作業容量１Ｌ／フラスコ）が接種された。

１０．培養物を振とう機／細菌培養器で、３７℃および１２５ｒｐｍでインキュベートした。

１１．吸光度を、培養物が濁度における可視変化を有したときに、６００ｎｍで測定した。

１２．培養物（段階３）が一旦Α_６００＝４±１．５Ａｕに達すると、平均Ａ_６００の読み取り値を有するフラスコを選択して、回収プロセスを開始した。

１３．選択された段階３培養物を、事前に加圧滅菌された１Ｌ遠心分離機チューブ内で、３０分間１２００ｘｇおよび４℃で遠心分離した。

１４．上澄は廃棄し、ペレットを１０％ＧＳＴの１／４容量（約２５０ｍＬ）中に再懸濁させた。

１５．混合を維持しながら、５ｍｌのクライオバイアルは４．０±０．５ｍｌの再懸濁細胞で充填した。

充填されたバイアルを、液体窒素の気相中で直ちに凍結させた。

例２ＡＥＲＡＳ−４４５からのｒＨＢＨＡ精製および機能分析
ＡＥＲＡＳ−４４５のＨＢＨＡタンパク質の収量に関する推定
ＡＥＲＡＳ−４４５に生成されたＨＢＨＡの分量は、リールパスツール研究所、フランスで開発されたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により推定された。主要な反ＨＢＨＡ抗体は１Ｇ１０であり、二次モノクローナル抗体は、ビオチン化された５Ｆ２であり、リールパスツール研究所、フランス（ＥＺ−リンク スルホン基−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）で開発された。要するに、コーティングバッファで希釈された５μｇ／ｍｌのｍ
Ａｂ １Ｇ１０の保護管あたりの１００μｌは高親和性結合のＥＬＩＳＡプレートに種を蒔かれて、一晩、４℃で培養された。プレートは二度洗浄され、１時間ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（＋１％ＢＳＡ）で遮断された。組換え型および天然のＨＢＨＡが１Ｘ ＰＢＳ（８つの希釈）に希釈されて、１００μｌは各保護管に加えられて、２時間培養された。１Ｘ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後に、０．２μｇ／ミリリットルの濃縮で、ｍＡｂ ５Ｆ２の１００μｌは加えられて、１時間培養された。保護管は３回洗浄され、１００μｌ ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤバイオサイエンス）結合体はＰＢＳで１／１０００の濃縮で加えられ、３０分間室温で培養された。タンパク質は、ＴＭＢ下層（ＥＬＩＳＡ過酸化物下層）の１００μｌで検出され、室温で５分から１５分間展開された。反応は３Ｍ Ｈ３ＰＯ４の５０μｌで停止され、光学密度は４５０ｎｍで読み込まれた。この結果から、ＡＥＲＡＳ−４４５は親型（図１１）と比較して、ＨＢＨＡよりもほとんど８倍以上で発現した。

また、ウシ型結核菌ＢＣＧパスツール１１７３Ｐ２からのＨＢＨＡの収量はＡＥＲＡＳ４４５と比較された。６００ｎｍで読む光学密度が約１．５に達するまで、ＢＣＧ型は１０日間の１リットルのフラスコに入った２００ｍｌの撹拌されたソートン培地で生育された。ＢＣＧ細胞は８，５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｊ２ＭＣ遠心分離機、ローターＪＡ１０）で遠心分離機によって回収された。ＢＣＧペレットは、次に、２０ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ８０（Ｔｗ ８０：Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ，ｒｅｆ． Ｐ８０７４）で懸濁し、２０分間、４℃で６，５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ，ｒｏｔｏｒ Ｆ０６５０）で遠心分離された。ペレットは下記記述のように２０ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で懸濁前に荷重され、熱失活され、そして超音波処理された。次に、上記記述のように、超音波処理物の上澄部はタンパク質含有量、およびモノクローナル抗体１Ｇ１０および５Ｆ２でサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用することによってＨＢＨＡ濃縮のために分析された。平均３〜４つの独立測定値は、ＢＣＧパスツール１１７３Ρ２が総タンパク量の約１０μｇのＨＢＨＡ ｍｇを生成するが、ＡＥＲＡＳ４４５が総タンパク量の平均約１９μｇのＨＢＨＡ／ｍｇを生成することを示した。このＡＥＲＡＳ４４５はおよそＢＣＧパスツール１１７３Ｐ２の２倍のＨＢＨＡを生成する。

ＡＥＲＡＳ４４５からのｒＨＢＨＡの精製
ＡＥＲＡＳ４４５のペレットは、２０ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ８０（Ｔｗ ８０：Ｓｉｇｍａ Ｕｌｔｒａ，ｒｅｆ．Ｐ８０７４）で再懸濁され、２０分間、４℃で６，５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ，ｒｏｔｏｒ Ｆ０６５０）で遠心分離された。ペレットは２０ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で荷重および再懸濁され、２０分間、４℃で１２，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ，ｒｏｔｏｒ Ｆ０６５０）で遠心分離された。

１．５ｇの熱失活されたＡＥＲＡＳ４４５は１５ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で懸濁され、フラットディスラプターホーンを使用し（１３ｍｍ、ＶＷＲ ｒｅｆ．１４２−３７５１）、２０分間、アナログソニファイアーユニットモデルＳ−４５０Ａ（ブランソン社、米国）で、氷の上で超音波処理された。超音波処理物は２０分間１万３５００ｘｇで遠心分離され、そして、表面に浮かぶのはＤＰＢＳで平衡化されたヘパリン・セファロースＣＬＢカラム（１×５ｃｍ）に適用された。次に、カラムは１００ｍｌのＤＰＢＳと共に洗浄され、結合物質は１００ｍｌＤＰＢＳで０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配によって溶出させられた。溶出している１ｍｌの断片は、ＳＤＳ−ページによって１２％のゲルを使用することで識別され、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０ 染色が後に続いた。

ＨＢＨＡを含む断片は、０，０５％のトリフルオロ酢酸で平衡化された逆相ＨＰＬＣ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ８カラム（ＴＳＫ ｇｅｌ ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ；Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）に、貯蔵され、適用された。０〜８０％の直線的なアセトニトリル勾配に従って、結合物質は溶出した。ＨＢＨＡを含む断片は貯蔵された、そして、溶媒は蒸発で除去された。１ｍｌの最終的断片のｐＨは、１Ｍ−Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ９）を使用することによって、ｐＨ８に調整された。最終生成物は−８０℃で保存された。ＨＢＨＡを含む断片は、上記記述のように、ＳＤＳ−ページ、質量分析、およびサンドイッチＥＬＩＳＡによって、１Ｇ１０および５Ｆ２モノクローナル抗体を使用することで分析された。

図１２はＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡの質量分析を示している。質量分析のために、タンパク質（０．１〜１０ｐｍｏｌ）はｄｒｙ ｄｒｏｐｌｅｔ法で調製された。蛋白溶液（０．５μｌ）は１０ｍｇ／ｍｌで５０％ＣＨ３ＣＮおよび０．１％のトリフルオロ酢酸で新たに溶解しているα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸に混ぜられた。スポッティングと乾燥の後、質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、実行された。以下の設定パラメータが使用された：ポジティブで直線モード、２５ｋＶの加速電圧、９２％の格子電圧、７５０ｎｓの遅れた抽出時間、１，０００Ｄａの低いマス・ゲート。スペクトルは、大腸菌チオレドキシンの平均質量とホース・アポミオグロビン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に異なったペプチドの［Ｍ＋Ｈ＋］アイソトピックイオンを使用することによって、外部的に較正された。

ｒＨＢＨＡメチル化パターンの質量分析法
精製されたｒＨＢＨＡは一晩で５％のエンドプロテイナーゼ・グルコース（Ｒｏｃｈｅ）で消化され、そして、得られたペプチドは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａ ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳカラム（２ｘ２００ｍｍ）および０．１％のトリフルオロ酢酸で調製されて質量分析によって直接分析された０〜６０％の直線的なアセトニトリル溶離法勾配を使用することで逆相ＨＰＬＣによって分離された。

質量分析法では、ペプチド溶液は１０ｍｇ／ｍｌで５０％ＣＨ３ＣＮおよび０．１％のトリフルオロ酢酸で新たに溶解しているα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸に混ぜられた。スポッティングと乾燥の後、質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、実行された。３，０００Ｄａから１，０００Ｄａの間のペプチドのために、以下の設定パラメータが使用された：ポジティブで直線モード、２５ｋＶの加速電圧、９２％の格子電圧、７５０ｎｓの遅れた抽出時間、１，０００Ｄａの低いマス・ゲート。スペクトルは、大腸菌チオレドキシンの平均質量とホース・アポミオグロビン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に異なったペプチドの［Ｍ＋Ｈ＋］アイソトピックイオンを使用することによって、外部的に較正された。

ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡの質量分析の結果は、図１３に表されており、タンパク質のＣ−末端側終端が異種性を示しており、ＨＢＨＡのために予想される複雑なメチル化プロフィールと一致している。

モノクローナル抗体４０５７Ｄ２および３９２１Ｅ４とのＨＢＨＡの異なった形式の反応
ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡの濃縮は、一晩でＥＬＩＳＡプレートの保護管あたり４℃１μｇをコーティングするように測定されて、調整された。そして、プレートはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で洗浄された。その後に３％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳＴで室温で２時間のブロッキングが続いた。再びＰＢＳＴで３回洗浄した後に、プレートは室温で１時間３０分間ＰＢＳＴ＋ＢＳＡでモノクローナル抗体３９２１Ｅ４または４０５７Ｄ２の連続の４倍の希釈で培養された。後者の２
つは優先的にメチル化されたフォームのＨＢＨＡ（３）を認識する。プレートは、次に、ＰＢＳＴで１０回洗浄して、室温で反マウス抗体がペルオキシダーゼ類にリンクされる状態で１時間、培養された。ＢＰＳＴで１０回の洗浄後に、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢの１００μｌは各保護管に加えられた、そして、色の反応は５０μｌ Ｈ３ＰＯ４の添加で停止された。最終的に４５０ｎｍの吸収性は、各井戸で標準の酵素結合免疫吸着検定法プレートリーダーを使用することで読み込まれた。図１４は、それが適切にメチル化されると確認して、ＡＥＲＡＳ４４５からのｒＨＢＨＡが４０５７Ｄ２および４Ｅの３９２１モノクローナル抗体の両方によって認識されるのを示している。

潜伏感染したヒトのＡＥＲＡＳ４４５からのｒＨＢＨＡの抗原性
ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡを、３人の潜伏感染ヒト被験者、３人の進行中の結核患者、および３人の陰性の対照被験者から分離された１０^６の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに、２μｇ／ｍｌでインキュベートした。９６時間後、上澄に遊離したＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、非刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ分泌を、抗原によって誘発されたＩＦＮ−γ分泌から引いた。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの感度は１０ｐｇ／ｍｌであった。非感染対照とＬＴＢＩ被験者との間の最適識別のためのカットオフ値は、以前に、ＨＢＨＡ（４）について１００ｐｇ／ｍｌであることを決定されていた。表２に示されるように、ＡＥＲＡＳ４４５から精製されたｒＨＢＨＡは、潜伏感染した個人からのＰＢＭＣによって良好に認識され、肺結核患者からのＰＢＭＣによって不十分に認識され、健康な対照からのＰＢＭＣによっては認識されなかった。
表２ＨＢＨＡのヒトＴセル抗原性。９人のヒト被験者（３人の潜伏感染被験者番号１、８、および９、３人の進行中の結核患者番号２、３、および４、ならびに３人の陰性の対照番号５、６、および７）からのＰＢＭＣを、ウシ型結核菌ＢＣＧパスツール１１７３Ｐ３（ＩＰＬ）またはＡＥＲＡＳ４４５（Ａｅｒａｓ）からの２μｇ／ｍｌのＨＢＨＡとともにインキュベートし、得られたＩＦＮ−ｇ濃度を培養上澄中で測定し、ｎｇ／ｍｌとして表した。

参考文献
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Ｖｅｒｔｕｃｃｉｏ Ｃ， Ｓｅｃｈｉ ＬＡ， Ｆａｄｄａ Ｇ． Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ． Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５ Ｓｅｐ；１２（９）：１１３５−８

好適実施形態で本発明について説明したが、当業者は、追加された請求の趣旨と範囲の中に修正がある状態で本発明を実施できると認める。従って、本発明は、上で説明したように、実施形態に制限するべきでないが、本明細書に提供された説明の趣旨と範囲の中にさらにすべての修正とそれの同等物を含んでいるはずである。

Claims (46)

1. マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着した、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核の酸性融合配列を含み、前記融合配列が、プロモーターに操作可能に結合されるマイコバクテリウム。
2. 前記マイコバクテリウムがヒト型結核菌、ウシ型結核菌およびスメグマ菌を含む群から選択される、請求項１に記載のマイコバクテリウム。
3. 前記マイコバクテリウムが、ウシ型結核菌（カルメット・ゲラン桿菌）（ＢＣＧ）である、請求項１または請求項２に記載のマイコバクテリウム。
4. 前記ＢＣＧがデンマークＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（ＳＳＩ）型である、請求項３に記載のマイコバクテリウム。
5. 前記ＢＣＧ ＳＳＩ型がｐｆｏ遺伝子である、請求項４に記載のマイコバクテリウム。
6. 前記ｐｆｏ遺伝子がウェルシュ菌からのｐｆｏ遺伝子である、請求項５に記載のマイコバクテリウム。
7. 前記マイコバクテリウムが栄養要求体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイコバクテリウム。
8. 前記マイコバクテリウムがパントテン酸栄養要求体である、請求項７に記載のマイコバクテリウム。
9. 前記核酸融合配列が、配列番号１に少なくとも９０％相同するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイコバクテリウム。
10. 前記核酸融合配列によってコードされるポリペプチドが、配列番号３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のマイコバクテリウム。
11. 前記マイコバクテリウムＨＢＨＡタンパク質が、ヒト型結核菌ＨＢＨＡである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイコバクテリウム。
12. 前記プロモーターがマイコバクテリウムＡｇ８５Ｂプロモーターである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイコバクテリウム。
13. 配列番号１に少なくとも９０％相同するヌクレオチド配列を含む孤立した核酸分子。
14. マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着するＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む融合タンパク質。
15. 前記融合タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
16. 前記融合タンパク質がメチル化された、請求項１４または請求項１５に記載の融合タンパク質。
17. 融合タンパク質をコードする核酸配列をマイコバクテリウム細胞に導入することと、
    前記マイコバクテリウム細胞が前記融合タンパク質を生産させる状況下で、前記導入されたマイコバクテリウム細胞を成長させることとを含み、マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着するＡｇ８５Ｂリーダー配列を含むタンパク質を生産する、方法。
18. 前記融合タンパク質をさらに取得することを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記導入することが電気穿孔法で実行される、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
20. 前記患者にマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着するＡｇ８５Ｂリーダー配列を含む融合タンパク質への免疫反応性の欠如の存在を検知することであって、すなわちそこで、免疫反応性の存在が、前記被験者が潜在的な結核感染症があることを示す、検知することを含む、被験者が潜在的な結核感染症があるかどうかを決定する方法。
21. 前記検知することは、
    前記被験者から生体サンプルを採取することと、
    前記生体サンプルの中で、前記免疫反応性を検知することとを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記の生体サンプルが、痰サンプルまたは血清サンプルである、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
23. 前記検知することは、
    前記融合タンパク質で前記被験者を皮下注射することと、
    皮下注射の場所で前記免疫反応性を検知することとを含む、請求項２０から２２のうちのいずれかに記載の方法。
24. ヒト型結核菌に対して免疫反応を必要とする被験者において、それを誘発する方法であって、
    前記被験者に、マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着する、Ａｇ８５Ｂリーダー配列を含む融合タンパク質の前記被験者で免疫反応を誘発するのに十分な量の投与することを含む、方法。
25. 前記免疫反応が、１つまたは複数のＢ細胞、抗体およびＴ細胞の生成である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記免疫反応が保護免疫反応である、請求項２４に記載の方法。
27. ヒト型結核菌に対して免疫反応を必要とする被験者において、それを誘発する方法であって、
    前記被験者にマイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着する、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核酸融合配列を含むマイコバクテリウムを投与し、融合配列はプロモーターに操作可能に結合されており、前記マイコバクテリウムが前記被験者で免疫反応を誘発するのに十分な量で投与されることを含む、方法。
28. 前記免疫反応が抗体の生成である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記免疫反応が保護免疫反応である、請求項２７に記載の方法。
30. マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着する、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核の酸性融合配列を含み、前記融合配列が、プロモーターに操作可能に結合されるマイコバクテリウムの培養菌を育てることを含む、組換え型ヘパリン結合性赤血球凝集素（ｒＨＢＨＡ）タンパク質を生産する方法。
31. 前記ｒＨＢＨＡ融合タンパク質を前記培養菌からさらに取得することを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ｒＨＢＨＡタンパク質を取得することの後に、前記ｒＨＢＨＡタンパク質を精製する前記のことをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記精製が、細胞破壊とクロマトグラフィーの一方または両方によって実行される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ｒＨＢＨＡタンパク質の識別の証明をさらに含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記成長が振とうまたは発酵により培養において実行される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記成長が、バッチ培養または連続培養を使用することで実行される、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 組換え型マイコバクテリウムであって、マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着する、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核の酸性融合配列を含み、前記融合配列が、プロモーターに操作可能に結合される、組換え型マイコバクテリウムと、
    前記シードロットの保管の間、生きた状態で前記組換えマイコバクテリウムを維持することに適切な培養とを含む、組換えマイコバクテリウムのシードロット。
38. ヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質を含む組成物を調製する方法であって、
    マイコバクテリウムヘパリン結合性赤血球凝集素（ＨＢＨＡ）タンパク質またはその抗原性断片のアミノ末端に付着する、Ａｇ８５Ｂリーダー配列をコードしている核の酸性融合配列を含み、前記融合配列が、プロモーターに操作可能に結合されるマイコバクテリウムの培養菌を育てることと、
    前記ｒＨＢＨＡ融合タンパク質を前記培養菌からさらに取得することと、
    ｒＨＢＨＡ融合タンパク質を精製することと、
    前記精製されたｒＨＢＨＡ融合タンパク質を生理学的に許容可能な担体と結合することとを含む、方法。
39. 前記成長が振とう培養で発酵により実行される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記組成物に対して、ＨＢＨＡではない薬品、１つまたは複数の抗原性補強剤および１つまたは複数の免疫原性補強剤からなる群からさらに選択された１つ以上の薬剤を加える
    ことを含む、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
41. 前記抗原性断片が配列番号４の最後の３０から５０のカルボキシ末端アミノ酸の範囲内で含まれる、請求項１に記載のマイコバクテリウム。
42. 前記抗原性断片が配列番号５であるかまたは構成する、請求項４１に記載のマイコバクテリウム。
43. 前記抗原性断片が配列番号４の最後の３０〜５０のカルボキシ末端アミノ酸の範囲内で含まれる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
44. 前記抗原性断片が配列番号５であるかまたはそれを含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
45. 前記抗原性断片が配列番号４の最後の３０〜５０のカルボキシ末端アミノ酸の範囲内で含まれる、請求項２０、２４、２７、３０、３７または３８に記載の方法。
46. 前記抗原性断片が配列番号５であるかまたはそれを含む、請求項４５に記載の方法。