BRPI0719169A2

BRPI0719169A2 - Método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular, composição imunogênica, e, uso de uma ou mais proteínas de chlamydia, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codifocadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos

Info

Publication number: BRPI0719169A2
Application number: BRPI0719169-3A
Authority: BR
Inventors: Mark Alderson; Rhea Coler; Yves Lobet; Jean-Francois L Maisonneuve; Pascal Mettens; Peter Probst; Steven Reed
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa; Corixa Corp
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2014-02-04
Also published as: EA200900338A1; WO2008040757A1; EP2068916A1; MX2009003127A; KR20090077065A; JP2010505795A; AU2007304199A1; CA2664236A1; CN101522215A; US20100172927A1

Description

“MÉTODO PARA O TRATAMENTO OU A PREVENÇÃO DE INFECÇÃO OCULAR, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, USO DE UMA OU MAIS PROTEÍNAS DE CHLAMYDIA, SEUS FRAGMENTOS IMUNOGÊNICOS OU POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICADORES DE DITAS PROTEÍNAS OU DE DITOS FRAGMENTOS”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral ao tratamento ou à prevenção de infecção clamídica. Em particular, a invenção refere-se a um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis e aos aspectos relacionados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Chlamydiae são patógenos bacterianos intracelulares que são responsáveis por uma ampla variedade de importantes infecções humanas e animais.

Chlamydia trachomatis é transmitida entre seres humanos através de contato social e sexual. Há numerosos soro vares de Chlamydia trachomatis, e embora a identificação e a classificação de sorovares continuem a ser desenvolvidas, pelo menos 18 têm sido relatados até o presente. Sorovares AaC estão primariamente associados com tracoma ocular, sorovares DaK com doença oculogenital e sorovares Ll a L3 com linfogranuloma venéreo (LGV) (Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161). Contudo, tais associações de doença não são absolutas, por exemplo, sorovar B tem sido encontrado em isolados de trato genital (Caldwell, HB et al. J. Clin. Invest. 2003 111 (11): 1757-1769).

Chlamydia trachomatis é uma das causas mais comuns de doenças sexualmente transmitidas e pode levar à doença inflamatória pélvica (PID), resultando em obstrução tubária e infertilidade. Chlamydia trachomatis também desempenha um papel importante em infertilidade masculina. Em 1990, o custo de tratamento de PID nos E.U.A. foi estimado em 4 bilhões de dólares americanos. A Organização Mundial da Saúde estimou que em 1999 mais de 90 milhões de casos novos de Chlamydia trachomatis sexualmente transmitida ocorreriam em todo o mundo (Global Prevalence and Incidence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections, World Health 5 Organisation, Geneva, 2001). Ademais, doenças ulcerativas sexualmente transmitidas tal como infecção causada por Chlamydia trachomatis são um fator de risco maior para aquisição de HIV (Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161; Igietseme, JU et al. Expert Rev. Vaccines 2003 2(1):129-146).

Muitas vezes infecção causada por Chlamydia trachomatis é

assintomática e subclínica, de tal modo que complicações severas e freqüentemente irreversíveis podem estar presentes como os primeiros sintomas de infecção genital. Crianças nascidas de uma mãe com uma infecção genital causada por Chlamydia trachomatis podem desenvolver 15 pneumonia e Chlamydia trachomatis é considerada o agente causador mais comum de pneumonia durante os primeiros seis meses de vida (de Ia Maza, LM et al. Curr. Opin. Investig. Drugs 2002 3(7):980-986).

Tracoma, devido à infecção ocular com Chlamydia trachomatis, é a causa líder de cegueira evitável em todo o mundo e é 20 estimado em afetar 300-500 milhões de pessoas (West, SK Prog. Ret. Eye Res. 2004 23:381-401). Tratamento corrente envolve o uso de antibióticos tal como tetraciclina (diariamente, por um período de 4 a 6 semanas) ou azitromicina (dose única). Embora efetivo no combate da infecção, re- infecção geralmente ocorre devido à natureza endêmica da infecção. Infecção 25 repetida durante muitos anos leva à cicatrização da pálpebra, distorção da margem da pálpebra e fricção dos cílios do olho contra a cómea (triquiase). Trauma constante na cómea é tanto doloroso quanto acarreta opacidade comeana e cegueira (Mabey, DCW et al. The Lancet 2003 362:223-229).

Tem sido mostrado que indivíduos que têm sido expostos a Chlamydia trachomatis desenvolvem algum grau de imunidade natural à re- infecção, pelo menos no caso do mesmo sorovar (Katz, BP et al. Sex. Transm. Dis. 1987 14:160-164), embora a extensão da proteção possa depender do tempo decorrido desde que a infecção anterior ocorreu. Tem sido mostrado 5 que idade é importante na duração da infecção, com indivíduos mais velhos demonstrando uma duração mais curta de infecção por Chlamydia trachomatis ocular (Bailey, R et al. Epidemiol. Infect. 1999 123:479-486), de novo sugerindo a existência de proteção imunológica adaptativa. Tem sido sugerido que o uso de antibióticos pode de fato impedir o desenvolvimento de 10 imunidade natural a Chlamydia trachomatis (Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161; Atik, B et al. J.A.M.A. 2006 296(12): 1488-1497).

Infecção causada por Chlamydia trachomatis portanto constitui um problema de saúde significativo em países tanto desenvolvidos quanto em desenvolvimento. A luz das preocupações de saúde pública, e o 15 fato de que o custo de tratamento corrente é excessivo em muitos países desenvolvidos, o desenvolvimento de vacinas para espécie Chlamydia tem sido um alvo de pesquisa importante. Como a composição genômica de Chlamydia trachomatis é relativamente estável, e porque a presença de reservatórios animais é insignificante, até mesmo vacinas com eficácia 20 limitada podem ter um impacto significativo sobre a prevalência de infecções.

A proteína de membrana externa maior (Momp) constitui aproximadamente 60% da massa de proteína da membrana externa bacteriana e é crida em ser importante na determinação de especificidade de sorotipo. A seqüência de aminoácidos contém quatro regiões que estão externamente 25 expostas e nas quais ocorre a maioria das variações de seqüência. De ca. 400 aminoácidos na seqüência de Momp, até 70 aminoácidos diferem entre Momp de sorovares diferentes. Particularmente surpreendente é a descoberta de que

o agrupamento de sorovares baseado em identidade de seqüência de aminoácidos não corresponde ao agrupamento de sorovares baseado nos estados de doença associados (i.e. ocular, oculogenital e LGV) (Stothard, DR et al. Infect. Immun. 1998 66(8):3618-3625). Similarmente, comparações de identidade de seqüência de nucleotídeos para o gene ompA que codifica Momp não correspondem aos estados de doença (Meijer, A et al. J. Bateriol.

5 1999 181(15):4469-4475; Lysen, M et al. J. Clin. Microbiol. 2004 42(4): 1641-1647). Anticorpos monoclonais para Momp são efetivos em cultura e em alguns modelos animais, contudo, proteção pode ser limitada e é geralmente específica para sorovar.

Camundongos imunizados subcutaneamente ou oralmente com um anticorpo monoclonal anti-idiotípico ao antígeno exoglicolipídeo desenvolveram uma resposta protetora ao sorovar C, embora permanecessem suscetíveis ao desafio com sorovar K (Whittum-Hudson, JA et al. Nat. Med. 1996 2(10):1116-1121).

Uma proteína que tem sido revelada até o presente e que 15 mostra um nível alto de homologia de seqüência entre sorovares diferentes, é a saber proteína-1 acessível de classe I (chamada de Cap 1, ou Ct-529). Tais proteínas têm uso potencial no desenvolvimento de vacinas que estimulam proteção contra mais do que um sorovar (Fling, SP et al PNAS 2001 98(3): 1160-1165). Contudo, em adição à exigência de níveis altos de homologia de 20 seqüência entre sorovares, proteínas de uso em vacinas também precisam induzir resposta imune suficiente.

Lyons, JM et al. BMC Infectious Diseases 2005 5:105 descrevem a aquisição de imunidade homotípica e heterotípica contra sorovares de Chlamydia trachomatis oculogenital após infecção de trato genital em camundongos.

Patel, HC et al. Genitourin. Med. 1995 71:2 94-97 verificaram que pacientes com infecção clamídica dual da conjuntiva e do trato genital tiveram um título de IgG mais alto do que aqueles com apenas infecção ocular ou genital. Ogra, PL et al. Clin. Microbiol. Rev. 2001 14(2):430-445 discutem estratégias de vacinação geral para obter respostas imunes mucosais.

Pedido de Patente Internacional de Número PCT/US2006/010793, publicação de número W02006/104890, mostra combinações de antígenos clamídicos de uso na prevenção e/ou no tratamento de infecção clamídica, embora não mostre especificamente seu uso no tratamento de infecções oculares.

Ainda permanece uma necessidade na arte de métodos efetivos para o tratamento e a prevenção de infecções oculares causadas por Chlamydia trachomatis. Também ainda permanece uma necessidade de métodos efetivos para o tratamento e a prevenção de infecções oculares causadas por Chlamydia trachomatis resultantes de uma variedade de sorovares. A presente invenção atende a estas necessidades e adicionalmente proporciona outras vantagens relacionadas.

Os presentes inventores têm surpreendentemente verificado que a administração de certas composições imunogênicas é um método efetivo de indução de uma resposta imune que é protetora contra infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

Ademais, tem sido verificado que proteínas de Chlamydia trachomatis Ct-089, Ct-858 e Ct-875 em particular tanto são elevadamente antigênicas quanto têm um grau alto de identidade de seqüência através de diferentes sorovares de Chlamydia trachomatis. Há conservação particularmente alta na região dos epítopos preditos. A luz desta descoberta, existe a possibilidade do desenvolvimento de vacinas contra infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis que são eficazes contra uma ampla variedade de sorovares de Chlamydia trachomatis (i.e. que podem ser usados em proteção cruzada).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção é fornecido um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis pela administração de uma quantidade segura e eficaz de uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

Adicionalmente é fornecida uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), para uso no tratamento ou na prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

Também é fornecido o uso de uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

De acordo com a presente invenção é fornecido um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis pela administração de uma quantidade segura e eficaz de uma composição imunogênica compreendendo duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd). É adicionalmente fornecida uma composição imunogênica compreendendo duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), para uso no tratamento ou na prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

Também é fornecido o uso de duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis pela administração ocular de uma quantidade segura e eficaz de uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

Também é fornecido um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por administração não-ocular de uma quantidade segura e eficaz de uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

Adequadamente, a composição imunogênica compreende uma proteína imunogênica Ct-089, Ct-858 ou Ct-875, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento.

Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis, compreendendo a administração de uma composição imunogênica compreendendo uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct- 858 ou Ct-875, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis.

Também é fornecido o uso de uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 ou Ct-875, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis, na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis.

r

E adicionalmente fornecida uma composição imunogênica compreendendo uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct- 858 ou Ct-875, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis, para uso no tratamento ou na prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis.

Adequadamente, a composição imunogênica compreende duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd) (em particular duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875, e.g. Ct-858 e Ct-875). Em particular, a composição imunogênica compreende proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, relacionadas a cada uma de Ct-089, Ct-858 e Ct-875.

Em uma modalidade específica, a composição imunogênica pode ser formulada como uma composição farmacêutica, adicionalmente compreendendo um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

A imunogenicidade da composição imunogênica pode ser aumentada pela formulação como uma composição de vacina que adicionalmente compreende um adjuvante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra o alinhamento de seqüências para Ct-089 de sorovar E de Chlamydia trachomatis com Ct-089 de uma variedade de outros sorovares de Chlamydia trachomatis.

Figuras 2a e 2b mostram o alinhamento de seqüências para Ct- 858 de sorovar E de Chlamydia trachomatis com Ct-858 de uma variedade de outros sorovares de Chlamydia trachomatis.

Figuras 3a e 3b mostram o alinhamento de seqüências para Ct- 875 de sorovar E de Chlamydia trachomatis com Ct-875 de uma variedade de outros sorovares de Chlamydia trachomatis.

Figura 4 mostra os resultados de esfregaços oculares obtidos de camundongos imunizados no dia 7 após desafio ocular com corpos elementares de Chlamydia trachomatis. Figura 5 mostra os resultados de esfregaços oculares obtidos de camundongos imunizados no dia 14 após desafio ocular com corpos elementares de Chlamydia trachomatis.

Figura 6 mostra os resultados de esfregaços oculares obtidos de camundongos imunizados no dia 21 após desafio ocular com corpos elementares de Chlamydia trachomatis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O termo 'duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd)' significa que compreende pelo menos um componente (i.e. proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento) relacionado com um primeiro antígeno clamídico da lista acima mencionada e pelo menos um componente (i.e. proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento) relacionado com um segundo antígeno clamídico da lista acima mencionada. Referências a 'três ou mais' e tais semelhantes são para serem entendidas correspondentemente.

A seguir são fornecidas seqüências de polinucleotídeo e de polipeptídeo para certos antígenos que têm sido listados acima e que podem ser usados nas composições da invenção:

BREVE DESCRIÇÃO DE IDENTIFICADORES DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 1 é a seqüência de cDNA de Ct-460, também conhecida como Swib, de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis (sorovar LGVII também é chamado de sorovar LII ou L2).

SEQ ID NO: 2 é a seqüência de proteína de Ct-460, também conhecida como Swib, de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 é a seqüência de cDNA do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp) de sorovar F de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 4 é a seqüência de proteína do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp) de sorovar F de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 6 é a seqüência de proteína de Ct-858 sorovar E de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 8 é a seqüência de proteína de Ct-875 de sorovar E de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 é a seqüência de cDNA de Ct-622 de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 10 é a seqüência de proteína de Ct-622 de sorovar E de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11 é a seqüência de cDNA do domínio passageiro de PmpG também conhecida como Ct-871 de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 12 é a seqüência de proteína do domínio passageiro de PmpG, também conhecida como Ct-871 de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 13 é a seqüência de cDNA do domínio passageiro de PmpD, também conhecida como Ct-812, de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 14 é a seqüência de proteína do domínio passageiro de PmpD, também conhecida como Ct-812, de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 15 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 16 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar E de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 21 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 22 é a seqüência de proteína de Ct-875 de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 27 é a seqüência de cDNA de PmpG também conhecida como Ct-871 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 28 é a seqüência de proteína de PmpG, também conhecida como Ct-871 de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 33 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 34 é a seqüência de proteína de Ct-858 sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 33.

SEQ ID NO: 41 é a seqüência de cDNA de PmpD, também

conhecida como Ct-812, de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 42 é a seqüência de proteína de PmpD, também conhecida como Ct-812, de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 41. O domínio passageiro inclui os aminoácidos 31a 1203.

SEQ ID NO: 47 é a seqüência de cDNA do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 48 é a seqüência de proteína do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar LGVII de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 47.

SEQ ID NO: 49 é a seqüência de cDNA do antígeno de

Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar J de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 50 é a seqüência de proteína do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar J de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 49.

SEQ ID NO: 51 é a seqüência de cDNA do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar H Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 52 é a seqüência de proteína do antígeno de

Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar H Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 51.

SEQ ID NO: 53 é a seqüência de cDNA do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 54 é a seqüência de proteína do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar E de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 53.

SEQ ID NO: 55 é a seqüência de cDNA do antígeno de Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 56 é a seqüência de proteína do antígeno de

Chlamydia conhecido como Proteína de Membrana Externa Maior (Momp), também conhecida como Ct-681 de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 55.

SEQ ID NO: 57 é a seqüência de cDNA de Ct-622 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 58 é a seqüência de proteína de Ct-622 de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 57.

SEQ ID NO: 63 é a seqüência de cDNA de Ct-460, também conhecida como Swib de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 64 é a seqüência de proteína de Ct-460, também conhecida como Swib de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO: 71 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar D de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 72 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar D de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 79 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar A de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 80 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar A de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 81 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar B de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 82 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar B de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 81.

SEQ ID NO: 83 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar

G de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 84 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar G de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 83.

SEQ ID NO: 85 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar

H Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 86 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar H Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 85.

SEQ ID NO: 87 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar I

Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 88 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar I Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 87.

SEQ ID NO: 89 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar

J de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 90 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar J de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 89.

SEQ ID NO: 91 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar

K de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 92 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar K de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 91. SEQ ID NO: 93 é a seqüência de cDNA de Ct-089 de sorovar L2 Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 94 é a seqüência de proteína de Ct-089 de sorovar L2 Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 93.

SEQ ID NO: 95 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar A de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 96 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar A de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 95.

SEQ ID NO: 97 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar B de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 98 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar B de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 97.

SEQ ID NO: 99 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar G de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 100 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar G de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 99.

SEQ ID NO: 101 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar H Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 102 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar H Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 101.

SEQ ID NO: 103 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar

I Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 104 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar I Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 103.

SEQ ID NO: 105 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar J de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 106 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar J de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 105.

SEQ ID NO: 107 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar K de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 108 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar K de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 107.

SEQ ID NO: 109 é a seqüência de cDNA de Ct-858 de sorovar L2 Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 110 é a seqüência de proteína de Ct-858 de sorovar L2 Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 109.

SEQ ID NO: 111 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar A de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 112 é a seqüência de proteína de Ct-875 de sorovar A de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 111.

SEQ ID NO: 113 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar B de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 114 é a seqüência de proteína de Ct-875 de sorovar B de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 113.

SEQ ID NO: 115 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar G de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 116 é a seqüência de proteína de Ct-875 de sorovar G de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 115.

SEQ ID NO: 117 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar H Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 118 é a seqüência de proteína de Ct-875 de

sorovar H Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 117.

SEQ ID NO: 119 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar

I Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 120 é a seqüência de proteína de Ct-875 de

sorovar I Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 119.

SEQ ID NO: 121 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar J de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 122 é a seqüência de proteína de Ct-875 de

sorovar J de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 121.

SEQ ID NO: 123 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar K de Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 124 é a seqüência de proteína de Ct-875 de

sorovar K de Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 123.

SEQ ID NO: 125 é a seqüência de cDNA de Ct-875 de sorovar L2 Chlamydia trachomatis.

SEQ ID NO: 126 é a seqüência de proteína de Ct-875 de

sorovar L2 Chlamydia trachomatis, cuja proteína é codificada por SEQ ID NO: 125.

Algumas das seqüências acima e outros polipeptídeos e polinucleotídeos de Chlamydia relacionados de numerosos sorovares são conhecidas(os) e estão disponíveis na arte. Outras seqüências relacionadas podem ser encontradas nas patentes US de números 6.447.779, 6.166.177, 6.565.856, 6.555.115, 6.432.916, e 6.448.234 e também são mostradas em pedidos de patente U.S. Nos. 10/197,220, 10/762,058 e 10/872,155, cada uma 5 das quais é aqui incorporada como referência.

A seqüência de Ct-089 de sorovar Dea aplicação potencial desta proteína como um antígeno têm sido publicamente exibidos, por exemplo em W002/08267 (Corixa Corporation). A seqüência de Ct-089 de sorovar L2 foi exibida em W099/28475 (Genset). O papel de CopN (também conhecida como Ct-089) como um regulador exportado putativo de sistemas de secreção de proteína de tipo III é discutido em Fields, KA e Hackstadt, T Mol. Microbiol. 2000 38(5): 1048-1060. As seqüências de Ct-858 e Ct-875 de sorovar D estão disponíveis no banco de dados Swiss-Prot, números de acesso primários 084866 e 084883 respectivamente. Para informação adicional veja Stephens, RS et al. Science 1998 282:754-759. O uso de Ct-858 como um antígeno é mostrado, por exemplo, em W002/08267 (Corixa Corporation). A seqüência de Ct-875 de sorovar E (incorporando uma etiqueta-His) e seu uso como um antígeno são mostrados, por exemplo, em US 20040137007. Contudo, o documento incorretamente refere-se ao número de seqüência 139 como sendo Ct-875, quando ele de fato está lá no número de seqüência 140.

Adequadamente a composição imunogênica de uso na presente invenção compreenderá três ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de 25 Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), por exemplo três, quatro, cinco ou seis proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct- 875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que cada componente em uma composição imunogênica pode independentemente ser uma proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento. Adicionalmente, uma pessoa experiente na arte reconhecerá que numerosas proteínas ou seus fragmentos imunogênicos podem estar contidos dentro de uma única proteína de fusão e não precisa ser proporcionado separadamente (e correspondentemente numerosos polinucleotídeos codificadores de proteínas específicas e/ou seus fragmentos imunogênicos podem estar contidos dentro de uma única seqüência de polinucleotídeo codificadora de uma proteína de fusão). Em uma modalidade da invenção todas(os) as proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos são fornecidas como polipeptídeos (tal como uma proteína de fusão). Em uma segunda modalidade da invenção todas as proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos são fornecidas como polinucleotídeos (por exemplo uma única seqüência de polinucleotídeo, tal como uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de uma proteína de fusão). Será reconhecido que um componente polipeptídeo (i.e. uma proteína ou seu fragmento imunogênico) pode estar compreendido dentro de um polipeptídeo maior que contém resíduos adicionais. Similarmente, um polinucleotídeo codificador de uma proteína ou seu fragmento imunogênico pode estar compreendido dentro de um polinucleotídeo maior.

Em adição às proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), as composições imunogênicas podem compreender outras proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos relacionados a qualquer outro 5 fragmento clamídico (por exemplo proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos relacionados a um, dois ou três antígenos clamídicos).

Com o propósito de obter respostas imunes eficazes através de uma população diversa de humanos criados fora, é vantajoso utilizar 10 combinações de antígenos. Nem todas as combinações de antígeno são complementares. Certas combinações de antígenos têm sido verificadas pelos presentes inventores como tendo reconhecimento amplo por sujeitos humanos com uma história de infecção clamídica.

Adequadamente, a composição imunogênica compreende uma proteína imunogênica Ct-089, Ct-858 ou Ct-875, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento. Mais adequadamente, a composição imunogênica compreende duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875 (e.g. Ct-089 e Ct-858; Ct-089 e Ct-875; ou Ct-858 e Ct-875). Em particular, a composição imunogênica pode compreender proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, relacionadas a cada uma de Ct-089, Ct-858 e Ct-875. Por exemplo, a composição imunogênica pode compreender

componentes relacionados a uma das seguintes combinações, desde que todas as combinações compreendam componentes Ct-858 e Ct-875:

I. Cinco de: Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd e Ct-

875 2. Três de: PmpDpd, Ct-858, Ct-0875, Swib

3. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875 e Swib

4. Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622 e Ct-

875

5. Três de: Ct-858, Ct-875, Ct-622 e Ct-089

6. Três de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089

7. Quatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd e Ct-875 Composições imunogênicas específicas podem compreender

componentes relacionados a uma das seguintes combinações (cada uma das quais contém os componentes Ct-858 e Ct-875):

la. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089

2a. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089

3a. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, Swib, Ct-089

4a. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-875, Ct-

089

5a. Ct-858, Ct-875

6a. Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-089

7a. Momp, Ct-858, Ct-875

8a. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-875, Ct-089 9a. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089

Uma composição imunogênica alternativa pode compreender componentes relacionados a Momp, Ct-089, Ct-858, Swib e PmpDpd.

As composições imunogênicas de uso na presente invenção podem ser administradas por qualquer rota de vacinação apropriada. Em uma modalidade da invenção a composição imunogênica é administrada ocularmente. Em uma segunda modalidade da invenção a composição imunogênica é administrada não-ocularmente.

Rotas de administração não-ocular incluem administração via superfícies mucosais do olho. Em uma modalidade da invenção administração não-ocular é via uma superfície mucosal (e.g. intranasal, oral ou vaginal). Em uma segunda modalidade da invenção administração não-ocular é via injeção (e.g. injeção intradermal, injeção subcutânea, injeção intramuscular ou injeção intravenosa, em particular injeção intramuscular).

5 Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um

método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis, compreendendo a administração de uma composição imunogênica compreendendo uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct- 10 858 ou Ct-875, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis.

Também é fornecido o uso de uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 ou Ct-875, um seu fragmento 15 imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis, na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis.

Adicionalmente é fornecida uma composição imunogênica

compreendendo uma proteína selecionada da lista consistindo de Ct-089, Ct- 858 ou Ct-875, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, que é derivado de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis, para uso no tratamento ou na 25 prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis por um segundo sorovar de Chlamydia trachomatis.

Em uma modalidade da invenção a composição imunogênica de uso em proteção cruzada compreende uma proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875. Composições imunogênicas que compreendem apenas uma proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct- 875 adequadamente adicionalmente compreenderão pelo menos um antígeno clamídico adicional (por exemplo um, dois, três ou quatro antígenos adicionais).

Em uma segunda modalidade da invenção a composição imunogênica de uso em proteção cruzada compreende duas proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct- 858 e Ct-875. Por exemplo: Ct-089 e Ct-858; Ct-089 e Ct-875; ou Ct-858 e Ct-875. Tais composições podem adicionalmente compreender antígenos clamídicos adicionais (por exemplo um, dois ou três antígenos adicionais).

Em uma terceira modalidade da invenção a composição imunogênica de uso em proteção cruzada compreende três proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct- 858 e Ct-875. Tais composições também podem adicionalmente compreender antígenos clamídicos adicionais (por exemplo um ou dois antígenos adicionais).

Tipicamente, antígenos clamídicos adicionais (que podem estar na forma de proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos) de uso em composições imunogênicas de uso em proteção cruzada serão selecionados da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-622, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), em particular de Swib, Momp e domínio passageiro de PmpD.

O primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis pode ser qualquer sorovar de Chlamydia trachomatis. O segundo sorovar de Chlamydia trachomatis pode ser qualquer sorovar de Chlamydia trachomatis, excluindo aquele do primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis.

Em uma modalidade da invenção o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado da lista consistindo de sorovares A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, Η, I, la, J, Ja, K , LI, L2 e L3 de Chlamydia trachomatis. Em uma segunda modalidade da invenção o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculares de Chlamydia trachomatis (por exemplo A, B, Ba e C). Em outra modalidade da invenção o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculogenitais de Chlamydia trachomatis (por exemplo D, Da, E, F, G, Η, I, la, J, Ja e K). Em uma outra modalidade da invenção o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares LGV de Chlamydia trachomatis (por exemplo LI, L2 e L3).

Em uma modalidade da invenção o segundo sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado da lista consistindo de sorovares A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, Η, I, la, J, Ja, K , LI, L2 e L3 de Chlamydia trachomatis. Em uma segunda modalidade da invenção o segundo sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculares de Chlamydia trachomatis (por exemplo A, B, Ba e C). Em outra modalidade da invenção o segundo sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculogenitais de Chlamydia trachomatis (por exemplo D, Da, E, F, G, Η, I, la, J, Ja e K). Em uma outra modalidade da invenção o segundo sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares LGV Chlamydia trachomatis (por exemplo LI, L2 e L3).

Com o objetivo de maximizar o raio de ação dos métodos e usos de proteção cruzada, pode ser desejável que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis seja selecionado de tal modo que haja um nível alto de identidade de seqüência (por exemplo pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, em particular pelo menos 98%, mais particularmente pelo menos 99% de identidade de seqüência) com a maior parte dos outros sorovares de Chlamydia trachomatis (por exemplo pelo menos 50%, especialmente pelo menos 70%), em particular pelo menos 80%, mais 5 particularmente pelo menos 90% de outros sorovares de Chlamydia trachomatis).

Com o objetivo de maximizar a aplicação prática do método e do uso da presente invenção, pode ser desejável que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis seja selecionado de tal modo que haja um nível alto 10 de identidade de seqüência (por exemplo pelo menos 90%, especialmente pelo menos 95%, em particular pelo menos 98%, mais particularmente pelo menos 99% de identidade de seqüência) com a maioria (por exemplo pelo menos 50%, especialmente pelo menos 70%, em particular pelo menos 80%), mais particularmente pelo menos 90%) dos sorovares comuns de Chlamydia 15 trachomatis (tais como os sorovares oculares comuns, os sorovares oculogenitais comuns, os sorovares LGV comuns, ou uma combinação de quaisquer dois destes grupos de sorovares, por exemplo, os sorovares oculares e oculogenitais comuns). Sorovares oculares comuns de Chlamydia trachomatis incluem AeB. Sorovares oculogenitais comuns de Chlamydia 20 trachomatis incluem D, E, F e I (Lan, J et al. J. Clin. Microbiol. 1995 33(12):3194-3197; Singh, V et al. J. Clin. Microbiol. 2003 41(6):2700-2702). Sorovares LGV comuns de Chlamydia trachomatis incluem L2.

Em uma modalidade da presente invenção o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é sorovar E de Chlamydia trachomatis.

Em uma modalidade da invenção o segundo sorovar de

Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares A, B e K de Chlamydia trachomatis.

Em um exemplo da presente invenção, onde a composição imunogênica compreende proteína Ct-089, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis, a composição imunogênica pode ser usada no tratamento ou na profilaxia de infecções decorrentes de sorovares A, B, D, G, Η, I, J, K ou L2; em particular A, B, D, G, Η, I ou K; especialmente 5 A ou B de Chlamydia trachomatis.

Em um segundo exemplo da presente invenção, onde a composição imunogênica compreende Ct-858 proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador 10 da(o) mesmo(a), derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis, a composição imunogênica pode ser usada no tratamento ou na profilaxia de infecções decorrentes de sorovares A, B, D, G, Η, I, J, K ou L2; em particular J ou L2 de Chlamydia trachomatis.

Em um outro exemplo presente invenção, onde a composição 15 imunogênica compreende Ct-875 proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, um seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador da(o) mesmo(a), derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis, a composição imunogênica pode ser usada no tratamento ou na profilaxia de infecções decorrentes de 20 sorovares A, B, D, G, Η, I, J, K ou L2; em particular A, B, D, G, H, I ou K de Chlamydia trachomatis

Os primeiro e segundo sorovares de Chlamydia trachomatis podem estar associados com o mesmo estado doentio (por exemplo podem ser ambos sorovares oculares ou podem ser ambos sorovares oculogenitais), ou 25 os primeiro e segundo sorovares de Chlamydia trachomatis podem estar associados com estados doentios diferentes (por exemplo o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis pode ser um sorovar oculogenital e o segundo sorovar de Chlamydia trachomatis pode ser um sorovar ocular, ou vice versa).

No caso de a composição imunogênica de uso na presente invenção compreender mais do que uma proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador de dita proteína ou de dito fragmento, selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875, deve ser notado que cada proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador deles, pode ser opcionalmente derivado de um primeiro diferente sorovar de Chlamydia trachomatis que pode ser independentemente selecionado. Embora, uma pessoa experiente na arte reconhecerá que as composições imunogênicas também podem incluir proteínas adicionais Ct- 089, Ct-858 e Ct-875, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos que são derivados de segundo sorovar de Chlamydia trachomatis.

Assim as composições imunogênicas de uso na presente invenção podem empregar as seqüências de polipeptídeo fornecidas na listagem de seqüências ou suas variantes, fragmentos imunogênicos destas, ou seqüências de polinucleotídeo codificadoras destas (que podem ser, por exemplo, as seqüências de polinucleotídeo fornecidas na listagem de seqüências ou fragmentos destas que codificam fragmentos imunogênicos dos polipeptídeos).

Os antígenos de proteína aqui descritos podem estar na forma de proteínas de fusão. As proteínas de fusão também podem conter polipeptídeos adicionais, opcionalmente peptídeos heterólogos de Chlamydia ou outras fontes. Antígenos dentro de proteínas de fusão podem ser modificados, por exemplo, pela adição de seqüências de peptídeo ligador como descrito abaixo. Estes peptídeos ligadores podem ser inseridos entre um ou mais polipeptídeos que compõem cada uma das proteínas de fusão. Os antígenos aqui descritos também podem estar na forma de conjugados químicos.

Será evidente que no caso de domínios passageiros de PmpD e PmpG, estes podem estar presentes no contexto de uma porção maior do polipeptídeo ou da proteína PmpD ou PmpG, por exemplo PmpD ou PmpG de comprimento total ou um seu fragmento, desde que o fragmento compreenda o domínio passageiro.

Em modalidades particulares:

(i) o componente Ct-089 tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-089 fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-089 fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Ct- 089 será derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

(ii) O componente Ct-858 tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-858 fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-858 fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Ct- 858 será derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

(iii) o componente Ct-875 tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-875 fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-875 fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Ct- 875 será derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

(iv) o componente PmpDpd tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência PmpDpd fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90%> de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência PmpDpd fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente PmpDpd será derivado de sorovar LU de Chlamydia trachomatis.

(v) o componente PmpGpd tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência PmpGpd fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência PmpGpd fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente PmpGpd será derivado de sorovar LU de Chlamydia trachomatis.

(vi) o componente Momp tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Momp fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Momp fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Momp será derivado de sorovar F de Chlamydia trachomatis.

(vii) o componente Swib tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Swib fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Swib fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Swib será derivado de sorovar LU de Chlamydia trachomatis.

(viii) o componente Ct-622 tipicamente será um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-622 fornecida aqui na listagem de seqüências, um seu fragmento imunogênico, ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de homologia (por exemplo 95% de homologia) a uma seqüência Ct-622 fornecida aqui na listagem de seqüências, ou um seu fragmento que codifica um fragmento imunogênico da proteína correspondente. Em particular, o componente Ct- 622 será derivado de sorovar E de Chlamydia trachomatis.

As composições imunogênicas de uso na presente invenção podem adicionalmente compreender outros componentes planejados para aumentar a antigenicidade dos antígenos ou para melhorar estes antígenos em outros aspectos, por exemplo, o isolamento destes antígenos através da adição de um segmento de resíduos de histidina em uma extremidade do antígeno. A adição de um segmento de resíduos de histidina em uma extremidade do antígeno também pode melhorar a expressão. As composições imunogênicas de uso na invenção podem compreender cópias de antígenos adicionais, ou polipeptídeos ou polinucleotídeos adicionais de Chlamydia sp. As composições imunogênicas também podem compreender polipeptídeos ou polinucleotídeos heterólogos adicionais de outras fontes que não-Chlamydia. Por exemplo, as composições da invenção podem incluir polipeptídeos ou ácidos nucleicos codificadores de polipeptídeos, sendo que o polipeptídeo intensifica a expressão do antígeno, e.g., NSl, uma proteína do vírus da gripe, ou uma porção imunogênica da mesma (veja, e.g. W099/40188 e W093/04175). Os ácidos nucleicos da invenção podem ser engenhados baseado na preferência de códon em uma espécie de escolha, e.g., humanos. Onde a seqüência de proteína para um antígeno inicia com um resíduo Met, será reconhecido que este resíduo pode ser tipicamente omitido sem detrimento para as propriedades funcionais do antígeno.

DEFINIÇÕES

"Polipeptídeo de fusão" ou "proteína de fusão" refere-se a uma proteína tendo pelo menos dois polipeptídeos de Chlamydia (que podem ser iguais, ou podem ser diferentes) covalentemente ligados, quer diretamente quer via um ligador de aminoácido. Os polipeptídeos formando a proteína de fusão são tipicamente ligados terminação-C em terminação-N, embora também possam ser ligados terminação-C em terminação-C, terminação-N em terminação-N, ou terminação-N em terminação C. Os polipeptídeos da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem. Este termo também se refere às variantes conservativamente modificadas, variantes polimórficas, alelos, subseqüências, homólogos inter-espécies, e fragmentos imunogênicos dos antígenos que compõem a proteína de fusão. Proteínas de fusão de uso na invenção também podem compreender cópias adicionais de um componente antígeno ou seu fragmento imunogênico.

Uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de uma proteína de fusão hibridiza sob condições estringentes em pelo menos duas seqüências de nucleotídeo, cada uma codificando um polipeptídeo de antígeno selecionado do grupo consistindo de Ct-681 (Momp) ou um seu fragmento 20 imunogênico, Ct-871 (PmpG) ou um seu fragmento imunogênico, Ct-812 (PmpD) ou um seu fragmento imunogênico, Ct-089 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-858 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-875 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-460 (Swib) ou um seu fragmento imunogênico, e Ct-622 ou um seu fragmento imunogênico. As seqüências de polinucleotídeo 25 codificadoras dos antígenos individuais do polipeptídeo de fusão portanto incluem variantes conservativamente modificadas, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subseqüências, fragmentos imunogênicos, e homólogos de inter-espécies de Ct-681 (Momp), Ct-871 (PmpG), Ct-812 (PmpD), Ct-089, Ct-858, Ct-875, Ct-460 (Swib), e Ct-622. As seqüências de polinucleotídeo codificadoras dos polipeptídeos individuais da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos individuais da proteína de fusão estão na ordem (terminação-N para C) de grande para

5 pequeno. Antígenos grandes são aproximadamente 30 a 150 kD em tamanho, antígenos médios são aproximadamente 10 a 30 kD em tamanho, e antígenos pequenos são aproximadamente menores do que 10 kD em tamanho.

A seqüência codificadora de polipeptídeo individual pode ser tão pequena quanto, e.g., um fragmento imunogênico tal como um epítopo 10 CTL individual codificador de cerca de 8 a 9 aminoácidos, ou, e.g., um epítopo de célula B ou HTL. O fragmento também pode incluir epítopos múltiplos. Os epítopos de célula auxiliar-T são peptídeos ligados em moléculas HLA de classe II e reconhecidos por células auxiliares-T. A predição de epítopos de célula-T auxiliar putativa pode ser realizada usando o 15 método TEPITOPE descrito por Stumiolo et al. Nature Biotech. 1999 17:555- 561.

Um polipeptídeo de fusão especificamente se liga em anticorpos produzidos contra pelo menos dois polipeptídeos antígeno selecionados de Ct-681 (Momp) ou um seu fragmento imunogênico, Ct-871 20 (PmpG) ou um seu fragmento imunogênico (e.g. PmpGpd ou um seu fragmento imunogênico), Ct-812 (PmpD) ou um seu fragmento imunogênico (e.g. PmpDpd ou um seu fragmento imunogênico), Ct-089 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-858 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-875 ou um seu fragmento imunogênico, Ct-460 (Swib) ou um seu fragmento 25 imunogênico, e Ct-622 ou um seu fragmento imunogênico. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Opcionalmente, o polipeptídeo de fusão especificamente se liga em anticorpos produzidos contra a junção de fusão dos antígenos, cujos anticorpos não se ligam nos antígenos individualmente, i.e., quando não são parte de uma proteína de fusão. Os polipeptídeos de fusão opcionalmente compreendem polipeptídeos adicionais, e.g., três, quatro, cinco, seis, ou mais polipeptídeos, até cerca de 25 polipeptídeos, opcionalmente polipeptídeos heterólogos ou polipeptídeos homólogos repetidos, fusionados em pelo menos dois antígenos. Os polipeptídeos adicionais da proteína de fusão são opcionalmente derivados de Chlamydia bem como outras fontes tais como outras fontes bacterianas, virais, ou de invertebrado, ou de mamífero. Os polipeptídeos individuais da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem. Como aqui descrito. Como aqui descrito, a proteína de fusão também pode estar ligada em outras moléculas, incluindo polipeptídeos adicionais. As composições de uso na invenção também podem compreender polipeptídeos adicionais que não estão ligados em proteínas de fusão da invenção. Estes polipeptídeos adicionais podem ser polipeptídeos heterólogos ou homólogos.

O termo "fusionado(a)" refere-se à ligação covalente entre dois polipeptídeos em uma proteína de fusão. Os polipeptídeos são tipicamente unidos via uma ligação peptídica, quer diretamente um no outro quer via um ligador de aminoácido. Opcionalmente, os peptídeos podem ser unidos via ligações covalentes não-peptídicas conhecidas por aqueles pessoas experientes na arte.

"FL" refere-se a comprimento total, i.e., um polipeptídeo que tem o mesmo comprimento do polipeptídeo de tipo selvagem.

O termo "seu fragmento imunogênico" refere-se a um polipeptídeo compreendendo um epítopo que é reconhecido pelos linfócitos T, em particular linfócitos T citotóxicos, células B ou linfócitos T auxiliares. Métodos de determinar regiões de epítopo de uma seqüência são descritos aqui alhures. Adequadamente, o fragmento imunogênico compreenderá pelo menos 30%, adequadamente pelo menos 50%, especialmente pelo menos 75%) e em particular pelo menos 90%) (e.g. 95% ou 98%) dos aminoácidos na seqüência de referência. Alternativamente, o fragmento imunogênico compreenderá um segmento de pelo menos 9, adequadamente pelo menos 15 (por exemplo pelo menos 25 ou pelo menos 50, em particular pelo menos 100) resíduos. O fragmento imunogênico adequadamente compreenderá todas as regiões de epítopo da seqüência de referência.

O adjuvante refere-se aos componentes em uma vacina ou composição terapêutica que aumentam a resposta imune específica ao antígeno (veja, e.g., Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Adjuvantes induzem respostas imunes do tipo Thl e do tipo Th2 Citocinas de tipo Thl (e.g., IFN-γ, IL-2, e IL-12) tendem a favorecer a indução da resposta imune mediada por célula a um antígeno administrado, enquanto que citocinas de tipo Th2 (e.g., IL-4, IL-5, II-6, IL-10 e TNF-β) tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais. Qualquer um de uma variedade de adjuvantes pode ser empregado nas vacinas desta invenção para intensificar a resposta imune. Alguns adjuvantes contêm uma substância planejada para proteger o antígeno do catabolismo rápido, tais como partículas de sal metálico (e.g. hidróxido de amônio ou fosfato de amônio) ou óleo mineral, e um estimulador específico ou não-específico de respostas imunes, tais como lipídeo A, Bortadella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Adjuvantes adequados estão comercialmente disponíveis e incluem, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories) e Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Outros adjuvantes adequados incluem monofosforil-lipídeo A, 3D-MPL, saponinas (e.g. Quil A, em particular a fração de Quil A conhecido como QS21, especialmente juntamente com componentes destoxificantes tais como colesterol que são descritos em W096/033739), formulações de lipossomo incluindo SBAS1, emulsões de óleo em água incluindo SBAS2 (Ling etal. Vaccine 1997 15:1562-1567) e oligonucleotídeo CpG (W096/02555). Adjuvantes adequados para uso na invenção são discutidos com mais detalhe abaixo. "Ácido nucleico" refere-se aos desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros na forma quer de fita única quer de fita dupla. O termo também pode se estender para incluir ácidos nucleicos contendo ligações ou estrutura principal ou análogos de nucleotídeo modificados conhecidos, que são sintéticos, naturalmente ocorrentes, e não- naturalmente ocorrentes, que têm propriedades de ligação semelhantes como as do ácido nucleico de referência, e que são metabolizados em uma maneira similar a dos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil-fosfonatos, quiral-metil- fosfonatos, 2-O-metil-ribonucleotídeos, ácidos peptídeo-nucleicos (PNAs).

A não ser que seja indicado de outro modo, uma seqüência de ácido nucleico particular também inclui implicitamente suas variantes conservativamente modificadas (e.g., substituição de códon degenerado) e seqüências complementares, bem como a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser realizadas por seqüências geradoras nas quais a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de desoxi-inosina e/ou base mista (Batzer et ai, Nucleie Aeid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka etal., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et ai, Mol. CelL Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.

Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente aqui para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos também se aplicam aos polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido naturalmente ocorrente, bem como aos polímeros de aminoácido naturalmente ocorrentes e polímero de aminoácido não- naturalmente ocorrente.

O termo "aminoácido" refere-se aos aminoácidos naturalmente ocorrentes e sintéticos, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar à dos aminoácidos naturalmente ocorrentes. Aminoácidos naturalmente ocorrentes são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são modificados mais tarde, e.g., hidróxi-prolina, γ-carbóxi-glutamato, e O-fosfo- serina. Análogos de aminoácido referem-se aos compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido naturalmente ocorrente, i.e., um carbono que é ligado em um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, e.g., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil-sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (e.g., norleucina) ou estruturas principais peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química que a de um aminoácido naturalmente ocorrente. Miméticos de aminoácido referem-se aos compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona em uma maneira similar a de um aminoácido naturalmente ocorrente.

Aminoácidos podem ser aqui referidos quer por seus símbolos de três letras comumente conhecidos quer pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotídeos, igualmente, podem ser referidos por seus códigos de uma letra comumente aceitos.

"Variantes" ou "variantes conservativamente modificadas" aplica-se a ambas as seqüências de aminoácidos e de ácido nucleico. Com respeito às seqüências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam seqüências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma seqüência de aminoácidos, às seqüências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos acima sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada seqüência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para dar uma molécula funcionalmente idêntica. Conseqüentemente, cada variação silenciosa de uma ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implicada em cada seqüência descrita.

Um polinucleotídeo da invenção pode conter numerosas variações silenciosas (por exemplo, 1-10, tal como 1-5, em particular 1 ou 2, e especialmente 1 códon(s) pode(m) estar alterado(s)) quando comparado com a seqüência de referência. Um polinucleotídeo da invenção pode conter numerosas variações conservativas não-silenciosas (por exemplo, 1-10, tal como 1-5, em particular 1 ou 2, e especialmente 1 códon(s) pode(m) estar alterado(s)) quando comparado com a seqüência de referência. Aqueles pessoas experientes na arte reconhecerão que uma seqüência de polinucleotídeo particular pode conter ambas variações conservativas silenciosas e não-silenciosas.

Como para as seqüências de aminoácidos, uma pessoa experiente na arte reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais em uma seqüência de ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, ou proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma percentagem pequena de aminoácidos na seqüência codificada é uma "variante conservativamente modificada" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido funcionalmente similar ou a deleção / adição de resíduos que não influenciam substancialmente a função biológica da variante. Tabelas de substituição conservativa fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na arte. Tais variantes conservativamente modificadas são em adição às e não excluem variantes polimórficas, homólogos de inter-espécies, e alelos da invenção.

Um polipeptídeo da invenção pode conter numerosas variações conservativas (por exemplo, 1-10, tal como 1-5, em particular 1 ou 2, e especialmente 1 resíduo(s) de aminoácido pode(m) ser alterado(s)) quando comparado com a seqüência de referência. Em geral, tais substituições conservativas cairão dentro dos agrupamentos de aminoácidos especificados abaixo, embora em algumas circunstâncias outras substituições possam ser possíveis sem substancialmente afetarem as propriedades imunogênicas do antígeno. Os seguintes oito grupos contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas de um pelo outro:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); e

8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, e.g., Creighton, Proteins

(1984)).

Adequadamente substituições de aminoácido são restritas às regiões de não-epítopo de um antígeno.

Variantes de seqüência de polipeptídeo também podem incluir aquelas nas quais aminoácidos adicionais são inseridos comparadas com a seqüência de referência, por exemplo, tais inserções podem ocorrer em 1-10 posições (tal como 1-5 posições, adequadamente 1 ou 2 posições, em particular 1) e podem envolver a adição de 50 ou menos aminoácidos (tal como 20 ou menos, em particular 10 ou menos, especialmente 5 ou menos) em cada posição. Adequadamente tais inserções não ocorrem na região de um epítopo, e portanto não têm uma influência significativa sobre as propriedades imunogênicas do antígeno. Um exemplo de inserções inclui um segmento curto de resíduos de histidina (e.g. 1-6 resíduos) para ajudas na expressão e/ou purificação do antígeno em questão.

Outras variantes de seqüência de polipeptídeo incluem aquelas nas quais os aminoácidos têm sido deletados comparadas com a seqüência de referência, por exemplo, tais deleções podem ocorrer em 1-10 posições (tal como 1-5 posições, adequadamente 1 ou 2 posições, em particular 1) e podem, por exemplo, envolver a deleção de 50 ou menos aminoácidos (tal como 20 ou menos, em particular 10 ou menos, especialmente 5 ou menos) em cada posição. Adequadamente tais deleções não ocorrem na região de um epítopo, e portanto não têm influência significativa sobre as propriedades imunogênicas do antígeno.

Métodos de determinar as regiões de epítopo de um antígeno são aqui descritos e exemplificados alhures.

O termo "heterólogo" quando usado com referência às porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subseqüências que não são encontradas na mesma relação de uma com a outra na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente recombinantemente produzido, tendo duas ou mais seqüências de genes não relacionados arranjadas para preparar um novo ácido nucleico funcional, e.g., um promotor de uma fonte e uma região codificadora de outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subseqüências que não são encontradas na mesma relação de uma com a outra na natureza (e.g., uma proteína de fusão). A frase "seletivamente (ou especificamente) hibridiza em" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula apenas em uma seqüência de nucleotídeos particular sob condições de hibridização estringentes quando aquela seqüência está presente em uma mistura complexa (e.g., DNA ou RNA de biblioteca ou celular total).

A frase "condições de hibridização estringentes" ou "hibridiza sob condições estringentes" refere-se às condições sob as quais uma sonda hibridizará em sua subseqüência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácido nucleico, mas não em outras seqüências. Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Seqüências menores hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Bioehemistry and Molecular Biology-Hybridization com Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, condições estringentes são selecionadas para estarem a cerca de 5-IO0C mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em um pH e uma força iônica definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam na seqüência alvo em equilíbrio (como as seqüências alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que a concentração de íon sódio de cerca de 1,0 M, tipicamente concentração de íon sódio de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou de outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maior do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tal como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes a hibridização de fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridização de fiindo. Condições de hibridização estringentes exemplares podem ser as seguintes: formamida 50%, 5x SSC, e SDS 1%, incubação a 42°C, ou, 5x SSC, SDS 1%, incubação a 65°C, com lavagem em 0,2x SSC, e SDS 0,1% a 65°C.

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Acidos nucleicos que não hibridizam uns nos outros sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridizam sob condições de hibridização moderadamente estringentes. "Condições de hibridização moderadamente estringentes" exemplares incluem uma hibridização em um tampão de formamida 40%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em IX SSC a 45°C. Uma hibridização positiva é pelo menos duas vezes a hibridização de fundo. Aqueles pessoas experientes na arte reconhecerão prontamente que condições de hibridização e de lavagem alternativas podem ser utilizadas para proporcionar condições de estringência similares.

"Anticorpo" refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma região de molde de um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos que especificamente se liga em e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de regiões constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, bem como a miríade de genes de regiões variáveis de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como quer kappa quer lambda. Cadeias pesadas são classificas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplar compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leva" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A terminação- N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) referem-se à estas cadeias leve e pesada respectivamente.

Anticorpos existem, e.g., como imunoglobulinas intactas ou como numerosos fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab que em si mesmo é uma cadeia leve ligada em Vh-ChI por uma ligação de dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condições suaves para quebrar a ligação de dissulfeto na região de dobradiça, convertendo deste modo o dímero F(ab)'2 em um monômero Fab'. O monômero Fab' é essencialmente Fab com parte da região de dobradiça (veja Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, uma pessoa experiente na arte reconhecerá que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quer quimicamente quer pelo uso de metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui usado, também inclui fragmentos de anticorpo quer produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, quer aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (e.g., Fv de cadeia única) ou aqueles identificados usando bibliotecas de exibição de fago (veja, e.g., McCafferty etal., Nature 348:552- 554(1990)).

Para preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais, qualquer técnica conhecida na arte pode ser usada (veja, e.g., Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole etal., pp. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy

(1985)). Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.S. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para polipeptídeos

desta invenção. Também, camundongos transgênicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados. Alternativamente, tecnologia de exibição de fago pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que especificamente se ligam em antígenos (veja, e.g., McCafferty et al., Nature 10 348:552-554 (1990); Marks etal., Bioteehnology 10:779-783 (1992)).

A frase "especificamente (ou seletivamente) se liga em" em relação a um anticorpo ou "especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com", quando se refere a uma proteína ou a um peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que é determinante da presença da proteína em uma 15 população heterogênea de proteínas e outras biologias. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos específicos se ligam em uma proteína particular pelo menos duas vezes o fundo e não se ligam substancialmente em uma quantidade significativa em outras proteínas presentes na amostra. Ligação específica em um anticorpo sob tais condições 20 pode exigir um anticorpo que é selecionado para sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, anticorpos policlonais produzidos contra proteínas de fusão podem ser selecionados para obter apenas aqueles anticorpos policlonais que são especificamente imunorreativos com proteína de fusão e não com componentes individuais das proteínas de fusão. Esta 25 seleção pode ser realizada pela subtração de anticorpos que reagem cruzadamente com os antígenos individuais. Pode ser usada uma variedade de formatos de imunoensaios para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA em fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com a proteína fveja, e.g., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para uma descrição de formatos de imunoensaio e condições eu podem ser usadas para determinar imunorreatividade específica). Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos o dobro do sinal de ruído de fundo e mais tipicamente mais do que 10 a 100 vezes o sinal ou ruído de fundo.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (i.e., uma seqüência endógena que codifica um antígeno individual ou uma sua porção) ou podem compreender uma variante de uma tal seqüência. Variantes de polinucleotídeo podem conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções de tal modo que a atividade biológica do polipeptídeo de fusão codificado não seja diminuída, em relação a um polipeptídeo de fusão compreendendo antígenos nativos. Variantes preferivelmente exigem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade e muito mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade em relação a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo nativo ou uma sua porção.

Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual, no contexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeo, referem- se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais (i.e., 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% (e.g. 98%) de identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada conforme medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüências ou por alinhamento manual e inspeção visual. Tais seqüências são então ditas em serem "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere ao complemento de uma seqüência de teste. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que é pelo menos cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos em comprimento, ou opcionalmente sobre uma região que é de 75-100 aminoácidos ou nucleotídeos em comprimento. Adequadamente a identidade existe sobre o comprimento inteiro da seqüência de referência. Seqüências variantes de polinucleotídeo e de polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% (e.g. 98%) de identidade sobre uma região especificada de uma seqüência de referência (e.g. o comprimento inteiro) são de interesse particular.

Para comparação de seqüências, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência, à qual as seqüências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüências, as seqüências de teste e de referência são inseridas em um computador, coordenadas de subseqüência são designadas, se necessárias, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. Ao parâmetros de programa pré-estabelecidos podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüências então calcula as identidades de seqüência percentuais para as seqüência de teste em relação à seqüência de referência, baseado nos parâmetros de programa.

Uma "janela de comparação", como aqui usada, inclui referência a um segmento de qualquer uma de numerosas posições contíguas selecionadas do grupo consistindo de 25 a 500, normalmente cerca de 50 a cerca de 200, mais normalmente cerca de 100 a cerca de 150 na qual uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, por algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, e.g., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal, eds. 1995 supplement)).

Um exemplo de algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria uma um alinhamento de múltiplas seqüências de um grupo de seqüências relacionadas usando alinhamentos pareados, progressivos para mostrar relação e identidade de seqüência percentual. Também plota uma árvore ou dendograma mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). O método usado é similar ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 seqüências, cada uma de um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento pareado das duas seqüências mais similares, produzindo um agrupamento de duas seqüências alinhadas. Este agrupamento é então alinhado com a seguinte seqüência mais relacionada ou agrupamento de seqüências alinhadas. Dois agrupamentos de seqüências são alinhados por uma extensão simples do alinhamento pareado de duas seqüências individuais. O alinhamento final é realizado por uma série de alinhamentos pareados, progressivos. O programa é operado pela designação de seqüências específicas e suas coordenadas de nucleotídeo ou aminoácido para regiões de comparação de seqüência e pela designação dos parâmetros de programa. Ao se usar PILEUP, uma seqüência de referência é comparada com outras seqüências de teste para determinar a relação de identidade de seqüência percentual usando os seguintes parâmetros: peso de lacuna pré-estabelecido (3,00), peso de comprimento de lacuna pré- estabelecido (0,10), e lacunas de extremidade ponderadas. PILEUP pode ser obtido do pacote de programas de computador para análise de seqüência GCG, e.g., versão 7.0 (Devereaux etal, Hue. Acids Res. 12:387-395 (1984).

Outros exemplos de algoritmos que são adequados para determinar identidade de seqüência percentual e a similaridade de seqüência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e tal., Nue. Aeids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403- 410 (1990), respectivamente. Programa de computador para realizar as análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de seqüências de escore alto (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência examinada, que quer combina com quer satisfaz a algum escore T de limite de valor positivo quando alinhadas com uma palavra de mesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. T é chamado de um limite de escore de palavra de vizinhança (Altschul etal., supra). Estes acertos de palavra de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciação de pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-os. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência para que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. Escores cumulativos são calculados usando, para seqüências de nucleotídeos, os parâmetros M (escore de premiação para um par de resíduos de combinação; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos de não-combinação; sempre < 0). Para seqüências de aminoácidos, uma matriz de escore é usada para calcular o escore cumulativo. Extensão dos acertos de palavra em cada direção é parada quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; o escore cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou a extremidade de qualquer seqüência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo W, T, e X de BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) usa como pré-estabelecidos um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usas como pré- estabelecidos um comprimento de palavra de 3, e uma expectativa (E) de 10, e a matriz de escore BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad.. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de

10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas.

Algoritmo BLAST também desempenha uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (veja, e.g., Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medição de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma mais baixa (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma seqüência de referência se a probabilidade de soma mais baixa em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e muito mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001.

COMPOSIÇÕES DE POLINUCLEOTÍDEO

Como aqui usados, os termos "segmento de DNA" e "polinucleotídeo" refere-se a uma molécula de DNA que tem sido isolada livre de DNA genômico total de uma espécie particular. Portanto, um segmento de DNA codificador de um polipeptídeo refere-se a um segmento de DNA que contém uma ou mais seqüências codificadoras que ainda está substancialmente isolado de, ou purificado livre de, DNA genômico total da espécie da qual o segmento de DNA é obtido. Incluídos dentro dos termos "segmento de DNA" e "polinucleotídeo" estão segmentos de DNA e fragmentos menores de tais segmentos, e também vetores recombinantes, incluindo, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, fago, vírus, e semelhantes.

Como será entendido por aqueles pessoas experientes na arte, os segmentos de DNA desta invenção podem incluir seqüências genômicas, seqüências extra-genômicas e plasmídeo-codificadas e segmentos de gene engenhados menores que expressam, ou podem estar adaptados para expressarem, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e semelhantes. Tais segmentos podem ser naturalmente isolados, ou modificados sinteticamente pela mão do homem.

Os termos "isolado", "purificado", ou "biologicamente puro", portanto se referem ao material que está substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como é encontrado em seu estado nativo. Claro que, isto se refere ao segmento de DNA como originalmente isolado, e não exclui outras proteínas, genes, ou regiões codificadoras isoladas(os) mais tarde adicionadas(os) na composição pela mão do homem. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de desempenho alto. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Um ácido nucleico isolado é separado das outras matrizes de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam proteínas diferentes do gene.

Como será reconhecido pelo técnico experiente, polinucleotídeos podem ser de fita única (codificadores ou de anti-senso) ou de fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira de uma- para-uma, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Seqüências codificadoras ou não-codificadoras adicionais podem, mas não necessitam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não necessita estar, ligado em outras moléculas e/ou materiais suporte.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (i.e., uma seqüência endógena que codifica um antígeno de Chlamydia ou uma sua porção) ou podem compreender uma variante, ou um equivalente funcional antigênico ou biológico de uma tal seqüência. Variantes de polinucleotídeo podem conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, como adicionalmente descrito abaixo, preferivelmente de tal modo que a imunogenicidade do polipeptídeo codificado não seja diminuída. O efeito sobre a imunogenicidade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado como aqui descrito. O termo "variantes" também inclui genes homólogos de origem xenogênica.

Em modalidades adicionais, a presente invenção utiliza polinucleotídeos e polipeptídeos isolados compreendendo vários comprimentos de segmentos contíguos de seqüência idêntica ou complementar a uma ou mais das seqüências aqui descritas. Por exemplo, polinucleotídeos que compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos contíguos de uma ou mais das seqüências aqui mostradas bem como todos os comprimentos intermediários entre eles. Será prontamente entendido que "comprimentos intermediários", neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores citado, tais como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluindo todos os números inteiros de um extremo ao outro de 200-500; 500-1.000, e similares.

Os polinucleotídeos, ou seus fragmentos, independente do comprimento da própria seqüência codificadora, podem ser combinados com outras seqüências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição adicionais, múltiplos sítios de clonagem, outros segmentos codificadores, e semelhantes, de tal modo que seu comprimento total possa variar consideravelmente. Portanto é contemplado que um fragmento de ácido nucleico de quase qualquer comprimento pode ser empregado, com o comprimento total preferivelmente sendo limitado pela facilidade de preparação e de uso no protocolo de DNA recombinante intencionado. Por exemplo, segmentos de DNA ilustrativos com comprimentos totais de cerca de 10.000, cerca de 5.000, cerca de 3.000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de bases em comprimento, e semelhantes, (incluindo todos os comprimentos intermediários) são contemplados para serem úteis em muitas implementações.

Além disso, será reconhecido por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte que, como um resultado da degeneração do código genético, há muitas seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo como aqui descrito. Alguns destes polinucleotídeos possuem homologia mínima à seqüência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. Todavia, polinucleotídeos que variam devido às diferenças em uso de códon são especificamente contemplados, por exemplo polinucleotídeos que são otimizados para seleção de códon de primata e/ou de humano. Ademais, alelos de genes compreendendo as seqüências de polinucleotídeo aqui fornecidos também são usados. Alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. A proteína e o mRNA resultantes podem, mas não precisam, ter uma função ou estrutura alterada. Alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de seqüências de banco de dados).

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO

Polinucleotídeos podem ser identificados, preparados e/ou manipulados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser identificado, como descrito com mais detalhe abaixo, por triagem de um microarranjo de cDNAs. Tais triagens podem ser realizadas, por exemplo , usando um microarranjo Synteni (Paio Alto, CA) de acordo com as instruções do fabricante (e essencialmente como descrito por Schena et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:10614-10619 (1996) e Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:2150- 2155 (1997)). Alternativamente, polinucleotídeos podem ser amplificados do cDNA preparados de células expressando as proteínas aqui descritas, tais como células de C. trachomatis. Tais polinucleotídeos podem ser amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR). Para esta abordagem, iniciadores seqüência-específicos podem ser planejados baseados nas seqüências aqui fornecidas, e podem ser comprados ou sintetizados.

Uma porção amplificada de um polinucleotídeo pode ser usada para isolar um gene de comprimento total de uma biblioteca adequada e.g., uma biblioteca de cDNA de C. trachomatis) usando técnicas bem conhecidas. Dentro de tais técnicas, uma biblioteca (cDNA ou genômica) é selecionada usando uma ou mais sondas de polinucleotídeo, ou iniciadores adequados para amplificação. Preferivelmente, uma biblioteca é selecionada por tamanho para incluir moléculas maiores. Bibliotecas de iniciadores aleatórios também podem ser preferidas para identificar regiões 5' e a montante dos genes. Bibliotecas genômicas são preferidas para obter íntrons e estender seqüências 5’.

Para técnicas de hibridização, uma seqüência parcial pode ser marcada (e.g., por nick translation ou marcação de extremidade com 32P) usando técnicas bem conhecidas. Uma biblioteca bacteriana ou bacteriófago é então geralmente selecionada por filtros de hibridização contendo colônias bacterianas desnaturadas (ou camadas contínuas de bactérias contendo placas de fago) com a sonda marcada (veja Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)). Colônias ou placas de hibridização são selecionadas e expandidas, e o DNA é isolado para análise posterior. Clones de cDNA pode ser analisado para determinar a quantidade de seqüência adicional, por exemplo, por PCR usando um iniciador da seqüência parcial e um iniciador do vetor. Mapas de restrição e seqüências parciais podem ser gerados para identificar um ou mais clones sobrepostos. A seqüência completa pode ser então determinada usando técnicas padrão, que podem envolver geração de uma série de clones de deleção. A seqüências sobrepostas resultantes podem ser então montadas em uma única seqüência contígua. Uma molécula de cDNA de comprimento total pode ser gerada por ligação de fragmentos adequados, usando técnicas bem conhecidas.

Alternativamente, há numerosas técnicas de amplificação para obter uma seqüência codificadora de comprimento total de uma seqüência de cDNA parcial. Dentro de tais técnicas, amplificação é geralmente realizada via PCR. Qualquer um de uma variedade de kits comercialmente disponíveis pode ser usado para realizar a etapa de amplificação. Iniciadores podem ser planejados usando, por exemplo, programa de computador bem conhecido na arte. Iniciadores são preferivelmente 22-30 nucleotídeos em comprimento que têm um teor de GC de pelo menos 50% e anelam-se com a seqüência alvo em temperaturas de cerca de 68°C a 72°C. A região amplificada pode ser seqüenciada como descrito acima, e seqüências sobrepostas montadas em uma seqüência contígua.

Uma tal técnica de amplificação é PCR inversa (veja Triglia et al., Nucl. Aeids Res. 16:8186 (1988)), que usa enzimas de restrição para gerar um fragmento na região conhecida do gene. O fragmento é então circulado por ligação intramolecular e usado como um modelo para PCR com iniciadores divergentes derivados da região conhecida. Dentro de uma abordagem alternativa, seqüências adjacentes a uma seqüência parcial podem ser recuperadas por amplificação com um iniciador para uma seqüência linker e um iniciador específico para uma região conhecida. As seqüências amplificadas são tipicamente submetidas a uma segunda rodada de amplificação com o mesmo iniciador linker e um segundo iniciador específico para a região conhecida. Uma variação sobre este procedimento, que emprega dois iniciadores que iniciam a extensão em direções opostas da seqüência conhecida, é descrita em WO 96/38591. Outra tal técnica é conhecida como "amplificação rápida de extremidades de cDNA" ou RACE. Esta técnica envolve o uso de um iniciador interno e um iniciador externo, que hibridiza em uma região de poliA ou seqüência de vetor, para identificar as seqüências que são 5' 3' de uma seqüência conhecida. Técnicas adicionais incluem PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) e PCR caminhante (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). Outros métodos empregando amplificação também podem ser empregados para obter uma seqüência de cDNA de comprimento total.

Em certas situações, é possível obter uma seqüência de cDNA de comprimento total por análise de seqüências fornecidas em um banco de dados de etiqueta de seqüência expressada (EST), tal como aquele disponível no GenBank. Pesquisas para ESRs sobrepostas podem geralmente ser realizadas usando programas bem conhecidos (e.g., pesquisas NCBI BLAST), e tais ESTs podem ser usadas para gerar uma seqüência de comprimento total contígua. Seqüências de DNA de comprimento total também podem ser obtidas por análise de fragmentos genômicos.

EXPRESSÃO DE POLINUCLEOTÍDEO EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Seqüências de polinucleotídeo ou seus fragmentos que codificam polipeptídeos, ou proteínas de fusão ou seus equivalentes funcionais, podem ser usadas em moléculas de DNA recombinante para dirigir a expressão de um polipeptídeo em células hospedeiras apropriadas. Devido à degeneração inerente do código genético, outras seqüências de DNA que codificam substancialmente a mesma ou uma seqüência de aminoácidos substancialmente equivalente podem ser produzidas e estas seqüências podem ser usadas para clonar e expressar um dado polipeptídeo.

Como será entendido por aqueles pessoas experientes na arte, pode ser vantajoso em algumas situações produzir seqüências de nucleotídeos codificadoras de polipeptídeo possuindo códons não-naturalmente ocorrentes. Por exemplo, códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular podem ser selecionados para aumentar a velocidade de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de RNA recombinante tendo propriedades desejadas, tal como uma meia-vida mais longa do que aquela de um transcrito gerado da seqüência naturalmente ocorrente.

Além disso, as seqüências de polinucleotídeo podem ser engenhadas usando métodos geralmente conhecidos na arte com o propósito de alterar as seqüências codificadoras de polipeptídeo por uma variedade de razões, incluindo mas não limitadas a, alterações que modificam a clonagem, o processamento, e/ou a expressão do produto de gene. Por exemplo, rearranjo de DNA por fragmentação aleatória e remontagem por PCR dos fragmentos de gene e oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados para engenhar as seqüências de nucleotídeos. Em adição, mutagênese sítio- direcionada pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, mudar preferência de códon, produzir variantes de editoração, ou introduzir mutações, e assim por diante.

Seqüências de ácido nucleico naturais, modificadas, ou recombinantes podem ser ligadas em uma seqüência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para selecionar bibliotecas de peptídeos para inibidores de atividade de polipeptídeo, pode ser útil codificar uma proteína quimérica que pode ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser engenhada para conter um sítio de clivagem localizado entre a seqüência codificadora de polipeptídeo e a seqüência de proteína heteróloga, de modo que o polipeptídeo possa ser clivado e purificado do grupo heterólogo. Com o objetivo de expressar um polipeptídeo desejado, as seqüências de nucleotídeos codificadoras de polipeptídeo, ou equivalentes funcionais, podem ser inseridas em um vetor de expressão apropriado , i.e., um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e a tradução da seqüência codificadora inserida. Métodos que são bem conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte podem ser usados para construir vetores de expressão contendo seqüências codificadoras de um polipeptídeo de interesse e elementos de controle de transcrição e de tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntese, e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).

Pode ser usada uma variedade de sistemas de hospedeiro / vetor de expressão para conter e expressar seqüências de polinucleotídeo. Estes incluem, mas não são limitados a, microorganismos tais como bactérias transformadas com vetores de expressão recombinante de DNA cosmídeo, plasmídeo ou bacteriófago; leveduras transformadas com vetores de expressão em levedura; sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão de vírus (e.g., baculovírus); sistemas de célula de planta transformados com vetores de expressão de vírus s (e.g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacteriana (e.g., plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de célula de animal.

Os "elementos de controle" ou "seqüências regulatórias" presentes em um vetor de expressão são aquelas regiões não traduzidas dos intensificadores de vetor, promotores, regiões não traduzidas 5' e 3' que interagem com proteínas de célula hospedeira para realizar transcrição e tradução. Tais elementos podem variar em suas força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e do hospedeiro utilizado, pode ser usado qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis. Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, promotores induzíveis tal como o promotor híbrido IacZ do fagomídeo PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) ou plasmídeo PSPORTI (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e semelhantes pode ser usado. Em sistemas de célula de mamífero, promotores de genes de mamífero ou de vírus de mamífero são geralmente preferidos. Se for necessário gerar uma linhagem celular que contém cópias múltiplas da seqüência codificadora de um polipeptídeo, vetores baseados em SV40 ou EBV podem ser vantajosamente usados com um marcador selecionável apropriado.

Em sistemas bacterianos, numerosos vetores de expressão podem ser selecionados dependendo do uso intencionado para o polipeptídeo expressado. Por exemplo, quando quantidades grandes são necessárias, por exemplo para a indução de anticorpos, vetores que dirigem expressão em nível alto de proteínas de fusão que são prontamente purificadas podem ser usados. Tais vetores incluem, mas não são limitados a, vetores de expressão e de clonagem de E. coli multifuncionais tais como BLUESCRIPT (Stratagene), nos quais a seqüência codificadora do polipeptídeo de interesse pode estar ligada no vetor em matriz com seqüências para Met amino- terminal e subseqüentes 7 resíduos de β-galactosidase de modo que uma proteína híbrida seja produzida; vetores pIN (Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX (Promega, Madison, Wis.) também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas por adsorção em glóbulos de glutationa-agarose seguida pela eluição na presença de glutationa livre. Proteínas preparadas em tais sistemas podem ser planejadas para incluírem sítios de clivagem de heparina, trombina, ou fator XA protease de modo que o polipeptídeo clonado de interesse possa ser liberado do grupo GST à vontade.

Na levedura, Saccharomyces eerevisiae, numerosos vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator alfa, álcool oxidase, e PGH podem ser usados. Outros vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis incluem GAP, PGK, GAL e ADH. Para revisões, veja Ausubel et al. (supra), Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987) e Romas et al. Yeast 8 423-88 (1992).

Em casos onde vetores de expressão em planta são usados, a expressão de seqüências codificadoras de polipeptídeos pode ser conduzida por qualquer um de numerosos promotores. Por exemplo, promotores virais tais como os promotores 35S e 19S de CaMV podem ser usados sozinhos ou em combinação com a seqüência líder ômega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, promotores de planta tais como a subunidade pequena de RUBISCO ou promotores de choque calorífico podem ser usados (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); e Wintered et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estes construtos podem ser introduzidos em células de planta por transformação de DNA direta ou transfecção mediada por patógeno. Tais técnicas são descritas em numerosas revisões geralmente disponíveis (veja, e.g., Hobbs em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992)).

Um sistema de inseto também pode ser usado para expressar um polipeptídeo de interesse. Por exemplo, em um tal sistema, vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda em Trichoplusia larvae. As seqüências codificadoras do polipeptídeo podem ser clonadas em uma região não-essencial do vírus, tais como o gene de poliedrina, e postas sob o controle do promotor de poliedrina. Inserção bem sucedida da seqüência codificadora de polipeptídeo tomará o gene de poliedrina inativo e produzirá proteína de capa faltante de vírus recombinante. Os vírus recombinantes podem ser então usados para infectar, por exemplo, células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae nas quais o polipeptídeo de interesse pode ser expressado (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91:3224-3227(1994)).

Em células hospedeiras de mamífero, numerosos sistemas de expressão baseados em vírus estão geralmente disponíveis. Por exemplo, em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, seqüências codificadoras de um polipeptídeo de interesse podem ser ligadas em um complexo de transcrição / tradução de adenovírus consistindo do promotor tardio e da seqüência líder tripartida. Inserção em uma região El ou E3 não essencial do genoma viral pode ser usada para obter um vírus viável que é capaz de expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectadas (Logan

& Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Em adição, intensificadores de transcrição, tal como o intensificador de sarcoma de Rous (RSV), podem ser usados para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamífero.

Sinais de iniciação específicos também podem ser usados para realizar tradução mais eficiente de seqüências codificadoras de um polipeptídeo de interesse. Tais sinais incluem o códon de iniciação ATG e as seqüências adjacentes. Em casos onde seqüências codificadoras de polipeptídeo, seu códon de iniciação, e seqüências a montante são inseridas no vetor de expressão apropriado, não são necessários sinais de controle de transcrição ou de tradução adicionais. Contudo, em casos onde apenas seqüência codificadora, ou uma sua porção, é inserida, sinais de controle de tradução exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser proporcionados. Ademais, o códon de iniciação deve estar na matriz de leitura correta para garantir tradução do inserto inteiro. Códons de iniciação e elementos de tradução exógenos podem ser de várias origens, tanto natural quanto sintética. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de intensificadores que são apropriados para o sistema celular particular que é usado, tais como aqueles descritos na literatura (Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162(1994)).

Em adição, uma cepa de célula hospedeira podem ser escolhida por sua capacidade de modular a expressão das seqüências de interesse ou para processar a proteína expressada no modo desejado. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não são limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação, e acilação. Processamento de pós-tradução que cliva uma forma "prepro" da proteína também pode ser usado para facilitar a inserção, o dobramento e/ou a função corretas(os). Células hospedeiras diferentes tais como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, e WI38, que têm maquinário celular específico e mecanismos característicos para tais atividades de pós-tradução, podem ser escolhidas para garantir a modificação correta e o processamento correto da proteína.

Para produção de rendimento alto, e duração longa de proteínas recombinantes, expressão estável é geralmente preferida. Por exemplo, linhagens de célula que estavelmente expressam um polinucleotídeo de interesse que podem ser transformadas usando vetores de expressão que podem conter origens virais de elementos de expressão endógenos e/ou de replicação e um gene marcador selecionável no mesmo vetor ou em um vetor separado. Após a introdução do vetor, as células podem ser permitidas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes de serem mudadas para meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e a recuperação de células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Numerosos sistemas de seleção podem ser usados para recuperar linhagens de célula transformadas. Estes incluem, mas não são limitadas, aos genes de timidina quinase do vírus do herpes simples (Wigler et al., Cell 11:223-32 (1977)) e de adenina fosfo-ribosil-transferase (Lowy et al., Cell 22:817-23 (1990)) que podem ser empregados em células tk.sup. ou aprt.sup., respectivamente. Também, resistência a herbicida, antibiótico ou anti-metabólito pode ser usada como a base para a seleção; por exemplo, dhfr que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confere resistência a amino-glicosídeos, neomicina e G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); e ais ou pat, que confere resistência a clorsulfurona e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Genes selecionáveis adicionais têm sido descritos, por exemplo, trpB, que permite que células utilizem indol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite que células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). Recentemente, o uso de marcadores visíveis tem ganho popularidade com tais marcadores como antocianinas, p- glicuronidase e seu substrato GUS, e luciferase e seu substrato luciferina, sendo amplamente usados não apenas para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transiente ou estável atribuível a um sistema de vetor específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

Embora a presença/ausência de expressão de gene marcador sugere que o gene de interesse também está presente, sua presença e expressão pode necessitar ser confirmada.. Por exemplo, se a seqüência codificadora de um polipeptídeo é inserida dentro de uma seqüência de gene marcador, células recombinantes contendo seqüências podem ser identificadas pela ausência de função de gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser posicionado em tandem com uma seqüência codificadora de polipeptídeo sob o controle de um promotor único. Expressão do gene marcador em resposta à indução ou seleção normalmente também indica a expressão do gene em tandem.

Alternativamente, células hospedeiras que contêm e expressam uma seqüência de polinucleotídeo desejada podem ser identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte. Estes procedimento incluem, mas não são limitados a, técnicas de hibridizações de DNA-DNA ou DNA-RNA e de imunoensaio ou bioensaio de proteína que incluem tecnologias baseadas em membrana, solução ou chip para a detecção e/ou quantificação de ácido nucleico ou proteína.

Vários protocolos para detectar e medir a expressão de produtos codificados por polinucleotídeo, usando anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para o produto são conhecidos na arte. Exemplos incluem ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Um imunoensaio monoclonal-baseado, de dois sítios utilizando anticorpos monoclonais reativos aos dois epítopos não-interferentes em um dado polipeptídeo podem ser preferidos para algumas aplicações, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser empregado. Estes e outros ensaios são descritos, dentre outros locais, em Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) e Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211- 1216(1983).

Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida por aqueles pessoas experientes na arte e pode ser usada em vários ensaios de ácido nucleico e aminoácido. Meio para produzir sondas de PCR ou hibridização marcada para detectar seqüências relacionadas com polinucleotídeos incluem oligomarcação, nick translation, marcação de extremidade ou amplificação por PCR usando um nucleotídeo realizado. Alternativamente, as seqüências, ou quaisquer suas porções podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na arte, estão comercialmente disponíveis, e podem ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro pela adição de uma RNA polimerase apropriada tal como T7, T3, ou SP6 e nucleotídeos marcados. Estes 5 procedimentos podem ser conduzidos usando uma variedade de kits comercialmente disponíveis. Marcadores ou moléculas repórteres adequados(as), que podem ser usados incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, ou agentes cromogênicos bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e 10 semelhantes.

Células hospedeiras transformadas com uma seqüência de polinucleotídeo de interesse podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e a recuperação da proteína da cultura de célula. A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser secretada ou contida 15 intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usada(o). Como será entendido por aqueles pessoas experientes na arte, vetores de expressão contendo polinucleotídeos da invenção podem ser planejados para conterem seqüências de sinal que dirigem a secreção do polipeptídeo codificado através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica. Outras construções 20 recombinantes podem ser usadas para unir seqüências codificadoras de um polipeptídeo de interesse na seqüência de nucleotídeos codificadora de um domínio de polipeptídeo que facilitará a purificação de proteínas solúveis. Tais domínios facilitadores de purificação incluem, mas não são limitados a, peptídeos quelantes de metal tais como módulos de histidina-triptofano que 25 permitem a purificação sobre metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado em sistema de purificação por afinidade / extensão FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). A inclusão das seqüências linker cliváveis tais como aquelas específicas para Fator XA ou enteroquinase (Invitrogen. San Diego, Calif.) entre o domínio de purificação e o polipeptídeo codificado pode ser usada para facilitar a purificação. Um tal vetor de expressão proporciona expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo de interesse e um ácido nucleico codificado de 6 resíduos de histidina precedendo um sítio de clivagem de enteroquinase ou tioredoxina. Os resíduos de histidina facilitam a purificação em uma IMIAC (cromatografia por afinidade de íon metal imobilizado) como descrito em Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992) enquanto que o sítio de clivagem de enteroquinase proporciona um meio para purificar o polipeptídeo desejado da proteína de fusão. Uma discussão de vetores que contêm proteínas de fusão é proporcionada em Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993)). TÉCNICAS DE LIBERAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO IN VIVO

Em modalidades adicionais, construtos genéticos compreendendo polinucleotídeos são introduzidos em células in vivo. Isto pode ser realizado usando qualquer uma de uma variedade de abordagens bem conhecidas, várias das quais são esboçadas abaixo para o propósito de ilustração.

1. Adenovírus

Um dos métodos preferidos para liberação in vivo de uma ou mais seqüências de ácido nucleico envolve o uso de um vetor de expressão de adenovírus. "Vetor de expressão de adenovírus" significa que inclui aqueles construtos contendo seqüências de adenovírus suficientes para (a) suportar o empacotamento do construto e (b) expressar um polinucleotídeo que tem sido clonado no mesmo em uma orientação de senso ou de anti-senso. Claro que no contexto de um construto de anti-senso, expressão não exige que o produto de gene seja sintetizado.

O vetor de expressão compreende uma forma geneticamente engenhada de um adenovírus. Conhecimento da organização genética de adenovírus, um vírus de DNA de fita dupla, linear, de 36 kb, permite substituição de pedaços grandes de DNA viral por seqüências estranhas de até 7 kb (Grunhaus & Horwitz, 1992). Em contraste ao retrovírus, a infecção adenoviral de células hospedeiras não resulta em integração cromossômica porque o DNA adenoviral DNA pode se replicar em uma maneira epissomal sem genotoxicidade potencial. Também, adenovírus são estruturalmente estáveis, e nenhum rearranjo de genoma tem sido detectado após amplificação extensiva. Adenovírus pode infectar virtualmente todas as células epiteliais independente de seu estágio de ciclo celular. Até agora, infecção adenoviral parece estar ligada apenas à doença branda tal como doença respiratória aguda em humanos.

Adenovírus é particularmente adequado para uso como um vetor de transferência de gene por causa de seu genoma de tamanho médio, facilidade de manipulação, título alto, variedade ampla de células alvo, e infectividade alta. Ambas as extremidade de genoma viral contêm 100-200 repetições invertidas de pares de bases (ITRs), que são elementos cis necessários para empacotamento e replicação de DNA viral. As regiões precoce (E) e tardia (L) do genoma contêm unidades de transcrição diferentes que são divididas pelo início da replicação de DNA viral. A região El (ElA e ElB) codifica proteínas responsáveis pela regulação de transcrição do genoma viral e uns poucos genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para replicação de DNA viral. Estas proteínas estão envolvidas em replicação de DNA, expressão de gene tardio e desligamento de célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genes tardios, incluindo as proteínas de capsídeo viral, são expressados apenas após processamento significativo de um único transcrito primário emitido pelo promotor tardio maior (MLP). O MLP, (localizado em 16,8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia de infecção, e todos os mRNA's emitidos por este promotor possuem uma seqüência líder tripartida (TPL) que os toma mRNA's preferidos para tradução. Em um sistema corrente, adenovírus recombinante é gerado de recombinação homóloga entre vetor bifuncional e vetor de provírus. Devido à recombinação possível entre dois vetores provirais, adenovírus de tipo selvagem pode ser gerado deste processo. Portanto, é crítico isolar um clone único do vírus de um placa individual e examinar sua estrutura genômica.

Geração e propagação dos vetores de adenovírus correntes, que são deficientes em replicação, dependem de uma linhagem de célula auxiliar única, chamada de 293, que foi transformada de células de rim embriônico de humano por fragmentos de Ad5 DNA e constitutivamente expressa proteínas El (Graham et al., 1977). Visto que a região E3 é dispensável do genoma de adenovírus (Jones & Shenk, 1978), os vetores de adenovírus correntes, com o auxílio de células 293, trazem DNA estranho em qualquer uma das regiões E1, a D3 ou ambas as regiões (Graham & Prevec, 1991). Em natureza, adenovírus pode empacotar aproximadamente 105% do genoma de tipo selvagem (Ghosh-Choudhury et al., 1987), proporcionando capacidade para cerca de 2 extra kB de DNA. Combinado com o aproximadamente 5,5 kB de DNA que é substituível nas regiões El e E3, a capacidade máxima do vetor de adenovírus corrente está abaixo de 7,5 kB, ou cerca de 15% do comprimento total do vetor. Mais do que 80% do genoma viral de adenovírus permanece na estrutura principal de vetor e é a fonte da citotoxicidade proveniente do vetor. Também, a deficiência de replicação do vírus El-deletado é incompleta. Por exemplo, vazamento de expressão de gene viral tem sido observado com os vetores correntemente disponíveis em multiplicidades altas de infecção (MOI) (Mulligan, 1993).

Linhagens de célula auxiliar podem ser derivadas de células de humano tais como células de rim embriônico de humano, células de músculo, células hematopoiéticas ou outras células epiteliais ou mesenquimais embriônicas de humano. Alternativamente, as células auxiliares podem ser derivadas das células de outras espécies de mamífero que são permissivas para adenovírus de humano. Tais células incluem, e.g., células Vero ou outras células epiteliais ou mesenquimais embriônicas de macaco. Como declarado acima, a linhagem de célula auxiliar correntemente preferida é 293.

Recentemente, Racher et al. (1995) mostrou métodos aperfeiçoados para cultivar células 293 e propagar adenovírus. Em um formato, agregados de células naturais são crescidos por inoculação de células individuais em frascos spinner siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) contendo 100-200 ml de meio. Após agitação a 40 rpm, a visibilidade das células é estimada com azul de tripano. Em outro formado, microssuportes Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) são empregados como segue. Um inóculo de célula, ressuspenso em 5 ml de meio, é adicionado no suporte (50 ml) em um frasco Erlenmeyer de 250 ml e deixado estacionário, com agitação ocasional, por 1 a 4 h. O meio é então substituído por 50 ml de meio fresco e agitação é iniciada. Para produção viral, células são permitidas crescerem a cerca de 80% de confluência, após cujo tempo o meio é substituído (em 25% do volume final) e adenovírus é adicionado em um MOI de 0,05. Culturas são deixadas estacionárias durante a noite, após o qual o volume é aumentado para 100% e agitação é começada por outras 72 h.

Diferente da exigência que o vetor de adenovírus é defectivo em replicação, ou pelo menos condicionalmente defectivo, a natureza do vetor de adenovírus não é crida em ser crucial para a prática bem sucedida da invenção. O adenovírus pode ser de qualquer um dos 42 diferentes sorotipos ou subgrupos A-F conhecidos. Adenovírus de tipo 5 de subgrupo C é o material inicial preferido com o propósito de obter um vetor de adenovírus replicação-defectivo condicional para uso na presente invenção, porque Adenovírus de tipo 5 é um adenovírus de humano sobre o qual é conhecida muita informação bioquímica e genética, e tem sido historicamente usado na maioria das construções empregando adenovírus como um vetor. Como declarado acima, o vetor típico de acordo com a presente invenção é defectivo em replicação e não terá uma região El de adenovírus. Assim, será mais conveniente introduzir o polinucleotídeo codificador do gene de interesse na posição cujas seqüências codificadoras de El têm sido removidas. Contudo, a posição de inserção do construto dentro das seqüências de adenovírus não é crítica para a invenção. O polinucleotídeo codificador do gene de interesse também pode ser inserido no lugar de região E3 deletada em vetores de reposição de E3 como descrito por Karlsson et al.

(1986) ou na região E4 onde uma linhagem de célula auxiliar ou vírus auxiliar complementa o defeito E4.

Adenovírus é fácil de crescer e manipular e exibe ampla variedade de hospedeiros in vitro e in vivo. Este grupo de vírus pode ser obtido em títulos altos, e.g., IO9-IOli unidades formadoras de placa por ml, e são elevadamente infecciosos. O ciclo de vida de adenovírus não exige integração no genoma da célula hospedeira. Os genes estranhos liberados pelos vetores de adenovírus são epissomais e, portanto, têm genotoxicidade baixa para células hospedeiras. Nenhuns efeitos colaterais têm sido relatados em estudos de vacinação com adenovírus de tipo selvagem (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), demonstrando sua segurança e seu potencial terapêutico como vetores de transferência de gene in vivo.

Vetores de adenovírus têm sido usados em expressão de gene eucariótico (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) e desenvolvimento de vacina (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Recentemente, estudos em animal sugerem que adenovírus recombinante poderia ser usado em terapia de gene (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Estudos em administração de adenovírus recombinante em tecidos diferentes incluem instilação de traquéia (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), injeção em músculo (Ragot et al., 1993), injeções intravenosas periféricas (Herz & Gerard, 1993) e inoculação estereotática no cérebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

2. RETROVÍRUS

Os retrovírus são um grupo de vírus de RNA de fita única caracterizados por uma capacidade para converter seu RNA em DNA de fita dupla em células infectadas por um processo de transcrição reversa (Coffin, 1990). DNA resultante então estavelmente integra em cromossomos celulares como um provírus e dirige a síntese de proteínas virais. A integração resulta na retenção das seqüências de gene viral na célula recipiente e em seus descendentes. O genoma retroviral contém três genes, gag, pol, e em que codificam as proteínas de capsídeo, enzima polimerase, e componentes de envelope, respectivamente. Uma seqüência verificada a montante do gene gag contém um sinal para empacotamento do genoma em virions. Duas seqüências de repetição terminais longas (LTR) estão presentes nas extremidades 5' e 3' do genoma viral. Estes contêm seqüências de intensificador e de promotor longas e também são exigidos para integração no genoma de célula hospedeira (Coffin, 1990).

Com o propósito de construir um vetor retroviral, um ácido nucleico codificador de uma ou mais seqüências de oligonucleotídeo ou de 20 polinucleotídeo de interesse é inserido no genoma viral no lugar de certas seqüências virais para produzir um vírus que é defectivo em replicação. Com o propósito de produzir virions, é construída uma linhagem celular de empacotamento contendo os genes gag, pol, e mas sem os componentes de empacotamento e LTR (Mann et al., 1983). Quando um plasmídeo 25 recombinante contendo um cDNA, junto com as seqüências de empacotamento e LTR retrovirais é introduzido nesta linhagem celular (por precipitação em fosfato de cálcio, por exemplo), a seqüência de empacotamento permite que o transcrito de RNA do plasmídeo recombinante seja empacotado nas partículas virais, que são então secretadas para dentro do meio de cultura (Nicolas & Rubenstein, 1988;Temin, 1986; Mannefa et al., 1983). O meio contendo os retrovírus recombinantes é então colhido, opcionalmente concentrado, e usado para transferência de gene. Vetores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de célula. Contudo, integração e expressão estável exigem a divisão das células hospedeiras (Paskind et al., 1975).

Uma abordagem nova planejada para permitir seleção específica de vetores de retrovírus foi recentemente desenvolvida baseada na modificação química de um retrovírus pela adição química de resíduos de lactose no envelope viral. Esta modificação poderia permitir a infecção específica de hepatócitos via receptores de sialoglicoproteína.

Uma abordagem diferente para seleção de retrovírus recombinantes foi planejada na qual anticorpos biotinilados contra uma proteína de envelope retroviral envelope e contra um receptor de célula específico foram usados. Os anticorpos foram copulados via os componentes de biotina pelo uso de estreptavidina (Roux et al., 1989). Pelo uso anticorpos contra antígenos de complexo de histocompatibilidade de classe I e de classe

II, demonstraram a infecção de uma variedade de células de humano que conduziram aqueles antígenos de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

3. VírusAdeno-Associados

AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) é um parvovírus, descoberto como uma contaminação de estoques adenovirais. É um vírus ubíquo (anticorpos estão presentes em 85% da população humana dos E.U.A.) que não tem sido ligado em qualquer doença. Também é classificado como um dependovírus, porque sua replicação é dependente da presença de um vírus auxiliar, tal como adenovírus. Cinco sorotipos têm sido isolados, dos quais AAV-2 é o melhor caracterizado. AAV tem um DNA de fita única linear que está encapsidado em proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3 para formar um virion icosaédrico de 20 nm a 24 nm em diâmetro (Muzyczka & McLaughlin, 1988).

O DNA de AAV é de aproximadamente 4,7 quilobases de comprimento. Contém duas matrizes de leitura aberta e é flanqueado por dois ITRs. Há dois genes maiores no genoma de AAV: rep e cap. O gene rep codifica as proteínas responsáveis por replicações virais, enquanto que o gene cap codifica a proteína de capsídeo VP1-3. Cada ITR forma uma estrutura de grampo-de-cabelo de forma-T. Estas repetições terminais são os componentes cis apenas essenciais do AAV para integração cromossômica. Portanto, o AAV pode ser usado como um vetor com todas as seqüências codificadoras virais removidas e substituídas pelo cassete de genes para liberação. Estes promotores virais têm sido identificados e chamados de p5, pl9, e p40, de acordo com sua posição em mapa. Transcrição de p5 e pl9 resulta em produção de proteínas rep, e transcrição de p40 produz as proteínas de capsídeo (Hermonat & Muzyczka, 1984).

Há vários fatores que motivaram os pesquisadores para estudar a possibilidade de uso de rAAV como um vetor de expressão. Um é que as exigências para liberação de um gene para integrar no cromossomo do hospedeiro são surpreendentemente poucas. E necessário ter as ITRs de 145- pb, que são apenas 6% do genoma de AAV. Isto deixa espaço no vetor para montar uma inserção de DNA de 4,5-kb. Embora esta capacidade de transporte possa evitar que o AAV libere genes grandes, é amplamente adequada para liberar construtos de anti-senso.

AAV também é uma escolha boa de veículos de liberação devido à sua segurança. Há um mecanismo de resgate relativamente complicado: não apenas o adenovírus de tipo selvagem mas também os genes de AAV são exigidos para mobilizar rAAV. Igualmente, AAV não é patogênico e não está associado com qualquer doença. A remoção de seqüências codificadoras virais minimiza reações imunes à expressão do gene viral, e portanto, rAAV não evoca uma resposta inflamatória. 4. Outros vetores virais como construtos de expressão

Outros vetores virais podem ser empregados como construtos de expressão na presente invenção para a liberação das seqüências de oligonucleotídeo ou de polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Vetores derivados de vírus tais como vírus da vacínia (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), lentivírus, poliovírus e vírus do herpes podem ser empregados. Outros vetores derivados de vírus de pústula, tais como vetores derivados de epitelioma contagioso, também podem ser esperados para uso. Oferecem várias características atrativas para várias células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Com o reconhecimento recente de vírus de hepatite B defectivo, novo entendimento foi ganho na relação entre estrutura e função de seqüências virais diferentes. Estudos in vitro mostraram que o vírus podia manter capacidade para transcrição reversa e empacotamento dependente de auxiliar e a despeito da deleção de até 80% de seu genoma (Horwich et al., 1990). Isto sugeriu que porções grandes do genoma puderam ser substituídas com material genético estranho. O hepatotropismo e a persistência (integração) foram propriedades particularmente atrativas para transferência de gene fígado-direcionada. Chang et al. (1991) introduziu o gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT) no genoma do vírus de hepatite B de pato no lugar das seqüências codificadoras de polimerase, superfície, e pré- superfície. Foi co-transfectado com vírus de tipo selvagem na linhagem de célula de hepatoma de ave. Meios de cultura contendo títulos altos do vírus recombinante foram usados para infectar hepatócitos de patos novos primários. Expressão de gene CAT estável foi detectada por pelo menos 24 dias após transfecção (Changed al., 1991).

Vetores 'virais' adicionais incluem partículas semelhantes a vírus (VLPs) e fagos. 5. Vetores Não-virais Com o propósito de efetuar a expressão das seqüências de oligonucleotídeo e polinucleotídeo η, o construto de expressão precisa ser liberado para dentro de uma célula. Esta liberação pode ser realizada in vitro, como em procedimentos de laboratório para transformar linhagens de células, ou in vivo ou ex vivo, como no tratamento de certos estados doentios. Como descrito acima, um mecanismo preferido para liberação é via infecção viral onde o construto de expressão é encapsulado em uma partícula viral infecciosa.

Uma vez tendo sido liberado o construto de expressão para dentro da célula o ácido nucleico codificador das seqüências de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo desejadas pode ser posicionado e expressado em sítios diferentes. Em certas modalidades, o ácido nucleico codificador do construto pode ser estavelmente integrado no genoma da célula. Esta integração pode estar na localização e na orientação específicas via recombinação homóloga (substituição de gene) ou pode ser integrada em uma localização aleatória, não-específica (aumento de gene). Em ainda outras modalidades, o ácido nucleico pode ser estavelmente mantido na célula como um segmento de DNA epissomal, separado. Tais segmentos de ácido nucleico "epissomos" codificam seqüências suficientes para permitir manutenção e replicação independente de ou em sincronização com o ciclo de célula hospedeira. Como o construto de construção é liberado para uma célula e onde na célula o ácido nucleico permanece é dependente do tipo de construto de expressão empregado.

Em certas modalidades, o construto de expressão compreendendo uma ou mais seqüências de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo modem simplesmente consistir de plasmídeos ou DNA recombinantes nus. Transferência do construto pode ser realizada por qualquer um dos métodos mencionados acima que física ou quimicamente permeiam a membrana celular. Isto é particularmente aplicável para transferência in vitro mas também pode ser aplicado em uso in vivo. Dubensky et al (1984) injetou com sucesso DNA de poliomavírus na forma de precipitados de fosfato de cálcio em fígado e baço de camundongos recém- nascidos e adultos demonstrando replicação viral ativa e infecção aguda. Benvenisty & Reshef (1986) também demonstraram que injeção intraperitoneal direta de plasmídeos precipitados por fosfato de cálcio resulta em expressão dos genes transfectados. E planejado que DNA codificador de um gene de interesse também pode ser transferido em uma maneira similar in vivo e expressar o produto de gene.

Outra modalidade da invenção para transferir um construto de expressão de DNA nu para dentro de células pode envolver bombardeio de partículas. Este método depende da capacidade para acelerar microprojéteis revestidos com DNA para uma velocidade alta permitindo que perfurem as membranas celulares e entrem nas células sem matá-las (Klein et al, 1987). Vários dispositivos para acelerar partículas pequenas têm sido desenvolvidos. Um tal dispositivo baseia-se em uma descarga de voltagem alta para gerar uma corrente elétrica, que por sua vez proporciona a força motriz. (Yang et al, 1990). Os microprojéteis usados têm consistido de substâncias biologicamente inertes tais como glóbulos de ouro ou de tungstênio.

Órgãos selecionados incluindo o fígado, a pele, e o tecido muscular de ratos e camundongos têm sido bombardeados in vivo (Yang et al, 1990; Zelenin et al, 1991). Isto pode exigir exposição cirúrgica do tecido ou das células, para eliminar qualquer tecido interposto entre o canhão e o órgão alvo, i.e., tratamento ex vivo. De novo, DNA codificador de um gene particular pode ser liberado via este método e ainda ser incorporado. COMPOSIÇÕES DE POLIPEPTÍDEO

Geralmente, uma composição de polipeptídeo será uma combinação de polipeptídeos ou seus fragmentos imunogênicos isolados. Alternativamente, alguns dos ou todos os antígenos de polipeptídeo em uma composição da invenção podem estar dentro de uma proteína de fusão. Por exemplo, em uma composição da invenção compreendendo três antígenos: (i) os antígenos podem ser proporcionados na forma de três polipeptídeos isolados (ii) todos os antígenos de polipeptídeos podem ser proporcionados em uma única proteína de fusão (iii) dois dos antígenos podem ser proporcionados em uma proteína de fusão, com o terceiro proporcionado em forma isolada. As proteínas / os polipeptídeos da combinação podem ser codificados por uma seqüência ou seqüências de polinucleotídeo aqui mostrada(s) que hibridizam sob condições moderadamente estringentes em uma seqüência ou seqüências de polinucleotídeo aqui mostradas. Alternativamente, as proteínas / os polipeptídeos podem ser definidos como polipeptídeos cada um compreendendo uma seqüência de aminoácidos contígua de uma seqüência de aminoácidos aqui mostrada (i.e. um fragmento imunogênico de uma seqüência aqui mostrada), ou cujas proteínas / cujos polipeptídeos compreendem, cada um(a), uma seqüência de aminoácidos inteira aqui mostrada.

Porções imunogênicas podem geralmente ser identificadas usando técnicas bem conhecidas, tais como aquelas resumidas em Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (1993) e as referências da mesma. Tais técnicas incluem seleção de polipeptídeos para a capacidade de reagir com clones, linhagens de célula-T e/ou anticorpos ou anti-soros específicos para antígeno. Como aqui usado, anti-soros ou anticorpos são "específicos para antígeno" se especificamente se ligam em um antígeno (i.e., reagem com a proteína em um ELISA ou outro imunoensaio, e não reagem detectavelmente com proteínas não relacionadas). Tais anti-soros e anticorpos podem ser preparados como aqui descrito, e usando técnicas bem conhecidas. Uma porção imunogênica de uma proteína de Chlamydia sp. é uma porção que reage com tais anti-soros e/ou células-T em um nível que não é substancialmente menor do que a reatividade do polipeptídeo de comprimento total (e.g., em um ELISA e/ou ensaio de reatividade de célula-T). Tal porções imunogênicas podem reagir dentro de tais ensaios em um nível que é similar a ou maior do que a reatividade do polipeptídeo de comprimento total. Tais 5 seleções podem ser geralmente realizadas usando métodos bem conhecidos por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte, tais como aquelas descritas em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988). Por exemplo, um polipeptídeo pode estar imobilizado sobre um suporte sólido e contatado com soros do paciente para permitir ligação de anticorpos dentro 10 dos soros no polipeptídeo imobilizado. Soros não ligados podem ser então removidos e ligados e anticorpos ligados detectados usando, por exemplo, Proteína A marcada com I.

Polipeptídeos podem ser preparados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas. Polipeptídeos recombinantes 15 codificados pelas seqüências de DNA como descritas acima podem ser prontamente preparados a partir das seqüências de DNA usando qualquer um de uma variedade de vetores de expressão conhecidos por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte. Expressão pode ser realizada em qualquer célula hospedeira apropriada que tem sido transformada com um vetor de 20 expressão contendo uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante. Células hospedeiras adequadas incluem procariotos, levedura, e células eucarióticas superiores, tais como células de mamífero e células de planta. Preferivelmente, as células hospedeiras empregadas são E. coli, levedura ou uma linhagem de célula de mamífero tal como COS ou CHO. 25 Sobrenadantes de sistemas de vetor / hospedeiro adequados que secretam polipeptídeo ou proteína recombinante para dentro do meio de cultura podem ser primeiro concentrados usando um filtro comercialmente disponível. Após concentração, o concentrado pode ser aplicado em uma matriz de purificação adequada tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iônica. Finalmente, uma ou mais etapas de HPLC de fase reversa podem ser empregadas para adicionalmente purificar um polipeptídeo recombinante.

Polipeptídeos, seus fragmentos imunogênicos que podem ter por exemplo menos do que cerca de 100 aminoácidos, ou menos do que cerca de 50 aminoácidos, também podem ser gerados por meios sintéticos, usando técnicas bem conhecidas por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte. Por exemplo, tais polipeptídeos podem ser sintetizados usando qualquer uma das técnicas em fase sólida comercialmente disponíveis, tal como o método de síntese em fase sólida de Merrifield, onde aminoácidos são seqüencialmente adicionados em uma cadeia de aminoácido em crescimento. Veja Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). Equipamento para síntese automática de polipeptídeos está comercialmente disponíveis em fornecedores tal como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), e pode ser operado de acordo com as instruções do fabricante.

Dentro de certas modalidades específicas, um polipeptídeo pode ser uma proteína de fusão que compreende múltiplos polipeptídeos como aqui descrito, ou que compreende pelo menos um polipeptídeo como aqui descrito e uma seqüência não relacionada, tal como uma proteína conhecida. Um tal parceiro de fusão pode, por exemplo, auxiliar no fornecimento de epítopos auxiliares T (um parceiro de fusão imunológico), preferivelmente epítopos auxiliares T reconhecidos por humanos, ou pode auxiliar na expressão da proteína (um intensificador de expressão) em rendimentos mais altos do que a proteína recombinante nativa. Certos parceiros e fusão preferidos são parceiros tanto imunológicos quanto de fusão intensificadores de expressão. Outros parceiros de fusão podem ser selecionados de modo a aumentar a solubilidade da proteína ou para permitir que a proteína seja direcionada para os compartimentos intracelulares desejados. Ainda outros parceiros de fusão incluem etiquetas de afinidade, que facilitam a purificação da proteína. Proteínas de fusão podem ser geralmente preparadas usando técnicas padrão, incluindo conjugação química. Assim, uma proteína de fusão pode ser expressada como uma proteína recombinante, permitindo a produção de níveis aumentados, em relação à proteína de não-fusão, em um sistema de expressão. Resumidamente, seqüências de DNA codificadoras de componentes polipeptídeo podem ser montadas separadamente, e ligadas em um vetor de expressão apropriado. A extremidade 3' da seqüência de DNA codificadora de um componente polipeptídeo é ligada, com ou sem um linker peptídeo, na extremidade 5' de uma seqüência de DNA codificadora de segundo componente polipeptídeo de modo que as matrizes de leitura das seqüências fiquem em fase. Isto permite a tradução em uma única proteína de fusão que retém a atividade biológica de ambos os polipeptídeos componentes. Tipicamente proteínas de fusão compreendendo dois ou mais antígenos podem omitir o códon de iniciação (Met) dos segundo e subseqüentes antígenos.

Uma seqüência de ligador de peptídeo pode ser empregada para separar os primeiro e segundo componentes polipeptídeo por uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo se dobre em suas estruturas secundária e terciária. Uma tal seqüência de ligador de peptídeo é incorporada na proteína de fusão usando técnicas padrão bem conhecidas na arte. Seqüências de ligador de peptídeo adequadas podem ser escolhidas baseado nos seguintes fatores: (1) sua capacidade para adotar uma conformação estendida; (2) sua incapacidade para adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com epítopos funcionais sobre os primeiro e segundo polipeptídeos; e (3) a falta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que podem reagir com os epítopos funcionais de polipeptídeo. Seqüências de ligador de peptídeo preferidas contêm resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos quase neutros, tais como Thr e Ala também podem ser usados na seqüência de linker. Seqüências de aminoácidos que podem ser bem sucedidamente empregadas como ligadores incluem aquelas mostradas em Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:8258-8262 (1986); Patente U.S. No. 4.935.,233 e Patente U.S. No. 4.751.180. A seqüência de linker pode ser geralmente de 1 a cerca de 50 aminoácidos em comprimento. Seqüências de linker não são exigidas quando os primeiro e segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácido N-terminal não-essencial que podem ser usadas para separar os domínios funcionais e evitar interferência estérica.

As seqüências de DNA são operacionalmente ligadas nos elementos regulatórios de transcrição ou de tradução adequados. Os elementos regulatórios responsáveis pela expressão de DNA estão localizados apenas 5' à seqüência de DNA codificadora dos primeiros polipeptídeos. Similarmente, códons de terminação exigidos para terminar os sinais de terminação de tradução e de transcrição estão apenas presentes 3' à seqüência de DNA codificadora do segundo polipeptídeo.

Assim as composições de acordo com a invenção podem compreender uma ou mais proteínas de fusão. Tais proteínas compreendem um componente polipeptídeo da composição como aqui descrito junto com uma proteína imunogênica não relacionada. A proteína imunogênica pode ser por exemplo capaz de induzir uma resposta chamada de volta. Exemplos de tais proteínas incluem proteínas de tétano, de tuberculose e de hepatite (veja, e.g., Stoute et al., New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)).

Dentro de certas modalidades, um parceiro de fusão imunológico é derivado de proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Um derivado de proteína D pode compreender aproximadamente o primeiro terço da proteína (e.g., os primeiros 100-1 Io aminoácidos N-terminais) e um derivado de proteína D pode estar lipidado. Dentro de certas modalidades, os primeiros 109 resíduos de um parceiro de fusão de lipoproteína D está incluído na terminação-N para proporcionar o polipeptídeo com epítopos de célula-T exógenos adicionais e para aumentar o nível de expressão em E. coli (funcionando assim como um intensificador de expressão). A cauda lipídica garante apresentação ótima do antígeno às células apresentadoras de antígeno. Outros parceiros de fusão incluem proteína não-estrutural de vírus da gripe, NSl (hemaglutinina). Tipicamente, os 81 aminoácidos N-terminais são usados, embora fragmentos diferentes que incluem epítopos auxiliares-T possam ser utilizados.

Em outra modalidade, o parceiro de fusão imunológico é a proteína conhecida como LYTA, ou uma sua porção (preferivelmente uma porção C-terminal). LYTA é derivada de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase conhecida como amidase LYTA (codificada pelo gene LytA; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA é uma autolisina que especificamente degrada certas ligações na estrutura principal de peptidoglicano. O domínio C-terminal da proteína LYTA é responsável pela afinidade por colina e por alguns análogos de colina tal como DEAE. Esta propriedade tem sido explorada para o desenvolvimento de E. coli C- LYTA expressando plasmídeos úteis para expressão de proteínas de fusão. Purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento C-LYTA na terminação amino tem sido descrita (veja Biotechnology 10:795-798 (1992)). Dentro de uma modalidade preferida, uma porção repetida de LYTA pode ser incorporada em uma proteína de fusão. Uma porção repetida é verificada na região C-terminal iniciando no resíduo 178. Uma porção repetida particularmente preferida incorpora resíduos 188-305.

Em geral, polipeptídeos (incluindo proteínas de fusão) e polinucleotídeos como aqui descrito são isolados. Um polipeptídeo ou polinucleotídeo "isolado" é um que é removido de seu ambiente original. Por exemplo, uma proteína naturalmente ocorrente é isolada se ela é separada de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural. Preferivelmente, tais polipeptídeos são pelo menos cerca de 90% puros, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% puros e muito mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% puros. Um polinucleotídeo é considerado isolado se, por exemplo, ele for clonado em um vetor que não é uma parte do ambiente natural.

CÉLULAS-T

Composições imunoterapêuticas também podem, ou alternativamente, compreender células-T específicas para um antígeno de Chlamydia. Tais células podem geralmente ser preparadas in vitro ou ex vivo, usando procedimentos padrão. Por exemplo, células-T podem ser isoladas de medula óssea, sangue periférico, ou uma fração de medula óssea ou de sangue periférico de um paciente, usando um sistema de separação de células comercialmente disponíveis, tal como o Isolex™ System, disponível na Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; veja também Patente U.S. No. 5,240,856; Patente U.S. No. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 e WO 92/07243). Alternativamente, células-T podem ser derivadas de culturas ou linhagens de célula, de mamíferos não-humanos, de humanos relacionados ou não relacionados.

Células-T podem ser estimuladas com um polipeptídeo, polinucleotídeo codificador de um tal polipeptídeo, e/ou uma célula apresentadora de antígeno (APC) que expressa um tal polipeptídeo. Tal estimulação é realizada sob condições e por um tempo suficiente para permitir a geração de células-T que são específicas para o polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo ou polinucleotídeo está presente dentro de um veículo de liberação, tal como uma microesfera, para facilitar a geração de células-T específicas.

Células-T são consideradas específicas para um polipeptídeo se as células-T especificamente se proliferam, secretam citocinas ou matam células alvo revestidas com o polipeptídeo ou expressando um gene codificador do polipeptídeo. Especificidade de célula-T pode ser avaliada usando qualquer uma de uma variedade de técnicas padrão. Por exemplo, dentro de um ensaio de proliferação ou de liberação de cromo, um índice de estimulação de maior do que duas vezes o aumento em Iise e/ou proliferação, comparado com controles negativos, indica especificidade de célula-T. Tais ensaios podem ser realizados, por exemplo, como descrito em Chen et al., Caneer Res. 54:1065-1070 (1994)). Alternativamente, a detecção da proliferação de células-T pode ser realizada por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, proliferação de célula-T pode ser detectada pela medição de uma velocidade aumentada de síntese de DNA (e.g., por culturas de marcação pulsada de células-T com timidina tritiada e medição da quantidade de timidina tritiada incorporada em DNA). Contato com um polipeptídeo (100 ng/ml - 100 ng/ml, preferivelmente 200 ng/ml - 25 ng/ml) por 3-7 dias deve resultar em pelo menos um aumento dobrado em proliferação das células-T. Contato como descrito acima por 2-3 horas deve resultar em ativação das células-T, conforme medida usando ensaios de citocina padrão nos quais um aumento dobrado no nível de liberação de citocina (e.g., TNF ou IFN-γ) é indicativo de ativação de célula-T (veja Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). Células-T que têm sido ativadas em resposta a polipeptídeo, polinucleotídeo ou APC expressando polipeptídeo, podem ser CD4+ e/ou CD8+. Células-T específicas para proteína podem ser expandidas usando técnicas padrão. Dentro de modalidades preferidas, as células-T são derivadas de um paciente, ou um doador relacionado ou um doador não relacionado, e são administradas ao paciente após estimulação e expansão.

Para propósitos terapêuticos, células-T CD4+ ou CD8+ que proliferam em resposta a um polipeptídeo, polinucleotídeo ou APC podem ser expandidas em número quer in vitro quer in vivo. Proliferação de tais células- T in vitro pode ser realizada em uma variedade de maneiras. Por exemplo, as células-T podem ser re-expostas a um polipeptídeo, ou um peptídeo curto correspondendo a uma porção imunogênica de um tal polipeptídeo, com ou sem a adição de fatores de crescimento de célula-T, tais como interleucina-2, e/ou células estimuladoras que sintetizam o polipeptídeo. Alternativamente, uma ou mais células-T que proliferam na presença da proteína que podem expandir em número por clonagem. Métodos para clonagem de células são bem conhecidos na arte, e incluem diluição limitante.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Em modalidades adicionais, as composições de polinucleotídeo, polipeptídeo, célula-T e/ou de anticorpo aqui mostradas serão formuladas em soluções farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis para administração a uma célula ou a um animal, quer sozinhas, quer em combinação com uma ou outras modalidades de terapia.

Também será entendido que, se desejado, os segmentos de ácido nucleico, as composições de RNA, DNA ou PNA que expressam uma composição de polipeptídeos como aqui mostrado também podem ser administrados em combinação com outros agentes, tais como, e.g., outras proteínas ou outros polipeptídeos ou vários agentes farmaceuticamente ativos. De fato, virtualmente não há limite para outros componentes que também podem ser incluídos, desde que os agentes adicionais não causem um efeito adverso significativo sob contado com as células alvo ou os tecidos de hospedeiro. As composições podem portanto ser liberadas juntamente com vários outros agentes conforme exigidos no caso particular. Tais composições podem ser purificadas de células hospedeiras ou outras fontes biológicas, ou alternativamente podem ser quimicamente sintetizadas como aqui descrito. Igualmente, tais composições podem adicionalmente compreender composições de RNA ou DNA derivado ou substituído.

Formulação de soluções de veículo e excipientes farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida por aqueles pessoas experientes na arte, do mesmo modo o desenvolvimento de regimes de tratamento e de dosagem adequados para uso das composições particulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo e.g., formulação e administração oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular. Outras rotas de administração incluem via as superfícies mucosais, por exemplo administração intravaginal.

1. Liberação Orai

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aqui mostradas podem ser liberadas via administração oral a um animal. Como tais, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veículo edível assimilável, ou podem estar contidas dentro de uma cápsula de gelatina de película mole ou dura, ou podem estar comprimidas em tabletes, ou podem estar incorporadas diretamente com o alimento da dieta.

Os compostos ativos podem mesmo estar incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingestíveis, tabletes bucais, pastilhas, comprimidos, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e semelhantes (Mathiowitz et a/., 1997; Hwang et al., 1998; Patente U.S. 5.641.515; Patente U.S. 5.580.579 e Patente U.S. 5.792.451, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade como referência). Os tabletes, as pastilhas, as pílulas, as cápsulas e semelhantes também podem conter o seguinte: um aglutinante, tal como goma tragacanto, acácia, amido de milho, ou gelatina; excipientes, tal como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante, tal como sacarose, lactose ou sacarina podem ser adicionados ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, em adição aos materiais do tipo acima, um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para diferentemente modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, tabletes, pílulas, ou cápsulas podem ser revestidos com shellac, açúcar, ou ambos. Um xarope de elixir pode conter o composto ativo, sacarose como um agente edulcorante, metil- e propil-parabenos como conservantes, um corante e um aromatizante, tais como aromatizante de cereja ou de laranja. Claro que qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não-tóxico nas quantidades empregadas. Em adição, os compostos ativos podem ser incorporados em formulações e preparações de liberação prolongada.

Tipicamente, estas formulações podem conter pelo menos cerca de 0,1% de composto ativo ou mais, embora a percentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa, naturalmente, ser variada e pode ser convenientemente estar entre cerca de 1 ou 2% e cerca de 60% ou 70% ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de composto(s) ativo(s) em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada em um tal modo que uma dosagem adequada será obtida em qualquer dada dose unitária do composto. Fatores tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, rota de administração, vida em prateleira do produto, bem como outras considerações farmacêuticas serão contemplados por uma pessoa experiente na arte de preparação de tais formulações farmacêuticas, e como tal, uma variedade de dosagens e regimes de tratamento pode ser desejável.

Para administração oral as composições da presente invenção podem ser alternativamente incorporadas com um ou mais excipientes na forma de um enxagüatório bucal, dentifrício, tablete bucal, borrifo oral, ou formulação oralmente administrada sublingual. Por exemplo, um enxagüatório bucal pode ser preparado incorporando o ingrediente ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado, tal como uma solução de borato de sódio (solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser incorporado em uma solução oral tal como uma contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio, ou dispersado em um dentifrício, ou adicionado em uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que pode incluir água, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes, e umectantes. Alternativamente as composições podem ser elaboradas em uma forma de tablete ou solução que pode ser posta sob a língua ou diferentemente dissolvida na boca.

2. Liberação Injetável

Em certas circunstâncias será desejável liberar as composições farmacêuticas aqui mostradas parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, ou até mesmo intraperitonealmente como descrito em Patente U.S. 5.543.158; Patente U.S. 5.641.515 e Patente U.S. 5.399.363 (cada uma das quais é especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência). Sob condições ordinárias de armazenagem e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de dispersões ou soluções injetáveis estéreis (Patente U.S. 5.466.468, especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência). Em todos os casos a forma precisa ser estéril e precisa ser fluida na extensão que exista a fácil seringabilidade. Ela precisa ser estável sob as condições de manufatura e armazenagem e precisa estar conservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (e.g., glicerol, propileno-glicol, e poli(etileno-glicol) líquido, e semelhante), misturas adequadas dos mesmos, e/ou óleos vegetais. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A evitação da ação de microorganismos pode ser facilitada por vários agentes antibacterianos e antifüngicos, por exemplo, parabenos, cloro-butanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada ao se usar nas composições agentes retardadores de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido primeiro tomado isotônico com glicose ou solução salina suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta conexão, um meio aquoso estéril que pode ser empregado será conhecido por aqueles pessoas experientes na arte à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e quer adicionada em 1.000 ml de fluido de hipodermoclise quer injetada no sítio de infusão proposto (Veja, e.g., Remingtoris Pharmaceutieal Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá dependendo da condição do sujeito sendo tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer evento, a dose apropriada para o sujeito individual. Além disso, para administração a humano, preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, e segurança e pureza conforme exigidos pelos padrões de FDA Office of Biologies.

Soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos componentes ativos na quantidade exigida com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme exigido, seguida pela esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a 5 vácuo e de secagem por congelamento que dão um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente estéril-filtrada.

As composições aqui mostradas podem ser formuladas em uma forma de sal ou neutra. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livre da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio, ou férrico, e de bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. Em formulação, as soluções serão administradas em uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de droga, e semelhantes.

Como aqui usado, "veículo" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, agentes de transporte, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifüngicos, agentes isotônicos e retardantes de 25 absorção, tampões, soluções de agente de transporte, suspensões, colóides, e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na arte. Exceto à medida que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se às composições e entidades moleculares que não produzem uma reação alérgica ou desfavorável similar quando administrada a um humano. A preparação de 5 uma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente ativo é bem entendida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções ou dispersões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode estar 10 emulsificada.

3. LIBERAÇÃO MUCOSAL (i) Liberação Nasal

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser liberadas por borrifos nasais, inalação, e/ou outros veículos de liberação por aerossol. Métodos para liberar composições de genes, ácidos nucleicos, e peptídeo diretamente para os pulmões via borrifos de aerossol nasal têm sido descritos e.g., em Patente U.S. 5.756.353 e Patente U.S. 5.804.212 (cada uma especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência). Igualmente, a liberação de drogas usando resinas de micropartícula intranasal (Takenaga et al., 1998) e compostos de lisofosfatidil-glicerol (Patente U.S. 5.725.871, especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência) também são bem conhecidas na arte farmacêutica. Igualmente, liberação de droga transmucosal na forma de uma matriz de suporte de poli(tetrafluoroetileno) é descrita em Patente U.S. 5.780.045 (especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência).

(U) Liberação Intravaginal

Em outras modalidades da invenção as composições farmacêuticas podem ser formuladas para liberação intravaginal. Tais formulações podem ser preparadas como líquidos, semi-sólidos ou sólidos (incluindo por exemplo, cremes, pomadas, géis etc), ou podem estar contidas dentro de um sistema de liberação físico tal como pessário, esponja, filme ou anel vaginal.

(iii) Liberação Ocular

Em outras modalidades da invenção as composições

farmacêuticas podem ser formuladas para liberação ocular. Tais formulações desejavelmente serão límpidas e incolores.

(iv) Liberação Retal

Em modalidades adicionais da invenção as composições farmacêuticas podem ser formuladas para liberação retal.

5. Liberação mediada por lipossomo, Nanocápsula, e Micropartícula

Em certas modalidades, os inventores contemplam o uso de lipossomos, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lipídeo, vesículas, e semelhantes, para a introdução das composições da 15 presente invenção pode ser formulada para liberação quer encapsulada em uma partícula lipídica, um lipossomo, um veículo, uma nanoesfera, ou uma nanopartícula, ou semelhante.

Tais formulações podem ser preferidas para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou construtos 20 aqui mostrados. A formação e o uso de lipossomos são geralmente conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte (veja por exemplo, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que descreve o uso de lipossomos e nanocápsulas na terapia antibiótica selecionada para doenças e infecções bacterianas intracelulares). Recentemente, lipossomos foram desenvolvidos 25 com estabilidade em soro e meias-vidas em circulação aperfeiçoadas. (Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen e Choun, 1987; Patente U.S. 5.741.516, especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência). Ademais, têm sido revistos vários métodos de preparações de lipossomos e lipossomos-semelhantes como agentes de transporte de droga potenciais (Takakura, 1998; Chandran et ai, 1997; Margalit, 1995; Patente U.S. 5.567.434; Patente U.S. 5.552.157; Patente U.S. 5.565.213; Patente U.S. 5.738.868 e Patente U.S. 5.795.587, cada uma especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência).

Lipossomos têm sido usados com sucesso com numerosos tipos de célula que são normalmente resistentes à transfecção por outros procedimentos incluindo suspensões de célula-T, culturas de hepatócito primário e células PC 12 (Renneisen et ai, 1990; Muller et ai, 1990). Em adição, lipossomos estão livres de restrições de comprimento de DNA que são típicas dos sistemas de liberação baseados em vírus. Lipossomos têm sido usados eficazmente para introduzir genes, drogas (Heath & Martin, 1986; Heath et ai, 1986; Balazsovits et ai, 1989; Fresta & Puglisi, 1996), agentes radioterapêuticos (Pikul et ai, 1987), enzimas (Imaizumi et ai, 1990a; Imaizumi et ai, 1990b), vírus (Faller & Baltimore, 1984), fatores de transcrição e efetores alostéricos (Nicolau & Gersonde, 1979) em uma variedade de animais e linhagens de célula cultivadas. Em adição, vários testes clínicos bem sucedidos examinando a efetividade de liberação de droga mediada por lipossomo têm sido completados (Lopez-Berestein et ai, 1985a; 1985b; Coune, 1988; Soulier et ai, 1988). Ademais, vários estudos sugerem que o uso de lipossomos não está associado com respostas autoimunes, toxicidade ou localização gonadal após liberação sistêmica. (Mori & Fukatsu, 1992).

Lipossomos são formados de fosfolipídeos que estão dispersados em um meio aquoso e espontaneamente formam vesículas de bicamada concêntrica multilamelar (também chamadas de vesículas multilamelares (MLVs). MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4 nm. Sonificação de MLVs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros dentro da faixa de 20,0 a 50,0 nm, contendo uma solução aquosa no núcleo. Lipossomos possuem semelhança com membranas celulares e são contemplados para uso em conexão com a presente invenção como agentes de transporte para composições de peptídeo. São amplamente adequados porque ambas substâncias solúveis em água e solúveis em lipídeo podem ser aprisionadas, i.e. nos espaços aquosos e dentro de própria bicamada, respectivamente. É possível que os lipossomos possuindo droga podem até mesmo ser empregados para liberação sítio-específica de agentes ativos por modificação seletiva da formulação lipossomal.

Em adição aos ensinamentos de Couvreur et al. (1977; 1988), a seguinte informação pode ser utilizada em geração de formulações lipossomais. Fosfolipídeos podem formar uma variedade de estruturas diferentes de lipossomos quando dispersados em água, dependendo da razão molar de lipídeo para água. Em razões baixas o lipossomo é a estrutura preferida. As características físicas de lipossomos dependem de pH , da força iônica e da presença de cátions divalentes. Lipossomos podem mostrar permeabilidade baixa a substâncias iônicas e polares, mas em temperaturas elevadas sofrem uma transição de fase que marcantemente altera sua permeabilidade. A transição de fase envolve uma mudança de uma estrutura ordenada, intimamente empacotada, conhecida como o estado de gel, para uma estrutura menos ordenada, soltamente empacotada, conhecida como o estado fluido. Isto ocorre em uma temperatura de transição de fase característica e resulta em um aumento em permeabilidade aos íons, açúcares e drogas.

Em adição à temperatura, exposição à proteínas pode alterar a permeabilidade de lipossomos. Certas proteínas solúveis, tal como citocromo c, ligam-se em, deformam e penetram na bicamada, causando deste modo mudanças em permeabilidade. Colesterol inibe esta penetração de proteínas, aparentemente pelo empacotamento dos fosfolipídeos mais apertadamente. E contemplado que as formações de lipossomo mais úteis para liberação de antibiótico e de inibidor conterão colesterol. A capacidade de aprisionar solutos varia entre tipos diferentes de lipossomos. Por exemplo, MLVs são moderadamente eficientes no aprisionamento de solutos, mas SUVs são extremamente ineficientes. SUVs oferecem a vantagem de homogeneidade e reprodutibilidade em distribuição de tamanhos, contudo, e um compromisso entre tamanho e eficiência de aprisionamento é oferecido pelas vesículas unilamelares grandes (LUVs). Estas são preparadas por evaporação de éter e são três a quatro vezes mais eficientes em aprisionamento de soluto do que as MLVs.

Em adição às características de lipossomo, um determinante importante em aprisionamento de compostos refere-se às propriedades físico- químicas do próprio composto. Compostos polares são aprisionados nos espaços aquosos e compostos não-polares se ligam na bicamada lipídica da vesícula. Compostos polares são liberados através de permeação ou quando a bicamada é rompida, mas compostos não-polares permanecem afiliados com a bicamada a não ser que ela seja rompida por temperatura ou exposição às lipoproteínas. Ambos os tipos mostram taxas de efluxo máximas na temperatura de transição de fase.

Lipossomos interagem com células via quatro mecanismos diferentes: endocitose por células fagocíticas do sistema reticuloendotelial tais como macrófagos e neutrófilos; adsorção na parede celular, quer por forças quer eletrostáticas ou hidrofóbicas fracas não específicas, quer por interações específicas com componentes de superfície celular; fusão com a membrana plasmática da célula por inserção da bicamada lipídica do lipossomo na membrana plasmática, com liberação simultânea do conteúdo lipossomal para dentro do citoplasma; e por transferência de lipídeos lipossomais para membranas celular ou subcelular, ou vice versa, sem qualquer associação do conteúdo do lipossomo. Freqüentemente é difícil determinar qual mecanismo é operativo e mais do que um pode operar ao mesmo tempo. O fato e a disposição de lipossomos intravenosamente injetados dependem de suas propriedades físicas, tais como tamanho, fluidez, e carga superficial. Podem persistir em tecidos por h ou dias, dependendo de sua composição, e meias-vidas no sangue variam de min a várias h. Lipossomos maiores tais como MLVs e LUVs, são capturados rapidamente por células fagocíticas do sistema reticuloendotelial, mas fisiologia do sistema circulatório impede a saída de tais espécies grandes na maioria dos sítios. Podem existir apenas em locais onde poros ou aberturas grandes existem no endotélio capilar, tais como os sinusóides do fígado ou do baço. Assim, estes órgãos são o sítio predominante de captação. Por outro lado, SUVs mostram uma distribuição de tecido mais ampla mas ainda são seqüestrados elevadamente no fígado e no baço. Em geral, este comportamento in vivo limita o direcionamento potencial de lipossomos para apenas aqueles órgãos e tecidos acessíveis ao seu tamanho grande. Estes incluem sangue, fígado, baço, medula óssea, e órgãos linfóides.

Direcionamento geralmente não é uma limitação em termos da presente invenção. Contudo, direcionamento específico deveria ser desejável, métodos disponíveis para isto estão para serem realizados. Anticorpos podem ser usados para se ligarem na superfície de lipossomo e para direcionar o anticorpo e seu conteúdo de droga para receptores antigênicos específicos localizados sobre uma superfície de tipo celular particular. Determinantes de carboidrato (componentes de superfície celular glicoproteína ou glicolipídeo que desempenham um papel em reconhecimento de célula-célula, interação e adesão) também podem ser usados como sítios de reconhecimento porque têm potencial em direcionamento de lipossomos para tipos de célula particulares. Principalmente, é contemplado que injeção intravenosa de preparações lipossomais seria usado, para outras rotas de administração também são concebíveis.

Alternativamente, a invenção fornece formulações de nanocápsula farmaceuticamente aceitáveis das composições da presente invenção. Nanocápsulas podem geralmente aprisionar compostos em uma maneira estável ou reproduzível (Henry-Michelland et ah, 1987; Quintanar- Guerrero et ah, 1998; Douglas et ah, 1987). Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (de tamanho de cerca de 0,1 μπι) devem ser preparadas usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. Nanopartículas de poli(ciano-acrilato de alquila) biodegradável que atendem a estas exigências são contempladas para uso na presente invenção. Tais partículas são facilmente preparadas, como descrito (Couvreuref ah, 1980; 1988; zur Muhlen et ah, 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et ah, 1995 e Patente U.S. 5,145,684, especificamente aqui incorporada em sua totalidade como referência).

VACINAS

Em certas modalidades preferidas da presente invenção, vacinas são fornecidas. As vacinas geralmente compreenderão uma ou mais composições farmacêuticas, tais como aquelas discutidas acima, em combinação com um imunoestimulante. Um imunoestimulante pode ser qualquer substância que intensifica ou potencializa uma resposta imune (incluindo mediada por anticorpo e/ou célula) a um antígeno exógeno. Exemplos de imunoestimulantes incluem adjuvantes, microesferas biodegradáveis (e.g., galactídeo poliláctico) e lipossomos (nas quais o composto é incorporado; veja, e.g., Fullerton, Patente U.S. No. 4.235.877). Preparação de vacina é geralmente descrita em, por exemplo, Powell & Newman, eds., Vaccine Design ("the subunit and adjuvant approach") (1995). Composições farmacêuticas e vacinas dentro do escopo da presente invenção também podem conter outros compostos, que podem ser biologicamente ativos ou inativos. Por exemplo, uma ou mais porções imunogênicas de outros antígenos podem estar presentes, quer incorporadas em um polipeptídeo de fusão quer como um composto separado, dentro da composição ou vacina. Vacinas ilustrativas podem conter DNA codificador de dois ou mais dos polipeptídeos como descrito acima, de tal modo que os polipeptídeos são gerados in situ. Como observado acima, o DNA pode estar presente dentro de qualquer um de uma variedade de sistemas de liberação conhecidos 5 por aqueles pessoas experientes na arte, incluindo sistemas de expressão de ácido nucleico, sistemas de expressão bacterianos e virais. Numerosas técnicas de liberação de gene são conhecidas na arte, tais como aquelas descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 (1998), e referências citadas no mesmo. Sistemas de expressão de ácido 10 nucleico apropriado contêm as seqüências de DNA necessárias para expressão no paciente (tais como sinal de terminação e promotor adequados). Sistemas de liberação bacterianos envolvem a administração de uma bactéria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expressa uma porção do polipeptídeo sobre sua superfície celular ou secreta em um epítopo. Em uma modalidade 15 preferida, o DNA pode ser introduzido usando um sistema de expressão viral (e.g., vírus da vacínia ou outro vírus de pústula, retrovírus, ou adenovírus), que podem envolver o uso de um vírus competente em replicação, não- patogênico (defectivo). Sistemas adequados são mostrados, por exemplo, em Fisher-Hoch et al., Proc. Nath Acad Sei. USA 86:317-321 (1989); Flexner et 20 al., Ann. N.Y. Acad.. Sei. 569:86-103 (1989); Flexner et al., Vaceine 8:17-21 (1990); Patentes U.S. Nos. 4.603.112, 4.769.330, e 5.017.487; WO 89/01973; Patente U.S. No. 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Bioteehniques 6:616-627 (1988); Rosenfeld et ah, Seience252:43l- 434 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 91:215-219 (1994); Kass- 25 Eisler et ah, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:2838-2848 (1993); e Guzman et al., Cir. Res. 73:1202- 1207 (1993). Técnicas para incorporação de DNA em tais sistemas de expressão são bem conhecidas por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte. O DNA também pode estar "nu", como descrito, por exemplo, em Ulmer et al., Science 259:1745-1749 (1993) e revisto por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). A captação de DNA nu pode ser aumentada pelo revestimento de DNA sobre glóbulos biodegradáveis, que são eficientemente transportados para dentro das células. Será evidente que uma 5 vacina pode compreender ambos um componente polinucleotídeo e um polipeptídeo. Tais vacinas podem proporcionar uma resposta imune intensificada.

Será evidente que urna vacina pode conter sais farmaceuticamente aceitáveis dos polinucleotídeos e dos polipeptídeos aqui 10 fornecidos. Tais sais podem ser preparados de bases não-tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (e.g., sais de aminoácidos básicos e de aminas primárias, secundárias e terciárias) e bases inorgânicas (e.g., sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio e magnésio).

Embora qualquer veículo adequado conhecido por aquelas 15 pessoas ordinariamente experientes na arte possa ser empregado nas composições de vacina desta invenção, o tipo de veículo variará dependendo do modo de administração. Composições da presente invenção podem ser formuladas para qualquer maneira apropriada de administração, incluindo por exemplo, administração tópica, oral, nasal, intravenoso, intracranial, 20 intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Para administração parenteral, tais como injeção subcutânea, o agente de transporte preferivelmente compreende água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, qualquer um dos agentes de transporte acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de 25 magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magnésio, podem ser empregados. Microesferas biodegradáveis (e.g., polilactato poliglicolato) também podem ser empregadas como veículos para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são mostradas, por exemplo, em Patentes U.S. Nos. 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344 e 5.942.252. Pode-se também empregar um veículo compreendendo os complexos de particulado-proteína descritos em Patente U.S. No. 5.928.647, que são capazes de induzir em um hospedeiro respostas de linfócito T 5 citotóxico restrito à classe I.

Tais composições também podem compreender tampões (e.g., solução salina tamponada com fosfato ou solução salina tamponada neutra), carboidratos (e.g., glicose, manose, sacarose ou aextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, 10 bacteriostatos, agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa, adjuvantes (e.g., hidróxido de alumínio), solutos que tomam a formulação isotônica ou fracamente hipertônica com o sangue de um paciente recipiente, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes. Alternativamente, composições da presente invenção podem ser formuladas como um 15 liofilizado. Compostos também podem estar encapsulados dentro de lipossomos usando tecnologia bem conhecida.

Qualquer um de uma variedade de imunoestimulantes pode ser empregado nas vacinas desta invenção. Por exemplo, um adjuvante pode estar incluído. Os adjuvantes contêm em sua maioria uma substância planejada 20 para proteger o antígeno do catabolismo rápido, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulante de respostas imunes, tal como lipídeo A, proteínas derivadas de Bortadella pertussis ou espécie Myeobaeterium ou Mycobaeterium. Por exemplo, M. vaecae ("pVac") deslipidado, desglicolipidado pode ser usado. Em outra modalidade, BCG é 25 utilizado como um adjuvante. Em adição, a vacina pode ser administrada a um sujeito previamente exposto a BCG. Adjuvantes adequados estão comercialmente disponíveis, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); CWS, TDM, Leif, sais de alumínio tais como gel de hidróxido de alumínio 1 (alume) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, de ferro ou de zinco; e uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; sais de cálcio, de ferro ou de zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacarídeos catiônica ou anionicamente derivados; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil-lipídeo A e quil A. Citocinas, tal como GM-CSF ou interleucinas-2, -7, ou-12, também podem ser usadas como adjuvantes.

Dentro das vacinas aqui fomccidas, a composição de adjuvante pode ser planejada para induzir uma resposta imune predominantemente do tipo Thl. Níveis altos de citocina de tipo Thl (e.g., IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL- 12) tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula a um antígeno administrado. Em contraste, níveis altos de citocinas de tipo Th2 (e.g., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais. Após a aplicação de uma vacina como aqui fornecida, um paciente suportará uma resposta imune que inclui respostas de tipos Thl e Th2. Dentro de uma modalidade, na qual uma resposta é predominantemente de tipo Thl, o nível de citocinas de tipo Thl aumentará para uma extensão maior do que o nível de citocinas de tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser prontamente avaliados usando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, veja Mosmann & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989).

Adjuvantes adequados para uso em indução de uma resposta predominantemente do tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil-lipídeo A, por exemplo monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL), juntamente com um sal de alumínio. Adjuvantes MPL estão disponíveis na Corixa Corporation (agora parte de GlaxoSmithKline; veja Patentes U.S. Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094). Oligonucleotídeos contendo CpG (nos quais o dinucleotídeo CpG está não metilado) também induzem uma resposta predominantemente Thl. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em WO 96/02555, WO 99/33488 e Patentes U.S. Nos. 6.008.200 e 5.856.462. Seqüências de DNA imunoestimulantes também são descritas, por exemplo, por Sato et al., Science 273:352 (1996). Outro adjuvante adequado compreende uma saponina, tal como Quil A, ou seus derivados, incluindo QS21 e QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; ou saponinas de Gypsophila ou Chenopodium quinoa. Outras formulações adequadas incluem mais do que uma saponina nas combinações adjuvantes da presente invenção, por exemplo combinações de pelo menos duas do seguinte grupo compreendendo QS21, QS7, Quil A, β-escina, ou digitonina.

Alternativamente as formulações de saponina podem ser combinadas com veículos de vacina compostos de quitosana ou outros polímeros policatiônicos, partículas de polilactídeo e polilactídeo-co- glicolídeo, matriz de polímero baseada em poli-N-acetil-glicosamina, partículas compostas de polissacarídeos ou polissacarídeos quimicamente modificados, lipossomos e partículas baseadas em lipídeo, partículas compostas de monoésteres de glicerol, etc. As saponinas também podem ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particuladas tais como lipossomos ou ISCOMs. Ademais, as saponinas podem ser formuladas juntamente com um polioxietileno-éter ou éster, em quer uma suspensão ou solução de não-particulado, quer em uma estrutura particulada tal como um lipossomo paucilamelar ou ISCOM. As saponinas também podem ser formuladas com excipientes tal como CarbopolR para aumentar a viscosidade, ou podem ser formuladas em uma forma de pó seco com um excipiente em pó tal como lactose.

Em uma modalidade, o sistema adjuvante inclui a combinação de um monofosforil-lipídeo A e um derivado de saponina, tal como a combinação de adjuvante QS21 e 3D-MPL®, como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde QS21 é extinto com lipossomos contendo colesterol, como descrito em WO 96/33739. Outras formulações adequadas compreendem uma emulsão de óleo-em-água e tocoferol. Outra formulação de adjuvante adequada empregando adjuvante QS21, 3D-MPL® e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água é descrita WO 95/17210.

Outro sistema adjuvante intensificado envolve a combinação de um oligonucleotídeo contendo CpG e um derivado de saponina particularmente a combinação de CpG e QS21 como mostrado em WO 00/09159. Adequadamente a formulação adicionalmente compreende uma emulsão de óleo-em-água e toçoferol.

Outros adjuvantes adequados incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série SBAS de adjuvantes (SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica, Detox (Corixa), RC-529 (Corixa) e outros amino-alquil- glicosaminida-4-fosfatos (AGPs), tais como aqueles descritos em Pedidos de Patente U.S. pendentes de Nos. Seriais 08/853.826 e 09/074,720, cujas descobertas são aqui incorporadas em suas totalidades como referências, e adjuvantes de polioxietileno-éter tais como aqueles descritos em WO 99/52549A1. SmithKline Beecham e Corixa Corporation são agora parte da GlaxoSmithKline.

Outros adjuvantes adequados incluem moléculas de adjuvante de fórmula geral (I):

HO(CH2CH2O)n-A-R

sendo que, n é 1-50, A é uma ligação ou -C(O)-, R é Ci_50 alquila ou Fenil C 1.50 alquila.

Um outro adjuvante de interesse é cadeia b de toxina de A shiga, usada por exemplo como descrito em W02005/112991.

Uma modalidade da presente invenção consiste de uma formulação de vacina compreendendo um polioxietileno-éter de fórmula geral (I), sendo que n está entre 1 e 50, preferivelmente 4-24, mais preferivelmente 9; o componente R é Ci_5o, preferivelmente C4-C20 alquila e muito mais preferivelmente C]2 alquila, e A é uma ligação. A concentração 5 dos polioxietileno-éteres deve estar dentro da faixa de 0,1-20%, preferivelmente de 0,1 -10%, e muito mais preferivelmente dentro da faixa de 0,1-1%. Os polioxietileno-éteres preferidos são selecionados do seguinte grupo: pol i oxietileno-9-lauril-étcr, polioxietileno-9-esteoril-éter,

polioxietileno-8-esteoril-éter, polioxietileno-4-lauril-éter, polioxietileno-35-

lauril-éter, e polioxietileno-23-lauril-éter. Polioxietilen-éteres tal como

• th polioxietileno lauril-éter são descritos no Merck Index (12 edition: entrada

7717). Estas moléculas adjuvantes são descritas em WO 99/52549.

Qualquer vacina aqui fornecida pode ser preparada usando métodos bem conhecidos que resultam em uma combinação de antígeno, intensificador de resposta imune e um excipiente ou veículo adequado. As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação prolongada (i.e., uma formulação tal como uma cápsula, esponja, ou gel (composto de polissacarídeos, por exemplo) que realiza uma liberação lenta de composto após a administração). Tais formulações podem ser geralmente preparadas usando tecnologia bem conhecida (veja, e.g., Coombes et al., Vaeeine 14:1429-1438 (1996)) e administradas, por exemplo, por implantação oral, retal ou subcutânea no sítio alvo desejado. Formulações de liberação prolongada podem conter um polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo dispersado em uma matriz veículo e/ou contido dentro de um reservatório circundado por uma membrana de controle de velocidade.

Veículos para uso dentro de tais formulações são biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis; preferivelmente a formulação proporciona um nível relativamente constante de liberação de componente ativo. Tais veículos incluem micropartícuias de poli(lactídeo-co- glicolídeo), poliacrilato, látex, amido, celulose, dextrano e semelhantes. Outros veículos de liberação retardada incluem biovetores supramoleculares, que compreende um núcleo hidrofílico não-líquido (e.g., um oligossacarídeo 5 ou polissacarídeo reticulado) e, opcionalmente, uma camada externa compreendendo um composto anfifílico, tal como um fosfolipídeo (veja, e.g., Patente U.S. No. 5.151.254 e Pedidos PCT Nos. WO 94/20078, WO/94/23701 e WO 96/06638). A quantidade de composto ativo contida dentro de uma formulação de liberação prolongada depende do sítio de 10 implantação, da velocidade e da duração de liberação esperada e da natureza da condição a ser tratada ou evitada.

Qualquer um de uma variedade de veículos pode ser empregado dentro das composições farmacêuticas e vacinas para facilitar a produção de uma resposta imune específica para antígeno que seleciona células de tumor. Veículos de liberação incluem células apresentadoras de antígeno (APCs), tais como células dendríticas, macrófagos, células-B, monócitos e outras células que podem ser engenhadas para serem APCs eficientes. Tais células podem, mas não necessitam, ser geneticamente modificadas para aumentar a capacidade de apresentação de antígeno, para melhorar ativação e/ou manutenção da resposta de célula-T, para ter efeitos anti-tumorais per se e/ou serem imunologicamente compatíveis com o receptor (i.e., haplótipo HLA igualado). APCs podem ser geralmente isoladas de qualquer um de uma variedade de fluidos biológicos e órgãos, incluindo tecidos de tumor e peritumorais, e podem ser células autólogas, alogênicas, singênicas ou xenogênicas.

Certas modalidades da presente invenção usam células dendríticas ou seus progenitores como células apresentadoras de antígeno. Células dendríticas são APCs elevadamente potentes (Banchereau & Steinman, Nature 392:245-251 (1998)) e tem sido mostrado que são eficazes como um adjuvante fisiológico para induzir imunidade profilática ou terapêutica antitumoral (veja Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50:507- 529 (1999)). Em geral, células dendríticas podem ser identificadas baseado em sua forma típica (estrelada in situ, com processos citoplásmicos marcados 5 (dendritos) visíveis in vitro), sua capacidade de captação, processo e antígenos com eficiência alta e sua capacidade para ativar respostas de célula- T não-experimentada. Células dendríticas, naturalmente, podem ser engenhadas para expressar ligantes ou receptores de superfície específicos que não são comumente encontrados sobre células dendríticas in vivo ou ex 10 vivo, e tais células dendríticas modificadas são contempladas pela presente invenção. Como uma alternativa às células dendríticas, células dendríticas carregadas de antígeno de vesículas secretadas (chamadas exossomos) podem ser usadas dentro de uma vacina (veja Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600 (1998)).

Células dendríticas e progenitores podem ser obtidos de

sangue periférico, medula óssea, células infiltrantes de tumor, células infiltrantes de tecidos peritumorais, linfonodos, baço, pele, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro fluido ou tecido adequado. Por exemplo, células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo pela adição de uma combinação 20 de citocinas tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa em culturas de monócios colhidos de sangue periféricos. Alternativamente, células positivas para CD34 colhidas de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas pela adição no meio de cultura de combinações de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligante CD40, 25 LPS, ligante flt3 e/ou outro(s) composto(s) que induzem diferenciação, maturação e proliferação de células dendríticas.

Células dendríticas são convenientemente categorizadas como células "imaturas" e "maduras", o que permite um modo simples de discriminar entre dois fenótipos bem caracterizados. Contudo, esta nomenclatura não deve ser construída como exclusão de todos os estágios intermediários de diferenciação possíveis. Células dendríticas imaturas são caracterizadas como APC com uma capacidade alta para captar e processar antígeno, que se correlaciona com a expressão alta de receptor Fcy e receptor 5 de manose. O fenótipo maduro é tipicamente caracterizado por uma expressão mais baixa destes marcadores, mas uma expressão alta de moléculas de superfície celular responsáveis pela ativação de célula-T tais como MHC de classe I e de classe II, moléculas de adesão (e.g., CD54 e CDl 1) e moléculas co-estimulantes (e.g., CD40, CD80, CD86 e 4-1BB).

APCs podem ser geralmente transfectadas com um

polinucleotídeo codificador de uma proteína (ou sua porção ou outra variante) de tal modo que o polipeptídeo, ou uma sua porção imunogênica, seja expressado sobre a superfície da célula. Tal transfecção pode ocorrer ex vivo, e uma composição ou vacina compreendendo tais células transfectadas pode 15 ser então usada para propósitos terapêuticos, como aqui descrito. Alternativamente, um veículo de liberação de gene que seleciona uma célula dendrítica ou uma outra célula apresentadora de antígeno pode ser administrado a um paciente, resultando em transfecção que ocorre in vivo. Transfecção in vivo e ex vivo de células dendríticas, por exemplo, pode ser 20 realizada usando quaisquer métodos conhecidos na arte, tais como aqueles descritos em WO 97/24447, ou a abordagem de canhão de gene descrita por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997). Carregamento de antígeno de células dendríticas pode ser realizado por incubação de células dendríticas ou células progenitoras com o polipeptídeo, DNA (nu ou dentro de 25 um vetor plasmídeo) ou RNA; ou com vírus ou bactéria recombinante expressando antígeno (e.g., vetores de vacínia, epitelioma contagioso, adenovírus ou lentivírus). Antes do carregamento, o polipeptídeo pode ser covalentemente conjugado em um parceiro imunológico que proporciona auxílio de célula-T (e.g., uma molécula veículo). Alternativamente, uma célula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não- conjugado, separadamente ou na presença do polipeptídeo.

Vacinas e composições farmacêuticas podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, tais como frascos ou ampolas selados(as). Tais recipientes são preferivelmente hermeticamente fechados para conservar a esterilidade da formulação até o uso. Em geral, as formulações podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, uma vacina ou composição farmacêutica pode ser armazenada em uma condição seca por congelamento exigindo apenas a adição de um veículo líquido estéril imediatamente antes do uso.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são fornecidos apenas por meio de exemplo e não servem para limitarem o escopo da invenção. Aqueles pessoas experientes na arte reconhecerão que é descrita uma variedade de parâmetros não-críticos que poderia ser adaptada para dar resultados similares.

Exemplo 1: Comparações de Seqüências Ct-089, Ct-858 e Ct-875

Sorovar E de Chlamydia trachomatis é um sorovar oculogenital comum e foi escolhido como uma base à qual outras seqüências seriam comparadas.

Um alinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos para comparação tem sido conduzido usando o programa CLUSTAL W, disponível no pacote de programas de computador Lasergene, versão 5.0 (vendido por DNASTAR, Inc., Madison, WI)). O algoritmo de alinhamento múltiplo básico envolve um procedimento de três etapas: todos os pares de seqüências são alinhados separadamente com o propósito de calcular uma matriz de distância dando a divergência de cada par de seqüências, então uma árvore guia é calculada da matriz de distância e finalmente as seqüências são progressivamente alinhadas de acordo com a árvore guia. Algoritmo CLUSTAL W é descrito em Thompson et al., Nuc. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994). Os alinhamentos são mostrados em Figuras 1, 2a/2b e 3a/3b.

Os epítopos de célula-T auxiliadora são peptídeos ligados em moléculas HLA de classe II e reconhecidos por células-T auxiliares. A 5 predição de epítopos de célula-T auxiliadora putativa, presentes sobre polipeptídeos Ct-089, Ct-858 e Ct-875 de Chlamydia trachomatis de sorovar E, foi baseada no método TEPITOPE descrito por Sturniolo et al., Nature Biotech. 77:555-561 (1999). Os peptídeos compreendendo epítopos de célula- T potenciais, bons estão realçados (caixas cinzas) em Figuras 1, 2a/2b e 10 3a/3b.

Exemplo 2: Indução de uma resposta imune protetora contra infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis em camundongos Sumário do Experimento

Camundongos fêmeas C57BL/6 e C3H foram vacinados (duas 15 ou três imunizações intramusculares, com dois níveis de dosagem diferentes) usando uma combinação de proteínas Ct-089, Ct-858 e Ct-875 de sorovar E formulada em adjuvante. Um grupo de controle positivo foi vacinado usando corpos elementares atenuados por UV de sorovar A ou K em adjuvante. Um grupo de controle negativo foi vacinado usando apenas adjuvante.

Camundongos foram infectados por um único desafio ocular

com sorovares oculares A, B ou sorovar oculogenital K. O curso de infecção foi monitorado por realização de esfregaços oculares.

Método

Sujeitos de teste

Duzentos e quarenta camundongos fêmeas de seis semanas de

idade (consistindo de centro e quarenta e quatro camundongos C3H e noventa e seis camundongos C57BL/6) foram obtidos de Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts). Animais foram divididos em trinta grupos de nove cada (dezoito grupos de camundongos C3H e doze grupos de camundongos C57BL/6). Seis grupos experimentais de camundongos C3H foram usados para desafio com cada um dos sorovares A, B ou K. Seis grupos experimentais de camundongos C57BL/6 foram usados para desafio com cada um dos sorovares A ou K.

Quatro grupos de camundongos em cada subconjunto foram

imunizados de acordo com a presente invenção (duas ou três imunizações em dose baixa ou alta). Os dois grupos restantes em cada subconjunto foram usados para controles com UVEB em adjuvante ou adjuvante sozinho.

Cada grupo de camundongos foi engaiolado individualmente e alojado sob um ciclo de 12 horas de escuridão /12 horas de luz.

Preparação de bactérias Corpos elementares (EB) vivos

Os sorovares A, B e K de Chlamydia trachomatis foram obtidos da American Type Culture Collection (ATCC) e expandidos antes do uso no desafio de camundongos. Os títulos de estoque originais foram 1,2x10 IFU/ml para sorovar K, 1,4x107 IFU/ml para sorovar B e 1,92x109 IFU/ml para sorovar A.

Os sorovares de estoque foram elevados em células McCoy em frascos de cultura de 75 cm . Monocamadas de células confluentes em frascos 20 de cultura foram inoculadas com o sorovar respectiva, centrifugadas a 2000 rpm por uma hora e incubadas por 48 horas a 37°C com CO2 5% em RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino 10%, piruvato de sódio 1 mM, IX ácidos MEM NEA, Bme β-mercapto-etanol 50 μΜ, 10 mg/L de micostatina e 10 mg/L de vancomicina. Ciclo-hexamida a 1 μ&/ηι1 foi adicionada antes da 25 infecção (ciclo-hexamida é um inibidor de síntese de proteína que favorece a replicação clamídica com o propósito de estabelecer infecção). Corpos elementares (EB) clamídicos foram colhidos após a infecção por rompimento de monocamadas de células com glóbulos de vidro de 5 mm e congelados em SPG a -80°C. Para obter títulos altos, sorovares foram cultivados por pelo menos quatro ciclos sobre monocamadas de células McCoy em frascos de cultura. Semi-purificação não foi realizada a menos que 90 a 100% das células foram infectadas em cada frasco de cultura sob exame sob microscopia de luz.

Corpos elementares viáveis de pelo menos vinte frascos de cultura infectados de 75 cm2 foram semi-purificados sobre um gradiente inicial de Hypaque 30% e secundariamente sobre gradientes de Hypaque 52%, 44% e 40%, usando ultracentri fugação para os gradientes. A pelota final após duas lavagens foi ressuspensa em SPG (75 g de sacarose, 0,52 g de fosfato de potássio, 2,3 g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado e 0,72 g ácido glutâmico, pH 7,5, estéril) em criofrascos e congelada a -80°C para uso posterior.

Corpos elementares atenuados por UV (UVEB)

Para os propósitos de imunizações de controle, corpos elementares de sorovares AeK purificados foram inativados sob luz UV. Camadas finas de suspensões de EB foram posicionadas em uma placa de seis cavidades diretamente sob uma lâmpada de UV (lâmpada germicida Sanyo) 2,54 centímetros da luz, por um período de 1 hora. Os UVEBs foram padronizados de acordo com teor de proteína determinado pelo ensaio de proteína BCA, aliquotados e congelados. A concentração do UVEB de estoque para sorovar A foi 249,3 μg/ml e para sorovar K foi 5145 μg/ml.

Um teste de viabilidade para UVEB foi realizado em monocamadas de células McCoy.

Preparação de vacina Controle de adjuvante

O adjuvante utilizado foi baseado em uma formulação lipossomal contendo 3D-MPL, QS21 e colesterol. A composição final da solução de adjuvante foi:

3 D-MPL 100 μ^ηιΐ QS21 100 vg/m\ DO PC 2 mg/ml (DOPC = dioleoil-fosfatidil-colina) Colesterol 0,5 mg/ml Solução tamponada com fosfato foi preparada a partir de Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 48 mM e NaCl 100 mM em pH6,l.

Uma mistura de lipídeo, colesterol e 3D-MPL foi preparada em solvente orgânico, esta foi então seca sob vácuo. PBS foi então adicionado 5 e o vaso foi agitado até ser formada uma suspensão. Esta suspensão foi então microfluidizada até um tamanho de lipossomo a cerca de 100 nm foi obtida (chamada de vesículas unilamelares pequenas ou SUV). Subseqüentemente, as SUV foram esterilizadas pela passagem através de um filtro de 0,2 μηι.

SUV estéreis foram misturadas com a quantidade apropriada de QS21 aquosa (em uma concentração de 2 mg/ml) com a adição de solução salina tamponada com fosfato para obter as concentrações desejadas finais. O pH foi então ajustado para 6,1 (+/- 0,1) conforme necessário usando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.

UVEB em adjuvante

10 μg de UVEB foram formulados em um volume de 100 μΐ

pela misturação de 50 μΐ da UVEB exigida (i.e. concentração de UVEB de estoque foi ajustada para 20 μg/μl) com 50 μΐ de adjuvante de força dupla. Proteínas Ct-089, Ct-858 e Ct-875 em adjuvante

Antígenos de proteína foram preparados usando meios 20 convencionais. Resumidamente, cepas competentes de E. coli BL21 plys E, Tuner (DE3) e BL21 plys S foram transformadas com plasmídeos de expressão de Ct-089, Ct-858 e Ct-875 respectivamente e crescidas sobre o meio de seleção antibiótico apropriado. Os clones de expressão resultantes foram usados em um protocolo de mini-indução, e rendimentos de proteína 25 foram analisados por SDS-PAGE. Se células cresceram bem durante este processo as proteínas foram induzidas por isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG) em quantidades suficientes para serem detectadas sobre géis de SDS corados com azul Coomassie, os clones foram usados em um experimento de indução em escala grande (IPTG, 1 mM). Após Iise das células em uma solução de CHAPS e centrifugação, alíquotas das frações de pelota e solúveis foram analisadas por SDS-PAGE para determinar se a maior parte da proteína de interesse estava na pelota ou na fração solúvel. A fração contendo a maior parte de cada antígeno foi submetida à purificação em coluna de Ni-NTA (após solubilização apropriada das proteínas). Alíquotas das preparações, incluindo material de antes de ligação em Ni- NTA, fluxo de passagem pela coluna, lavagens da coluna, e frações de eluição da coluna, foram analisadas por SDS-PAGE. Frações contendo a proteína eluída foram combinadas, dialisadas contra Tris 10 mM de pH 8 ou pH 10, esterilizadas for filtração, e concentradas. O ensaio de proteína BCA foi usado nas frações de proteína Ct, e a pureza foi avaliada por SDS-PAGE.

Foram preparadas duas composições contendo Ct-089, Ct-858 e Ct-875 de sorovar E de Chlamydia trachomatis com adjuvante (como descrito acima). A primeira (dose baixa) tendo 1,25 μg de cada antígeno de proteína em 100 μΐ de composição, a segunda (dose alta) tendo 5 μg de cada proteína em 100 μΐ de composição.

Imunização e desafio Anestésico

Antes das imunizações os camundongos foram anestesiados por anestésico injetável (dose de Ketaject-Xylaject 1:1) com 30 μΐ dados intraperitonealmente por camundongo.

Antes do desafio ocular e dos esfregaços oculares, os camundongos foram anestesiados por anestésico injetável (dose de Ketaject- Xylaject 1:1) com 30 μΐ dados intraperitonealmente por camundongo e 20 μΐ intramuscularmente em cada coxa.

Imunizações

As imunizações foram dadas uma vez, duas vezes ou três vezes nos dias 0, 21 e 42 (se apropriado). Camundongos foram injetados intramuscularmente usando um volume total de 100 μΐ por camundongo, injetando 50 μΐ da formulação em cada coxa. Grupos de camundongos recebendo tratamento de acordo com a invenção foram intramuscularmente imunizados com a vacina de combinação exemplar de três proteínas de Chlamydia trachomatis (Ct-089, Ct-858 e Ct-875, 1,25 μg de cada para dose baixa, 5 μg de cada para dose alta) em 100 μΐ de formulação de adjuvante. Os camundongos de tratamento foram imunizados com duas ou três doses nos dias 0, 21 e também dia 42 para aqueles recebendo três doses.

Grupos de controle positivo de camundongos foram imunizados intramuscularmente com 10 μg de UVEB em 100 μΐ de formulação adjuvante, recebendo imunizações uma vez ou três vezes no dia 0 e também nos dias 21 e 42 para aqueles recebendo três doses. Os grupos de controle negativo foram imunizados intramuscularmente com 100 μΐ de formulação de adjuvante, recebendo imunizações três vezes nos dias 0, 21 e 42.

Desafio

Alíquotas de sorovar A, B ou K de Chlamydia trachomatis EB recém descongeladas foram cada uma separadamente diluídas em tampão SPG frio para uma concentração final de 5x10 IFU em 5 μΐ. Os inóculos foram mantidos sobre gelo durante inoculações. Camundongos

Λ

profundamente anestesiados foram desafiados no dia 70 com 5x10 IFU do sorovar apropriado, em 5 μΐ por olho, por aplicação tópica no fómice superior com uma micropipeta usando novas pontas de pipeta estéreis para Monitoração de infecção

O curso de infecção após exposição ocular foi monitorado por realização de esfregaços oculares nos dias 7, 14 e 21 após desafio e análise dos esfregações para a presença de IFU.

No final do experimento sangramento terminal foi realizado por punção cardíaca sob anestesia profunda (obtendo até 1 ml de sangue de cada camundongo). As amostras foram processadas imediatamente e armazenadas a -20°C. Camundongos foram mortos usando CO2.

Esfregaços

Os esfregões (aplicadores de ponta de poliéster estéril) foram pré-umedecidos em 1 ml de SPG em seu respectivo criofrasco. Cada esfregaço foi girado na conjuntiva e na pálpebra 30 voltas cada área enquanto o camundongo estava profundamente anestesiado. O esfregaço foi então posicionado dentro do respectivo criofrasco e deixado em gelo seco. Os criofrascos contendo os esfregaços foram armazenados a -80°C.

Titulação de esfregaços foi realizada com placas de 24 cavidades contendo monocamadas confluentes de células McCoy em meio com ciclo-hexamida (1 μg/ml). Uma vez descongelados, os criofrascos contendo os esfregaços foram agitados por 5 min na presença de glóbulos de vidro. 100 μΐ de cada um dos criofrascos contendo os esfregaços foram inoculados em uma cavidade sobre placas de 24 cavidades em dobro contendo uma monocamada de células McCoy em 1 ml de meio com ciclo-hexamida. Após centrifugação a 2000 rpm por 1 h as placas foram incubadas a 37°C e CO2 5%. As monocamadas foram fixadas em metanol em 48 horas após infecção e coradas por Azul de Evans e anticorpo anti-Chlamydia trachomatis conjugado com FITC.

As monocamadas foram examinadas para corpos de inclusão por microscopia de fluorescência invertida. O método usado para calcular o número de IFU por esfregaço consistiu de contagem de cavidade inteira sob um microscópio de fluorescência e então multiplicação pelo fator de diluição de 10. Quando nenhuns corpos de inclusão foram observados, um valor arbitrário abaixo do limite de detecção de 10 (normalmente 7) foi usado para representar o número de IFU/esfregaço.

ELISA

Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima foi realizado em amostras de soro. A ou K EB inteiros separadamente diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,1 M. Concentrado de Solução de Revestimento KPL (pH 7,2 a 7,4) serviu como antígeno (-106 FU/cavidade). Diluições seriais de soro (1:2) foram feitas após bloqueio com PBS-Tween 0,05%, BSA 1%, seguido por lavagens seqüenciais em PBS-Tween 0,05% e a adição de anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina nas cavidades IgG + IgM + IgA (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Reações foram reveladas com nitro-fenil-fosfato em tampão de substrato de dietanol-amina (sistema de substrato de microcavidade KPL p-NPP) e a absorbância em cada cavidade (OD405) foi lida após 30 a 60 min.

Sumário de tratamento

Grupo Sujeitos Tratamento Sorovar n Cepa Antígeno Sorovar Quantidade Inoculações de desafio (dia) (dia 70) 1 8 C3H - - - 3(0,21,42) K 2 8 C3H UVEB K 10 μg 1(0) K 3 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 μg 2(0,21) K Ct-875 4 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 2(0,21) K Ct-875 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 3(0,21,42) K Ct-875 6 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 3(0,21,42) K Ct-875 7 8 C57B - - 3(0,21,42) K L/6 8 8 C57B UVEB K IOMg 3(0,21,42) K L/6 9 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 2(0,21) K L/6 Ct-875 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 2(0,21) K L/6 Ct-875 11 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 3(0,21,42) K L/6 Ct-875 12 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 3(0,21,42) K L/6 Ct-875 13 8 C3H - - - 3(0,21,42) A 14 8 C3H UVEB A IOMg 3(0,21,42) A 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 2(0,21) A Ct-875 16 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 2(0,21) A Ct-875 Grupo Sujeitos Tratamento Sorovar n Cepa Antígeno Sorovar Quantidade Inoculações de desafio (dia) (dia 70) 17 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 3(0,21,42) A Ct-875 18 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 3(0,21,42) A Ct-875 19 8 C57B - - " 3(0,21,42) A L/6 8 C57B UVEB A 10 Mg 3(0,21,42) A L/6 21 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 2(0,21) A L/6 Ct-875 22 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 2(0,21) A L/6 Ct-875 23 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 3(0,21,42) A L/6 Ct-875 24 8 C57B Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 3(0,21,42) A L/6 Ct-875 8 C3H - - - 3(0,21,42) B 26 8 C3H UVEB K IOMg 3(0,21,42) B 27 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 2(0,21) B Ct-875 28 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 2(0,21) B Ct-875 29 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 1,25 Mg 3(0,21,42) B Ct-875 8 C3H Ct-089, Ct-858, E 5 Mg 3(0,21,42) B Ct-875 Resultados

Figuras 4 a 6 mostram o número de IFU presente nos esfregaços oculares obtidos respectivamente nos dias 7, 14 e 21 após desafio.

Análise estatística dos dados leva às seguintes observações

chave:

Comparação de grupos de controle negativo (adjuvante sozinho) e de controle positivo (UVEB em adjuvante)

Testes T não pareados mostram que a imunização com UVEB A fornece proteção estatisticamente significativa comparados com adjuvante sozinho em camundongos C3H nos dias 7, 14 a 21 após desafio com sorovar A (p<0,0001).

Testes T não pareados mostram que a imunização com UVEB A fomece proteção estatisticamente significativa comparada com adjuvante sozinho em camundongos C57BL/6 nos dias 7, 14 e 21 após desafio com sorovar A (p=0,0019 para dia 7, p<0,0001 para dias 14 e 21).

Nos dias 7, 14 e 21, Testes de Comparação Múltipla de Dunnett após Anova mostram que imunização com UVEB A em ambos os grupos C3H e C57BL/6 fomece proteção estatisticamente significativa comparada com adjuvantes apenas após desafio com sorovar A (p<0,01).

Testes T não-pareados mostram que imunização com UVEB K fomece proteção estatisticamente significativa comparada com adjuvante sozinho em camundongos C3H nos dias 7, 14 e 21 após desafio com sorovar K(p<0,0001).

Testes T não-pareados mostram que imunização com UVEB K fomece proteção estatisticamente significativa comparada com adjuvante sozinho em camundongos C57BL/6 nos dias 7, 14 e 21 após desafio com sorovar K (p<0,0001).

Nos dias 7, 14 e 21, testes de Comparação Múltipla de Anova- Dunnett mostram que imunização com UVEB K em ambos os grupos C3H e C57BL/6 fomece proteção estatisticamente significativa comparada com adjuvante sozinho após desafio com sorovar K (p<0,01).

Comparação de controle negativo com grupos de tratamento (i.e. x3 imunizações em dose baixa)

Testes T não-pareados comparando controles negativos (i.e. adjuvante sozinho) com imunização de acordo com a presente invenção usando uma combinação de proteínas Ct-089, Ct-858 e Ct-875 mostra uma 25 diferença significativa na proteção conferida após desafio com sorovar A ou sorovar K em ambos camundongos C3H e C57BL/6 em dias 7, 14 e 21 (p<0,0001).

Teste de Anova-Tukey comparando controles negativos (i.e. adjuvante sozinho) com imunização de acordo com a presente invenção usando uma combinação de proteínas Ct-089, Ct-858 e Ct-875 mostra uma diferença significativa na proteção conferida após desafio com sorovar B em camundongos C3H em dias 7, 14 e 21 (p<0,001).

Em dias 7, 14 e 21, testes de Comparação Múltipla de Dunnett após Anova mostram diferenças estatísticas significativas na proteção conferida pelo controle negativo quando comparada com o tratamento de combinação em ambos camundongos C3H e C57BL/6 após desafio com sorovar A (p<0,01).

Comparação de controles positivos com grupos de tratamento de dose alta triplamente imunizados

Em dias 7, 14 e 21, testes de Comparação Múltipla de Dunnett após Anova não mostraram diferenças estatísticas significativas (p>0,05) entre o controle positivo (i.e. imunização com UVEB) e o tratamento de combinação correspondente em camundongos C3H e C57BL/6 após desafio com sorovar A.

Em dias 7, 14 e 21, testes de Comparação Múltipla de Dunnett após Anova não mostraram diferenças estatísticas significativas (p>0,05) entre o controle positivo (i.e. imunização com UVEB) e o tratamento de combinação correspondente em camundongos C3H e C57BL/6 após desafio com sorovar K.

Em dias 7, 14 e 21, testes de Comparação Múltipla de Dunnett após Anova não mostraram diferenças estatísticas significativas (p>0,05) entre o controle positivo (i.e. imunização com UVEB) e o tratamento de combinação correspondente em camundongos C3H após desafio com sorovar B.

Conclusão

Adjuvante sozinho (controle negativo) é incapaz de conferir proteção contra infecção ocular.

UVEBs em adjuvante (controle positivo) de sorovar A ou K conferem proteção contra infecção ocular com sorovares AeK respectivamente em ambas as cepas de camundongos em todos os instantes de tempo.

Tratamento com composições imunogênicas de acordo com a presente invenção (que são derivadas de sorovar E em cada caso) resulta em proteção estatisticamente significativa contra infecção ocular com sorovar A ou sorovar K em qualquer cepa de camundongos em todos os instantes de tempo quando as três imunizações de dose alta são fornecidas. Níveis similares de proteção são observados com respeito ao desafio de sorovar B em camundongos C3H, embora análise estatística não tenha sido realizada para confirmar a significância deste resultado. .

Duas imunizações de dose alta fornecem proteção melhorada em todos os casos quando comparadas com as três imunizações de dose alta.

Os resultados mostram que o tratamento de acordo com a presente invenção fomece proteção substancial contra infecção ocular (equivalente a UVEB), é capaz de induzir proteção de sorovares diferentes daqueles dos quais a composição imunogênica é derivada (i.e. proteção de sorovar-cruzada contra infecção ocular). Ademais, tal proteção pode ser alcançada pela administração via rota não-ocular.

Todas as referências citadas neste pedido, incluindo patente e pedidos de patente, são aqui incorporadas como referências na extensão máxima possível.

Em todo o relatório descritivo e nas reivindicações que seguem, a não ser que o contexto exija de outro modo, a palavra 'compreender', e variações tais como 'compreende', 'compreendem', e 'compreendendo', serão entendidas em implicar a inclusão de um número inteiro, uma etapa, um grupo de números inteiros ou grupo de etapas mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro, outra etapa, outro grupo de números inteiros ou outro grupo de etapas. O pedido do qual esta descrição e estas reivindicações formam parte pode ser usado como uma base de prioridade com respeito a qualquer pedido subseqüente. As reivindicações de tal pedido subseqüente podem ser direcionadas para qualquer característica ou combinação de características 5 aqui descrita. Podem tomar a forma de reivindicações de produto, composição, processo, ou uso e podem incluir, por meio de exemplo e sem limitação, as seguintes reivindicações: I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA Corixa Corporation Mettens, Pascal Lobet, Yves Alderson1 Mark R Maisonneuve, Jean-Francois Probst, Peter Coler, Rhea Reed, Steve

<120> VACINAS CONTRA INFECÇÃO CLAMÍDICA

<130> VU62162PCT

<150> US60/828,092 <151> 2006-10-04

<160> 126

<170> Patentln version 3.1

<210> 1 <211> 261 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 1

atgagtcaaa ataagaactc tgctttcatg cagcctgtga acgtatccgc tgatttagct gccatcgttg gtgcaggacc tatgcctcgc acagagatca ttaagaaaat gtgggattac attaaggaga atagtcttca agatcctaca aacaaacgta atatcaatcc cgatgataaa ttggctaaag tttttggaac tgaaaaacct atcgatatgt tccaaatgac aaaaatggtt tctcaacaca tcattaaata a

<210> 2 <211> 86 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 2

Met Ser Gln Asn Lys Asn Ser Ala Phe Met Gln Pro Val Asn Val Ser 10 15

Ala Asp Leu Ala Ala Ile Val Gly Ala Gly Pro Met Pro Arg Thr Glu 20 25 30

Ile Ile Lys Lys Met Trp Asp Tyr Ile Lys Glu Asn Ser Leu Gln Asp 35 40 45

Pro Thr Asn Lys Arg Asn Ile Asn Pro Asp Asp Lys Leu Ala Lys Val 50 55 60

60

120

180

240

261 Phe Gly Thr Glu Lys Pro Ile Asp Met Phe Gln Met Thr Lys Met Val 65 70 75 80

Ser Gln His He Ile Lys 85

<210> 3 <211> 1122 <212> DNA

<213> Chlarnydia trachomatis <400> 3

ctgcctgtgg ggaatcctgc tgaaccaagc cttatgatcg acggaattct gtgggaaggt

ttcggcggag atccttgcga tccttgcacc acttggtgtg acgctatcag catgcgtatg

ggttactatg gtgactttgt tttcgaccgt gttttgaaaa cagatgtgaa taaagagttt

gaaatgggcg aggctttagc cggagcttct gggaatacga cctctactct ttcaaaattg

gtagaacgaa cgaaccctgc atatggcaag catatgcaag acgcagagat gtttaccaat

gccgcttgca tgacattgaa tatttgggat cgttttgatg tattctgtac attaggagcc

accagtggat atcttaaagg aaattcagca tctttcaact tagttgggtt attcggcgat

ggtgtaaacg ccacgaaacc tgctgcagat agtattccta acgtgcagtt aaatcagtct

gtggtggaac tgtatacaga tactactttt gcttggagtg ttggagctcg tgcagctttg

tgggaatgtg gatgtgcaac tttaggagct tctttccaat atgctcaatc taaacctaaa

atcgaagaat taaacgttct ctgtaacgca gcagagttta ctattaataa acctaaaggg

tatgtaggta aggagtttcc tcttgatctt acagcaggaa cagatgcagc gacgggcact

aaagatgcct ctattgatta ccatgagtgg caagcaagtt tatctctttc ttacagactc

aatatgttca ctccctacat tggagttaaa tggtctcgtg caagctttga ttctgataca

attcgtatag cccagccgag gttggtaaca cctgttgtag atattacaac ccttaaccca

actattgcag gatgcggcag tgtagctgga gctaacacgg aaggacagat atctgataca

atgcaaatcg tctccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca

gtaggaacaa ctattgtgga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc

gatgagagag ctgctcacgt aaatgcacaa ttccgcttct ag

<210> 4

<211> 373

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 4

Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu Met Ile Asp Gly Ile 1 5 10 15 Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro cys Asp Pro Cys Thr Thr T rp 20 25 30 Cys Asp Al a Ile ser Met Arg Met Gly Tyr Tyr Gly ASp Phe Val Phe 35 40 45 Asp Arg Val Leu Lys Thr Asp Val Asn Lys Glu Phe Glu Met Gly Glu 50 55 60 Ala Leu Ala Gly Ala Ser Gly Asn Thr Thr Ser Thr Leu Ser Lys Leu 65 70 75 80 Val Gl u Arg Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Lys Hi S Met Gln Asp Al a Glu 85 90 95 Met Phe Thr Asn Ala Ala Cys Met Thr Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe 100 105 110 Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn 115 120 125 Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp Gly Val Asn Ala 130 135 140 Thr Lys Pro Ala Ala Asp Ser Ile Pro Asn Val Gln Leu Asn Gln Ser 145 150 155 160 Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala Trp Ser Val Gly Ala 165 170 175 Arg Al a Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Al a Thr Leu Gly Ala Ser Phe 1ΛΠ ι«ς IQn 60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1122 Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Ile Glu Glu Leu Asn Val Leu Cys 195 200 205 Asn Ala Al a Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys 210 215 220 Glu Phe Pro Leu Asp Leu Thr Ala Gly Thr Asp Ala Ala Thr Gly Thr 225 230 235 240 Lys Asp Ala Ser Ile ASp Tyr Hi S Glu T rp Gln Ala Ser Leu Ser Leu 245 250 255 Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser 260 265 270 Arg Ala Ser Phe Asp Ser Asp Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Arg Leu 275 280 285 Val Thr Pro val Val Asp Ile Thr Thr Leu Asn Pro Thr Ile Ala Gly 290 295 300 Cys Gly Ser Val Ala Gly Ala Asn Thr Glu Gly Gln Ile Ser Asp Thr 305 310 315 320 Met Gln Ile Val Ser Leu Gl n Leu Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ser 325 330 335 Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp Ala Asp Lys Tyr Ala 340 345 350 val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala Ala His Val Asn 355 360 365 Al a Gln Phe Arg Phe 370 <210> 5 <211> 1746 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 5

gtacgaggag aaagcttggt ttgcaagaat gctcttcaag atttgagttt tttagagcat 60

ttattacagg ttaaatatgc tcctaaaaca tggaaagagc aatacttagg atgggatctt 120

gttcaaagct ccgtttctgc acagcagaag cttcgtacac aagaaaatcc atcaacaagt 180

ttttgccagc aggtccttgc tgattttatc ggaggattaa atgactttca cgctggagta 240

actttctttg cgatagaaag tgcttacctt ccttataccg tacaaaaaag tagtgacggc 300

cgtttctact ttgtagatat catgactttt tcttcagaga tccgtgttgg agatgagttg 360

ctagaggtgg atggggcgcc tgtccaagat gtgctcgcta ctctatatgg aagcaatcac 420

aaagggactg cagctgaaga gtcggctgct ttaagaacac tattttctcg catggcctct 480

ttagggcaca aagtaccttc tgggcgcact actttaaaga ttcgtcgtcc ttttggtact 540

acgagagaag ttcgtgtgaa atggcgttat gttcctgaag gtgtaggaga tttggctacc 600

atagctcctt ctatcagggc tccacagtta cagaaatcga tgagaagctt tttccctaag 660

aaagatgatg cgtttcatcg gtctagttcg ctattctact ctccaatggt tccgcatttt 720

tgggcagagc ttcgcaatca ttatgcaacg agtggtttga aaagcgggta caatattggg 780

agtaccgatg ggtttctccc tgtcattggg cctgttatat gggagtcgga gggtcttttc 840

cgcgcttata tttcttcggt gactgatggg gatggtaaga gccataaagt aggatttcta 900

agaattccta catatagttg gcaggacatg gaagattttg atccttcagg accgcctcct 960

tgggaagaat ttgctaagat tattcaagta ttttcttcta atacagaagc tttgattatc 1020

gaccaaacga acaacccagg tggtagtgtc ctttatcttt atgcactgct ttccatgttg 1080

acagaccgtc ctttagaact tcctaaacat agaatgattc tgactcagga tgaagtggtt 1140

gatgctttag attggttaac cctgttggaa aacgtagaca caaacgtgga gtctcgcctt 1200

gctctgggag acaacatgga aggatatact gtggatctac aggttgccga gtatttaaaa 1260

agctttggac gtcaagtatt gaattgttgg agtaaagggg atatcgagtt atcaacacct 1320

attcctcttt ttggttttga gaagattcat ccacatcctc gagttcaata ctctaaaccg 1380

atttgtgttt tgatcaatga gcaagacttt tcttgtgctg acttcttccc tgtagttttg 1440

aaagacaatg atcgagctct tattgttggt actcgaacag ctggagctgg aggatttgtc 1500

tttaatgtgc agttcccaaa tagaactgga ataaaaactt gttctttaac aggatcatta 1560

gctgttagag agcatggtgc cttcattgag aacatcggag tcgaaccgca tatcgatctg 1620

ccttttacag cgaatgatat tcgctataaa ggctattccg agtatcttga taaggtcaaa 1680

aaattggttt gtcagctgat caataacgac ggtaccatta ttcttgcgga agatggtagt 1740

ttttaa 1746 <210> 6 <211> 581 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 6

Val Arg Gly Glu Ser Leu Val Cys Lys Asn Ala Leu Gln Asp Leu Ser 10 15

Phe Leu Glu His Leu Leu Gln Val Lys Tyr Ala Pro Lys Thr Trp Lys 20 25 30

Glu Gln Tyr Leu Gly Trp Asp Leu Val Gln Ser Ser Val Ser Ala Gln 35 40 45

Gln Lys Leu Arg Thr Gln Glu Asn Pro Ser Thr Ser Phe Cys Gln Gln 50 55 60

Val Leu Ala Asp Phe Ile Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly Val 65 70 75 80

Thr Phe Phe Ala Ile Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Tyr Thr Val Gln Lys 85 90 95

Ser Ser Asp Gly Arg Phe Tyr Phe Val Asp Ile Met Thr Phe Ser Ser 100 105 110

Glu Ile Arg Val Gly Asp Glu Leu Leu Glu Val Asp Gly Ala Pro Val 115 120 125

Gln Asp Val Leu Ala Thr Leu Tyr Gly Ser Asn His Lys Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Glu Glu Ser Ala Ala Leu Arg Thr Leu Phe Ser Arg Met Ala Ser 145 150 155 160

Leu Gly His Lys Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys Ile Arg Arg 165 170 175

Pro Phe Gly Thr Thr Arg Glu Val Arg Val Lys Trp Arg Tyr Val Pro 180 185 190

Glu Gly Val Gly Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Ser Ile Arg Ala Pro 195 200 205

Gln Leu Gln Lys Ser Met Arg Ser Phe Phe Pro Lys Lys Asp Asp Ala 210 215 220

Phe His Arg Ser Ser Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Val Pro His Phe 225 230 235 240

Trp Ala Glu Leu Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser Gly 245 250 255

Tyr Asn Ile Gly Ser Thr Asp Gly Phe Leu Pro Val Ile Gly Pro Val 260 265 270

Ile Trp Glu Ser Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr Ile Ser Ser Val Thr 275 280 285

Asp Gly Asp Gly Lys Ser His Lys Val Gly Phe Leu Arg Ile Pro Thr 290 295 300

Tyr Ser Trp Gln Asp Met Glu Asp Phe Asp Pro Ser Gly Pro Pro Pro 305 310 315 320

Trp Glu Glu Phe Ala Lys Ile Ile Gln Val Phe Ser Ser Asn Thr Glu 325 330 335

Ala Leu Ile Ile Asp Gln Thr Asn Asn Pro Gly Gly Ser Val Leu Tyr 340 345 350

Leu Tyr Ala Leu Leu Ser Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu Pro 355 360 365 Lys Hi S Arg Met Ile Leu Thr Gln Asp Glu val val Asp Ala Leu ASp 370 375 380 Trp Leu Thr Leu Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val Glu Ser Arg Leu 385 390 395 400 Ala Leu Gly Asp Asn Met Glu Gly Tyr Thr Val Asp Leu Gln val Ala 405 410 415 Glu Tyr Leu Lys Ser Phe Gly Arg Gln Val Leu Asn Cys Trp Ser Lys 420 425 430 Gly Asp Ile Glu Leu Ser Thr Pro Ile Pro Leu Phe Gly Phe Glu Lys 435 440 445 Ile Hi s Pro His Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Val Leu 450 455 460 Ile Asn Glu Gln Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val Leu 465 470 475 480 Lys Asp Asn Asp Arg Al a Leu Ile Val Gly Thr Arg Thr Ala Gly Ala 485 490 495 Gly Gly Phe Val Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly Ile Lys 500 505 510 Thr Cys Ser Leu Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu Hi s Gly Ala Phe 515 520 525 Ile Glu Asn Ile Gly Val Glu Pro Hi s Ile As p Leu Pro Phe Thr Ala 530 535 540 Asn Asp Ile Arg Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val Lys 545 550 555 560 Lys Leu Val Cys Gln Leu Ile Asn Asn Asp Gly Thr Ile Ile Leu Ala 565 570 575 Glu Asp Gly Ser Phe 580

<210> 7 <211> 1776 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 7

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60

ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag ggtaataata aagttgaaga tcgagtttgt 120

tctctatatt catctcgtag taacgaaaat agagaatctc cttatgcagt agtagacgtc 180

agctctatga tcgagagcac cccaacgagt ggagagacga caagagcttc gcgtggagtg 240

ctcagtcgtt tccaaagagg tttagtacga atagctgaca aagtaagacg agctgttcag 300

tgtgcgtgga gttcagtctc tacaagcaga tcgtctgcaa caagagccgc agaatccgga 360

tcaagtagtc gtactgctcg tggtgcaagt tctgggtata gggagtattc tccttcagca 420

gctagagggc tgcgtcttat gttcacagat ttctggagaa ctcgggtttt acgccagacc 480

tctcctatgg ctggagtttt tgggaatctt gatgtgaacg aggctcgttt gatggctgcg 540

tacacaagtg agtgcgcgga tcatttagaa gcgaaggagt tggctggccc tgacggggta 600

gcggccgccc gggaaattgc taaaagatgg gagaaaagag ttagagatct acaagataaa 660

ggtgctgcac gaaaattatt aaatgatcct ttaggccgac gaacacctaa ttatcagagc 720

aaaaatccag gtgagtatac tgtagggaat tccatgtttt acgatggtcc tcaggtagcg 780

aatctccaga acgtcgacac tggtttttgg ctggacatga gcaatctctc agacgttgta 840

ttatccagag agattcaaac aggacttcga gcacgagcta ctttggaaga atccatgccg 900

atgttagaga atttagaaga gcgttttaga cgtttgcaag aaacttgtga tgcggctcgt 960

actgagatag aagaatcggg atggactcga gagtccgcat caagaatgga aggcgatgag 1020

gcgcaaggac cttctagagt acaacaagct tttcagagct ttgtaaatga atgtaacagc 1080

atcgagttct catttgggag ctttggagag catgtgcgag ttctctgcgc tagagtatca 1140

cgaggattag ctgccgcagg agaggcgatt cgccgttgct tctcttgttg taaaggatcg 1200

acgcatcgct acgctcctcg cgatgaccta tctcctgaag gtgcatcgtt agcagagact 1260

ttggctagat tcgcagatga tatgggaata gagcgaggtg ctgatggaac ctacgatatt 1320

cctttggtag atgattggag aagaggggtt cctagtattg aaggagaagg atctgactcg 1380

atctatgaaa tcatgatgcc tatctatgaa gttatgaata tggatctaga aacacgaaga 1440

tcttttgcgg tacagcaagg gcactatcag gacccaagag cttcagatta tgacctccca 1500

cgtgctagcg actatgattt gcctagaagc ccatatccta ctccaccttt gcctcctaga 1560

tatcagctac agaatatgga tgtagaagca gggttccgtg aggcagttta tgcttctttt 1620 gtagcaggaa tgtacaatta tgtagtgaca cagccgcaag agcgtattcc caatagtcag caggtggaag ggattctgcg tgatatgctt accaacgggt cacagacatt tagagacctg atgaagcgtt ggaatagaga agtcgatagg gaataa

<210> 8 <211> 591 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 8

Met Ser Ile Arg Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Gly Asn 20 25 30

Asn Lys Val Glu Asp Arg Val Cys Ser Leu Tyr Ser Ser Arg Ser Asn 35 40 45

Glu Asn Arg Glu Ser Pro Tyr Ala Val Val Asp Val Ser Ser Met Ile 50 55 60

Glu Ser Thr Pro Thr Ser Gly Glu Thr Thr Arg Ala Ser Arg Gly Val 65 70 75 80

Leu Ser Arg Phe Gln Arg Gly Leu Val Arg Ile Ala Asp Lys Val Arg 85 90 95

Arg Ala Val Gln Cys Ala Trp Ser Ser Val Ser Thr Ser Arg Ser Ser 100 105 110

Ala Thr Arg Ala Ala Glu Ser Gly Ser Ser Ser Arg Thr Ala Arg Gly 115 120 125

Ala Ser Ser Gly Tyr Arg Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arg Gly Leu 130 135 140

Arg Leu Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr 145 150 155 160

Ser Pro Met Ala Gly Val Phe Gly Asn Leu Asp Val Asn Glu Ala Arg 165 170 175

Leu Met Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Cys Ala Asp His Leu Glu Ala Lys 180 185 190

Glu Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Lys 195 200 205

Arg Trp Glu Lys Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Arg 210 215 220

Lys Leu Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser 225 230 235 240

Lys Asn Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn Ser Met Phe Tyr Asp Gly 245 250 255

1680

1740

1776 Pro Gln Val Ala Asn Leu Gln Asn Val Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp

260 265 270

Met Ser Asn Leu Ser Asp Val Val Leu Ser Arg Glu Ile Gln Thr Gly 275 280 285

Leu Arg Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn 290 295 300

Leu Glu Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg

305 310 315 320

Thr Glu Ile Glu Glu Ser Gly Trp Thr Arg Glu Ser Ala Ser Arg Met

325 330 335

Glu Gly Asp Glu Ala Gln Gly Pro Ser Arg Val Gln Gln Ala Phe Gln 340 345 350

Ser Phe Val Asn Glu Cys Asn Ser Ile Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe 355 360 365

Gly Glu His Val Arg Val Leu Cys Ala Arg Val Ser Arg Gly Leu Ala 370 375 380

Ala Ala Gly Glu Ala Ile Arg Arg Cys Phe Ser Cys Cys Lys Gly Ser 385 390 395 400

Thr His Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Asp Leu Ser Pro Glu Gly Ala ser 405 410 415

Leu Ala Glu Thr Leu Ala Arg Phe Ala Asp Asp Met Gly Ile Glu Arg 420 425 430

Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Pro Leu Val Asp Asp Trp Arg Arg 435 440 445

Gly Val Pro Ser Ile Glu Gly Glu Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Glu Ile 450 455 460

Met Met Pro Ile Tyr Glu Val Met Asn Met Asp Leu Glu Thr Arg Arg 465 470 475 480

Ser Phe Ala Val Gln Gln Gly His Tyr Gln Asp Pro Arg Ala Ser Asp 485 490 495

Tyr Asp Leu Pro Arg Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Pro Arg Ser Pro Tyr 500 505 510

Pro Thr Pro Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Gln Leu Gln Asn Met Asp Val 515 520 525

Glu Ala Gly Phe Arg Glu Ala Val Tyr Ala Ser Phe Val Ala Gly Met 530 535 540

Tyr Asn Tyr Val Val Thr Gln Pro Gln Glu Arg Ile Pro Asn Ser Gln 545 550 555 560 Gln Val Glu Gly Ile Leu Arg Asp Met Leu Thr Asn Gly Ser Gln Thr

Phe Arg Asp Leu Met Lys Arg Trp Asn Arg Glu Val Asp Arq Glu

<210> 9 <211> 1962

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 9

atggaatcag gaccagaatc agtttcttct aatcagagct cgatgaatcc aattattaat 60

gggcaaatcg cttctaattc ggagaccaaa gagtccacga aggcgtccga agcgagtcct 120

tcagcatcgt cctctgtaag cagctggagt tttttatcct cagcaaagaa tgcattaatc 180

tctcttcgtg atgccatctt gaataaaaat tccagtccaa cagactctct ctctcaatta 240

gaggcctcta cttctacctc tacggttaca cgtgtagcgg caaaagatta tgatgaggct 300

aaatcgaatt ttgatacggc gaaaagtgga ttagagaacg ctaagacact tgctgaatac 360

gaaacgaaaa tggctgattt gatggcagct ctccaagata tggagcgttt agctaattca 420

gatcctagta acaatcatac cgaagaagta aataatatta agaaagcgct cgaagcacaa 480

aaagatacta ttgataagct gaataaactc gttacgctgc aaaatcagaa taaatcttta 540

acagaagtgt tgaaaacaac tgactctgca gatcagattc cagcgattaa tagtcagtta 600

gagatcaaca aaaattctgc agatcaaatt atcaaagatc tggaaagaca aaacataagt 660

tatgaagctg ttctcactaa cgcaggagag gttatcaaag cttcttctga agcgggaatt 720

aagttaggac aagctttgca gtctattgtg gatgctgggg accaaagtca ggctgcagtt 780

ctgcaagcac agcaaaataa tagcccagat aatattgcag ccacgaagga attaattgat 840

gctgctgaaa cgaaggtaaa cgagttaaaa caagagcata cagggctaac ggactcgcct 900

ttagtgaaaa aagctgagga gcagattagt caagcacaaa aagatattca agagatcaaa 960

cctagtggtt cggatattcc tatcgttggt ccgagtgggt cagctgcttc cgcaggaagt 1020

gcggcaggag cgttgaaatc ctctaacaat tcaggaagaa tttccttgtt gcttgatgat 1080

gtagacaatg aaatggcagc gattgcactg caaggttttc gatctatgat cgaacaattt 1140

aatgtaaaca atcctgcaac agctaaagag ctacaagcta tggaggctca gctgactgcg 1200

atgtcagatc aactggttgg tgcggatggc gagctcccag ccgaaataca agcaatcaaa 1260

gatgctcttg cgcaagcttt gaaacaacca tcagcagatg gtttggctac agctatggga 1320

caagtggctt ttgcagctgc caaggttgga ggaggctccg caggaacagc tggcactgtc 1380

cagatgaatg taaaacagct ttacaagaca gcgttttctt cgacttcttc cagctcttat 1440

gcagcagcac tttccgatgg atattctgct tacaaaacac tgaactcttt atattccgaa 1500

agcagaagcg gcgtgcagtc agctattagt caaactgcaa atcccgcgct ttccagaagc 1560

gtttctcgtt ctggcataga aagtcaagga cgcagtgcag atgctagcca aagagcagca 1620

gaaactattg tcagagatag ccaaacgtta ggtgatgtat atagccgctt acaggttctg 1680

gattctttga tgtctacgat tgtgagcaat ccgcaagcaa atcaagaaga gattatgcag 1740

aagctcacgg catctattag caaagctcca caatttgggt atcctgctgt tcagaattct 1800

gcggatagct tgcagaagtt tgctgcgcaa ttggaaagag agtttgttga tggggaacgt 1860

agtctcgcag aatctcaaga gaatgcgttt agaaaacagc ccgctttcat tcaacaggtg 1920

ttggtaaaca ttgcttctct attctctggt tatctttctt aa 1962

<210> 10 <211> 653 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 10

Met Glu Ser Gly Pro Glu Ser Val Ser Ser Asn Gln Ser Ser Met Asn

Pro Ile Ile Asn Gly Gln Ile Ala Ser Asn Ser Glu Thr Lys Glu Ser 20 25 30

Thr Lys Ala Ser Glu Ala Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser

35 40 45

Trp Ser Phe Leu Ser Ser Ala Lys Asn Ala Leu Ile Ser Leu Arg Asp

Ala Ile Leu Asn Lys Asn Ser Ser Pro Thr Asp Ser Leu Ser Gln Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Thr Val Thr Arg Val Ala Ala Lys Asp

Tyr Asp Glu Ala Lys Ser Asn Phe Asp Thr Ala Lys Ser Gly Leu Glu 100 105 HO

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Asn Lys Ser Leu Thr Glu Val Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Asp Gln 180 185 190

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Ala Leu Gln Gly Phe Arg Ser Met Ile Glu Gln Phe Asn Val Asn Asn 370 375 380 Pro Ala Thr Ala Lys Glu Leu Gln Ala Met Glu Ala Gln Leu Thr Ala 385 390 395 400

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<210> 11 <211> 2010 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 11

gcagaaatca tgattcctca aggaatttac gatggggaga cgttaactgt atcatttccc tatactgtta taggagatcc gagtgggact actgtttttt ctgcaggaga gttaacatta

60

120 aaaaatcttg acaattctat tgcagctttg cctttaagtt gttttgggaa cttattaggg 180

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aatggggcag ctctaagtaa tagcgctgct gatggactgt ttactattga gggttttaaa 300

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acagatcttt tgttactcaa taatgagaag ttctcattct atagtaattt agtctctgga 480

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ctgaaagcta catggactaa aactgggtaa 2010

<210> 12 <211> 669 <212> PRT <213> Chlamydia trachomatis <400> 12 Ala Glu Ile Met Ile Pro Gln Gly 1 5 10 15

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100 105 110

val Leu Pro Ala Ala Thr Thr Asn Lys Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr

115 120 125

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Asp Gly Gly Ala Ile Asp Ala Lys Ser Leu Thr val Gln Gly Ile Ser 165 170 175

Lys Leu Cys Val Phe Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala 180 185 190

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290 295 300

Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln

305 310 315 320

Ala Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val 325 330 335

Val Phe Phe Ser Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Tyr

340 345 350

Ala Lys Lys Leu Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Arg

355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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Ser Thr Leu Tyr Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu 485 490 495

Arg Glu Lys Ala Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly 500 505 510

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Pro Pro Thr Asn Pro Pro Ala Gln Asp Ser His Pro Ala Val Ile Gly 565 570 575

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Asp Leu Asp Asp Thr Ala Tyr Asp Arg Tyr Asp Trp Leu Gly Ser Asn 595 600 605

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Tyr Gln Gly Ser Trp Lys Leu Ala Trp Asp Pro Asn Thr Ala Asn Asn

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<210> 13 <211> 3519 <212> DNA

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agttgcgtag atcttcatgc tggaggacag tctgtaaatg agctggtata tgtaggccct 60

caagcggttt tattgttaga ccaaattcga gatctattcg ttgggtctaa agatagtcag 120

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ttccaaggtg tggaccaaca ggatcaagtc tcttcccaag ggttaatttg tagttttacg 300

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gatagtagta aggctggaat cacattaact gacgtgaaag cttctttgtc tggagcggct 420

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gaaggaaaca gcgcgaactt tgctaatgga ggagcgattg ctgcctctgg gaaagtgctt 780 tttgtcgcta atgataaaaa gacttctttt atagagaacc gagctttgtc tggaggagcg 840

attgcagcct cttctgatat tgcctttcaa aactgcgcag aactagtttt caaaggcaat 900

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accgttcttt tgcaagggaa tcacgggata acttgtgata agaatgagtc tgcttcgcaa 1020

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ggaggaggag cgattttagc tactggtaag gtggaaatta ccaataattc cggaggaatt 1500

tcttttacag gaaatgcgag agctccacaa gctcttccaa ctcaagagga gtttccttta 1560

ttcagcaaaa aagaagggcg accactctct tcaggatatt ctgggggagg agcgatttta 1620

ggaagagaag tagctattct ccacaacgct gcagtagtat ttgagcaaaa tcgtttgcag 1680

tgcagcgaag aagaagcgac attattaggt tgttgtggag gaggcgctgt tcatgggatg 1740

gatagcactt cgattgttgg caactcttca gtaagatttg gtaataatta cgcaatggga 1800

caaggagtct caggaggagc tcttttatct aaaacagtgc agttagctgg aaatggaagc 1860

gtcgattttt ctcgaaatat tgctagtttg ggaggaggag ctcttcaagc ttctgaagga 1920

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gcaggtaaag aatcgcatat tacagccctg aatgctacgg aaggacatgc tattgttttc 2760

cacgacgcat tagtttttga aaatctaaaa gaaaggaaat ctgctgaagt attgttaatc 2820

aatagtcgag aaaatccagg ttacactgga tctattcgat ttttagaagc agaaagtaaa 2880

gttcctcaat gtattcatgt acaacaagga agccttgagt tgctaaatgg agctacatta 2940

tgtagttatg gttttaaaca agatgctgga gctaagttgg tattggctgc tggatctaaa 3000

ctgaagattt tagattcagg aactcctgta caagggcatg ctatcagtaa acctgaagca 3060

gaaatcgagt catcttctga accagagggt gcacattctc tttggattgc gaagaatgct 3120

caaacaacag ttcctatggt tgatatccat actatttctg tagatttagc ctccttctct 3180

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gaagcttcag ccgaaatcag taacttgtcg gtttctgatt tacagattca tgtagcaact 3420

ccagagattg aagaagacac atacggccat atgggagatt ggtctgaggc taaaattcaa 3480

gatggaactc ttgtcattag ttggaatcct actggataa 3519

<210> 14 <211> 1172 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 14

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Cys Ser Phe Thr Ser Ser Asn Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Glu Ser 100

105

HO

Phe Leu Gly Ile Ala Phe Val Gly Asp Ser Ser Lys Ala Gly Ile Thr 115 120 125

Leu Thr Asp Val Lys Ala Ser Leu Ser Gly Ala Ala Leu Tyr Ser Thr 130 135 140

Glu Asp Leu Ile Phe Glu Lys Ile Lys Gly Gly Leu Glu Phe Ala ser 145 150 155 160

Cys Ser Ser Leu Glu Gln Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gln Ser Ile Leu 165 170 175

Ile His Asp Cys Gln Gly Leu Gln Val Lys His Cys Thr Thr Ala Val 180 185 190

Asn Ala Glu Gly Ser Ser Ala Asn Asp His Leu Gly Phe Gly Gly Gly 195 200 205

Ala Phe Phe Val Thr Gly Ser Leu Ser Gly Glu Lys Ser Leu Tyr Met 210 215 220

Pro Ala Gly Asp Met Val Val Ala Asn Cys Asp Gly Ala Ile Ser Phe 225 230 235 240

Glu Gly Asn Ser Ala Asn Phe Ala Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ala Ser 245 250 255

Gly Lys Val Leu Phe Val Ala Asn Asp Lys Lys Thr Ser Phe Ile Glu 260 265 270

Asn Arg Ala Leu Ser Gly Gly Ala Ile Ala Ala Ser Ser Asp Ile Ala 275 280 285

Phe Gln Asn Cys Ala Glu Leu Val Phe Lys Gly Asn Cys Ala Ile Gly 290 295 300

Thr Glu Asp Lys Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ser Ser Leu Gly 305 310 315 320

Thr Val Leu Leu Gln Gly Asn His Gly Ile Thr Cys Asp Lys Asn Glu 325 330 335

Ser Ala Ser Gln Gly Gly Ala Ile Phe Gly Lys Asn Cys Gln Ile Ser 340 345 350

Asp Asn Glu Gly Pro vai vai Phe Arg Asp Ser Thr Ala Cys Leu Gly 355 360 365

Gly Gly Ala Ile Ala Ala Gln Glu Ile Val Ser Ile Gln Asn Asn Gln 370 375 380

Ala Gly Ile Ser Phe Glu Gly Gly Lys Ala Ser Phe Gly Gly Gly Ile 385 390 395 400

Ala Cys Gly Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Gly Thr 405 410 415

Ile Asp Ile Ser Lys Asn Leu Gly Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Leu 420 425 430

Cys Thr Thr Ser Asp Leu Gly Gln Met Glu Tyr Gln Gly Gly Gly Ala 435 440 445

Leu Phe Gly Glu Asn Ile Ser Leu Ser Glu Asn Ala Gly Val Leu Thr 450 455 460

Phe Lys Asp Asn lle Val Lys Thr Phe Ala Ser Asn Gly Lys Ile Leu 465 470 475 480

Gly Gly Gly Ala lle Leu Ala Thr Gly Lys Val Glu Ile Thr Asn Asn 485 490 495

Ser Gly Gly lle Ser Phe Thr Gly Asn Ala Arg Ala Pro Gln Ala Leu 500 505 510 Pro Thr

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Leu Ser

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515

Ser Gly

Leu His

Glu Glu

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Tyr Ala Met Gly Gln Gly Val Ser Gly Gly Ala Leu 600 605

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Leu Asp Gly

Val Val Phe

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Asn Gln Glu

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Phe Thr

Glu vai

Ser Ser

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Gly Asn Asn Ser Lys Glu

vai Phe

Gly Ser

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Ser Gly Asn

Asp Glu His

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Phe Ser Asp

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Phe Gly Gly 880

Gly Ser Asp 895

Leu Asn Ala 910 Thr Gl u Gly His Ala Ile Val Phe Hi S Asp Ala Leu Val Phe Glu Asn 915 920 925 Leu Lys Glu Arg Lys Ser Al a Glu Val Leu Leu lle Asn Ser Arg Glu 930 935 940 Asn Pro Gly Tyr Thr Gly Ser Ile Arg Phe Leu Glu Ala Glu Ser Lys 945 950 955 960 Val Pro Gln Cys Ile His Val Gln Gln Gly Ser Leu Glu Leu Leu Asn 965 970 975 Gly Al a Thr Leu Cys Ser Tyr Gly Phe Lys Gln Asp Ala Gly Ala Lys 980 985 990 Leu Val Leu Ala Ala Gly Ser Lys Leu I Lys ; Ile I Leu I Asp Ser Gly Thr 995 1000 1005

Pro Val Gln Gly His Ala lle Ser Lys Pro Glu Ala Glu Ile Glu 1010 1015 1020 Ser Ser Ser Glu Pro Glu Gly Ala Hi S Ser Leu Trp Ile Ala Lys 1025 1030 1035 Asn Al a Gln Thr Thr Val Pro Met Val Asp Ile Hi S Thr Ile Ser 1040 1045 1050 Val Asp Leu Ala Ser Phe Ser Ser Ser Gln Gln Glu Gly Thr Val 1055 1060 1065 Glu Al a Pro Gln Val Ile Val Pro Gly Gly Ser Tyr Val Arg Ser 1070 1075 1080 Gly Glu Leu Asn Leu Glu Leu Val Asn Thr Thr Gly Thr Gly Tyr 1085 1090 1095 Glu Asn His Ala Leu Leu Lys Asn Glu Ala Lys Val Pro Leu Met 1100 1105 1110 Ser Phe vai Ala Ser Ser Asp Glu Al a Ser Ala Glu Ile Ser Asn 1115 1120 1125 Leu Ser Val Ser Asp Leu Gln Ile Hi s Val Ala Thr Pro Glu Ile 1130 1135 1140 Glu Glu Asp Thr Tyr Gly His Met Gly Asp Trp Ser Glu Ala Lys 1145 1150 1155 Ile Gln Asp Gly Thr Leu Val Ile Ser Trp Asn Pro Thr Gly 1160 1165 1170 <210> 15 <211> 1266 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 15

atgactgcat caggaggagc tggagggcta ggcagcaccc aaacagtaga cgttgcgcga 60

gcacaagctg ctgcagctac tcaagatgca caagaggtta tcggctctca ggaagcttct 120

gaggcaagta tgctcaaagg atgtgaggat ctcataaatc ctgcagctgc aacccgaatc 180

aaaaaaaaag aagagaagtt tgaatcatta gaagctcgtc gcaaaccaac agcggataaa 240

gcagaaaaga aatccgagag cacagaggaa aaaggcgata ctcctcttga agatcgtttc 300

acagaagatc tttccgaagt ctccggagaa gattttcgag gattgaaaaa ttcgttcgat 360

gatgattctt ctcctgaaga aattctcgat gcgctcacaa gtaaattttc tgatcccaca 420

ataaaggatc tagctcttga ttatctaatt caaacagctc cctctgatag gaaacttaag 480

tccgctctca ttcaggcaaa gcatcaactg atgagccaga atcctcaggc gattgttgga 540

ggacgcaatg ttctgttagc ttcagaaacc tttgcttcca gagcaaatac atctccttca 600

tcgcttcgct ccttatatct ccaagtaacc tcatccccct ctaattgtga taatttacgt 660

caaatgcttg cttcttactt gccatcagag aaaaccgctg ttatggagtt tctagtaaat 720

ggcatggtag cagatttaaa atcggagggc ccttccattc ctcctgcaaa attgcaagta 780

tatatgacgg aactaagcaa tctccaagcc ttacactctg tagatagctt ttttgataga 840

aatattggga acttggaaaa tagcttaaag catgaaggac atgcccctat tccatcctta 900

acgacaggaa atttaactaa aaccttctta caattagtag aagataaatt cccttcctct 960

tccaaagctc aaaaggcatt aaatgaactg gtaggcccag atactggtcc tcaaactgaa 1020

gttttaaact tattcttccg cgctcttaat ggctgttcgc ctagaatatt ctctggagct 1080 gaaaaaaaac agcagctggc atcggttatc acaaatacgc tagatgcgat aaatgcggat aatgaggatt atcctaaacc aggtgacttc ccacgatctt ccttctctag tacgcctcct catgctccag tacctcaatc tgagattcca acgtcaccta cctcaacaca gcctccatca ccctaa

<210> 16 <211> 421 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 16

Met Thr Ala Ser Gly Gly Ala Gly Gly Leu Gly Ser Thr Gln Thr Val 10 15

Asp Val Ala Arg Ala Gln Ala Ala Ala Ala Thr Gln Asp Ala Gln Glu 20 25 30

Val Ile Gly Ser Gln Glu Ala Ser Glu Ala Ser Met Leu Lys Gly Cys 35 40 45

Glu Asp Leu lle Asn Pro Ala Ala Ala Thr Arg Ile Lys Lys Lys Glu 50 55 60

Glu Lys Phe Glu Ser Leu Glu Ala Arg Arg Lys Pro Thr Ala Asp Lys 65 70 75 80

Ala Glu Lys Lys Ser Glu Ser Thr Glu Glu Lys Gly Asp Thr Pro Leu 85 90 95

Glu Asp Arg Phe Thr Glu Asp Leu Ser Glu Val Ser Gly Glu Asp Phe 100 105 110

Arg Gly Leu Lys Asn Ser Phe Asp Asp Asp Ser Ser Pro Glu Glu Ile 115 120 125

Leu Asp Ala Leu Thr Ser Lys Phe Ser Asp Pro Thr Ile Lys Asp Leu 130 135 140

Ala Leu Asp Tyr Leu Ile Gln Thr Ala Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys 145 150 155 160

Ser Ala Leu lle Gln Ala Lys His Gln Leu Met Ser Gln Asn Pro Gln 165 170 175

Ala Ile Val Gly Gly Arg Asn Val Leu Leu Ala Ser Glu Thr Phe Ala 180 185 190

Ser Arg Ala Asn Thr Ser Pro Ser Ser Leu Arg Ser Leu Tyr Leu Gln 195 200 205

Val Thr Ser Ser Pro Ser Asn Cys Asp Asn Leu Arg Gln Met Leu Ala 210 215 220

Ser Tyr Leu Pro Ser Glu Lys Thr Ala Val Met Glu Phe Leu Val Asn 225 230 235 240

Gly Met Val Ala Asp Leu Lys Ser Glu Gly Pro Ser Ile Pro Pro Ala 245 250 255

1140

1200

1260

1266 Lys Leu Gln Val Tyr Met Thr Glu Leu Ser Asn Leu Gln Ala Leu His 260 265 270

Ser Val Asp Ser Phe Phe Asp Arg Asn Ile Gly Asn Leu Glu Asn Ser 275 280 285

Leu Lys His Glu Gly His Ala Pro Ile Pro Ser Leu Thr Thr Gly Asn 290 295 300

Leu Thr Lys Thr Phe Leu Gln Leu Val Glu Asp Lys Phe Pro Ser Ser 305 310 315 320

Ser Lys Ala Gln Lys Ala Leu Asn Glu Leu Val Gly Pro Asp Thr Gly 325 330 335

Pro Gln Thr Glu Val Leu Asn Leu Phe Phe Arg Ala Leu Asn Gly Cys 340 345 350

Ser Pro Arg Ile Phe Ser Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Leu Ala Ser 355 360 365

Val lle Thr Asn Thr Leu Asp Ala lle Asn Ala Asp Asn Glu Asp Tyr 370 375 380

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His Ala Pro Val Pro Gln Ser Glu Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ser Thr

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<210> 21 <211> 1776 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 21

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60

ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag ggtaataata aagttgaaga tcgagtttgt 120

tctctatatt catctcgtag taacgaaaat agagaatctc cttatgcagt agtagacgtc 180

agctctatga tcgagagcac cccaacgagt ggagagacga caagagcttc gcgtggagtg 240

ttcagtcgtt tccaaagagg tttagtacga gtagctgaca aagtaagacg agctgttcag 300

tgtgcgtgga gttcagtctc tacaagaaga tcgtctgcaa caagagccgc agaatccgga 360

tcaagtagtc gtactgctcg tggtgcaagt tctgggtata gggagtattc tccttcagca 420

gctagagggc tgcgtcttat gttcacagat ttctggagaa ctcgggtttt acgccagacc 480

tctcctatgg ctggagtttt tgggaatctt gatgtgaacg aggctcgttt gatggctgcg 540

tacacaagtg agtgcgcgga tcatttagaa gcgaacaagt tggctggccc tgacggggta 600

gcggccgccc gggaaattgc taaaagatgg gagcaaagag ttagagatct acaagataaa 660

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aaaaatccag gtgagtatac tgtagggaat tccatgtttt acgatggtcc tcaggtagcg 780

aatctccaga acgtcgacac tggtttttgg ctggacatga gcaatctctc agacgttgta 840

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actgagatag aagaatcggg atggactcga gagtccgcat caagaatgga aggcgatgag 1020

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cgaggattag ctgccgcagg agaggcgatt cgccgttgct tctcttgttg taaaggatcg 1200

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ttggctagat tcgcagatga tatgggaata gagcgaggtg ctgatggaac ctacgatatt 1320

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atctatgaaa tcatgatgcc tatctatgaa gttatggata tggatctaga aacacgaaga 1440 tcttttgcgg tacagcaagg gcactatcag gacccaagag cttcagatta tgacctccca

cgtgctagcg actatgattt gcctagaagc ccatatccta ctccaccttt gcctcctaga

tatcagctac agaatatgga tgtagaagca gggttccgtg aggcagttta tgcttctttt

gtagcaggaa tgtacaatta tgtagtgaca cagccgcaag agcgtattcc caatagtcag

caggtggaag ggattctgcg tgatatgctt accaacgggt cacagacatt tagagacctg

atgaggcgtt ggaatagaga agtcgatagg gaataa

<210> 22 <211> 591 <212> PRT

<213> Chlaraydia trachomatis <400> 22

Met Ser Ile Arg Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Gly Asn 20 25 30

Asn Lys Val Glu Asp Arg Val Cys Ser Leu Tyr Ser Ser Arg Ser Asn 35 40 45

Glu Asn Arq Glu Ser Pro Tyr Ala Val Val Asp Val Ser Ser Met Ile 50 55 60

Glu Ser Thr Pro Thr Ser Gly Glu Thr Thr Arg Ala Ser Arg Gly Val 65 70 75 80

Phe Ser Arg Phe Gln Arg Gly Leu Val Arg Val Ala Asp Lys Val Arg 85 90 95

Arg Ala Val Gln Cys Ala Trp Ser Ser Val Ser Thr Arg Arg Ser Ser 100 105 110

Ala Thr Arg Ala Ala Glu Ser Gly Ser Ser Ser Arg Thr Ala Arg Gly 115 120 125

Ala Ser Ser Gly Tyr Arg Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arg Gly Leu 130 135 140

Arg Leu Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr 145 150 155 160

Ser Pro Met Ala Gly Val Phe Gly Asn Leu Asp Val Asn Glu Ala Arg 165 170 175

Leu Met Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Cys Ala Asp His Leu Glu Ala Asn 180 185 190

Lys Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Lys 195 200 205

Arg Trp Glu Gln Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Arg 210 215 220

Lys Leu Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser 225 230 235 240

Lys Asn Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn ser Met Phe Tyr Asp Gly

1500

1560

1620

1680

1740

1776 245

250

255

Pro Gln Val Ala Asn Leu Gln Asn Val Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp 260 265 270

Met Ser Asn Leu Ser Asp Val Val Leu Ser Arg Glu Ile Gln Thr Gly 275 280 285

Leu Arg Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn 290 295 300

Leu Glu Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg 305 310 315 320

Thr Glu lle Glu Glu Ser Gly Trp Thr Arg Glu Ser Ala Ser Arg Met 325 330 335

Glu Gly Asp Glu Ala Gln Gly Pro Ser Arg Ala Gln Gln Ala Phe Gln 340 345 350

Ser Phe Val Asn Glu Cys Asn Ser lle Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe 355 360 365

Gly Glu His Val Arg Val Leu Cys Ala Arg Val Ser Arg Gly Leu Ala 370 375 380

Ala Ala Gly Glu Ala Ile Arg Arg Cys Phe Ser Cys Cys Lys Gly Ser 385 390 395 400

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<210> 27 <211> 3042 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 27

atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60

ttaagtgggg gggggtatgc agcagaaatc atgattcctc aaggaattta cgatggggag 120

acgttaactg tatcatttcc ctatactgtt ataggagatc cgagtgggac tactgttttt 180

tctgcaggag agttaacgtt aaaaaatctt gacaattcta ttgcagcttt gcctttaagt 240

tgttttggga acttattagg gagttttact gttttaggga gaggacactc gttgactttc 300

gagaacatac ggacttctac aaatggagct gcactaagtg acagcgctaa tagcgggtta 360

tttactattg agggttttaa agaattatct ttttccaatt gcaactcatt acttgccgta 420

ctgcctgctg caacgactaa taatggtagc cagactccga cgacaacatc tacaccgtct 480

aatggtacta tttattctaa aacagatctt ttgttactca ataatgagaa gttctcattc 540

tatagtaatt tagtctctgg agatggggga gctatagatg ctaagagctt aacggttcaa 600

ggaattagca agctttgtgt cttccaagaa aatactgctc aagctgatgg gggagcttgt 660

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gttgcaggag taagaggggg agggattgct gctgttcagg atgggcagca gggagtgtca 780

tcatctactt caacagaaga tccagtagta agtttttcca gaaatactgc ggtagagttt 840

gatgggaacg tagcccgagt aggaggaggg atttactcct acgggaacgt tgctttcctg 900

aataatggaa aaaccttgtt tctcaacaat gttgcttctc ctgtttacat tgctgctgag 960

caaccaacaa atggacaggc ttctaatacg agtgataatt acggagatgg aggagctatc 1020

ttctgtaaga atggtgcgca agcagcagga tccaataact ctggatcagt ttcctttgat 1080

ggagagggag tagttttctt tagtagcaat gtagctgctg ggaaaggggg agctatttat 1140

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<210> 28

<211> 1013

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 28

Met Gln Thr Ser Phe His Lys Phe Phe Leu Ser Met lle Leu Ala Tyr 10 15

Ser Cys Cys Ser Leu Ser Gly Gly Gly Tyr Ala Ala Glu Ile Met Ile 20 25 30

Pro Gln Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val Ser Phe Pro Tyr 35 40 45

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Ser Leu Thr Phe Glu Asn lle Arg Thr Ser Thr Asn Gly Ala Ala Leu 100 105 110

Ser Asp Ser Ala Asn Ser Gly Leu Phe Thr Ile Glu Gly Phe Lys Glu 115 120 125

Leu Ser Phe Ser Asn Cys Asn Ser Leu Leu Ala Val Leu Pro Ala Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Asn Gly Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Ser Thr Pro Ser 145 150 155 160

Asn Gly Thr Ile Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Leu Leu Leu Asn Asn Glu 165 170 175

Lys Phe Ser Phe Tyr Ser Asn Leu Val Ser Gly Asp Gly Gly Ala lle 180 185 190

Asp Ala Lys Ser Leu Thr Val Gln Gly lle Ser Lys Leu Cys Val Phe 195 200 205

Gln Glu Asn Thr Ala Gln Ala Asp Gly Gly Ala Cys Gln Val Val Thr 210 215 220

Ser Phe Ser Ala Met Ala Asn Glu Ala Pro lle Ala Phe lle Ala Asn 225 230 235 240

Val Ala Gly Val Arg Gly Gly Gly Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Gln 245 250 255

Gln Gly Val Ser Ser Ser Thr Ser Thr Glu Asp Pro Val Val Ser Phe 260 265 270

Ser Arg Asn Thr Ala Val Glu Phe Asp Gly Asn Val Ala Arg Val Gly 275 280 285

Gly Gly lle Tyr Ser Tyr Gly Asn Val Ala Phe Leu Asn Asn Gly Lys 290

295

300

Thr Leu Phe Leu Asn Asn Val Ala Ser Pro Val Tyr lle Ala Ala Glu 305 310 315 320

Gln Pro Thr Asn Gly Gln Ala Ser Asn Thr Ser Asp Asn Tyr Gly Asp 325 330 335

Gly Gly Ala Ile Phe Cys Lys Asn Gly Ala Gln Ala Ala Gly Ser Asn 340 345 350

Asn Ser Gly Ser Val Ser Phe Asp Gly Glu Gly Val vai Phe Phe Ser 355 360 365

Ser Asn Val Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala lle Tyr Ala Lys Lys Leu 370 375 380

Ser Val Ala Asn Cys Gly Pro Val Gln Phe Leu Gly Asn lle Ala Asn 385 390 395 400

Asp Gly Gly Ala Ile Tyr Leu Gly Glu Ser Gly Glu Leu Ser Leu Ser 405 410 415

Ala Asp Tyr Gly Asp Ile Ile Phe Asp Gly Asn Leu Lys Arg Thr Ala 420 425 430

Lys Glu Asn Ala Ala Asp Val Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Gln Ala

435 440 445

lle Ser Met Gly Ser Gly Gly Lys Ile Thr Thr Leu Arg Ala Lys Ala

450 455 460

Gly His Gln lle Leu Phe Asn Asp Pro Ile Glu Met Ala Asn Gly Asn

465 470 475 480

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485 490 495

Gly Tyr Thr Gly Asp lle Val Phe Ala Asn Gly Asn Ser Thr Leu Tyr

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Gln Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Arg Ile Val Leu Arg Glu Lys Ala

515 520 525

Lys Leu Ser Val Asn Ser Leu Ser Gln Thr Gly Gly Ser Leu Tyr Met 530 535 540

Glu Ala Gly Ser Thr Leu Asp Phe Val Thr Pro Gln Pro Pro Gln Gln

545 550 555 560

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Leu Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Ala Val Thr Asn Pro Pro Thr Asn 580 585 590

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600

605

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<210> 33 <211> 1806 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 33

atgaaaatga ataggatttg gctattactg cttacctttt cttctgccat acattctcct 60

gtacaaggag aaagcttggt ttgcaagaat gctcttcaag atttgagttt tttagagcat 120

ttattacagg ttaaatatgc tcctaaaaca tggaaagagc aatacttagg atgggatctt 180

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ttttaa 1806

<210> 34

<211> 601

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 34

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Val Ser Ala Gln Gln Lys Leu Arg Thr Gln Glu Asn Pro Ser Thr Ser 65 70 75 80

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lle Gly Pro Val lle Trp Glu Ser Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr Ile 290 295 300 Ser Ser Val Thr Asp Gly Asp Gly Lys Ser His Lys vai Gly Phe Leu

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<213> Chlamydia trachomatis <400> 41

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

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<213> Chlamydia trachomatis <400> 47

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aatgctgctt acatggcatt gaatatttgg gatcgttttg atgtattctg tacattagga 420

gccaccagtg gatatcttaa aggaaattca gcatctttca acttagttgg cttattcgga 480

gataatgaga accatgctac agtttcagat agtaagcttg taccaaatat gagcttagat 540

caatctgttg ttgagttgta tacagatact acttttgctt ggagtgctgg agctcgtgca 600

gctttgtggg aatgtggatg cgcgacttta ggcgcttctt tccaatacgc tcaatccaag 660

cctaaagtcg aagaattaaa cgttctctgt aacgcagctg agtttactat caataagcct 720

aaaggatatg tagggcaaga attccctctt gatcttaaag caggaacaga tggtgtgaca 780

ggaactaagg atgcctctat tgattaccat gaatggcaag caagtttagc tctctcttac 840

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aacccaacta ttgctggagc tggcgatgtg aaagctagcg cagagggtca gctcggagat 1020

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gcagtaggaa caactattgt ggatgcagac aaatacgcag ttacagttga gactcgcttg 1140

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<210> 48 <211> 394 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 48

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser 20 25 30

Leu Met lle Asp Gly lle Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys

35 40 45

Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala lle Ser Met Arg Met Gly Tyr

Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Gln Thr Asp Val Asn Lys 65

70

75

80

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Ala Pro Ser Thr Cys Thr Ala Arq Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arq His 100 105 110

Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn 115 120 125

Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly 130 135 140

Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly 145 150 155 160

Asp Asn Glu Asn His Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn 165 170 175

Met Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe 180 185 190

Ala Trp Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala 195 200 205

Thr Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu 210 215 220

Glu Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro 225 230 235 240

Lys Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Asp Leu Lys Ala Gly Thr 245 250 255

Asp Gly Val Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp 260 265 270

Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr 275 280 285

Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg 290 295 300

Ile Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Thr Val Phe Asp Val Thr Thr Leu

305 310 315 320

Asn Pro Thr lle Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly 325 330 335

Gln Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met 340 345 350

Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly lle Ala Val Gly Thr Thr lle Val Asp 355 360 365

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Ala Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe 385 390

<210> 49 <211> 1194 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 49

atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg 60

caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg 120

gaaggtttcg gtggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg 180

cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaacaga tgtgaataaa 240

gaatttcaga tgggagcggc gcctactacc agcgatgtag caggcttaca aaacgatcca 300

acaacaaatg ttgctcgtcc aaatcccgct tatggcaaac acatgcaaga tgctgaaatg 360

tttacgaacg ctgcttacat ggcattaaat atctgggatc gttttgatgt attttgtaca 420

ttgggagcaa ctaccggtta tttaaaagga aactccgctt ccttcaactt agttggatta 480

ttcggaacaa aaacacaagc ttctagcttt aatacagcga atctttttcc taacactgct 540

ttgaatcaag ctgtggttga gctttataca gacactacct ttgcttggag cgtaggtgct 600

cgtgcagctc tctgggaatg tgggtgtgca acgttaggag cttctttcca atatgctcaa 660

tctaaaccta aagtagaaga gttaaatgtt ctttgtaatg catccgaatt tactattaat 720

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gcgacaggga ctaaggatgc ctctattgac taccatgagt ggcaagcaag tttagccctt 840

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actcgcttga tcgatgagag agcagctcac gtaaatgcac aattccgctt ctaa 1194

<210> 50 <211> 397 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 50

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser 10 15

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser 20 25 30

Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys 35 40 45

Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr 50 55 60

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Gln Asn Asp Pro Thr Thr Asn Val Ala Arg Pro Asn Pro Ala Tyr Gly 100 105 110

Lys His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala 115 120 125

Leu Asn lle Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr 130 135 140 Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu 145 150 155 160

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lle Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Glu Ala Ile Leu Asp Val Thr 305 310 315 320

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Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr 355 360 365

lle Val Asp Ala Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile 370 375 380

Asp Glu Arg Ala Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe 385 390 395

<210> 51 <211> 1194 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 51

atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg gaaggttttg gcggagatcc ttgcgatcct tgcgccactt ggtgtgacgc tatcagcatg cgtgttggtt actacggaga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaactga tgtgaataaa gaatttcaga tgggagcggc gcctactacc aacgatgcag cagacttaca aaacgatcca

60

120

180

240

300 aaaacaaatg

tttacgaacg

ttgggagcaa

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cgtttccttg

gactattgta

agcagctcac

tatggcaaac

atctgggatc

aactccgctt

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ccacttgata

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attggagtta

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aatggtctag

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agatgaaatc

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aattccgctt

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taacattgct

cgtaggtgct

atatgctcaa

tactattaat

aacagaagct

tttagccctt

agtaagtttt

ggatgtcact

cgataacgac

tagaaaatct

tacagttgag

ctaa

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1194

<210> 52 <211> 397 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 52

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser 10 15

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser 20 25 30

Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys 35 40 45

Asp Pro Cys Ala Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Val Gly Tyr 50 55 60

Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Lys Thr Asp Val Asn Lys 65 70 75 80

Glu Phe Gln Met Gly Ala Ala Pro Thr Thr Asn Asp Ala Ala Asp Leu 85 90 95

Gln Asn Asp Pro Lys Thr Asn Val Ala Arg Pro Asn Pro Ala Tyr Gly 100 105 110

Lys His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Tyr Met Ala 115 120 125

Leu Asn lle Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr 130 135 140

Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu

145 150 155 160

Phe Gly Thr Lys Thr Lys Ser Ser Asp Phe Asn Thr Ala Lys Leu Val 165 170 175

Pro Asn Ile Ala Leu Asn Arg Ala Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr 180 185 190

Thr Phe Ala Trp Ser Val Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly 195 200 205 Cys Ala Thr Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys 210 215 220

Val Glu Glu Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ser Glu Phe Thr Ile Asn 225 230 235 240

Lys Pro Lys Gly Tyr vai Gly Ala Glu Phe Pro Leu Asp lle Thr Ala 245 250 255

Gly Thr Glu Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His 260 265 270

Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr 275 280 285

Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Val Ser Phe Asp Ala Asp Thr 290 295 300

lle Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Glu Ala lle Leu Asp Val Thr 305 310 315 320

Thr Leu Asn Pro Thr lle Ala Gly Lys Gly Thr Val Val Ala Ser Gly 325 330 335

Ser Asp Asn Asp Leu Ala Asp Thr Met Gln lle Val Ser Leu Gln Leu 340 345 350

Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr 355 360 365

lle Val Asp Ala Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile

Asp Glu Arg Ala Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe

<210> 53 <211> 1182 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 53

atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg 60

caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg 120

gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg 180

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gcctctagcg gataccttaa aggaaactct gcttctttca atttagttgg attgtttgga 480

gataatgaaa atcaaagcac ggtcaaaacg aattctgtac caaatatgag cttagatcaa 540

tctgttgttg aactttacac agatactgcc ttctcttgga gcgtgggcgc tcgagcagct 600

ttgtgggagt gcggatgtgc gactttaggg gcttctttcc aatacgctca atctaaacct 660

aaagtcgaag aattaaacgt tctctgtaac gcagctgagt ttactatcaa taagcctaaa 720

ggatatgtag ggcaagaatt ccctcttgca ctcatagcag gaactgatgc agcgacgggc 780

actaaagatg cctctattga ttaccatgag tggcaagcaa gtttagctct ctcttacaga 840

ttgaatatgt tcactcccta cattggagtt aaatggtctc gagcaagttt tgatgccgat 900

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ccaactattg ctggagctgg cgatgtgaaa gctagcgcag agggtcagct cggagatacc 1020

atgcaaatcg tctccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca 1080

gtaggaacga ctattgtaga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc 1140

gatgagagag ctgctcacgt aaatgcacaa ttccgcttct aa 1182 <210> 54 <211> 393 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 54

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser 10 15

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser 20 25 30

Leu Met lle Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys 35 40 45

Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr 50 55 60

Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Lys Thr Asp Val Asn Lys 65 70 75 80

Glu Phe Gln Met Gly Asp Lys Pro Thr Ser Thr Thr Gly Asn Ala Thr 85 90 95

Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His 100 105 110

Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn 115 120 125

Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Ser Ser Gly 130 135 140

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Asp Asn Glu Asn Gln Ser Thr Val Lys Thr Asn Ser Val Pro Asn Met 165 170 175

Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Ala Phe Ser 180 185 190

Trp Ser Val Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr 195 200 205

Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu 210 215 220

Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr lle Asn Lys Pro Lys 225 230 235 240

Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Ala Leu lle Ala Gly Thr Asp 245 250 255

Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln 260 265 270

Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile 275 280 285

Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg lle 290 295 300

Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Ala Ile Phe Asp Thr Thr Thr Leu Asn 305 310 315 320

Pro Thr lle Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Ala Ser Ala Glu Gly Gln 325 330 335

Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys 340 345 350

Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr lle Val Asp Ala 355 360 365

Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala 370 375 380

Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe 385 390

<210> 55 <211> 1179 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 55

atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg 60

caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg 120

gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcgccactt ggtgtgacgc tatcagcatg 180

cgtgttggtt actacggaga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaactga tgtgaataaa 240

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cttacagcaa gagagaatcc tgcttacggc cgacatatgc aggatgctga gatgtttaca 360

aatgccgctt gcatggcatt gaatatttgg gatcgttttg atgtattctg tacattagga 420

gccaccagtg gatatcttaa aggaaactct gcttctttca atttagttgg attgtttgga 480

gataatgaaa atcaaaaaac ggtcaaagcg gagtctgtac caaatatgag ctttgatcaa 540

tctgttgttg agttgtatac agatactact tttgcgtgga gcgtcggcgc tcgcgcagct 600

ttgtgggaat gtggatgtgc aactttagga gcttcattcc aatatgctca atctaaacct 660

aaagtagaag aattaaacgt tctctgcaat gcagcagagt ttactattaa taaacctaaa 720

gggtatgtag gtaaggagtt tcctcttgat cttacagcag gaacagatgc tgcgacagga 780

actaaggatg cctctattga ttaccatgaa tggcaagcaa gtttagctct ctcttacaga 840

ctgaatatgt tcactcccta cattggagtt aaatggtctc gagcaagctt tgatgccgat 900

acgattcgta tagcccagcc aaaatcagct acagctattt ttgatactac cacgcttaac 960

ccaactattg ctggagctgg cgatgtgaaa actggcgcag agggtcagct cggagacaca 1020

atgcaaatcg tttccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca 1080

gtaggaacaa ctattgtgga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc 1140

gatgagagag cagctcacgt aaatgcacaa ttccgcttc 1179

<210> 56 <211> 393 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 56

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser 10 15

Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser 20 25 30

Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys 35 40 45 Asp Pro Cys Ala Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arq vai Gly Tyr 50 55 60

Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Lys Thr Asp Val Asn Lys 65 70 75 80

Glu Phe Gln Met Gly Ala Lys Pro Thr Thr Asp Thr Gly Asn Ser Ala 85 90 95

Ala Pro Ser Thr Leu Thr Ala Arg Glu Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His 100 105 110

Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn 115 120 125

Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly 130 135 140

Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly 145 150 155 160

Asp Asn Glu Asn Gln Lys Thr Val Lys Ala Glu Ser vai Pro Asn Met 165 170 175

Ser Phe Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala 180 185 190

Trp Ser Val Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr

195 200 205

Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu 210 215 220

Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys 225 230 235 240

Gly Tyr Val Gly Lys Glu Phe Pro Leu Asp Leu Thr Ala Gly Thr Asp 245 250 255

Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln 260 265 270

Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile 275 280 285

Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile 290 295 300

Ala Gln Pro Lys Ser Ala Thr Ala lle Phe Asp Thr Thr Thr Leu Asn 305 310 315 320

Pro Thr lle Ala Gly Ala Gly Asp Val Lys Thr Gly Ala Glu Gly Gln 325 330 335

Leu Gly Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys 340 345 350 Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile vai Asp Ala 355 360 365

f

Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala

Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe

<210> 57 <211> 1944 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 57

atggaatcag gaccagaatc agtttcttct aatcagagct cgatgaatcc aattattaat 60

gggcaaatcg cttctaattc ggagaccaaa gagtccacga aggagtcaga agcgagtcct 120

tcagcatcgt cctctgtaag cagctggagt tttttatcct cagcaaagca tgcattaatc 180

tctcttcgtg atgccatctt gaataaaaat tctagtccaa cagactctct ctctcaatta 240

gaggcctcta cttctacctc tacggttaca cgtgtagctg cgcgagatta taatgaggct 300

aaatcgaatt ttgatacggc gaaaagtgga ttagagaacg ctacgacact tgctgaatac 360

gagacgaaaa tggctgattt aatggcagct ctccaagata tggagcgttt ggctaaacag 420

aaggctgaag ttacaagaat taaagaagct cttcaagaga aacaagaggt tattgataag 480

ctcaatcagt tagttaaact tgaaaaacag aatcagactt taaaggaaac tttaacaacc 540

acagactctg cagatcagat tccagcgatt aatagtcagt tagagatcaa caaaaattct 600

gcagatcaaa ttatcaaaga tctggaagga caaaacataa gttatgaagc tgttctcact 660

aacgcaggag aggttatcaa agcttcttct gaagcgggaa ttaagttagg acaagctttg 720

cagtctattg tggatgctgg ggatcaaagc caggctgcag ttcttcaagc acagcaaaat 780

aatagcccag ataatatcgc agccacgaag aaattaattg atgctgctga aacgaaggta 840

aacgagttaa aacaagagca tacagggcta acggactcgc ctttagtgaa aaaagctgag 900

gagcagatta gtcaagcaca aaaagatatt caagagatca aacctagtgg ttcggatatt 960

cctatcgttg gtccgagtgg gtcagctgct tccgcaggaa gtgcggtagg agcgttgaaa 1020

tcctctaaca attcaggaag aatttccttg ttgcttgatg atgtagacaa tgaaatggca 1080

gcgattgcaa tgcaaggttt tcgatctatg atcgaacaat ttaatgtaaa caatcctgca 1140

acagctaaag agctacaagc tatggaggct cagctgactg cgatgtcaga tcaactggtt 1200

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<213> Chlamydia trachomatis <400> 58

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<213> Chlamydia trachomatis

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<21Β> Chlamydia trachomatis

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<213> Chlamydia trachomatis

<400> 93 atgactgcat caggaggagc tggagggcta ggcagcaccc aaacagtaga cgttgcgcga 60 gcacaagctg ctgcagctac tcaagatgca caagaggtta tcggctctca ggaagcttct 120 gaggcaagta tgctcaaaga atgtgaggat ctcataaatc ctgcagctgc aacccgaatc 180 aaaaaaaaag aagagaagtt tgaatcatta gaagctcgtc gcaaaccaac agcggataaa 240 gcagaaaaga aatccgagag cacagaggaa aaaggcgata ctcctcttga agatcgtttc 300 acagaagatc tttccgaagt ctctggagaa gattttcgag gattgaaaaa ttcgttcgat 360 gatgattctt cttctgacga aattctcgat gcgctcacaa gtaaattttc tgatcccaca 420 ataaaggatc tagctcttga ttatctaatt caaatagctc cctctgatgg gaaacttaag 480 tccgctctca ttcaggcaaa gcatcaactg atgagccaga atcctcaggc gattgttgga 540 ggacgcaatg ttctgttagc ttcagaaacc tttgcttcca gagcaaatac atctccttca 600 tcgcttcgct ccttatattt ccaagtaacc tcatccccct ctaattgcgc taatttacat 660 caaatgcttg cttcttactc gccatcagag aaaaccgctg ttatggagtt tctagtgaat 720 ggcatggtag cagatttaaa atcggagggc ccttccattc ctcctgcaaa attgcaagta 780 tatatgacgg aactaagcaa tctccaagcc ttacactctg tagatagctt ttttgataga 840 aatattggga acttggaaaa tagcttaaag catgaaggac atgcccctat tccatcctta 900 acgacaggaa atttaactaa aaccttctta caattagtag aagataaatt cccttcctct 960 tccaaagctc aaaaggcatt aaatgaactg gtaggcccgg atactggtcc tcaaactgaa 1020 gttttaaact tattcttccg cgctcttaat ggctgttcgc ctagaatatt ctctggagct 1080 gaaaaaaaac agcagctggc atcggttatc acaaatacgc tagatgcgat aaatgcggat 1140 aatgaggatt atcctaaacc aggtgacttc ccacgatctt ccttctctag tacgcctcct 1200 catgctccag tacctcaatc tgagattcca acgtcaccta cctcaacaca gcctccatca 1260 ccctaa 1266

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Lys Gly Asp Ile Glu Leu Ser Thr Pro lie Pro Leu Phe Gly Phe Glu 435 440 445

Lys Ile His Pro His Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Val 450 455 460

Leu Ile Asn Glu Gln Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val 465 470 475 480

Leu Lys Asp Asn Asp Arg Ala Leu Ile vai Gly Thr Arg Thr Ala Gly 485 490 495

Ala Gly Gly Phe Val Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly Ile 500 505 510

Lys Thr Cys Ser Leu Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala 515 520 525

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Ala Asn Asp lie Arg Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val 545 550 555 560 Lys Lys Leu Val Cys Gln Leu lie Asn Asn Asp Gly Thr Ile Ile Leu 565 570 575

Ala Glu Asp Gly Ser Phe 580

<210> 103 <211> 1749 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 103 atggtacaag gagaaagctt ggtttgcaag aatgctcttc aagatttgag ttttttagag 60 catttattac aggttaaata tgctcctaaa acatggaaag agcaatactt aggatgggat 120 cttgttcaaa gctccgtttc tgcacagcag aagcttcgta cacaagaaaa tccatcaaca 180 agtttttgcc agcaggtcct tgctgatttt atcggaggat taaatgactt tcacgctgga 240 gtaactttct ttgcgataga aagtgcttac cttccttata ccgtacaaaa aagtagtgac 300 ggccgtttct actttgtaga tatcatgact ttttcttcag agatccgtgt tggagatgag 360 ttgctagagg tggatggggc gcctgtccaa gatgtactcg ctactctata tggaagcaat 420 cacaaaggga ctgcagctga agagtcggct gctttaagaa cactattttc tcgcatggcc 480 tctttagggc acaaagtacc ttctgggcgc actactttaa agattcgtcg tccttttggt 540 actacgagag aagttcgtgt gaaatggcgt tatgttcctg aaggtgtagg agatttggct 600 accatagctc cttctatcag ggctccacag ttacagaaat cgatgagaag ctttttccct 660 aagaaagatg atgcgtttca tcggtctagt tcgctattct actctccaat ggttccgcat 720 ttttgggcag agcttcgcaa tcattatgca acgagtggtt tgaaaagcgg gtacaatatt 780 gggagtaccg atgggtttct ccctgtcatt gggcctgtta tatgggagtc ggagggtctt 840 ttccgcgctt atatttcttc ggtgactgat ggggatggta agagccataa agtaggattt 900 ctaagaattc ctacatatag ttggcaggac atggaagatt ttgatccttc aggaccgcct 960 ccttgggaag aatttgctaa gattattcaa gtattttctt ctaatacaga agctttgatt 1020 atcgaccaaa cgaacaaccc aggtggtagt gtcctttatc tttatgcact gctttccatg 1080 ttgacagacc gtcctttaga acttcctaaa catagaatga ttctgactca ggatgaagtg 1140 gttgatgctt tagattggtt aaccctgttg gaaaacgtag acacaaacgt ggagtctcgc 1200 cttgctctgg gagacaacat ggaaggatat actgtggatc tacaggttgc cgagtattta 1260 aaaagctttg gacgtcaagt attgaattgt tggagtaaag gggatatcga gttatcaacg 1320 cctattcctc tttttggttt tgagaagatt catccacatc ctcgagttca atactctaaa 1380 ccgatttgtg ttttgatcaa tgagcaagac ttttcttgtg ctgacttctt ccctgtagtt 1440 ttgaaagaca atgatcgagc tcttattgtt ggtactcgaa cagctggagc tggaggattt 1500 gtctttaatg tgcagttccc aaatagaact ggaataaaaa cttgttcttt aacaggatca 1560 ttagctgtta gagagcatgg tgccttcatt gagaacatcg gagtcgaacc gcatatcgat 1620 ctgcctttta cagcgaatga tattcgctat aaaggctatt ccgagtatct tgataaggtc 1680 aaaaaattgg tttgtcagct gatcaataac gacggtacca ttattcttgc ggaagatggt 1740 agtttttag 1749

<210> 104 <211> 582 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 104

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Asp Trp Leu Thr Leu Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val Glu Ser Arg 385 390 395 400

Leu Ala Leu Gly Asp Asn Met Glu Gly Tyr Thr Val Asp Leu Gln Val 405 410 415

Ala Glu Tyr Leu Lys Ser Phe Gly Arg Gln Val Leu Asn Cys Trp Ser 420 425 430

Lys Gly Asp lie Glu Leu Ser Thr Pro Ile Pro Leu Phe Gly Phe Glu 435 440 445

Lys Ile His Pro His Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Val 450 455 460

Leu ile Asn Glu Gln Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val vai 465 470 475 480

Leu Lys Asp Asn Asp Arg Ala Leu lie Val Gly Thr Arg Thr Ala Gly 485 490 495

Ala Gly Gly Phe Val Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly lie 500 505 510

Lys Thr Cys Ser Leu Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala 515 520 525

Phe Ile Glu Asn Ile Gly Val Glu Pro His lie Asp Leu Pro Phe Thr 530 535 540 Ala Asn Asp lie Arg 545

Tyr Lys Gly Tyr ser Glu Tyr Leu Asp Lys

550

555

Val 560

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570

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Ala Glu Asp Gly Ser Phe

580

<210> 105 <211> 1749 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 105

atggtacgag gagaaagctt ggtttgcaag aatgctcttc aagatttgag ttttttagag 60

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<210> 106 <211> 582 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 106

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Gln Val Leu Ala Asp Phe Ile Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly 65 70 75 80

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Lys Ser Ser Asp Gly Arg Phe Tyr Phe Val Asp Ile Met Thr Phe Ser 100 105 110

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Ser Leu Gly His Lys Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys lie Arg 165 170 175

Arg Pro Phe Gly Thr Thr Arg Glu Val Arg Val Lys Trp Arg Tyr Val 180 185 190

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Pro Gln Leu Gln Lys Ser Met Arg Ser Phe Phe Leu Lys Lys Asp Asp 210 215 220 Ala Phe His Arg Ser ser ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met vai Pro His 225 230 235 240

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Ala Glu Tyr Leu Lys Ser Phe Gly Arg Gln Val Leu Asn Cys Trp Ser 420 425 430

Lys Gly Asp Ile Glu Leu Ser Thr Pro Ile Pro Leu Phe Gly Phe Glu 435 440 445

Lys lie His Pro His Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys vai 450 455 460

Leu lie Asn Glu Gln Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val 465 470 475 480

Leu Lys Asp Asn Asp Arg Ala Leu Ile Val Gly Thr Arg Thr Ala Gly 485 490 495

Ala Gly Gly Phe Val Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly Ile 500 505 510

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Ala Asn Asp lie Arg Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val 545 550 555 560

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Ala Glu Asp Gly Ser Phe 580

<210> 107 <211> 1749

<212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 107

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<212> PRT

<213> Chlamydia trachoniatis

<400> 108

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Gln Val Leu Ala Asp Phe Ile Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly

65 70 75 80

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Ser Leu Gly His Lys Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys Ile Arg 165 170 175

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Phe Trp Ala Glu Leu Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser 245 250 255

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Ala Gly Gly Phe Val Phe Asn vai Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly lie 500 505 510 Lys Thr cys Ser Leu Thr Gly ser Leu Ala vai Arg Glu His Gly Ala 515 520 525

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Ala Asn Asp Ile Arg Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys vai 545 550 555 560

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Ala Glu Asp Gly Ser Phe 580

<210> 109 <211> 1749 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 109 atggtacgag gagaaagctt ggtttgcaag aatgctcttc aagatttgag ttttttagag 60 catttattac aggttaaata tgctcctaaa acatggaaag agcaatactt aggatgggat 120 cttgttcaaa gctccgtttc tgcacagcag aagcttcgta cacaagaaaa tccatcaaca 180 agtttttgcc agcaggtcct tgctgatttt atcggaggat taaatgactt tcacgctgga 240 gtaactttct ttgcgataga aagtgcttac cttccttata ccgtacaaaa aagtagtgac 300 ggccgtttct actttgtaga tatcatgact ttttcttcag agatccgtgt tggagatgag 360 ttgctagagg tggatggggc gcctgtccaa gatgtgctcg ctactctata tggaagcaat 420 cacaaaggga ctgcagctga agagtcggct gctttaagaa cactattttc tcgcatggcc 480 tctttagggc acaaagtacc ttctgggcgc actactttaa agattcgtcg tccttttggt 540 actacgagag aagttcgtgt gaaatggcgt tatgttcctg aaggtgtagg agatttggct 600 accatagctc cttctatcag ggctccacag ttacagaaat cgatgagaag ctttttccct 660 aagaaagatg atgcgtttca tcggtctagt tcgctattct actctccaat ggttccgcat 720 ttttgggcag agcttcgcaa tcattatgca acgagtggtt tgaaaagcgg gtacaatatt 780 gggagtaccg atgggtttct ccctgtcatt gggcctgtta tatgggagtc ggagggtctt 840 ttccgcgctt atatttcttc ggtgactgat ggggatggta agagccataa agtaggattt 900 ctaagaattc ctacatatag ttggcaggac atggaagatt ttgatccttc aggaccgcct 960 ccttgggaag aatttgctaa gattattcaa gtattttctt ctaatacaga agctttgatt 1020 atcgaccaaa cgaacaaccc aggtggtagt gtcctttatc tttatgcact gctttccatg 1080 ttgacagacc gtcctttaga acttcctaaa catagaatga ttctgactca ggatgaagtg 1140 gttgatgctt tagattggtt aaccctgttg gaaaacgtag acacaaacgt ggagtctcgc 1200 cttgctctgg gagacaacat ggaaggatat actgtggatc tacaggttgc cgagtattta 1260 aaaagctttg gacgtcaagt attgaattgt tggagtaaag gggatatcga gttatcaaca 1320 cctattcctc tttttggttt tgagaagatt catccacatc ctcgagttca atactctaaa 1380 ccgatttgtg ttttgatcaa tgagcaagac ttttcttgtg ctgacttctt ccctgtagtt 1440 ttgaaagaca atgatcgagc tcttattgtt ggtactcgaa cagctggagc tggaggattt 1500 gtctttaatg tgcagttccc aaatagaact ggaataaaaa cttgttcttt aacaggatca 1560 ttagctgtta gagagcatgg tgccttcatt gagaacatcg gagtcgaacc gcatatcgat 1620 ctgcctttta cagcgaatga tattcgctat aaaggctatt ccgagtatct tgataaggtc 1680 aaaaaattgg tttgtcagct gatcaataac gacggtacca ttattcttgc ggaagatggt 1740 agtttttag 1749

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<212> PRT

<213> Chlairydia trachomatis

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Lys Glu Gln Tyr Leu Gly Trp Asp Leu Val Gln Ser Ser Val Ser Ala 40 45

Gln Gln Lys Leu Arg Thr Gln Glu Asn Pro Ser Thr Ser Phe Cys Gln 50 55 60

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Ser Glu Ile Arg Val Gly Asp Glu Leu Leu Glu vai Asp Gly Ala Pro 115 120 125

vai Gln Asp Val Leu Ala Thr Leu Tyr Gly Ser Asn His Lys Gly Thr 130 135 140

Ala Ala Glu Glu Ser Ala Ala Leu Arg Thr Leu Phe Ser Arg Met Ala 145 150 155 160

Ser Leu Gly His Lys Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys Ile Arg 165 170 175

Arg Pro Phe Gly Thr Thr Arg Glu Val Arg Val Lys Trp Arg Tyr Val 180 185 190 ΡΓΟ Glu Gly vai Gly Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro ser Ile Arg Ala 195 200 205

Pro Gln Leu Gln Lys Ser Met Arg Ser Phe Phe Leu Lys Lys Asp Asp 210 215 220

Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Val Pro His 225 230 235 240

Phe Trp Ala Glu Leu Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser 245 250 255

Gly Tyr Asn Ile Gly Ser Thr Asp Gly Phe Leu Pro Val Ile Gly Pro 260 265 270

Val lie Trp Glu Ser Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr Ile Ser Ser Val 275 280 285

Thr Asp Gly Asp Gly Lys Ser His Lys Val Gly Phe Leu Arg lie Pro 290 295 300

Thr Tyr Ser Trp Gln Asp Met Glu Asp Phe Asp Pro Ser Gly Pro Pro 305 310 315 320

Pro Trp Glu Glu Phe Ala Lys Ile Ile Gln Val Phe Ser Ser Asn Thr 325 330 335

Glu Ala Leu lie Ile Asp Gln Thr Asn Asn Pro Gly Gly Ser vai Leu 340 345 350

Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu Ser Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu 355 360 365

Pro Lys His Arg Met lie Leu Thr Gln Asp Glu vai Val Asp Ala Leu 370 375 380

Asp Trp Leu Thr Leu Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val Glu Ser Arg 385 390 395 400

Leu Ala Leu Gly Asp Asn Met Glu Gly Tyr Thr vai Asp Leu Gln Val 405 410 415

Ala Glu Tyr Leu Lys Ser Phe Gly Arg Gln vai Leu Asn Cys Trp Ser 420 425 430

Lys Gly Asp Ile Glu Leu Ser Thr Pro lie Pro Leu Phe Gly Phe Glu

435 440 445

Lys Ile His Pro His Pro Arg Val Gln Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Val 450 455 460

Leu Ile Asn Glu Gln Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val vai 465 470 475 480

Leu Lys Asp Asn Asp Arg Ala Leu Ile vai Gly Thr Arg Thr Ala Gly 485 490 495 Ala Gly Gly Phe Val Phe Asn vai Gln Phe Pro Asn Arg Thr Gly Ile 500 505 510

Lys Thr Cys Ser Leu Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala 515 520 525

Phe Ile Glu Asn lie Gly Val Glu Pro His Ile Asp Leu Pro Phe Thr 530 535 540

Ala Asn Asp Ile Arg Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val 545 550 555 560

Lys Lys Leu Val Cys Gln Leu Ile Asn Asn Asp Gly Thr Ile lie Leu 565 570 575

Ala Glu Asp Gly Ser Phe 580

<210> 111

<211> 1770

<212> DNA

<213> Chlaiiiydia trachomatis

<400> 111 atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60 ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag aataaagttg aagatcgagt tcgttctcta 120 tattcatctc gtagtaacga aaatagagaa tctccttatg cagtagtaga cgtcagctct 180 atgatcgaga gcaccccaac gagtggagag acgacaagag cttcgcgtgg agtattcagt 240 cgtttccaaa gaggtttagg acgagtagct gacaaagtaa gacgagctgt tcagcgtgcg 300 tggagttcag tctctataag aagatcgtct gcaacaagag ccacagaatc cagatcaagt 360 agtcgtactg ctcgtggtgc aagttctggg tataaggagt attctccttc agcagctaga 420 gggctgcgtc ttatgttcac agatttctgg agaactcggg ttttacgcca gacctctcct 480 atggctggag tttttgggaa tcttgatgtg aacgaggctc gtttgatggc tgcgtacaca 540 agtgagtgcg cggatcattt agaagcgaag gagttggctg gccctgacgg ggtagcggcc 600 gcccgggaaa ttgctaaaag atgggagaaa agagttagag atctacaaga taaaggtgct 660 gcacgaaaat tattaaatga tcctttaggc cgacgaacac ctaattatca gagcaaaaat 720 ccaggtgagt atactgtagg gaattccatg ttttacgatg gtcctcaggt agcgaatctc 780 cagaacgtcg acactggttt ttggctggac atgagcaatc tctcagacgt tgtattatcc 840 agagagattc aaacaggact tcgagcacga gctactttgg aagaatccat gccgatgtta 900 gagaatttag aagagcgttt tagacgtttg caagaaactt gtgatgcggc tcgtactgag 960 atagaagaat cgggatggac tcgagagtcc gcatcaagaa tggaaggcga tgaggcgcaa 1020 ggaccttcta gagcacaaca agcttttcag agctttgtaa atgaatgtaa cagcatcgag 1080 ttctcatttg ggagctttgg agagcatgtg cgagttctct gcgctagagt atcacgagga 1140 ttagctgccg caggagaggc gattcgccgt tgcttctctt gttgtaaagg atcgacgcat 1200 cgctacgctc ctcgcgatga cctatctcct gaaggtgcat cgttagcaga gactttggct 1260 agattcgcag atgatatggg aatagagcga ggtgctgatg gaacctacga tattcctttg 1320 gtagatgatt ggagaagagg ggttcctagt attgaaggag aaggatctga ctcgatctat 1380 gaaatcatga tgcctatcta tgaagttatg aatatggatc tagaaacacg aagatctttt 1440 gcggtacagc aagggcacta tcaggaccca agagcttcag attatgacct cccacgtgct 1500 agcgactatg atttgcctag aagcccatat cctactccac ctttgcctcc tagatatcag 1560 ctacagaata tggatgtaga agcagggttc cgtgaggcag tttatgcttc ttttgtagca 1620 ggaatgtaca attatgtagt gacacagccg caagagcgta ttcccaatag tcagcaggtg 1680 gaagggattc tgcgtgatat gcttaccaac gggtcacaga catttagaga cctgatgaag 1740 cgttggaata gagaagtcga tagggaataa 1770

<210> 112

<211> 589

<212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis

<400> 112

Met Ser Ile Arg Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Asn Lys 25 30

Val Glu Asp Arg Val Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Arg Ser Asn Glu Asn 40 45

Arg Glu Ser Pro Tyr Ala Val Val Asp Val Ser Ser Met Ile Glu Ser 50 55 60

Thr Pro Thr Ser Gly Glu Thr Thr Arg Ala Ser Arg Gly Val Phe Ser 65 70 75 80

Arg Phe Gln Arg Gly Leu Gly Arg Val Ala Asp Lys Val Arg Arg Ala 85 90 95

Val Gln Arg Ala Trp Ser Ser Val Ser Ile Arg Arg Ser Ser Ala Thr 100 105 110

Arg Ala Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Arg Thr Ala Arg Gly Ala Ser 115 120 125

Ser Gly Tyr Lys Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arg Gly Leu Arg Leu 130 135 140

Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr Ser Pro 145 150 155 160

Met Ala Gly Val Phe Gly Asn Leu Asp Val Asn Glu Ala Arg Leu Met 165 170 175 Ala Ala Tyr Thr ser Glu Cys Ala Asp His Leu Glu Ala Lys Glu Leu 180 185 190

Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Lys Arq Trp

195 200 205

Glu Lys Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Arg Lys Leu

210 215 220

Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser Lys Asn 225 230 235 240

Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn Ser Met Phe Tyr Asp Gly Pro Gln 245 250 255

Val Ala Asn Leu Gln Asn Val Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp Met Ser 260 265 270

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Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn Leu Glu 290 295 300

Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg Thr Glu 305 310 315 320

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Val Asn Glu Cys Asn Ser Ile Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe Gly Glu 355 360 365

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Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Asp Leu Ser Pro Glu Gly Ala Ser Leu Ala 405 410 415

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Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Pro Leu Val Asp Asp Trp Arg Arg Gly Val 435 440 445

Pro Ser Ile Glu Gly Glu Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Glu Ile Met Met 450 455 460

Pro Ile Tyr Glu Val Met Asn Met Asp Leu Glu Thr Arg Arg Ser Phe 465 470 475 480 Ala vai Gln Gln Gly His Tyr Gln Asp Pro Arg Ala Ser Asp Tyr Asp 485 490 495

Leu Pro Arg Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Pro Arg Ser Pro Tyr Pro Thr

Gly Phe Arg Glu Ala vai Tyr Ala Ser Phe Val Ala Gly Met Tyr Asn 530 535 540

Tyr Val Val Thr Gln Pro Gln Glu Arg Ile Pro Asn Ser Gln Gln Val 545 550 555 560

Glu Gly Ile Leu Arq Asp Met Leu Thr Asn Gly Ser Gln Thr Phe Arg

Asp Leu Met Lys Arg Trp Asn Arg Glu Val Asp Arg Glu 580 585

<210> 113 <211> 1770 <212> DNA

<213> Chlainydia trachomatis <400> 113

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60 ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag aataaagttg aagatcgagt tcgttctcta 120

tattcatctc gtagtaacga aaatagagaa tctccttatg cagtagtaga cgtcagctct 180

atgatcgaga gcaccccaac gagtggagag acgacaagag cttcgcgtgg agtattcagt 240

cgtttccaaa gaggtttagg acgagtagct gacaaagtaa gacgagctgt tcagcgtgcg 300

tggagttcag tctctataag aagatcgtct gcaacaagag ccgcagaatc cagatcaagt 360

agtcgtactg ctcgtggtgc aagttctggg tatagggagt attctccttc agcagctaga 420

gggctgcgtc ttatgttcac agatttctgg agaactcggg ttttacgcca gacctctcct 480

atggctggag tttttgggaa tcttgatgtg aacgaggctc gtttgatggc tgcgtacaca 540

agtgagtgcg cggatcattt agaagcgaag gagttggctg gccctgacgg ggtagcggcc 600

gcccgggaaa ttgctaaaag atgggagaaa agagttagag atctacaaga taaaggtgct 660

gcacgaaaat tattaaatga tcctttaggc cgacgaacac ctaattatca gagcaaaaat 720

ccaggtgagt atactgtagg gaattccatg ttttacgatg gtcctcaggt agcgaatctc 780

cagaacgtcg acactggttt ttggctggac atgagcaatc tctcagacgt tgtattatcc 840

agagagattc aaacaggact tcgagcacga gctactttgg aagaatccat gccgatgtta 900

gagaatttag aagagcgttt tagacgtttg caagaaactt gtgatgcggc tcgtactgag 960

atagaagaat cgggatggac tcgagagtcc gcatcaagaa tggaaggcga tgaggcgcaa 1020

ggaccttcta gagcacaaca agcttttcag agctttgtaa atgaatgtaa cagcatcgag 1080 ttctcatttg ggagctttgg agagcatgtg cgagttctct gcgctagagt atcacgagga 1140

ttagctgccg caggagaggc gattcgccgt tgcttctctt gttgtaaagg atcgacgcat 1200

cgctacgctc ctcgcgatga cctatctcct gaaggtgcat cgttagcaga gactttggct 1260

agattcgcag atgatatggg aatagagcga ggtgctgatg gaacctacga tattcctttg 1320

gtagatgatt ggagaagagg ggttcctagt attgaaggag aaggatctga ctcgatctat 1380

gaaatcatga tgcctatcta tgaagttatg aatatggatc tagaaacacg aagatctttt 1440

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agcgactatg atttgcctag aagcccatat cctactccac ctttgcctcc tagatatcag 1560

ctacagaata tggatgtaga agcagggttc cgtgaggcag tttatgcttc ttttgtagca 1620

ggaatgtaca attatgtagt gacacagccg caagagcgta ttcccaatag tcagcaggtg 1680

gaagagattc tgcgtgatat gcttaccaac gggtcacaga catttagaga cctgatgaag 1740

cgttggaata gagaagtcga tagggaataa 1770

<210> 114 <211> 589 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 114

Met Ser Ile Arg Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Asn Lys 25 30

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Arg Phe Gln Arg Gly Leu Gly Arg Val Ala Asp Lys Val Arg Arg Ala 85 90 95

Val Gln Arg Ala Trp Ser Ser Val Ser Ile Arg Arg Ser Ser Ala Thr 100 105 110

Arg Ala Ala Glu Ser Arg Ser Ser Ser Arg Thr Ala Arg Gly Ala Ser

115

120

125

Ser Gly Tyr Arg Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arg Gly Leu Arg Leu

Arg 140

130

135

Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr Ser Pro

150

145

155

160 Met Ala Gly vai Phe Gly Asn Leu Asp Val Asn Glu Ala Arg Leu Met 165 170 175

Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Cys Ala Asp His Leu Glu Ala Lys Glu Leu 180 185 190

Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Lys Arg Trp 195 200 205

Glu Lys Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Arg Lys Leu 210 215 220

Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser Lys Asn 225 230 235 240

Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn Ser Met Phe Tyr Asp Gly Pro Gln 245 250 255

Val Ala Asn Leu Gln Asn Val Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp Met Ser 260 265 270

Asn Leu Ser Asp Val vai Leu Ser Arg Glu Ile Gln Thr Gly Leu Arg 275 280 285

Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn Leu Glu 290 295 300

Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg Thr Glu 305 310 315 320

Ile Glu Glu Ser Gly Trp Thr Arg Glu Ser Ala Ser Arg Met Glu Gly 325 330 335

Asp Glu Ala Gln Gly Pro Ser Arg Ala Gln Gln Ala Phe Gln Ser Phe 340 345 350

Val Asn Glu Cys Asn Ser lie Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe Gly Glu 355 360 365

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

Glu Glu Ile Leu Arg Asp Met Leu Thr Asn Gly Ser Gln Thr Phe Arg

Asp Leu Met Lys Arg Trp Asn Arg Glu vai Asp Arg Glu 580 585

<210> 115 <211> 1776 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 115

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60

ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag ggtaataata aagttgaaga tcgagtttgt 120

tctctatatt catctcgtag taacgaaaat agagaatctc cttatgcagt agtagacgtc 180

agctctatga tcgagagcac cccaacgagt ggagagacga caagagcttc gcgtggagtg 240

ttcagtcgtt tccaaagagg tttagtacga gtagctgaca aagtaagacg agctgttcag 300

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tcaagtagtc gtactgctcg tggtgcaagt tctgggtata gggagtattc tccttcagca 420

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tctcctatgg ctggagtttt tgggaatctt gatgtgaacg aggctcgttt gatggctgcg 540

tacacaagtg agtgcgcgga tcatttagaa gcgaacaagt tggctggccc tgacggggta 600

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aaaaatccag gtgagtatac tgtagggaat tccatgtttt acgatggtcc tcaggtagcg 780

aatctccaga acgtcgacac tggtttttgg ctggacatga gcaatctctc agacgttgta 840

ttatccagag agattcaaac aggacttcga gcacgagcta ctttggaaga atccatgccg 900

atgttagaga atttagaaga gcgttttaga cgtttgcaag aaacttgtga tgcggctcgt 960 actgagatag aagaatcggg atggactcga gagtccgcat caagaatgga aggcgatgag 1020 gcgcaaggac cttctagagc acaacaagct tttcagagct ttgtaaatga atgtaacagc 1080 atcgagttct catttgggag ctttggagag catgtgcgag ttctctgcgc tagagtatca 1140 cgaggattag ctgccgcagg agaggcgatt cgccgttgct tctcttgttg taaaggatcg 1200 acgcatcgct acgctcctcg cgatgaccta tctcctgaag gtgcatcgtt agcagagact 1260 ttggctagat tcgcagatga tatgggaata gagcgaggtg ctgatggaac ctacgatatt 1320 cctttggtag atgattggag aagaggggtt cctagtattg aaggagaagg atctgactcg 1380 atctatgaaa tcatgatgcc tatctatgaa gttatggata tggatctaga aacacgaaga 1440 tcttttgcgg tacagcaagg gcactatcag gacccaagag cttcagatta tgacctccca 1500 cgtgctagcg actatgattt gcctagaagc ccatatccta ctccaccttt gcctcctaga 1560 tatcagctac agaatatgga tgtagaagca gggttccgtg aggcagttta tgcttctttt 1620 gtagcaggaa tgtacaatta tgtagtgaca cagccgcaag agcgtattcc caatagtcag 1680 caggtggaag ggattctgcg tgatatgctt accaacgggt cacagacatt tagagacctg 1740 atgaggcgtt ggaatagaga agtcgatagg gaataa 1776

<210> 116 <211> 591 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis <400> 116

Met Ser Ile Arg Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Gly Asn 25 30

Asn Lys Val Glu Asp Arg Val Cys Ser Leu Tyr Ser Ser Arg Ser Asn 40 45

Glu Asn Arg Glu Ser Pro Tyr Ala Val Val Asp Val Ser Ser Met Ile 50 55 60

Glu Ser Thr Pro Thr Ser Gly Glu Thr Thr Arg Ala Ser Arg Gly Val 65 70 75 80

Phe Ser Arq Phe Gln Arq Gly Leu Val Arg Val Ala Asp Lys Val Arg 85 90 95

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Ala Ser Ser Gly Tyr Arg Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arg Gly Leu 130 135 140 Arg Leu Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr 145 150 155 160

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Leu Met Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Cys Ala Asp His Leu Glu Ala Asn 180 185 190

Lys Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Lys 195 200 205

Arg Trp Glu Gln Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Arg 210 215 220

Lys Leu Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser 225 230 235 240

Lys Asn Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn Ser Met Phe Tyr Asp Gly 245 250 255

Pro Gln vai Ala Asn Leu Gln Asn vai Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp 260 265 270

Met Ser Asn Leu Ser Asp Val Val Leu Ser Arg Glu Ile Gln Thr Gly 275 280 285

Leu Arg Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn 290 295 300

Leu Glu Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg 305 310 315 320

Thr Glu lie Glu Glu Ser Gly Trp Thr Arg Glu Ser Ala Ser Arg Met 325 330 335

Glu Gly Asp Glu Ala Gln Gly Pro Ser Arg Ala Gln Gln Ala Phe Gln 340 345 350

Ser Phe Val Asn Glu Cys Asn Ser Ile Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe 355 360 365

Gly Glu His vai Arg vai Leu Cys Ala Arg vai Ser Arg Gly Leu Ala

370 375 380

Ala Ala Gly Glu Ala lie Arg Arg Cys Phe Ser Cys Cys Lys Gly Ser

385 390 395 400

Thr His Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Asp Leu Ser Pro Glu Gly Ala Ser

405 410 415

Leu Ala Glu Thr Leu Ala Arg Phe Ala Asp Asp Met Gly Ile Glu Arg 420 425 430

Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Pro Leu Val Asp Asp Trp Arg Arg 435 440 445 Gly vai Pro Ser Ile Glu Gly Glu Gly ser Asp ser Ile Tyr Glu Ile 450 455 460

Met Met Pro Ile Tyr Glu Val Met Asp Met Asp Leu Glu Thr Arg Arg 465 470 475 480

Ser Phe Ala Val Gln Gln Gly His Tyr Gln Asp Pro Arg Ala Ser Asp 485 490 495

Tyr Asp Leu Pro Arg Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Pro Arg Ser Pro Tyr 500 505 510

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Gl u Ala Gly Phe Arg Glu Ala Val Tyr Ala Ser Phe Val Ala Gly Met 530 535 540

Tyr Asn Tyr Val Val Thr Gln Pro Gln Glu Arg Ile Pro Asn Ser Gln 545 550 555 560

Gln Val Glu Gly Ile Leu Arg Asp Met Leu Thr Asn Gly Ser Gln Thr

Phe Arg Asp Leu Met Arg Arg Trp Asn Arg Glu Val Asp Arg Glu 580 585 590

<210> 117 <211> 1776 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 117

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60

ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag ggtaataata aagttgaaga tcgagtttgt 120

tctctatatt catctcgtag taacgaaaat agagaatctc cttatgcagt agtagacgtc 180

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tcaagtagtc gtactgctcg tggtgcaagt tctgggtata gggagtattc tccttcagca 420

gctagagggc tgcgtcttat gttcacagat ttctggagaa ctcgggtttt acgccagacc 480

tctcctatgg ctggagtttt tgggaatctt gatgtgaacg aggctcgttt gatggctgcg 540

tacacaagtg agtgcgcgga tcatttagaa gcgaacaagt tggctggccc tgacggggta 600

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aaaaatccag gtgagtatac tgtagggaat tccatgtttt acgatggtcc tcaggtagcg 780

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<210> 125 <211> 1773 <212> DNA

<213> Chlamydia trachomatis <400> 125

atgagcatca ggggagtagg aggcaacggg aatagtcgaa tcccttctca taatggggat 60 ggatcgaatc gcagaagtca aaatacgaag ggtaataata aagttgaaga tcgagttcat 120 tctctatatt catctcttag taacgaaaat agagaatctc cttatccagt agtagacgtc 180 agctctatga tcgagagcac cccaacgagt ggagagacgc caagagcttc gcgtggagtg 240 ttcagtcgtt tccaaagagg tttaggacga gtagctgaca aagtaagacg agctgttcag 300 tgtgcgtggg gttcagtctc tacaagaaga tcgtctgcaa caagagccgt agaatccgga 360 tcaagtagtc gtactgctcg tggtgcaagt tctgggaggg agtattctcc ttcagcagct 420 agagggctgc gtcttatgtt cacagatttc tggagaactc gggttttacg ccagacctct 480 cctatggatg tagtttttgg gaatcttgat gtgaacgagg ctcgtttgat ggctgcttac 540 acaagtgagt gcgcggatta tttagaagcg cacgatttgg ctggccctga cggggtagcg 600 gccgcccggg aaattgctca aagatgggat aaaagagtta gagatctaca agataaaggt 660 gctgcacaaa aattattaaa tgatccttta ggccgacgaa cacctaatta tcagagcaaa 720 aatccaggtg agtatactgt agggaattcc atgttttacg atggtcctca ggtagcgaat 780 ctccagaacg tcgacactgg tttttggctg gacatgagca atttctcaga cgttgtatta 840 tccagagaga ttcaaacagg gcttcgagca cgagctactt tggaagaatc catgccgatg 900 ttagagaatt tagaagagcg ttttagacgt ttgcaagaaa cttgtgatgc ggctcgtact 960 gagatagaag aatcgggatg gactcgagag tccgcatcaa gaatgggagg cgatgagacg 1020 caaggacctt ctagagcaca acaagctttt cagagctttg taaatgaatg taatagcatc 1080 gagttctcat ttgggagctt tggagagcat gtgcgagttc tctgcgctag agtatcacga 1140 ggattagttg ccgcaggaga ggcgattcgc cgttgcttct cttgttgtaa aggatcgacg 1200 catcgctacg ctcctcgcga tgacctatct cctgaaggtg catcgttagc agagactttg 1260 gctagattcg cagatgatat gggaatagag caaggtgctg atggaaccta cgatattcct 1320 tgggtagatg attggagaag aggggttcct agtattgaag gagaaggatc tgactcgatc 1380 tatgaaatca tgatgcctat ctatgaagtt atgaatatgg atctagaaac acgaagatct 1440 tttgcggtac agcaagggca ctatcaggac ccaagagctt cagattatga cctcccacgt 1500 gctagcgact atgatttgcc tagaagccca tatcctactc cacctttgcc ttctagatat 1560 cagctacaga atatggatgt agaagcaggg ttccgtgagg cagtttatgc ttcttttgta 1620 gcaggaatgt acaattatgt agtgacacag ccgcaagagc gtattcccaa tagtcagcag 1680 gtggaaggga ttctgcgtga tatgcttacc aacgggtcac agacatttag caacctgatg 1740 cagcgttggg atagagaagt cgatagggaa taa 1773

<210> 126

<211> 590

<212> PRT

<21Β> Chlamydia trachomatis

<400> 126

Met Ser Ile Arq Gly Val Gly Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ile Pro Ser 1 5 10 15

His Asn Gly Asp Gly Ser Asn Arg Arg Ser Gln Asn Thr Lys Gly Asn 25 BO

Asn Lys Val Glu Asp Arg Val His Ser Leu Tyr Ser Ser Leu Ser Asn Β5 40 45

Glu Asn Arg Glu Ser Pro Tyr Pro Val Val Asp Val Ser Ser Met Ile 50 55 60 Glu ser Thr Pro Thr ser Gly Glu Thr Pro Arg Ala ser Arq Gly vai 65 70 75 80

Phe Ser Arg Phe Gln Arg Gly Leu Gly Arg vai Ala Asp Lys vai Arq 85 90 95

Arg Ala Val Gln Cys Ala Trp Gly Ser Val Ser Thr Arq Arg Ser Ser 100 105 110

Ala Thr Arg Ala Val Glu Ser Gly Ser Ser Ser Arg Thr Ala Arg Gly 115 120 125

Ala Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Ser Pro Ser Ala Ala Arq Gly Leu Arg 130 135 140

Leu Met Phe Thr Asp Phe Trp Arg Thr Arg Val Leu Arg Gln Thr Ser 145 150 155 160

Pro Met Asp Val Val Phe Gly Asn Leu Asp Val Asn Glu Ala Arg Leu 165 170 175

Met Ala Ala Tyr Thr Ser Glu Cys Ala Asp Tyr Leu Glu Ala His Asp 180 185 190

Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Ala Ala Ala Arg Glu Ile Ala Gln Arg 195 200 205

Trp Asp Lys Arg Val Arg Asp Leu Gln Asp Lys Gly Ala Ala Gln Lys 210 215 220

Leu Leu Asn Asp Pro Leu Gly Arg Arg Thr Pro Asn Tyr Gln Ser Lys 225 230 235 240

Asn Pro Gly Glu Tyr Thr Val Gly Asn Ser Met Phe Tyr Asp Gly Pro 245 250 255

Gln Val Ala Asn Leu Gln Asn Val Asp Thr Gly Phe Trp Leu Asp Met 260 265 270

Ser Asn Phe Ser Asp Val Val Leu Ser Arg Glu Ile Gln Thr Gly Leu 275 280 285

Arg Ala Arg Ala Thr Leu Glu Glu Ser Met Pro Met Leu Glu Asn Leu 290 295 300

Glu Glu Arg Phe Arg Arg Leu Gln Glu Thr Cys Asp Ala Ala Arg Thr 305 310 315 320

Glu Ile Glu Glu Ser Gly Trp Thr Arg Glu Ser Ala Ser Arg Met Gly 325 330 335

Gly Asp Glu Thr Gln Gly Pro Ser Arg Ala Gln Gln Ala Phe Gln Ser 340 345 350

Phe vai Asn Glu Cys Asn Ser Ile Glu Phe Ser Phe Gly Ser Phe Gly 355 360 365 Glu His Val Arg vai Leu Cys Ala Arg Val Ser Arg Gly Leu Val Ala 370 375 380

Ala Gly Glu Ala Ile Arg Arg Cys Phe Ser Cys Cys Lys Gly Ser Thr 385 390 395 400

His Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Asp Leu Ser Pro Glu Gly Ala Ser Leu 405 410 415

Ala Glu Thr Leu Ala Arg Phe Ala Asp Asp Met Gly Ile Glu Gln Gly 420 425 430

Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Pro Trp vai Asp Asp Trp Arg Arg Gly 435 440 445

Val Pro Ser Ile Glu Gly Glu Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Glu Ile Met 450 455 460

Met Pro Ile Tyr Glu Val Met Asn Met Asp Leu Glu Thr Arg Arg Ser 465 470 475 480

Phe Ala Val Gln Gln Gly His Tyr Gln Asp Pro Arg Ala Ser Asp Tyr 485 490 495

Asp Leu Pro Arg Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Pro Arg Ser Pro Tyr Pro 500 505 510

Thr Pro Pro Leu Pro Ser Arg Tyr Gln Leu Gln Asn Met Asp Val Glu 515 520 525

Ala Gly Phe Arg Glu Ala Val Tyr Ala Ser Phe Val Ala Gly Met Tyr 530 535 540

Asn Tyr vai Val Thr Gln Pro Gln Glu Arg Ile Pro Asn Ser Gln Gln 545 550 555 560

Val Glu Gly Ile Leu Arg Asp Met Leu Thr Asn Gly Ser Gln Thr Phe 565 570 575

Ser Asn Leu Met Gln Arg Trp Asp Arg Glu Val Asp Arg Glu 580 585 590

Claims

1. Método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis, caracterizado pelo fato de ser pela administração de uma quantidade segura e eficaz de uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

2. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), para uso no tratamento ou na prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

3. Uso de uma ou mais proteínas de Chlamydia, a dita Chlamydia sendo Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd), caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia trachomatis.

4. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende duas ou mais proteínas de Chlamydia trachomatis, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores de ditas proteínas ou de ditos fragmentos, selecionadas(os) da lista consistindo de Swib, Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089, domínio passageiro de PmpG (PmpGpd) e domínio passageiro de PmpD (PmpDpd).

5. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadofa) pelo fato de que a composição imunogênica é administrada ocularmente.

6. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica é administrada não-ocularmente.

7. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-089.

8. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-858.

9. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-875.

10. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-858 e Ct-875.

11. Método, composição ou uso de acordo com a reivindicação10, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-089, Ct-858 e Ct-875.

12. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações Iall caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica adicionalmente compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

13. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caracterizadofa) pelo fato de que a composição imunogênica adicionalmente compreende um adjuvante.

14. Método, composição ou uso de acordo com a reivindicação 13 caracterizadoía) pelo fato de que o adjuvante é um estimulante preferencial de uma resposta Thl.

15. Método, composição ou uso de acordo com a reivindicação 14 caracterizado(a) pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL, QS21 ou uma combinação de 3D-MPL e QS21.

16. Método, composição ou uso de acordo com a reivindicação 15 caracterizado(a) pelo fato de que o adjuvante adicionalmente compreende uma emulsão de óleo-em-água.

17. Método, composição ou uso de acordo com a reivindicação 15 caracterizado(a) pelo fato de que o adjuvante adicionalmente compreende lipossomos.

18. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 caracterizado(a) pelo fato de que duas ou mais das proteínas ou dois ou mais dos fragmentos imunogênicos são ligadas(os) para formarem uma proteína de fusão, ou o polinucleotídeo ou os polinucleotídeos codificador(es) da proteína ou dos fragmentos imunogênicos codifica(m) uma fusão de duas ou mais das proteínas ou de dois ou mais dos fragmentos imunogênicos.

19. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende uma das seguintes combinações de polipeptídeos de Chlamydia ou seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos desde que todas as combinações compreendam os componentes Ct-858 e Ct-875:1. Cinco de: Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd e Ct-875 2.Três de: PmpDpd, Ct-858, Ct-0875, Swib .3.Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875 e Swib 4.Cinco de: Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622 e Ct-875 5. Três de: Ct-858, Ct-875, Ct-622 e Ct-089 6. Três de: PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 7. Quatro de: Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd e Ct-875

20. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende uma das seguintes combinações de polipeptídeos Chlamydia ou seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos:la. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 2a. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Swib, Ct-089 3a. Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875, Swib, Ct-089 4a. Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622, Ct-875, Ct-089 5a. Ct-858, Ct-875 6a. Momp, Ct-858, Ct-875, Ct-089 7a. Momp, Ct-858, Ct-875 8a. Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-875, Ct-089 9a. PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089

21. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado(a) pelo fato de que a composição imunogênica compreende polipeptídeos Momp, Ct-089, Ct-858, Swib e PmpDpd ou seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos.

22. Uso de uma ou mais proteínas de Chlamydia, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores das(os) mesmas(os), selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875, e que são derivados de um primeiro sorovar de Chlamydia trachomaíis, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular causada por Chlamydia por um segundo sorovar de Chlamydia trachomaíis.

23. Método para o tratamento ou a prevenção de infecção ocular clamídica por um segundo sorovar de Chlamydia trachomaíis, caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais proteínas clamídicas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores das(os) mesmas(os), selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875, e que são derivados de um primeiro sorovar de Chlamydia frachomafis.

24. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 e 23, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende uma proteína, seu fragmento imunogênico ou polinucleotídeo codificador deles, selecionada (o) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875.

25. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende duas proteínas, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores das(os) mesmas(os), selecionadas(os) da lista consistindo de Ct-089, Ct-858 e Ct-875.

26. Uso ou método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-089 e Ct-858, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos.

27. Uso ou método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-089 e Ct-875, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos.

28. Uso ou método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-858 e Ct-875, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos.

29. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende Ct-089, Ct-858 e Ct-875, seus fragmentos imunogênicos ou polinucleotídeos codificadores dos mesmos.

30. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado da lista consistindo de sorovares A, B, Ba, C, D, Da, E, F, G, Η, I, la, J, Ja, K, LI, L2 e L3 de Chlamydia trachomatis.

31. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30, caracterizado pelo fato de que o sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculares de Chlamydia trachomatis.

32. Uso ou método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado dos sorovares oculares A, B, Ba e C de Chlamydia trachomatis.

33. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculogenitais de Chlamydia trachomatis.

34. Uso ou método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado(a) pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares oculogenitais D, Da, E, F, G, Η, I, Ia, J, Ja e K de Chlamydia trachomatis.

35. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares LGV de Chlamydia trachomatis.

36. Uso ou método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de sorovares LI, L2 e L3 de Chlamydia trachomatis LGV.

37. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 36, caracterizado pelo fato de que o primeiro sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de tal modo que ele seja um sorovar de Chlamydia trachomatis tendo um nível alto de identidade de seqüência com a maioria dos outros sorovares de Chlamydia trachomatis.

38. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 37, caracterizado pelo fato de que o sorovar de Chlamydia trachomatis é selecionado de tal modo que ele seja um sorovar de Chlamydia trachomatis tendo um tendo um nível alto de identidade de seqüência com a maioria dos sorovares comuns de Chlamydia trachomatis.

39. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 38, caracterizado pelo fato de que os primeiro e segundo sorovares de Chlamydia trachomatis são sorovares de Chlamydia trachomatis que estão associados com o mesmo estado doentio.

40. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 38, caracterizado pelo fato de que os primeiro e segundo sorovares de Chlamydia trachomatis são sorovares de Chlamydia trachomatis que estão associados com estados doentios diferentes.

41. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 40, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende um ou mais antígenos adicionais.

42. Uso ou método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que os um ou mais antígenos adicionais são antígenos de Chlamydia trachomatis.

43. Uso ou método de acordo com qualquer uma reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que os um ou mais antígenos adicionais são selecionados da lista consistindo de Momp, Ct-622, PmpGpd e PmpDpd.

44. Uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 43, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica adicionalmente compreende um adjuvante.

45. Uso ou método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é um estimulante preferencial de uma resposta Th 1.

46. Uso ou método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL, QS21 ou uma combinação de 3D-MPL e QS21.

47. Uso ou método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o adjuvante adicionalmente compreende uma emulsão de óleo-em-água.

48. Uso ou método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o adjuvante adicionalmente compreende lipossomos.