CN104800841B - 牦牛流产衣原体灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种牦牛流产衣原体病预防用灭活疫苗的制备方法，以及这种疫苗和制备过程中的所用的缓冲液及佐剂。本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法是将牦牛流产衣原体菌的抗原用pH7.2的SPG缓冲液稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2%加入浓度37%的甲醛充分灭活，再将灭活后的抗原与佐剂按1：1比例混合、摇均匀并充分乳化得到所要求的疫苗。本发明的疫苗可以使被接种的牦牛产生对流产衣原体的感染进行有效的抵抗，且免疫效果优于现有技术的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治家畜传染病的畜用疫苗及制备方法，确切讲是一种用于防治牦牛流产衣原体病的疫苗及制备方法。
背景技术
牦牛是一种生成于高海拔地区的特有动物。全世界牦牛大约为1700万头，我国牦牛存栏量大约为1362万头，约占世界牦牛的80%。青海省是我国主要的五大牧区之一，也是我国重要的草地畜牧业生产基地，这里有5亿多亩可利用草场，有各类牲畜2,300多万头只，其中牦牛有500万头，随着国家惠农政策的实施和畜牧业产业化的发展，促进了青海省农牧区牛羊繁育场、育肥基地、养殖小区的迅速发展，牛羊养殖业为青海省的农牧民增加经济收入开辟了一条有效途径。
牦牛流产衣原体病是牦牛的一种传染性疾病，它对牦牛业危害最严重的是牦牛衣原体性流产，该病是由牦牛流产衣原体引起的一种地方流行性的接触性传染病，以妊娠牦牛流产、早产、死产或产无活力犊牛为主要特征。
然而，近年来牦牛的繁殖力下降，牦牛肉价格飙升，牦牛产业因繁殖力下降而受到威胁。通过流行病学调查和病原分离，流产衣原体是引起牦牛繁殖力下降的直接罪魁祸首。而各地对牦牛衣原体病的流行有不同程度的报到，如1990年，袁文华检测玉树地区牦牛血清553份，其中阳性236份，阳性率达到42.68%；2004年，马少丽检测青海省某牦牛场血清156份，其中阳性30份，阳性率19.23%；2009年，张晓强检测天俊县牦牛血清214份，其中阳性21份，阳性率达到9.81%；2010年，候生库检测果洛地区牦牛血清368份，其中阳性血清62份，阳性率达到17.39%；2012年，朱巧英检测德令哈地区牦牛血清160份，其中阳性血清15份，阳性率达9.37%；平均阳性率达19.7%。这些数据说明，青海省牦牛流产历来已久，每年牦牛产业因衣原体感染导致的损失达几十亿。由于缺乏有效的疫苗，导致牦牛流产衣原体病不断蔓延，农牧民损失不断增加，也严重阻碍了牦牛产业的健康发展。
早在二十世纪二十年代，美国人首先报道了牛地方流行性流产综合征；到1956年，德国人采用血清学实验和细胞培养技术，证明原联邦德国牛流行性流产是由衣原体感染所致。以后欧洲许多国家，加拿大、前苏联、日本、印度也相继报道牛衣原体性流产。
兰州兽医研究所用血清学和病原学分离方法再次证明流产衣原体是引起牦牛流产的重要病原之一。流产衣原体对牦牛业的危害不可低估。
目前，用四环素、金霉素等抗生素进行牦牛衣原体病的预防和治疗是一种主要的方式，但这种方式费用昂贵，由于大量或长期使用抗生素会导致产生新的抗药株，使防治效果明显降低或无效果，病的复发率上升。同时，服药牦牛体内的药物残留升高，食用抗生素高残留牦牛奶和肉将严重危害人民的身体健康。因此，各国都禁止在饲料中添加各类抗生素来防治家畜的细菌性传染病，而提倡采用以疫苗免疫为主的综合性措施防治家畜的细菌性传染病。
各国都在进行相关疫苗研究，虽然有奶牛衣原体灭活疫苗，但这一疫苗不能用于牦牛衣原体病的防控，这在过去的实验中得到证实，这可能与衣原体侵入不同动物后自身发生变化有关，即奶牛衣原体与牦牛衣原体在基因组、蛋白组学方面可能有很大的差距。由于牦牛的特殊性至今还没有见到任何有关牦牛衣原体病灭活疫苗研制成功的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牦牛流产衣原体病预防用灭活疫苗的制备方法，以及这种疫苗和制备过程中的所用的缓冲液及佐剂。
本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法是将牦牛流产衣原体菌的抗原用pH7.2的SPG缓冲液稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2%加入浓度37%的甲醛充分灭活，再将灭活后的抗原与佐剂按体积比1：1比例混合、摇均匀并充分乳化得到所要求的疫苗。
本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法还可以是：牦牛流产衣原体菌株接种于无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代进行增值，再以接种后死亡鸡胚培养物为疫苗种毒，将衣原体抗体阴性产蛋种鸡群所产的种蛋表面清洗消毒后，37℃孵化6-7天，将种毒用pH7.2的SPG缓冲液10000倍稀释在无菌环境里，经卵黄囊途径接种鸡胚，收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，将检验合格的制苗用抗原捣碎过滤，将滤液用pH7.2的SPG缓冲液稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2%加入浓度37%以上的甲醛充分灭活，再将灭活后的抗原与油佐剂按1：1比例混合、摇均匀并充分乳化得到所要求的疫苗，所用的油佐剂为矿物油佐剂，如：MONTANIDE ISA 201佐剂或MONTANIDE ISA 206佐剂。
本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法中所用的油佐剂最好是采用MONTANIDE ISA 201佐剂。
本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法所用的缓冲液是由：Sucros 75g，KH2PO4 0.52g，Na2HPO4，1.22g，L-Glutamic，0.72g和水 1L组成。
本发明的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法中，在进行乳化时是用四叶搅拌器，工作参数是：剪切力为350rpm，乳化时间为5分钟。
本发明的疫苗可以使被接种的牦牛产生对流产衣原体的感染进行有效的抵抗。
本发明相关试验表明，采用通常使用的PBS缓冲液在用于牦牛衣原体种毒的稀释后，无法使鸡胚在接种后4-8天内正常死亡，而且会严重影响牦牛衣原体的毒力，使所得到的牦牛衣原体无法达到制苗的需求。本发明制备方法中使用pH7.2的SPG盐缓冲液，可以使接种牦牛衣原体的鸡胚在接种后72小时开始有规律的死亡，所收集的衣原体毒力完全可以达到制苗的要求。
本发明的最佳实施例使用MONTANIDE ISA 201佐剂，经相关试验表明，采用这种佐剂可比其它的油佐剂更为稳定。
本发明疫苗乳化过程中的剪切力为350rpm，时间为5min，这样可以使本发明疫苗的最后存在形式为水包油包水，即W/O/W剂型，这一剂型能够在短时间内刺激动物产生坚强的免疫力。
本发明疫苗在肌肉注射免疫牦牛最小免疫量为2ml/头，其用量远远小于同样采用肌肉注射免疫的现有奶牛衣原体灭活疫苗，这说明本发明的免疫活性远高于现有技术疫苗的免疫活性。
具体实施方式
以下提供本发明的一个实施例。
1）种毒的复苏与检验：将-70℃长期保存的牦牛流产衣原体GN6制苗菌株接种于无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代，可使全部接种鸡胚在接种72小时以后规律地死亡，取死亡鸡胚的卵黄膜涂片姬姆萨染色镜检，只看见大量紫红色的衣原体原生小体（E），而没有任何其他杂菌污染，此鸡胚培养物可以作为繁殖疫苗抗原的种（子）毒。
2）抗原繁殖与检验：将衣原体抗体阴性产蛋种鸡群所产的种蛋表面清洗消毒后，放入专用孵化机37℃孵化6-7天，将种毒用pH7.2的SPG缓冲液10000倍稀释在无菌环境里，经卵黄囊途径接种鸡胚，接种剂量0.4ml/鸡胚。鸡胚在接种后72小时开始有规律的死亡，收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，其中含有大量的衣原体原生小体。细菌检查为阴性，效价检测≥10-8ELD50为合格，可用于制苗。
一般情况下多使用PBS缓冲液，本发明相关试验中也曾试采用的PBS缓冲液，但经试验发现PBS缓冲液用于牦牛衣原体种毒的稀释，无法使鸡胚在接种后4-8天内正常死亡，严重影响牦牛衣原体的毒力，达不到制苗的需求。而采用SPG缓冲液完全解决了这个问题。相关试验结果参见表1。
3）抗原灭活与检验：将b）检验合格的抗原（卵黄膜）用组织捣碎机捣碎后过滤，然后将滤液用pH7.2的SPG缓冲液稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2%加入浓度37%以上的市售甲醛，充分摇均匀，容器严格密封好，于4℃环境灭活72小时，每天要摇容器2-3次，每次振荡5分钟。抗原灭活72小时后，无菌抽取样品，分别接种人工培养基和6-7日龄鸡胚培养，人工培养基内无任何细菌生长，鸡胚发育正常无死亡，说明抗原灭活合格，可以用于制苗。
4）抗原乳化与检验：选用MONTANIDETM ISA 201 佐剂高压消毒。将灭活抗原与油佐剂按1：1比例混合、摇均匀。在350rpm剪切力的条件下乳化5-10分钟，乳化抗原呈乳白色，乳化型为水包油包水，疫苗分装入疫苗瓶。
本发明所用的佐剂为MONTANIDETM ISA 201，在25℃保存30天以上未发现有分层现象，作为其对比，用 ISA 206佐剂在25℃条件下30天就容易形成分层。
本发明乳化条件为四叶搅拌器，剪切力为350rpm，乳化时间为5分钟，形成水包油包水（W/O/W）剂型,而200510042611.3所采用的MONTANIDETM ISA 206佐剂是在高均质乳化器的35-40 Pa的条件下形成油包水（O/W）。
。
5）疫苗检验：按照国家生物制品检验的规定，随即取样，每瓶受检疫苗分别接种人工培养基和小白鼠，进行无菌检验、安全检验和效力检验。效力检验攻毒所用的种毒为原制苗菌株。试验组5只小鼠接种本疫苗后21天攻毒，从所有小鼠均检不出衣原体（组织常规涂片染色检查或PCR检查为阴性）；对照组5只不接种本疫苗，同期攻毒，从所有小鼠均可以检出衣原体（组织常规涂片染色检查或PCR检查为阳性）。此为疫苗效检合格。试验组5只小鼠接种本疫苗后生长发育正常。同时无菌检验为阴性。生产的此批疫苗为检验合格。
6）本发明动物实验：
本发明的效力试验数据见表3，
上述试验中：用本发明的3批牦牛流产衣原体病灭活疫苗（疫苗批号为20130104、20130107、20130110）分别免疫3组衣原体抗体检查阴性牦牛，每组5头，免疫剂量2ml/头，免疫后21天攻毒，结果3个试验组有1头发病，其保护率分别为5/5，4/5，5/5；说明本发明的牦牛流产衣原体灭活的保护率达93%（14/15）。对照组5头牦牛不接种本疫苗，攻毒后5/5感染，保护率为0/5。
本发明的疫苗与现有奶牛衣原体灭活疫苗对比试验表明，本发明的疫苗免疫效果优于现有技术，参见表4 。
。
Claims (2)
1.牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于，牦牛流产衣原体菌株接种于无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代进行增殖，再以接种后死亡鸡胚培养物为疫苗种毒，将衣原体抗体阴性产蛋种鸡群所产的种蛋表面清洗消毒后，37℃孵化6-7天，将种毒用pH7.2的SPG缓冲液10000倍稀释在无菌环境里，经卵黄囊途径接种鸡胚，收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，将检验合格的制苗用抗原捣碎过滤，将滤液用pH7.2的SPG缓冲液稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2％加入浓度37％以上的甲醛充分灭活，再将灭活后的抗原与油佐剂按1：1比例混合、摇均匀并充分乳化得到所要求的疫苗，所用的油佐剂为MONTANIDE ISA 201佐剂；
乳化时采用四叶搅拌器，剪切力为350rpm，乳化时间为5分钟；
所述SPG缓冲液由：Sucros 75g，KH2PO40.52g，Na2HPO4，1.22g，L-Glutamic，0.72g和水1L组成。
2.权利要求1所述的牦牛流产衣原体灭活疫苗的制备方法制备的牦牛流产衣原体灭活疫苗。
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